JP2020501607A

JP2020501607A - 生ごみを分解利用することができる遺伝子組換えカンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）及びその構築方法

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Publication number: JP2020501607A
Application number: JP2019553609A
Authority: JP
Inventors: ジョファンリォウ; ジァンハイリン; シュアイリ
Original assignee: Guangdong Qizhi Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Guangdong Qizhi Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2016-12-19
Filing date: 2017-07-03
Publication date: 2020-01-23
Anticipated expiration: 2037-07-03
Also published as: US20190309315A1; AU2017383475B2; EP3556846A4; CN106701606A; CN106701606B; EP3556846A1; AU2017383475A1; JP6978653B2; EP3556846B1; WO2018113245A1; US10577615B2

Abstract

生ごみを分解利用することができる遺伝子組換えカンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）を提供し、この遺伝子組換えカンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）は、カンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）多重遺伝子共発現ベクターを介して、α−アミラーゼ遺伝子と、グルコアミラーゼ遺伝子と、酸性プロテアーゼ遺伝子をカンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）ゲノムに組み込み、これらの三つの酵素を正確に発現させることによって得られる。【選択図】図１

Description

本発明は、遺伝子工学及び発酵工学の分野に関し、特に生ごみを分解利用することができる遺伝子組換えカンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）及びその構築方法に関する。

生ごみとは家庭、食堂及び飲食業界における食材の廃棄物と残渣であり、都市生活ゴミの重要な構成部分である。生ごみは、含水量が高く、栄養物質が豊富で、有機物の含有量は乾燥物質の９５％以上を占め、デンプン、糖質、タンパク質、脂肪などが多く含まれる。生ごみは更に、ビタミン、窒素、リン、硫黄、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどの微量元素を含み、栄養元素が完全であるので、生物学的に再利用できる。しかしながら、生ごみは含水量が高く、栄養物質が豊富であるため、微生物は様々な有機物と無機塩を利用して常温で急速に繁殖して代謝することにより、生ごみを腐敗させて悪臭を放つとともに、環境を汚染し、処理が非常に煩雑である。生ごみの量が巨大であり、中国では毎年の生ごみは６０００万トン以上発生するが、そのうち大部分が豚の飼育や、埋め立てに利用されたり、ひいては「生ごみ再生食用油」の製造に利用されたりし、深刻の環境汚染を引き起こす一方、ごく小さな部分だけが焼却、堆肥化とバイオガスの製造などに合理的に利用されるが、経済的利益が低い。そのため、生ごみを十分に資源化して利用する方法の開発は、生ごみを処理するために１つの重要な課題となっている。

生ごみはデンプン、糖質、タンパク質などの有機物を多く含むため、理想的な再生可能物質である。生ごみを原料として非食糧燃料エタノールを製造することは、非常に有望な開発方向である。それは、廃棄物を宝に変え、経済的利益を向上させることができるのみならず、環境汚染問題も解決することができ、巨大な社会的利益を有するという生ごみの資源化利用問題を解決することができる一方、生ごみを原料とすることによって、現在中国における燃料エタノールの製造原料は食糧デンプンを主とするため、食糧価格が高騰になって、食糧危機を引き起こすという問題を解決することができる。

カンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）は、トルラ・ユティリス（Ｔｏｒｕｌａｕｔｉｌｉｓ）又は食用トルラ酵母とも称され、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により認定された安全な酵母（ＧＲＡＳ、ＧｅｎｅｒａｌｌｙＲｅｃｏｇｎｉｚｅｄａｓＳａｆｅ）であり、中国食品医薬品監督及び管理局により認定された「健康食品に利用可能な真菌」でもある。カンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）は重要な工業用酵母であり、様々の高付加価値の生物製剤、例えば、グルタチオン、ＲＮＡ、アミラーゼ、Ｌ−乳酸、カロテノイドなどの製造に用いられる。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）と同様に、カンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）はグルコースを発酵させてエタノールを製造することができ、糖アルコールの変換率はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に相当する。また、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に比べて、カンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）は、（１）カンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）がクラブツリー効果陰性菌（Ｃｒａｂｔｒｅｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ）に属し、グルコースを富んだ培地において増殖する時、呼吸効果が抑制されず、エタノールを生成せず、厳密な好気性の条件下で迅速に増殖することができ、（２）カンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）の発酵密度が高く、有効な連続培養条件下で、高密度の培養を実現することができ、細胞の乾燥重量は９２ｇ／Ｌに達することができ、所望な製品を効率的に製造することに有利であり、（３）カンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）が安価な糖蜜と木材の加水分解液を養分として利用し増殖することができ、製造コストを節約し、（４）カンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）がペントースとヘキソースを共に炭素源とすることができ、（５）カンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）が複数種の炭素源と窒素源（尿素と硝酸を含む）に適するのみならず、そのタンパク質の含有量とビタミンＢの含有量がサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）より高く、（６）その分泌型タンパク質群がいかなるプロテアーゼを含まず、宿主菌株として外来タンパク質の発現に有利であり、（７）カンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）が食用可能且つ安全な単細胞タンパク質であり、その生成物と菌体自体が、複雑な分離精製手順を必要とせず、添加剤として食品、医薬品と化粧品業界に直接応用することができ、時間も手間も省くという利点を有する。

しかしながら、カンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）には、デンプンを効果的に分解してグルコースを生成し、タンパク質を分解してポリペプチドとアミノ酸を生成する酵素とが足りず、自然条件下で、エタノールを発酵生成するために生ごみにおけるデンプンとタンパク質を炭素源と窒素源として直接利用することができない。そのため、生ごみを原料として発酵させ、エタノールを製造するために、遺伝子工学により、その生ごみに対する分解能力の不足を補うために、デンプンとタンパク質を分解可能な酵素の遺伝子をカンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）に導入することを必要とし、それによって、組換えカンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）は自己合成したアミラーゼとプロテアーゼを利用して生ごみにおけるデンプンとタンパク質を利用可能な炭素源と窒素源とに分解することで、産業上で生ごみを発酵させて燃料エタノールを製造するという目的を達成する。

上記に鑑み、本発明は、従来技術の欠点を解決するために、生ごみを分解利用することができる遺伝子組換えカンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）を提供することを目的とする。

生ごみを分解利用することができる遺伝子組換えカンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）の構築方法であって、前記カンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）は、カンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）多重遺伝子共発現ベクター（ｐＣｕＩＫＰ）を介して、α−アミラーゼ（α−ａｍｙｌａｓｅ、ａｍｙ）遺伝子と、グルコアミラーゼ（ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ、ｇａ）遺伝子と、酸性プロテアーゼ（ａｃｉｄｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ、ａｐ）遺伝子とをカンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）ゲノムに組み込むことによって構築される。

本発明に記載のカンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）ゲノムに組み込むα−アミラーゼはアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）由来のものであり、グルコアミラーゼと酸性プロテアーゼはアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）由来のものである。前記α−アミラーゼとグルコアミラーゼは表層に提示するように発現され、前記酸性プロテアーゼは分泌発現される。

本発明に記載のα−アミラーゼ、グルコアミラーゼと酸性プロテアーゼのＤＮＡ配列はカンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）のコドンバイアスに基づいて改めて設計されて人工合成されたものであり、またα−アミラーゼとグルコアミラーゼの３’末端にサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）αレクチンの３’膜貫通領域の配列を付加することで、カンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）の表層に固定することができ、表層に提示するような発現を実現する。使用されたサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）αレクチンの配列は同様にカンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）のコドンバイアスに対してコドンの最適化を行う。α−アミラーゼの配列は配列番号１に示されるとおりであり、グルコアミラーゼの配列は配列番号２に示されるとおりであり、酸性プロテアーゼの配列は配列番号３で表されるとおりである。

