CN106701606A - 一种能降解利用餐厨废弃物的基因工程产朊假丝酵母及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种能降解利用餐厨废弃物的基因工程产朊假丝酵母。该基因工程产朊假丝酵母是通过产朊假丝酵母多基因共表达载体将α‑淀粉酶、糖化酶和酸性蛋白酶基因整合至产朊假丝酵母基因组上，并正确表达这三种酶而获得。其中α‑淀粉酶和糖化酶为表面展示表达，酸性蛋白酶为分泌表达。通过成功同时表达α‑淀粉酶、糖化酶和酸性蛋白酶，本发明的基因工程产朊假丝酵母能高效的降解餐厨废弃物种的主要应用成分淀粉及蛋白质，为酵母生长发酵提供碳源和氮源，实现餐厨垃圾到乙醇的高效转化。

Description

一种能降解利用餐厨废弃物的基因工程产朊假丝酵母及其构 建方法

技术领域

本发明涉及遗传工程及发酵工程领域，尤其涉及一种能降解利用餐厨废弃物的基因工程产朊假丝酵母及其构建方法。

背景技术

餐厨废弃物是指家庭、食堂以及餐饮行业的食物废料和残余，是城市生活垃圾的重要组成部分。餐厨废弃物含水量高、营养物质丰富，其中有机物含量占干物质的95％以上，富含淀粉、糖类、蛋白质、脂肪等。餐厨废弃物同时还含有维生素、氮、磷、硫、钾、钙、镁等微量元素，营养元素齐全，能够被生物再利用。但是，正是由于餐厨废弃物含水量高、营养物质丰富，在常温条件下微生物会利用各类有机物和无机盐快速繁殖进行代谢，使餐厨废弃物腐烂发臭、污染环境，为处理带来极大麻烦。餐厨废弃物数量巨大，在我国每年的餐厨废弃物产量在6000万吨以上，但是，目前大部分的餐厨废弃物被用来喂猪、填埋，甚至制造“地沟油”，造成了严重的环境污染，仅少部分得以合理利用，比如焚烧、堆肥和沼气等等，但经济效益低下。因此，寻找一种能将餐厨废弃物进行充分资源化利用的办法，是餐厨废弃物处理面临的重要课题。

由于餐厨废弃物富含淀粉、糖类、蛋白质等有机物，因此是一种理想的可再生物质。利用餐厨废弃物作为原料生产非粮燃料乙醇，是非常有前景的一个发展方向。一方面，可以解决餐厨废弃物资源化利用的问题，既可以变废为宝，提高经济效益，又可以解决环境污染问题，具有巨大的社会效益；另一方面，以餐厨废弃物为原料，可以解决目前我国燃料乙醇生产原料以粮食性淀粉为主，推高粮食价格，造成粮食危机的问题。

产朊假丝酵母(Candida utilis)，又称产朊圆酵母或食用圆酵母，是美国食品和药品管理局(FDA)认证的安全酵母(GRAS,Generally Recognized as Safe)，也是我国食品药品监督管理局认证的“可用于保健食品的真菌”。产朊假丝酵母是一种重要的工业酵母，被用于生产多种高附加值的生物制剂，如谷胱甘肽、RNA、淀粉酶、L-乳酸、类胡萝卜素等。与酿酒酵母类似，产朊假丝酵母可以利用葡萄糖发酵产乙醇，而且糖醇转化率与酿酒酵母相当。而且，与酿酒酵母相比，产朊假丝酵母又具有以下优势：(1)产朊假丝酵母属于克雷布特效应阴性菌(Crabtree-negative)，在富含葡萄糖的培养基中生长时，呼吸作用不受抑制，不产生乙醇；在严格好氧的条件下能够快速生长；(2)产朊假丝酵母发酵密度高，在有效的连续培养条件下，可以实现高密度培养，细胞干重可达92g/L，有利于高效产出所需产品；(3)产朊假丝酵母能够利用廉价的糖蜜和木材水解液作为养分生长，节约生产成本；(4)产朊假丝酵母可以同时将戊糖和己糖作为碳源；(5)产朊假丝酵母不仅适应多种碳源和氮源(包括尿素和硝酸)，其蛋白质含量和维生素B含量比酿酒酵母高；(6)它的分泌蛋白质组不含任何蛋白酶，有利于其作为宿主菌表达外源蛋白；(7)产朊假丝酵母是一种可食用的、安全的单细胞蛋白，其产物和菌体自身可直接作为添加剂应用于食品、医药和化妆品行业，无需经过复杂的分离纯化程序，既省时又省力。

