CN102869763A - 用于提高燃料、化学品和氨基酸产生的副产物蓄积减少的酵母微生物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包含生物合成途径的重组微生物以及使用所述重组微生物产生多种有益代谢产物的方法。在本发明的多个方面,所述重组微生物可进一步包含一种或多种修饰,导致降低或消除3-酮酸(例如,乙酰乳酸和2-乙酰-2-羟基丁酸)和/或醛衍生的副产物。在本文所述的多个实施方案中,所述重组微生物可以是酵母属(Saccharomyces)进化枝微生物、Crabtree-阴性酵母微生物、Crabtree-阳性酵母微生物、后-WGD(全基因组倍增)酵母微生物、前-WGD(全基因组倍增)酵母微生物以及非发酵酵母微生物。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2010年2月12日提交的美国临时申请序列号61/304,069、2010年2月26日提交的美国临时申请序列号61/308,568、2010年3月10日提交的美国临时申请序列号61/282,641、2010年6月7日提交的美国临时申请序列号61/352,133、2010年11月9日提交的美国临时申请序列号61/411,885以及2011年1月7日提交的美国临时申请序列号61/430,801的优先权,它们中的每一份都全文以引用方式并入本文以用于所有目的。
政府支持承认
本发明根据美国农业部授予的第2009-10006-05919号合同以及美国陆军研究所授予的第W911NF-09-2-0022号合同在政府支持下完成。政府在本发明中享有某些权利。
技术领域
本发明提供了重组微生物以及产生此类微生物的方法。还提供了通过使合适的底物与重组微生物和由其得到的酶制剂接触来产生包括燃料、化学品和氨基酸的有益代谢产物的方法。
以电子方式提交的文本文件描述
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发明背景
微生物将丙酮酸转化成有益代谢产物(包括燃料、化学品和氨基酸)的能力近年来已在文献中得到广泛描述。参见例如Alper等,2009,NatureMicrobiol.Rev.7:715-723。重组工程技术已使得可以创建表达能够产生许多有用产物的生物合成途径的微生物,这些产物例如缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和泛酸(维生素B5)。此外,已在表达异源代谢途径的微生物中通过重组方法产生了燃料,诸如异丁醇(参见例如,Donaldson等的WO/2007/050671以及Liao等的WO/2008/098227)。虽然工程化微生物代表了可再生生产燃料、化学品和氨基酸的可能有用的工具,但是其中许多这些微生物不能满足商业相关要求,原因是它们的性能特征低下,包括低生产率、低滴度和低得率。
在许多现有微生物中观察到的性能欠佳的主要原因之一是不可取地将途径中间体转化成了不需要的副产物。本发明人已鉴定出多种副产物,包括2,3-二羟基-2-甲基丁酸(DH2MB)(CAS#14868-24-7)、2-乙基-2,3-二羟基丁酸、2,3-二羟基-2-甲基-丁酸、异丁酸、3-甲基-1-丁酸、2-甲基-1-丁酸和丙酸,它们衍生自用于产生燃料、化学品和氨基酸的生物合成途径的多种中间体。这些副产物的蓄积会对多种发酵反应中所期望代谢产物的合成和得率产生负面影响。迄今为止,尚未表征负责产生这些不需要的副产物的酶活性。更具体地讲,本申请表明,3-酮酸还原酶(3-KAR)和醛脱氢酶(ALDH)的活性使得由重要的生物合成途径中间体形成这些副产物。
本发明由研究这些酶活性而得来,并表明3-KAR和/或ALDH酶的抑制能显著减少或消除不需要的副产物的形成,并同时提高有益代谢产物的得率和滴度。本申请此外还表明,增强3-KAR和/或ALDH酶活性可用于增加多种副产物的产生,诸如2,3-二羟基-2-甲基丁酸(DH2MB)、2-乙基-2,3-二羟基丁酸、2,3-二羟基-2-甲基-丁酸、异丁酸、3-甲基-1-丁酸、2-甲基-1-丁酸和丙酸。
发明概述
本发明人已发现,不需要的副产物可在多个发酵过程中蓄积,包括候选生物燃料-异丙醇的发酵。这些不需要的副产物的蓄积因途径中间体的不可取转化所致,这些中间体包括3-酮酸、乙酰乳酸和2-乙酰-2-羟基丁酸和/或醛,诸如异丁醛、1-丁醛、1-丙醛、2-甲基-1-丁醛和3-甲基-1-丁醛。这些中间体向不需要的副产物的转化会抑制3-酮酸-和/或醛衍生产物的最佳的生产率和得率。因此,本发明人已开发了在3-酮酸和/或醛作为途径中间体的过程中减少3-酮酸和/或醛中间体向各种发酵副产物转化的方法。
在第一方面,本发明涉及重组微生物,其包含3-酮酸和/或醛为其中间体的生物合成途径,其中所述重组微生物(a)基本上不含催化3-酮酸向3-羟基酸转化的酶;(b)基本上不含催化醛向酸副产物转化的酶;(c)被工程化以降低或消除催化3-酮酸向3-羟基酸转化的酶的表达或活性;和/或(d)被工程化以降低或消除催化醛向酸副产物转化的酶的表达或活性。在一个实施方案中,3-酮酸为乙酰乳酸。在另一个实施方案中,3-酮酸为2-乙酰-2-羟基丁酸。
在一个实施方案中,本发明涉及重组微生物,其包含使用3-酮酸(乙酰乳酸)作为中间体的生物合成途径,其中所述重组微生物被工程化以降低或消除催化乙酰乳酸向相应的3-羟基酸(DH2MB)转化的酶的表达或活性。在一些实施方案中,催化乙酰乳酸向DH2MB转化的酶为3-酮酸还原酶(3-KAR)。
在一个实施方案中,本发明涉及重组微生物,其包含使用3-酮酸(2-乙酰-2-羟基丁酸)作为中间体的生物合成途径,其中所述重组微生物被工程化以降低或消除催化乙酰乳酸向相应3-羟基酸(2-乙基-2,3-二羟基丁酸)转化的酶的表达或活性。在一些实施方案中,催化2-乙酰-2-羟基丁酸向2-乙基-2,3-二羟基丁酸转化的酶为3-酮酸还原酶(3-KAR)。
在一个实施方案中,本发明涉及重组微生物,其包含使用醛作为中间体的生物合成途径,其中所述重组微生物被工程化以降低或消除催化醛向酸副产物转化的酶的表达或活性。在一些实施方案中,催化醛向酸副产物转化的酶为醛脱氢酶(ALDH)。
在一个实施方案中,本发明涉及重组微生物,其包含使用3-酮酸和醛两者作为中间体的生物合成途径,其中所述重组微生物(a)被工程化以降低或消除催化3-酮酸中间体向3-羟基酸副产物转化的酶的表达或活性;以及(b)被工程化以降低或消除催化醛中间体向酸副产物转化的酶的表达或活性。在一个实施方案中,3-酮酸为乙酰乳酸,而3-羟基酸副产物为DH2MB。在另一个实施方案中,3-酮酸为2-乙酰-2-羟基丁酸,而3-羟基酸副产物为2-乙基-2,3-二羟基丁酸。在一些实施方案中,催化乙酰乳酸向DH2MB转化的酶为3-酮酸还原酶(3-KAR)。在一些其它实施方案中,催化2-乙酰-2-羟基丁酸向2-乙基-2,3-二羟基丁酸转化的酶为3-酮酸还原酶(3-KAR)。在一些其它实施方案中,催化醛向酸副产物转化的酶为醛脱氢酶(ALDH)。在另一些其它实施方案中,催化乙酰乳酸向DH2MB转化的酶为3-酮酸还原酶(3-KAR),而催化醛向酸副产物转化的酶为醛脱氢酶(ALDH)。在另一些其它实施方案中,催化2-乙酰-2-羟基丁酸向2-乙基-2,3-二羟基丁酸转化的酶为3-酮酸还原酶(3-KAR),而催化醛向酸副产物转化的酶为醛脱氢酶(ALDH)。
在本文所述的多个实施方案中,本发明的重组微生物可包括降低或缺失催化3-酮酸中间体向3-羟基酸副产物转化中涉及到的一种或多种内源性蛋白质的活性或表达。在一个实施方案中,催化3-酮酸中间体向3-羟基酸副产物转化中涉及到的一种或多种内源性蛋白质的活性或表达被降低至少约50%。在另一个实施方案中,所述催化3-酮酸中间体向3-羟基酸副产物转化中涉及到的一种或多种内源性蛋白质的活性或表达与不包括降低或缺失催化3-酮酸中间体向3-羟基酸副产物转化中涉及到的一种或多种内源性蛋白质的活性或表达的重组微生物相比,被降低至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或至少约99%。在一个实施方案中,3-酮酸中间体为乙酰乳酸,而3-羟基酸副产物为DH2MB。在另一个实施方案中,3-酮酸中间体为2-乙酰-2-羟基丁酸,而3-羟基酸副产物为2-乙基-2,3-二羟基丁酸。
在本文所述的多个实施方案中,催化3-酮酸中间体向3-羟基酸副产物转化中涉及到的蛋白质为酮还原酶。在示例性实施方案中,酮还原酶为3-酮酸还原酶(3-KAR)。在另一个实施方案中,该蛋白质为短链醇脱氢酶。在又一个实施方案中,该蛋白质为中链醇脱氢酶。在又一个实施方案中,该蛋白质为醛糖还原酶。在又一个实施方案中,该蛋白质为D-羟基酸脱氢酶。在又一个实施方案中,该蛋白质为乳酸脱氢酶。在又一个实施方案中,该蛋白质选自由下列组成的组:酿酒酵母(S.cerevisiae)的YAL060W、YJR159W、YGL157W、YBL114W、YOR120W、YKL055C、YBR159W、YBR149W、YDL168W、YDR368W、YLR426W、YCR107W、YIL124W、YML054C、YOL151W、YMR318C、YMR226C、YBR046C、YHR104W、YIR036C、YDL174C、YDR541C、YBR145W、YGL039W、YCR105W、YDL124W、YIR035C、YFL056C、YNL274C、YLR255C、YGL185C、YGL256W、YJR096W、YMR226C、YJR155W、YPL275W、YOR388C、YLR070C、YMR083W、YER081W、YJR139C、YDL243C、YPL113C、YOL165C、YML086C、YMR303C、YDL246C、YLR070C、YHR063C、YNL331C、YFL057C、YIL155C、YOL086C、YAL061W、YDR127W、YPR127W、YCl018W、YIL074C、YIL124W和YEL071W基因以及它们的同源物。
在一个实施方案中,内源性蛋白质为3-酮酸还原酶(3-KAR)。在示例性的实施方案中,3-酮酸还原酶为酿酒酵母YMR226C(SEQ ID NO:1)蛋白质,其在本文中可与"TMA29"互换使用。在一些实施方案中,内源性蛋白质可以为酿酒酵母YMR226C(SEQ ID NO:1)蛋白质或其同源物或变体。在一个实施方案中,该同源物可选自由下列组成的组:Vanderwaltomzyma polyspora(SEQ ID NO:2)、芽殖酵母(Saccharomyces castellii)(SEQ ID NO:3)、光滑假丝酵母(Candida glabrata)(SEQ ID NO:4)、贝酵母(Saccharomyces bayanus)(SEQ ID NO:5)、鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)(SEQ ID NO:6)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)(SEQ ID NO:7)、棉阿舒囊霉(Ashbyagossypii)(SEQ ID NO:8)、可鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)(SEQ ID NO:9)、耐热克鲁维酵母(Kluyveromyces thermotolerans)(SEQ ID NO:10)、克鲁雄酵母(Kluyveromyces waltii)(SEQ ID NO:11)、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)(SEQ ID NO:12)、汉逊德巴利酵母(Debaromyces hansenii)(SEQ ID NO:13)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(SEQ ID NO:14)、杜氏假丝酵母(Candidadubliniensis)(SEQ ID NO:15)、白假丝酵母(Candida albicans)(SEQ ID NO:16)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)(SEQ ID NO:17)、东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)(SEQ ID NO:18)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)(SEQ ID NO:19)、黑曲霉(Aspergillus niger)(SEQ ID NO:20)、粗糙链孢霉(Neurospora crassa)(SEQ ID NO:21)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)(SEQ ID NO:22)和马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)(SEQ ID NO:23)。
在一个实施方案中,重组微生物在编码3-酮酸还原酶的至少一个基因中包括突变,从而导致由所述基因编码的多肽的3-酮酸还原酶活性降低。在另一个实施方案中,重组微生物包括编码3-酮酸还原酶的基因的部分缺失,从而导致由所述基因编码的多肽的3-酮酸还原酶活性降低。在另一个实施方案中,重组微生物包括编码3-酮酸还原酶的基因的完全缺失,从而导致由所述基因编码的多肽的3-酮酸还原酶活性降低。在又一个实施方案中,重组微生物包括与编码3-酮酸还原酶的基因相关的调控区的修饰,从而导致由所述基因编码的多肽的表达降低。在又一个实施方案中,重组微生物包括转录调控子的修饰,从而导致编码3-酮酸还原酶的基因的转录降低。在又一个实施方案中,重组微生物在编码3-酮酸还原酶的所有基因中都包括突变,从而导致由所述基因编码的多肽的活性降低。在一个实施方案中,3-酮酸还原酶活性或表达被降低至少约50%。在另一个实施方案中,3-酮酸还原酶活性或表达与不包括3-酮酸还原酶活性或表达降低的重组微生物相比,被降低至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或至少约99%。在一个实施方案中,所述3-酮酸还原酶由酿酒酵母TMA29(YMR226C)基因或其同源物编码。
在本文所述的多个实施方案中,本发明的重组微生物可包括降低或缺失催化醛向酸副产物转化中涉及到的一种或多种内源性蛋白质的活性或表达。在一个实施方案中,催化醛向酸副产物转化中涉及到的一种或多种内源性蛋白质的活性或表达被降低至少约50%。在另一个实施方案中,所述催化醛向酸副产物转化中涉及到的一种或多种内源性蛋白质的活性或表达与不包括降低或缺失催化醛向酸副产物转化中涉及到的一种或多种内源性蛋白质的活性或表达的重组微生物相比,被降低至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或至少约99%。
在本文所述的多个实施方案中,催化醛向酸副产物转化中涉及到的内源性蛋白质为醛脱氢酶(ALDH)。在一个实施方案中,醛脱氢酶由选自由下列组成的组的基因编码:ALD2、ALD3、ALD4、ALD5、ALD6和HFD1及其同源物和变体。在示例性的实施方案中,醛脱氢酶为酿酒酵母ALD6(SEQ IDNO:25)蛋白质。在一些实施方案中,醛脱氢酶为酿酒酵母ALD6(SEQ ID NO:25)蛋白质或其同源物或变体。在一个实施方案中,该同源物选自由下列组成的组:芽殖酵母(SEQ ID NO:26)、光滑假丝酵母(SEQ ID NO:27)、贝酵母(SEQ ID NO:28)、乳酸克鲁维酵母(SEQ ID NO:29)、耐热克鲁维酵母(SEQ IDNO:30)、克鲁雄酵母(SEQ ID NO:31)、酿酒酵母YJ789(SEQ ID NO:32)、酿酒酵母JAY291(SEQ ID NO:33)、酿酒酵母EC1118(SEQ ID NO:34)、酿酒酵母DBY939(SEQ ID NO:35)、酿酒酵母AWRI1631(SEQ ID NO:36)、酿酒酵母RM11-1a(SEQ ID NO:37)、巴斯德毕赤酵母(SEQ ID NO:38)、马克斯克鲁维酵母(SEQ ID NO:39)、粟酒裂殖酵母(SEQ ID NO:40)和粟酒裂殖酵母(SEQ ID NO:41)。
在一个实施方案中,重组微生物在编码醛脱氢酶的至少一个基因中包括突变,从而导致由所述基因编码的多肽的醛脱氢酶活性降低。在另一个实施方案中,重组微生物包括编码醛脱氢酶的基因的部分缺失,从而导致由所述基因编码的多肽的醛脱氢酶活性降低。在另一个实施方案中,重组微生物包括编码醛脱氢酶的基因的全部缺失,从而导致由所述基因编码的多肽的醛脱氢酶活性降低。在又一个实施方案中,重组微生物包括与编码醛脱氢酶的基因相关的调控区的修饰,从而导致由所述基因编码的多肽的表达降低。在又一个实施方案中,重组微生物包括转录调控子的修饰,从而导致编码醛脱氢酶的基因的转录降低。在又一个实施方案中,重组微生物在编码醛脱氢酶的所有基因中都包括突变,从而导致由所述基因编码的多肽的活性降低。在一个实施方案中,醛脱氢酶活性或表达被降低至少约50%。在另一个实施方案中,醛脱氢酶活性或表达与不包括醛脱氢酶活性或表达降低的重组微生物相比,被降低至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或至少约99%。在一个实施方案中,所述醛脱氢酶由酿酒酵母ALD6基因或其同源物编码。
在本文所述的多个实施方案中,重组微生物可以包括使用3-酮酸作为中间体的生物合成途径。在一个实施方案中,3-酮酸中间体为乙酰乳酸。使用乙酰乳酸作为中间体的生物合成途径可以选自以下物质的生物合成途径:异丁醇、2-丁醇、1-丁醇、2-丁酮、2,3-丁二醇、乙偶姻、二乙酰、缬氨酸、亮氨酸、泛酸、异丁烯、3-甲基-1-丁醇、4-甲基-1-戊醇和辅酶A。在另一个实施方案中,3-酮酸中间体为2-乙酰-2-羟基丁酸。使用2-乙酰-2-羟基丁酸作为中间体的生物合成途径可选自以下物质的生物合成途径:2-甲基-1-丁醇、异亮氨酸、3-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-己醇和5-甲基-1-庚醇。
在本文所述的多个实施方案中,重组微生物可包括使用醛作为中间体的生物合成途径。使用醛作为中间体的生物合成途径可以选自以下物质的生物合成途径:异丁醇、1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、1-丙醇、1-戊醇、1-己醇、3-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-己醇和5-甲基-1-庚醇。在本文所述的多个实施方案中,醛中间体可以选自:异丁醛、1-丁醛、2-甲基-1-丁醛、3-甲基-1-丁醛、1-丙醛、1-戊醛、1-己醛、3-甲基-1-戊醛、4-甲基-1-戊醛、4-甲基-1-己醛和5-甲基-1-庚醛。
在本文所述的多个实施方案中,重组微生物可包括使用3-酮酸和醛作为中间体的生物合成途径。在一个实施方案中,3-酮酸中间体为乙酰乳酸。使用乙酰乳酸和醛作为中间体的生物合成途径可选自以下物质的生物合成途径:异丁醇、1-丁醇和3-甲基-1-丁醇。在另一个实施方案中,3-酮酸中间体为2-乙酰-2-羟基丁酸。使用2-乙酰-2-羟基丁酸和醛作为中间体的生物合成途径可选自以下物质的生物合成途径:2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-己醇和5-甲基-1-庚醇。
在一个实施方案中,本发明涉及用于产生异丁醇的重组微生物,其中所述重组微生物包括产生异丁醇的代谢途径,并且其中所述微生物被工程化以降低或消除催化乙酰乳酸向DH2MB转化的酶的表达或活性。在一些实施方案中,催化乙酰乳酸向DH2MB转化的酶为3-酮酸还原酶(3-KAR)。在具体的实施方案中,3-酮酸还原酶由酿酒酵母TMA29(YMR226C)基因或其同源物编码。
在另一个实施方案中,本发明涉及用于产生异丁醇的重组微生物,其中所述重组微生物包括产生异丁醇的代谢途径,并且其中所述微生物被工程化以降低或消除催化异丁醛向异丁酸转化的酶的表达或活性。在一些实施方案中,催化异丁醛向异丁酸转化的酶为醛脱氢酶。在具体的实施方案中,醛脱氢酶由酿酒酵母ALD6基因或其同源物编码。
在又一个实施方案中,本发明涉及用于产生异丁醇的重组微生物,其中所述重组微生物包括产生异丁醇的代谢途径,并且其中所述微生物(i)被工程化以降低或消除催化乙酰乳酸向DH2MB转化的酶的表达或活性以及(ii)被工程化以降低或消除催化异丁醛向异丁酸转化的酶的表达或活性。在一些实施方案中,催化乙酰乳酸向DH2MB转化的酶为3-酮酸还原酶(3-KAR)。在具体的实施方案中,3-酮酸还原酶由酿酒酵母TMA29(YMR226C)基因或其同源物编码。在一些实施方案中,催化异丁醛向异丁酸转化的酶为醛脱氢酶。在具体的实施方案中,醛脱氢酶由酿酒酵母ALD6基因或其同源物编码。
在一个实施方案中,产生异丁醇的代谢途径包括至少一个催化丙酮酸向异丁醇转化步骤的外源基因。在另一个实施方案中,产生异丁醇的代谢途径包括至少两个催化丙酮酸向异丁醇转化步骤的外源基因。在又一个实施方案中,产生异丁醇的代谢途径包括至少三个催化丙酮酸向异丁醇转化步骤的外源基因。在又一个实施方案中,产生异丁醇的代谢途径包括至少四个催化丙酮酸向异丁醇转化步骤的外源基因。在又一个实施方案中,产生异丁醇的代谢途径包括至少五个催化丙酮酸向异丁醇转化步骤的外源基因。
在一个实施方案中,异丁醇途径基因中的一个或多个编码局限于胞质溶胶的酶。在一个实施方案中,重组微生物包括产生异丁醇的代谢途径,其具有至少一种局限于胞质溶胶的异丁醇途径酶。在另一个实施方案中,重组微生物包括产生异丁醇的代谢途径,其具有至少两种局限于胞质溶胶的异丁醇途径酶。在又一个实施方案中,重组微生物包括产生异丁醇的代谢途径,其具有至少三种局限于胞质溶胶的异丁醇途径酶。在又一个实施方案中,重组微生物包括产生异丁醇的代谢途径,其具有至少四种局限于胞质溶胶的异丁醇途径酶。在示例性的实施方案中,重组微生物包括产生异丁醇的代谢途径,其具有至少五种局限于胞质溶胶的异丁醇途径酶。
在本文所述的多个实施方案中,异丁醇途径基因编码选自由下列组成的组的酶:乙酰乳酸合酶(ALS)、酮醇酸还原异构酶(KARI)、二羟酸脱水酶(DHAD)、2-酮酸脱羧酶(KIVD)和醇脱氢酶(ADH)。
在另一方面,重组微生物可被工程化以通过降低和/或消除一种或多种醇脱氢酶的表达而减少异丁醇向异丁醛的转化。在具体的实施方案中,醇脱氢酶由选自由下列组成的组的基因编码:ADH1、ADH2、ADH3、ADH4、ADH5、ADH6和ADH7及其同源物和变体。
在另一方面,本发明涉及修饰的醇脱氢酶(ADH),其表现出增强的异丁醛向异丁醇转化能力。一般来讲,表达这些改良ADH酶的细胞将在发酵反应过程中产生升高水平的异丁醇。虽然本发明的修饰ADH酶可用于产生异丁醇的发酵反应,但是通过本公开,本领域的技术人员还将领会,这些修饰的ADH酶也可用于产生其它醇的发酵反应,诸如1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、1-戊醇、2-甲基-1-丁醇和3-甲基-1-丁醇。
在某些方面,本发明涉及醇脱氢酶(ADH),其被修饰以增强酶将异丁醛转化成异丁醇的能力。此类ADH的实例包括在对应于选自以下的氨基酸的位置具有一个或多个突变的酶:(a)乳酸乳球菌(L.lactis)AdhA(SEQ ID NO:185)第50位酪氨酸;(b)乳酸乳球菌AdhA(SEQ ID NO:185)第77位谷氨酰胺;(c)乳酸乳球菌AdhA(SEQ ID NO:185)第108位缬氨酸;(d)乳酸乳球菌AdhA(SEQ ID NO:185)第113位酪氨酸;(e)乳酸乳球菌AdhA(SEQ ID NO:185)第212位异亮氨酸;以及(f)乳酸乳球菌AdhA(SEQ ID NO:185)第264位亮氨酸,其中AdhA(SEQ ID NO:185)由乳酸乳球菌醇脱氢酶(ADH)基因adhA(SEQ ID NO:184)或其密码子优化形式(SEQ ID NO:206)编码。
在一个实施方案中,修饰的ADH酶在对应于乳酸乳球菌AdhA(SEQ IDNO:185)第50位的氨基酸包含突变。在另一个实施方案中,修饰的ADH酶在对应于乳酸乳球菌AdhA(SEQ ID NO:185)第77位的氨基酸包含突变。在又一个实施方案中,修饰的ADH酶在对应于乳酸乳球菌AdhA(SEQ ID NO:185)第108位的氨基酸包含突变。在又一个实施方案中,修饰的ADH酶在对应于乳酸乳球菌AdhA(SEQ ID NO:185)第113位的氨基酸包含突变。在又一个实施方案中,修饰的ADH酶在对应于乳酸乳球菌AdhA(SEQ ID NO:185)第212位的氨基酸包含突变。在又一个实施方案中,修饰的ADH酶在对应于乳酸乳球菌AdhA(SEQ ID NO:185)第264位的氨基酸包含突变。
在一个实施方案中,ADH酶在对应于上述位置的氨基酸包含两个或更多个突变。在另一个实施方案中,ADH酶在对应于上述位置的氨基酸包含三个或更多个突变。在又一个实施方案中,ADH酶在对应于上述位置的氨基酸包含四个或更多个突变。在又一个实施方案中,ADH酶在对应于上述位置的氨基酸包含五个或更多个突变。在又一个实施方案中,ADH酶在对应于上述位置的氨基酸包含六个突变。
在一个具体实施方案中,本发明涉及其中第50位的酪氨酸被苯丙氨酸或色氨酸残基替换的ADH酶。在另一个具体实施方案中,本发明涉及其中第77位的谷氨酰胺被精氨酸或丝氨酸残基替换的ADH酶。在另一个具体实施方案中,本发明涉及其中第108位的缬氨酸被丝氨酸或丙氨酸残基替换的ADH酶。在另一个具体实施方案中,本发明涉及其中第113位的酪氨酸被苯丙氨酸或甘氨酸残基替换的ADH酶。在另一个具体实施方案中,本发明涉及其中第212位的异亮氨酸被苏氨酸或缬氨酸残基替换的ADH酶。在又一个具体实施方案中,本发明涉及其中第264位的亮氨酸被缬氨酸残基替换的ADH酶。在一个实施方案中,ADH酶在对应于这些具体实施方案中所述的位置的氨基酸包含两个或更多个突变。在另一个实施方案中,ADH酶在对应于这些具体实施方案中所述的位置的氨基酸包含三个或更多个突变。在又一个实施方案中,ADH酶在对应于这些具体实施方案中所述的位置的氨基酸包含四个或更多个突变。在又一个实施方案中,ADH酶在对应于这些具体实施方案中所述的位置的氨基酸包含五个或更多个突变。在又一个实施方案中,ADH酶在对应于这些具体实施方案中所述的位置的氨基酸包含六个突变。
在某些示例性实施方案中,ADH酶包含选自以下的序列:SEQ ID NO:189、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:193、SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:199、SEQ ID NO:201、SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:205、SEQID NO:208、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:216、SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:220、SEQ ID NO:222、SEQ ID NO:224及其同源物或变体,它们与野生型或亲本酶相比包含相应的突变。
如前面的段落中所提及,除了乳酸乳球菌AdhA(SEQ ID NO:185)外,包含与上述那些相对应的改变的ADH酶也包括在本发明的范围内。此类ADH酶可以包括但不限于在表97中列出的ADH酶。
在一些实施方案中,待修饰的ADH酶为NADH依赖性ADH酶。此类NADH依赖性ADH酶的实例在共同拥有和共同未决的美国专利公开No.2010/0143997中有所描述,该专利公开全文以引用方式并入本文以用于所有目的。在一些实施方案中,对最初编码利用NADPH的ADH酶的基因进行修饰,以将该酶的辅因子偏好切换到NADH。
如本文所述,修饰的ADH与野生型或亲本ADH相比将通常表现出增强的将异丁醛转化成异丁醇的能力。优选地,修饰的ADH酶的催化效率(kcat/KM)与野生型或亲本ADH相比增强至少约5%。更优选地,修饰的ADH酶的催化效率与野生型或亲本ADH相比增强至少约15%。更优选地,修饰的ADH酶的催化效率与野生型或亲本ADH相比增强至少约25%。更优选地,修饰的ADH酶的催化效率与野生型或亲本ADH相比增强至少约50%。更优选地,修饰的ADH酶的催化效率与野生型或亲本ADH相比增强至少约75%。更优选地,修饰的ADH酶的催化效率与野生型或亲本ADH相比增强至少约100%。更优选地,修饰的ADH酶的催化效率与野生型或亲本ADH相比增强至少约200%。更优选地,修饰的ADH酶的催化效率与野生型或亲本ADH相比增强至少约500%。更优选地,修饰的ADH酶的催化效率与野生型或亲本ADH相比增强至少约1000%。更优选地,修饰的ADH酶的催化效率与野生型或亲本ADH相比增强至少约2000%。更优选地,修饰的ADH酶的催化效率与野生型或亲本ADH相比增强至少约3000%。最优选地,修饰的ADH酶的催化效率与野生型或亲本ADH相比增强至少约3500%。
在另外的方面,本发明涉及修饰的ADH酶,其已进行了密码子优化,以在某些期望的宿主生物诸如酵母和大肠杆菌(E.coli)中表达。在其它方面,本发明涉及包含本发明的修饰ADH酶的重组宿主细胞。根据该方面,本发明还涉及在任何发酵过程中使用修饰的ADH酶的方法,在这些发酵过程中期望将异丁醛转化成异丁醇。在根据该方面的一个实施方案中,修饰的ADH酶可适于增强宿主细胞产生异丁醇的能力。在根据该方面的另一个实施方案中,修饰的ADH酶可适于增强宿主细胞产1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、1-戊醇、2-甲基-1-丁醇和3-甲基-1-丁醇的能力。
在本文所述的多个实施方案中,包含修饰的ADH的重组微生物还可被进一步工程化以表达产生异丁醇的代谢途径。在一个实施方案中,重组微生物可被工程化以表达包含至少一个外源基因的产生异丁醇的代谢途径。在一个实施方案中,重组微生物可被工程化以表达包含至少两个外源基因的产生异丁醇的代谢途径。在另一个实施方案中,重组微生物可被工程化以表达包含至少三个外源基因的产生异丁醇的代谢途径。在另一个实施方案中,重组微生物可被工程化以表达包含至少四个外源基因的产生异丁醇的代谢途径。在另一个实施方案中,重组微生物可被工程化以表达包含五个外源基因的产生异丁醇的代谢途径。因此,本发明还提供包含产生异丁醇代谢途径的重组微生物以及使用所述重组微生物产生异丁醇的方法。
在本文所述的多个实施方案中,异丁醇途径酶选自乙酰乳酸合酶(ALS)、酮醇酸还原异构酶(KARI)、二羟酸脱水酶(DHAD)、2-酮酸脱羧酶(KIVD)和醇脱氢酶(ADH)。
在本文所述的多个实施方案中,异丁醇途径酶可衍生自原核生物。在本文所述的可供选择的实施方案中,异丁醇途径酶可衍生自真核生物。将丙酮酸转化成异丁醇的示例性代谢途径可由以下部分组成:乙酰醇酸合酶(ALS),例如由枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的alsS编码;酮醇酸还原异构酶(KARI),例如由大肠杆菌的ilvC编码;二羟酸脱水酶(DHAD),例如由乳酸乳球菌的ilvD编码;2-酮酸脱羧酶(KIVD),例如由乳酸乳球菌的kivD编码;以及醇脱氢酶(ADH)(如本文所述的修饰的ADH),例如由乳酸乳球菌的adhA编码,如本文所述,其在Y50、Q77、V108、Y113、I212和L264位具有一个或多个突变。