前記カンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）多重遺伝子共発現ベクター（ｐＣｕＩＫＰ）はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）多重遺伝子共発現ベクター（ｐＳｃＩＫＰ）をベースとし、ｐＳｃＩＫＰのｒＤＮＡ配列を除去し、カンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターでｐＳｃＩＫＰのサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターを置換することによって得られる。具体的な改造ステップは、
制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩとＳａｃＩを用いてｐＳｃＩＫＰのｒＤＮＡ断片を切断した後、一本鎖特異的エンドヌクレアーゼ（Ｓ１ｎｕｃｌｅａｓｅ、Ｔａｋａｒａ）で切断して得られた突出末端を平滑化した後、ＤＮＡリガーゼによって、ベクターを環状化してｒＤＮＡを除去したベクターを得るステップ１）と、
ＰＣＲ増幅により、カンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター（ＣｕＧＡＰ）ＤＮＡ断片を得るステップ２）と、
制限エンドヌクレアーゼＮｈｅＩとＢａｍＨＩを用いて、ＣｕＧＡＰ断片とステップ１）で得られたベクターとをそれぞれ二重消化した後、ＣｕＧＡＰをベクターに連結し、ＣｕＧＡＰでＰＧＫプロモーターを代替したカンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）発現ベクターｐＣｕＩＫＰを得るステップ３）と、を含む。

前記カンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）構築方法は具体的には、
カンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）のコドンバイアスに基づいて、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼと酸性プロテアーゼのアミノ酸配列に応じて、それぞれのＤＮＡ配列をそれぞれ合成すると共に、配列の両端に適切な制限エンドヌクレアーゼ認識部位ＢａｍＨＩとＳｐｅＩを加え、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩとＳｐｅＩを用いて、カンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）多重遺伝子共発現ベクターと、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）多重遺伝子共発現ベクターと、配列番号１で表されるα−アミラーゼ遺伝子と、配列番号２で表されるグルコアミラーゼ遺伝子と配列番号３で表される酸性プロテアーゼ遺伝子を二重消化し、必要な断片を精製して回収するステップＳ１と、
ＤＮＡリガーゼによって、α−アミラーゼ遺伝子とグルコアミラーゼ遺伝子をそれぞれｐＳｃＩＫＰに連結し、酸性プロテアーゼ遺伝子をｐＣｕＩＫＰに連結し、３つの組換え単一遺伝子発現ベクターを形成するステップＳ２と、
制限エンドヌクレアーゼを用いて、ベクタープロモーターとターミネーター断片を含む完全なα−アミラーゼ遺伝子発現カセットとグルコアミラーゼ遺伝子発現カセットを、組換え単一遺伝子発現ベクターから切り出した後、ランダム発現カセットの形で酸性プロテアーゼ遺伝子を含有する単一遺伝子発現ベクターに一つずつ連結して、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼと酸性プロテアーゼとの３遺伝子共発現ベクターを構築するステップＳ３と、
制限エンドヌクレアーゼＳａｃＩを用いて、構築した上記３遺伝子共発現ベクターを単一消化し、線状化した後、カンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）に形質転換して、そのゲノムに組み込み、生ごみを分解利用することができる遺伝子組換えカンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）を得るステップＳ４と、を含む。

ステップＳ３において、前記３遺伝子共発現ベクターの構築は、
制限エンドヌクレアーゼＮｈｅＩとＸｂａＩを用いて、α−アミラーゼとグルコアミラーゼ単一遺伝子発現ベクターを二重消化し、ベクタープロモーターとターミネーターを含むα−アミラーゼとグルコアミラーゼ遺伝子の完全な発現カセットを回収するステップＳ１１と、
制限エンドヌクレアーゼＮｈｅＩを用いて、酸性プロテアーゼ単一遺伝子発現ベクターを消化した後、ＮｈｅＩとＸｂａＩのイソカウダーナー特徴を利用し、グルコアミラーゼ遺伝子発現カセットを酸性プロテアーゼ単一遺伝子発現ベクターに連結して、グルコアミラーゼと酸性プロテアーゼとの２遺伝子発現ベクターを構築するステップＳ１２と、
制限エンドヌクレアーゼＮｈｅＩを用いて、ステップＳ１２で構築した２遺伝子発現ベクターを消化した後、α−アミラーゼ遺伝子発現カセットを２遺伝子発現ベクターに連結し、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼと酸性プロテアーゼ３遺伝子共発現ベクターを構築するステップＳ１３と、を含む。

