RU2679390C1 - Рекомбинантная плазмидная ДНК pSAT1-AhA1, кодирующая запасный белок А1 семян Amaranthus hypochondriacus, и рекомбинантный штамм Myceliophthora thermophila/pSAT1-AhA1 - продуцент запасного белка А1 - Google Patents
Рекомбинантная плазмидная ДНК pSAT1-AhA1, кодирующая запасный белок А1 семян Amaranthus hypochondriacus, и рекомбинантный штамм Myceliophthora thermophila/pSAT1-AhA1 - продуцент запасного белка А1 Download PDFInfo
- Publication number
- RU2679390C1 RU2679390C1 RU2017136594A RU2017136594A RU2679390C1 RU 2679390 C1 RU2679390 C1 RU 2679390C1 RU 2017136594 A RU2017136594 A RU 2017136594A RU 2017136594 A RU2017136594 A RU 2017136594A RU 2679390 C1 RU2679390 C1 RU 2679390C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- aha1
- psat1
- recombinant
- seeds
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 61
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 51
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 29
- 240000003147 Amaranthus hypochondriacus Species 0.000 title claims abstract description 21
- 235000011746 Amaranthus hypochondriacus Nutrition 0.000 title claims abstract description 20
- 241001313536 Thermothelomyces thermophila Species 0.000 title description 19
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 9
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 5
- 101710132457 Protein A1 Proteins 0.000 claims description 17
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 10
- 230000031787 nutrient reservoir activity Effects 0.000 claims description 8
- 241000219318 Amaranthus Species 0.000 claims description 3
- 241000205003 Methanothrix thermoacetophila Species 0.000 claims 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 13
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 abstract description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 45
- 240000001592 Amaranthus caudatus Species 0.000 description 35
- 235000009328 Amaranthus caudatus Nutrition 0.000 description 35
- 235000012735 amaranth Nutrition 0.000 description 35
- 239000004178 amaranth Substances 0.000 description 35
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 description 25
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 16
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 15
- 239000000463 material Substances 0.000 description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 12
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 11
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 11
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 9
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 9
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 8
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 8
- 101100001231 Caenorhabditis elegans aha-1 gene Proteins 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 7
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 7
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 7
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 6
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000010908 plant waste Substances 0.000 description 5
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 5
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 4
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 4
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 4
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 4
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 4
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 4
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101100365516 Mus musculus Psat1 gene Proteins 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 3
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 3
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 229920005610 lignin Polymers 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 3
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 3
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 3
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- 241000219317 Amaranthaceae Species 0.000 description 2
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000206672 Gelidium Species 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 2
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 2
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 239000002154 agricultural waste Substances 0.000 description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 244000309464 bull Species 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000010902 straw Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 244000251953 Agaricus brunnescens Species 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 1
- 235000016068 Berberis vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 241000335053 Beta vulgaris Species 0.000 description 1
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 description 1
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 1
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 1
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710121765 Endo-1,4-beta-xylanase Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108090000942 Lactalbumin Proteins 0.000 description 1
- 102000004407 Lactalbumin Human genes 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 235000006679 Mentha X verticillata Nutrition 0.000 description 1
- 235000002899 Mentha suaveolens Nutrition 0.000 description 1
- 235000001636 Mentha x rotundifolia Nutrition 0.000 description 1
- GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]-N-methylprop-2-en-1-amine Chemical compound CN(CCC1=CNC2=C1C=CC=C2)CC=C GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000028571 Occupational disease Diseases 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 1
- 108010064851 Plant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 241000287530 Psittaciformes Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 108010073771 Soybean Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 description 1
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000000061 acid fraction Substances 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 description 1
- 239000012223 aqueous fraction Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 235000020247 cow milk Nutrition 0.000 description 1
- 235000021403 cultural food Nutrition 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019621 digestibility Nutrition 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000010410 dusting Methods 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 235000002864 food coloring agent Nutrition 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 244000053095 fungal pathogen Species 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000002573 hemicellulolytic effect Effects 0.000 description 1
- 235000020256 human milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004251 human milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000035987 intoxication Effects 0.000 description 1
- 231100000566 intoxication Toxicity 0.000 description 1
- 238000007169 ligase reaction Methods 0.000 description 1
- 239000010808 liquid waste Substances 0.000 description 1
- 239000010871 livestock manure Substances 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 238000012269 metabolic engineering Methods 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000000050 nutritive effect Effects 0.000 description 1
- 239000005416 organic matter Substances 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 description 1
- 239000003415 peat Substances 0.000 description 1
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 1
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 1
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021118 plant-derived protein Nutrition 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 108700022487 rRNA Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 235000011121 sodium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 229940001941 soy protein Drugs 0.000 description 1
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000010025 steaming Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к плазмиде для синтеза белка А1 семян Amaranthus hypochondriacus, а также к рекомбинантному штамму, содержащему вышеуказанную плазмиду. Изобретение позволяет получать запасной белок А1 семян Amaranthus hypochondriacus, который может быть использован в животноводстве для разработки технологий обогащения растительных кормов. 2 н.п. ф-лы, 3 пр., 1 ил.
Description
Рекомбинантная плазмидная ДНК pSAT1-AhA1, кодирующая запасный белок А1 семян Amaranthus hypochondriacus, и рекомбинантный штамм Myceliophthora thermophila/pSAT1-AhA1 - продуцент запасного белка А1
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и позволяет получать микробиологическим синтезом по оптимизированной технологии запасный белок А1 семян Amaranthus hypochondriacus L., который может быть использован в животноводстве для обогащения грибного мицелия и кормов сбалансированным по аминокислотному составу белком.