在本文所述的多个实施方案中,重组微生物可以是酵母属进化枝的微生物、Saccharomyces sensu stricto微生物、Crabtree-阴性酵母微生物、Crabtree-阳性酵母微生物、后-WGD(全基因组倍增)酵母微生物、前-WGD(全基因组倍增)酵母微生物以及非发酵酵母微生物。
在一些实施方案中,重组微生物可以为酵母属进化枝的酵母重组微生物。
在一些实施方案中,重组微生物可以为Saccharomyces sensu stricto微生物。在一个实施方案中,Saccharomyces sensu stricto选自由下列组成的组:酿酒酵母、库德里阿兹威酵母(S.kudriavzevii)、S.mikatae、贝酵母、葡萄汁酵母(S.uvarum)、S.carocanis及其杂交体。
0047在一些实施方案中,重组微生物可以为Crabtree-阴性重组酵母微生物。在一个实施方案中,将Crabtree-阴性酵母微生物归类为选自由下列组成的组的属:酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、汉逊酵母属(Hansenula)或假丝酵母属(Candida)。在另外的实施方案中,Crabtree-阴性酵母微生物选自可鲁弗酵母、乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、异常毕赤酵母(Pichia anomala)、树干毕赤酵母、异常汉逊酵母(Hansenula anomala)、产朊假丝酵母(Candidautilis)和克鲁雄酵母。
在一些实施方案中,重组微生物可以是Crabtree-阳性重组酵母微生物。在一个实施方案中,将Crabtree-阳性酵母微生物归类为选自由下列组成的组的属:酵母属、克鲁维酵母属、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、假丝酵母属、毕赤酵母属和裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)。在另外的实施方案中,Crabtree-阳性酵母微生物选自由下列组成的组:啤酒酵母、葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)、贝酵母、奇异酵母(Saccharomyces paradoxus)、芽殖酵母、耐热克鲁维酵母、光滑假丝酵母、拜耳接合酵母(Z.bailli)、鲁氏接合酵母、汉逊德巴利酵母、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastorius)、粟酒裂殖酵母和葡萄汁酵母。
在一些实施方案中,重组微生物可以是后-WGD(全基因组倍增)酵母重组微生物。在一个实施方案中,将后-WGD酵母重组微生物归类为选自由下列组成的组的属:酵母属或假丝酵母属。在另外的实施方案中,后-WGD酵母选自由下列组成的组:啤酒酵母、葡萄汁酵母、贝酵母、奇异酵母、芽殖酵母和光滑假丝酵母。
在一些实施方案中,重组微生物可以为前-WGD(全基因组倍增)酵母重组微生物。在一个实施方案中,将前-WGD酵母重组微生物归类为选自由下列组成的组的属:酵母属、克鲁维酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属、伊萨酵母属、德巴利酵母属、汉逊酵母属、管囊酵母属(Pachysolen)、耶氏酵母属和裂殖酵母属。在另外的实施方案中,前-WGD酵母选自由下列组成的组:可鲁弗酵母、耐热克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、克鲁雄酵母、乳酸克鲁维酵母、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、巴斯德毕赤酵母、异常毕赤酵母、树干毕赤酵母、东方伊萨酵母、西方伊萨酵母(Issatchenkia occidentalis)、汉逊德巴利酵母、异常汉逊酵母、嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilis)、解脂耶氏酵母和粟酒裂殖酵母。
在一些实施方案中,重组微生物可以为属于非发酵酵母微生物的微生物,包括但不限于归类为选自由下列组成的组的属的那些:丝孢酵母属(Tricosporon)、红酵母属(Rhodotorula)、Myxozyma或假丝酵母属。在具体的实施方案中,非发酵酵母为C.xestobii。
在另一方面,本发明提供使用如本文所述的重组微生物产生有益代谢产物(包括燃料、化学品和氨基酸)的方法。在一个实施方案中,该方法包括在含有提供碳源的原料的培养基中培养重组微生物直到产生可回收量的代谢产物,以及任选地回收所述代谢产物。在一个实施方案中,该微生物以至少约5%的理论得率由碳源产生代谢产物。在另一个实施方案中,该微生物以至少约10%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或至少约97.5%的理论得率产生代谢产物。在一个实施方案中,该代谢产物可以衍生自使用3-酮酸作为中间体的生物合成途径。在一个实施方案中,3-酮酸中间体为乙酰乳酸。因此,该代谢产物可以衍生自使用乙酰乳酸作为中间体的生物合成途径,包括但不限于异丁醇、2-丁醇、1-丁醇、2-丁酮、2,3-丁二醇、乙偶姻、二乙酰、缬氨酸、亮氨酸、泛酸、异丁烯、3-甲基-1-丁醇、4-甲基-1-戊醇和辅酶A生物合成途径。在另一个实施方案中,3-酮酸中间体为2-乙酰-2-羟基丁酸。因此,该代谢产物可以衍生自使用2-乙酰-2-羟基丁酸作为中间体的生物合成途径,包括但不限于2-甲基-1-丁醇、异亮氨酸、3-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-己醇和5-甲基-1-庚醇生物合成途径。在另一个实施方案中,该代谢产物可以衍生自使用醛作为中间体的生物合成途径,包括但不限于异丁醇、1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、1-丙醇、1-戊醇、1-己醇、3-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-己醇和5-甲基-1-庚醇生物合成途径。在又一个实施方案中,该代谢产物可以衍生自使用乙酰乳酸和醛作为中间体的生物合成途径,包括但不限于异丁醇、1-丁醇和3-甲基-1-丁醇生物合成途径。在又一个实施方案中,该代谢产物可以衍生自使用2-乙酰-2-羟基丁酸和醛作为中间体的生物合成途径,包括但不限于2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-己醇和5-甲基-1-庚醇生物合成途径。
在一个实施方案中,重组微生物在有氧条件下生长。在另一个实施方案中,重组微生物在微氧条件下生长。在又一个实施方案中,重组微生物在厌氧条件下生长。
附图简述
本发明的说明性性实施方案以附图示出,其中:
图1示出了异丁醇途径的示例性实施方案。
图2示出了能够由3-酮酸还原酶催化的示例性反应。
图3示出了示例性3-酮酸还原酶及其相应的酶分类号的非限制性列表。
图4示出了能够由醛脱氢酶催化的示例性反应。
图5示出了在产生异丁醇的重组微生物中减少DH2MB和异丁酸产生的策略。
图6示出了在产生3-甲基-1-丁醇的重组微生物中减少DH2MB和3-甲基-1-丁酸产生的策略。
图7示出了在产生2-甲基-1-丁醇的重组微生物中减少2-乙基-2,3-二羟基丁酸和2-甲基-1-丁酸产生的策略。
图8示出了LC4色谱图的叠加,显示了含DH2MB和乙酸的样品(上图)以及含乙酸和DHIV的样品(下图)。洗脱顺序:DH2MB然后是乙酸(上图);乳酸、乙酸、DHIV、异丁酸、丙酮酸(下图)。
图9示出了样品馏分的色谱图,该馏分在对应于通过LC1收集的DHIV的保留时间收集,并在使用电导率检测的AS-11色谱柱上通过LC4分析。
图10示出了通过LC1分离的峰的1H-COSY光谱。该光谱表明0.95ppm的DH2MB甲基质子(双峰)偶合到3.7ppm的次甲基质子(四重峰)。
图11示出了通过LC1分离的峰的1H-NMR光谱。该光谱表明存在DH2MB:1.2ppm的甲基质子(a)单峰(积分值为3),0.95ppm的甲基质子(b)双峰(积分值为3)以及3.7ppm的次甲基质子(c)四重峰(积分值为1.84)。次甲基质子(c)的积分值由于在同一区域中与葡萄糖共振重叠而大于1。
图12示出了通过LC1分离的峰的LC-MS分析。在该样品中鉴定出多个分子离子,如图的顶部所示。134分子离子的进一步碎裂(MS2)表明,分离的LC1馏分含有通过CO2(*)和H2O+CO2(**)的特征性丢失产生的羟基羧酸。
图13示出了2,3-二羟基-2-甲基丁酸的非对映和对映体结构:(2R,3S)-1a、(2S,3R)-1b、(2R,3R)-2a、(2S,3S)-2b。
图14示出了结晶DH2MB在D2O中的1H光谱。1H NMR(TSP)1.1(d,6.5Hz,3H),1.3(s,3H),3.9(q,6.5Hz,3H)
图15示出了结晶DH2MB在D2O中的13C光谱。光谱表明存在五个不同的碳共振,其中一个为181ppm的特征性羧酸共振。
图16示出了通过GEVO3160的单式发酵产生的异丁醇及副产物的发酵变化曲线。生产曝气从0.8mM/h的OTR降低到接种后93h的0.3mM/h。空心菱形=iBuOH,方形=未知定量为DH2MB,星号=细胞干重(cdw)以及实心三角形=总副产物。
图17示出了乳酸乳球菌AdhA氨基酸序列与嗜热脂肪土芽孢杆菌(G.stearothermophilus)结构的结构比对(Pymol)。示出了活性位点突变(Y50F和L264V)。还示出了辅助因子结合结构域中的突变(I212T和N219Y)。
图18示出了利用乙酰乳酸作为中间体的生物合成途径。生产1-丁醇、异丁醇、3-甲基-1-丁醇和4-甲基-1-戊醇的生物合成途径使用乙酰乳酸和醛两者作为中间体。
图19示出了利用2-乙酰-2-羟基丁酸作为中间体的生物合成途径。生产2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-己醇和5-甲基-1-庚醇的生物合成途径使用2-乙酰-2-羟基丁酸和醛两者作为中间体。
图20示出了利用醛作为中间体的另外的生物合成途径。
发明详述
除非上下文另有明确表示,否则如本文和所附权利要求书中所用,单数形式“一个”、“一种”和“该”包括多个指代物。因此,例如,提及“一种多核苷酸”包括多种此类多核苷酸,而提及“该微生物”包括提及一种或多种微生物等等。
除非另有定义,否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管与本文描述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料也可用于所公开的方法和组合物的实践,但是本文描述了示例性的方法、装置和材料。
上文以及全文中讨论的任何出版物仅是为了它们在本申请提交日期之前的公开内容而提供的。都不应解释为发明人由于在先公开的内容而承认本文的内客不能置于这些内容之前。
术语“微生物”包括来自古细菌域、细菌域和真核域的原核和真核微生物种,后者包括酵母和丝状真菌、原生动物、藻类或高等原生生物。术语“微生物细胞(microbial cell)”和“微菌(microbe)”与术语微生物(microorganism)可互换使用。
术语“属”根据Taxonomic Outline of Bacteria and Archaea(Garrity,G.M.,Lilburn,T.G.,Cole,J.R.,Harrison,S.H.,Euzeby,J.,and Tindall,B.J.(2007)TheTaxonomic Outline of Bacteria and Archaea.TOBA Release 7.7,March 2007.Michigan State University Board of Trustees.[http://www.taxonomicoutline.org/])定义为相关种的分类群。
术语“种”定义为密切相关的生物体的集合,其具有大于97%的16S核糖体RNA序列同源性和大于70%的基因组杂交,并且与所有其它生物体有充分的区别从而被认为是不同的单位。
术语“重组微生物”、“修饰微生物”和“重组宿主细胞”在本文可互换使用并指代如下的微生物,所述微生物经遗传修饰以表达或过表达内源多核苷酸、或表达异源性多核苷酸(诸如包含在载体中、整合构建体中的那些)、或在内源基因的表达上有改变。所谓“改变”是指基因的表达、或RNA分子水平或编码一种或多种多肽或多肽亚单位的等效RNA分子水平、或一种或多种多肽或多肽亚单位的活性被上调或下调,使得表达、水平或活性大于或小于在没有该变化时所观察到的。例如,术语“改变”可以表示“抑制”,但是词语“改变”的用途并不限于此定义。
关于基因序列的术语“表达”是指该基因的转录,以及在适当时,将所得的mRNA转录物翻译成蛋白质。因此,从上下文中将会明确,蛋白质的表达是由开放阅读框序列的转录和翻译产生的。宿主细胞中所需产物的表达水平可基于细胞中存在的相应mRNA的量或由所选序列编码的所需产物的量来决定。例如,从所选序列转录的mRNA可以由PCR或Northern杂交来定量(参见Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press (1989))。由所选序列编码的蛋白质可以通过多种方法定量,例如,通过ELISA,通过测定蛋白质的生物活性,或通过采用不依赖这种活性的测定法,诸如Western印迹或放射性免疫测定,其使用识别蛋白质并与蛋白质结合的抗体。参见Sambrook等,1989(见上文)。多核苷酸通常编码在产生所需代谢产物的代谢途径中涉及到的靶酶。应当理解,术语“重组微生物”和“重组宿主细胞”不仅仅指具体的重组微生物,还指这种微生物的子代或潜在子代。由于某些修饰可能因为突变或环境影响而在后代中发生,所以事实上这些子代可能与亲本细胞不同,但是其仍然包含在如本文所用的术语的范围之内。
术语“过表达”是指与类似的相应表达基础水平mRNA(如编码Aft蛋白质的那些)或具有基础蛋白质水平的未修饰细胞相比,细胞中编码蛋白质(如TMA29蛋白质或其同源物)的mRNA水平升高(如水平异常)和/或蛋白质(如TMA29)水平升高。在特定实施方案中,在工程化以表现出增加的TMA29mRNA、蛋白质和/或活性的微生物中,TMA29或其同源物可过表达至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、8倍、10倍、12倍、15倍或更多倍。
如本文所用以及如本领域的普通技术人员将会理解,蛋白质(诸如酶)“降低的活性和/或表达”可以表示细胞中降低的蛋白质比催化活性(如降低的活性)和/或降低的蛋白质浓度(如降低的表达),而蛋白质(诸如酶)“缺失的活性和/或表达”或“消除的活性和/或表达”可以表示细胞中酶的比催化活性为零或可以忽略(如缺失的活性)和/或酶浓度为零或可以忽略(例如缺失的表达)。
术语“野生型微生物”描述出现在自然界中的细胞,即,未经遗传修饰的细胞。野生型微生物可以被遗传修饰以表达或过表达第一目标酶。此微生物可以在经修饰而表达或过表达第二目标酶的微生物的产生中充当亲本微生物。依次类推,可以修饰经修饰以表达或过表达第一和第二目标酶的微生物以使其表达或过表达第三目标酶。
因此,“亲本微生物”起到连续遗传修饰事件的参照细胞的作用。每次修饰事件都可以通过将核酸分子引入参照细胞来完成。这种引入促进目标酶的表达或过表达。应当理解,术语“促进”涵盖通过对亲本微生物中的例如启动子序列进行遗传修饰而活化编码目标酶的内源多核苷酸。还应理解的是术语“促进”涵盖向亲本微生物中引入编码目标酶的异源多核苷酸。
术语“工程化”是指导致微生物中出现可检测变化的对微生物的任何操纵,其中所述操纵包括但不限于插入对于所述微生物是异源的多核苷酸和/或多肽以及突变对于所述微生物是天然的多核苷酸和/或多肽。
如本文所用的术语“突变”表示对核酸和/或多肽的任何修饰,其导致核酸或多肽改变。突变包括(例如)多核苷酸中的点突变、缺失或单个或多个残基的插入,其包括出现在基因的蛋白质编码区内的改变以及在蛋白质编码序列以外区域(诸如但不限于调控或启动子序列)中的改变。遗传改变可以是任何类型的突变。例如,突变可以构成点突变、移码突变、无义突变、插入或部分或全部基因的缺失。此外,在一些修饰的微生物的实施方案中,微生物基因组的一部分已经被异源多核苷酸替换。在一些实施方案中,突变是天然发生的。在其它实施方案中,突变通过人工选择压力而鉴定和/或富集。在其它实施方案中,微生物基因组中的突变是遗传工程的结果。
术语“生物合成途径”,也称为“代谢途径”,是指为了将一种化学物质转化为另一种化学物质的一组合成代谢的或分解代谢的生化反应。如果基因产物平行或连续地作用于相同的底物、产生相同的产物、或作用于或产生在相同底物和代谢终产物之间的代谢中间体(即代谢产物),那么它们属于相同的“代谢途径”。
如本文所用,术语“产生异丁醇的代谢途径”是指由丙酮酸产生异丁醇的酶途径。
如本文所用的关于分子并且特别是酶和多核苷酸的术语“异源”表示分子在生物体中表达,该生物体不同于该分子所起源的生物体或在自然界中存在该分子的生物体,而与表达水平无关,表达水平可低于、等于或高于该分子在天然微生物中的表达水平。
另一方面,如本文所用的关于分子并且特别是酶和多核苷酸的术语“天然”或“内源”表示该分子在生物体中表达,该生物体是该分子所起源的生物体或在自然界中存在该分子的生物体,而与表达水平无关,表达水平可低于、等于或高于该分子在天然微生物中的表达水平。应当理解,在重组微生物中可以修饰天然酶或多核苷酸的表达。
术语“原料”定义为提供给微生物或能够产生其它产物的发酵过程的原材料或原材料的混合物。例如,碳源(诸如生物质或由生物质衍生的碳化合物)是供在发酵过程中产生生物燃料的微生物用的原料。然而,原料可以含有碳源之外的营养物。
术语“底物”或“合适的底物”是指通过酶的作用转化或要转化为另一种化合物的任何物质或化合物。该术语不仅包括单一的化合物,还包括化合物的组合,诸如含有至少一种底物或其衍生物的溶液、混合物以及其它材料。此外,术语“底物”不仅涵盖提供适宜作为起始材料使用的碳源的化合物,诸如任何生物质衍生的糖,还包括如本文描述的在与重组微生物相关的途径中使用的中间体和终产物代谢产物。
所用术语“C2-化合物”是指包含两个碳原子的有机化合物,包括但不限于乙醇和乙酸盐/酯,该“C2-化合物”用作碳源供工程化酵母微生物用,所述酵母微生物在所有丙酮酸脱羧酶(PDC)基因中带有突变,导致所述基因的丙酮酸脱羧酶活性降低。
术语“发酵”或“发酵过程”定义为这样的过程,其中在包含原材料(诸如原料和营养物)的培养基中培养微生物,其中所述微生物将原材料(诸如原料)转化为产物。
术语“容积生产率”或“生产速率”定义为每单位时间每体积培养基形成的产物的量。容积生产率以克每升每小时(g/L/h)记录。
术语“比生产率”或“比生产速率”定义为每一定量的细胞每单位时间每体积培养基形成的产物量。比生产率以克或毫克每升每小时每OD(g/L/h/OD)记录。
术语“得率”定义为每单位重量的原材料获得的产物的量并可以表示为克产物每克底物(g/g)。得率可以表示为理论得率的百分比。“理论得率”定义为可由给定量底物产生的产物的最大量,如通过用于产生产物的代谢途径的化学计量学所指定。例如,葡萄糖向异丁醇的一种典型转化的理论得率为0.41g/g。照这样,0.39g/g的由葡萄糖到异丁醇的得率可以表示为理论值的95%或95%理论得率。
术语“滴度”定义为溶液的浓度或溶液中物质的浓度。例如,发酵液中生物燃料的滴度描述为每升发酵液中的溶液中生物燃料的克数(g/L)。
“有氧条件”定义为发酵培养基中的氧浓度对于需氧或兼性厌氧微生物而言足以用作末端电子受体的条件。
相反,“厌氧条件”定义为发酵培养基中的氧浓度对于微生物而言太低而不能用作末端电子受体的条件。厌氧条件可以通过将惰性气体(诸如氮气)鼓入发酵培养基直到氧不再能够用作微生物的末端电子受体来实现。作为另外一种选择,厌氧条件可以通过微生物消耗发酵中的可用氧直至氧不能用作微生物的末端电子受体来实现。在厌氧条件下产生异丁醇的方法描述于共同拥有和共同未决的专利公开US 2010/0143997中,其公开内容全文以引用方式并入本文以用于所有目的。
“有氧代谢”是指如下生化过程,其中氧被用作末端电子受体以由碳水化合物产生能量,通常以ATP的形式。例如通过糖酵解和TCA循环发生有氧代谢,其中在氧的存在下,将单个葡萄糖分子完全代谢为二氧化碳。
相反,“厌氧代谢”是指其中氧不是NADH中所含电子的最终受体的生化过程。厌氧代谢可以分为:厌氧呼吸,其中不同于氧的化合物被用作末端电子受体;和底物水平磷酸化,其中利用来自NADH的电子以通过“发酵性途径”产生还原产物。
在“发酵性途径”中,NAD(P)H将其电子贡献给通过产生NAD(P)H上携带的电子的同一代谢途径所产生的分子。例如,在某些酵母菌株的发酵性途径之一中,通过糖酵解产生的NAD(P)H将其电子传递给丙酮酸,从而产生乙醇。发酵性途径通常在厌氧条件下有活性,但是也可以发生在有氧条件下、在NADH未通过呼吸链完全氧化的条件下。例如,高于某些葡萄糖浓度时,Crabtree-阳性酵母在有氧条件下产生大量乙醇。
术语“副产物(byproduct)”或“副产物(byproduct)”是指与氨基酸、氨基酸前体、化学品、化学品前体、生物燃料或生物燃料前体的产生相关的非期望的产物。
术语“基本上不含”当关于与所需代谢途径(例如,产生异丁醇的代谢途径)竞争的碳途径中的酶活性(3-KAR、ALDH、PDC、GPD等)的存在与否使用时,是指酶的水平基本上低于野生型宿主中相同酶的水平,其中低于野生型水平的约50%是优选的,而低于约30%是更优选的。活性可以低于野生型活性的约20%、低于约10%、低于约5%或低于约1%。“基本上不含”特定酶活性(3-KAR、ALDH、PDC、GPD等)的微生物可以通过重组方法构建或在自然界中鉴定。
术语“非发酵酵母”是一种酵母物种,其不能展示出其中利用来自NADH的电子经由发酵性途径产生还原产物(诸如由葡萄糖产生乙醇和CO2)的厌氧代谢。非发酵酵母可以通过“德拉姆管检测”(J.A.Barnett,R.W.Payne,and D.Yarrow.2000.Yeasts Characteristics and Identification.第三版.第28-29页.Cambridge University Press,Cambridge,UK)或通过监测发酵产物(诸如乙醇和CO2)的产生来鉴定。
术语“多核苷酸”在本文中可与术语“核酸”互换使用,并且是指由两种或更多种单体(包括核苷酸、核苷或其类似物)组成的有机聚合物,包括但不限于任意长度的单链或双链、有义或反义脱氧核糖核酸(DNA),以及在适当时,任意长度的单链或双链、有义或反义核糖核酸(RNA),包括siRNA。术语“核苷酸”是指由结合到嘌呤或嘧啶碱基并结合到磷酸基团的核糖或脱氧核糖组成的多种化合物的任一种,并且它们是核酸的基本结构单元。术语“核苷”是指由与脱氧核糖或核糖组合的嘌呤或嘧啶碱基组成的化合物(如鸟苷或腺苷),并且其特别存在于核酸中。术语“核苷酸类似物”或“核苷类似物”分别是指这样的核苷酸或核苷,其中一个或多个单独的原子被不同原子或不同的官能团替换。因此,术语“多核苷酸”包括任意长度的核酸、DNA、RNA、其类似物和片段。三个或更多个核苷酸的多核苷酸也称为核苷酸寡聚物或寡核苷酸。
应当理解,本文描述的多核苷酸包括“基因”,并且本文描述的核酸分子包括“载体”或“质粒”。因此,术语“基因”,也称为“结构基因”,是指编码特定氨基酸序列的多核苷酸,其包合一种或多种蛋白质或酶的全部或部分,并且可以包括调节性(非转录的)DNA序列,诸如启动子序列,其确定例如在何种条件下表达基因。基因的转录区可以包括非翻译区(包括内含子、5'-非翻译区(UTR)和3'-UTR)以及编码序列。
术语“操纵子”是指由共同的启动子作为单一转录单元而转录的两种或更多种基因。在一些实施方案中,构成操纵子的基因是相邻的基因。应当理解,可以通过修饰该共同的启动子而改变整个操纵子的转录(即,增加、减少或消除)。作为另外一种选择,可以修饰操纵子中的任何基因或基因的组合以改变所编码的多肽的功能或活性。修饰可导致编码多肽的活性提高。进一步地,修饰可以赋予编码的多肽新的活性。示例性的新活性包括可选底物的应用和/或在可选环境条件中发挥作用的能力。
“载体”是任何如下的手段,即可以通过该手段使核酸在生物体、细胞或细胞组分之间增殖和/或转移。载体包括病毒、噬菌体、原病毒、质粒、噬菌粒、转座子和人工染色体诸如YAC(酵母人工染色体)、BAC(细菌人工染色体)和PLAC(植物人工染色体)等,这些是“附加体(episome)”,也就是说,其自主地复制或者可整合到寤主细胞的染色体内。载体也可以是裸RNA多核苷酸、裸DNA多核苷酸、在同一链内由DNA和RNA两者组成的多核苷酸、多聚赖氨酸缀合的DNA或RNA、多肽缀合的DNA或RNA、脂质体缀合的DNA等,它们本质上不是附加体,或者载体可以是包含一种或多种上述多核苷酸构建体的生物体,诸如土壤杆菌或细菌。
“转化”是指将载体引入宿主细胞的过程。转化(或转导、或转染)可以通过包括化学转化(例如乙酸锂转化)、电穿孔、显微注射、基因枪(或粒子轰击介导的传递)或土壤杆菌介导的转化在内的许多方法中的任一种来完成。
如本文所用的术语“酶”是指催化或促进一种或多种化学或生化反应的任何物质,其通常包括全部或部分由多肽组成的酶,但是可以包括由不同分子(包括多核苷酸)组成的酶。
如本文所用的术语“蛋白质”、“肽”或“多肽”表示由两种或更多种氨基酸单体和/或其类似物组成的有机聚合物。如本文所用,术语“氨基酸”或“氨基酸单体”是指包括甘氨酸和D或L光学异构体在内的任何天然和/或合成氨基酸。术语“氨基酸类似物”是指一个和多个单独的原子被不同的原子或不同的官能团替换的氨基酸。因此,术语多肽包括任意长度的氨基酸聚合物,其包括全长蛋白质和肽以及其类似物和片段。三个或更多个氨基酸的多肽也称为蛋白质寡聚物或寡肽。
关于第一家族或种的原始酶或基因的术语“同源物”是指第二家族或种的不同的酶或基因,其是通过功能、结构或基因组分析来确定的对应于第一家族或种的原始酶或基因的第二家族或种的酶或基因。最通常的情况是,同源物将具有功能、结构或基因组相似性。使用基因探针和PCR可以容易地克隆酶或基因的同源物的技术是已知的。克隆的序列作为同源物的身份(identity)可以使用功能测定法和/或通过对基因的基因组作图来确认。
如果由某一基因编码的氨基酸序列与第二基因的氨基酸序列具有相似的氨基酸序列,则该蛋白质与第二蛋白质具有“同源性”或与第二蛋白质是“同源的”。作为另外一种选择,如果某一蛋白质与第二蛋白质具有“相似的”氨基酸序列,则两种蛋白质具有同源性。(因此,将术语“同源蛋白质”定义为是指两种蛋白质具有相似的氨基酸序列)。
术语“类似物”或“类似的”是指仅在功能上彼此相关但不来自共同的谱系或不共有共同祖先序列的核酸或蛋白质序列或蛋白质结构。由于趋同进化,类似物在序列上可以不同但是可以共有相似的结构。例如,如果两种酶催化相同的底物转化为产物的反应、两种酶在序列上无关、且不论两种酶在结构上是否相关,那么这两种酶是类似物或者是类似的。
具有减少的副产物蓄积的重组微生物
酵母细胞转化糖以产生丙酮酸,其随后在多种细胞代谢途径中被利用。近年来,已将酵母细胞工程化,以通过丙酮酸驱动的生物合成途径产生多种所需的产物。在其中许多生物合成途径中,初始途径步骤是将内源性丙酮酸转化为3-酮酸。
如本文所用,“3-酮酸”是指在C1碳上包含羧酸部分以及在C3碳上包含酮部分的有机化合物。例如,乙酰乳酸和2-羟基-2-甲基-3-氧代丁酸是在C3碳上具有酮基团的3-酮酸(参见,例如图2)。
许多生物合成途径常见的3-酮酸的实例为乙酰乳酸,其由丙酮酸通过乙酰乳酸合酶(也称为乙酰羟酸合酶)的作用而形成。在使用乙酰乳酸作为中间体的生物合成途径中,包括产生异丁醇、2-丁醇、1-丁醇、2-丁酮、2,3-丁二醇、乙偶姻、二乙酰、缬氨酸、亮氨酸、泛酸、异丁烯、3-甲基-1-丁醇、4-甲基-1-戊醇和辅酶A的途径。合成这些有益的乙酰乳酸衍生的代谢产物的工程化生物合成途径见表1和图18。
表1.利用乙酰乳酸作为中间体的生物合成途径
a-此表中每篇参考文献的内容全文以引用方式并入本文以用于所有目的。
表1中所列的每种生物合成途径均共享共同的3-酮酸中间体-乙酰乳酸。因此,这些生物合成途径的产物得率将部分取决于可用于所述生物合成途径下游酶的乙酰乳酸的量。
许多生物合成途径常见的3-酮酸的另一个实例为2-乙酰-2-羟基丁酸,其由丙酮酸和2-酮丁酸通过乙酰乳酸合酶(也称为乙酰羟酸合酶)的作用而形成。在这些使用2-乙酰-2-羟基丁酸作为中间体的生物合成途径中,包括产生2-甲基-1-丁醇、异亮氨酸、3-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-己醇和5-甲基-1-庚醇的途径。合成这些有益的2-乙酰-2-羟基丁酸衍生的代谢产物的工程化生物合成途径见表2和图19。
表2.利用2-乙酰-2-羟基丁酸作为中间体的生物合成途径
a-此表中每篇参考文献的内容全文以引用方式并入本文以用于所有目的。
表2中所列的每种生物合成途径均共享共同的3-酮酸中间体-2-乙酰-2-羟基丁酸。因此,这些生物合成途径的产物得率将部分取决于可用于所述生物合成途径下游酶的乙酰乳酸的量。
同样,可将酵母细胞工程化以通过利用醛作为途径中间体的生物合成途径产生多种所需的产物。包含醛中间体的工程化生物合成途径包括产生异丁醇、1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、1-丙醇、1-戊醇、1-己醇、3-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-己醇和5-甲基-1-庚醇的生物合成途径(参见表3以及图18、19和20)。
表3.利用醛作为中间体的生物合成途径
a-此表中每篇参考文献的内容全文以引用方式并入本文以用于所有目的。
表3中所列的每种生物合成途径具有醛中间体。例如,产生异丁醇的代谢途径中的醛中间体为异丁醛(参见图1),而产生1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、1-丙醇、1-戊醇、1-己醇、3-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-己醇和5-甲基-1-庚醇的途径则分别利用1-丁醛、2-甲基-1-丁醛、3-甲基-1-丁醛、1-丙醛、1-戊醛、1-己醛、3-甲基-1-戊醛、4-甲基-1-戊醛、4-甲基-1-己醛和5-甲基-1-庚醇作为醛中间体。因此,在利用这些醛中间体的生物合成途径中的产物得率将部分取决于可用于所述生物合成途径下游酶的醛中间体的量。
如本文所述,本发明人已发现了负责由3-酮酸和/或醛中间体衍生的不需要的副产物蓄积的酶活性。具体地讲,他们已确定3-酮酸还原酶和醛脱氢酶负责分别将3-酮酸和醛转化为不需要的副产物。已表明,这些酶的活性会抑制3-酮酸-和/或醛衍生产物(包括但不限于表1-3中所列的那些)的最佳生产率和得率。本发明人已发现,抑制这些新表征的酶活性可显著降低或消除不需要的副产物的形成,同时增加有益代谢产物的得率和滴度。
减少的来自3-酮酸的3-羟基酸蓄积
如本文所述,本发明人已发现不需要的副产物3-羟基酸会在包含涉及3-酮酸中间体的途径的微生物发酵反应过程中蓄积。
如本文所用,“3-羟基酸”是在C1碳上含有羧酸部分以及在C3碳上含有醇部分的有机化合物。3-羟基酸可通过将3-酮酸的酮部分化学还原成醇部分而得自3-酮酸。例如,在乙酰乳酸或2-羟基-2-甲基-3-氧代丁酸中酮部分的还原导致形成3-羟基酸:2,3-二羟基-2-甲基丁酸(DH2MB)(参见,例如图2)。