但是产朊假丝酵母缺乏有效降解淀粉生成葡萄糖、降解蛋白质生成多肽和氨基酸的酶，在自然条件下不能直接利用餐厨废弃物中的淀粉和蛋白质作为碳源和氮源来发酵产生乙醇。因此，为了以餐厨废弃物作为原料发酵生产乙醇，必须通过基因工程，将能降解淀粉和蛋白质的酶的基因导入产朊假丝酵母中，以弥补其降解餐厨废弃物能力的缺陷，使重组产朊假丝酵母可以利用自身合成的淀粉酶和蛋白酶将餐厨废弃物中的淀粉和蛋白质降解成为可以利用的碳源和氮源，从而实现利用餐厨废弃物发酵生产燃料乙醇的工业化目的。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种能降解利用餐厨废弃物的基因工程产朊假丝酵母。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下方案实现：

一种能降解利用餐厨废弃物的基因工程产朊假丝酵母的构建方法，所述产朊假丝酵母为将α-淀粉酶(α-amylase，amy)基因、糖化酶(glucoamylase，ga)基因和酸性蛋白酶(acid proteinase,ap)基因通过产朊假丝酵母多基因共表达载体(pCuIKP)整合至产朊假丝酵母基因组上构建而成。

本发明所述整合至产朊假丝酵母基因组的α-淀粉酶来源于米曲霉、糖化酶和酸性蛋白酶来源于黑曲霉。所述α-淀粉酶和糖化酶为表面展示表达；所述酸性蛋白酶为分泌表达。

本发明所述的α-淀粉酶、糖化酶和酸性蛋白酶的DNA序列为根据产朊假丝酵母的密码子偏好性重新设计并人工合成所得，且α-淀粉酶和糖化酶的3’端加上酿酒酵母α凝集素的3’跨膜区序列，使其能固定到产朊假丝酵母表面，实现表面展示表达。所使用酿酒酵母α凝集素的序列同样针对产朊假丝酵母的密码子偏好性进行密码子优化。α-淀粉酶的序列如SEQ ID NO.1所示；糖化酶的序列如SEQ ID NO.2所示；酸性蛋白酶的序列如SEQ ID NO.3所示。

所述产朊假丝酵母多基因共表达载体(pCuIKP)为以酿酒酵母多基因共表达载体(pScIKP)为基础，去除pScIKP的rDNA序列，以产朊假丝酵母的甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子替换pScIKP的酿酒酵母磷酸甘油酸激酶启动子而得。具体改造步骤如下：

1)使用限制性内切酶XbaI和SacI将pScIKP的rDNA片段切除，然后单链特异性核酸内切酶(S1nuclease，Takara)将酶切所得突出末端平滑化后再DNA连接酶将载体环化得到去掉rDNA的载体；

2)通过PCR扩增，获得产朊假丝酵母的甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子(CuGAP)DNA片段；

3)使用限制性内切酶NheI和BamHI分别对CuGAP片段和1)所得载体进行双酶切，然后将CuGAP连入载体，得到以CuGAP取代了PGK启动子的产朊假丝酵母表达载体pCuIKP。

所述产朊假丝酵母构建方法具体如下：

S1：根据产朊假丝酵母的密码子偏好性，按照α-淀粉酶、糖化酶和酸性蛋白酶的氨基酸序列，分别合成各自的DNA序列，同时在序列两端加上合适的限制性内切酶识别位点：BamHI和SpeI。使用限制性内切酶BamHI和SpeI对产朊假丝酵母多基因共表达载体、酿酒酵母多基因共表达载体，以及SEQ ID NO.1所示的α-淀粉酶基因、SEQ ID NO.2所示的糖化酶基因和SEQ ID NO.3所示的酸性蛋白酶基因进行双酶切，纯化回收所需片段；

