CN110373339A - 一种降解蛋白质的产朊假丝酵母三基因表达菌株及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及遗传工程和发酵工程领域，提供一种降解蛋白质的产朊假丝酵母三基因表达菌株，所述产朊假丝酵母三基因表达菌株为将氨肽酶、羧肽酶和内切蛋白酶基因通过产朊假丝酵母表达载体整合至产朊假丝酵母基因组上构建而成。本发明对餐厨发酵残液进行处理，将其中的有机物进一步利用，相对于现有技术来说，将餐厨发酵液中大量的蛋白质分解转变成氨基酸，不仅可以解决残存的蛋白质污染问题，还可以生产出氨基酸，氨基酸是制药、生物饲料、有机肥的原材料，具有一定的经济价值。

Description

一种降解蛋白质的产朊假丝酵母三基因表达菌株及其构建 方法

技术领域

本发明涉及遗传工程和发酵工程领域，更具体地，涉及一种降解蛋白质的产朊假丝酵母双基因表达菌株及其构建方法。

背景技术

餐厨垃圾俗称泔水，是居民在生活中形成的固体废弃物，食品浪费的数量正在随着人口的快速增加和经济的快速发展而迅速增长，残留的肉类，蔬菜，油脂，米饭是餐厨垃圾中的主要物质。在化学成分上，主要含有纤维素类，蛋白质类，糖类，脂肪类等有机物成分，具有含水量高，有机物比例高，含盐量高的特点。由于餐厨垃圾产量巨大，金黄色葡萄球菌，沙门氏菌等多种有毒有害的病原微生物经常会在含有丰富的营养物质的餐厨垃圾中滋生。如果没有及时的加工处理，还会腐烂变质，产生NH₃和H₂S等大量带有臭味的气体和毒素等，不仅造成严重的空气问题，同时非法使用餐厨垃圾提取的废油已经对人的健康产生严重的危害。

根据统计，在餐饮行业中每年就有大约有4亿吨餐厨垃圾，造成的浪费总价值高达7500 亿美元，而且还在呈现不断增长的趋势。所有急需要找到一种切实有效的方法对餐厨垃圾进行综合利用，不合理的利用餐厨垃圾不仅会造成严重的资源的浪费，还会造成严重的环境污染。焚烧处理和用作饲料是对餐厨垃圾的传统的处理方法；焚烧不仅对餐厨垃圾的利用效率低下，而且会排出大量的二氧化碳，使全球气候变暖加剧，大量的含氮、含硫、二噁英等化合物的产生，不仅污染空气，也会对人的身体产生极大的危害。餐厨垃圾处理后做成饲料饲喂牲畜，饲料中含有大量的有毒有害微生物和难于降解的毒素，饲养牲畜后，不仅会容易造成牲畜致病，还会使毒素在牲畜体内富集，最终影响到人的健康，而且其中含有不同来源的大量生物蛋白，未经处理饲喂牲畜存在的潜在的生物安全风险，所有需要发展一种有效的方法，对餐厨垃圾进行综合的利用，既可以避免垃圾围城，保护环境，减数有害气体，温室气体的排出，也可以达到提升废物产品的利用价值，对资源达到综合的利用。

微生物发酵正在被国内外业界重视，发酵技术正在成为一种对餐厨垃圾综合利用的有效方式，真正达到资源节约和环境有好地目的。发酵残液，一般是指在工业生产应用中，原材料经过微生物的发酵后所产生的废渣或废液的总称。而餐厨乙醇发酵残液，是指原始的餐厨垃圾经过了油脂去除，酵母菌酒精发酵以及酒精蒸馏提取等一系列工艺流程得到的微生物未利用的废弃物。经过前面工艺中的油脂去除和酒精发酵，餐厨垃圾中原有的油脂类和糖类化合物基本被利用完，而餐厨垃圾中的蛋白质类化合物只有很少的一部分被微生物生长所利用，大部分蛋白质以废弃物的形式残留在发酵残液中，而且随着工业上对餐厨垃圾发酵的进一步研究和发展，必然会使发酵产生的残液越来越多，如果不经过有效的处理，随意排放，残液中大量的蛋白质类有机物，不仅会造成有毒有害微生物的大量繁殖，而且会对环境造成严重的危害，所以必须采取有效的处理方式，对餐厨发酵残液进行处理，而处理的关键是将其中的有机物进一步利用，将大量的蛋白质分解转变成氨基酸就成为一条可行的办法，不仅可以解决残存的蛋白质污染问题，氨基酸还是制药、生物饲料、有机肥的原材料，具有一定的经济价值。