本发明人已发现,3-羟基酸副产物-2,3-二羟基-2-甲基丁酸(CAS#14868-24-7)(DH2MB)在包含涉及3-酮酸中间体-乙酰乳酸的生物合成途径的微生物的发酵反应过程中蓄积。发现,该副产物的蓄积会抑制生物合成途径目标代谢产物的最佳生产率和得率。本发明人发现,DH2MB的产生由乙酰乳酸的还原所致。为了降低或消除负责产生DH2MB的活性,必须鉴定并降低或消除催化此反应的相应酶活性。本发明人在酿酒酵母中已发现,一种这样的催化乙酰乳酸向DH2MB转化的酶为YMR226C(也称为TMA29)。这是一种在酵母中将乙酰乳酸转化成DH2MB的首次报道的蛋白质。
131本发明人还发现,3-羟基酸副产物-2-乙基-2,3-二羟基丁酸在包含涉及3-酮酸中间体-2-乙酰-2-羟基丁酸的生物合成途径的微生物的发酵反应过程中蓄积。发现,该副产物的蓄积会抑制生物合成途径目标代谢产物的最佳生产率和得率。本发明人发现,2-乙基-2,3-二羟基丁酸的产生因2-乙酰-2-羟基丁酸的还原所致。为了降低或消除负责产生2-乙基-2,3-二羟基丁酸的活性,必须鉴定并降低或消除催化此反应的相应酶活性。本发明人已在酿酒酵母中发现,催化乙酰乳酸向DH2MB转化的酶YMR226C(也称为TMA29)也催化2-乙酰-2-羟基丁酸向2-乙基-2,3-二羟基丁酸的转化。这是一种在酵母中将2-乙酰-2-羟基丁酸转化成2-乙基-2,3-二羟基丁酸的首次报道的蛋白质。
本发明人在本文中介绍多种策略,用于减少3-酮酸中间体向相应的3-羟基酸副产物转化,这个过程伴随所需代谢产物得率的升高。在一个实施方案中,3-酮酸中间体为乙酰乳酸而相应的3-羟基酸为DH2MB。如本文所述,减少乙酰乳酸向DH2MB的转化使得能够增加有益代谢产物的产生,诸如异丁醇、2-丁醇、1-丁醇、2-丁酮、2,3-丁二醇、乙偶姻、二乙酰、缬氨酸、亮氨酸、泛酸、异丁烯、3-甲基-1-丁醇、4-甲基-1-戊醇和辅酶A,它们衍生自使用乙酰乳酸作为中间体的生物合成途径。在另一个实施方案中,3-酮酸中间体为2-乙酰-2-羟基丁酸,而相应的3-羟基酸为2-乙基-2,3-二羟基丁酸。如本文所述,减少2-乙酰-2-羟基丁酸向2-乙基-2,3-二羟基丁酸的转化使得能够增加有益代谢产物的产生,诸如2-甲基-1-丁醇、异亮氨酸、3-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-己醇和5-甲基-1-庚醇。
因此,本发明的一个方面涉及重组微生物,其包含使用3-酮酸作为中间体的生物合成途径,其中所述重组微生物基本上不含催化3-酮酸中间体向3-羟基酸副产物转化的酶。在一个实施方案中,3-酮酸中间体为乙酰乳酸,而3-羟基酸副产物为DH2MB。在另一个实施方案中,3-酮酸中间体为2-乙酰-2-羟基丁酸,而3-羟基酸副产物为2-乙基-2,3-二羟基丁酸。
在另一方面,本发明涉及重组微生物,其包含使用3-酮酸作为中间体的生物合成途径,其中所述重组微生物被工程化以降低或消除催化3-酮酸中间体向3-羟基酸副产物转化的酶的表达或活性。在一个实施方案中,3-酮酸中间体为乙酰乳酸,而3-羟基酸副产物为DH2MB。在另一个实施方案中,3-酮酸中间体为2-乙酰-2-羟基丁酸,而3-羟基酸副产物为2-乙基-2,3-二羟基丁酸。
在本文所述的多个实施方案中,在催化3-酮酸中间体向3-羟基酸副产物转化中涉及到的蛋白质为酮还原酶。在示例性的实施方案中,酮还原酶为3-酮酸还原酶(3-KAR)。如本文所用,术语“3-酮酸还原酶”是指对3-酮酸的3-氧代基团具有活性的酮还原酶(即酮还原酶)。能够由3-酮酸还原酶催化的示例性反应的例证示于图2中。合适的3-酮酸还原酶通常见于酶分类亚组1.1.1.X,最后一位数X取决于底物。示例性的3-酮酸还原酶及其相应酶分类号的非限制性列表在图3中示出。
在示例性的实施方案中,3-酮酸还原酶为酿酒酵母YMR226C(SEQ IDNO:1)蛋白质,其在本文中可与“TMA29”互换使用。在一些实施方案中,3-酮酸还原酶为酿酒酵母YMR226C(SEQ ID NO:1)蛋白质或其同源物或变体。在一个实施方案中,该同源物可选自由下列组成的组:Vanderwaltomzymapolyspora(SEQ ID NO:2)、芽殖酵母(SEQ ID NO:3)、光滑假丝酵母(SEQ IDNO:4)、贝酵母(SEQ ID NO:5)、鲁氏接合酵母(SEQ ID NO:6)、乳酸克鲁维酵母(SEQ ID NO:7)、棉阿舒囊霉(SEQ ID NO:8)、可鲁弗酵母(SEQ ID NO:9)、耐热克鲁维酵母(SEQ ID NO:10)、克鲁雄酵母(SEQ ID NO:11)、树干毕赤酵母(SEQ ID NO:12)、汉逊德巴利酵母(SEQ ID NO:13)、巴斯德毕赤酵母(SEQ ID NO:14)、杜氏假丝酵母(SEQ ID NO:15)、白假丝酵母(SEQ ID NO:16)、解脂耶氏酵母(SEQ ID NO:17)、东方伊萨酵母(SEQ ID NO:18)、构巢曲霉(SEQ ID NO:19)、黑曲霉(SEQ ID NO:20)、粗糙链孢霉(SEQ ID NO:21)、粟酒裂殖酵母(SEQ ID NO:22)和马克斯克鲁维酵母(SEQ ID NO:23)。
在一个实施方案中,本发明的重组微生物在编码3-酮酸还原酶的至少一个基因中包括突变,从而导致由所述基因编码的多肽的3-酮酸还原酶活性降低。在另一个实施方案中,重组微生物包括编码3-酮酸还原酶的基因的部分缺失,从而由导致所述基因编码的多肽的3-酮酸还原酶活性降低。在另一个实施方案中,重组微生物包括编码3-酮酸还原酶的基因的完全缺失,从而导致由所述基因编码的多肽的3-酮酸还原酶活性降低。在又一个实施方案中,重组微生物包括与编码3-酮酸还原酶的基因相关的调控区修饰,从而导致由所述基因编码的多肽的表达降低。在又一个实施方案中,重组微生物包括转录调控子的修饰,从而导致编码3-酮酸还原酶的基因的转录降低。在又一个实施方案中,重组微生物在编码3-酮酸还原酶的所有基因中都包括突变,从而导致由所述基因编码的多肽的活性降低。在一个实施方案中,所述3-酮酸还原酶基因是酿酒酵母TMA29(YMR226C)基因或其同源物。如本领域中将会理解,在酿酒酵母之外的酵母中,可相似地使用本发明的方法使天然存在的TMA29同源物失活。本文将描述TMA29同源物和鉴定此类TMA29同源物的方法。
如本领域的技术人员所理解,有多种另外的机理可用于降低或破坏蛋白质(诸如3-酮酸还原酶)的活性,包括但不限于:使用调控型启动子、使用弱组成型启动子、破坏二倍体酵母中基因的一个或两个拷贝、破坏二倍体酵母中基因的两个拷贝、表达反义核酸、表达siRNA、过表达内源性启动子的负调控子、改变内源或异源基因的活性、使用低比活性的异源基因等等或它们的组合。
如本文所述,将本发明的重组微生物工程化以比未修饰的亲本微生物产生更少的3-羟基酸副产物。在一个实施方案中,重组微生物以低于约20%的碳得率由碳源产生3-羟基酸副产物。在另一个实施方案中,微生物以低于约10、低于约5、低于约2、低于约1、低于约0.5、低于约0.1或低于约0.01%的碳得率由碳源产生3-羟基酸副产物。在一个实施方案中,3-羟基酸副产物为DH2MB,其衍生自3-酮酸-乙酰乳酸。在另一个实施方案中,3-羟基酸副产物为2-乙基-2,3-二羟基丁酸,其衍生自3-酮酸-2-乙酰-2-羟基丁酸。
在一个实施方案中,在重组微生物中,与不含催化3-酮酸中间体向3-羟基酸副产物转化中涉及到的一种或多种内源性蛋白质的活性或表达降低或缺失的亲本微生物相比,将衍生自3-酮酸的3-羟基酸副产物碳得率降低至少约50%。在另一个实施方案中,与不含催化3-酮酸向3-羟基酸副产物转化中涉及到的一种或多种内源性蛋白质的活性或表达降低或缺失的亲本微生物相比,将衍生自3-酮酸的3-羟基酸副产物减少至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约99%、至少约99.9%或至少约100%。在一个实施方案中,3-羟基酸副产物为DH2MB,其衍生自3-酮酸-乙酰乳酸。在另一个实施方案中,3-羟基酸副产物为2-乙基-2,3-二羟基丁酸,其衍生自3-酮酸-2-乙酰-2-羟基丁酸。
在另外的实施方案中,在包含催化3-酮酸中间体向3-羟基酸副产物转化中涉及到的一种或多种内源性蛋白质的活性或表达降低或消除的重组微生物中,增加所需发酵产物的得率。在一个实施方案中,与不含催化3-酮酸中间体向3-羟基酸副产物转化中涉及到的一种或多种内源性蛋白质的活性或表达降低或消除的亲本微生物相比,将所需发酵产物的得率增加至少约1%。在另一个实施方案中,与不含催化3-酮酸中间体向3-羟基酸副产物转化中涉及到的一种或多种内源性蛋白质的活性或表达降低或消除的亲本微生物相比,将所需发酵产物的得率增加至少约5%、至少约10%、至少约25%或至少约50%。在一个实施方案中,3-羟基酸副产物为DH2MB,其衍生自3-酮酸,乙酰乳酸。因此,在一个实施方案中,所需的发酵产物衍生自其中乙酰乳酸作为中间体的任何生物合成途径,包括但不限于异丁醇、2-丁醇、1-丁醇、2-丁酮、2,3-丁二醇、乙偶姻、二乙酰、缬氨酸、亮氨酸、泛酸、异丁烯、3-甲基-1-丁醇、4-甲基-1-戊醇和辅酶A生物合成途径。在另一个实施方案中,3-羟基酸副产物为2-乙基-2,3-二羟基丁酸,其衍生自3-酮酸-2-乙酰-2-羟基丁酸。因此,在另一个实施方案中,所需的发酵产物衍生自其中2-乙酰-2-羟基丁酸作为中间体的任何生物合成途径,包括但不限于2-甲基-1-丁醇、异亮氨酸、3-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-己醇和5-甲基-1-庚醇生物合成途径。
在进一步的实施方案中,使可能催化3-酮酸中间体向3-羟基酸副产物转化的另外的酶从包含使用3-酮酸作为中间体的生物合成途径的重组微生物的基因组中缺失。可能将3-酮酸中间体向3-羟基酸副产物转化的内源性酵母基因包括酮还原酶、短链醇脱氢酶、中链醇脱氢酶、醛糖还原酶家族成员、D-羟基酸脱氢酶家族、醇脱氢酶和乳酸脱氢酶。在一个实施方案中,3-羟基酸副产物为DH2MB,其衍生自3-酮酸,乙酰乳酸。在另一个实施方案中,3-羟基酸副产物为2-乙基-2,3-二羟基丁酸,其衍生自3-酮酸,2-乙酰-2-羟基丁酸。
鉴定催化3-酮酸中间体向3-羟基酸副产物转化的另外的酶的方法如下所示:使编码酮还原酶、短链醇脱氢酶、中链醇脱氢酶、醛糖还原酶家族成员、D-羟基酸脱氢酶家族、醇脱氢酶和乳酸脱氢酶的内源性酵母基因从包含3-酮酸(例如,乙酰乳酸或2-乙酰-2-羟基丁酸)为中间体的生物合成途径的酵母菌株的基因组中缺失。将这些缺失菌株通过发酵以及分析发酵液中相应3-羟基酸副产物(例如,DH2MB或2-乙基-2,3-二羟基丁酸,分别衍生自乙酰乳酸和2-乙酰-2-羟基丁酸)的存在和浓度与亲本菌株进行比较。在酿酒酵母中,将减少3-羟基酸副产物产生的缺失通过构建携带多个缺失的菌株而加以组合。候选基因可包括但不限于YAL060W、YJR159W、YGL157W、YBL114W、YOR120W、YKL055C、YBR159W、YBR149W、YDL168W、YDR368W、YLR426W、YCR107W、YILL24W、YML054C、YOL151W、YMR318c、YBR046C、YHR104W、YIR036C、YDL174C、YDR541C、YBR145W、YGL039W、YCR105W、YDL124W、YIR035C、YFL056C、YNL274c、YLR255C、YGL185C、YGL256W、YJR096W、YJR155W、YPL275W、YOR388C、YLR070C、YMR083W、YER081W、YJR139C、YDL243C、YPL113C、YOL165C、YML086C、YMR303C、YDL246C、YLR070C、YHR063C、YNL331C、YFL057C、YIL155C、YOL086C、YAL061W、YDR127W、YPR127W、YCL018W、YIL074C、YIL124W和YEL071W。其中许多缺失菌株可商购获得(例如Open Biosystems YSC1054)。将这些缺失菌株用质粒pGV2435转化,而通过该质粒可在CUP1启动子的控制下表达ALS基因(例如,枯草芽孢杆菌alsS)。将转化体在振荡培养箱的30℃、75rpm的摇瓶中在含有150g/L葡萄糖的YPD培养基中培养48小时。48h后,通过HPLC分析摇瓶中样品的3-羟基酸副产物(例如,DH2MB和2-乙基-2,3-二羟基丁酸,分别衍生自乙酰乳酸和2-乙酰-2-羟基丁酸)浓度。如本领域中将会理解,在酿酒酵母之外的酵母中,可使天然存在的3-酮酸还原酶基因(例如,TMA29)同源物可相似地失活。本文将描述3-酮酸还原酶基因(例如,TMA29)同源物以及鉴定此类3-酮酸还原酶基因同源物的方法。
筛选缺失文库的另一种方式是将酵母细胞与3-酮酸中间体(例如,乙酰乳酸或2-乙酰-2-羟基丁酸)孵育并分析发酵液中相应3-羟基酸副产物(例如,DH2MB或2-乙基-2,3-二羟基丁酸,分别衍生自乙酰乳酸和2-乙酰-2-羟基丁酸)的产生情况。
一些列出的基因是串联倍增或全基因组倍增事件的结果,并且预计具有相似的底物特异性。实例为YAL061W(BDH1)和YAL060W(BDH2)、YDR368W(YPR1)以及YOR120W(GCY1)。仅一个重复基因的缺失可能不会产生表型。必须在两个基因中都携带缺失的菌株中分析这些基因对。
寻找负责产生3-羟基酸副产物(例如,DH2MB或2-乙基-2,3-二羟基丁酸,分别衍生自乙酰乳酸和2-乙酰-2-羟基丁酸)的另外内源性活性的可供选择方法是分析如下酵母菌株,其过表达疑似编码负责产生3-羟基酸副产物的酶的基因。对于上面列出的许多候选基因,可以商购获得此类菌株(例如Open Biosystems YSC3870)。将ORF过表达菌株按缺失菌株相同的方式处理。将它们用质粒转化以表达ALS,然后筛选3-羟基酸副产物(例如,DH2MB或2-乙基-2,3-二羟基丁酸)的产生水平。为了缩窄导致产生3-羟基酸副产物(例如,DH2MB或2-乙基-2,3-二羟基丁酸)的可能基因的列表,可在发酵样品中分析它们的表达。未在产生3-羟基酸副产物(例如,DH2MB或2-乙基-2,3-二羟基丁酸)的发酵中表达的基因可从可能目标的列表中排除。可通过从发酵罐样品中提取RNA并将这些样品进行全基因组表达分析(例如通过Roche NimbleGen)而完成此分析。
如本文所述,天然产生低水平的一种或多种3-羟基酸副产物的菌株也可用于产生升高水平的衍生自包含3-酮酸中间体的生物合成途径的所需发酵产物。如通过本公开本领域的技术人员将会理解,天然产生低水平的一种或多种3-羟基酸副产物的菌株可固有地表现出低水平或不可检测水平的内源性酶活性,从而导致减少3-酮酸向3-羟基酸转化,这是一种有利于产生所需发酵产物(诸如异丁醇)的性状。本文描述多种方法用于鉴定基本上不含3-酮酸还原酶活性的天然宿主微生物。例如,一种寻找表现出固有低的或不可检测的负责3-羟基酸副产物(例如,DH2MB或2-乙基-2,3-二羟基丁酸)产生的内源性酶活性的宿主微生物的方法是,通过使酵母细胞与3-酮酸(例如,乙酰乳酸或2-乙酰-2-羟基丁酸)孵育而分析酵母菌株,以及分析发酵液中相应3-羟基酸副产物(例如,DH2MB或2-乙基-2,3-二羟基丁酸,分别衍生自乙酰乳酸和2-乙酰-2-羟基丁酸)的产生情况。
本文所述的产生衍生自使用3-酮酸作为中间体的生物合成途径的有益代谢产物的重组微生物可进一步被工程化,以降低或消除将丙酮酸转化成3-酮酸(如乙酰乳酸和/或2-乙酰-2-羟基丁酸)之外的产物的酶活性。在一个实施方案中,降低或消除丙酮酸脱羧酶(PDC)、乳酸脱氢酶(LDH)、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶和/或甘油3-磷酸脱氢酶(GPD)的酶活性。
在一个具体实施方案中,在过表达乙酰乳酸合酶(ALS)基因的重组PDC-负型GPD-负型酵母微生物中产生有益代谢产物。在另一个具体实施方案中,ALS由枯草芽孢杆菌alsS编码。
减少的来自醛中间体的酸副产物蓄积
如在实施例中进一步所述,本发明人还发现,不需要的酸副产物(例如,就异丁醇而言为异丁酸)可在包含涉及醛中间体(例如,就异丁醇而言为异丁醛)的途径的微生物的发酵反应中蓄积。
如本文所用,“酸副产物”是指包含羧酸部分的有机化合物。酸副产物可通过醛的氧化获得。例如,异丁醛的氧化导致形成异丁酸(参见例如图4)。
本发明人已发现,这些酸副产物的蓄积抑制利用醛中间体的生物合成途径的最佳生产率和得率。本发明人发现,这些酸副产物的产生由相应醛的脱氢所致。为了降低或消除负责产生酸副产物的活性,必须鉴定并降低或消除催化此反应的相应酶活性。本发明人已在酿酒酵母中发现,一种这样的催化醛向酸副产物转化的酶为醛脱氢酶。
本发明人在本文中介绍多种减少酸副产物形成的策略,该过程伴随所需代谢产物得率的升高,这些代谢产物诸如为异丁醇、1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、1-丙醇、1-戊醇、1-己醇、3-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-己醇和5-甲基-1-庚醇。
因此,本发明的一个方面涉及重组微生物,其包含使用醛作为中间体的生物合成途径,其中所述重组微生物基本上不含催化醛向酸副产物转化的酶。
在另一方面,本发明涉及重组微生物,其包含使用醛作为中间体的生物合成途径,其中所述重组微生物被工程化以降低或消除催化醛向酸副产物转化的一种或多种酶的表达或活性。
在一个实施方案中,醛中间体为异丁醛而酸副产物为异丁酸。在另一个实施方案中,醛中间体为1-丁醛而酸副产物为丁酸。在又一个实施方案中,醛中间体为2-甲基-1-丁醛而酸副产物为2-甲基-1-丁酸。在又一个实施方案中,醛中间体为3-甲基-1-丁醛而酸副产物为3-甲基-1-丁酸。在又一个实施方案中,醛中间体为1-丙醛而酸副产物为丙酸。在又一个实施方案中,醛中间体为1-戊醛而酸副产物为戊酸。在又一个实施方案中,醛中间体为1-己醛而酸副产物为己酸。在又一个实施方案中,醛中间体为3-甲基-1-戊醛而酸副产物为3-甲基-1-戊酸。在又一个实施方案中,醛中间体为4-甲基-1-戊醛而酸副产物为4-甲基-1-戊酸。在又一个实施方案中,醛中间体为4-甲基-1-己醛而酸副产物为4-甲基-1-己酸。在又一个实施方案中,醛中间体为5-甲基-1-庚醛而酸副产物为5-甲基-1-庚酸。
在本文所述的多个实施方案中,催化醛向酸副产物转化中涉及到的蛋白质为醛脱氢酶(ALDH)。
如本文所用,术语“醛脱氢酶”是指催化以下反应的酶:
醛+氧化的辅因子+H2O=酸+还原的辅因子+H+
能够由醛脱氢酶催化的示例性反应的例证示于图4中。合适的醛脱氢酶通常见于酶分类亚组EC 1.2.1.X,其中最后一位数X取决于底物或辅因子。例如,EC 1.2.1.3催化以下反应:醛+NAD++H2O=酸+NADH+H+);EC 1.2.1.4催化以下反应:醛+NADP++H2O=酸+NADPH+H+);以及EC1.2.1.5催化以下反应:醛+NAD(P)++H2O=酸+NAD(P)H+H+。
如本文所用,催化醛向酸副产物转化中涉及到的蛋白质为醛脱氢酶(ALDH)。在一个实施方案中,醛脱氢酶由选自由下列组成的组的基因编码:ALD2、ALD3、ALD4、ALD5、ALD6和HFD1及其同源物和变体。在示例性实施方案中,醛脱氢酶为酿酒酵母醛脱氢酶ALD6(SEQ ID NO:25)或其同源物或变体。在一个实施方案中,该同源物可选自由下列组成的组:芽殖酵母(SEQ ID NO:26)、光滑假丝酵母(SEQ ID NO:27)、贝酵母(SEQ ID NO:28)、乳酸克鲁维酵母(SEQ ID NO:29)、耐热克鲁维酵母(SEQ ID NO:30)、克鲁雄酵母(SEQ ID NO:31)、酿酒酵母YJ789(SEQ ID NO:32)、酿酒酵母JAY291(SEQ ID NO:33)、酿酒酵母EC1118(SEQ ID NO:34)、酿酒酵母DBY939(SEQ ID NO:35)、酿酒酵母AWRI1631(SEQ ID NO:36)、酿酒酵母RM11-1a(SEQ ID NO:37)、巴斯德毕赤酵母(SEQ ID NO:38)、马克斯克鲁维酵母(SEQID NO:39)、粟酒裂殖酵母(SEQ ID NO:40)和粟酒裂殖酵母(SEQ ID NO:41)。
在一个实施方案中,重组微生物在编码醛脱氢酶的至少一个基因中包括突变,从而导致由所述基因编码的多肽的醛脱氢酶活性降低。在另一个实施方案中,重组微生物包括编码醛脱氢酶的基因的部分缺失,从而导致由所述基因编码的多肽的醛脱氢酶活性降低。在另一个实施方案中,重组微生物包含编码醛脱氢酶的基因的全部缺失,从而导致由所述基因编码的多肽的醛脱氢酶活性降低。在又一个实施方案中,重组微生物包括与编码醛脱氢酶的基因相关的调控区修饰,从而导致由所述基因编码的多肽的表达降低。在又一个实施方案中,重组微生物包括转录调控子的修饰,从而导致编码醛脱氢酶的基因的转录降低。在又一个实施方案中,重组微生物在编码醛脱氢酶的所有基因中都包括突变,从而导致由所述基因编码的多肽的活性降低。在一个实施方案中,所述醛脱氢酶由选自由下列组成的组的基因编码:ALD2、ALD3、ALD4、ALD5、ALD6和HFD1及其同源物和变体。如本领域中将会理解,在酿酒酵母之外的酵母中,可使天然存在的醛脱氢酶的同源物相似地使用本发明的方法失活。本文将描述醛脱氢酶同源物以及鉴定此类醛脱氢酶同源物的方法。
如本领域的技术人员所理解,有多种另外的机理可用于降低或破坏蛋白质(诸如醛脱氢酶)的活性,包括但不限于:使用调控型启动子、使用弱组成型启动子、破坏二倍体酵母中基因的一个或两个拷贝、破坏二倍体酵母中基因的两个拷贝、表达反义核酸、表达siRNA、过表达内源性启动子的负调控子、改变内源或异源基因的活性、使用低比活性的异源基因等等或它们的组合。
如本领域的技术人员将会理解,可降低或消除一种以上的醛脱氢酶的活性或表达。在一个具体实施方案中,降低或消除ALD4和ALD6或其同源物或变体的活性或表达。在另一个具体的实施方案中,降低或消除ALD5和ALD6或其同源物或变体的活性或表达。在又一个具体实施方案中,降低或消除ALD4、ALD5和ALD6或其同源物或变体的活性或表达。在又一个具体实施方案中,降低或消除胞质内局限性醛脱氢酶ALD2、ALD3和ALD6或其同源物或变体的活性或表达。在又一个具体实施方案中,降低或消除线粒体内局限性醛脱氢酶ALD4和ALD5或其同源物或变体的活性或表达。
如本文所述,将本发明的重组微生物工程化以比未修饰的亲本微生物产生更少的酸副产物。在一个实施方案中,重组微生物与亲本微生物相比以低于约50%的碳得率由碳源产生酸副产物。在另一个实施方案中,该微生物与亲本微生物相比以低于约25、低于约10、低于约5、低于约1、低于约0.5、低于约0.1或低于约0.01%的碳得率由碳源产生酸副产物。在一个实施方案中,酸副产物为异丁酸,其衍生自异丁醇生物合成途径的中间体:异丁醛。在另一个实施方案中,酸副产物为丁酸,其衍生自1-丁醇生物合成途径的中间体:1-丁醛。在又一个实施方案中,酸副产物为2-甲基-1-丁酸,其衍生自2-甲基-1-丁醇生物合成途径的中间体:2-甲基-1-丁醛。在又一个实施方案中,酸副产物为3-甲基-1-丁酸,其衍生自3-甲基-1-丁醇生物合成途径的中间体:3-甲基-1-丁醛。在又一个实施方案中,酸副产物为丙酸,其衍生自1-丙醇生物合成途径的中间体:1-丙醛。在又一个实施方案中,酸副产物为戊酸,其衍生自1-戊醇生物合成途径的中间体:1-戊醛。在又一个实施方案中,酸副产物为己酸,其衍生自1-己醇生物合成途径的中间体:1-己醛。在又一个实施方案中,酸副产物为3-甲基-1-戊酸,其衍生自3-甲基-1-戊醇生物合成途径的中间体:3-甲基-1-戊醛。在又一个实施方案中,酸副产物为4-甲基-1-戊酸,其衍生自4-甲基-1-戊醇生物合成途径的中间体:4-甲基-1-戊醛。在又一个实施方案中,酸副产物为4-甲基-1-己酸,其衍生自4-甲基-1-己醇生物合成途径的中间体:4-甲基-1-己醛。在又一个实施方案中,酸副产物为5-甲基-1-庚酸,其衍生自5-甲基-1-庚醇生物合成途径的中间体:5-甲基-1-庚醛。
在一个实施方案中,在重组微生物中,与不含催化醛向酸副产物转化中涉及到的一种或多种蛋白质的活性或表达降低或缺失的亲本微生物相比,将由相应醛得到的酸副产物碳得率降低至少约50%。在另一个实施方案中,与不含催化醛向酸副产物转化中涉及到的一种或多种蛋白质的活性或表达降低或缺失的亲本微生物相比,将由乙酰乳酸得到的酸副产物碳得率降低至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约99%、至少约99.9%或至少约100%。在一个实施方案中,酸副产物为异丁酸,其衍生自异丁醇生物合成途径的中间体:异丁醛。在另一个实施方案中,酸副产物为丁酸,其衍生自1-丁醇生物合成途径的中间体:1-丁醛。在又一个实施方案中,酸副产物为2-甲基-1-丁酸,其衍生自2-甲基-1-丁醇生物合成途径的中间体:2-甲基-1-丁醛。在又一个实施方案中,酸副产物为3-甲基-1-丁酸,其衍生自3-甲基-1-丁醇生物合成途径的中间体:3-甲基-1-丁醛。在又一个实施方案中,酸副产物为丙酸,其衍生自1-丙醇生物合成途径的中间体:1-丙醛。在又一个实施方案中,酸副产物为戊酸,其衍生自1-戊醇生物合成途径的中间体:1-戊醛。在又一个实施方案中,酸副产物为己酸,其衍生自1-己醇生物合成途径的中间体:1-己醛。在又一个实施方案中,酸副产物为3-甲基-1-戊酸,其衍生自3-甲基-1-戊醇生物合成途径的中间体:3-甲基-1-戊醛。在又一个实施方案中,酸副产物为4-甲基-1-戊酸,其衍生自4-甲基-1-戊醇生物合成途径的中间体:4-甲基-1-戊醛。在又一个实施方案中,酸副产物为4-甲基-1-己酸,其衍生自4-甲基-1-己醇生物合成途径的中间体:4-甲基-1-己醛。在又一个实施方案中,酸副产物为5-甲基-1-庚酸,其衍生自5-甲基-1-庚醇生物合成途径的中间体:5-甲基-1-庚醛。
在另外的实施方案中,在包含催化醛向酸副产物转化中涉及到的一种或多种蛋白质的活性或表达降低或消除的重组微生物中,增加所需发酵产物的得率。在一个实施方案中,与不含催化醛向酸副产物转化中涉及到的一种或多种内源性蛋白质的活性或表达降低或消除的亲本微生物相比,将所需发酵产物的得率增加至少约1%。在另一个实施方案中,与不含催化醛向酸副产物转化中涉及到的一种或多种内源性蛋白质的活性或表达降低或消除的亲本微生物相比,将所需发酵产物的得率增加至少约5%、至少约10%、至少约25%或至少约50%。如本文所述,所需发酵产物可以衍生自醛作为中间体的任何生物合成途径,包括但不限于异丁醇、1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、1-丙醇、1-戊醇、1-己醇、3-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-己醇和5-甲基-1-庚醇生物合成途径。
鉴定催化醛向酸副产物转化的另外酶的方法如下所示:使编码推定的醛和醇脱氢酶的内源性酵母基因从酵母菌株的基因组中缺失。将这些缺失菌株通过酶测定法与亲本菌株进行比较。其中许多缺失菌株可商购获得(例如Open Biosystems YSC1054)。
筛选缺失文库的另一种方式是使酵母细胞与醛(例如,异丁醛或1-丁醛)孵育,并分析发酵液中相应酸副产物(例如,异丁酸或丁酸,分别衍生自异丁醛或1-丁醛)的产生情况。
寻找负责产生酸副产物(例如,异丁酸或丁酸,分别衍生自异丁醛或1-丁醛)的另外内源性活性的可供选择方法是分析如下酵母菌株,其过表达疑似编码负责产生酸副产物的酶的基因。对于上面列出的许多候选基因,可以商购获得此类菌株(例如Open Biosystems YSC3870)。筛选酸副产物产生水平升高的ORF过表达菌株。作为另外一种选择,测定ORF过表达菌株细胞裂解液的升高的醛氧化活性。为了缩窄导致酸副产物产生的可能基因的列表,可在发酵样品中分析它们的表达。未在产生酸副产物的发酵中表达的基因可从可能目标的列表中排除。可通过从发酵罐样品中提取RNA并将这些样品进行全基因组表达分析(例如通过Roche NimbleGen)而进行此分析。
如本文所述,天然产生低水平的一种或多种酸副产物的菌株也可用于产生升高水平的衍生自包含醛中间体的生物合成途径的所需发酵产物。如通过本公开本领域的技术人员将会理解,天然产生低水平的一种或多种酸副产物的菌株可固有地表现出低水平或不可检测水平的内源性酶活性,从而导致减少醛向酸副产物的转化,这是一种有利于产生所需发酵产物(诸如异丁醇)的性状。本文描述用于鉴定基本上不含醛脱氢酶活性的天然宿主微生物的多种方法。例如,一种寻找表现出固有低的或不可检测的负责酸副产物(例如,异丁酸或丁酸)产生的内源性酶活性的宿主微生物的方法是,通过使酵母细胞与醛(例如,异丁醛或1-丁醛)孵育而分析酵母菌株,以及分析发酵液中相应酸副产物(例如,异丁酸或丁酸,分别衍生自异丁醛和1-丁醛)的产生情况。
如上所述,一种减少酸副产物(异丁酸)产生的策略是降低或消除可能将异丁醛转化成异丁酸的酵母中存在的一种或多种内源性醛脱氢酶蛋白质的活性或表达。
另一种减少异丁酸产生的策略是降低或消除一种或多种内源性酵母醇脱氢酶的活性或表达。降低一种或多种醇脱氢酶的表达或缺失一种或多种醇脱氢酶(包括但不限于酿酒酵母ADH1、ADH2、ADH3、ADH4、ADH5、ADH6、ADH7和SFA1及其同源物或变体)通常将导致减少异丁酸的产生同时升高异丁醇得率。本文设想并在本发明的范围内考虑了另外的脱氢酶的减少和/或缺失。这些脱氢酶包括另外的醇脱氢酶(诸如酿酒酵母BDH1、BDH2、SOR1、SOR2和XYL1及其同源物或变体)以及芳基醇脱氢酶(诸如AAD3、AAD4、AAD6、AAD10、AAD14、AAD15、AAD16和YPL088W及其同源物或变体)。
在另一个实施方案中,本发明提供重组微生物,其被工程化以减少和/或缺失一种或多种另外的编码羰基/醛还原酶的基因。这些羰基/醛还原酶包括酿酒酵母ARI1、YPR1、TMA29、YGL039W和UGA2及其同源物或变体。
本文所述的用于减少副产物异丁酸产生的另外策略是降低或消除可能由异丁醇途径中间体2-酮异戊酸产生异丁酸的酵母中存在的内源性蛋白质的活性或表达。此类酶通常被称为酮酸脱氢酶(KDH)。这些内源性蛋白质活性或表达的消除或降低可减少或消除不需要的副产物异丁酸的产生。已在酿酒酵母中鉴定了KDH酶活性(Dickinson,J.R.,和I.W.Dawes,1992,Thecatabolism of branched-chain amino acids occurs via a 2-oxoacid dehydrogenasein S.cerevisiae.J.Gen.Microbiol.138:2029-2033)。降低一种或多种酮酸脱氢酶及其同源物或变体的表达,或缺失一种或多种酮酸脱氢酶及其同源物或变体通常将导致减少异丁酸的产生并伴随升高异丁醇得率。
酿酒酵母和其它酵母中基因表达降低或基因缺失可通过本领域技术人员已知的方法实现,诸如等位置环或交换以及通过插入另一基因或标记物盒(marker cassette)而破坏基因。
本文所述的用于减少副产物异丁酸产生的另一种策略是增加负责将异丁醛转化成异丁醇的醇脱氢酶(ADH)的活性和/或表达。该策略阻止内源性酶对异丁醇途径中间体-异丁醛的竞争。醇脱氢酶活性和/或表达的增加可以通过多种手段实现。例如,醇脱氢酶活性可通过以下方法增加:利用具有增强启动子强度的启动子,增加醇脱氢酶基因的拷贝数,或利用具有增强比活性的可供选择的或修饰的醇脱氢酶。