S2：使用DNA连接酶将α-淀粉酶基因和糖化酶基因分别连接入pScIKP，将酸性蛋白酶基因连入pCuIKP，形成三个重组单基因表达载体；

S3：使用限制性内切酶将含有载体启动子和终止子片段的完整的α-淀粉酶基因表达盒和糖化酶基因表达盒从重组单基因表达载体上切下，然后以串联表达盒的形式逐个接入带有酸性蛋白酶基因的单基因表达载体中，构建出α-淀粉酶、糖化酶和酸性蛋白酶三基因共表达载体；

S4：使用限制性内切酶SacI对上述构建的三基因共表达载体进行单酶切，使其线性化后将其转入产朊假丝酵母，并整合到其基因组上，获得能降解利用餐厨废弃物的基因工程产朊假丝酵母。

步骤S3中，所述三基因共表达载体的构建包括如下步骤：

S11：使用限制性内切酶NheI和XbaI对α-淀粉酶和糖化酶单基因表达载体进行双酶切，回收带有载体启动子和终止子的α-淀粉酶和糖化酶基因的完整表达盒；

S12：使用限制性内切酶NheI对酸性蛋白酶单基因表达载体进行酶切，然后利用NheI和XbaI的同尾酶特点，将糖化酶基因表达盒连入酸性蛋白酶单基因表达载体，构建糖化酶和酸性蛋白酶二基因表达载体。

S13：使用限制性内切酶NheI对步骤S12所构建的二基因表达载体进行酶切，然后将α-淀粉酶基因表达盒连入二基因表达载体，构建出α-淀粉酶、糖化酶和酸性蛋白酶三基因共表达载体。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明利用产朊假丝酵母代替乙醇发酵工业常用的酿酒酵母，其具有以下优势：首先，产朊假丝酵母具有和酿酒酵母同样的安全性，以及相近的乙醇发酵能力；其次，产朊假丝酵母可利用糖蜜和木材水解液生长，可利用己糖和戊糖，具体比酿酒酵母更宽的糖谱及更高的适应性；再次产朊假丝酵母是克雷布特效应阴性菌，可以实现比酿酒酵母更高的培养密度，在菌种生产阶段可以收获更多的菌体，节约培养时间及成本。

本发明所述的基因工程产朊假丝酵母，其α-淀粉酶和糖化酶为表面展示表达，酸性蛋白酶为分泌表达。因为α-淀粉酶和糖化酶为淀粉降解所必需的酶，为了使基因工程菌种能更好的利用餐厨废弃物中的淀粉物质，需要在接入发酵菌株的同时接入淀粉降解酶。如果分泌表达，基因工程菌株自身不带要酶，则需要预先经过逐级放大培养，以产生足够的降解酶，才能接入餐厨废弃物，造成操作上的复杂性；而且接入体积通常为所处理的餐厨废弃物的10％，对于工业发酵而言，大大增加了发酵菌株准备所需的设备成本。而表面展示表达，可以在菌种生产的过程中同时生产淀粉酶，可以制备成活性干酵母同时保留淀粉酶的活性。在降解餐厨废弃物前只需要经过简单的菌种活化，即可接入餐厨废弃物中。所需体积仅为0.05％，大大简化了操作。而且以活性干酵母的形式制备菌种，便于保藏，非常适合工业化应用。