发明内容

本发明旨在克服上述现有技术的至少一种不足，提供一种降解蛋白质的产朊假丝酵母三基因表达菌株及其构建方法，用于解决降解餐厨发酵液中蛋白质的问题。

本发明采取的技术方案是，提供一种降解蛋白质的产朊假丝酵母三基因表达菌株，所述产朊假丝酵母三基因表达菌株为将氨肽酶、羧肽酶和内切蛋白酶基因通过产朊假丝酵母表达载体整合至产朊假丝酵母基因组上构建而成。

本发明的重点在于构建了一种能够降解餐厨废弃物的产朊假丝酵母三基因表达菌株，将氨肽酶、羧肽酶和内切蛋白酶基因转入产朊假丝酵母并使其分泌表达，所选用的工具为产朊假丝酵母表达载体。

其中，氨肽酶可以从多肽链的N端开始水解肽键生产氨基酸，在生物体中广泛存在，产生氨肽酶的微生物主要包括假单胞菌属、乳酸杆菌属、芽孢杆菌属、放线菌等。目前在应用中的氨肽酶都是利用微生物发酵的代谢产物收集得到的，主要应用于蛋白质类水解液，脱除其中的苦味，另一方面可以与其他蛋白酶复合使用，蛋白质的水解程度可以进一步提高。酱油酿造，奶酪生产和其他蛋白水解产品可以节省成本和提高蛋白质利用率。

羧肽酶与氨肽酶相似，也是一种外切蛋白酶，可以有选择的从蛋白质的C端水解产生相应的氨基酸一种蛋白酶，在多种生物体中都能够找到羧肽酶酶分子的酶原形式。羧肽酶参与了机体中多个器官的新陈代谢。此外，在医药应用上，很多机体中产生的不良物质，都依赖于羧肽酶的水解。现在生产羧肽酶的主要来源是微生物自身代谢产生的羧肽酶或以微生物为宿主过量表达的羧肽酶。

内切蛋白酶，可以将蛋白质分子多肽链从中间打断成几段或几十段。广泛存在于生物体的消化，凝血和补体激活和补体激活生理功能等方面，其作用是通过识别相应的氨基酸残基链，活化的羟基与肽键的原子产生亲核反应。

产朊假丝酵母，在生产和生活中得到了广泛的应用，是美国食品和药品管理局认证的可视为安全的微生物菌株，产朊假丝酵母具有一系列优良的特性；培养条件简双，可以在一些简双的培养条件下就可以进行生长，而且具有五六碳糖双糖共转运系统，能够实现戊糖和己糖的共用，拓宽了应用范围；因自身不分泌胞外蛋白酶，产朊假丝酵母可以被应用于多种目标蛋白的表达，其本身作为一种生物安全性生物，只需要经过简双的分离纯化程序目标产物的分离，大大节约了生产成本。

进一步地，所述的产朊假丝酵母表达载体为产朊假丝酵母多基因共表达载体。

进一步地，所述产朊假丝酵母表达载体为pcGAPGA-pepA。

一种降解蛋白质的产朊假丝酵母三基因表达菌株的构建方法，包括以下步骤：

S1：获取氨肽酶基因表达盒；

S2：将上述氨肽酶基因表达盒与表达载体pcGAPGA-pepA连接及转化，得到同时含有氨肽酶和内切蛋白酶基因的表达载体；

S3：获取羧肽酶基因表达盒；

S4：将上述羧肽酶基因表达盒与S2得到的表达载体连接及转化，得到同时含有氨肽酶、羧肽酶和内切蛋白酶的三基因表达载体；

S5：将上述构建得到的重组三基因表达载体用限制性核酸内切酶切割，使之线性化后转化产朊假丝酵母，构建基因重组产朊假丝酵母三基因表达菌株。

进一步地，所述步骤S2中同时含有氨肽酶和内切蛋白酶基因的表达载体命名为GAP-pepA-HXT7-YPDF；所述步骤S4中同时含有氨肽酶、羧肽酶和内切蛋白酶基因的三基因表达载体命名为GAP-pepA-TEF1-YPDF-HXT7-pepF。

进一步地，所述步骤S5得到基因重组产朊假丝酵母三基因表达菌株命名为 Cu-coexpression。

进一步地，还包括重组蛋白SDS-PAGE分析和重组菌的生长曲线和酶活曲线测定。

进一步地，步骤S5中所述的转化是使用电转化法、冷冻法或化学试剂法进行转化。

进一步地，所述步骤S1中的氨肽酶为凝结芽孢杆菌的氨肽酶YPDF，所述步骤S2中的内切蛋白酶为黑曲霉中的内切蛋白酶pepA，所述步骤S3中的羧肽酶为黑曲霉中的羧肽酶pepF。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：餐厨垃圾中含有大量的营养物质，其中原有的油脂类和糖类化合物基本被利用完，而餐厨垃圾中的蛋白质类化合物只有很少的一部分被微生物生长所利用，大部分蛋白质以废弃物的形式残留在发酵残液中。鉴于此，本发明提供了一种降解餐厨废弃物的产朊假丝酵母双基因表达菌株，对餐厨发酵残液进行处理，将其中的有机物进一步利用，将大量的蛋白质分解转变成氨基酸，不仅可以解决残存的蛋白质污染问题，氨基酸还是制药、生物饲料、有机肥的原材料，具有一定的经济价值。