В качестве одного из альтернативных источников кормового протеина может использоваться перспективная высокобелковая культура - амарант {Amaranthus L).
В последние годы во многих странах мира проводятся интенсивные исследования с этой культурой. Семена и фитомасса амарантовых представляют собой прекрасный корм для животных в свежем, сушеном или засилосованном состоянии, а также высокотехнологичное сырье для извлечения белка и сопутствующих ценных компонентов, таких как пектин, пигменты, витамины, пищевые красители и др. Семена амаранта содержат в среднем 15-18% белка, 5-8% масла и 3,7-5,7% клетчатки, что выше, чем у большинства зерновых культур [Магомедов, И.М. Физиологические особенности конкурентоспособности амаранта / И.М. Магомедов // Успехи современного естествознания. - 2008. - №5. - С. 41 - 43].
Родиной амаранта является Центральная и Южная Америка, где он уже тысячелетия служит пищевой культурой для местных народов. Амарант устойчив против болезней, засухи, жары. Хорошо приспосабливается к новым условиям, в том числе и таким, которые для других растений невыносимы. Семейство амарантовых представлено 65 родами и 850 видами, распространенными главным образом в субтропических областях земного шара. Все они являются древними зерновыми культурами. Именно поэтому за последние 25 лет многие виды амаранта интродуцируются и широко используются в качестве пищевых, кормовых и лекарственных культур в странах Америки, Европы, Азии и Африки [Алексеев Г.В. Переработка нетрадиционного растительного сырья с целью дальнейшего его использования в продуктах питания / Г.В. Алексеев, В.А. Головацкий, И.В. Краснов [и др] // Электронный научный журнал процессы и аппараты пищевых производств [Электронный ресурс] / СПб НИУ ИТМО ИХиБТ. - Электрон, текстовые дан. - С-Петербург: СПБГУНиПТ, 2007. - Режим доступа: http://processes.open-mechanics.com/articles/29.pdf.; Журавель, Н.В. Амарант перспективная зернокормовая культура для возделывания на юге России / Н.В. Журавель, В.В. Чумакова // Зерновое хозяйство России. - 2012. - №2. - С. 18 - 25].
В отличие от низкокачественных белков зерновых злаков, ценность белка амаранта определяется преобладанием легкорастворимых в воде и слабых солевых растворах фракций альбуминов и глобулинов, не образующих клейковины, с повышенным содержанием незаменимых аминокислот [Чернов, И.А. Специфика биосинтеза высоколизинового белка у растений рода Amaranthus 1., состав, свойства и технология его выделения из фитомассы амаранта / И.А. Чернов, Г.А. Гасимова, И.А. Дегтярева, Ю.А. Куликов // Ученые записки казанского государственного университета. Естественные науки. - 2007. - Т. 149, кн. 4. - С. 8 - 19]. При применении зерна амаранта в кормлении домашней птицы повышается яйценоскость кур-несушек, ускоряется ростцыплят, повышается производство мяса птицы. Особый интерес зерно амаранта как корм, представляет при выращивании мелких пернатых (перепелов, попугаев и другой мелкой птицы). Однако стоит отметить, что семена амаранта, имеющие темную оболочку, включают в себя небольшое количество токсичных веществ. Исходя из этого факта, для пищевых и кормовых целей, в большинстве случаев, подходят сорта только со светлой окраской семян. Следует учитывать способность амаранта к переопылению сортов.
В России сорняк - щирица обыкновенная, является подвидом семейства Амарантовые, имеет сходства с амарантом культурных видов, но сильно уступает им в продуктовых и качественных показателях. Поэтому, щирица не представляет ценности как сельскохозяйственная культура и, как правило, отделяется от понятия амарант.
По содержанию незаменимой аминокислоты - лизина, амарант в 2 раза превосходит пшеницу и в 3 раза кукурузу. При недостатке лизина пища плохо усваивается и белок проходит через организм транзитом. По содержанию незаменимых аминокислот - треонина, фенилаланина, тирозина и триптофана структура амаранта приравнивается к белку женского молока. Амарант имеет наибольшее совпадение с теоретически рассчитанным идеальным белком. Для сравнения, коэффициент оценки к идеальному белку: амарант - 75, коровье молоко - 72, соя - 68, ячмень - 62, пшеница - 60, кукуруза - 44, арахис - 32. Однако из всех белков амарантовых стоит выделить проламиноподобный запасный белок А1 из Amaranthus hypochondriacus L., который содержит в своем составе наибольшее количество дефицитных в кормопроизводстве аминокислот: 8,36% лизина, 6,13% треонина, 2,99% метионина, 6,37% валина, 4,09% триптофана, что превышает в несколько раз содержание этих аминокислот в таких белках, как казеин, овальбумин, лактальбумин, белок сои и пр. Поэтому аминокислотная последовательность проламиноподобного запасного белка амаранта А1, созданная природой, является лучшей альтернативой для целей получения наиболее сбалансированного по аминокислотному составу протеина рекомбинантным способом.
Известны способы обогащения белком Al Amaranthus hypochondriacus L. плодов трансгенных растений томатов, кукурузы или табака путем внедрения в растения гена, кодирующего запасной белок Al [Accession no: AF49129, Chakraborty et al., 2000) (SEQ ID NO: 5) (U.S. patent 5846736); Chakraborty, S., Chakraborty, N., and Datta, A. (2000). Increased nutritive value of transgenic potato by expressing a nonallergenic seed albumin gene from Amaranthus hypochondriacus. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 97, 3724-3729.]. Методы получения рекомбинантного белка амаранта A1 микробиальным синтезом не известны.