本文所述的用于减少副产物异丁酸产生的可供选择的策略是在负责将异丁醛转化成异丁醇的异丁醇途径中利用醇脱氢酶(ADH),其表现出米夏埃利斯-门滕常数(KM)的降低。该策略还阻止内源性酶对异丁醇途径中间体-异丁醛的竞争。
本文所述的用于减少副产物异丁酸产生的另一种策略是在负责将异丁醛转化成异丁醇的异丁醇途径中利用醇脱氢酶(ADH),其表现出增强的活性和降低的米夏埃利斯-门滕常数(KM)。该策略还阻止内源性酶对异丁醇途径中间体-异丁醛的竞争。
此外,通过利用修饰的ADH酶,本发明人可以建立一种情形,其中正反应(即异丁醛向异丁醇转化)相对于逆反应(即异丁醇向异丁醛转化)为优势反应。
上文所述的策略通常会导致异丁酸得率的降低,其伴随异丁醇得率的升高。因此,上述策略可用于降低异丁酸得率和/或滴度以及升高异丁醇得率与异丁酸得率的比率。
在一个实施方案中,异丁酸得率(每摩尔葡萄糖的异丁酸摩尔数)小于约5%。在另一个实施方案中,异丁酸得率(每摩尔葡萄糖的异丁酸摩尔数)小于约1%。在又一个实施方案中,异丁酸得率(每摩尔葡萄糖的异丁酸摩尔数)小于约0.5%、小于约0.1%、小于约0.05%或小于约0.01%。
在一个实施方案中,异丁醇与异丁酸得率的比率为至少约2。在另一个实施方案中,异丁醇与异丁酸得率的比率为至少约5。在又一个实施方案中,异丁醇与异丁酸得率的比率为至少约20、至少约100、至少约500或至少约1000。
本文所述的产生衍生自使用醛作为中间体的生物合成途径的有益代谢产物的重组微生物可进一步被工程化,以降低或消除将丙酮酸转化成3-酮酸之外的产物(例如,乙酰乳酸和/或2-乙酰-2-羟基丁酸)的酶活性。在一个实施方案中,降低或消除丙酮酸脱羧酶(PDC)、乳酸脱氢酶(LDH)、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶和/或甘油3-磷酸脱氢酶(GPD)的酶活性。
在一个具体实施方案中,在过表达乙酰乳酸合酶(ALS)基因的重组PDC-负型GPD-负型酵母微生物中产生有益的代谢产物。在另一个具体实施方案中,ALS由枯草芽孢杆菌alsS编码。
减少的3-羟基酸副产物和酸副产物蓄积
本发明人在本文中介绍多种策略,用于减少3-酮酸中间体向相应的3-羟基酸副产物转化,这个过程伴随所需代谢产物得率的升高。本发明人还在本文中描述多种策略,用于减少醛中间体向相应的酸副产物的转化,这个过程伴随所需代谢产物得率的进一步升高。
因此,在一个方面,本发明涉及重组微生物,其包含使用3-酮酸作为中间体以及醛作为中间体的生物合成途径,其中所述重组微生物(i)基本上不含催化3-酮酸中间体向3-羟基酸副产物转化的酶,以及(ii)基本上不含催化醛向酸副产物转化的酶。在一个实施方案中,3-酮酸中间体为乙酰乳酸。使用乙酰乳酸和醛作为中间体的生物合成途径可选自以下物质的生物合成途径:异丁醇、1-丁醇和3-甲基-1-丁醇。在另一个实施方案中,3-酮酸中间体为2-乙酰-2-羟基丁酸。使用2-乙酰-2-羟基丁酸和醛作为中间体的生物合成途径可选自以下物质的生物合成途径:2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-己醇和5-甲基-1-庚醇。
在另一方面,本发明涉及重组微生物,其包含使用3-酮酸作为中间体以及醛作为中间体的生物合成途径,其中所述重组微生物(i)被工程化以降低或消除催化3-酮酸中间体向3-羟基酸副产物转化的酶的表达或活性,以及(ii)被工程化以降低或消除催化醛向酸副产物转化的一种或多种酶的表达或活性。在一个实施方案中,3-酮酸中间体为乙酰乳酸。使用乙酰乳酸和醛作为中间体的生物合成途径可选自以下物质的生物合成途径:异丁醇、1-丁醇和3-甲基-1-丁醇。在另一个实施方案中,3-酮酸中间体为2-乙酰-2-羟基丁酸。使用2-乙酰-2-羟基丁酸和醛作为中间体的生物合成途径可选自以下物质的生物合成途径:2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-己醇和5-甲基-1-庚醇。
在本文所述的多个实施方案中,在催化3-酮酸中间体向3-羟基酸副产物转化中涉及到的蛋白质为酮还原酶。在示例性的实施方案中,酮还原酶为3-酮酸还原酶(3-KAR)。在进一步的示例性实施方案中,3-酮酸还原酶为酿酒酵母YMR226C(SEQ ID NO:1)蛋白质或其同源物或变体。在一个实施方案中,该同源物可选自由下列组成的组:Vanderwaltomzyma polyspora(SEQ IDNO:2)、芽殖酵母(SEQ ID NO:3)、光滑假丝酵母(SEQ ID NO:4)、贝酵母(SEQID NO:5)、鲁氏接合酵母(SEQ ID NO:6)、乳酸克鲁维酵母(SEQ ID NO:7)、棉阿舒囊霉(SEQ ID NO:8)、可鲁弗酵母(SEQ ID NO:9)、耐热克鲁维酵母(SEQ ID NO:10)、克鲁雄酵母(SEQ ID NO:11)、树干毕赤酵母(SEQ ID NO:12)、汉逊德巴利酵母(SEQ ID NO:13)、巴斯德毕赤酵母(SEQ ID NO:14)、杜氏假丝酵母(SEQ ID NO:15)、白假丝酵母(SEQ ID NO:16)、解脂耶氏酵母(SEQ ID NO:17)、东方伊萨酵母(SEQ ID NO:18)、构巢曲霉(SEQ ID NO:19)、黑曲霉(SEQ ID NO:20)、粗糙链孢霉(SEQ ID NO:21)、粟酒裂殖酵母(SEQ IDNO:22)和马克斯克鲁维酵母(SEQ ID NO:23)。
在本文所述的多个实施方案中,催化醛向酸副产物转化中涉及到的蛋白质为醛脱氢酶(ALDH)。在一个实施方案中,醛脱氢酶由选自由下列组成的组的基因编码:ALD2、ALD3、ALD4、ALD5、ALD6和HFD1及其同源物和变体。在示例性的实施方案中,醛脱氢酶为酿酒酵母醛脱氢酶ALD6(SEQ IDNO:25)或其同源物或变体。在一个实施方案中,该同源物可选自由下列组成的组:芽殖酵母(SEQ ID NO:26)、光滑假丝酵母(SEQ ID NO:27)、贝酵母(SEQ ID NO:28)、乳酸克鲁维酵母(SEQ ID NO:29)、耐热克鲁维酵母(SEQ IDNO:30)、克鲁雄酵母(SEQ ID NO:31)、酿酒酵母YJ789(SEQ ID NO:32)、酿酒酵母JAY291(SEQ ID NO:33)、酿酒酵母EC1118(SEQ ID NO:34)、酿酒酵母DBY939(SEQ ID NO:35)、酿酒酵母AWRI1631(SEQ ID NO:36)、酿酒酵母RM11-1a(SEQ ID NO:37)、巴斯德毕赤酵母(SEQ ID NO:38)、马克斯克鲁维酵母(SEQ ID NO:39)、粟酒裂殖酵母(SEQ ID NO:40)和粟酒裂殖酵母(SEQ ID NO:41)。
本文所述的产生衍生自使用3-酮酸和醛作为中间体的生物合成途径的有益代谢产物的重组微生物可进一步被工程化,以降低或消除将丙酮酸转化成3-酮酸之外的产物(例如,乙酰乳酸和/或2-乙酰-2-羟基丁酸)的酶活性。在一个实施方案中,降低或消除丙酮酸脱羧酶(PDC)、乳酸脱氢酶(LDH)、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶和/或甘油3-磷酸脱氢酶(GPD)的酶活性。
在一个具体实施方案中,在过表达乙酰乳酸合酶(ALS)基因的重组PDC-负型GPD-负型酵母微生物中产生有益的代谢产物。在另一个具体饿实施方案中,ALS由枯草芽孢杆菌alsS编码。
用于减少3-羟基酸副产物和/或酸副产物蓄积的策略的示例性实施方案
在一个具体的示例性实施方案中,重组微生物包含乙酰乳酸和异丁醛为中间体的产生异丁醇的代谢途径,其中所述重组微生物基本上不含催化乙酰乳酸中间体向DH2MB转化以及异丁醛中间体向异丁酸转化的酶。在另一个具体实施方案中,重组微生物包含乙酰乳酸和异丁醛为中间体的产生异丁醇的代谢途径,其中所述重组微生物(i)被工程化以降低或消除催化乙酰乳酸向DH2MB转化的一种或多种酶的表达或活性,以及(ii)被工程化以降低或消除催化异丁醛向异丁酸转化的一种或多种酶的表达或活性。在一个实施方案中,催化乙酰乳酸向DH2MB转化的酶为3-酮酸还原酶(3-KAR)。在另一个实施方案中,催化异丁醛向异丁酸转化的酶为醛脱氢酶(ALDH)。这样的消除3-酮酸还原酶(3-KAR)和醛脱氢酶(ALDH)的途径的非限制性实例示于图5中。
在进一步的具体的示例性实施方案中,重组微生物包含乙酰乳酸和3-甲基-1-丁醛为中间体的产生3-甲基-1-丁醇的代谢途径,其中所述重组微生物基本上不含催化乙酰乳酸中间体向DH2MB转化以及3-甲基-1-丁醛中间体向3-甲基-1-丁酸转化的酶。在另一个具体实施方案中,重组微生物包含乙酰乳酸和3-甲基-1-丁醛为中间体的产生3-甲基-1-丁醇的代谢途径,其中所述重组微生物(i)被工程化以降低或消除催化乙酰乳酸向DH2MB转化的一种或多种酶的表达或活性,以及(ii)被工程化以降低或消除催化3-甲基-1-丁醛向3-甲基-1-丁酸转化的一种或多种酶的表达或活性。在一个实施方案中,催化乙酰乳酸向DH2MB转化的酶为3-酮酸还原酶(3-KAR)。在另一个实施方案中,催化3-甲基-1-丁醛向3-甲基-1-丁酸转化的酶为醛脱氢酶(ALDH)。这样的消除3-酮酸还原酶(3-KAR)和醛脱氢酶(ALDH)的途径的非限制性实例示于图6中。
在进一步的具体示例性实施方案中,重组微生物包含乙酰乳酸和2-甲基-1-丁醛为中间体的产生2-甲基-1-丁醇的代谢途径,其中所述重组微生物基本上不含催化2-乙酰-2-羟基丁酸中间体向2-乙基-2,3-二羟基丁酸以及2-甲基-1-丁醛中间体向2-甲基-1-丁酸转化的酶。在另一个具体实施方案中,重组微生物包含2-乙酰-2-羟基丁酸和2-甲基-1-丁醛为中间体的产生2-甲基-1-丁醇的代谢途径,其中所述重组微生物(i)被工程化以降低或消除催化2-乙酰-2-羟基丁酸向2-乙基-2,3-二羟基丁酸转化的一种或多种酶的表达或活性,以及(ii)被工程化以降低或消除催化2-甲基-1-丁醛向2-甲基-1-丁酸转化的一种或多种酶的表达或活性。在一个实施方案中,催化2-乙酰-2-羟基丁酸向2-乙基-2,3-二羟基丁酸转化的酶为3-酮酸还原酶(3-KAR)。在另一个实施方案中,催化2-甲基-1-丁醛向2-甲基-1-丁酸转化的酶为醛脱氢酶(ALDH)。这样的消除3-酮酸还原酶(3-KAR)和醛脱氢酶(ALDH)的途径的非限制性实例示于图7中。
将DH2MB转化成异丁醇途径中间体的酶的过表达
在产生异丁醇酵母中减少或消除2,3-二羟基-2-甲基丁酸(CAS#14868-24-7)产生的不同方法是过表达将DH2MB转化成异丁醇途径中间体的酶。一种实现此目的的方式是通过使用催化DH2MB和乙酰乳酸互变但利于DH2MB氧化的酶。因此,在一个实施方案中,本发明提供产生异丁醇的重组微生物,其中所述重组微生物过表达能够将DH2MB向乙酰乳酸转化的内源或异源蛋白质。
在一个实施方案中,内源或异源蛋白质在动力学上利于氧化反应。在另一个实施方案中,内源或异源蛋白质对于DH2MB具有低KM,并且对于乙酰乳酸具有高KM。在又一个实施方案中,内源或异源蛋白质对于其辅因子的氧化形式具有低KM,并且对于其辅因子的相应还原形式具有高KM。在又一个实施方案中,内源或异源蛋白质对于氧化反应比还原反应具有更高的kcat。此内源或异源蛋白质应优选地具有使用比其还原形式具有高浓度氧化形式的氧化还原辅因子的能力。
在一个实施方案中,内源或异源蛋白质由选自由下列组成的组的基因编码:YAL060W、YJR159W、YGL157W、YBL114W、YOR120W、YKL055C、YBR159W、YBR149W、YDL168W、YDR368W、YLR426W、YCR107W、YILL24W、YML054C、YOL151W、YMR318c、YBR046C、YHR104W、YIR036C、YDL174C、YDR541C、YBR145W、YGL039W、YCR105W、YDL124W、YIR035C、YFL056C、YNL274c、YLR255C、YGL185C、YGL256W、YJR096W、YJR155W、YPL275W、YOR388C、YLR070C、YMR083W、YER081W、YJR139C、YDL243C、YPL113C、YOL165C、YML086C、YMR303C、YDL246C、YLR070C、YHR063C、YNL331C、YFL057C、YIL155C、YOL086C、YAL061W、YDR127W、YPR127W、YCL018W、YIL074C、YIL124W和YEL071W。此外,异源基因可在产生异丁醇的酵母中过表达。例如,β-羟基酸脱氢酶(EC1.1.1.45和EC1.1.1.60)将是过表达的候选酶。
在另一个实施方案中,将动力学上利于还原反应的内源或异源蛋白质工程化以利于氧化反应。在另一个实施方案中,将蛋白质工程化以对于DH2MB具有低KM,以及对于乙酰乳酸具有高KM。在又一个实施方案中,将蛋白质工程化以对于其辅因子的氧化形式具有低KM,以及对于其辅因子的相应还原形式具有高KM。在又一个实施方案中,将蛋白质工程化以对于氧化反应比还原反应具有更高的kcat。此工程化蛋白质应优选地具有使用比其还原形式具有高浓度氧化形式的氧化还原辅因子的能力。
作为另外一种选择,可以过表达使DH2MB异构化为DHIV的酶。此方法代表了由丙酮酸产生异丁醇的新型途径。因此,在一个实施方案中,本发明提供产生异丁醇的重组微生物,其中所述重组微生物过表达能够将DH2MB转化成2,3-二羟基异戊酸的内源或异源蛋白质。
将2-乙基-2,3-二羟基丁酸转化成生物合成途径中间体的酶的过表达
在酵母中,降低或消除2-乙基-2,3-二羟基丁酸产生的不同方法是过表达将2-乙基-2,3-二羟基丁酸转化成生物合成途径中间体的酶。此方法可用于任何使用2-乙酰-2-羟基丁酸作为中间体的生物合成途径,包括但不限于2-甲基-1-丁醇、异亮氨酸、3-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-己醇和5-甲基-1-庚醇生物合成途径。一种实现此目的的方法是通过使用催化2-乙基-2,3-二羟基丁酸和2-乙酰-2-羟基丁酸互变但利于2-乙基-2,3-二羟基丁酸氧化的酶。因此,在一个实施方案中,本发明提供产生选自以下的产物的重组微生物:2-甲基-1-丁醇、异亮氨酸、3-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-己醇和5-甲基-1-庚醇,其中所述重组微生物过表达能够将2-乙基-2,3-二羟基丁酸转化成2-乙酰-2-羟基丁酸的内源或异源蛋白质。
在一个实施方案中,内源或异源蛋白质在动力学上利于氧化反应。在另一个实施方案中,内源或异源蛋白质对于2-乙基-2,3-二羟基丁酸具有低KM,并且对于2-乙酰-2-羟基丁酸具有高KM。在又一个实施方案中,内源或异源蛋白质对于其辅因子的氧化形式具有低KM,并且对于其辅因子的相应还原形式具有高KM。在又一个实施方案中,内源或异源蛋白质对于氧化反应比还原反应具有更高的kcat。此内源或异源蛋白质应优选地具有使用比其还原形式具有高浓度氧化形式的氧化还原辅因子的能力。
在一个实施方案中,内源或异源蛋白质由选自由下列组成的组的基因编码:YAL060W、YJR159W、YGL157W、YBL114W、YOR120W、YKL055C、YBR159W、YBR149W、YDL168W、YDR368W、YLR426W、YCR107W、YILL24W、YML054C、YOL151W、YMR318c、YBR046C、YHR104W、YIR036C、YDL174C、YDR541C、YBR145W、YGL039W、YCR105W、YDL124W、YIR035C、YFL056C、YNL274c、YLR255C、YGL185C、YGL256W、YJR096W、YJR155W、YPL275W、YOR388C、YLR070C、YMR083W、YER081W、YJR139C、YDL243C、YPL113C、YOL165C、YML086C、YMR303C、YDL246C、YLR070C、YHR063C、YNL331C、YFL057C、YIL155C、YOL086C、YAL061W、YDR127W、YPR127W、YCL018W、YIL074C、YIL124W和YEL071W。此外,异源基因可在产异亮氨酸的酵母中过表达。例如,β-羟基酸脱氢酶(EC1.1.1.45和EC1.1.1.60)将是过表达的候选酶。
作为另外一种选择,可过表达使2-乙基-2,3-二羟基丁酸异构化成2,3-二羟基-3-甲基戊酸的酶。此方法代表了由丙酮酸产生2-甲基-1-丁醇、异亮氨酸、3-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-己醇和5-甲基-1-庚醇的新型途径。因此,在一个实施方案中,本发明提供产生选自下列的产物的重组微生物:2-甲基-1-丁醇、异亮氨酸、3-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-己醇和5-甲基-1-庚醇,其中所述重组微生物过表达能够将2-乙基-2,3-二羟基丁酸转化成α,β-二羟基-β-甲基戊酸的内源或异源蛋白质。
使用过表达的酮醇酸还原异构酶(KARI)和/或修饰的酮醇酸还原异构酶
(KARI)减少DH2MB的产生
如本文所述,将乙酰乳酸转化成DH2MB会与异丁醇途径竞争中间体乙酰乳酸。在目前的产生异丁醇酵母菌株中,酮醇酸还原异构酶(KARI)催化乙酰乳酸向DHIV转化。
在一个实施方案中,本发明提供具有过表达的酮醇酸还原异构酶(KARI)的重组微生物,该酶催化乙酰乳酸向2,3-二羟基异戊酸(DHIV)的转化。KARI的过表达具有减少DH2MB产生的作用。在一个实施方案中,KARI在裂解液中具有至少0.01U/mg的活性。在另一个实施方案中,KARI在裂解液中具有至少0.03U/mg的活性。在又一个实施方案中,KARI在裂解液中具有至少0.05、0.1、0.5、1、2、5或10U/mg的活性。
在一个优选的实施方案中,将过表达的KARI工程化以表现出相对于野生型或亲本KARI降低的乙酰乳酸KM。使用具有对于乙酰乳酸较低的KM的修饰KARI预计可以减少副产物DH2MB的产生。通过筛选同源物鉴定具有较低底物KM的KARI。作为另外一种选择,可通过使用本领域已知技术的定向进化将KARI工程化以表现出降低的KM。
在这些实施方案的每一个中,KARI可以是利用NADH(而非NADPH)作为辅因子的变体酶。此类酶在共同拥有和共同未决的专利公开US2010/0143997中有所描述,该专利公开全文以引用方式并入本文以用于所有目的。
使用过表达的二羟酸脱水酶(DHAD)减少DH2MB的产生
如本文所述,本发明人已发现,异丁醇途径酶-二羟酸脱水酶(DHAD)的过表达减少副产物DH2MB的产生。
因此,在一个实施方案中,本发明提供具有二羟酸脱水酶(DHAD)的重组微生物,该酶催化2,3-二羟基异戊酸(DHIV)向2-酮异戊酸(KIV)转化。DHAD的过表达具有减少DH2MB产生的作用。在一个实施方案中,DHAD在裂解液中具有至少0.01U/mg的活性。在另一个实施方案中,DHAD在裂解液中具有至少0.03U/mg的活性。在又一个实施方案中,DHAD在裂解液中具有至少0.05、0.1、0.5、1、2、5或10U/mg的活性。
用于产生3-羟基酸的重组微生物
本发明在另外的方面提供用于产生作为产物或代谢中间体的3-羟基酸的重组微生物。在一个实施方案中,这些产3-羟基酸的重组微生物表达催化2-乙酰乳酸还原成DH2MB的乙酰乳酸合酶(ALS)和3-酮酸还原酶。在另一个实施方案中,这些产生3-羟基酸的重组微生物表达催化2-乙酰-2-羟基丁酸还原成2-乙基-2,3-二羟基丁酸的乙酰乳酸合酶(ALS)和3-酮酸还原酶。
这些产生3-羟基酸的重组微生物可以被进一步工程化以降低或消除将丙酮酸转化成乙酰乳酸之外产物的酶活性。在一个实施方案中,降低或消除丙酮酸脱羧酶(PDC)、乳酸脱氢酶(LDH)、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脱氢酶和/或甘油3-磷酸脱氢酶(GPD)的酶活性。
在具体的实施方案中,在过表达ALS基因和表达3-酮酸还原酶的重组PDC-负型GPD-负型酵母微生物中产生DH2MB。在一个实施方案中,3-酮酸还原酶为天然表达的。在另一个实施方案中,3-酮酸还原酶为异源表达的。在又一个实施方案中,3-酮酸还原酶为过表达的。在具体的实施方案中,3-酮酸还原酶由酿酒酵母TMA29基因或其同源物编码。在另一个具体的实施方案中,ALS由枯草芽孢杆菌AlsS编码。
在另一个具体的实施方案中,在过表达ALS基因和表达3-酮酸还原酶的重组PDC-负型GPD-负型酵母微生物中产生2-乙基-2,3-二羟基丁酸。在一个实施方案中,3-酮酸还原酶为天然表达的。在另一个实施方案中,3-酮酸还原酶为异源表达的。在又一个实施方案中,3-酮酸还原酶为过表达的。在具体的实施方案中,3-酮酸还原酶由酿酒酵母TMA29基因或其同源物编码。在另一个具体实施方案中,ALS由枯草芽孢杆菌AlsS编码。
根据这些另外的方面,本发明还提供产生2,3-二羟基-2-甲基丁酸(DH2MB)的方法,包括:(a)提供产生DH2MB的重组微生物,其表达催化2-乙酰乳酸还原成DH2MB的乙酰乳酸合酶(ALS)和3-酮酸还原酶,以及(b)在行业提供碳源的原料的培养基中培养所述重组微生物,直到产生可回收量的DH2MB。
根据这些另外的方面,本发明还提供产生2-乙基-2,3-二羟基丁酸的方法,包括:(a)提供产生2-乙基-2,3-二羟基丁酸的重组微生物,其表达催化2-乙酰-2-羟基丁酸还原成2-乙基-2,3-二羟基丁酸的乙酰乳酸合酶(ALS)和3-酮酸还原酶,以及(b)在含有提供碳源的原料的培养基中培养所述重组微生物,直到产生可回收量的2-乙基-2,3-二羟基丁酸。
用于产生酸产物的重组微生物
本发明在另外的方面提供用于产生衍生自醛的酸产物的重组微生物。在一个实施方案中,这些产生酸产物的重组微生物表达催化醛向相应酸产物转化的醛脱氢酶。这些产生酸产物的重组微生物可被进一步工程化,以降低或消除所需酸产物上游代谢产物的不可取转化的竞争酶活性。
在具体的实施方案中,在过表达醛脱氢酶的重组酵母微生物中产生酸产物。在一个实施方案中,醛脱氢酶为天然表达的。在另一个实施方案中,醛脱氢酶为异源表达的。在又一个实施方案中,醛脱氢酶为过表达的。在具体的实施方案中,醛脱氢酶由酿酒酵母ALD6基因或其同源物编码。
根据此另外的方面,本发明还提供产生酸产物的方法,包括:(a)提供产生酸产物的重组微生物,其表达催化醛向酸产物转化的醛脱氢酶,以及(b)在含有提供碳源的原料的培养基中培养所述重组微生物,直到产生可回收量的所需酸产物。
一般微生物
本文提供的重组微生物可表达由合适的碳源产生有益代谢产物的途径中涉及到的多种异源和/或天然酶,这些有益代谢产物诸如为异丁醇、2-丁醇、1-丁醇、2-丁酮、2,3-丁二醇、乙偶姻、二乙酰、缬氨酸、亮氨酸、泛酸、异丁烯、3-甲基-1-丁醇、辅酶A、2-甲基-1-丁醇、异亮氨酸、1-戊醇、1-己醇、3-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-己醇、5-甲基-1-庚醇和1-丙醇。在工程化生物合成途径中产生的有益代谢产物的非限制性列表见于本文的表1-3。
如本文所述,通过将遗传物质引入所选的宿主或亲本微生物和/或通过修饰天然基因的表达,从而修饰或改变微生物的细胞生理和生物化学,以产生“工程化的”或“修饰的”微生物。通过引入遗传物质和/或修饰天然基因的表达,亲本微生物获得新的特性,例如,产生新的、更大量的细胞内和/或细胞外代谢产物的能力。如本文所述,在亲本微生物中引入遗传物质和/或修饰天然基因的表达导致新的或改变的从合适碳源产有益代谢产物的能力,这些代谢产物诸如为异丁醇、2-丁醇、1-丁醇、2-丁酮、2,3-丁二醇、乙偶姻、二乙酰、缬氨酸、亮氨酸、泛酸、异丁烯、3-甲基-1-丁醇、辅酶A、2-甲基-1-丁醇、异亮氨酸、1-戊醇、1-己醇、3-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-己醇、5-甲基-1-庚醇和1-丙醇。在亲本微生物中引入的遗传物质和/或为表达而修饰的基因包括:编码产一种或多种代谢产物的生物合成途径中涉及到的一种或多种酶的一种或多种基因或基因部分,这些代谢产物选自异丁醇、2-丁醇、1-丁醇、2-丁酮、2,3-丁二醇、乙偶姻、二乙酰、缬氨酸、亮氨酸、泛酸、异丁烯、3-甲基-1-丁醇、辅酶A、2-甲基-1-丁醇、异亮氨酸、1-戊醇、1-己醇、3-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-己醇、5-甲基-1-庚醇和1-丙醇;并且还可以包括用于这些基因表达和/或调控其表达的另外元件,例如启动子序列。
除了向宿主或亲本微生物引入遗传物质外,工程化或修饰的微生物还可以包括基因或多核苷酸的改变、破坏、缺失或敲除,以改变微生物的细胞生理和生物化学。通过基因或多核苷酸的改变、破坏、缺失或敲除,微生物获得新的或改进的特性(例如,产生新的代谢产物或更大量细胞内代谢产物的能力、改善代谢产物顺着所需途径的量的能力和/或减少副产物产生的能力)。
本文提供的重组微生物还可以产生在亲本微生物中无法实现的量的代谢产物。“代谢产物”是指由代谢产生的任何物质或特定代谢过程所必需的或参与该过程的物质。代谢产物可以是作为代谢的起始材料(例如,葡萄糖或丙酮酸)、中间体(例如,2-酮异戊酸)或终产物(例如,异丁醇)的有机化合物。代谢产物可用于构建更复杂的分子,或者它们可被分解成更简单的分子。中间体代谢产物可由其它代谢产物合成、可能用于形成更复杂的物质、或分解成更简单的化合物,通常伴随化学能量的释放。
本公开鉴定可用于本公开方法、组合物和生物体的特定基因;然而,将认识到没要必要对此类基因进行绝对鉴定。例如,可对包含编码多肽或酶的序列的特定基因或多核苷酸进行改变并筛选其活性。通常,此类改变包括保守突变和沉默突变。可使用本领域已知的方法,筛选此类修饰或突变多的核苷酸和多肽的功能酶表达。
由于遗传密码的固有简并性,编码基本上相同或功能上相当的多肽的其它多核苷酸也可用于克隆和表达编码此类酶的多核苷酸。
如本领域的技术人员将会理解,会有利的是,对编码序列进行修饰以增强其在特定宿主中的表达。遗传密码具有64种可能的密码子,是冗余的,但是大多数生物体通常使用这些密码子的子集。在某个种中最常使用的密码子称为最优密码子,而不常使用的那些则归类为稀有或利用率低的密码子。在有时被称为“密码子优化”或“种密码子偏性控制”的过程中,密码子可被取代以反映宿主的优选密码子使用。
可以制备含有被特定原核或真核宿主所优选的密码子的经优化的编码序列(Murray等,1989,Nucl Acids Res.17:477-508),例如,以加快翻译速率或产生具有所需特性(诸如与由未优化的序列产生的转录本相比,更长的半衰期)的重组RNA转录本。也可对翻译终止密码子进行修饰以反映宿主偏好。例如,酿酒酵母和哺乳动物的典型终止密码子分别为UAA和UGA。单子叶植物的典型终止密码子为UGA,而昆虫和大肠杆菌则通常使用UAA作为终止密码子(Dalphin等,1996,Nucl Acids Res.24:216-8)。例如在美国专利No.6,015,891及其中引述的参考文献中,提供了在植物中优化核苷酸序列表达的方法。
本领域的技术人员将认识到,由于遗传密码的简并性,许多在其核苷酸序列中存在差异的DNA化合物可用于编码本公开的给定酶。本文仅参考了编码上述生物合成酶的天然DNA序列以示出本公开的实施方案,并且本公开包括编码本公开方法中所用酶的多肽和蛋白质的氨基酸序列的任何序列的DNA化合物。以相似的方式,多肽通常可以在其氨基酸序列中容许一个或多个氨基酸取代、缺失和插入而不损失或明显损失所需的活性。本公开包括与本文所述的特定蛋白质具有不同氨基酸序列的此类多肽,只要修饰的多肽或变体多肽具有参考多肽的酶合成代谢或分解代谢活性。此外,由本文所示的DNA序列编码的氨基酸序列仅仅示出了本公开的实施方案。
此外,本文提供的微生物和方法涵盖了可用于生成代谢产物的酶同源物。
如本文所用,当氨基酸序列具有至少约30%、40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性时,两种蛋白质(或蛋白质的区域)基本上同源。为了确定两种氨基酸序列或两种核酸序列的百分比同一性,将序列进行比对以用于最优比较目的(例如,可将间隙引入第一和第二氨基酸或核酸序列的一者或两者以用于最优比对,并可忽视非同源序列以用于比较目的)。在一个实施方案中,用于比较目的的所比对参考序列的长度为参考序列长度的至少30%、通常至少40%、更通常至少50%、甚至更通常至少60%以及甚至更通常至少70%、80%、90%、100%。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时,则分子在该位置相同(如本文所用,氨基酸或核酸“同一性”等同于氨基酸或核酸“同源性”)。考虑到用于两个序列最佳比对而需要引入的间隙数以及每个间隙的长度,两个序列之间的百分比同一性是序列共有的相同位置个数的函数。
当关于蛋白质或肽使用“同源”时,应认识到,不同的残基位置通常的差别在于保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有化学性质相似(例如,电荷或疏水性)的侧链(R基团)的另一氨基酸残基取代的情形。通常,保守氨基酸取代基本上不会改变蛋白质的功能特性。在其中两个或更多个氨基酸序列因保守取代而彼此不同的情况下,可向上调节百分比序列同一性或同源性程度以纠正取代的保守性质。进行这种调节的方法对本领域的技术人员是熟知的(参见例如Pearson W.R.,1994,Methods in Mol Biol25:365-89)。
以下六组的每一组都含有作为彼此保守取代的氨基酸:1)丝氨酸(S)、苏氨酸(T);2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q);4)精氨酸(R)、赖氨酸(K);5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V);以及6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
也称为百分比序列同一性的多肽序列同源性通常使用序列分析软件进行测定。参见共同拥有和共同未决的专利申请US 2009/0226991。用于将某一分子序列与含有大量来自不同生物体的序列的数据库进行比较的典型算法为计算机程序BLAST。当检索含有来自大量不同生物体的序列的数据库时,典型的是比较氨基酸序列。使用氨基酸序列的数据库检索可通过共同拥有和共同未决的专利申请US 2009/0226991中所述的算法进行测量。
应当理解,可以对大量的微生物进行修饰,以包括适于由需要乙酰乳酸和/或醛中间体的生物合成途径产生有益代谢产物的重组代谢途径。在多个实施方案中,微生物可以选自酵母微生物。用于产生代谢产物(诸如异丁醇、2-丁醇、1-丁醇、2-丁酮、2,3-丁二醇、乙偶姻、二乙酰、缬氨酸、亮氨酸、泛酸、异丁烯、3-甲基-1-丁醇、辅酶A、2-甲基-1-丁醇、异亮氨酸、1-戊醇、1-己醇、3-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-己醇、5-甲基-1-庚醇和1-丙醇)的酵母微生物可根据某些特性进行选择。
一种特性可以包括选择微生物以将多种碳源转化成有益代谢产物的性质,这些代谢产物诸如为异丁醇、2-丁醇、1-丁醇、2-丁酮、2,3-丁二醇、乙偶姻、二乙酰、缬氨酸、亮氨酸、泛酸、异丁烯、3-甲基-1-丁醇、辅酶A、2-甲基-1-丁醇、异亮氨酸、1-戊醇、1-己醇、3-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-己醇、5-甲基-1-庚醇和1-丙醇。术语“碳源”通常是指适合用作原核或真核细胞生长的碳来源的物质。合适的碳源的实例在共同拥有和共同未决的专利申请US 2009/0226991中有所描述。因此,在一个实施方案中,本文所公开的重组微生物可将多种碳源转化成产物,这些碳源包括但不限于葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、乳糖、蔗糖以及它们的混合物。