附图说明

图1为产朊假丝酵母表达载体pCuIKP的构建；

图2为α-淀粉酶(图2b)、糖化酶(图2c)、酸性蛋白酶(图2a)单基因表达载体的构建；

图3为α-淀粉酶、糖化酶、酸性蛋白酶三基因共表达载体的构建；

图4为基因工程产朊假丝酵母表达淀粉酶活性检测；

图5为基因工程产朊假丝酵母表达蛋白酶活性检测；

图6为基因工程产朊假丝酵母发酵餐厨废弃物产乙醇结果。

具体实施方式

为了让本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图对本发明作进一步阐述。

实施例

本实施例所用的产朊假丝酵母购自广东省微生物菌种保藏中心(编号：GIM2.176)；载体pScIKP为暨南大学分子生物研究中心构建并保存。

一、产朊假丝酵母表达载体pCuIKP的构建

1、使用限制性内切酶XbaI和SacI双酶切切割酿酒酵母表达载体pScIKP，切除掉pScIKP的酿酒酵母rDNA序列片段。

2、使用单链特异性核酸内切酶(S1nuclease，Takara)将上述步骤1双酶切所产生的突出末端切除，得到平末端的片段；然后使用T4DNA连接酶，将所得平末端片段环化，得到去除了rDNA的载体。

3、参照NCBI公布的产朊假丝酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子(CuGAP)序列(Accession：FJ664342)，用Primer 3软件设计引物，同时添加相应的酶切位点：

CuGAP-F:5'-GCTAGCTTACAGCGAGCACTCAAATCTG-3'

NheI

CuGAP-R:5'-GGATCCTATGTTGTTTGTAAGTGTGTTTTGTATCTG-3'

BamHI

以产朊假丝酵母GIM2.176的基因组DNA为模板，通过PCR扩增反应获得CuGAP启动子片段，将PCR扩增产物连接到pMD18-T载体(Takara)上，测序验证。

其PCR反应条件为：

4、以限制性内切酶NheI和BamHI对上述步骤2所得载体及上述步骤3所得经测序验证的CuGAP片段；然后以T4DNA连接酶将酶切后的CuGAP连入载体，得到产朊假丝酵母表达载体pCuIKP(如图1)。

二、α-淀粉酶、糖化酶、酸性蛋白酶单基因表达载体的构建

1、根据NCBI公布的米曲霉α-淀粉酶基因amy(Accession：XM_001821384)，黑曲霉糖化酶基因ga(Accession：XM_001390493.1)和酸性蛋白酶基因ap(Accession：XM_001401056.2)的氨基酸序列参照产朊假丝酵母的密码子偏好性进行密码子优化，并合成得到优化后的DNA序列(见SEQ.ID1-3)，α-淀粉酶以及糖化酶分别融合了酿酒酵母α凝集素羧基端的锚定序列以实现表面展示表达。所合成序列已克隆至载体pUC57上，分别命名为pUC57-amy、pUC57-ga和pUC57-ap；

2、使用限制性内切酶BamHI和SpeI对pScIKP、pCuIKP、pUC57-amy、pUC57-ga和pUC57-ap进行双酶切，并回收纯化所需载体及基因片段；

3、使用T4DNA连接酶，将酸性蛋白酶基因连入pCuIKP载体，得到酸性蛋白酶单基因表达载体pCuIKP-ap(如图2a)；

4、使用T4DNA连接酶，将α-淀粉酶基因连入pScIKP载体，得到α-淀粉酶单基因表达载体pScIKP-amy(如图2b)；

5、使用T4DNA连接酶，将糖化酶基因连入pScIKP载体，得到糖化酶单基因表达载体pScIKP-ga(如图2c)。

至此，三个基因的单基因表达载体构建完毕。

三、α-淀粉酶、糖化酶、酸性蛋白酶三基因共表达载体的构建及转化产朊假丝酵母

1、使用限制性内切酶NheI对pCuIKP-ap进行单酶切，然后对酶切后产物进行去磷酸化，获得具有NheI突出末端的pCuIKP-ap；

2、使用限制性内切酶NheI和XbaI对pScIKP-ga进行双酶切，然后回收带有载体启动子和终止子的糖化酶基因的完整表达盒；

3、利用NheI和XbaI是同尾酶，具有相同突出末端的特点，使用T4DNA连接酶将上述步骤1和2所得的载体和糖化酶基因表达盒连接，获得二基因表达载体pCuIKP-ga-ap；