Тем не менее, одним из путей решения проблемы обогащения животноводческих кормов белками является получение белка микробиологическим путем. Микроорганизмы отличаются высоким (до 60% сухой массы) содержанием белка, сбалансированного по аминокислотному составу. Кроме того, микроорганизмы содержат углеводы, липиды, витамины, макро- и микроэлементы. Важным достоинством производства кормового белка на основе микроорганизмов является использование сельскохозяйственных отходов, возможность организации промышленного производства, отсутствие сезонности и зависимости от погодно-климатических условий [Мхитарян, Г.А. Современные технологии переработки свекловичного жома / Г.А. Мхитарян, А.П. Леснов, В.М. Ткаченко // Сахарная свекла. - 2009. - №2. - С. 33-35; Chadd,
S.A. Practical production of protein for food animals / S.A. Chadd, W.P. Davies, J.M. Koivisto // Protein sources for the animal feed industry. Expert Consultation and Workshop Bangkok, 29 April – 3 May 2002. – 2004. - № 1. – p. 77 – 125].
Таким образом при использовании микроорганизмов в качестве продуцентов целлюлолитических ферментов и кормового белка одновременно решаются две важные задачи — получение белковой массы и утилизация отходов растениеводства, деревообрабатывающей и целлюлозно-бумажной промышленности, которые могут быть источниками загрязнения окружающей среды [Базунова, М.В. Способы утилизации отходов полимеров / М.В. Базунова, Ю.А. Прочухан // Вестник башкирского университета. – 2008. – Т. 13, № 4. – С. 875 – 885; Пат. 2354633 Российская федерация, МПК C 05 F 11/08, C 02 F 3/34 . Способ утилизации жиросодержащих отходов и продукт, получаемый этим способом / Н.С. Фунтикова, Н.Б. Сократова, М.С. Тришкин ; заявители и Н.С. Фунтикова, Н.Б. Сократова, М.С. Тришкин. – № 2007124272/13 ; заявл. 28.06.2007 ; 10.05.2009, Бюл. № 13. – 6 с.]. В отличие от бактериальных и дрожжевых клеток, которые продуцируют ДНК в количестве, вызывающем интоксикацию у животных, концентрация нуклеиновых кислот в грибном мицелии почти такая же, как в тканях растительного организма (1 – 4 % от сухой массы). Однако в биомассе мицелиальных грибов синтезируется значительно меньше белков (20 – 60 % от сухой массы), чем в дрожжах, и у них относительно медленней происходит рост биомассы [Дедков, В.Н. Биоконверсия соломы злаковых культур грибами рода Trichoderma в кормовые продукты для животноводства / В.Н. Дедков, И.А. Гнеушева, Н.Е. Павловская // Вестник ОрелГАУ. – 2012. – №4(37). – С. 102 – 105].
В целях ускорения роста грибов проводится предварительная обработка растительного сырья, повышающая доступность его компонентов для утилизации микроорганизмами [Низкотемпературный гидролиз растительного сырья / Р.М. Нуртдинов, Р.Т. Валеева, С.Г. Мухачев [и др.] // Вестник казанского технологического университета. – 2011. - № 15. – С. 150 – 153]. Чаще всего применяют кислотно-щелочной способ обработки целлюлозо- и лигнинсодержащих отходов, отпаривание под давлением, обработка аммиаком и каустической содой [Высокотемпературный гидролиз растительного сырья // Р.М. Нуртдинов, С.Г. Мухачев, Р.Т. Валеева [и др.] // Вестник казанского технологического университета. – 2011. - № 10. – С. 204 – 208; Голязимова, О.В. Увеличение эффективности измельчения лигноцеллюлозного растительного сырья с помощью химической обработки / О.В. Голязимова, А.А. Политов, О.И. Ломовский // Химия растительного сырья. – 2009. - № 2. – С. 53 – 58.]. После такой обработки происходит полное или частичное разложение трудногидролизуемых полисахаридов и лигнина, что обеспечивает ускоренный рост грибной массы и сокращение сроков промышленного культивирования грибов (до 7 - 8 суток). В зависимости от способа подготовки растительного сырья для культивирования микроскопических грибов применяют и соответствующие технологии их выращивания. Для культивирования грибов на твердой питательной среде разработан метод твердофазной ферментации. Это гетерофазный процесс, который включает измельчение и обработку растительного сырья парами воды и аммиака, обогащение этого сырья минеральными веществами, посев и выращивание мицелия грибов в заданном режиме аэрации и поддержание оптимальной температуры [Смирнов, К.А. Особенности твердофазной ферментации / К.А. Смирнов, Ю.Д. Алашкевич, Н.С. Решетова // Химия растительного
сырья. – 2009. - № 3. – С. 161 – 164]. Однако, при такой технологии культивирования грибов коэффициент использования растительного сырья невысокий, что предопределяет и сравнительно невысокий уровень содержания белка в выращиваемой грибной массе (20 – 30 % от сухой массы). Так, прямое культивирование мицелиальных грибов на соломе и других отходах растениеводства обеспечивает включение углерода из этих источников в органическое вещество грибного мицелия на 17 – 25 %. Более высокий коэффициент использования сырья обычно достигается при выращивании грибов на гидролизатах растительных отходов и жидких отходах деревообрабатывающей и целлюлозно-бумажной промышленности [Егорова, Т.А. Основы биотехнологии: учеб. пособие для высш. пед. учеб. заведений / Т.А. Егорова, С.М. Клунова, Е.А. Живухина. – 4-е изд., стер. – М. : Издательский центр «Академия», 2008. – 208 с]. В пересчете на сухую массу количество протеина в грибном мицелии, культивируемом на среде с высокой влажностью, может составлять 50 – 60 %. Для более эффективной переработки сырья в некоторых случаях применяется одновременное культивирование бактерий и грибов. Разработаны технологии по переработке в грибной белок торфа, навоза [Пат. 2005789 Российская Федерация, МПК C 12 P 1/00 A, C 02 F 3/34 B. Способ очистки животноводческих стоков и получение биомассы / М.В. Левчикова, Р.А. Мельник, Л.И. Ульченко, А.А. Ковалев; заявитель и патентообладатель «Всероссийский институт электрофикации сельского хозяйства». - № 4856861/13 ; заявл. 26.06.1990 ; 15.01.1994, Бюл. № 1. – 6 с.].