该重组微生物因此可进一步包含用于由五碳糖(戊糖)(包括木糖)产生异丁醇、2-丁醇、1-丁醇、2-丁酮、2,3-丁二醇、乙偶姻、二乙酰、缬氨酸、亮氨酸、泛酸、异丁烯、3-甲基-1-丁醇、辅酶A、2-甲基-1-丁醇、异亮氨酸、1-戊醇、1-己醇、3-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-己醇、5-甲基-1-庚醇和1-丙醇的途径。大多数酵母种通过复杂的途径代谢木糖,其中首先通过木糖还原酶(XR)将木糖还原成木糖醇。然后通过木糖醇脱氢酶(XDH)将木糖醇氧化成木酮糖。木酮糖随后通过木酮糖激酶(XK)磷酰化。此途径的效率在酵母种中非常低,因为它在细胞中引入了氧化还原失衡。木糖到木糖醇步骤使用NADH作为辅因子,而木糖醇到木酮糖步骤则使用NADPH作为辅因子。其它过程必须发挥作用以恢复细胞内的氧化还原失衡。这通常意味着生物体无法依靠木糖或其它戊糖在厌氧条件下生长。因此,迫切需要可有效地将木糖和其它戊糖发酵成所需发酵产物的酵母种。
因此,在一个方面,将重组微生物工程化以表达功能性外源木糖异构酶。酵母中的功能性外源木糖异构酶在本领域已知的。参见例如Rajgarhia等,US2006/0234364,其全文以引用方式并入本文。在根据该方面的一个实施方案中,将外源木糖异构酶基因可操作地连接到在酵母细胞中发挥作用的功能性启动子和终止子序列。在一个优选的实施方案中,重组微生物进一步具有编码催化木糖向木糖醇转化的酶(例如,XR和/或XDH)的天然基因的缺失或破坏。在一个进一步优选的实施方案中,重组微生物还含有可操作地连接到在酵母细胞中发挥作用的启动子和终止子序列的功能性外源木酮糖激酶(XK)基因。在一个实施方案中,将木酮糖激酶(XK)基因过表达。
在一个实施方案中,微生物具有降低的丙酮酸脱羧酶(PDC)活性或无丙酮酸脱羧酶(PDC)活性。PDC催化丙酮酸脱羧成乙醛,其然后经由NADH氧化成NAD+而被ADH还原成乙醇。乙醇的产生是氧化来自糖酵解的NADH的主要途径。此途径的缺失增加可用于生物合成途径的丙酮酸和还原当量(NADH)。因此,PDC基因的缺失可进一步提高所需代谢产物的得率。
在另一个实施方案中,微生物具有降低的甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)活性或无甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)活性。GPD通过NADH氧化成NAD+而催化磷酸二羟丙酮(DHAP)还原成甘油-3-磷酸(G3P)。然后通过甘油-3-磷酸酶(GPP)由G3P产生甘油。甘油的产生是氧化来自糖酵解的多余NADH的次要途径。减少或消除此途径将会增加可用于生物合成途径的丙酮酸和还原当量(NADH)。因此,GPD基因的缺失可进一步提高所需代谢产物的得率。
在又一个实施方案中,微生物具有降低的PDC活性或无PDC活性以及降低的PDC活性或无GPD活性。PDC-负型/GPD-负型酵母生产菌株在共同拥有和共同未决的专利公开US 2009/0226991和US 2011/0020889中有所描述,它们均全文以引用方式并入本文以用于所有目的。
在一个实施方案中,酵母微生物可选自“酵母属酵母进化枝”,如在共同拥有和共同未决的专利申请US 2009/0226991中所述。
术语“Saccharomyces sensu stricto”分类群是一组与酿酒酵母高度相关的酵母种(Rainieri等,2003,J.Biosci Bioengin 96:1-9)。Saccharomyces sensustricto酵母种包括但不限于酿酒酵母、库德里阿兹威酵母、S.mikatae、贝酵母、葡萄汁酵母、S.carocanis以及由这些菌种衍生的杂交体(Masneuf等,1998,Yeast 7:61-72)。
在半子囊酵母的进化过程中发生了古老的全基因组倍增(WGD)事件,并且该事件使用比较基因组工具而发现(Kellis等,2004,Nature 428:617-24;Dujon等,2004,Nature 430:35-44;Langkjaer等,2003,Nature 428:848-52;Wolfe等,1997,Nature 387:708-13)。使用这些主要的进化事件,酵母可以分成在WGD事件之后偏离共同祖先的种(本文称为“后-WGD酵母”)和在WGD事件之前偏离酵母谱系的种(本文称为“前-WGD酵母”)。
因此,在一个实施方案中,酵母微生物可以选自后-WGD酵母属,包括但不限于酵母属和假丝酵母属。有利的后-WGD酵母种包括:酿酒酵母、葡萄汁酵母、贝酵母、奇异酵母、S.castelli和光滑假丝酵母。
在另一个实施方案中,酵母微生物可以选自前-全基因组倍增(前-WGD)酵母属,其包括但不限于酵母属、克鲁维酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属、伊萨酵母属、德巴利酵母属、汉逊酵母属、耶氏酵母属和裂殖酵母属。代表性的前-WGD酵母种包括:克鲁弗酵母、耐热克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、克鲁雄酵母、乳酸克鲁维酵母、热带假丝酵母、巴斯德毕赤酵母、异常毕赤酵母、树干毕赤酵母、东方伊萨酵母、罕见伊萨酵母、菱形伊萨酵母(I.scutulata)、汉逊德巴利酵母、异常汉逊酵母、解脂耶氏酵母和粟酒裂殖酵母。
酵母微生物可以为Crabtree-阴性或Crabtree-阳性的,如共同拥有和共同未决的专利申请US 2009/0226991中所述。在一个实施方案中,酵母微生物可选自具有Crabtree-阴性表型的酵母,但不限于以下属:酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、伊萨酵母属、汉逊酵母属和假丝酵母属。Crabtree-阴性种包括但不限于:乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、异常毕赤酵母、树干毕赤酵母、东方伊萨酵母、罕见伊萨酵母、菱形伊萨酵母、异常汉逊酵母和产朊假丝酵母。在另一个实施方案中,酵母微生物可以选自具有Crabtree-阳性表型的酵母,包括但不限于酵母属、克鲁维酵母属、接合酵母属、德巴利酵母属、毕赤酵母属和裂殖酵母属。Crabtree-阳性酵母种包括但不限于:酿酒酵母、葡萄汁酵母、贝酵母、奇异酵母、S.castelli、耐热克鲁维酵母、光滑假丝酵母、拜耳接合酵母、鲁氏接合酵母、汉逊德巴利酵母、巴斯德毕赤酵母和粟酒裂殖酵母。
另一种特性可以包括微生物为非发酵微生物的性质。换句话讲,其无法在厌氧条件下代谢碳源,而该酵母能够在氧存在下代谢碳源。非发酵酵母是指天然存在的酵母以及经遗传修饰的酵母两者。在用发酵性酵母进行厌氧发酵期间,氧化来自糖酵解的NADH的主要途径是通过产生乙醇。乙醇通过醇脱氢酶(ADH)经由乙醛的还原产生,而乙醛则通过丙酮酸脱羧酶(PDC)由丙酮酸产生。在一个实施方案中,可以通过降低或消除天然PDC活性将发酵性酵母工程化为非发酵性酵母。因此,由糖酵解产生的大多数丙酮酸不被PDC消耗,并可用于异丁醇途径。这种途径的缺失增加生物合成途径可用的丙酮酸和还原当量。发酵性途径造成了所需代谢产物(诸如异丁醇)的低得率和低生产率。因此,PDC基因的缺失可以提高所需代谢产物(诸如异丁醇)的得率和生产率。
在一些实施方案中,重组微生物可以是为非发酵酵母微生物的微生物,包括但不限于归类为选自由下列组成的组的属的那些:丝孢酵母属、红酵母属、Myxozyma或假丝酵母属。在具体的实施方案中,非发酵酵母为C.xestobii。
产生异丁醇的酵母微生物
如本文所述,在一个实施方案中,将酵母微生物工程化以通过糖酵解将碳源(诸如葡萄糖)转化成丙酮酸,并且通过产生异丁醇的代谢途径将丙酮酸转化成异丁醇(参见例如WO/2007/050671、WO/2008/098227和Atsumi等,2008,Nature 45:86-9)。可供选择的产生异丁醇的途径在WO/2007/050671以及在Dickinson等,1998,J Biol Chem 273:25751-6中有所描述。
因此,在一个实施方案中,将丙酮酸转化成异丁醇的产生异丁醇的代谢途径可由以下反应构成:
1.2丙酮酸→乙酰乳酸+CO2
2.乙酰乳酸+NAD(P)H→2,3-二羟基异戊酸+NAD(P)+
3.2,3-二羟基异戊酸→α-酮异戊酸
4.α-酮异戊酸→异丁醛+CO2
5.异丁醛+NAD(P)H→异丁醇+NAD(P)+
这些反应通过以下酶进行:1)乙酰乳酸合酶(ALS)、2)酮醇酸还原异构酶(KARI)、3)二羟酸脱水酶(DHAD)、4)酮异戊酸脱羧酶(KIVD)和5)醇脱氢酶(ADH)(图1)。在另一个实施方案中,将酵母微生物工程化以过表达这些酶。例如,这些酶可由天然基因编码。作为另外一种选择,这些酶可由异源基因编码。例如,ALS可由枯草芽孢杆菌的alsS基因、乳酸乳球菌的alsS基因或肺炎克雷伯氏菌(K.pneumonia)的ilvK基因编码。例如,KARI可由大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)、M.maripaludis或Piromyces sp E2的ilvC基因编码。例如,DHAD可由大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌或乳酸乳球菌的ilvD基因编码。例如,KIVD可由乳酸乳球菌的kivD基因编码。ADH可由酿酒酵母的ADH2、ADH6或ADH7或者乳酸乳球菌的adhA编码。
在一个实施方案中,途径的步骤2和5可以通过利用NADH(而非NADPH)作为辅因子的KARI和ADH酶进行。此类酶在共同拥有和共同未决的专利公开US 2010/0143997中有所描述,该专利公开全文以引用方式并入本文以用于所有目的。本发明人已发现,利用NADH依赖性KARI和ADH酶分别催化途径的步骤2和5,令人惊讶地使得能够在厌氧条件下产生异丁醇。因此,在一个实施方案中,本发明的重组微生物可使用NADH依赖性KARI催化乙酰乳酸(+NADH)转化生成2,3-二羟基异戊酸。在另一个实施方案中,本发明的重组微生物可使用NADH依赖性ADH催化异丁醛(+NADH)转化生成异丁醇。在又一个实施方案中,本发明的重组微生物可使用NADH依赖性KARI催化乙酰乳酸(+NADH)转化生成2,3-二羟基异戊酸和NADH依赖性ADH催化异丁醛(+NADH)转化生成异丁醇。
在另一个实施方案中,酵母微生物可以被工程化以具有增强的丙酮酸向异丁醇转化能力。在一个实施方案中,酵母微生物可以被工程化以具有增强的丙酮酸向异丁醛转化能力。在另一个实施方案中,酵母微生物可以被工程化以具有增强的丙酮酸向酮异戊酸转化能力。在另一个实施方案中,酵母微生物可以被工程化以具有增强的丙酮酸向2,3-二羟基异戊酸转化能力。在另一个实施方案中,酵母微生物可以被工程化以具有增强的丙酮酸向乙酰乳酸转化能力。
此外,编码前述酶(或本文所述的任何其它酶(或控制或调节其表达的任何调控元件))的任何基因均可通过本领域普通技术人员已知的遗传/蛋白质工程技术优化,诸如定向进化或合理诱变。这种操作允许本领域的普通技术人员优化酵母中酶的表达和活性。
此外,编码这些酶的基因可从其它真菌和细菌菌种中鉴定并可进行表达以调节该途径。多种生物体可作为这些酶的来源,包括但不限于酵母属菌种,包括酿酒酵母和葡萄汁酵母;克鲁维酵母属菌种,包括耐热克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母和马克斯克鲁维酵母;毕赤酵母属菌种;汉逊酵母属菌种,包括多形汉逊酵母(H.polymorpha);假丝酵母属菌种;毛孢子菌属菌种(Trichosporon spp.);Yamadazyma属菌种,包括Y.spp.Stipitis;有孢圆酵母(Torulaspora pretoriensis);东方伊萨酵母;裂殖酵母属菌种,包括粟酒裂殖酵母;隐球酵母属菌种(Cryptococcus spp.);曲霉属菌种(Aspergillus spp.);脉孢菌属菌种(Neurospora spp.)或黑粉菌属菌种(Ustilago spp.)。来自厌氧真菌的基因来源包括但不限于瘤胃壶菌属菌种(Piromyces spp.)、Orpinomyces属菌种或Neocallimastix属菌种。可用的原核酶的来源包括但不限于大肠杆菌、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、芽孢杆菌属菌种、梭菌属菌种(Clostridium spp.)、棒杆菌属菌种(Corynebacterium spp.)、假单胞菌属菌种(Pseudomonas spp.)、乳球菌属菌种(Lactococcus spp.)、肠杆菌属菌种(Enterobacter spp.)和沙门氏菌属菌种(Salmonella spp.)。
在一个实施方案中,本发明涉及用于产生异丁醇的重组微生物,其中所述重组微生物包括产生异丁醇的代谢途径,并且其中所述微生物被工程化以降低或消除催化乙酰乳酸向DH2MB转化的酶的表达或活性。在一些实施方案中,催化乙酰乳酸向DH2MB转化的酶为3-酮酸还原酶(3-KAR)。在具体的实施方案中,3-酮酸还原酶由酿酒酵母TMA29(YMR226C)基因或其同源物编码。在一个实施方案中,该同源物可选自由下列组成的组:Vanderwaltomzyma polyspora(SEQ ID NO:2)、芽殖酵母(SEQ ID NO:3)、光滑假丝酵母(SEQ ID NO:4)、贝酵母(SEQ ID NO:5)、鲁氏接合酵母)(SEQ IDNO:6)、乳酸克鲁维酵母(SEQ ID NO:7)、棉阿舒囊霉(SEQ ID NO:8)、可鲁弗酵母(SEQ ID NO:9)、耐热克鲁维酵母(SEQ ID NO:10)、克鲁雄酵母(SEQID NO:11)、树干毕赤酵母(SEQ ID NO:12)、汉逊德巴利酵母(SEQ ID NO:13)、巴斯德毕赤酵母(SEQ ID NO:14)、杜氏假丝酵母(SEQ ID NO:15)、白假丝酵母(SEQ ID NO:16)、解脂耶氏酵母(SEQ ID NO:17)、东方伊萨酵母(SEQ ID NO:18)、构巢曲霉(SEQ ID NO:19)、构巢曲霉(SEQ ID NO:20)、粗糙链孢霉(SEQ ID NO:21)、粟酒裂殖酵母(SEQ ID NO:22)和马克斯克鲁维酵母(SEQ ID NO:23)。
在另一个实施方案中,本发明涉及用于产生异丁醇的重组微生物,其中所述重组微生物包括产生异丁醇的代谢途径,并且其中所述微生物被工程化以降低或消除催化异丁醛向异丁酸转化的酶的表达或活性。在一些实施方案中,催化异丁醛向异丁酸转化的酶为醛脱氢酶。在示例性实施方案中,醛脱氢酶为酿酒酵母醛脱氢酶ALD6(SEQ ID NO:25)或其同源物或变体。在一个实施方案中,该同源物选自由下列组成的组:芽殖酵母(SEQ ID NO:26)、光滑假丝酵母(SEQ ID NO:27)、贝酵母(SEQ ID NO:28)、乳酸克鲁维酵母(SEQID NO:29)、耐热克鲁维酵母(SEQ ID NO:30)、克鲁雄酵母(SEQ ID NO:31)、酿酒酵母YJ789(SEQ ID NO:32)、酿酒酵母JAY291(SEQ ID NO:33)、酿酒酵母EC1118(SEQ ID NO:34)、酿酒酵母DBY939(SEQ ID NO:35)、酿酒酵母AWRI1631(SEQ ID NO:36)、酿酒酵母RM11-1a(SEQ ID NO:37)、巴斯德毕赤酵母(SEQ ID NO:38)、马克斯克鲁维酵母(SEQ ID NO:39)、粟酒裂殖酵母(SEQ ID NO:40)和粟酒裂殖酵母(SEQ ID NO:41)。
在又一个实施方案中,本发明涉及用于产生异丁醇的重组微生物,其中所述重组微生物包括产生异丁醇的代谢途径,并且其中所述微生物(i)被工程化以降低或消除催化乙酰乳酸向DH2MB转化的酶的表达或活性以及(ii)被工程化以降低或消除催化异丁醛向异丁酸转化的酶的表达或活性。在一些实施方案中,催化乙酰乳酸向DH2MB转化的酶为3-酮酸还原酶(3-KAR)。在具体的实施方案中,3-酮酸还原酶由酿酒酵母TMA29(YMR226C)基因或其同源物或变体编码。在一个实施方案中,该同源物选自由下列组成的组:Vanderwaltomzyma polyspora(SEQ ID NO:2)、芽殖酵母(SEQ ID NO:3)、光滑假丝酵母(SEQ ID NO:4)、贝酵母(SEQ ID NO:5)、鲁氏接合酵母(SEQ IDNO:6)、乳酸克鲁维酵母(SEQ ID NO:7)、棉阿舒囊霉(SEQ ID NO:8)、可鲁弗酵母(SEQ ID NO:9)、耐热克鲁维酵母(SEQ ID NO:10)、克鲁雄酵母(SEQID NO:11)、树干毕赤酵母(SEQ ID NO:12)、汉逊德巴利酵母(SEQ ID NO:13)、巴斯德毕赤酵母(SEQ ID NO:14)、杜氏假丝酵母(SEQ ID NO:15)、白假丝酵母(SEQ ID NO:16)、解脂耶氏酵母(SEQ ID NO:17)、东方伊萨酵母(SEQ ID NO:18)、构巢曲霉(SEQ ID NO:19)、黑曲霉(SEQ ID NO:20)、粗糙链孢霉(SEQ ID NO:21)、粟酒裂殖酵母(SEQ ID NO:22)和马克斯克鲁维酵母(SEQ ID NO:23)。在一些实施方案中,催化异丁醛向异丁酸转化的酶为醛脱氢酶。在一个具体实施方案中,醛脱氢酶为酿酒酵母醛脱氢酶ALD6(SEQ IDNO:25)或其同源物或变体。在一个实施方案中,该同源物选自由下列组成的组:芽殖酵母(SEQ ID NO:26)、光滑假丝酵母(SEQ ID NO:27)、贝酵母(SEQ ID NO:28)、乳酸克鲁维酵母(SEQ ID NO:29)、耐热克鲁维酵母(SEQ IDNO:30)、克鲁雄酵母(SEQ ID NO:31)、酿酒酵母YJ789(SEQ ID NO:32)、酿酒酵母JAY291(SEQ ID NO:33)、酿酒酵母EC1118(SEQ ID NO:34)、酿酒酵母DBY939(SEQ ID NO:35)、酿酒酵母AWRI1631(SEQ ID NO:36)、酿酒酵母RM11-1a(SEQ ID NO:37)、巴斯德毕赤酵母(SEQ ID NO:38)、马克斯克鲁维酵母(SEQ ID NO:39)、粟酒裂殖酵母(SEQ ID NO:40)和粟酒裂殖酵母(SEQ ID NO:41)。
在一个实施方案中,产生异丁醇的代谢途径包括至少一个催化丙酮酸向异丁醇转化步骤的外源基因。在另一个实施方案中,产生异丁醇的代谢途径包括至少两个催化丙酮酸向异丁醇转化步骤的外源基因。在又一个实施方案中,产生异丁醇的代谢途径包括至少三个催化丙酮酸向异丁醇转化步骤的外源基因。在又一个实施方案中,产生异丁醇的代谢途径包括至少四个催化丙酮酸向异丁醇转化步骤的外源基因。在又一个实施方案中,产生异丁醇的代谢途径包括至少五个催化丙酮酸向异丁醇转化步骤的外源基因。
在一个实施方案中,异丁醇途径基因中的一个或多个编码局限于胞质溶胶的酶。在一个实施方案中,重组微生物包含产生异丁醇的代谢途径,其具有至少一种局限于胞质溶胶的异丁醇途径酶。在另一个实施方案中,重组微生物包含产生异丁醇的代谢途径,其具有至少两种局限于胞质溶胶的异丁醇途径酶。在又一个实施方案中,重组微生物包含产生异丁醇的代谢途径,其具有至少三种局限于胞质溶胶的异丁醇途径酶。在又一个实施方案中,重组微生物包含产生异丁醇的代谢途径,其具有至少四种局限于胞质溶胶的异丁醇途径酶。在示例性实施方案中,重组微生物包含产生异丁醇的代谢途径,其具有至少五种局限于胞质溶胶的异丁醇途径酶。其中一种或多种基因局限于胞质溶胶的产生异丁醇代谢途径在共同拥有和共同未决的美国专利申请序列号12/855,276中有所描述,该专利申请全文以引用方式并入本文以用于所有目的。
修饰的醇脱氢酶在产生异丁醇中的表达
本文所述的用于减少副产物异丁酸产生的另一种策略是增加负责将异丁醛转化成异丁醇的醇脱氢酶(ADH)的活性和/或表达。该策略阻止内源性酶对异丁醇途径中间体-异丁醛的竞争。ADH活性和/或表达的增加可以通过多种手段实现。例如,ADH活性可通过利用具有增强的启动子强度的启动子或通过增加醇脱氢酶基因的拷贝数而增强。
在可供选择的实施方案中,副产物异丁酸的产生可通过利用具有增强的异丁醛比活性的ADH而减少。此类具有增强的异丁醛比活性的ADH酶可在自然界中鉴定,或可通过对ADH酶的修饰而产生,诸如本文所述的修饰。在一些实施方案中,这些修饰将使异丁醛的米夏埃利斯-门滕常数(KM)降低。通过使用此类修饰的ADH酶,进一步限制了异丁醛内源酶的竞争。在一个实施方案中,在包含如本文所述的修饰ADH的重组微生物中,异丁酸得率(每摩尔葡萄糖的异丁酸摩尔数)低于约5%。在另一个实施方案中,在包含如本文所述的修饰ADH的重组微生物中,异丁酸得率(每摩尔葡萄糖的异丁酸摩尔数)低于约1%。在又一个实施方案中,在包含如本文所述的修饰ADH的重组微生物中,异丁酸得率(每摩尔葡萄糖的异丁酸摩尔数)低于约0.5%、低于约0.1%、低于约0.05%或低于约0.01%。
此外,通过利用修饰的ADH酶,本发明人可以建立一种情形,其中正反应(即异丁醛向异丁醇转化)相对于逆反应(即异丁醇向异丁醛转化)为优势反应。
上文所述的策略通常会导致异丁酸得率的降低,其伴随异丁醇得率的升高。因此,上述策略可用于降低异丁酸得率和/或滴度以及升高异丁醇得率与异丁酸得率的比率。
因此,在一个方面,本专利申请描述产生具有增强活性的修饰ADH,当与其余的四种异丁醇途径酶共表达时其可有利于提高异丁醇的产生。在根据该方面的一个实施方案中,本专利申请涉及包含一种或多种修饰ADH的重组微生物。在一个实施方案中,重组微生物被进一步工程化以降低或消除如本文所述的催化乙酰乳酸向DH2MB转化的酶的表达或活性。在另一个实施方案中,重组微生物被进一步工程化以降低或消除如本文所述的催化异丁醛向异丁酸转化的酶的表达或活性。
除了异丁醇生物合成途径之外,其它生物合成途径也利用将醛转化成醇的ADH酶。例如,ADH酶将多种醛转化成醇,作为产生1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、1-戊醇、2-甲基-1-丁醇和3-甲基-1-丁醇生物合成途径的一部分。
如本文所用,术语“ADH”或“ADH”酶或“醇脱氢酶”在本文中可互换使用,是指催化异丁醛向异丁醇转化的酶。ADH序列可得自大量的微生物,包括但不限于乳酸乳球菌(SEQ ID NO:175)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、金黄色葡萄球菌和蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)。可通过本发明方法修饰的ADH酶包括但不限于共同拥有和共同未决的美国专利公开No.2010/0143997中所公开的那些。可通过本文所述的方法修饰的ADH酶的代表性列表可见于表97。
修饰的ADH酶
根据本发明,可使ADH酶产生任意数量的突变,并在一个实施方案中,可产生多个突变以导致增强的异丁醛向异丁醇转化能力。此类突变包括点突变、移码突变、缺失和插入,而一个或多个(例如,一个、两个、三个、四个、五个或六个等)点突变是优选的。在示例性实施方案中,修饰的ADH酶在对应于选自以下的氨基酸的位置包含一个或多个突变:(a)乳酸乳球菌AdhA(SEQ ID NO:185)第50位酪氨酸;(b)乳酸乳球菌AdhA(SEQ ID NO:185)第77位谷氨酰胺;(c)乳酸乳球菌AdhA(SEQ ID NO:185)第108位缬氨酸;(d)乳酸乳球菌AdhA(SEQ ID NO:185)第113位酪氨酸;(e)乳酸乳球菌AdhA(SEQ ID NO:185)第212位异亮氨酸;以及(f)乳酸乳球菌AdhA(SEQ IDNO:185)第264位亮氨酸,其中AdhA(SEQ ID NO:185)由乳酸乳球菌醇脱氢酶(ADH)基因adhA(SEQ ID NO:184)或其密码子优化形式(SEQ ID NO:206)编码。
可使用本领域技术人员已知的任何方法将突变引入本发明的ADH酶。可通过例如在作为二价金属离子辅因子的镁存在下进行PCR反应而随机引入突变。作为另外一种选择,寡核苷酸定向诱变可用于创建修饰的ADH酶,其允许沿着编码的DNA分子在任何确定的位点发生所有可能类别的碱基对变化。一般来讲,该技术涉及对与编码所关注的ADH酶的单链核苷酸序列互补(除了一个或多个错配)的寡核苷酸退火。然后将错配的寡核苷酸通过DNA聚合酶延伸,从而产生在一条链中含有所需的序列变化的双链DNA分子。序列变化可例如导致氨基酸的缺失、取代或插入。然后可将双链多核苷酸插入合适的表达载体,从而可产生突变或修饰的多肽。上述寡核苷酸定向诱变可例如通过PCR进行。
用于本发明组合物和方法中的酶包括具有异丁醛向异丁醇转化能力的任何酶。此类酶包括但不限于乳酸乳球菌AdhA、肺炎链球菌AdhA和金黄色葡萄球菌AdhA以及蜡状芽孢杆菌AdhA等等。另外的可由本发明的方法修饰的ADH酶包括但不限于在共同拥有和共同未决的美国专利公开No.2010/0143997中所公开的那些。可通过本文所述的方法修饰的ADH酶的代表性列表可见于表16。如本领域的普通技术人员将会理解,修饰的ADH酶可通过本领域常规和熟知的重组或基因工程技术获得。修饰的ADH酶可例如通过定点或随机诱变使编码所关注的ADH酶的一种或多种基因产生突变而获得。此类突变可以包括点突变、缺失突变和插入突变。例如,一个或多个点突变(例如,一个或多个氨基酸被一个或多个不同的氨基酸取代)可用于构建本发明的修饰ADH酶。
本发明还包括与野生型ADH酶(例如,乳酸乳球菌AdhA或大肠杆菌AdhA)在氨基酸水平具有5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性并表现出增强的异丁醛向异丁醇转化能力的同源ADH酶。本发明还包括与包含如SEQID NO:185所示的氨基酸序列的ADH酶在氨基酸水平具有50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性并表现出与未修饰的野生型酶相比具有增强的异丁醛向异丁醇转化能力的ADH酶。本发明还包括编码上述ADH酶的核酸分子。
本发明还包括含有至少50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550或600个氨基酸残基并保持与ADH酶相关的一种或多种活性的ADH酶片段。此类片段可通过缺失突变、通过本领域常规和熟知的重组技术或通过使用多种熟知蛋白质分解酶的任一种对所关注ADH酶进行酶消化而获得。本发明还包括编码上述修饰的ADH酶和ADH酶片段的核酸分子。
所谓具有与参考氨基酸序列具有至少(例如)50%“同一性”的氨基酸序列的蛋白质或蛋白质片段,是指蛋白质的氨基酸序列与参考序列除了以下外都相同:蛋白质序列在参考蛋白质的氨基酸序列的每100个氨基酸中可包含最多50个氨基酸改变。换句话讲,为了获得具有与参考氨基酸序列具有至少50%同一性的氨基酸序列的蛋白质,参考序列中最多50%的氨基酸残基可以缺失或被另一种氨基酸取代,或者参考序列中总氨基酸残基的最多50%的大量氨基酸可被插入参考序列。参考序列的这些改变可发生在参考氨基酸序列的氨基(N-)和/或羧基(C-)末端位置和/或那些末端位置之间的任何位置,单个地散布在参考序列的残基之中和/或以一个或多个连续的组散布在参考序列内。实际情况是,给定的氨基酸序列是否例如与参考蛋白质的氨基酸序列具有至少50%同一性可常规地使用已知的计算机程序进行测定,所述已知的计算机程序诸如上文针对核酸序列同一性测定而描述的那些,或使用CLUSTAL W程序(Thompson,J.D.,等,Nucleic Acids Res.22:46734680(1994))进行测定。
在一个方面,在上文确定的位置的一个或多个中进行氨基酸取代(即,相当于或对应于乳酸乳球菌AdhA(SEQ ID NO:185)的Y50、Q77、V108、Y113、I212或L264的氨基酸位置)。因此,这些位置的氨基酸可由包括以下的任何其它氨基酸取代:Ala、Asn、Arg、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val。表现出增强的异丁醛向异丁醇转化能力的ADH酶的具体实例为下述ADH,其中:(1)第50位的酪氨酸已被苯丙氨酸或色氨酸残基取代,(2)第77位的谷氨酰胺已被精氨酸或丝氨酸残基取代,(3)第108位的缬氨酸已被丝氨酸或丙氨酸残基取代,(4)第113位的酪氨酸已被苯丙氨酸或甘氨酸残基取代,(5)第212位的异亮氨酸已被苏氨酸或缬氨酸残基取代,和/或(6)第264位的亮氨酸已被缬氨酸残基取代。
具有将异丁醛转化为异丁醇的能力的用于本发明的多肽可根据本领域普通技术人员熟知的用于分离和纯化天然蛋白质的标准程序从其天然原核或真核源中分离(参见例如Houts,G.E.,等,J.Virol.29:517(1979))。此外,具有将异丁醛转化为异丁醇的能力的多肽可通过本领域普通技术人员熟悉的重组DNA技术而制备(参见例如Kotewicz,M.L.,等,Nucl.Acids Res.16:265(1988);Soltis,D.A.,and Skalka,A.M.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:33723376(1988))。
在本发明的一个方面,修饰的ADH酶通过重组技术制备。为了克隆编码将根据本发明修饰的ADH酶的基因或其它核酸分子,可使用包含ADH酶基因或开放阅读框的分离的DNA来构建重组DNA文库。可使用本领域熟知的任何载体来克隆所关注的ADH酶。然而,所用的载体必须与将在其中转化重组载体的宿主相容。
用于构建质粒文库的原核载体包括诸如能够在大肠杆菌中复制的那些质粒,诸如例如pBR322、ColE1、pSC101、pUC-载体(pUC18、pUC19等;见于:Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.(1982);和Sambrook等,Molecular Cloning ALaboratory Manual(第2版)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.(1989))。芽孢杆菌属质粒包括pC194、pUB110、pE194、pC221、pC217等。此类质粒在Glyczan,T.在The Molecular Biology Bacilli,AcademicPress,York(1982),307329中进行公开。合适的链霉菌属质粒包括pIJ101(Kendall等,J.Bacteriol.169:41774183(1987))。假单胞菌属质粒由John等人(Rad.Insec.Dis.8:693704(1986))和Igaki(Jpn.J.Bacteriol.33:729742(1978))进行了综述。广宿主范围质粒或粘粒,诸如pCP13(Darzins andChakrabarty,J.Bacteriol.159:918(1984)),也可用于本发明。
合适的用于克隆所关注的ADH核酸分子的宿主为原核宿主。原核宿主的一个实例为大肠杆菌。然而,本发明的所需ADH核酸分子可在其它原核宿主中克隆,包括但不限于埃希氏菌属、芽孢杆菌属、链霉菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属和变形杆菌属中的宿主。