本発明は、カンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）でエタノール発酵工業において一般的に用いられるサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を代替し、その利点として、まず、カンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）とサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が同様な安全性及び近似なエタノール発酵能を有し、次に、カンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）は糖蜜と木材の加水分解液を利用し増殖することができ、ヘキソースとペントースを利用することができ、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に比べて更に広い糖スペクトル及び更に高い適応性を有し、最後に、カンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）はクラブツリー効果陰性菌であり、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に比べて更に高い培養密度を実現することができ、菌株生産段階ではより多くの菌体を得ることができ、培養時間及びコストを節約する。

本発明に記載の遺伝子組換えカンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）では、そのα−アミラーゼとグルコアミラーゼは表層に提示するように発現され、酸性プロテアーゼは分泌発現される。α−アミラーゼとグルコアミラーゼとはデンプンを分解するのに必要な酵素であるので、遺伝子組換え菌株が生ごみにおけるデンプン物質をより良く利用するために、発酵菌株を導入すると共にデンプン分解酵素を導入する必要がある。分泌発現の場合、遺伝子組換え菌株自体には酵素がないため、生ごみに導入するために、十分な分解酵素が生成されるように予め段階的に拡大培養する必要があり、操作上に非常に煩雑となり、また、導入体積は一般的に処理対象の生ごみの１０％であり、工業的な発酵にとって、発酵菌株を用意するのに必要な装置上のコストを大幅に増加させる。表層に提示するような発現の場合、菌株の製造中にアミラーゼを製造することができ、活性乾燥酵母を製造すると共にアミラーゼの活性を維持することができる。生ごみを分解する前に簡単な菌株活性化を行うだけで、生ごみに導入することができる。所望の体積は僅か０．０５％であり、操作を大幅に簡略化させる。しかも、活性乾燥酵母の形で製造された菌株は、貯蔵しやすく、工業的用途に非常に適する。

カンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）発現ベクターｐＣｕＩＫＰの構築を示す図である。 α−アミラーゼ（図２ｂ）、グルコアミラーゼ（図２ｃ）、酸性プロテアーゼ（図２ａ）の単一遺伝子発現ベクターの構築を示す図である。 α−アミラーゼと、グルコアミラーゼと、酸性プロテアーゼとの３遺伝子共発現ベクターの構築を示す図である。遺伝子組換えカンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）に発現されるアミラーゼの活性検出を示す図である。遺伝子組換えカンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）に発現されるプロテアーゼの活性検出を示す図である。遺伝子組換えカンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）により生ごみを発酵させてエタノールを製造する結果を示す図である。

本実施例に利用されるカンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）は広東省微生物菌株保存センター（受託番号：ＧＩＭ２．１７６）から購入され、ベクターｐＳｃＩＫＰは曁南大学分子生物研究センターで構築されて保存される。

実施例１：カンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）発現ベクターｐＣｕＩＫＰの構築

１、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）発現ベクターｐＳｃＩＫＰを制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩとＳａｃＩで二重消化し、ｐＳｃＩＫＰのサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ｒＤＮＡ配列断片を切除した。

２、一本鎖特異的エンドヌクレアーゼ（Ｓ１ｎｕｃｌｅａｓｅ、Ｔａｋａｒａ）で、上記ステップ１で二重消化して得られた突出末端を切除し、平滑末端の断片を得た後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによって、得られた平滑末端断片を環状化し、ｒＤＮＡを除去したベクターを得た。

３、ＮＣＢＩに公開されたカンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター（ＣｕＧＡＰ）配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＦＪ６６４３４２）を参照し、Ｐｒｉｍｅｒ３ソフトウェアによりプライマーを設計し、対応する制限酵素切断部位を加え、

カンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）ＧＩＭ２．１７６のゲノムＤＮＡをテンプレートとし、ＰＣＲ増幅反応によってＣｕＧＡＰプロモーター断片を得て、ＰＣＲ増幅生成物をｐＭＤ１８−Ｔベクター（Ｔａｋａｒａ）に連結し、シークエンシングにより検証を行った。

そのＰＣＲ反応条件は、

４、上記ステップ２で得られたベクター及び上記ステップ３で得られてシークエンシングにより検証されたＣｕＧＡＰ断片を制限エンドヌクレアーゼＮｈｅＩとＢａｍＨＩで二重消化した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによって、消化したＣｕＧＡＰをベクターに連結し、カンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）の発現ベクターｐＣｕＩＫＰ（図１を参照）を得た。