Хорошая перевариваемость грибной белковой массы в организме животных, а также низкий уровень содержания нуклеиновых кислот позволяют использовать её в качестве кормовой добавки в значительно большей концентрации, чем кормовые дрожжи. Обычно при кормлении молодняка животных допускается введение в кормовые рационы грибного белка в пределах 15 – 20 % от белка корма, а при кормлении взрослых животных - до 50 %.
Практическое использование термофильных мицелиальных грибов в технологических процессах имеет преимущества перед мезофильными микроорганизмами [Билай Т.И. Термофильные грибы и их ферментативные свойства. Киев: Наукова думка. 1985. 172 с.]. Недостатком использования для ферментации многих видов мезофильных грибов является их отношение к группе условно-патогенных грибов. Способность многими видами плесневых грибов образовывать обильное спороношение может привести к пылению субстрата, что создает неблагоприятные условия для работы персонала, приводит к развитию профзаболеваний. Температурный режим, при котором могут существовать и развиваться мезофильные грибы, не исключает развитие патогенной и условно-патогенной микобиоты. Кроме того, многие виды атоксигенных термофильных грибов, обладая более высоким уровнем образования целлюлолитических ферментов и биомассы, являются перспективными продуцентами кормового источника белка, витаминов, липидов и других физиологически активных метаболитов с использованием дешевых растительных субстратов. Основными критериями в селекции штаммов мицелиальных грибов для производства обогащенных грубых кормов и различных растительных отходов являются следующие: атоксигенность, высокая скорость роста на субстрате (высокая белоктрансформирующая активность), высокое содержание белка с набором незаменимых аминокислот, степень безвредности при производстве обогащенного корма и его скармливании животным, стабильность и технологичность при изготовлении посевного материала культуры, проведение твердофазной ферментации [Смирнов и др., 2009; Смирнов К.А., Ю.Д. Алашкевич, Н.С. Решетова. Особенности твердофазной ферментации. Химия растительного сырья. 2009. №3. С. 161-164].
Так, например, известен способ переработки отходов растительного сырья, предусматривающий жидкофазную ферментацию с использованием термофильного штамма гриба М. termophila F-2109, гидролиз растительного сырья жидкофазной фракцией, полученной при жидкофазной ферментации и содержащей ферменты, обеспечивающие деградацию крахмала, целлюлозы и лигнина, и твердофазную ферментацию, осуществляемую на смеси продуктов жидкофазной ферментации и ферментативного гидролиза растительного сырья в слое смеси, не превышающем 15 мм, при этом переработку осуществляют в условиях порционного замещения целевого продукта свежей средой [Кудряшов В.К., Шкидченко А.Н., Редикульцев Ю.В. Способ переработки отходов растительного сырья. Патент. RU 2354135]. Способ позволяет перерабатывать 27 кг опилок и получать 27,5 кг ферментированного продукта, обогащенного легкодоступными углеводами и биомассой грибов, а производительность переработки (биодеградации) растительного сырья при использовании гидролизного аппарата емкостью 3 дм3 достигает 5,4 кг/сутки.
Таким образом, путь прямой трансформации полимеров грубых отходов сельского хозяйства в белок и другие полезные метаболиты грибной массы решает вопрос обогащения белком и другими биологически активными метаболитами целлюлозосодержащих субстратов. Однако для выбранного штамма-продуцента всегда остается необходимость либо увеличения эффективности имеющихся ферментативных систем методами метаболического инжиниринга для более глубокой переработки субстратов, либо создания новых метаболитов в виде рекомбинантных белков и ферментов. Кроме того, в отличие от бактерий мицелиальные грибы могут обеспечить рекомбинантному белку эукариотического происхождения, каким является белок семян амаранта А1, необходимую пострансляционную модификацию и фолдинг, что обеспечит биологическую ценность продукта.
Таким образом, одной из задач изобретения является разработка векторной системы, позволяющей переносить и экспрессировать в клетке термофильного мицелиального гриба гетерологичный растительный белок, что позволит создавать рекомбинантные штаммы с комбинированными свойствами.
Задача изобретения - конструирование рекомбинантного штамма-продуцента Myceliophthora thermophila, несущего такую экспрессирующую конструкцию (плазмиду), которая позволит получать в препаративных количествах целевой продукт - кормовой белок А1 семян амаранта вида Amaranthus hypochondriacus L., который можно будет использовать для балансирования аминокислотного состава кормового белка.
Поставленная задача решена путем конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pSAT1-AhA1, кодирующей запасный белок А1 семян амаранта Amaranthus hypochondriacus.
Технический результат заявленного изобретения - получение с высоким выходом кормового белка А1 амаранта в термофильном мицелиальном грибе Myceliophthora thermophila.
Плазмида pSAT1-AhA1 имеет 4680 пар оснований (п.о.) и характеризуется наличием NcoI/XbaI-фрагмента плазмиды pSAT1-MCS [Tzfira Т, Tian G-W, Lacroix В, Vyas S, Li J, Leitner-Dagan Y, Krichevsky A, Taylor T, et al. pSAT vectors: a modular series of plasmids for autofluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Mol Biol 2005; 57:503-16] и последовательности фрагмента ДНК размером 915 п. о., содержащего белок-кодирующий участок гена AhA1 со стартовым кодоном.