用于克隆和表达所关注的ADH酶的真核生物包括酵母和真菌细胞。尤其优选的真核宿主为酵母。在此类真核细胞中表达所需的ADH酶可能需要使用包含真核启动子的真核调控区。在真核细胞中克隆和表达ADH核酸分子可通过熟知的技术使用熟知的真核载体系统而实现。
根据本发明,可在任何所关注的ADH酶中产生一个或多个突变,以便增强酶将异丁醛转化成异丁醇的能力或根据本发明为酶赋予本文所述的其它性质。此类突变包括点突变、移码突变、缺失和插入。优选地,使用导致一个或多个氨基酸取代的一个或多个点突变,来产生具有增强的将异丁醛转化成异丁醇的能力的ADH酶。在本发明的一个优选方面,在等价于或对应于乳酸乳球菌AdhA(SEQ ID NO:185)酶的Y50(例如,Y50W或Y50F)、Q77(例如,Q77S或Q77R)、V108(例如,V108S或V108A)、Y113(例如,Y113F或Y113G)、I212(例如,I212T或I212V)和/或L264(例如,L264V)位的位置,可以产生一个或多个突变以在其它所关注的ADH酶中得到所需的结果。
本文鉴定的ADH酶(例如SEQ ID NO:185所示的乳酸乳球菌AdhA)的相应位置可容易地由本领域的技术人员对其它ADH酶进行鉴定。因此,鉴于限定的区域和本申请所述的测定法,本领域的技术人员可以进行一种或多种修饰,这会在任何所关注的ADH酶中导致增强的异丁醛向异丁醇转化能力。
在一个优选的实施方案中,修饰的ADH酶与野生型ADH酶相比,具有选自对应于Y50、Q77、V108、Y113、I212或L264的位置的1至6个氨基酸取代。在其它实施方案中,修饰的ADH酶与相应的野生型ADH酶相比,具有在其它位置的另外氨基酸取代。因此,修饰的ADH酶与相应的野生型ADH酶相比,可具有在其它位置的至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40个不同的残基。本领域的技术人员将会认识到,可具有氨基酸取代的附加位置的个数将取决于用于产生变体的野生型ADH酶。因此,在一些情况下,最多50个不同的位置可以具有氨基酸取代。
应当理解,多种微生物可作为编码适用于本文提供的重组微生物的ADH酶的遗传物质的“来源”。例如,此外,编码这些酶的基因可从其它真菌和细菌菌种中鉴定并可进行表达以调节该途径。多种微生物可作为这些酶的来源,包括但不限于:乳球菌种,包括乳酸乳球菌;乳酸杆菌种,包括短乳杆菌(L.brevis)、布氏乳杆菌(L.buchneri)、海格乳杆菌(L.hilgardii)、发酵乳杆菌(L.fermentum)、罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)、阴道乳杆菌(L.vaginalis)、L.antri、口腔乳杆菌(L.oris)和L.coleohominis;片球菌种(Pediococcus sp.),包括乳酸片球菌(P.acidilactici);芽孢杆菌种,包括蜡状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)、韦氏芽孢杆菌(B.weihenstephanensis)、蕈状芽孢杆菌(B.mycoides)和解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens);纤毛菌种(Leptotrichia sp.),包括L.goodfellowii、颊纤毛菌(L.buccalis)和L.hofstadii;放线杆菌种(Actinobacillus sp.),包括胸膜肺炎放线杆菌(A.pleuropneumoniae);链球菌种(Streptococcus sp.),包括血链球菌(S.sanguinis)、副溶血链球菌(S.parasanguinis)、格氏链球菌(S.gordonii)肺炎链球菌和S.mitis;链杆菌种(Streptobacillus sp.),包括念珠状链杆菌(S.moniliformis);葡萄球菌种,包括金黄色葡萄球菌;艾肯菌种(Eikenella sp.),包括侵蚀艾肯菌(E.corrodens);魏斯氏菌种(Weissella sp.),包括W.paramesenteroides;金氏菌种(Kingella sp.),包括口金氏菌(K.oralis);罗氏菌种(Rothia sp.),包括龋齿罗氏菌(R.dentocariosa)以及微小杆菌种(Exiguobacterium sp.)。
多种ADH酶的核苷酸序列是已知的。例如,ADH酶的序列可得自大量的微生物,包括但不限于乳酸乳球菌(SEQ ID NO:185)、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌和蜡状芽孢杆菌。可通过本发明方法修饰的ADH酶包括但不限于在共同拥有和共同未决的美国专利公开No.2010/0143997中所公开的那些。可通过本文所述的方法修饰的ADH酶的代表性列表可见于表97。
此外,任何方法均可用于鉴定编码具有比活性的ADH酶的基因。一般来讲,具有相似活性的同源或异源基因可通过功能、结构和/或遗传分析进行鉴定。在大多数情况下,具有相似活性的同源或异源基因将具有功能、结构和遗传上的相似性。本领域技术人员已知的技术可适于鉴定同源基因和同源酶。一般来讲,类似基因和/或类似酶可通过功能分析而鉴定并将具有功能相似性。本领域技术人员已知的技术可适于鉴定类似基因和类似酶。例如,要鉴定同源或类似基因、蛋白质或酶,技术可以包括但不限于:使用基于基因/酶的公开序列的引物通过PCR克隆基因,或使用设计用来扩增基因中保守区的简并引物通过简并PCR克隆基因。此外,本领域技术人员可使用技术来鉴定具有功能同源性或相似性的同源或类似基因、蛋白质或酶。这些技术包括通过针对所述活性的体外酶测定法检查细胞或细胞培养物的酶的催化效率或比活性,然后通过纯化分离具有所述活性的酶,通过诸如Edman降解的技术确定酶的蛋白质序列,为可能的核酸序列设计PCR引物,通过PCR对所述DNA序列进行扩增,以及克隆所述核酸序列。为了鉴定具有相似活性的同源或类似基因,这些技术还包括将关于候选基因或酶的数据与数据库诸如BRENDA、KEGG或MetaCYC进行比较。候选基因或酶可以根据本文的教导在上述数据库中鉴定。此外,酶活性可从表型上确定。
制备具有增强催化效率的ADH酶的方法
本发明还提供工程化ADH酶以增强其催化效率的方法。
一种增强ADH酶催化效率的方法是通过NNK文库进行饱和诱变。可对这些文库进行催化效率增强方面的筛选,以便鉴定哪一个突变有助于增强将异丁醛转化为异丁醇的能力。对在上述残基位的突变组合可通过任何方法进行研究。例如,可基于饱和诱变研究,设计突变体的组合文库。
另一种方法是使用随机寡核苷酸诱变,以通过把在合成寡核苷酸上编码的随机突变掺入酶中而产生多样性。群体内个别酶的突变数量可通过改变靶序列的长度以及寡核苷酸合成中的随机化程度而控制。此更明确的方法的优点在于可找到所有可能的氨基酸突变以及偶合突变。
如果上述实验中的最佳突变体未表现出足够的活性,则通过易错PCR的定向进化可用于获得进一步的改善。可执行ADH酶的易错PCR诱变,然后筛选ADH活性。
增强的ADH催化效率
在一个方面,修饰的ADH酶的催化效率得以增强。如本文所用,短语“催化效率”是指ADH酶允许其将异丁醛转化为异丁醇的性质。
在一个实施方案中,与野生型或亲本ADH相比,修饰的ADH的催化效率得以增强。优选地,修饰的ADH酶的催化效率与野生型或亲本ADH相比增强至少约5%。更优选地,修饰的ADH酶的催化效率与野生型或亲本ADH相比增强至少约15%。更优选地,修饰的ADH酶的催化效率与野生型或亲本ADH相比增强至少约25%。更优选地,修饰的ADH酶的催化效率与野生型或亲本ADH相比增强至少约50%。更优选地,修饰的ADH酶的催化效率与野生型或亲本ADH相比增强至少约75%。更优选地,修饰的ADH酶的催化效率与野生型或亲本ADH相比增强至少约100%。更优选地,修饰的ADH酶的催化效率与野生型或亲本ADH相比增强至少约200%。更优选地,修饰的ADH酶的催化效率与野生型或亲本ADH相比增强至少约500%。更优选地,修饰的ADH酶的催化效率与野生型或亲本ADH相比增强至少约1000%。更优选地,修饰的ADH酶的催化效率与野生型或亲本ADH相比增强至少约2000%。更优选地,修饰的ADH酶的催化效率与野生型或亲本ADH相比增强至少约3000%。最优选地,修饰的ADH酶的催化效率与野生型或亲本ADH相比增强至少约3500%。
修饰的ADH酶的基因表达
本文提供表达产生有益代谢产物中涉及到的一种或多种修饰ADH酶基因的方法,以及可用于该方法的重组DNA表达载体。因此,本公开的范围包括含有此类核酸的重组表达载体。术语“表达载体”是指可被引入宿主微生物或无细胞转录和翻译系统中的核酸。表达载体可永久或暂时保持在微生物中,无论是作为染色体或其它DNA的一部分存在于微生物中还是任何细胞区室中,诸如细胞质中的复制型载体。表达载体还包含驱动RNA表达的启动子,而RNA通常在微生物或细胞提取物中被翻译成多肽。为了高效将RNA翻译成蛋白质,表达载体通常还包含位于待表达基因的编码序列的起始密码子上游的核糖体结合位点序列。其它元件(诸如增强子、分泌信号序列、转录终止序列以及一种或多种可借以鉴定和/或选择含载体的宿主微生物的标记基因)也可以存在于表达载体中。使用选择标记(即赋予抗生素抗性或敏感性的基因),并且当细胞在合适的选择培养基中生长时,其赋予转化的细胞选择表型。
表达载体的各种组分可差异巨大,具体取决于载体的预期用途以及载体旨在其中复制或驱动表达的宿主细胞。适于在大肠杆菌、酵母、链霉菌属和其它常用细胞中表达基因和维持载体的表达载体组分广为人知并可商购获得。例如,适于包含在本公开表达载体中的启动子包括在真核或原核宿主微生物中发挥作用的那些。启动子可包含允许相对于宿主微生物的生长调控表达的或导致基因表达响应于化学或物理刺激而打开或关闭的调控序列。对于大肠杆菌和某些其它细菌宿主细胞,可使用衍生自生物合成酶、赋予抗生素抗性的酶和噬菌体蛋白质的基因的启动子,并且它们包括例如半乳糖、乳糖(lac)、麦芽糖、色氨酸(trp)、β-内酰胺酶(bla)、噬菌体λPL和T5启动子。此外,也可使用合成的启动子,诸如tac启动子(美国专利No.4,551,433)。对于大肠杆菌表达载体,有用的是包括大肠杆菌复制起点,诸如从pUC、p1P、p1和pBR。
因此,重组表达载体包含至少一个表达系统,其继而又由可操作地连接至启动子的生物合成基因编码序列以及任选地发挥作用以实现编码序列在相容宿主细胞中表达的终止序列的至少一部分组成。将宿主细胞通过用本公开的重组DNA表达载体进行转化而修饰,以含有作为染色体外元件的或整合进染色体的表达系统序列。
此外,用于从对特定微生物(即酵母微生物)特异的核酸分子表达多肽的方法是熟知的。例如,用于在克鲁维酵母属和酵母属内表达异源多肽的核酸构建体是熟知的(参见,例如针对克鲁维酵母属的美国专利No.4,859,596和4,943,529,它们均以引用方式全文并入本文;以及例如针对酵母属的Gellissen等,Gene 190(1):87-97(1997))。酵母质粒具有选择标记和复制起点,也称为自主复制序列(ARS)。此外,某些质粒也可以含有着丝粒序列。这些着丝粒质粒通常是单拷贝或低拷贝质粒。无着丝粒序列并利用2微米(酿酒酵母)或1.6微米(乳酸克鲁维酵母)复制起点的质粒是高拷贝质粒。选择标记可以为原养型的,诸如HIS3、TRP1、LEU2、URA3或ADE2;或抗生素抗性的,诸如bar、ble、hph或kan。
本公开的核酸可使用cDNA、mRNA、合成DNA或基因组DNA(作为模板)以及合适的寡核苷酸引物根据标准PCR扩增技术以及下文实施例章节中所述的那些程序而扩增。可将如此扩增的核酸克隆进合适的载体并通过DNA序列分析进行表征。此外,对应于核苷酸序列的寡核苷酸可通过标准合成技术制备,例如使用自动DNA合成仪。
还应理解的是,编码与本文所述的酶同源的多肽的分离的核酸分子可通过以下方式创建:将一个或多个核苷酸取代、增加或缺失引入编码特定多肽的核苷酸序列,使得将一个或多个氨基酸取代、增加或缺失引入所编码的蛋白质。可通过标准技术将突变引入多核苷酸,诸如定点诱变和PCR-介导的诱变。相比那些可能希望进行非保守氨基酸取代(参见上文)的位置,在一些位置中,优选地进行保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是这样的取代,即其中氨基酸残基由具有相似侧链的氨基酸残基取代。具有相似侧链的氨基酸残基家族在本领域中已有定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如,赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如,天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电极性侧链的氨基酸(例如,甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链侧氨基酸(例如,丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-支化侧链的氨基酸(例如,苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳族侧链的氨基酸(例如,酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
虽然氨基酸变化所产生的影响随多种因素而改变,诸如磷酸化、糖基化、链内键合、三级结构以及氨基酸在活性位点或可能的别构位点的作用,但是通常优选的是,取代的氨基酸与被取代的氨基酸来自同一组。在某种程度上,以下组含有可互换的氨基酸:碱性氨基酸赖氨酸、精氨酸和组氨酸;酸性氨基酸天冬氨酸和谷氨酸;中极性氨基酸丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺以及较小程度上的甲硫氨酸;非极性脂族氨基酸甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸(然而,由于大小,甘氨酸和丙氨酸更密切相关,并且缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸更密切相关);以及芳族氨基酸苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。此外,虽然按不同的类别分类,但是丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸似乎可在某种程度上互换,而半胱氨酸也适合该组,或可分类为中极性氨基酸。
一般方法
3-酮酸还原酶同源物的鉴定
任何方法均可用于鉴定编码具有3-酮酸还原酶活性的酶的基因,包括但不限于酿酒酵母TMA29。一般来讲,与诸如TMA29的3-酮酸还原酶同源或相似的基因可通过功能、结构和/或遗传分析进行鉴定。在大多数情况下,同源或相似基因和/或同源或相似酶将具有功能、结构或遗传上的相似性。
酿酒酵母基因TMA29也称为YMR226C。开放阅读框(ORF)YMR226C存在于酿酒酵母第XIII号染色体的第722395…721592位。YMR226C的染色体位置是与许多相关酵母中的染色体高度同线的区域[Byrne,K.P.和K.H.Wolfe(2005)“The Yeast Gene Order Browser:combining curated homology andsyntenic context reveals gene fate in polyploid species.”Genome Res.15(10):1456-61.Scannell,D.R.,K.P.Byrne,J.L.Gordon,S.Wong,和K.H.Wolfe(2006)“Multiple rounds of speciation associated with reciprocal gene lossin polyploidy yeasts.”Nature 440:341-5.Scannell,D.R.,A.C.Frank,G.C.Conant,K.P.Byrne,M.Woolfit and K.H.Wolfe(2007)”Independentsorting-out of thousands of duplicated gene pairs in two yeast species descendedfrom a whole-genome duplication.”Proc Natl Acad Sci USA104:8397-402.]
例如,其它酵母种中同线形式的YMR226C的位置可见于光滑假丝酵母13号染色体、鲁氏接合酵母1号染色体、乳酸克鲁维酵母2号染色体、棉阿舒囊霉6号染色体、可鲁弗酵母8号染色体、耐热克鲁维酵母4号染色体和推测的祖先酵母种8号染色体[Gordon,J.L.,K.P.Byrne,和K.H.Wolfe(2009)“Additions,losses andrearrangements on the evolutionary route from areconstructed ancestor to the modern Saccharomyces cerevisiae genome.”PLoSGenet.5:e1000485.]
使用此同线关系,可容易地鉴定此基因的种特定形式,并且实例可见于表4。
表4.YMR226C及其同源物。
种 | 基因名称 | SEQ ID NO: |
酿酒酵母 | YMR226C | 1 |
K.polyspora | Kpol_1043p53 | 2 |
芽殖酵母 | Scas_594.12d | 3 |
光滑假丝酵母 | CAGL0M11242g | 4 |
贝酵母 | Sbay_651.2 | 5 |
鲁氏接合酵母 | ZYRO0A05742p | 6 |
乳酸克鲁维酵母 | KLLA0B08371g | 7 |
棉阿舒囊霉 | AFR561Wp | 8 |
可鲁弗酵母 | SAKL0H04730g | 9 |
耐热克鲁维酵母 | KLTH0D 13002p | 10 |
克鲁雄酵母 | Kwal_26.9160 | 11 |
除了同线性以外,酿酒酵母TMA29基因的真菌同源物可由本领域的技术人员通过诸如BLAST和序列比对的工具进行鉴定。这些其它同源物可按相似的方式从相应的酵母种中缺失,以消除3-羟基酸副产物的蓄积。同源蛋白质的实例可见于Vanderwaltomzyma polyspora(SEQ ID NO:2)、芽殖酵母(SEQ ID NO:3)、光滑假丝酵母(SEQ ID NO:4)、贝酵母(SEQ ID NO:5)、鲁氏接合酵母(SEQ ID NO:6)、乳酸克鲁维酵母(SEQ ID NO:7)、棉阿舒囊霉(SEQ ID NO:8)、可鲁弗酵母(SEQ ID NO:9)、耐热克鲁维酵母(SEQ ID NO:10)、克鲁雄酵母(SEQ ID NO:11)、树干毕赤酵母(SEQ ID NO:12)、汉逊德巴利酵母(SEQ ID NO:13)、巴斯德毕赤酵母(SEQ ID NO:14)、杜氏假丝酵母(SEQ ID NO:15)、白假丝酵母(SEQ ID NO:16)、解脂耶氏酵母(SEQ ID NO:17)、东方伊萨酵母(SEQ ID NO:18)、构巢曲霉(SEQ ID NO:19)、黑曲霉(SEQID NO:20)、粗糙链孢霉(SEQ ID NO:21)、粟酒裂殖酵母(SEQ ID NO:22)和马克斯克鲁维酵母(SEQ ID NO:23)。
本领域技术人员已知的技术可适于鉴定另外的同源基因和同源酶。一般来讲,类似基因和/或类似酶可通过功能分析鉴定并将具有功能相似性。本领域技术人员已知的技术可适于鉴定类似基因和类似酶。例如,要鉴定同源或类似基因、蛋白质或酶,技术可以包括但不限于:使用基于基因/酶的公开序列的引物通过PCR克隆脱水酶基因,或使用设计用来扩增脱水酶基因中保守区的简并引物通过简并PCR克隆脱水酶基因。此外,本领域技术人员可使用技术来鉴定具有功能同源性或相似性的同源或类似基因、蛋白质或酶。这些技术包括通过针对所述活性的体外酶测定法检查细胞或细胞培养物的酶催化活性(如本文所述或Kiritani,K.Branched-Chain Amino Acids MethodsEnzymology,1970中所述),然后通过纯化分离具有所述活性的酶,通过诸如Edman降解的技术确定酶的蛋白质序列,为可能的核酸序列设计PCR引物,通过PCR对所述DNA序列进行扩增,以及克隆所述核酸序列。为了鉴定同源或相似基因和/或同源或相似酶、类似基因和/或类似酶或蛋白质,这些技术还包括将关于候选基因或酶的数据与诸如BRENDA、KEGG或MetaCYC的数据库进行比较。候选基因或酶可以根据本文的教导在上述数据库中鉴定。
醛脱氢酶同源物的鉴定
任何方法均可用于鉴定编码具有醛脱氢酶活性的酶的基因,所述醛脱氢酶包括但不限于酿酒酵母ALD6。一般来讲,与诸如ALD6的醛脱氢酶同源或相似的基因可通过功能、结构和/或遗传分析进行鉴定。在大多数情况下,同源或相似基因和/或同源或相似酶将具有功能、结构或遗传上的相似性。
酿酒酵母基因ALD6的系统名称也称为YPL061W。开放阅读框(ORF)YPL061W存在于酿酒酵母第XVI号染色体的第432585…434087位。YPL061W的染色体位置是与许多相关酵母中的染色体高度同线的区域[Byrne,K.P.和K.H.Wolfe(2005)“The Yeast Gene Order Browser:combiningcurated homology and syntenic context reveals gene fate in polyploid species.”Genome Res.15:1456-61.Scannell,D.R.,K.P.Byrne,J.L.Gordon,S.Wong,和K.H.Wolfe(2006)“Multiple rounds of speciation associated with reciprocalgene loss in polyploidy yeasts.”Nature 440:341-5.Scannell,D.R.,A.C.Frank,G.C.Contant,K.P.Byrme,M.Woolfit,and K.H.Wolfe(2007)”Independentsorting-out of thousands of duplicated gene pairs in two yeast species descendedfrom a whole-genome duplication.”Proc Natl Acad Sci USA104:8397-402.]。
例如,其它酵母种中同线形式的YPL061W的位置可见于光滑假丝酵母8号染色体、乳酸克鲁维酵母5号染色体、耐热克鲁维酵母5号染色体和推测的祖先酵母种8号染色体[Gordon,J.L.,K.P.Byrne,和K.H.Wolfe(2009)“Additions,losses,and rearrangements on the evolutionary route from areconstructed ancestor to the modern Saccharomyces cerevisiae genome.”PLoSGenet.5:e1000485.]。
使用此同线关系,可容易地鉴定此基因的种特定形式,并且实例可见于表5。
表5.ALD6及其同源物。
种 | 基因名称 | SEQ ID NO: |
酿酒酵母 | YPL061W | 25 |
芽殖酵母 | Scas_664.24 | 26 |
光滑假丝酵母 | CAGL0H05137g | 27 |
贝酵母 | Sbay_623.4 | 28 |
乳酸克鲁维酵母 | KLLA0E23057 | 29 |
耐热克鲁维酵母 | KLTH0E12210g | 30 |
克鲁雄酵母 | Kwal_27.119760 | 31 |
除了同线性以外,酿酒酵母ALD6基因的真菌同源物可由本领域的技术人员通过诸如BLAST和序列比对的工具进行鉴定。这些其它同源物可按相似的方式从相应的酵母种中缺失,以消除醛副产物的蓄积。同源蛋白质的实例可见于芽殖酵母(SEQ ID NO:26)、光滑假丝酵母(SEQ ID NO:27)、贝酵母(SEQ ID NO:28)、乳酸克鲁维酵母(SEQ ID NO:29)、耐热克鲁维酵母(SEQ IDNO:30)、克鲁雄酵母(SEQ ID NO:31)、酿酒酵母YJ789(SEQ ID NO:32)、酿酒酵母JAY291(SEQ ID NO:33)、酿酒酵母EC1118(SEQ ID NO:34)、酿酒酵母DBY939(SEQ ID NO:35)、酿酒酵母AWRI1631(SEQ ID NO:36)、酿酒酵母RM11-1a(SEQ ID NO:37)、巴斯德毕赤酵母(SEQ ID NO:38)、马克斯克鲁维酵母(SEQ ID NO:39)、粟酒裂殖酵母(SEQ ID NO:40)和粟酒裂殖酵母(SEQ ID NO:41)。
微生物中ADH或KDH的鉴定
任何方法均可用于鉴定编码具有醇脱氢酶(ADH)或酮酸脱氢酶(KDH)活性的酶的基因。醇脱氢酶(ADH)可催化异丁醇向异丁醛的可逆转化。酮酸脱氢酶(KDH)可催化2-酮异戊酸向异丁酰-CoA的转化,后者可通过转乙酰酶和羧酸激酶的作用被进一步转化成异丁酸。一般来讲,与已知的醇脱氢酶和酮酸脱氢酶同源或相似的基因可通过功能、结构和/或遗传分析进行鉴定。在大多数情况下,同源或相似的醇脱氢酶基因和/或同源或相似的醇脱氢酶将具有功能、结构或遗传上的相似性。同样,同源或相似的酮酸脱氢酶基因和/或同源或相似的酮酸脱氢酶将具有功能、结构或遗传上的相似性。
酵母微生物中PDC和GPD的鉴定
可以使用任何方法来鉴定编码具有丙酮酸脱羧酶(PDC)活性或甘油3-磷酸脱氢酶(GPD)活性的酶的基因。适于鉴定PDC和GPD的方法在共同拥有和共同未决的专利公开US 2009/0226991和US 2011/0020889中有所描述,它们均全文以引用方式并入本文以用于所有目的。
基因插入或缺失
可以使用任何方法以将核酸分子引入酵母中,并且许多这样的方法都是熟知的。例如,转化和电穿孔是将核酸引入酵母细胞的常用方法。参见例如Gietz等,1992,Nuc Acids Res.27:69-74;Ito等,1983,J.Bacteriol.153:163-8;以及Becker等,1991,Methods in Enzymology 194:182-7。
在一个实施方案中,根据同源重组的原理,发生所关注基因整合到酵母微生物的DNA片段或目标基因中。根据该实施方案,将包含含有至少一种酵母标记基因和/或待整合基因的模块(内部模块)的整合盒的任一侧为与目标整合位点两端的DNA片段同源的DNA片段(引起重组的序列)。在通过合适的方法用所述盒转化酵母之后,引起重组的序列之间的同源重组可以导致内部模块取代基因组中对应于整合盒中引起重组之序列的两个位点间的染色体区域(Orr-Weaver等,1981,PNAS USA 78:6354-58)。
在一个实施方案中,用于将所关注基因整合进酵母微生物的整合盒包括在适当启动子和终止子控制下的异源基因以及选择标记,它们两侧为引起重组的序列,用于异源基因整合进酵母染色体。在一个实施方案中,异源基因包括期望增加天然基因拷贝数的适当的天然基因。选择标记基因可以是用于酵母的任何标记基因,包括但不限于HIS3、TRP1、LEU2、URA3、bar、ble、hph和kan。引起重组的序列可以随意选择,取决于适合于所需应用的期望整合位点。
在另一实施方案中,将基因整合进酵母微生物的染色体可以通过随机整合发生(Kooistra等,2004,Yeast 21:781-792)。
此外,在一个实施方案中,使用本领域技术人员熟知的技术从基因组去除某些引入的标记基因。例如,URA3标记的丢失可以通过将含URA3的细胞接种在含有FOA(5-氟乳清酸)的培养基中并选择FOA抗性菌落而获得(Boeke等,1984,Mol.Gen.Genet 197:345-47)。
包含在本公开的酵母细胞内的外源核酸分子可以任何形式保持在该细胞内。例如,外源核酸分子可以整合进细胞的基因组或保持在附加体状态,这种状态可以稳定地传代(“遗传”)给子细胞。这样的染色体外遗传元件(诸如质粒、线粒体基因组等)可另外含有确保这样的遗传元件在子细胞中存在的选择标记。此外,可以将酵母细胞稳定地或暂时地转化。此外,本文所述的酵母细胞可以含有如上所述的特定外源核酸分子的单个拷贝或多个拷贝。
酶活性的降低
在本发明范围内的酵母微生物可以具有降低的酶活性,诸如降低的3-酮酸还原酶、PDC、ALDH或甘油3-磷酸脱氢酶(GPD)活性。如本文所用的关于特定酶活性的术语“降低”是指,与在相同种的可比较的酵母细胞中测量的相比,酶活性水平较低。术语“降低”还指与相同种的可比较的酵母细胞中测量的相比,酶活性的消除。因此,缺乏3-酮酸还原酶、PDC、ALDH或甘油3-磷酸脱氢酶(GPD)活性的酵母细胞被视为具有降低的3-酮酸还原酶、PDC、ALDH或甘油3-磷酸脱氢酶(GPD)活性,因为,即使不是全部,也是大部分的可比较的酵母菌株具有至少一些3-酮酸还原酶、PDC、ALDH或甘油3-磷酸脱氢酶(GPD)活性。这种降低的酶活性可以是较低的酶浓度、较低的酶比活性或它们的组合的结果。可以使用许多不同的方法以产生具有降低的酶活性的酵母。例如,可以使用常用的诱变或敲除技术使酵母细胞工程化,以使其具有被破坏的酶编码基因座。参见例如Methods in Yeast Genetics(1997 edition),Adams,Gottschling,Kaiser,and Stems,Cold Spring Harbor Press(1998)。此外,可以引入导致具有降低活性的酶的某些点突变。本发明的范围还包括当天然存在时基本上不含选自3-酮酸还原酶、PDC、ALDH或甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)活性的一种或多种活性的酵母菌株。
作为另外一种选择,可以使用反义技术来降低酶活性。例如,可使酵母工程化以使其包含编码反义分子的cDNA,该反义分子阻止酶的产生。如本文所用的术语“反义分子”涵盖含有对应于内源多肽的编码链的序列的任意核酸分子。反义分子还可具有侧翼序列(例如,调控序列)。因此,反义分子可以是核酶或反义寡核苷酸。核酶可具有任意的一般结构,包括但不限于发夹、锤头或斧头结构,只要该分子裂解RNA即可。
具有降低的酶活性的酵母可以用多种方法鉴定。例如,具有降低的3-酮酸还原酶、PDC、ALDH或甘油3-磷酸脱氢酶(GPD)活性的酵母可以使用普通方法容易地鉴定,这些方法可以包括(例如)通过液相色谱测量甘油的形成。
异源基因的过表达
从天然或异源核酸分子过表达多肽的方法是已知的。这些方法包括但不限于,构建核酸序列使得调控元件促进编码所需多肽的核酸序列的表达。通常,调控元件是在转录水平调控其它DNA序列表达的DNA序列。因此,调控元件包括但不限于启动子、增强子等。例如,外源基因可受诱导型启动子或组成型启动子的控制。此外,在酵母中由外源核酸分子表达多肽的方法也是熟知的。例如,用于在克鲁维酵母属和酵母属内表达外源多肽的核酸构建体是熟知的(参见,对于克鲁维酵母属例如美国专利No.4,859,596和4,943,529,以及对于酵母属例如Gellissen等,Gene 190(1):87-97(1997))。酵母质粒具有选择标记和复制起点。此外,某些质粒也可以含有着丝粒序列。这些着丝粒质粒通常是单拷贝或低拷贝质粒。无着丝粒序列并利用2微米(酿酒酵母)或1.6微米(乳酸克鲁维酵母)复制起点的质粒是高拷贝质粒。选择标记可以是原养型的,诸如HIS3、TRP1、LEU2、URA3或ADE2,或者抗生素抗性的,诸如bar、ble、hph或kan。