本发明的难点在于将氨肽酶、羧肽酶和内切蛋白酶基因通过产朊假丝酵母表达载体，一起转入产朊假丝酵母同时实现分泌表达。

附图说明

图1为本发明的GAP-pepA-TEF1-YPDF-HXT7-pepF构建流程图。

图2为GAP-pepA-HXT7-YPDF阳性转化子菌液PCR鉴定。

图3为GAP-pepA-TEF1-YPDF-HXT7-pepF重组载体菌液PCR电泳。

图4为含GAP-pepA-TEF1-YPDF-HXT7-pepF重组质粒的重组酵母基因组PCR电泳。

图5蛋白定量标准曲线。

图6为重组蛋白SDS-PAGE分析。

图7为三基因共表达酶活生长曲线。

具体实施方式

本发明附图仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。为了更好说明以下实施例，附图某些部件会有省略、放大或缩小，并不代表实际产品的尺寸；对于本领域技术人员来说，附图中某些公知结构及其说明可能省略是可以理解的。以下实施例中的产朊假丝酵母rDNA 序列如SEQ ID No.1所示，YPDF序列如SEQ ID No.2所示，AP1序列如SEQ ID No.3所示， AP2序列如SEQ IDNo.4所示，APC序列如SEQ IDNo.5所示，APS序列如SEQ IDNo.6所示，pepF序列如SEQ ID No.7所示，Bc-S1序列如SEQ ID No.8所示，Bc-S2序列如SEQ ID No.9所示。

实施例1GAP-pepA-TEF1-YPDF-HXT7-pepF表达载体的构建

表达载体构建流程图，如图1所示。

实施例2氨肽酶YPDF基因表达盒的获取

将带有质粒pcHXT7-rDNA-YPDF和质粒pcGAPGA-pepA的大肠杆菌在37℃，200rpm条件下培养过夜，提取质粒。利用BglII和BamHI是同尾酶的特性，将pcHXT7-rDNA-YPDF 质粒用内切酶BglII和BamHI同时切割，并对氨肽酶YPDF表达盒片段进行回收备用。用 BamHI切割pcGAPGA-pepA质粒，去磷酸化处理后回收备用，反应体系如下：

YPDF表达盒酶切体系：

载体酶切体系：

37℃水浴一个小时。

实施例3氨肽酶YPDF基因表达盒与表达载体pcGAPGA-pepA连接及转化

双酶切得到的氨肽酶YPDF基因表达盒，和经单酶切线性化的pcGAPGA-pepA载体用连接酶进行连接，转化大肠杆菌并对阳性重组子进行鉴定，连接及PCR反应体系如下：

连接体系：

PCR反应体系：

鉴定出的阳性重组子即为同时含有氨肽酶YPDF基因和内切蛋白酶pepA基因的质粒，命名为GAP-pepA-HXT7-YPDF。

用BglII和BamHI两种限制酶在重组质粒pcHXT7GA-rDNA-YPDF中切下YPDF表达盒，将YPDF表达盒连接到单酶切后的线性化载体中，构成重组质粒GAP-pepA-HXT7-YPDF，转化大肠杆菌后挑取阳性转化子进行菌液PCR鉴定，结果如图2所示，3-6号重组子扩增出目标条带，且大小与预期相符，表明YPDF表达盒已连接入pcGAPGA-pepA载体中，二基因共表达载体GAP-pepA-HXT7-YPDF构建成功。

M：DNAMarker2000；1-6：YPDF片段阳性克隆鉴定结果。

实施例4羧肽酶pepF基因表达盒的获取

将带有质粒pcTEF1-rDNA-pepF和质粒GAP-pepA-HXT7-YPDF的大肠杆菌在37℃，200rpm的条件下培养过夜后提取质粒。以质粒pcTEF1-rDNA-pepF为模板进行PCR扩增羧肽酶pepF表达盒后进行纯化备用。用BamHI切割GAP-pepA-HXT7-YPDF质粒，并且去磷酸化处理，并纯化回收线性化的GAP-pepA-HXT7-YPDF。反应体系如下：