На фиг. 1 представлена физическая карта плазмиды pSAT1-AhA1 и область плазмиды, ответственная за экспрессию гибридного белка А1 амаранта. Нуклеотидная последовательность фрагмента плазмиды pSAT1-AhA1, фланкированная сайтами NcoI и XbaI, содержит последовательность структурного гена AhA1, соответствующую открытой рамке считывания для зрелого белка А1. Экспрессия гена AhA1 обеспечивается наличием двойного промотора гена 35S рРНК вируса мозаики цветной капусты (CaMV), участком усиления трансляции (TL) вируса гравировки табака (TEV), а также терминаторным участком гена 35S CaMV. Кроме того, плазмида pSAT1-AhA1 несет ген, кодирующий фермент бета-лактамазу, обеспечивающий устойчивость к ампицилину (AmpR) в процессе селекции (см. фиг. 1)
Рекомбинантный штамм Myceliophthora thermophila/pSAT1-AhA1 продуцент запасного белка А1 семян Amaranthus hypochondriacus L., получен трансформацией клеток М. thermophila F-859 (ВКПМ) плазмидой pSAT1-AhA1 с использованием традиционного метода электропорации [Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis Т. // Molecular Cloning. A. Laboratory Manual. 2bd ed. Cold Spring Harbor, NY, 1989].
Рекомбинантный штамм Myceliophthora thermophila/pSAT1-AhA1 характеризуется следующими признаками:
1) культурально-морфологические признаки: колонии на агаризованном солодовом экстракте быстро растущие, достигающие 60-65 мм в диаметре через 7 дней, распростертые, сначала белые, затем светло-коричневые, текстура поверхности гранулированная. Вегетативные гифы септированные, неокрашенные. Конидиеносцы простые или разветвленные, бесцветные. Конидии образуются одиночно или небольшими группами, неокрашенные, гладкие, овальные до грушевидных, 4-10(12)×3-5 мкм. Пигмент отсутствует. Штамм хорошо растет на таких средах, как агаризованный солодовый экстракт (мальт-пептонный агар: мальт-экстракт - 30 г; пептон - 1 г; агар-агар - 15 г), картофельно-глюкозный агар (картофельный отвар - 200 г; глюкоза - 20 г; агар-агар - 15 г), а также на жидкой среде, содержащей воду и мучку рисовую 25%, при температуре 45°С.
2) физико-биологические признаки: штамм характеризуется высокой гемицеллюлолитечской активностью (целлюлазы, ксиланазы, 1,3(1,4)-глюканазы, амилазы, гликозидазы).
Штамм не патогенен и не токсичен для теплокровных животных.
Штамм хранится обычным способом в суспензии с глицерином (30%) при -70°С.
Способ получения рекомбинантного белка А1 семян Amaranthus hypochondriacus L. заключается в следующем: мицелий штамма М. thermophila/pSAT1-AhA1 культивируют в жидкой питательной среде на основе картофельно-глюкозного бульона, или 25-% смеси мучки рисовой и воды дистиллированной, или среды Вогеля в течение 7 дней при 45°С при перемешивании 2 раза в день, затем биомассу осаждают центрифугированием, суспензию дезинтегрируют в буфере с 8М мочевиной, далее экстракт центрифугируют, затем в надосадочной жидкости оценивают количество синтезированного белка с использованием металлафинной хроматографии, метода Бредфорда, метода электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ).
Рекомбинантный белок Al семян Amaranthus hypochondriacus L. имеет молекулярную массу 34,8 кДа и полностью соответствует природному белку, т.е. не содержит каких-либо дополнительных аминокислотных последовательностей плазмиды.
Существенными преимуществами вышеописанного способа получения рекомбинантного аналога белка амаранта А1 являются:
- использование рекомбинантного штамма-продуцента термофильного мицелиального гриба М. thermophila/pSAT1-AhA1, что позволяет получать при биосинтезе большое количество функционального белкового аналога А1, биологически равноценного запасному белку А1 из амаранта Amaranthus hypochondriacus, и улучшать аминокислотный баланс мицелиального белка при обогащении производимого им корма на растительных субстратах;
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Конструирование плазмиды pSAT1-AhA1.
Рекомбинантную плазмиду pSAT1-AhA1, содержащую ген, кодирующий полноразмерный кормовой белок А1 семян Amaranthus hypochondriacus L., фланкированный сайтами рестрикции Ncol и Xbal, конструируют на основе плазмиды pSAT1-MCS [Tzfira Т, Tian G-W, Lacroix В, Vyas S, Li J, Leitner-Dagan Y, Krichevsky A, Taylor T, et al. pSAT vectors: a modular series of plasmids for autofluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Mol Biol 2005; 57:503-16].