4、使用限制性内切酶NheI对pCuIKP-ga-ap进行单酶切，然后对酶切后产物进行去磷酸化，获得具有NheI突出末端的pCuIKP-ga-ap；

5、使用限制性内切酶NheI和XbaI对pScIKP-amy进行双酶切，然后回收带有载体启动子和终止子的α-淀粉酶基因的完整表达盒；

6、利用NheI和XbaI是同尾酶，具有相同突出末端的特点，使用T4DNA连接酶将上述步骤4和5所得的载体和α-淀粉酶基因表达盒连接，获得三基因表达载体pCuIKP-amy-ga-ap(如图3)；

7、将上述步骤6得到的三基因共表达载体pCuIKP-amy-ga-ap用限制性内切酶SacI线性化后，用电穿孔转化法转入产朊假丝酵母GIM2.176中，在G418的浓度为300μg/ml的YPD琼脂平板上培养3～4d后，挑取能够正常生长的菌落即为转有上述重组质粒的转化子。以菌落PCR鉴定阳性转化子，即为本发明所述的能降解餐厨废弃物的基因工程产朊假丝酵母。

四、基因工程产朊假丝酵母表达淀粉酶及蛋白酶活性检测

1、将上述“三、α-淀粉酶、糖化酶、酸性蛋白酶三基因共表达载体的构建及转化产朊假丝酵母”所得阳性基因工程产朊假丝酵母接种至5ml YPD培养基中，30℃、200rpm条件下培养活化24h；

2、将活化的菌种，以1：10的比例接种至100ml YPD培养基中，30℃、200rpm条件下培养72h后，离心分别收集菌体和上清。菌体用于测定淀粉酶活；上清用于测定蛋白酶酶活；

3、淀粉酶活的测定：称取一定量的菌体，加入1ml pH5.5的醋酸-醋酸钠缓冲液洗涤菌体两遍，洗去残余的培养基。然后加入1ml pH5.5的醋酸-醋酸钠缓冲液重悬菌体，吸取200μL菌体，加入300μL pH5.5的醋酸-醋酸钠缓冲液，再加1％(w/v)的可溶性淀粉溶液400μL充分混匀，60℃水浴条件下反应30min，加入100μL 0.1M的盐酸溶液冰浴终止反应。采用DNS法测定所生成的还原糖的总量，计算淀粉酶活。酶活力单位定义为：1g菌体在60℃条件下1min水解淀粉产生1μmol葡萄糖当量的还原糖的酶量为一个酶活力单位，用U/g表示。

结果显示经72h培养后，本发明所述基因工程产朊假丝酵母的淀粉酶活为2477U/g。

4、蛋白酶的酶活测定：吸取1.0ml上清，40℃水浴预热2min。同时取适量1％酪素溶液在40℃水浴预热3～5min，然后取其1.0ml，加入到经预热的上清中，立即开始计时，于40℃水浴中精确反应10min，反应后立即加入2.0ml0.4M三氯乙酸，摇匀，取出静置10min，过滤；取滤液1.0ml，加入0.4M碳酸钠溶液5.0ml，福林试剂1.00ml，置于40℃水浴中显色20min，取出后室温冷却。用10mm比色皿，在波长660nm处用分光光度计分别测定其吸光度，根据L-酪氨酸标准曲线，计算酸性蛋白酶的酶活。酶活单位定义为：1ml酶液在40℃和pH值为3.0条件下，1min水解酪素产生1微克酪氨酸的酶量为1个酶活力单位，以U/ml表示。

结果显示经72h培养后，本发明所述基因工程产朊假丝酵母的蛋白酶活为231U/ml。

5、水解圈实验：将上述“三、α-淀粉酶、糖化酶、酸性蛋白酶三基因共表达载体的构建及转化产朊假丝酵母”得到的具有G418抗性的转化子菌落分别接种至含有1％可溶性淀粉和1％酪素的YNBS固体培养基(YNB 6.7g/l，可溶性淀粉10g/l，琼脂粉15g/l)上，在30℃培养箱中孵育3h后，分别观察水解圈的形成(淀粉板需先经过碘熏)。结果如图4和图5所示表明转化子可以表达淀粉酶、糖化酶及酸性蛋白酶，可以降解利用培养基淀粉和酪素，从而在菌落周围形成透明的水解圈。