在另一实施方案中,异源控制元件可以用于激活或抑制内源基因的表达。此外,当表达需要受到抑制或消除时,可以通过已知的缺失技术来消除相关的酶、蛋白质或RNA的基因。
如本文所述,本公开范围内的任何酵母可以通过对所表达、过表达或抑制的特异酶的选择技术来鉴定。鉴定具有所需表型的菌株的方法是本领域的技术人员熟知的。这些方法包括但不限于PCR、RT-PCR和核酸杂交技术如Northern和Southern分析,改变在特定底物上或在特定底物、化学化合物、选择剂等存在下的生长能力。在一些情况下,免疫组织化学和生物化学技术可以用来通过检测编码多肽的表达来确定细胞是否包含特定核酸。例如,对于编码的酶具有特异性的抗体可以用于确定特定酵母细胞是否包含该编码的酶。进一步地,生物化学技术可用于通过检测作为酶多肽表达的结果所产生的产物来确定细胞是否含有编码该酶多肽的特定核酸分子。例如,用编码乙酰乳酸合酶的载体转化细胞并检测与无载体的细胞相比乙酰乳酸浓度的增加同时表明载体存在且基因产物具有活性。检测特定酶活性或特定产物存在的方法是本领域的技术人员所熟知的。例如,乙酰乳酸的存在可以按Hugenholtz and Starrenburg,1992,Appl.Micro.Biot.38:17-22所描述的方法来测定。
酶活性的增加
可以进一步使本发明的酵母微生物工程化以使其具有增强的酶活性(例如,在产生异丁醇的代谢途径中涉及到的酶的增强活性)。如本文所用的关于特定酶活性的术语“增加的”是指,与在相同种的可比较的酵母细胞中测量的相比,酶活性水平更高。例如,特定酶的过表达可以导致在细胞中该酶的活性水平增加。糖酵解或异丁醇途径中涉及的酶活性的增加会导致异丁醇的生产率和得率的增加。
增加酶活性的方法是本领域的技术人员已知的。这些技术可以包括通过增加的拷贝数和/或使用强启动子、引入减轻对酶的负调节的突变、引入增加比活性和/或降低对底物的Km的特定突变、或通过定向进化来增加酶的表达。参见例如Methods in Molecular Biology(第231卷),Arnold和Georgiou编著,Humana Press(2003)。
使用重组微生物实现高得率发酵的方法
为了使生物催化剂最经济地产生有益代谢产物,期望以高得率产生所述代谢产物。优选地,产生的唯一产物为所需的代谢产物,因为额外的产物(即副产物)会导致所需代谢产物的得率降低以及资本和生产成本增加,尤其是如果额外的产物价值很低或无价值时。这些额外的产物还需要额外的资本和生产成本来将这些产物与所需代谢产物分离。
在一个方面,本发明提供衍生自包含生物合成途径的重组微生物的有益代谢产物的生产方法。
在一个实施方案中,该方法包括在培养基中培养包含使用3-酮酸作为中间体的生物合成途径的重组微生物,该培养基包含提供碳源的原料,直到产生可回收量的有益代谢产物;以及任选地回收该代谢产物。在一个实施方案中,3-酮酸中间体为乙酰乳酸。在一个示例性实施方案中,所述重组微生物被工程化以降低或消除催化乙酰乳酸向DH2MB的酶的表达或活性。有益代谢产物可以衍生自使用乙酰乳酸作为中间体的任何生物合成途径,包括但不限于产生异丁醇、2-丁醇、1-丁醇、2-丁酮、2,3-丁二醇、乙偶姻、二乙酰、缬氨酸、亮氨酸、泛酸、异丁烯、3-甲基-1-丁醇、4-甲基-1-戊醇和辅酶A的生物合成途径。在一个具体实施方案中,有益代谢产物为异丁醇。在另一个实施方案中,3-酮酸中间体为2-乙酰-2-羟基丁酸。在示例性实施方案中,所述重组微生物被工程化以降低或消除催化2-乙酰-2-羟基丁酸向2-乙基-2,3-二羟基丁酸转化的酶的表达或活性。有益代谢产物可以衍生自使用2-乙酰-2-羟基丁酸作为中间体的任何生物合成途径,包括但不限于产生2-甲基-1-丁醇、异亮氨酸、3-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-己醇和5-甲基-1-庚醇的生物合成途径。
在另一个实施方案中,该方法包括在培养基中培养包含使用醛作为中间体的生物合成途径的重组微生物,该培养基包含提供碳源的原料,直到产生可回收量的有益代谢产物;以及任选地回收该代谢产物。在一个示例性实施方案中,所述重组微生物被工程化以降低或消除催化醛向酸副产物转化的酶的表达或活性。有益代谢产物可以衍生自使用醛作为中间体的任何生物合成途径,包括但不限于产生异丁醇、1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、1-丙醇、1-戊醇、1-己醇、3-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-己醇和5-甲基-1-庚醇的生物合成途径。在一个具体实施方案中,有益代谢产物为异丁醇。
在另一个实施方案中,该方法包括在培养基中培养包含使用乙酰乳酸和醛作为中间体的生物合成途径的重组微生物,该培养基包含提供碳源的原料,直到产生可回收量的有益代谢产物;以及任选地回收该代谢产物。在一个示例性实施方案中,所述重组微生物被工程化以(i)降低或消除催化乙酰乳酸向DH2MB转化的酶的表达或活性,以及(ii)降低或消除催化醛向酸副产物转化的酶的表达或活性。有益代谢产物可衍生自使用乙酰乳酸和醛作为中间体的任何生物合成途径,包括但不限于产生异丁醇、1-丁醇和3-甲基-1-丁醇的生物合成途径。在一个具体实施方案中,有益代谢产物为异丁醇。
在另一个实施方案中,该方法包括在培养基中培养包含使用2-乙酰-2-羟基丁酸和醛作为中间体的生物合成途径的重组微生物,该培养基包含提供碳源的原料,直到产生可回收量的有益代谢产物;以及任选地回收该代谢产物。在一个示例性实施方案中,所述重组微生物被工程化以(i)降低或消除催化2-乙酰-2-羟基丁酸向2-乙基-2,3-二羟基丁酸转化的酶的表达或活性,以及(ii)降低或消除催化醛向酸副产物转化的酶的表达或活性。有益代谢产物可以衍生自使用2-乙酰-2-羟基丁酸和醛作为中间体的任何生物合成途径,包括但不限于产生2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-己醇和5-甲基-1-庚醇的生物合成途径。
在另一个实施方案中,本发明提供衍生自需要醇脱氢酶(ADH)的生物合成途径的有益代谢产物的生产方法。在一个实施方案中,该方法包括在培养基中培养包含本文所述的修饰ADH的重组微生物,该培养基包含提供碳源的原料,直到产生可回收量的有益代谢产物;以及任选地回收该代谢产物。有益代谢产物可以衍生自任何需要ADH的生物合成途径,包括但不限于产生1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、1-戊醇、2-甲基-1-丁醇和3-甲基-1-丁醇的生物合成途径。在一个具体实施方案中,有益代谢产物为异丁醇。
在由碳源产生有益代谢产物的方法中,将酵母微生物在包含碳源的合适培养基中进行培养。在某些实施方案中,该方法还包括将有益代谢产物从培养基中分离。例如,异丁醇可以通过本领域技术人员已知的任何方法从培养基中分离,诸如蒸馏、全蒸发或液-液萃取。
在一个实施方案中,重组微生物可以按至少5%的理论得率由碳源产生有益代谢产物。在另一个实施方案中,微生物可以按至少约10%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或至少约97.5%的理论得率由碳源产生有益代谢产物。在一个具体实施方案中,有益代谢产物为异丁醇。
本发明将通过不应理解为限制的以下实施例进一步说明。本申请全文中引用的所有参考文献、专利和已公布的专利申请的内容以及附图和序列表均以引用方式并入本文以用于所有目的。
实施例
实施例1-26的一般方法
序列:本文所公开的氨基酸和核苷酸序列示于表6。
表6.在各个实施例中公开的酶和基因的氨基酸和核苷酸序列。
培养基:所用的培养基为标准酵母培养基(参见,例如Sambrook,J.,Russel,D.W.Molecular Cloning,A Laboratory Manual.第3版.2001,ColdSpring Harbor,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press以及Guthrie,C.和Fink,G.R.编著Methods in Enzymology Part B:uide to Yeast Genetics andMolecular and Cell Biology 350:3-623(2002))。YP培养基含1%(w/v)的酵母提取物、2%(w/v)的蛋白质胨。除非另外规定,否则YPD为含2%葡萄糖的YP。YPE为含25mL/L乙醇的YP。SC培养基为6.7g/L DifcoTM酵母氮源基础、14g/L SigmaTM合成缺陷型培养基添加剂(包含组氨酸、色氨酸、尿嘧啶和亮氨酸之外的氨基酸和营养物)、0.076g/L组氨酸、0.076g/L色氨酸、0.380g/L亮氨酸和0.076g/L尿嘧啶。除非另外指明,否则SCD为含2%(w/v)葡萄糖的SC。缺陷型SC和SCD培养基通过省去组氨酸(-H)、色氨酸(-W)、亮氨酸(-L)或尿嘧啶(-U)中的一种或多种而制备。上述培养基的固体形式含2%(w/v)琼脂。
克隆技术:除非另外指明,否则一般使用用于克隆和质粒构建的标准分子生物学方法(Sambrook,J.,Russel,D.W.Molecular Cloning,A LaboratoryManual.第3版.2001,Cold Spring Harbor,New York:Cold Spring HarborLaboratory Press)。克隆技术包括通过限制性酶消化、通过PCR产生DNA片段(KOD热启动聚合酶,Cat# 71086,Merck,Darmstadt,Germany)、使用DNA连接试剂盒(Mighty Mix Cat#TAK 6023,Clontech Laboratories,Madison,WI)连接两个DNA片段以及细菌转化进感受态大肠杆菌细胞(XtremeEfficiency DH5a感受态细胞,Cat#ABP-CE-CC02096P,Allele Biotechnology,San Diego,CA)。使用Qiagen QIAprep Spin Miniprep试剂盒(Cat#27106,Qiagen,Valencia,CA)从大肠杆菌细胞中纯化质粒DNA。使用Zymoclean凝胶DNA回收试剂盒(Zymo Research,Orange,CA;Catalog#D4002)根据制造商方案从琼脂糖凝胶中纯化DNA。
菌落PCR:酵母菌落PCR使用FailSafeTM PCR系统(EBiotechnologies,Madison,WI;Catalog#FS99250)根据制造商方案进行。对于每个样品(各30μL),将试剂盒中的含15μL Master Mix E缓冲液、10.5μL水、10μM浓度的各2μL引物、0.5μL聚合酶混合物的PCR混合物加入到0.2mL PCR管中。对于每种候选细胞,将少量细胞使用无菌移液枪头加到反应管中。使用琼脂糖凝胶电泳评价了阳性PCR产物的存在情况。
SOE PCR:使用以下PCR条件在热循环仪中孵育PCR反应:94℃×2min 1个循环,94℃×30s、53℃×30s、72℃×2min 35个循环以及72℃×10min1个循环。制备主混合物(master mix)使得每个反应包含以下组成:3μLMgSO4(25mM)、5μL 10×KOD缓冲液、5μL 50%DMSO、5μL dNTP混合物(各2mM)、1μL KOD、28μL dH2O、1.5μL正向引物(10μM)、1.5μL反向引物(10μM)、0.5μL模板(质粒或基因组DNA)。
基因组DNA分离:将Zymo Research ZR真菌/细菌DNA试剂盒(ZymoResearch Orange,CA;Catalog#D6005)根据制造商方案并进行以下改进而用于基因组DNA分离。在重悬沉淀后,取200μL转移到2个单独的ZRBashingBeadTM裂解管中(以最大化得率)。通过珠磨裂解后,将每歌ZRBashingBeadTM裂解管中的400μL上清液转移到2个单独的Zymo-SpinTM IV旋滤器中,以7,000rpm离心1分钟。离心后,将1.2mL真菌/细菌DNA结合缓冲液加入各滤液中。以800μl等分试样,将得自两过滤器的滤液转移到收集管中的单个Zymo-SpinTM IIC柱,并以10,000×g离心1分钟。对于洗脱步骤,不是以100μL EB(洗脱缓冲液,Qiagen)洗脱,而是加入50μL EB,孵育1分钟,然后将柱离心1分钟。重复该洗脱步骤,达到100μL的最终洗脱体积。
酿酒酵母转化。使酿酒酵母菌株在含有1%乙醇的YPD中生长。通过将酿酒酵母细胞在100mM乙酸锂中重悬而制备转化感受态细胞。一旦制备好细胞后,即为各转化制备DNA(用无菌水定容至15μL)、72μL 50%PEG、10μL 1M乙酸锂和3μL变性鲑精DNA(10mg/mL)的混合物。在1.5mL的管中,将15μL细胞悬液加到DNA混合物(100μL)中,然后将转化悬液涡旋5个短脉冲。将转化物在30℃孵育30分钟,然后在42℃孵育22分钟。通过离心(18,000×g,10秒,25℃)收集细胞。将细胞重悬在350μL YPD中,在30℃和250rpm下过夜复苏震摇后,将细胞平铺在含0.2g/L G418的YPD选择性平板上。然后将转化体单菌落纯化到G418选择性平板上。
马克斯克鲁维酵母转化:使马克斯克鲁维酵母菌株在250rpm和30℃下在3mL合适的培养基中过夜生长。第二天,将培养物稀释在50mL相同的培养基中,并让其生长到OD600为1与4之间。在无菌50mL锥形管中通过离心(1600×g,5min,室温)收集细胞。将细胞重悬在10mL电穿孔缓冲液(10mM Tris-C1、270mM蔗糖、1mM MgCl2,pH 7.5)中,然后在室温下以1600×g离心5分钟进行收集。将细胞重悬在10mL IB(YPE,25mM DTT,20mM HEPES,pH 8.0;通过将pH 8.0的100μL 2.5M的DTT和200μL 1M的HEPES稀释到10mL YPD中而现配)中。将细胞在250rpm、30℃下孵育30分钟(管直立)。在室温下以1600×g离心5分钟收集细胞,然后重悬在10mL冰冷的电穿孔缓冲液中。在4℃以1600×g离心5分钟使细胞沉降。将细胞重悬在1mL冰冷的电穿孔缓冲液中,然后转移到微量离心管。通过在4℃以>10,000×g离心20秒收集细胞。将细胞重悬在适量的冰冷电穿孔缓冲液中,使最终生物量浓度为30-38OD600/mL。将400μL细胞加到冰冷的电穿孔比色皿(隙宽0.4cm),将50μL SOE PCR产物(或水对照)加入并通过移液枪反复吹打进行混合,然后将比色皿在冰上孵育30分钟。将样品在1.8kV、1000Ω、25μF下进行电穿孔。然后将样品转移到具有1mL合适培养基的50mL管中,将样品在250rpm和30℃过夜孵育。孵育后,将细胞接种到合适的琼脂平板上。
乳酸克鲁维酵母转化:使乳酸克鲁维酵母菌株在3mL YPD中在250rpm和30℃过夜生长。第二天,将培养物稀释在50mL YPD中,让其生长,直到达到OD600为~0.8。通过离心(2700rcf,2min,25℃)收集50mLYPD培养物中的细胞。将细胞用50mL无菌水洗涤,然后通过室温下以2700rcf离心2分钟进行收集。将细胞再次用25mL无菌水洗涤,并且通过在室温下以2700rcf离心2分钟进行收集。将细胞重悬在1mL 100mM乙酸锂中,然后转移到1.5mL Eppendorf管中。通过在室温下以18,000rcf离心10秒收集细胞。将细胞重悬在大约为细胞沉淀体积4倍体积的100mM乙酸锂中。对于各转化,合并10-15μLDNA、72μL 50%PEG(3350)、10μL 1M乙酸锂、3μL变性鲑精DNA和无菌水,得到100μL的最终体积。在1.5mL的管中,将15μL细胞悬液加到DNA混合物中,并且然后将转化悬液涡旋5个短脉冲。将转化物在30℃孵育30分钟,然后在42℃孵育22分钟。通过在室温下以18,000rcf离心10秒收集细胞。将细胞重悬在400μL合适的培养基中,并且然后平铺在含有合适培养基的琼脂平板上,以选择转化的细胞。
分析化学:
气相色谱(方法GC1)。在配有Agilent 7673自动进样器、连接到火焰离子检测器(FID)的ZB-FFAP柱(J&W;30m长、0.32mm内径、0.25μM膜厚)或等同色谱柱的Agilent 5890/6890/7890气相色谱仪上进行挥发性有机化合物(包括乙醇和异丁醇)的分析。温度程序如下:进样器200℃,检测器300℃,烘箱100℃持续1分钟再以70℃/分钟梯度升温至230℃然后维持2.5分钟。使用纯标准品(>99%,得自Sigma-Aldrich)以及5点校正曲线(以1-戊醇作为内标)进行分析。
高效液相色谱(方法LC1):在配有Bio-Rad Micro-guard Cation HCartridge保护柱和两根串联Phenomenex Rezex RFQ-Fast Fruit H+(8%),100x7.8-mm色谱柱或等同色谱柱的Agilent 1200或等同高效液相色谱系统上进行有机酸代谢产物的分析,所述有机酸代谢产物包括2,3-二羟基异戊酸(DHIV)、2,3-二羟基-2-甲基丁酸(DH2MB)、异丁酸和葡萄糖。使用Agilent1100或等同紫外检测器(210nm)和折射率检测器检测有机酸代谢产物。柱温为60℃。该方法为等度方法,其中以溶于Milli-Q水的0.0180N H2SO4作为流动相。流速设为1.1mL/min。进样体积为20μL,运行时间为16min。使用具有纯标准品(>99%或可用的更高纯度)的5点校正曲线进行有机酸代谢产物的定量,以下除外:DHIV(2,3-二羟基-3-甲基-丁酸,CAS 1756-18-9),其根据Cioffi等的方法合成(Cioffi,E.等Anal Biochem 1980,104,第485页);以及DH2MB,其基于DHIV和DH2MB表现出相同的响应因子的假设而定量。在此方法中,DHIV和DH2MB共洗脱,因此它们的浓度以两种浓度之和进行记录。
高效液相色谱(方法LC4):在配有与IonPac AG11-HC保护柱(Dionex:13μm,4.6×50mm)和IonPac ATC-3 Anion Trap柱(Dionex:9×24mm)连接的IonPac AS11-HC分析柱(Dionex:9μm,4.6×250mm)的Agilent-1100高效液相色谱系统上进行含氧酸的分析,所述含氧酸包括2,3-二羟基异戊酸(DHIV,CAS 1756-18-9)、2,3-二羟基-2-甲基丁酸(DH2MB)、乳酸、乙酸、乙酰乳酸、异丁酸和丙酮酸。使用紫外检测器在225nm检测乙酰乳酸,而使用电导率检测器(ED50抑制电导,ASRS 4mm,自动抑制循环模式,200mA抑制电流)检测所有其它分析物。柱温为35℃。进样量为10μL。此方法使用以下洗脱图:0.25mM NaOH持续3分钟,然后以0.25至5mM NaOH的线性梯度运行22分钟,接着以5mM至38.25mM的第二线性梯度运行0.1min分钟,然后以38.25mM NaOH持续4.9分钟,再以38.25mM至0.25mM的最终线性梯度运行0.1分钟,最后以0.25mM NaOH重新平衡7分钟。将流速设为2mL/min。使用具有纯标准品(>99%,或可用的最高纯度)的4点校正曲线进行分析,以下除外:DHIV根据Cioffi等的方法合成(Cioffi,E.等AnalBiochem 1980,104,第485页)。DH2MB如实施例8中所述合成,并基于DHIV和DH2MB表现出相同的响应因子的假设而定量。外消旋乙酰乳酸通过用NaOH进行2-乙酰氧基-2-甲基-乙酰乙酸乙酯(EAMMA)的水解而制备(Krampitz,L.O.Methods in Enzymology 1957,3,277-283.)。在此方法中,对DHIV和DH2MB进行分离(图8)。
酶测定
蛋白质浓度测定:使用BioRad Bradford蛋白质测定试剂盒(Cat#500-0006,BioRad Laboratories,Hercules,CA)并将BSA用于标准曲线,测定(酵母裂解液的或纯化蛋白质的)蛋白质浓度。使用500μg/mL BSA的标准蛋白质储备溶液的系列稀释液绘制用于测定的标准曲线。在水中对细胞裂解液进行适当的稀释,以得到落在BioRad蛋白质标准曲线线性范围内的各裂解液的OD595测量值。将10μL裂解液稀释液加到500μL经稀释的BioRad蛋白质测定染料中,通过涡旋混合样品,并在室温孵育6分钟。然后将样品转移到比色皿,通过分光光度计在595nm读数。使用标准品的线性回归计算各样品的蛋白质浓度。
醇脱氢酶(ADH)测定。将细胞在冰上解冻,然后重悬在裂解缓冲液(100mM Tris-HCl pH 7.5)中。将1000μL玻璃珠(0.5mm直径)加到1.5mLEppendorf管中,然后加入875μL细胞悬液。使用Retsch MM301混磨机(Retsch Inc.Newtown,PA)裂解酵母细胞,其中以全速混合6×1分钟,每次珠磨步骤之间在冰上孵育1分钟。使管以23,500×g在4℃离心10分钟,并且移除上清液备用。将这些裂解液保持在冰上,直至用于测定。如本文所述测定酵母裂解液蛋白质浓度。
对样品进行稀释,使得能够获得活性读数。一般来讲,将预计具有低ADH活性的菌株样品按1:5稀释在裂解缓冲液(100mM Tris-HClpH 7.5)中,将预计具有高ADH活性的菌株样品(诸如其中由高拷贝数质粒表达ADH基因的菌株)按1:40至1:100稀释。使用10μL适当稀释的细胞提取物与90μL反应缓冲液(100mM Tris-HCl,pH 7.5;150μM NADH;11mM异丁醛)在340PC多功能酶标仪(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)中于96孔板中一式三份地进行反应。让反应在340nm进行5分钟,每10秒读取一次吸光度读数。反应的进行温度为30℃。反应在完整缓冲液以及无底物的缓冲液中进行。
异丁醛氧化测定(ALD6测定):将细胞沉淀在冰上解冻,然后重悬在裂解缓冲液(10mM磷酸钠(pH7.0)、1mM二硫苏糖醇、5%w/v甘油)中。对于各样品,将1mL玻璃珠(0.5mm直径)加到1.5mL Eppendorf管中,然后加入850μL细胞悬液。使用Retsch MM301混磨机(Retsch Inc.Newtown,PA)裂解酵母细胞,其中以全速混合6×1分钟,每次之间在冰上孵育1分钟。将管以21,500×g在4℃离心10分钟,然后将上清液转移到新的管中。将提取物保持在冰上,直至进行测定。如本文所述测定酵母裂解液蛋白质浓度。
用于测量细胞裂解液中催化异丁醛氧化成异丁酸的酶的酶活性的方法通过对Meaden等1997,Yeast13:1319-1327以及Postma等1988,Appl.Environ.Microbiol.55:468-477中的方法进行改进而得。简而言之,对于各样品,将10μL未稀释的细胞裂解液加到紫外微量滴定板的6个孔中。三个孔接纳90μL测定缓冲液,其含有pH 7.5的50mM HEPES-NaOH、0.4mMNADP+、3.75mM MgCl2和0.1mM、1mM或10mM异丁醛。另外3个孔接纳90μL无底物的缓冲液(与测定缓冲液相同,但不含异丁醛)。通过移液枪反复吹打将缓冲液与裂解液在孔中混合。然后在340nm监测反应5分钟,在340PC酶标仪(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)中每10秒采集一次吸光度读数。反应在30℃进行。每个样品的Vmax通过减去无底物对照的背景读数而确定。对于每种底物浓度,无裂解液对照也一式三份地进行。
ALS测定:对于实施例1-18中所述的ALS测定,将细胞在冰上解冻,然后重悬在裂解缓冲液(50mM磷酸钠缓冲液(pH 6.0)和1mM MgSO4)中。将1000μL玻璃珠(0.5mm直径)加到1.5mL Eppendorf管中,然后加入875μL细胞悬液。使用Retsch MM301混磨机(Retsch Inc.Newtown,PA)裂解酵母细胞,其中以全速混合6×1分钟,每次珠磨步骤之间在冰上孵育1分钟。将管以23,500×g在4℃离心10分钟,移除上清液备用。将这些裂解液保持在冰上,直至用于测定。如本文所述测量裂解液的蛋白质含量。对于每种裂解液,具有和不具有底物,所有ALS测定均一式三份进行。要测定各裂解液,将15μL裂解液与135μL缓冲液(50mM磷酸钠缓冲液(pH 6.0)、1mMMgSO4、1mM硫胺素焦磷酸盐、110mM丙酮酸)混合,然后在30℃孵育15分钟。在室温下配制缓冲液。也包括无底物对照(无丙酮酸的缓冲液)和无裂解液对照(裂解缓冲液代替裂解液)。孵育后,将21.5μL 35%的H2SO4加到各反应中,在37℃孵育1h。
对于实施例19-25中所述的ALS测定,将细胞在冰上解冻,然后重悬在裂解缓冲液(100mM NaPO4缓冲液(pH 7.0)、5mM MgCl2和1mM DTT)中。将1mL玻璃珠(0.5mm直径)加到1.5mL Eppendorf管中,然后将800μL细胞悬液加到含玻璃珠的管中。使用Retsch MM301混磨机(Retsch Inc.Newtown,PA)和冷却模块裂解酵母细胞,方法是以30次循环/秒混合六次,每次1分钟,每次混合之间冰冻1分钟。将管在4℃以21,500×g离心10分钟,然后移除上清液。将提取物保持在冰上,直至进行测定。如本文所述,使用BioRad Bradford蛋白质测定试剂盒(Cat#500-0006,BioRad Laboratories,Hercules,CA)并将BSA用于标准曲线而测定酵母裂解液蛋白质浓度。对于各裂解液,所有ALS测定均一式三份进行。将所有缓冲液、裂解液和反应管在冰上预冷。为了测定各裂解液,将15μL裂解液(根据需要用裂解缓冲液稀释)与135μL测定缓冲液(50mM KPi(pH 7.0)、1mM MgSO4、1mM硫胺素焦磷酸盐、110mM丙酮酸)混合,然后在30℃孵育15分钟。也包括无底物对照(无丙酮酸的缓冲液)和无裂解液对照(裂解缓冲液代替裂解液)。孵育后,将各反应与21.5μL 35%的H2SO4混合,在37℃孵育1h,以5,000×g离心5分钟以除去任何不溶性沉淀物。
分析所有测定样品的测定底物(丙酮酸)和产物(乙偶姻),方法是在配有两根串联Restek RFQ 150×4.6mm柱的HP-1200高效液相色谱系统上通过高效液相色谱法进行。使用HP-1100紫外检测器(210nm)和折射率检测器检测有机酸代谢产物。柱温为60℃。该方法为等度方法,以0.0180N H2SO4(溶于Milli-Q水)为流动相。流速设为1.1mL/min。进样体积为20μL,运行时间为8分钟。使用纯标准品(>99%,得自Sigma-Aldrich)和5点校正曲线进行分析。
TMA29酶测定:将细胞沉淀在冰上解冻,然后重悬在裂解缓冲液(10mM磷酸钠pH7.0、1mM二硫苏糖醇、5%w/v甘油)中。对于各样品,将1mL玻璃珠(0.5mm直径)加到1.5mL Eppendorf管中,然后加入850μL细胞悬液。使用Retsch MM301混磨机(Retsch Inc.Newtown,PA)裂解酵母细胞,其中以全速混合6×1分钟,每次之间在冰上孵育1分钟。将管在4℃以21,500×g离心10分钟,然后将上清液转移到新的管中。将提取物保持在冰上,直至进行测定。如本文所述,使用BioRad Bradford蛋白质测定试剂盒(Cat#500-0006,BioRad Laboratories,Hercules,CA)并将BSA用于标准曲线而测定酵母裂解液蛋白质浓度。
在厌氧瓶中进行(S)-2-乙酰乳酸((S)-AL)的酶法合成。反应以55mL含20mM磷酸钠(pH 7.0)、1mM MgCl2、0.05mM硫胺素焦磷酸盐(TPP)和200mM丙酮酸钠的总体积进行。合成通过加入65单位的纯化枯草芽孢杆菌AlsS而引发,并将反应在30℃的静态培养箱中孵育7.5h。
外消旋2-乙酰乳酸((R/S)-2-AL)的化学合成通过将50μL 2-乙酰氧基-2-甲基-乙酰乙酸乙酯(EAMMA)与990μL水混合而进行。然后以10μL的增量将260μL 2N NaOH加入,每次加入后涡旋15秒。然后将溶液在轨道式震荡器上混合20分钟。
外消旋AHB((R/S)-AHB)的化学合成通过将50μL乙基-2-乙酰氧基-2-乙基-3-氧代丁酸与990μL水混合而进行。然后以10μL的增量将2N NaOH加入,每次加入后涡旋15秒。持续加入NaOH直到溶液的pH为12(约180μL的2N NaOH)。然后将溶液在轨道式震荡器上混合20分钟。
对于(S)-AL、(R/S)-AL或(R/S)-AHB还原活性的测定,将10μL未稀释的细胞裂解液加到紫外微量滴定板的6个孔中。三个孔接纳90μL测定缓冲液,其包含100mM KPO4(pH 7.0)、150μM NADPH和作为底物的5mM(S)-AL或10mM(R/S)-AL或10mM(R/S)-AHB。另外3个孔接纳90μL测定缓冲液但无底物。通过移液枪反复吹打在孔中将缓冲液与裂解液混合。在340nm监测反应,在340PC酶标仪(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)中每10秒取一次吸光度读数。反应在30℃进行。通过减去无底物对照的背景读数确定每个样品的(S)-AL、(R/S)-AL或(R/S)-AHB还原活性。无裂解液对照也一式三份进行。
DHAD酶测定:将细胞沉淀在冰上解冻,然后重悬在裂解缓冲液(50mMTris(pH 8.0)、5mM MgSO4和G Biosciences Yeast/Fungal ProteaseArrestTM(St.Louis,MO,USA,Catalog#788-333))中。对于各样品,将1mL玻璃珠(0.5mm直径)加到1.5mL Eppendorf管中,然后加入850μL细胞悬液。使用Retsch MM301混磨机(Retsch Inc.Newtown,PA)裂解酵母细胞,其中以全速混合6×1分钟,每次之间在冰上孵育1分钟。将管在4℃以21,500×g离心10分钟,然后将上清液转移到新的管中。将提取物保持在冰上,直至进行测定。如本文所述测定酵母裂解液蛋白质浓度。将每个样品的蛋白质稀释在DHAD测定缓冲液(50mM Tris(pH8),5mM MgSO4)中得到0.5μg/μL的最终浓度。与无裂解液对照一起,测定各裂解液的三个样品。将10μL各样品(或DHAD测定缓冲液)加到0.2mL PCR管中。使用多通道移液枪,将90μL底物加到各管中(底物混合物通过将4mL DHAD测定缓冲液加到0.5mL100mM DHIV中而制备)。将样品放在35℃的热循环仪(EppendorfMastercycler)中30分钟,然后在95℃孵育5分钟。将样品在热循环仪上冷却到4℃,然后以3000×g离心5分钟。最后,将75μL上清液转移到新的PCR管中,并如下通过HPLC进行分析。将100μL DNPH试剂(12mM 2,4-二硝基苯肼、10mM柠檬酸(pH 3.0)、80%乙腈、20%MilliQ H2O)加到100μL各样品中。将样品在70℃的热循环仪(Eppendorf,Mastercycler)中孵育30分钟。在配有Eclipse XDB C-18反相色谱柱(Agilent)和C-18反相色谱柱保护柱(Phenomenex)的HP-1200高效液相色谱系统上进行酮异戊酸和异丁醛的分析。使用HP-1100紫外检测器(210nm)检测酮异戊酸和异丁醛。柱温为50℃。该方法为等度方法,使用70%乙腈比水作为流动相(含2.5%稀磷酸(4%))。流速设为3mL/min。进样体积为10μL,并且运行时间为2分钟。