Фрагмент кДНК, содержащий ген AhA1 (GenBank ID: Z11577), получают в три этапа. На первом этапе проводят выделение РНК из проростков амаранта Amaranthus hypochondriacus. Для этого навеску растительной ткани весом 100 мг растирают в жидком азоте до получения гомогенной массы и экстрагируют при помощи буфера следующего состава: 100 mМ Трис-HCl (рН8,0), 2М NaCl, 25 mM ЭДТА, 2% ЦТАБ, 2% ПВП, 2% 2-меркаптоэтанол. Полученный лизат инкубируют 5 минут при температуре 65°С периодически перемешивая. По истечении времени инкубации раствор дважды обрабатывают смесью хлороформ/изоамиловый спирт (24/1) с последующим центрифугированием 10 мин при 18000 g и верхнюю фазу, содержащую фракцию нуклеиновых кислот переносят в новые пробирки. Для отделения молекул РНК от ДНК, к раствору добавляют 0,25 объема 10 М LiCl и инкубируют при +4°С в течении 16 часов. Смесь центрифугируют 15 мин при 18000 д. Для очистки от избытка соли осадок РНК растворяют в 0,1 мл стерильной бидистиллированной воды и осаждают добавлением 2,5 объема охлажденного 96% этанола с последующим центрифугированием 15 мин при 18000 д. Осадок РНК промывают последовательно 70%-ным раствором этанола и подсушивают на воздухе. РНК растворяют в 0,02 мл стерильной бидистиллированной воде. Количество РНК определяют спектрофотометрическим методом по величине оптической плотности раствора при 260 нм. Качество РНК оценивают по соотношению оптической плотности при 260 нм, с поглощением раствора при 230 и 280 нм. На втором этапе 2 мкг полученной РНК используют для синтеза кДНК. Реакцию обратной транскрипции проводят при помощи набора реактивов Mint (Евроген, Москва) согласно протоколу фирмы-производителя. На третьем этапе проводят полимеразную цепную реакцию с использованием кДНК амаранта в качестве матрицы для получения гена AhA1 и праймеров AhA1-pSAT-NcoI-dir и AhA1-pSAT-XbaI-rev, где AhA1-pSAT-NcoI-dir - праймер, специфичный по отношению к N-концевой последовательности AhAl, включающий сайт для рестриктазы NcoI; AhA1-pSAT-XbaI-rev - обратный праймер, специфичный по отношению к С-концевой последовательности AhA1, включающий сайт рестрикции XbaI:
AhA1-pSAT-NcoI-dir: 5'-TATAAGATCTCCATGGCGGGATTACCAGTGAT-3' AhA1-pSAT-XbaI-rev: 5'-ACTCTAGACCTAGTTGTTGGATCCCAATTCTA-3'
Данную реакцию проводят в следующих условиях: 10х Encycio буфер, 50х смесь полимераз Encycio («Encyclo PCR kit», Евроген, Москва), 50х смесь dNTP (10 mM каждого), смесь праймеров (5 μМ каждого), 20 нг ДНК. Процесс амплификации состоит из следующих стадий: 30 циклов ПЦР (15 с - 95°С, 15 с - 55°С, 1 мин - 72°С) и инкубация 10 мин при 72°С. После амплификации ПЦР-продукт очищают электрофоретически в 1% агарозном геле. Фрагмент (1 мкг) обрабатывают рестриктазами NcoI и XbaI в оптимальном буфере (Fermentas) в течение 24 ч, затем ферменты удаляют из реакционной среды по стандартной методике фенолом (1:1) [Sambrook J. et. al. // Molecular Cloning. A. Laboratory Manual. 2bd ed. Cold Spring Harbor, NY, 1989]. В водную фракцию, содержащую фрагмент, добавляют 1/10 объема 0,3 М ацетата Na, рН 5,2 и 1/2 объема изопропилового спирта и оставляют на -20°С в течение 30 мин. Затем центрифугируют при 18000 g в течение 2 0 мин, осадок промывают 70% этанолом и высушивают при комнатной температуре. Осадок растворяют в 20 мкл деионизованной воды. Для сравнения нуклеотидной последовательности полученного фрагмента с последовательностью целевого гена его секвенируют с использованием смеси флуоресцентно-меченных терминаторов BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit по методике производителя (Applied Biosystems).
2 мкг плазмидной ДНК pSAT1-MCS обрабатывают рестриктазами NcoI и XbaI в соответствии с методикой, описанной выше, и из полученного гидролизата выделяют векторную часть плазмиды в 1% геле легкоплавкой агарозы.
Полученный фрагмент гена AhA1 и векторную часть плазмиды pSATl-MCS сшивают при помощи лигазной реакции в 50 мкл буфера для лигирования согласно инструкции (Fermentas). 10 мкл реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток Е. coli Rosetta (DE3). Трансформанты высевают на LB-агар, содержащий 50 мкг/мл ампициллина. После инкубирования в течение 16 ч при 37°С клоны отсевают, выделяют плазмидную ДНК и анализируют на наличие мутаций при помощи автоматического секвенирования. Отбирают плазмидную ДНК pSAT1-AhA1, содержащую последовательность AhA1.
Пример 2. Получение рекомбинантного штамма М. thermophila/pSAT1-AhA1 - продуцента запасного белка А1 семян Amaranthus hypochondriacus L.
Рекомбинантный штамм-продуцент М. thermophila/pSAT1-AhA1 получают путем электропорации клеток штамма М. thermophila F-859 рекомбинантной плазмидой pSAT1-AhA1.
Конидии М. thermophila собирают с поверхности мицелия 15-дневной культуры гриба М. thermophila F-859, выращенного на обедненной агаризованной среде Вогеля с добавлением 2% сахарозы, путем их суспендирования стерильной водой с 2-% Твином-80. Далее конидии переводят в буфер, содержащий 1 мМ HEPES, рН 7,0, 50 мМ маннитол, 0,01% Твин-20, и доводят до концентрации 106/мл с использованием камеры Горяева. Далее суспензию конидий смешивают с 10 мкг плазмидной ДНК в объеме 250 мкл и помещают в ячейку для электропорации с зазором 0,2 см (Bio-Rad). Процедуру электропорации проводят в кюветном электропораторе Gene Pulser Xcell (BioRad) вследующем режиме: два импульса по 1 мс каждый при 1,70 кВ с интервалом 5 с.