PCR反应体系：

酶切体系：

实施例5羧肽酶pepF基因表达盒与表达载体GAP-pepA-HXT7-YPDF无缝连接及转化

在实施例4PCR得到的羧肽酶pepF基因表达盒，和单酶切线性化的 GAP-pepA-HXT7-YPDF载体片段进行无缝连接，并大肠杆菌转化，对阳性重组子进行菌落 PCR鉴定，连接及PCR反应体系如下：

线性化反应体系：

PCR反应体系：

鉴定出的阳性菌落同时含有氨肽酶YPDF基因、羧肽酶pepF基因和内切蛋白酶pepA基因，命名为GAP-pepA-TEF1-YPDF-HXT7-pepF表达载体。

通过PCR获得羧肽酶pepF表达盒，与单酶切后的线性化二基因共表达载体 GAP-pepA-HXT7-YPDF进行连接，构建三基因共表达载体 GAP-pepA-TEF1-YPDF-HXT7-pepF后，转化大肠杆菌，对重组子进行菌液PCR鉴定，结果如图3所示，2-4号重组子均扩增出目标条带，且大小与预期相符，表明pepF表达盒已连接入二基因共表达载体中，三基因共表达载体GAP-pepA-TEF1-YPDF-HXT7-pepF构建成功。

M：DNAMarker 2000；1-5：pepF片段阳性克隆鉴定结果。

实施例6GAP-pepA-TEF1-YPDF-HXT7-pepF表达载体线性化

由于表达载体GAP-pepA-TEF1-YPDF-HXT7-pepF的三个启动子中，只有CuGAP为产朊假丝酵母自身的启动子，ScTEF1和ScHXT7都为酿酒酵母启动子，所以选择CuGAP启动子上的SacI作为线性化位点，线性化反应体系如下：

37℃反应1h后纯化DNA，保存于-20℃备用。

实施例7产朊假丝酵母转化

(1)产朊假丝酵母感受态细胞的制备

(2)电击转化

向每管产朊假丝酵母感受态细胞中分别加入20μL(约5μg)的重组质粒，轻轻混匀，冰浴15min后转移至预冷的电转杯中；电压为1.8kv，电击5ms后，立即加入1mL预冷的1M山梨醇溶液并混匀，常温静置15min；在无菌条件下将电转杯中的菌液全部转移至无菌的4mL离心管中，加入2mL YPD液体培养基并混匀，于30℃，175rpm复苏4h；4,000 ×g离心8min后，倒弃大部分上清液，剩余200μL重悬菌体；将菌体重悬液全部涂于含 G418的YPD固体培养基上，30℃培养箱中倒置培养3-5天。

(3)产朊假丝酵母阳性重组子鉴定

用枪头的在平板上蘸取生长出重组子，放入具有G418抗性的YPD培养基中，在30℃， 200rpm恒温条件下进行培养，二十四小时后，对各个重组子按1％接种量将酵母接种至5ml YPD液体培养基，在30℃，200rpm条件下培养24h后，使用美基盐析法酵母基因组提取试剂盒SolPure Yeast DNA Kit提取基因组，然后用相应的引物进行PCR鉴定。

将得到质粒GAP-pepA-TEF1-YPDF-HXT7-pepF，线性化后电转产朊假丝酵母，30℃恒温条件下，在含G418的平板上培养2-3天，挑取长出的重组子，转移到液体培养基扩大培养，之后提取基因组进行PCR鉴定，能扩增出单一条带说明氨肽酶和羧肽酶基因已经成功转入产朊假丝酵母，如图4所示，构建的重组酵母，命名为：Cu-coexpression。

M：DNAMarker2000；1-5：YPDF基因阳性鉴定；6-10：pepF基因组阳性鉴定。

实施例8重组蛋白SDS-PAGE分析

重组产朊假丝酵母表达的三种蛋白酶均为分泌型蛋白，所以取重组产朊假丝酵母培养液上清直接进行SDS-PAGE检测。

(1)蛋白定量

为了在SDS-PAGE中控制相同的蛋白上样量，需要对提取的蛋白进行定量，具体步骤参考Easy II Protein Quantitave Kit(BCA)的步骤，绘制标准曲线，结果如图5所示。该曲线 R2值为0.999，可用于后续实验中蛋白含量的测定。