実施例２：α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、酸性プロテアーゼの単一遺伝子発現ベクターの構築

１、ＮＣＢＩに公開されたアスペル・ギルスオリゼα−アミラーゼ遺伝子ａｍｙ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＭ＿００１８２１３８４）、アスペルギルス・ニガーグルコアミラーゼ遺伝子ｇａ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＭ＿００１３９０４９３．１）と酸性プロテアーゼ遺伝子ａｐ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＸＭ＿００１４０１０５６．２）のアミノ酸配列に基づいてカンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）のコドンバイアスを参照してコドンの最適化を行い、最適化されたＤＮＡ配列（ＳＥＱ．ＩＤ１−３を参照）を合成し、α−アミラーゼ及びグルコアミラーゼには、表層に提示するような発現を実現するためにそれぞれサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）αレクチンカルボキシ基端のアンカー配列を融合した。合成した配列は既にベクターｐＵＣ５７にクローンされ、それぞれｐＵＣ５７−ａｍｙ、ｐＵＣ５７−ｇａとｐＵＣ５７−ａｐと名付けられる。

２、ｐＳｃＩＫＰ、ｐＣｕＩＫＰ、ｐＵＣ５７−ａｍｙ、ｐＵＣ５７−ｇａとｐＵＣ５７−ａｐを制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩとＳｐｅＩで二重消化し、必要なベクター及び遺伝子断片を精製して回収した。

３、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによって、酸性プロテアーゼ遺伝子をｐＣｕＩＫＰベクターに連結し、酸性プロテアーゼ単一遺伝子発現ベクターｐＣｕＩＫＰ−ａｐ（図２ａを参照）を得た。

４、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによって、α−アミラーゼ遺伝子をｐＳｃＩＫＰベクターに連結し、α−アミラーゼ単一遺伝子発現ベクターｐＳｃＩＫＰ−ａｍｙ（図２ｂを参照）を得た。

５、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによって、グルコアミラーゼ遺伝子をｐＳｃＩＫＰベクターに連結し、グルコアミラーゼ単一遺伝子発現ベクターｐＳｃＩＫＰ−ｇａ（図２ｃを参照）を得た。

このようにして、３つの遺伝子の単一遺伝子発現ベクターの構築を完成する。

実施例３：α−アミラーゼと、グルコアミラーゼと、酸性プロテアーゼとの３遺伝子共発現ベクターの構築及びカンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）の形質転換

１、ｐＣｕＩＫＰ−ａｐを制限エンドヌクレアーゼＮｈｅＩで単一消化した後、消化した生成物に対する脱リン酸化を行い、ＮｈｅＩ突出末端を有するｐＣｕＩＫＰ−ａｐを得た。

２、ｐＳｃＩＫＰ−ｇａを制限エンドヌクレアーゼＮｈｅＩとＸｂａＩで二重消化した後、ベクタープロモーターとターミネーターを含有するグルコアミラーゼ遺伝子の完全な発現カセットを回収した。

３、ＮｈｅＩとＸｂａＩがイソカウダーナーであり、同じ突出末端を有するという特徴を利用し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによって、上記ステップ１と２で得られたベクターをグルコアミラーゼ遺伝子発現カセットに連結し、２遺伝子発現ベクターｐＣｕＩＫＰ−ｇａ−ａｐを得た。

４、ｐＣｕＩＫＰ−ｇａ−ａｐを制限エンドヌクレアーゼＮｈｅＩで単一消化した後、消化した生成物に対する脱リン酸化を行い、ＮｈｅＩ突出末端を有するｐＣｕＩＫＰ−ｇａ−ａｐを得た。

５、ｐＳｃＩＫＰ−ａｍｙを制限エンドヌクレアーゼＮｈｅＩとＸｂａＩで二重消化した後、ベクタープロモーターとターミネーターを含有するα−アミラーゼ遺伝子の完全な発現カセットを回収した。

６、ＮｈｅＩとＸｂａＩがイソカウダーナーであり、同じ突出末端を有するという特徴を利用し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによって、上記ステップ４と５で得られたベクターをα−アミラーゼ遺伝子発現カセットに連結し、３遺伝子発現ベクターｐＣｕＩＫＰ−ａｍｙ−ｇａ−ａｐ（図３を参照）を得た。