Для определения эффективности трансформации и наличия вставки гена запасного белка амаранта А1 конидии штамма М. thermophila F-859 после электропорации высевают на агаризованную среду Вогеля, инкубируют в течение 5 дней при 45°С. Далее отбирают отдельно стоящие колонии в качестве матрицы для проведения ПЦР с парами специфических праймеров для плазмиды pSAT:
UTR-D:5'-TCACCATTTACGAACGATAG-3'
Term-R: 5'-GATTTGTAGAGAGAGACTG-3'
и гена белка A1 семян амаранта:
AhA1-pSAT-NcoI-dir: 5'-TATAAGATCTCCATGGCGGGATTACCAGTGAT-3'
AhA1-pSAT-XbaI-rev: 5'-ACTCTAGACCTAGTTGTTGGATCCCAATTCTA-3'
Для определения продуктивности штамма по рекомбинантному белку экстракты грибной биомассы в буфере с 8 М мочевиной анализируют электрофорезом в 12,5% ПААГ. Гель окрашивают Кумасси R-250 по стандартной методике и определяют относительное количество белка в полосе целевого продукта. Содержание рекомбинантного белка в клеточной фракции составляет не менее 30% от всех белков этой фракции.
Пример 3. Выделение и характеристика рекомбинантного белка
AhAl.
Штамм-продуцент рекомбинантного белка А1 семян амаранта - М. thermophila/pSAT1-AhA1, инкубируют в трехлитровой колбе в жидкой среде, содержащей на 1 л культуры 200 г картофельного отвара, 20 г сахарозы, рН 5,1, в течение 7 суток при 45°С при перемешивании 2 раза в день. Грибную биомассу отделяют от культуральной среды центрифугированием и промывают физраствором на фильтровальной бумаге. Суспензию дезинтегрируют жидким азотом, экстрагируют в буфере с 8 М мочевины и центрифугируют при 14000 об/мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость собирают и помещают помещают на колонку с Ni-сефарозой (GE Healthcare). Элюцию белка проводят 0,5-М имидазолом в том же буфере и анализируют методом Бредфорд и электрофорезом в ПААГ. Гель окрашивают Кумасси R-250 по стандартной методике и определяют относительное количество белка в полосе целевого продукта. Содержание рекомбинантного белка в штамме М. thermophila/pSAT1-AhA1 составляет не менее 30% от всех белков клеточной фракции.
Выход рекомбинантного белка составляет 8 9±7 мг из 1 л культуры.
Идентификацию полученного рекомбинантного полипептида проводят по первым 10 аминокислотам на автоматическом секвенаторе. Секвенирование препарата рекомбинантного белка, выделенного из клеток штамма М. thermophila/pSAT1-AhA1, показало, что N-концевая последовательность рекомбинантного белка соответствует первым 10 аминокислотам MAGLPVIMCL белка А1 из семян амаранта Amaranthus hypochondriacus.
Заявленное изобретение позволяет:
- с помощью использования рекомбинантного штамма-продуцента М. thermophila/pSAT1-AhA1 получать путем биосинтеза большое количество запасного белка А1 семян Amaranthus hypochondriacus L., что может быть использовано в животноводстве для разработки способов получения кормов из растительных субстратов и обогащения кормов сбалансированным по аминокислотному составу белком.
Claims (2)
1. Плазмида pSAT1-AhA1 размером 4680 пар оснований (п.о.), для синтеза белка А1 семян Amaranthus hypochondriacus и характеризующаяся наличием следующих фрагментов: NcoI/XbaI фрагмента ДНК размером 915 п. о., содержащего полноразмерную последовательность гена белка А1 семян Amaranthus hypochondriacus, как показано на фиг. 1.
2. Рекомбинантный штамм М. thermophila/pSAT1-AhA1, полученный путем модификации штамма М. thermophila F-859 плазмидой pSAT1-AhA1 по п. 1, - продуцент запасного белка А1 семян Amaranthus hypochondriacus.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017136594A RU2679390C1 (ru) | 2017-10-18 | 2017-10-18 | Рекомбинантная плазмидная ДНК pSAT1-AhA1, кодирующая запасный белок А1 семян Amaranthus hypochondriacus, и рекомбинантный штамм Myceliophthora thermophila/pSAT1-AhA1 - продуцент запасного белка А1 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017136594A RU2679390C1 (ru) | 2017-10-18 | 2017-10-18 | Рекомбинантная плазмидная ДНК pSAT1-AhA1, кодирующая запасный белок А1 семян Amaranthus hypochondriacus, и рекомбинантный штамм Myceliophthora thermophila/pSAT1-AhA1 - продуцент запасного белка А1 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2679390C1 true RU2679390C1 (ru) | 2019-02-07 |
Family
ID=65273806
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017136594A RU2679390C1 (ru) | 2017-10-18 | 2017-10-18 | Рекомбинантная плазмидная ДНК pSAT1-AhA1, кодирующая запасный белок А1 семян Amaranthus hypochondriacus, и рекомбинантный штамм Myceliophthora thermophila/pSAT1-AhA1 - продуцент запасного белка А1 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2679390C1 (ru) |
-
2017
- 2017-10-18 RU RU2017136594A patent/RU2679390C1/ru active
Non-Patent Citations (9)
| Title |
|---|
| GORINSTEIN S. et al., Characterisation of pseudocereal and cereal proteins by protein and amino acid analyses, Journal of the Science of Food and Agriculture, 2002, vol.82, N8, pp.886-891. * |