五、基因工程产朊假丝酵母降解餐厨废弃物制备乙醇

本实施例所述的餐厨废弃物，收集自广州市某食街多家餐馆餐后剩余物。将收集回来的餐厨废弃物除去杂物后使用垃圾专用粉碎处理器将餐厨废弃物粉碎后，121℃、20min灭菌处理，于-20℃保存备用。其理化性质经测定后如下：水分含量86.6％，干物质含量13.4％，其中蛋白含量2.9％，总糖含量4.2％，粗脂肪含量4.2％，pH 4.2。

1、将上述“三、α-淀粉酶、糖化酶、酸性蛋白酶三基因共表达载体的构建及转化产朊假丝酵母”所得阳性基因工程产朊假丝酵母接种至5ml YPD培养基中，30℃、200rpm条件下培养活化24h；

2、将活化的菌种，以1：10的比例接种至200ml YPD培养基中，30℃、200rpm条件下培养24h后，离心收集菌体，用新鲜YPD培养基洗涤菌体两遍，然后用少量YPD重悬菌体，作为发酵菌种悬液；

3、称取100g餐厨废弃物，按每千克底物0.2克菌体干重的量，接入上述步骤2所制备的菌种悬液，充分搅拌均匀后，于30℃、200rpm厌氧发酵72h。发酵期间隔12h取样，用高效液相色谱法检测发酵液乙醇产量(结果见图6)，结果发现重组酵母产乙醇最高峰出现在60h左右，最高乙醇浓度达到16.3g/L，糖醇转化率达到理论值的78％。通过以上结果可知本发明构建的基因工程产朊假丝酵母能降利用解餐厨废弃物，并将其变废为宝地转化成为乙醇。

上述实施例仅为本发明的其中具体实现方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些显而易见的替换形式均属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东启智生物科技有限公司

<120> 一种能降解利用餐厨废弃物的基因工程产朊假丝酵母及其构建方法

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2490

<212> DNA

<213> α-淀粉酶基因

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ggttacgatt tgtgggagga ggttaacggt tcttctttct tcaccatcgc tgttcaacac 660