７、上記ステップ６で得られた３遺伝子共発現ベクターｐＣｕＩＫＰ−ａｍｙ−ｇａ−ａｐを制限エンドヌクレアーゼＳａｃＩで線状化した後、エレクトロポレーション形質転換法でカンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）ＧＩＭ２．１７６に導入し、Ｇ４１８の濃度が３００μｇ／ｍｌであるＹＰＤ寒天プレートで３〜４ｄ培養した後、正常に繁殖したコロニーを選択し、上記組換えプラスミドが導入された形質転換体とする。コロニーＰＣＲで陽性形質転換体を同定し、本発明に記載の生ごみの分解に有用な遺伝子組換えカンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）とした。

実施例４：遺伝子組換えカンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）に発現されるアミラーゼ及びプロテアーゼの活性検出

１、上記「[実施例３]：α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、酸性プロテアーゼ３遺伝子共発現ベクターの構築及びカンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）の形質転換」で得られた陽性遺伝子組換えカンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）を５ｍｌのＹＰＤ培地に接種し、３０℃、２００ｒｐｍの条件下で２４時間培養し活性化した。

２、活性化した菌株を１：１０の割合で１００ｍｌのＹＰＤ培地に接種し、３０℃、２００ｒｐｍの条件下で７２時間培養した後、遠心分離してそれぞれ菌体と上澄みを収集した。菌体はアミラーゼの酵素活性を測定するのに用いられ、上澄みはプロテアーゼの酵素活性を測定するのに用いられる。

３、アミラーゼの酵素活性の測定：一定の量の菌体を称量し、１ｍｌのｐＨ５．５の酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液を加えて菌体を２回洗浄し、残った培地を取り除いた。続いて１ｍｌのｐＨ５．５の酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液を加えて菌体を再懸濁し、２００μＬの菌体を吸引し、３００μＬのｐＨ５．５の酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液を加え、更に１％（ｗ／ｖ）の可溶性デンプン溶液４００μＬを加えて十分に均一に混合し、６０℃の水浴の条件下で３０ｍｉｎ反応させ、１００μＬの０．１Ｍの塩酸溶液氷浴を加えて反応を終了する。生成された還元糖の総量をＤＮＳ法で測定し、アミラーゼの酵素活性を算出した。酵素活性の単位は、１ｇの菌体が６０℃の条件下でデンプンを１ｍｉｎ加水分解させて１μｍｏｌのデキストロース当量の還元糖を生成する酵素の量を１つの酵素活性の単位とするように定義され、Ｕ／ｇで示される。

その結果、７２時間培養した後、本発明に記載の遺伝子組換えカンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）のアミラーゼの酵素活性は２４７７Ｕ／ｇであることが見出された。

４、プロテアーゼの酵素活性の測定：１．０ｍｌの上澄みを吸引し、４０℃の水浴で２ｍｉｎ予備加熱する。それと同時に適量の１％カゼイン溶液を４０℃の水浴中で３〜５ｍｉｎ予備加熱した後、その１．０ｍｌを、予熱後の上澄みに加えた直後に計時を開始し、４０℃の水浴中で１０ｍｉｎ正確に反応させ、反応後直ちに２．０ｍｌの０．４Ｍのトリクロロ酢酸を加え、均一に振動させ、取り出して１０ｍｉｎ静置し、濾過し、１．０ｍｌの濾液に０．４Ｍ炭酸ナトリウム溶液５．０ｍｌ、フォリン試液１．００ｍｌを加え、４０℃の水浴において２０ｍｉｎ発色させ、取り出した後に室温で冷却した。１０ｍｍのキュベットにおいて、波長６６０ｎｍで分光光度計によってその吸光度をそれぞれ測定し、Ｌ−チロシン標準曲線に従って、酸性プロテアーゼの酵素活性を算出した。酵素活性の単位は、１ｍｌの酵素液が４０℃、ｐＨ３．０の条件下で、カゼインを１ｍｉｎ加水分解して１マイクログラムのチロシンを生成する酵素の量を１つの酵素活性の単位とするように定義され、Ｕ／ｍｌで示される。