| RAN F. et al., Hsp90 Cochaperone Aha1 Is a Negative Regulator of the Saccharomyces MAL Activator and Acts Early in the Chaperone Activation Pathway, Journal of Biological Chemistry, 2010, vol.285, N18, pp.13850-13862. * |
| RAN F. et al., Hsp90 Cochaperone Aha1 Is a Negative Regulator of the Saccharomyces MAL Activator and Acts Early in the Chaperone Activation Pathway, Journal of Biological Chemistry, 2010, vol.285, N18, pp.13850-13862. GORINSTEIN S. et al., Characterisation of pseudocereal and cereal proteins by protein and amino acid analyses, Journal of the Science of Food and Agriculture, 2002, vol.82, N8, pp.886-891. TZFIRA Т. et al., pSAT vectors: a modular series of plasmids for autofluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants, Plant Mol Biol, 2005, vol.57, N4, pp.503-516. ПИСКУРЕВА В.А. и др. Использование отходов сельскохозяйственного производства для получения белково-углеводных кормовых добавок с разными функциональными свойствами, Вестник аграрной науки, 2010, т.27, н.6, стр.109-111. ГНЕУШЕВА И.А. и др., Биотехнологические подходы для получения белково-углеводных кормовых добавок для животноводства, ОрелГАУ, 2010, стр.45-48. ДЕДКОВ В.Н. и др., Биоконверсия соломы злак * |
| TZFIRA Т. et al., pSAT vectors: a modular series of plasmids for autofluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants, Plant Mol Biol, 2005, vol.57, N4, pp.503-516. * |
| VENSKUTONIS P.R. et al., Nutritional Components of Amaranth Seeds and Vegetables: A Review on Composition, Properties, and Uses, Comprehensive Reviewsin Food Scienceand Food Safety, 2013, vol.12, pp.381-412 * |
| ГНЕУШЕВА И.А. и др., Биотехнологические подходы для получения белково-углеводных кормовых добавок для животноводства, ОрелГАУ, 2010, стр.45-48. * |
| ДЕДКОВ В.Н. и др., Биоконверсия соломы злаковых культур грибами рода Trichoderma в кормовые продукты для животноводства, Вестник ОрелГАУ, 2012, т.37, н.4, стр.102-105. . * |
| ПИСКУРЕВА В.А. и др. Использование отходов сельскохозяйственного производства для получения белково-углеводных кормовых добавок с разными функциональными свойствами, Вестник аграрной науки, 2010, т.27, н.6, стр.109-111. * |
| ЧЕРНОВ И.А. и др., Специфика биосинтеза высоколизинового белка у растений рода Amaranthus l., состав, свойства и технология его выделения из фитомассы амаранта, Ученые записки казанского государственного университета. Естественные науки, 2007, т.149, н.4., стр.8-19. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ukaegbu-Obi | Single cell protein: a resort to global protein challenge and waste management | |
| US20160374364A1 (en) | Method of and system for producing a high value animal feed additive from a stillage in an alcohol production process | |
| Nangul et al. | Microorganisms: a marvelous source of single cell proteins | |
| Alves et al. | Microbial meat: A sustainable vegan protein source produced from agri-waste to feed the world | |
| CN103025862A (zh) | 新型破囊壶菌类微藻及用其生产生物油的方法 | |
| Bogale | Microbial protein production from agro-industrial wastes as food and feed | |
| SANTOS et al. | Use of products of vegetable origin and waste from hortofruticulture for alternative culture media | |
| CN106916752A (zh) | 制备纤维素酶和/或木聚糖酶的方法及其专用菌株 | |
| CN104087529B (zh) | 短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）JY2及其应用 | |
| Mojsov | New and future developments in microbial biotechnology and bioengineering | |
| RU2679390C1 (ru) | Рекомбинантная плазмидная ДНК pSAT1-AhA1, кодирующая запасный белок А1 семян Amaranthus hypochondriacus, и рекомбинантный штамм Myceliophthora thermophila/pSAT1-AhA1 - продуцент запасного белка А1 | |
| Soundarapandian et al. | Effects of chemical parameters on Spirulina platensis biomass production: Optimized method for phycocyanin extraction | |
| Abdel-Azeem et al. | Bioconversion of lignocellulosic residues into single-cell protein (SCP) by Chaetomium | |
| CN102978114A (zh) | 一株栅藻及其应用 | |
| CN102943049B (zh) | 一种固体发酵生产白地霉培养物的工艺 | |
| Kahil et al. | Economic co-production of cellulase and αamylase by fungi grown on agro-industrial wastes using solid-state fermentation conditions | |
| RU2680295C1 (ru) | Рекомбинантная плазмидная ДНК pSAT1-ZmZeinB1, кодирующая кормовой белок альфа-зеин В1 кукурузы вида Zea mays, и рекомбинантный штамм Myceliophthora thermophila/pSAT1-ZmZeinB1 - продуцент кормового белка альфа-зеин В1 | |
| Abodunde et al. | Conversion of Orange and Pineapple Fruit Peel Waste into Single Cell Protein Using Saccharomyces Cerevisiae | |
| KR101403489B1 (ko) | 신규한 셀룰로시마이크로비움 펀케이 ｈｙ―１３ 균주 및 이로부터 생산되는 자일라나제 | |
| Aguilar et al. | Microbial technology: advances and challenges | |
| CN110373339A (zh) | 一种降解蛋白质的产朊假丝酵母三基因表达菌株及其构建方法 | |
| Taiwo et al. | Valorization of Corn Steep Liquor for Improved Value-added Products: A Review | |
| Doelle | Socio-ecological biotechnology concepts for developing countries | |
| CN108077187A (zh) | 鸡、鸭粪结合凉粉加工厂凉粉草渣养殖蚯蚓的方法 | |
| CN108094327A (zh) | 猪粪结合凉粉加工厂凉粉草渣养殖蚯蚓的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20190802 |