agagctttgg ttgagggttc tgctttcgct accgctgttg gttcttcttg ttcttggtgt 720

gattctcaag ctccagagat cttgtgttac ttgcaatctt tctggaccgg ttctttcatc 780

ttggctaact tcgattcttc cagatctggt aaggatgcta acaccttgtt gggttctatc 840

cacaccttcg atccagaggc tgcttgtgat gattctacct tccaaccatg ttctccaaga 900

gctttggcta accacaagga ggttgttgat tctttcagat ctatctacac cttgaacgat 960

ggtttgtctg attctgaggc tgttgctgtt ggtagatacc cagaggatac ctactacaac 1020

ggtaacccat ggttcttgtg taccttggct gctgctgagc aattgtacga tgctttgtac 1080

caatgggata agcaaggttc tttggaggtt accgatgttt ctttggattt cttcaaggct 1140

ttgtactctg atgctgctac cggtacctac tcttcttctt cttctaccta ctcttctatc 1200

gttgatgctg ttaagacctt cgctgatggt ttcgtttcta tcgttgagac ccacgctgct 1260

tctaacggtt ctatgtctga gcaatacgat aagtctgatg gtgagcaatt gtctgctaga 1320

gatttgacct ggtcttacgc tgctttgttg accgctaaca acagaagaaa ctctgttgtt 1380

ccagcttctt ggggtgagac ctctgcttct tctgttccag gtacctgtgc tgctacctct 1440

gctatcggta cctactcttc tgttaccgtt acctcttggc catctatcgt tgctaccggt 1500

ggtaccacca ccaccgctac cccaaccggt tctggttctg ttacctctac ctctaagacc 1560

accgctaccg cttctaagac ctctacctct acctcttcta cctcttgtac caccccaacc 1620

gctgttgctg ttaccttcga tttgaccgct accaccacct acggtgagaa catctacttg 1680

gttggttcta tctctcaatt gggtgattgg gagacctctg atggtatcgc tttgtctgct 1740

gataagtaca cctcttctga tccattgtgg tacgttaccg ttaccttgcc agctggtgag 1800

tctttcgagt acaagttcat cagaatcgag tctgatgatt ctgttgagtg ggagtctgat 1860

ccaaacagag agtacaccgt tccacaagct tgtggtacct ctaccgctac cgttaccgat 1920

acctggagag gtggtggtgg ctcgagcgct aagtcttctt tcatctctac caccaccacc 1980

gatttgacct ctatcaacac ctctgcttac tctaccggtt ctatctctac cgttgagacc 2040

ggtaacagaa ccacctctga ggttatctct cacgttgtta ccacctctac caagttgtct 2100

ccaaccgcta ccacctcttt gaccatcgct caaacctcta tctactctac cgattctaac 2160

atcaccgttg gtaccgatat ccacaccacc tctgaggtta tctctgatgt tgagaccatc 2220

tccagagaga ccgcttctac cgttgttgct gctccaacct ctaccaccgg ttggaccggt 2280

gctatgaaca cctacatctc tcaattcacc tcttcttctt tcgctaccat caactctacc 2340

ccaatcatct cttcttctgc tgttttcgag acctctgatg cttctatcgt taacgttcac 2400

accgagaaca tcaccaacac cgctgctgtt ccatctgagg agccaacctt cgttaacgct 2460

accagaaact ctttgaactc tttctgttct tctaagcaac catcttctcc atcttcttac 2520

acctcttctc cattggtttc ttctttgtct gtttctaaga ccttgttgtc tacctctttc 2580

accccatctg ttccaacctc taacacctac atcaagacca agaacaccgg ttacttcgag 2640

cacaccgctt tgaccacctc ttctgttggt ttgaactctt tctctgagac cgctgtttct 2700

tctcaaggta ccaagatcga taccttcttg gtttcttctt tgatcgctta cccatcttct 2760

gcttctggtt ctcaattgtc tggtatccaa caaaacttca cctctacctc tttgatgatc 2820

tctacctacg agggtaaggc ttctatcttc ttctctgctg agttgggttc tatcatcttc 2880

ttgttgttgt cttacttgtt gttctgaact agt 2913

<210> 3

<211> 1200

<212> DNA

<213> 酸性蛋白酶基因

<400> 3

ggatccacta tggttgtttt ctctaagacc gctgctttgg ttttgggttt gtcttctgct 60

gtttctgctg ctccagctcc aaccagaaag ggtttcacca tcaaccaaat cgctagacca 120

gctaacaaga ccagaaccat caacttgcca ggtatgtacg ctagatcttt ggctaagttc 180

ggtggtaccg ttccacaatc tgttaaggag gctgcttcta agggttctgc tgttaccacc 240

ccacaaaaca acgatgagga gtacttgacc ccagttaccg ttggtaagtc taccttgcac 300

ttggatttcg ataccggttc tgctgatttg tgggttttct ctgatgagtt gccatcttct 360

gagcaaaccg gtcacgattt gtacacccca tcttcttctg ctaccaagtt gtctggttac 420

acctgggata tctcttacgg tgatggttct tctgcttctg gtgatgttta cagagatacc 480

gttaccgttg gtggtgttac caccaacaag caagctgttg aggctgcttc taagatctct 540

tctgagttcg ttcaaaacac cgctaacgat ggtttgttgg gtttggcttt ctcttctatc 600

aacaccgttc aaccaaaggc tcaaaccacc ttcttcgata ccgttaagtc tcaattggat 660

tctccattgt tcgctgttca attgaagcac gatgctccag gtgtttacga tttcggttac 720

atcgatgatt ctaagtacac cggttctatc acctacaccg atgctgattc ttctcaaggt 780

tactggggtt tctctaccga tggttactct atcggtgatg gttcttcttc ttcttctggt 840

ttctctgcta tcgctgatac cggtaccacc ttgatcttgt tggatgatga gatcgtttct 900

gcttactacg agcaagtttc tggtgctcaa gagtctgagg aggctggtgg ttacgttttc 960

tcttgttcta ccaacccacc agatttcacc gttgttatcg gtgattacaa ggctgttgtt 1020

ccaggtaagt acatcaacta cgctccaatc tctaccggtt cttctacctg tttcggtggt 1080

atccaatcta actctggttt gggtttgtct atcttgggtg atgttttctt gaagtctcaa 1140

tacgttgttt tcaactctga gggtccaaag ttgggtttcg ctgctcaagc ttgaactagt 1200

Claims (7)