その結果、７２時間培養した後、本発明に記載の遺伝子組換えカンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）のプロテアーゼの酵素活性は２３１Ｕ／ｍｌであると見出された。

５、加水分解領域アッセイ：上記「実施例３：α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、酸性プロテアーゼ３遺伝子共発現ベクターの構築及びカンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）の形質転換」で得られたＧ４１８抵抗性を有する形質転換体コロニーをそれぞれ１％可溶性デンプンと１％カゼインを含有するＹＮＢＳ固体培地（ＹＮＢ６．７ｇ／ｌ、可溶性デンプン１０ｇ／ｌ、寒天粉末１５ｇ／ｌ）に接種し、３０℃のインキュベータで３時間培養した後、それぞれ加水分解領域の形成を観察した（デンプンプレートを予めヨウ素で燻蒸する必要がある）。結果を図４および図５に示すように、形質転換体はアミラーゼ、グルコアミラーゼ及び酸性プロテアーゼを発現することができ、培地デンプンとカゼインを分解して利用することができ、それによってコロニー周囲に透明な加水分解領域を形成した。

実施例５：遺伝子組換えカンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）による生ごみの分解及びエタノールの製造

本実施例に記載の生ごみは、広州市のある飲食街の複数のレストランから収集した。収集した生ごみから雑物を除去してから廃棄物専用粉砕処理装置で生ごみを粉砕した後、１２１℃、２０ｍｉｎ殺菌処理を行い、−２０℃で貯蔵して使用に備える。その物理化学的特性を測定した結果、含水量が８６．６％、乾燥物質含有量が１３．４％、タンパク質含有量が２．９％、全糖含有量が４．２％、粗脂肪含有量が４．２％、ｐＨ４．２である。

１、上記「実施例３：α−アミラーゼと、グルコアミラーゼと、酸性プロテアーゼとの３遺伝子共発現ベクターの構築及びカンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）の形質転換」で得られた陽性遺伝子組換えカンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）を５ｍｌのＹＰＤ培地に接種し、３０℃、２００ｒｐｍの条件下で２４時間培養し活性化した。

２、活性化した菌株を１：１０の割合で２００ｍｌのＹＰＤ培地に接種し、３０℃、２００ｒｐｍの条件下で２４時間培養した後、遠心分離により菌体を収集し、新鮮なＹＰＤ培地で菌体を２回洗浄した後、少量のＹＰＤで菌体を再懸濁し、発酵菌株懸濁液とした。

３、１００ｇの生ごみを称量し、１キログラムの基質あたりに０．２グラムの菌体（乾燥重量）の量で、上記ステップ２で調製された菌株懸濁液に導入し、十分に均一に撹拌した後、３０℃、２００ｒｐｍで７２時間嫌気発酵させた。発酵期間において１２時間ごとに試料を取り出し、高速液体クロマトグラフィー法で発酵液のエタノール産量（結果を図６に示す）を検出し、その結果、組換え酵母によるエタノール産量が６０時間前後に最高ピークになり、最高エタノール濃度は１６．３ｇ／Ｌに達し、糖アルコール変換率は理論値の７８％に達することが見出された。上記結果のように、本発明で構築した遺伝子組換えカンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）によって生ごみを分解して利用し、その廃棄物を再利用してエタノールに転換することができる。

上記実施例は、具体的で詳細に説明される、本発明を実現するための形態に過ぎず、本発明の特許保護の範囲を限定するものではない。当業者にとって、本発明の趣旨を逸脱することなく、更に複数の変形と改良を加えることができ、これらの容易に理解される代替形態は、本発明の保護範囲に属することが意図される。