(2)SDS-PAGE分析

配胶：

样品处理：

蛋白样品： 800μg

5×Loading Buffer： 8μL

dd H2O： 补足至40μL

沸水煮5min后，8,000g离心3min。

点样：蛋白样品上样量为10-15μL，蛋白Marker上样量为4μL。

电泳：电压设置为100V，电泳3h。

切胶：将凝胶从胶板上取下来，放入考马斯亮蓝染色液中染色1h。

脱色：沸水浴约20min，至条带变清晰。

观察并保存：用凝胶成像仪观察条带并保存电泳图。

将产朊假丝酵母scTEF1-pepF培养液，产朊假丝酵母scHXT7-YPDF培养液，产朊假丝酵母cuGAP-pepA培养液，产朊假丝酵母Cu-coexpression培养液进行SDS-PAGE分析，结果如图6所示，2号泳道和4号泳道标注的位置为氨肽酶YPDF，内切蛋白酶pepA基因，大小分别为41kDa和46kDa；目标条带与预期大小一致。3号泳道标注位置为羧肽酶pepF，实际大小在54kDa，比预期50kDa大，可能是由于翻译后修饰引起的。5号泳道为三基因共表达，氨肽酶YPDF和内切蛋白酶pepA因分子量接近，可能发生了重叠，在54kDa附近有一条颜色较浅的条带为羧肽酶pepF。

M：蛋白标准分子量，1：阴性对照，2：产朊假丝酵母scHXT7-YPDF培养液，3：产朊假丝酵母scTEF1-pepF培养液，4：产朊假丝酵母cuGAP-pepA培养液，5：产朊假丝酵母 Cu-coexpression培养液。

实施例9重组菌的生长曲线和酶活曲线测定

本节比较了三基因共表达重组菌Cu-coexpression和三个经启动子优化后的单基因表达重组菌scTEF1-pepF，scHXT7-YPDF，cuGAP-pepA的生长情况和蛋白酶活，结果如图6所示。从图中发现，转入单个或三个蛋白酶的重组产朊假丝酵母生长速度减慢，经过84h的生长后才达到平台期，这可能是由于重组菌需要分泌表达外源蛋白酶基因，使整个菌株的载荷量变大，导致自身生长减缓；还可能是由于分泌表达的外源蛋白酶在培养液中影响了菌体自身的结构蛋白，对生长有不良影响。随着培养时间的增加，各重组菌分泌表达的蛋白酶酶活性也逐渐增加。cuGAP-pepA和Cu-coexpression重组菌的蛋白酶活在72h达到最高，分别为 17.1U/mL和14.7U/mL；cuGAP-pepA重组菌的蛋白酶活在60h达到最高，为18.4U/mL。三基因共表达重组菌Cu-coexpression在48h时酶活达到最高，为14.8U/mL，且持续至72h。培养72h后，所有重组产朊假丝酵母的酶活均明显下降，可能是由于较长时间的培养后，一方面菌体生长量下降，分泌的蛋白酶数量减少，另一方面蛋白酶自身也会相互攻击，使蛋白酶数量减少，导致酶活性下降。

图7三基因共表达酶活生长曲线。

在上述实施例1～9过程中用到的引物如表1所示，其中字母F代表正向引物，R代表反向引物，序号代表不同的引物组合。

表1

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明技术方案所作的举例，而并非是对本发明的具体实施方式的限定。凡在本发明权利要求书的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

序列表

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caggatggaa ccgttgtgcc ggtattccgc aatggggact gggccatcta atctaga 1257