1.一种能降解利用餐厨废弃物的基因工程产朊假丝酵母的构建方法，其特征在于，所述产朊假丝酵母为将α-淀粉酶基因、糖化酶基因和酸性蛋白酶基因通过产朊假丝酵母多基因共表达载体整合至产朊假丝酵母基因组上构建而成。

2.根据权利要求1所述的能降解利用餐厨废弃物的基因工程产朊假丝酵母的构建方法，其特征在于，所述产朊假丝酵母多基因共表达载体为以酿酒酵母多基因共表达载体为基础，去除酿酒酵母多基因共表达载体的rDNA序列，以产朊假丝酵母的甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子替换酿酒酵母多基因共表达载体的酿酒酵母磷酸甘油酸激酶启动子而得。

3.根据权利要求2所述的能降解利用餐厨废弃物的基因工程产朊假丝酵母的构建方法，其特征在于，所述产朊假丝酵母构建方法具体如下：

S1：使用限制性内切酶对产朊假丝酵母多基因共表达载体、酿酒酵母多基因共表达载体，以及SEQ ID NO.1所示的α-淀粉酶基因、SEQ ID NO.2所示的糖化酶基因和SEQ ID NO.3所示的酸性蛋白酶基因进行双酶切，纯化回收所需片段；

S2：使用DNA连接酶将α-淀粉酶基因和糖化酶基因分别连接入酿酒酵母多基因共表达载体，将酸性蛋白酶基因连入产朊假丝酵母多基因共表达载体，形成三个重组单基因表达载体；

S3：使用限制性内切酶将含有载体启动子和终止子片段的完整的α-淀粉酶基因表达盒和糖化酶基因表达盒从重组单基因表达载体上切下，然后以串联表达盒的形式逐个接入带有酸性蛋白酶基因的单基因表达载体中，构建出α-淀粉酶、糖化酶和酸性蛋白酶三基因共表达载体；

S4：使用限制性内切酶对上述构建的三基因共表达载体进行单酶切，使其线性化后将其转入产朊假丝酵母，并整合到其基因组上，获得能降解利用餐厨废弃物的基因工程产朊假丝酵母。

4.根据权利要求3所述的能降解利用餐厨废弃物的基因工程产朊假丝酵母的构建方法，其特征在于，步骤S3中，所述三基因共表达载体的构建包括如下步骤：

S11：使用限制性内切酶对α-淀粉酶和糖化酶重组单基因表达载体进行双酶切，回收带有载体启动子和终止子的α-淀粉酶和糖化酶基因的完整表达盒；

S12：使用限制性内切酶对酸性蛋白酶重组单基因表达载体进行酶切，然后将糖化酶基因表达盒连入酸性蛋白酶单基因表达载体，构建糖化酶和酸性蛋白酶二基因表达载体。

S13：使用限制性内切酶对步骤S12所构建的二基因表达载体进行酶切，然后将α-淀粉酶基因表达盒连入二基因表达载体，构建出α-淀粉酶、糖化酶和酸性蛋白酶三基因共表达载体。

5.根据权利要求3所述的能降解利用餐厨废弃物的基因工程产朊假丝酵母的构建方法，其特征在于，步骤S1中所述的限制性内切酶为BamHI和SpeI；步骤S4中所述的限制性内切酶为SacI。

6.根据权利要求4所述的能降解利用餐厨废弃物的基因工程产朊假丝酵母的构建方法，其特征在于，步骤S11中所述的限制性内切酶为NheI和XbaI；所述步骤S12中所述限制性内切酶为NheI；所述步骤S13中所述限制性内切酶为NheI。

7.一种能降解利用餐厨废弃物的基因工程产朊假丝酵母，其特征在于，采用权利要求1至6任一项所述方法制备。