Claims

生ごみを分解利用することができる遺伝子組換えカンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）の構築方法であって、
前記カンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）は、カンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）多重遺伝子共発現ベクターを介して、α−アミラーゼ遺伝子と、グルコアミラーゼ遺伝子と、酸性プロテアーゼ遺伝子とをカンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）ゲノムに組み込むことによって構築されることを特徴とする生ごみを分解利用することができる遺伝子組換えカンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）の構築方法。
前記カンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）多重遺伝子共発現ベクターは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）多重遺伝子共発現ベクターをベースとし、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）多重遺伝子共発現ベクターのｒＤＮＡ配列を除去し、カンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼのプロモーターでサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）多重遺伝子共発現ベクターのサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーターを置換することによって得られることを特徴とする請求項１に記載の生ごみを分解利用することができる遺伝子組換えカンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）の構築方法。
制限エンドヌクレアーゼを用いて、カンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）多重遺伝子共発現ベクター、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）多重遺伝子共発現ベクター、配列番号１で表されるα−アミラーゼ遺伝子、配列番号２で表されるグルコアミラーゼ遺伝子および配列番号３で表される酸性プロテアーゼ遺伝子を二重消化し、必要な断片を精製して回収するステップＳ１と、
ＤＮＡリガーゼによって、α−アミラーゼ遺伝子とグルコアミラーゼ遺伝子とをそれぞれサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）多重遺伝子共発現ベクターに連結し、酸性プロテアーゼ遺伝子をカンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）多重遺伝子共発現ベクターに連結して、３つの組換え単一遺伝子発現ベクターを形成するステップＳ２と、
制限エンドヌクレアーゼを用いて、ベクタープロモーターとターミネーター断片を含む完全なα−アミラーゼ遺伝子発現カセットとグルコアミラーゼ遺伝子発現カセットを組換え単一遺伝子発現ベクターから切り出した後、直列接続された発現カセットの形で酸性プロテアーゼ遺伝子を含有する単一遺伝子発現ベクターに一つずつ連結して、α−アミラーゼと、グルコアミラーゼと、酸性プロテアーゼとの３遺伝子共発現ベクターを構築するステップＳ３と、
制限エンドヌクレアーゼを用いて、構築した前記３遺伝子共発現ベクターを単一消化し、線状化した後に、カンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）に形質転換して、そのゲノムに組み込んで、生ごみを分解利用することができる遺伝子組換えカンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）を得るステップＳ４と、を含むことを特徴とする請求項２に記載の生ごみを分解利用することができる遺伝子組換えカンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）の構築方法。
前記ステップＳ３において、前記３遺伝子共発現ベクターを構築することは、
制限エンドヌクレアーゼを用いて、α−アミラーゼとグルコアミラーゼ組み換え単一遺伝子発現ベクターを二重消化し、ベクターのプロモーターとターミネーターを含む、α−アミラーゼ遺伝子とグルコアミラーゼ遺伝子の完全な発現カセットを回収するステップＳ１１と、
制限エンドヌクレアーゼを用いて、酸性プロテアーゼ組み換え単一遺伝子発現ベクターを消化した後、グルコアミラーゼ遺伝子発現カセットを酸性プロテアーゼ単一遺伝子発現ベクターに連結して、グルコアミラーゼと酸性プロテアーゼとの２遺伝子発現ベクターを構築するステップＳ１２と、
制限エンドヌクレアーゼを用いて、ステップＳ１２で構築した２遺伝子発現ベクターを消化した後、α−アミラーゼ遺伝子発現カセットを２遺伝子発現ベクターに連結し、α−アミラーゼと、グルコアミラーゼと、酸性プロテアーゼとの３遺伝子共発現ベクターを構築するステップＳ１３と、を含むことを特徴とする請求項３に記載の生ごみを分解利用することができる遺伝子組換えカンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）の構築方法。
前記ステップＳ１における前記制限エンドヌクレアーゼはＢａｍＨＩとＳｐｅＩであり、前記ステップＳ４における前記制限エンドヌクレアーゼはＳａｃＩであることを特徴とする請求項３に記載の生ごみを分解利用することができる遺伝子組換えカンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）の構築方法。
前記ステップＳ１１における前記制限エンドヌクレアーゼはＮｈｅＩとＸｂａＩであり、前記ステップＳ１２における前記制限エンドヌクレアーゼはＮｈｅＩであり、前記ステップＳ１３における前記制限エンドヌクレアーゼはＮｈｅＩであることを特徴とする請求項４に記載の生ごみを分解利用することができる遺伝子組換えカンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）の構築方法。
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法により製造されることを特徴とする生ごみを分解利用することができる遺伝子組換えカンジダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）。