<210> 5

<211> 1353

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 5

ctcgagatgg caaaagacat tacacgggaa atggcggagc ggttttcccg acaaatccgc 60

gaactgccgc aaaacaaagt gattcaaaat gcaatgatga aaaacgggat aaaggccgcg 120

acaatcaaca atgatgctgt ggtttctatg aatcacgtat tctcccacga aattgaaacg 180

ggaaaagtgt caaatcagaa acaaagcggg cgctgctgga tgtttgccgc cttaaatacg 240

tttacgcata agttaaatgc caaattcaga ttgaaagact ttgagctttc gcaaaactat 300

acgaatttct gggacaaatt tgaaaaagcc aattacttcc tggaaacgat gattgaaacc 360

gtagacgaac ctgtggaagg acggctcatt tcctggctgc ttgaaacccc gcagcaggac 420

ggcgggcagt gggatatgct cgtcgcgctc attaaaaaat acggcgttgt gccgaaacag 480

gtcatgccgg aaacgtataa cagcagcagc tcacgcgaac ttaattcgct tttgaatgcc 540

aaactccgcg aaaacgcggt gaaactgaga aaattgcacg cagcagggca gccggaagaa 600

gaattgcggc aagcgaaaga aggtatgctt gcagaagttt acaaattgct tgcctttgca 660

ctcggtgagc cgccgaagac ctttgatttt gaattccgcg ataccgacaa attgttccat 720

cgcgagcaaa atatcacccc gcaggcattt tttgagaaat acgtcgggtt tgacctcgac 780

aattacatta gcattatcaa tgcgccgaca agcgacaaac cgtacggcaa aacgtatacg 840

gtgcagtatt tgggcaatgt ggttggcggc aaaccggtca aatatttaaa tgtcgatatc 900

gaaaccttta aatcgctggc cgtaaaacag ctgaaggata accgcagcgt ctggttcggc 960

tgtgatgttg cagcatcatc agaccggaat gaaggcatca tggataccgg cctttttgat 1020

ttggaaaaag ctttcggatt ctcgttcgga atgaccaaag cagaacgcct cgattataaa 1080

gacagtgtga tgacgcatgc aatggtactg accggtgtca acctcgttga cggcaaaccg 1140

gacagatgga aagtggaaaa cagctggggt gaaaaagtgg gcaaagacgg ttattttgtc 1200

atgagtgacg cctggatgga tgaatatacg taccaaatcg tcattgacaa aaaatatttg 1260

ccggaggaat tgcaaaaagc atgggaacaa gatccgatcg ccctgaaacc ttgggatccg 1320

atggggtctc ttgcctggat gcattaatct aga 1353

<210> 6

<211> 1287

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 6

ctcgagatga aaaataataa acaggaggga atcgaaatgg ctttgccaaa ttttgaacag 60

aatttacaaa aatatgcgaa attgctcgtg acaaagggca tcaatgtaaa gcagggcgac 120

tgggtaaaag tatatattgc agtcgaccag gcaaaacttg cgcgccttgt cgtaaaagaa 180

gcgtatgcac taggcgcgga aaaagtaatc gtcgaatggt cggatgatga aattacaaaa 240

cagcattatc tgaatcagcc gcaggaagtg ctgacacata ttccggatta caaaattgcc 300

gagacggaag accatgtgct taaccataaa gtgagccggc tgtctattct ttcaagcgat 360

cccggcctgc tcaatgatgt cgatccgcac aaagtggccg cttatcaaaa tacagcagcg 420

aaagctttca aagcgcagcg ggttgccacg caaaatgacg atatcaaatg gacggttgct 480

gcagcggcgg gggccggatg ggcaaaagca gtattcccgg atttagaaac cgaagaagca 540

caagtcgatg cgctttggga tcagattttt aaaacatgcc gtgtctacgc ggacgacccg 600

gttgccgcct gggaacagca taaacagacg ttaaatgaaa aagcggcgaa gttaaacgac 660

attcaattcg atgcccttca ttatacggcg ccggggacgg accttacact cggccttccg 720

aaaaaccata tttgggccag tgcgggcagc gtgaacccga aaggcgaaga attcattgcc 780

aatatgccaa cggaggaagt gtttactgca ccggatacgc acaggatgga aggcgtcgtg 840

cgcagcacaa aaccattaag ttatgcaggc actttaatcg aaggcattgt tgtccacttt 900

aaagacggga aaatcgtcga tatttctgct gaaaaaggcg aagaagcgat caaaaaactc 960

gtgtttgaaa acgagggtgc aacagggctc ggggaagttg cgcttgtacc ggatccgtcg 1020

ccgatttcac agtccggcat tacatttttc aatacattgt ttgacgagaa tgcctcgaac 1080

cacctggcca ttggtgcagc ctatccgaca acgatccagg gcggcacgaa aatgagcgaa 1140

gaagaactgt taaaacacgg catgaatgtc tccaatgtcc acgttgactt catgatcggc 1200

tctgctgata tgaatattga cggcatcaag caggatggaa ccgttgtgcc ggtattccgc 1260

aatggggact gggccatcta atctaga 1287

<210> 7

<211> 1608

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 7

ctcgagatgc tgtttcgcag tctgttgtcg acggctgtcc tagccgtctc gctgtgcacg 60

gataatgctt cagctgctaa acatggtcga tttggccaaa aagctcgcga cgccatgaac 120

atcgcgaagc gttccgctaa cgccgtgaaa cactcgttga agatccctgt cgaggactat 180

cagttcttga acaacaagac taagccttac cgcgtggaaa gcctgcctga tgttcacttc 240

gatctgggcg agatgtattc cggcttggtc cctattgaga agggcaacgt gtcacggtcc 300

cttttctttg tcttccagcc cactattggc gagcctgtgg atgagatcac catctggctg 360

aatggtggcc ctggttgcag ttcccttgag gcctttctcc aggagaatgg tagattcgtg 420

tggcagcctg gaacctacca gcctgttgag aacccatact cgtgggtgaa tctcaccaat 480

gttctgtggg ttgaccaacc tgtgggaacg ggattctctc tgggtgtccc aaccgctacg 540

tccgaggagg agattgctga agactttgtg aagttcttca agaactggca gcagatcttt 600

gggatcaaaa acttcaagat ctatgttact ggagaaagtt atgcgggccg ttatgttcct 660

tacatatccg ctgctttcct agatcagaat gatacagaac acttcaacct aaaaggtgca 720

ctggcatatg atccctgtat tggtcagttt gactacgtgc aggaggaagc acctgttgtt 780

ccctttgtcc agaagaacaa tgccctcttc aatttcaatg caagcttttt ggcggaacta 840

gagagcatcc atgagcaatg tggatacaag gatttcatcg accagtatct agtcttccca 900

gcatccggtg tccagccgcc aaaggctatg aactggagcg atcccacctg tgatgtttat 960

gacatcgtta ataacgccgt cctggatccc aacccgtgct tcaaccccta cgaaatcaac 1020

gagatgtgcc ccattctctg ggacgttctt ggattcccca ccgaagtcga ctatctccct 1080

gcgggcgcca gcatctactt tgaccgcgct gatgttaagc gtgccatgca cgctcctaac 1140

atcacctggt ccgagtgctc ggtggagagc gtctttgtcg ggggcgacgg cggtcccgag 1200

caggagggcg actactcggc caaccccatc gagcatgtct tgccccaggt catcgaaggc 1260

accaaccgag ttctgatcgg taacggtgat tatgacatgg tcatccttac caacggcacc 1320

cttctctcga tccagaacat gacatggaat ggaaagcttg gattcgacac ggcccccagc 1380

acccccatca acatcgacat ccctgacctg atgtacaatg aagtgttcat tgagaacggc 1440

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tgggctgaga ccttccagag cggacacatg cagccccaat tccaacccag agtgtcatac 1560

cgtcaccttg agtggctgct tggccggcgt gataccctgt aatctaga 1608

<210> 8

<211> 927

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 8

ctcgagatga gaaaagggaa acgattacag gcgggagata cgatcgggct ggtcgcgcct 60

gcaagcccgg tctcaatcga aaggcttcaa actgctgttg cgaaattgcg gcggctcggt 120

ttccgggtaa aagtgcgaga aaatgcggag aaagtatacg gtgggtatat ggccggtacg 180

ccgcttgaac gggcagccga tctgcatgcg atgtttgcag acgatgacgt gcgggcaatt 240

ctttgtttgc gcggcgggta cgggacaccg caaattttac cgtatctcga cgttgaatgg 300

atccgggaga atccgaaatt atttatcggt tacagcgata ttacagcact acacatcgtt 360

ttccagcaaa aatgcggcct cgccacgatc catggcccga tggcggctgt cgaatttatc 420

acagacgatg cgctttcggt acaatcattg ctcaagctgg cgtcaaccgg tgttcctacc 480

ggcagttaca cgggggaagc gtggggtgaa ggggtcatga cagcgccgct tacaggcggg 540

aatctgtcat taatctgcgc actgatggga acgccgtttg aaatcgatac aagcggaaaa 600

attctttttc ttgaagaagt gcatgaagag ccatatgcga tcgaccggat gctgacccag 660

cttcagcttt ccggaaaact ggatgacgcc tccgggtttg tgctcgggca atggacggac 720

tgtgagccgg aagcatacgc ggatgggttt acggcacagg atgtcctgaa aaagtttttt 780

tacgggagcg gtaagccggt gcttgccggc atacagtccg ggcacggtac cccgaatctg 840

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gaaaccattg tcgttgaata atctaga 927

<210> 9

<211> 1536

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 9

ctcgagatga tgggaacaga gtcgattgaa aaactggagc aggacttttt ggcatatgtc 60

aaaaaaatca aagcttatga agaagcgctc gccctcatat actgggattt gcggaccggc 120

gcgccgaaaa aaggcgtcgg gcagcgcgcg gaagtgatcg gcattttatc gggtgaagtc 180

tttgacatgc aaacttcaaa agaaatggcc gaatttttgg agaagctttt gccgcacaag 240

cagcaattgc cggaacggac agccggtaca ttggaagaat gccggaaaac atacgaacgc 300

agcaaaaaaa tcccgcctga cgaataccag gcttatacgg tgctcgtctc gaaagcggaa 360

aatgtttggg aagaagcaaa ggaaaaagca gacttctcct tgttcaagcc ttatctcgaa 420

caaatcgtgg cattcaaaaa gaaatttgtc cgctactggg ggtatgaagg ccatccgtat 480

aatcccctgc tcgatctgta tgaaccgggc atgacggtcg atgtgctcga ccgtgtgttc 540

aaacaagtga aggatgcgat tgtgccgctt gtccagaaaa tcagtatgtc ggaagaaaaa 600

ccggatacgg catttctttt tcacccgttc ccgaaagaaa agcaaaaagc gtttacgctt 660

gaaattctaa agcaaatggg ctttgacttt gaggcgggac ggctggatga aacggtgcat 720

ccgtttgcaa ccggcatcaa ccagggggat gtgcggatta cgacacgtta taatgaaaac 780

gactggcgcg tcgatgtgtt cggtgtcatg catgaaggcg ggcacgcttt gtatgagcag 840

catatttcaa aagatctgtc gggtacgccg cttgcagaag gcgcgtcaat ggggatacac 900

gaatcacaat ccctgttttt tgaaaacatc atcggccgtt cttttccgtt ctggaagaaa 960

aattatccgc ttttgaaaca gtttgcatcc gggcagtttg atgacgtgcc gcttgaagca 1020

ttttaccgtg cagtgaacga ggcgaaacca tccctgatcc ggattgaagc cgatatgctg 1080

acgtatccgc ttcatattat ggtgcggtat gaaattgaaa aagcgctcct caatgatgaa 1140

atcgaaatcg gggacctccc ggaaatctgg aatgcgaaat atgaggacta tcttggcatc 1200

cggccggcac atgacgggga aggcgtcctc caggatgtgc attgggccgg cggggatttc 1260

ggctattttc cgtcttatgc gctcggcctg atgtacgccg cccagttcaa acatgcgatg 1320

ttaaaatcgc ttccagattt tgacaagctt gtggaatcgg gcaatctgga gccggtccga 1380

gaatggctca cggcgcatgt tcaccggttc ggcaaattga aaaaacctgc cgatattttg 1440

cgcgatgcca ctggtgaagc gctcaacccg aaatacttga ttgattactt aaccgaaaaa 1500

tataccgatg tataccggat caaagattaa tctaga 1536

Claims (9)

1.一种降解蛋白质的产朊假丝酵母三基因表达菌株，其特征在于，所述产朊假丝酵母三基因表达菌株为将氨肽酶、羧肽酶和内切蛋白酶基因通过产朊假丝酵母表达载体整合至产朊假丝酵母基因组上构建而成。

2.根据权利要求1所述的一种降解蛋白质的产朊假丝酵母三基因表达菌株，其特征在于，所述的产朊假丝酵母表达载体为产朊假丝酵母多基因共表达载体。

3.根据权利要求1所述的一种降解蛋白质的产朊假丝酵母三基因表达菌株的构建方法，其特征在于，所述产朊假丝酵母表达载体为pcGAPGA-pepA。

4.根据权利要求1至3任一项所述的一种降解蛋白质的产朊假丝酵母三基因表达菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：获取氨肽酶基因表达盒；

S2：将上述氨肽酶基因表达盒与表达载体pcGAPGA-pepA连接及转化，得到同时含有氨肽酶和内切蛋白酶基因的表达载体；

S3：获取羧肽酶基因表达盒；

S4：将上述羧肽酶基因表达盒与S2得到的表达载体连接及转化，得到同时含有氨肽酶、羧肽酶和内切蛋白酶的三基因表达载体；

S5：将上述构建得到的重组三基因表达载体用限制性核酸内切酶切割，使之线性化后转化产朊假丝酵母，构建基因重组产朊假丝酵母三基因表达菌株。

5.根据权利要求4所述的一种降解蛋白质的产朊假丝酵母三基因表达菌株的构建方法，其特征在于：所述步骤S2中同时含有氨肽酶和内切蛋白酶基因的表达载体命名为GAP-pepA-HXT7-YPDF；

所述步骤S4中同时含有氨肽酶、羧肽酶和内切蛋白酶基因的三基因表达载体命名为GAP-pepA-TEF1-YPDF-HXT7-pepF。

6.根据权利要求4所述的一种降解蛋白质的产朊假丝酵母三基因表达菌株的构建方法，其特征在于，所述步骤S5得到基因重组产朊假丝酵母三基因表达菌株命名为Cu-coexpression。

7.根据权利要求4所述的一种降解蛋白质的产朊假丝酵母三基因表达菌株的构建方法，其特征在于，还包括重组蛋白SDS-PAGE分析和重组菌的生长曲线和酶活曲线测定。

8.根据权利要求4所述的一种降解蛋白质的产朊假丝酵母三基因表达菌株的构建方法，其特征在于，步骤S5中所述的转化是使用电转化法、冷冻法或化学试剂法进行转化。

9.根据权利要求4所述的一种降解蛋白质的产朊假丝酵母三基因表达菌株的构建方法，其特征在于，所述步骤S1中的氨肽酶为凝结芽孢杆菌的氨肽酶YPDF，所述步骤S2中的内切蛋白酶为黑曲霉中的内切蛋白酶pepA，所述步骤S3中的羧肽酶为黑曲霉中的羧肽酶pepF。