实施例1:通过增强酿酒酵母中的ADH活性而提高异丁醇/异丁酸比率
本实施例的目的是展示增强的醇脱氢酶活性导致提高的异丁醇得率、降低的异丁酸得率以及增加的异丁醇得率与异丁酸得率的比率。
本实施例中公开的菌株和质粒分别示于表7和8中。
表7.实施例1中所公开的菌株的基因型。
表8.实施例1中所公开的质粒。
如所述,将由其染色体DNA表达单一醇脱氢酶(黑腹果蝇ADH,Dm_ADH)的酿酒酵母菌株GEVO2843用只携带KARI和DHAD(分别为Ec_ilvC_Q110V和Ll_ilvD_coSc)的2μ质粒pGV2011或携带KARI、DHAD和ADH(分别为Ec_ilvC_Q110V、Ll_ilvD_coSc和Ll_adhA)的pGV2485转化。
为了起始发酵培养,将转化菌株的少量过夜培养物在含1%乙醇和0.2g/L G418的YPD培养基中起始,并且在30℃和250rpm下孵育过夜。测试了各菌株的三个生物学重复。第二天早上,测定这些培养物的OD600,使用适量接种到50mL带挡板摇瓶中的50mL相同培养基,达到约0.1的OD600。将这些预培养物在30℃和250rpm下孵育过夜。当培养物达到约5-6的OD600时,将它们在50mL Falcon管中于25℃以2700rpm离心5分钟。将来自一个50mL培养物(一个克隆)中的细胞重悬在含8%葡萄糖、0.2g/L G418、1%(v/v)乙醇(含有3g/L麦角固醇和132g/L Tween-80)并用200mM MES缓冲到pH 6.5的YPD中。然后将培养物转移到250mL不带挡板的摇瓶中,并在30℃和75rpm下孵育。
在72h时间点,采集各发酵摇瓶中的样品用于测定OD600、ADH活性以及用于通过GC1和LC1分析。为了制备用于GC1和LC1分析的样品,将适当体积的细胞培养物在微量离心机中以最大速度离心10分钟,然后移除上清液用于GC1和LC1分析。通过将14mL细胞培养基以3000×g在4℃离心5分钟来制备用于ADH测定的细胞沉淀。移除上清液,并将细胞在3mL冷无菌水中洗涤。然后如上所述将管离心2分钟,移除上清液,并再次对管称重以确定总细胞重量。将Falcon管储存在-80℃。如所述进行ADH测定。
表9显示了在发酵过程中各菌株的OD600。在该发酵的72h中,菌株的OD600相似:它们以为约7的OD600起始,以为约9的OD600结束。测量了72h时间点的得自用两种质粒转化的GEVO2843的裂解液的体外ADH酶活性。表9显示了体外测量的裂解液中的ADH活性。携带无ADH的质粒(pGV2011)的菌株表现出约0.04U/mg的活性。携带具有Ll_adhA基因的质粒(pGV2485)的菌株具有约7倍高的ADH活性。
表9.用质粒pGV2011或pGV2485转化的菌株GEVO2843在发酵72h后的OD600和醇脱氢酶活性。
发酵72h后的异丁醇和异丁酸滴度示于表10中。具有约0.04U/mg的低ADH活性的菌株中的异丁醇滴度与具有0.29U/mg的高ADH活性的菌株相比明显更低。具有约0.04U/mg的低ADH活性的菌株中的异丁酸滴度与具有0.29U/mg的高ADH活性的菌株相比明显更高。表6还示出了发酵72h后异丁酸和异丁醇的得率。具有约0.04U/mg的低ADH活性的菌株中的异丁醇得率与具有0.29U/mg的高ADH活性的菌株相比明显更低。具有约0.04U/mg的低ADH活性的菌株中的异丁酸得率与具有0.29U/mg的高ADH活性的菌株相比明显更高。
表10.用质粒pGV2011或pGV2485转化的菌株GEVO2843在发酵72h后的异丁醇和异丁酸滴度和得率。
实施例2:在酿酒酵母中通过使用变体ADH L1_AdhA
RE1
进一步提高异
丁醇/异丁酸比率
本实施例的目的是展示,具有升高kcat和降低KM的醇脱氢酶的表达导致进一步的异丁醇得率升高、异丁酸得率降低以及异丁醇得率与异丁酸得率的比率升高。
表11.实施例2中所公开的菌株的基因型。
表12.实施例2中所公开的质粒。
将由其染色体DNA表达单一醇脱氢酶(黑腹果蝇ADH,Dm_ADH)的酿酒酵母菌株GEVO2843用携带KARI、DHAD、KIVD和组氨酸标记、密码子优化的野生型ADH(分别为Ec_ilvCQ110V、Ll_ilvD_coSc和Ll_adhA_coSchis6)的2μ质粒pGV2543或携带KARI、DHAD、KIVD和组氨酸标记、密码子优化的突变ADH(分别为Ec_ilvCQ110V、Ll_ilvD_coSc和Ll_adhARE1_coSchis6)的pGV2545转化。如所述,将这些菌株进行培养,并通过GC1和LC1评价ADH酶活性以及细胞外代谢产物的产生情况。
Ll_adhA_coSchis6Ll_adhARE1_coSchis6基因产物(分别为Ll_adhAhis6和Ll_adhARE1-his6)的动力学参数示于表13中。
表13.野生型Ll_adhAhis6与修饰的Ll_adhARE1的动力学参数的比较,以NADH作为辅因子对异丁醛测得。
表14显示了在发酵过程中各菌株的OD600。在该发酵的72h中,菌株的OD600相似:它们以约6的OD600起始,以约9的OD600结束。测量了72h时间点的得自用两种质粒转化的GEVO2843的裂解液的体外ADH酶活性。表14显示了如上所述体外测得的裂解液中的ADH活性。携带具有Ll_adhA_coSchis6的质粒(pGV2543)的菌株表现出约0.38U/mg的活性。携带Ll_adhARE1_coSchis6基因的质粒(pGV2545)的菌株具有约7倍高的ADH活性。
表14.用质粒pGV2543或pGV2545转化的菌株GEVO2843在发酵72h后的OD600和醇脱氢酶活性。
发酵72h后的异丁醇和异丁酸滴度和得率示于表15中。携带pGV2543的菌株的异丁醇滴度和得率低于携带pGV2545的菌株。携带pGV2543的菌株的异丁酸滴度和得率明显高于携带pGV2545的菌株。
表15.用质粒pGV2453或pGV2485转化的菌株GEVO2843在发酵72h后的异丁醇和异丁酸滴度和得率。
实施例3:通过表达RE1进一步提高酿酒酵母中的异丁醇/异丁酸比率
本实施例的目的是展示,表达具有升高kcat和降低KM的醇脱氢酶导致在发酵罐容器中进行的发酵的异丁醇得率升高而异丁酸得率降低。
进行发酵以比较酿酒酵母菌株GEVO3519和GEVO3523的性能。在发酵过程中测量了异丁醇和异丁酸滴度和得率。GEVO3519携带2μ质粒pGV2524,其含有编码以下酶的基因:KARI、DHAD、KIVD和组氨酸标记、密码子优化的野生型乳酸乳球菌ADH。GEVO3523携带2μ质粒pGV2524,其含有编码以下酶的基因:KARI、DHAD、KIVD和具有降低KM和升高kcat的组氨酸标记、密码子优化的乳酸乳球菌ADH的改良变体。通过LC1和GC1评价这些菌株的异丁醇、异丁醛、葡萄糖消耗,以及评价DasGip发酵罐容器的发酵过程中的OD600。
表16.实施例3中所公开的菌株的基因型。
表17.实施例3中所公开的质粒。
分别如所述,将酿酒酵母菌株GEVO3128用2μ质粒pGV2524或pGV2546转化,以产生菌株GEVO3519和GEVO3523。通过接种含有80mLYPD培养基的500mL带挡板摇瓶起始GEVO3519和GEVO3523的接种培养,该培养基含有0.2g/L G418抗生素、1%v/v乙醇和0.019g/L色氨酸。将培养物孵育大约34h。在两实验中,均将轨道式震荡器设置在250rpm和30℃。GEVO3519和GEVO3523菌株实现了相似的细胞群。孵育后实现的细胞密度为8.0OD600。使用2L顶驱马达DasGip容器(每只容器的工作体积为0.9L)在含有80g/L葡萄糖、0.2g/L G418、1%v/v乙醇和0.019g/L色氨酸的YPD培养基中进行分批发酵。对容器与合适的溶解氧探头和pH探头一起在121℃灭菌60分钟。在灭菌后对溶解氧探头进行校准,以便允许极化,然而pH探头则在灭菌前进行校准。使用6N KOH和2N H2SO4将pH控制在pH 6.0。在培养的生长期,氧传递速率(OTR)为10mM/h,并且在培养的生产期,OTR为0.2mM/h。
表18显示了为培养的生产期计算出的异丁醇滴度和得率(以%理论表示)。在携带具有升高KM和降低kcat的醇脱氢酶的菌株GEVO3523中,异丁醇滴度和得率均升高。表18还显示了异丁酸滴度(以达到的最大滴度记录)以及得率(用%表示的碳得率)。在携带具有降低KM和升高kcat的醇脱氢酶的菌株GEVO3523中,异丁酸滴度和得率均降低。
表18.异丁醇和异丁酸滴度和得率。
实施例4:在酿酒酵母ALD6基因缺失的发酵中异丁酸和乙酸产生减少
以下实施例示出了ALD6基因的缺失导致发酵中异丁酸和乙酸的产生减少。
ALD6缺失菌株的构建:使用PCR产生含有ALD6的等位基因缺失的DNA片段,以使ALD6从酿酒酵母中缺失。一个PCR反应扩增DNA片段(A),它包含ALD6的上游侧翼区以及在DNA片段3’末端与pGV1954的PSc_CCW12启动子区域的5’末端的重叠区,其中使用引物oGV2834和oGV2835。另一个PCR反应扩增DNA片段(D),它包含ALD6的下游侧翼区以及在DNA片段5’末端与pGV2074的hph潮霉素抗性ORF的3’末端的重叠区,其中使用引物oGV2836和oGV2837。另一个PCR反应扩增DNA片段(B),它包含pGV1954的PSc_CCW12启动子区域,其具有在DNA片段的5’末端与ALD6(片段A)的上游侧翼区的3’末端的重叠区,以及在DNA片段的3’末端与pGV2074的hph潮霉素抗性ORF的5’末端的区域,其中使用引物oGV2631和oGV2632。另一个PCR反应扩增DNA片段(C),它包含pGV2074的hph潮霉素抗性ORF,其具有在DNA片段的5’末端与pGV1954(片段B)PSc_CCW12启动子区域的3’末端的重叠区,以及在DNA片段的3’末端与ALD6(片段D)下游侧翼区的5’末端的重叠区,其中使用引物oGV2633和oGV2634。将DNA片段A和B通过PCR使用引物oGV2834和oGV2632合并以产生DNA片段AB,以及将DNA片段C和D通过PCR使用引物oGV2633和oGV2837合并以产生DNA片段CD。将DNA片段AB和CD通过PCR使用引物oGV2834和oGV2837合并,以产生含有ALD6的等位基因缺失的DNA片段ABCD。
表19.实施例4中所公开的引物序列。
通过缺失ALD6而表现出异丁酸和乙酸产生减少的菌株通过用含有ALD6的等位基因缺失的ABCD DNA片段转化GEVO3198而构建。选择对0.1g/L潮霉素有抗性的转化体,并且使用引物对oGV2840/oGV2680、oGV968/oGV2841和oGV2838/oGV2839通过菌落PCR筛选具有正确ABCDDNA片段整合的转化体菌落。通过该菌落PCR鉴定出菌株GEVO3711、GEVO3712和GEVO3713为通过ABCD DNA片段的正确整合而缺失了ALD6。
通过缺失ALD6而表现出异丁酸和乙酸产生减少的含有产生异丁醇途径的菌株通过用2μ复制起点质粒pGV2247转化GEVO3711、GEVO3712和GEVO3713而构建,该质粒携带表达KARI、DHAD、KIVD和ADH的基因(分别为Ec_ilvC_coScP2D1-A1、Ll_ilvD_coSc、Ll_kivD2_coEc和Ll_adhA)。选择对0.2g/L G418和0.1g/L潮霉素有抗性的转化体,并通过重新划线接种到含有0.1g/L潮霉素和0.2g/L G418的培养基上进行纯化,从而产生菌株GEVO3714、GEVO3715和GEVO3716。含有产生异丁醇途径的ALD6对照菌株GEVO3466通过用质粒pGV2247转化GEVO3198而生成。选择对0.2g/LG418有抗性的转化体,并通过重新划线接种到含有0.2g/L G418的培养基上进行纯化。
ald2Δ、ald3Δ、ald4Δ、ald5Δ和hfd1Δ缺失菌株的构建:使用PCR产生单独的DNA片段,它们含有ALD2、ALD3、ALD4、ALD5和HFD1的单个缺失等位基因,以使ALD2、ALD3、ALD4、ALD5和HFD1单个地从单独菌株中的酿酒酵母缺失。另外,使用PCR产生以下DNA片段,其含有覆盖ALD2和ALD3两者的缺失等位基因,这两者是酿酒酵母基因组中的相邻基因,以使ALD2和ALD3一起(ald2Δald3Δ)从单个菌株中的酿酒酵母中缺失。对于各个基因,通过PCR产生含有上游侧翼区、pGV1954的PSc_CCW12启动子区域、pGV2074的hph潮霉素抗性ORF以及下游侧翼区的四元件片段,与产生缺失ALD6的ABCD片段一样,不同的是使用表20中列出的引物对。同时缺失ALD2和ALD3的四元件片段含有ALD2的上游侧翼区和ALD3的下游侧翼区,并通过PCR使用表20中列出的引物对相似地构建。pGV1954的PSc_CCW12启动子区域始终通过引物对oGV2631/oGV2632扩增,并且pGV2074的hph潮霉素抗性ORF始终通过引物对oGV2633/oGV2634扩增。
表20.用于扩增基因缺失的上游和下游区域的引物。
单个缺失ALD2、ALD3、ALD4、ALD5和HFD1以及同时缺失ALD2和ALD3的菌株通过使用含有ALD2、ALD3、ALD4、ALD5或HFD1各个缺失等位基因的单个四元件DNA片段或者使用同时含有ALD2和ALD3缺失等位基因的四元件DNA片段转化GEVO3198或GEVO3466而构建。选择对0.1g/L潮霉素抗性的转化体,使用表21中列出的引物对通过菌落PCR筛选转化体菌落的四元件DNA片段的正确整合。通过此菌落PCR鉴定出菌株GEVO3567正确缺失了ALD2;通过此菌落PCR鉴定出菌株GEVO3568正确缺失了ALD3;通过此菌落PCR鉴定出菌株GEVO3569同时正确缺失了ALD2和ALD3;通过此菌落PCR鉴定出菌株GEVO3579正确缺失了ALD4;通过此菌落PCR鉴定出菌株GEVO3705、GEVO3706和GEVO3707正确缺失了ALD5;以及通过此菌落PCR鉴定出菌株GEVO3720、GEVO3721和GEVO3722正确缺失了HFD1。
含有产生异丁醇途径并单个缺失ALD2、ALD3和ALD5或同时缺失ALD2和ALD3的菌株通过用质粒pGV2247转化菌株GEVO3567、GEVO3568、GEVO3569、GEVO3705、GEVO3706和GEVO3707而构建。选择对0.2g/LG418和0.1g/L潮霉素有抗性的转化体,并通过重新划线接种到含0.1g/L潮霉素和0.2g/L G418的培养基上进行纯化,从而产生菌株GEVO3586、GEVO3587、GEVO3588、GEVO3590、GEVO3591、GEVO3592、GEVO3593、GEVO3594、GEVO3595、GEVO3708、GEVO3709和GEVO3710。菌株GEVO3579、GEVO3720、GEVO3721和GEVO3722由GEVO3466产生,并因此含有质粒pGV2247。
表21.用于筛选菌落以确认基因缺失的引物。
表22.实施例4中所公开的菌株的基因型。
表23.实施例4中所公开的质粒。
摇瓶发酵:进行了发酵以将GEVO3466的性能与含有ald2Δ、ald3Δ、ald2Δald3Δ、ald4Δ、ald5Δ、hfd1Δ和ald6Δ缺失突变的菌株进行比较。将酵母菌株从含有0.2g/L G418的YPD琼脂平板中的细胞贴片(patch)或纯化的单个菌落接种到14mL圆底按盖(snap-cap)管中的3mL含有0.2g/L G418和1%v/v乙醇的YPD培养基中。以250rpm在30℃下以一定角度震摇,将培养物孵育过夜最长24h。单独地针对各菌株,将这些过夜培养物用于接种250mL带挡板摇瓶(带套罩)中的50mL含0.2g/L G418和1%v/v乙醇的YPD培养基中,达到0.1的OD600。以250rpm在30℃下进行震摇,将这些摇瓶培养物孵育过夜最长24h。通过以3000×g离心5分钟单独收获对于各菌株的这些摇瓶培养物中的细胞,并将各细胞沉淀单独重悬在5mL含80g/L葡萄糖、1%v/v的溶于乙醇的3g/L麦角固醇和132g/L Tween 80的储备溶液、200mM MES缓冲液(pH 6.5)和0.2g/L G418的YPD培养基中。将各细胞悬液用于接种250mL无挡板摇瓶(带通气螺旋盖)中的50mL含80g/L葡萄糖、1%v/v的溶于乙醇的3g/L麦角固醇和132g/L Tween 80的储备溶液、200mM MES缓冲液(pH 6.5)和0.2g/L G418的YPD培养基,达到约5的OD600。将这些发酵液在250rpm和30℃下震摇孵育。定期地,取出各摇瓶发酵中的样品,以测量OD600并准备用于异丁醇和其它代谢产物的气相色谱(GC1)分析以及有机酸和葡萄糖的高效液相色谱(LC1)分析。取2mL样品加到微量离心管,并在微量离心机中以最大rpm离心10分钟。如所述,通过GC1和LC1分析1mL上清液的细胞外代谢产物。
在摇瓶发酵中ALD6的缺失减少了异丁酸和乙酸的产生:GEVO3466以及ald6Δ菌株GEVO3714、GEVO3715和GEVO3716的52h摇瓶发酵结果汇总在表24中。ald6Δ菌株GEVO3714、GEVO3715和GEVO3716与ALD6菌株GEVO3466相比产生的异丁酸少71%。ald6Δ菌株GEVO3714、GEVO3715和GEVO3716与ALD6菌株GEVO3466相比产生的乙酸也少86%。ald6Δ菌株GEVO3714、GEVO3715和GEVO3716的异丁醇得率与ALD6菌株GEVO3466相比无明显不同。ald6Δ菌株GEVO3714、GEVO3715和GEVO3716的异丁醇滴度比ALD6菌株GEVO3466高23%。
表24.通过缺失ALD6证实异丁酸和乙酸产生减少的摇瓶发酵结果
GEVO3466和ald2Δ、ald3Δ、ald2Δ、ald3Δ、ald4Δ、ald5Δ和hfd1Δ菌株的72h摇瓶发酵结果汇总在表25和26中。缺失ALD3、同时缺失ALD2和ALD3或缺失ALD4的菌株与野生型ALDH菌株GEVO3466相比异丁酸的产生未减少。缺失ALD2、ALD5或HFD1的菌株与野生型ALDH菌株GEVO3466相比异丁酸的产生无明显减少。同时缺失ALD2和ALD3两者的菌株与野生型ALDH菌株GEVO3466相比产生的乙酸少19%,但是单个缺失ALD2、ALD3、ALD4、ALD5或HFD1的菌株与野生型ALD菌株GEVO3466相比乙酸的产生无明显减少。
表25.通过缺失ALD2、ALD3、ALD4或同时缺失ALD2和ALD3证实异丁酸和乙酸的产生未减少的摇瓶发酵结果。
表26.通过缺失ALD5或HFD1证实异丁酸和乙酸的产生未减少的摇瓶发酵结果。
台式发酵罐中的发酵:进行台式发酵罐中的发酵以将GEVO3466(ALD6)的性能与GEVO3714和GEVO3715(ald6Δ)进行比较。在发酵过程中测量了葡萄糖消耗、异丁醇产生、异丁酸产生和OD600。对于这些发酵,将划线平板中的纯化菌株转移到含80mL YPD培养基的500mL带挡板摇瓶中,该YPD培养基含有1%v/v乙醇、100μM CuSO4.5H2O和0.2g/L G418,然后在轨道式震荡器中在30℃以250rpm孵育32h。然后将摇瓶培养物转移到各个2L顶驱马达发酵罐容器中,每个容器具有0.9L YPD培养基的工作体积,该培养基含有80g/L葡萄糖、1%v/v乙醇、100μM CuSO4.5H2O和0.2g/LG418,达到0.5的起始OD600。在基于氧传递速率(OTR)的2阶段有氧条件下,将发酵罐在30℃以及用6N KOH和2N H2SO4控制在pH 6.0下运行。最初,通过700rpm的固定搅拌速度以及5sL/h的空气覆盖将发酵罐以10mM/h的生长期OTR运行。让培养物生长24h以达到约9-10的OD600,然后立即通过将搅拌速度从700rpm降到450rpm持续24h至86.5h而切换到生产曝气OTR=2.0mM/h。定期地,取出各发酵罐中的样品,以测量OD600并准备用于异丁醇和其它代谢产物的气相色谱(GC1)分析以及有机酸和葡萄糖的高效液相色谱(LC1)分析。取2mL样品加到微量离心管,并在微量离心机中以最大rpm离心10分钟。如所述,将1mL上清液用于GC1和LC1分析。
在台式发酵罐发酵中缺失ALD6减少了异丁酸和乙酸的产生并提高了异丁醇的得率:86.5h台式发酵罐发酵结果汇总在表27中。ald6Δ菌株GEVO3714和GEVO3715与ALD6菌株GEVO3466相比产生的异丁酸少38%。ald6Δ菌株GEVO3714和GEVO3715与ALD6菌株GEVO3466相比产生的乙酸也少61%。ald6Δ菌株GEVO3714和GEVO3715的异丁醇得率比ALD6菌株GEVO3466高25%。ald6Δ菌株GEVO3714和GEVO3715的异丁醇滴度也比ALD6菌株GEVO3466高35%。
表27.通过缺失ALD6证实异丁酸和乙酸的产生减少而异丁醇得率升高的台式发酵罐发酵结果。
实施例5:酿酒酵母中ALD6活性的测定
以下实施例示出了在ald6Δ菌株中异丁醛氧化活性明显降低。
表28.实施例5中所公开的菌株的基因型。
将ALD6(YPL061W)基因从其缺失的酵母菌株GEVO3940及其亲本GEVO3527均一式三份地进行培养,方式是对于各菌株一式三份地接种14mL培养管中的3mLYPD培养基。对于GEVO3527,通过YPD琼脂平板上的贴片起始培养,并且对于GEVO3940,通过含0.2g/L G418的YPD琼脂平板上的贴片起始培养。将培养物在30℃下和以250rpm过夜孵育。第二天,测量过夜培养物的OD600,并计算接种50mL培养物达到0.1OD600所需的各培养物的体积。将各培养物计算得到的体积用于接种250mL带挡板摇瓶中的50mL YPD,并将培养物在30℃下并且以250rpm进行孵育。在生长7h后OD达1.6-2.1的对数中期收获细胞。将培养物转移到预称重的50mLFalcon管中,并且通过以3000×g离心5分钟收集细胞。移除培养基后,将细胞用10mL MilliQ H2O洗涤。除去水后,将细胞以3000×g再次离心5分钟,并使用1mL移液枪头小心除去剩余的水。将细胞沉淀称重,然后储存在-80℃,直到如所述将其裂解并测定异丁醛氧化活性。
如表29所示,GEVO3527裂解液中酿酒酵母ALD6氧化10mM异丁醛的比活性为13.9mU/mg。ALD6缺失的相同菌株具有0.6mU/mg的比活性,为其二十二分之一。GEVO3527裂解液中酿酒酵母ALD6氧化1.0mM异丁醛的比活性为17.6mU/mg。ALD6缺失的相同菌株具有2.1mU/mg的比活性,为其八分之一。GEVO3527裂解液中酿酒酵母ALD6氧化0.1mM异丁醛的比活性为6.7mU/mg。ALD6缺失的相同菌株具有1.3mU/mg的比活性,为其五分之一。这些数据表明,内源性ALD6酶负责酿酒酵母中异丁醇途径的异丁酸副产物。
表29.使用多种异丁醛浓度的菌株GEVO3527和GEVO3940的比异丁醛氧化活性。在得自GEVO3527和GEVO3940的3个平行培养物的裂解液中测量了比活性。所示为生物学重复培养物中测得的活性的平均值和标准偏差。
实施例6:酿酒酵母中ALD6基因的缺失以及改良醇脱氢酶的过表达进
一步减少了异丁酸的产生
以下实施例示出了ALD6缺失以及具有改进动力学性质的ADH的过表达两者相结合导致异丁酸的产生进一步减少以及异丁醇的产生进一步增加。
异丁酸是酵母中异丁醛代谢的副产物,并可构成碳得率的重要部分。构建了以下酵母菌株:GEVO3466通过用2μ质粒pGV2247转化菌株GEVO3198而构建,该质粒携带编码以下酶的基因:KARI、DHAD、KIVD和野生型ADH(分别为Ec_ilvC_coScP2D1-A1、Ll_ilvD_coSc、Ll_kivD2_coEc和Ll_adhA)。GEVO3198从其染色体DNA表达醇脱氢酶(乳酸乳球菌ADH,Ll_adhA)的单拷贝。第二菌株(其生物学重复称为GEVO3714和GEVO3715)通过用2μ质粒pGV2247转化两个独立的菌株GEVO3711和GEVO3712而构建,该质粒携带编码以下酶的基因:KARI、DHAD、KIVD和野生型ADH(分别为Ec_ilvC_coScP2D1-A1、Ll_ilvD_coSc、Ll_kivD2_coEc和Ll_adhA)。GEVO3711和3712表达单一醇脱氢酶(乳酸乳球菌ADH,LI_adhA)并从染色体DNA缺失ALD6基因。第三菌株(其生物学重复称为GEVO3855和GEVO3856)通过用2μ质粒pGV2602转化菌株GEVO3711而构建,该质粒携带编码以下酶的基因:KARI、DHAD、KIVD和突变ADH(分别为Ec_ilvC_coScP2D1-A1-his6、Ll_ilvD_coSc、Ll_kivD2_coEc和Ll_adhARE1)。
表30.实施例6中所公开的菌株的基因型。
表31.实施例6中所公开的质粒。
进行两组不同的发酵。进行A组发酵以将GEVO3466(LI_adhA)的性能与GEVO3714-GEVO3715(LI-adhA,ald6Δ)进行比较。进行B组发酵以分别将GEVO3714(LI adhA,ald6Δ)的性能与GEVO3855-GEVO3856(LI_adhARE1,ald6Δ)进行比较。在发酵过程中测量了葡萄糖消耗、异丁醇产生、异丁酸产生和OD600。对于这些发酵,将在YPD琼脂平板上生长的单个分离的细胞菌落转移到含有80mL YPD培养基的500mL带挡板摇瓶中,该YPD培养基含有1%v/v乙醇、100μM CuSO4.5H2O和0.2g/L G418,并在轨道式震荡器中在30℃下以250rpm孵育32h。然后将摇瓶培养物转移到单个2L顶驱马达发酵容器中,每个容器具有0.9L YPD培养基的工作体积,该培养基含有80g/L葡萄糖、1%v/v乙醇、100μM CuSO4.5H2O和0.2g/L G418,达到0.5的起始OD600。在基于氧传递速率(OTR)的2阶段有氧条件下,将发酵罐在30℃以及用6N KOH控制在pH 6.0下运行。在两个实验中,最初通过700rpm的固定搅拌以及5sL/h的空气覆盖使发酵罐以10mM/h的生长期OTR运行。让培养物生长24h达到约9-10的OD600,然后立即切换到生产曝气条件持续48.5h。在第一个实验中,通过将搅拌从700rpm降到425rpm来维持2.5–3.0mM/h的OTR,而在第二实验中,通过将搅拌从700rpm降到400rpm来维持2.0-2.5mM/h的OTR。定期地,取出每只发酵罐中的样品以测量OD600并准备用于气相色谱(GC1)和液相色谱(LC1)分析。对于GC1和LC1,取2mL样品加到Eppendorf管中,并在微量离心机中以最大速度离心10分钟。通过GC1分析1mL上清液(异丁醇、其它代谢产物),通过高效液相色谱(LC1)分析1mL中的有机酸和葡萄糖。
得自两组单独发酵A和B的72.5h数据汇总在表32和33中。A组发酵将GEVO3466(WT ADH)与GEVO3714和3715(WT ADH,ald6Δ)进行比较,而B组发酵将GEVO3714(WT ADH,ald6Δ)与GEVO3855和3856(Ll_adhARE1,ald6Δ)进行比较。
关于A组发酵的数据(表32)表明,携带Ll_adhA且ALD6基因缺失的菌株中异丁醇滴度和理论得率与携带LI_adhA且未缺失ALD6基因的菌株相比分别为1.4和1.3倍高。携带LI_adhA且未缺失ALD6基因的菌株(GEVO3466)具有0.040g/g的异丁酸得率(产生的异丁酸克数/消耗的葡萄糖克数),而携带LI_adhA且ALD6基因缺失的菌株(GEVO3714,GEVO3715)具有0.017g/g的较低异丁酸得率。携带乳酸乳球菌adhA且未缺失ALD6基因的菌株产生了2.3g/L的乙酸,而携带乳酸乳球菌adhA且ALD6基因缺失的菌株产生了0.6g/L的乙酸。
表32.A组发酵的数据。
关于B组发酵的数据(表33)表明,携带乳酸乳球菌adhARE1且ALD6基因缺失的菌株中异丁醇滴度和理论得率与携带乳酸乳球菌adhA且ALD6基因缺失的菌株相比分别为1.2和1.1倍高。与具有0.014g/g的较高异丁酸得率和0.0g/L相似乙酸滴度的携带酸乳球菌adhA且ALD6基因缺失的菌株(GEVO3714)相比,携带乳酸乳球菌adhARE1且ALD6基因缺失的菌株(GEVO3855,GEVO3856)具有最低的异丁酸得率(产生的异丁酸克数/消耗的葡萄糖克数)0.005g/g并产生了0.0g/L乙酸(表33)。
表33.B组发酵的数据。
实施例7:作为异丁醇发酵副产物的DH2MB的鉴定
在产生异丁醇酵母菌株的发酵过程中,据发现,在方法LC1中与2,3-二羟基异戊酸(DHIV)共洗脱并在此基础上定量的未知峰充当被利用的大部分碳的“库”(sink)。
最初,据信,该峰仅为2,3-二羟基异戊酸(DHIV),但是后续研究表明,KARI产物抑制将会在这些DHIV水平发生,使得此类浓度不可能存在。附加的实验表明,此回收的峰在酶测定中不与DHAD反应,因而消除了显著量DHIV存在的可能性。
高效液相色谱LC1:在配有两根串联Rezex RFQ-Fast FruitH+(8%)150×4.6mm柱(Phenomenex)的Agilent-1200高效液相色谱系统上进行了有机酸代谢产物的分析。使用Agilent 1100紫外检测器(210nm)和折射率(RI)检测器检测有机酸代谢产物。柱温为60℃。该方法为等度方法,以0.0128N H2SO4(溶于Milli-Q水的25%0.0512N H2SO4)作为流动相。流速设为1.1mL/min。进样体积为20μL,运行时间为16分钟。
高效液相色谱LC3:对于包含最多的10mM醛、酮和酮酸中间体(组合)的样品,将DNPH试剂按1:1比率加入各样品中。将100μL DNPH试剂(12mM 2,4-二硝基苯肼、20mM柠檬酸(pH 3.0)、80%乙腈、20%MilliQH2O)加到100μL的各样品中。将样品在70℃的热循环仪(Eppendorf,Mastercycler)中孵育30分钟。在配有Eclipse XDB C-18 150×4mm;5μm粒度反相色谱柱(Agilent)和C-18反相保护柱(Phenomenex)的Agilent-1200高效液相色谱系统上进行乙偶姻、二乙酰、酮异戊酸和异丁醛的分析。使用Agilent-1100紫外检测器(360nm)检测所有分析物。柱温为50℃。该方法为等度方法,以60%乙腈、2.5%磷酸(0.4%)、37.5%水作为流动相。流速设为2mL/min。进样体积为10μL,并且运行时间为10分钟。
高效液相色谱LC4:在配有IonPac AS11-HC分析柱、IonPac AG11-HC保护柱(3-4mm,用于IonPac ATC柱,Dionex)或等同柱以及IonPac ATC-1Anion Trap柱或等同柱的Agilent-1100高效液相色谱系统上进行了氧代酸的分析。使用电导率检测器检测氧代酸(ED50-抑制电导,抑制类型:ASRS 4mm的自动抑制循环模式,抑制电流:300mA)。柱温为35℃。此方法使用以下洗脱图:在0.25mM保持3分钟;在第25分钟线性梯度到5mM;在第25.1分钟线性梯度到38.5mM,以38.5mM保持4.9分钟;在第30.1分钟线性梯度到0.25mM;保持7分钟至平衡。流速设为2mL/min。进样体积为5μL,并且运行时间为37.1分钟。
GC-MS:配有单重四极杆320MS的Varian 3800CP GC系统;DB-5ms色谱柱;1079进样口(250℃);恒定流速1.0mL/min(100分流比);柱温箱温度曲线:初始温度40℃,保持5分钟,以20℃/min升温至最高235℃并保持2分钟;递送0.5μL样品的combiPAL自动进样器;35至100的收集质量。BSTFA衍生化:(1)在GC小瓶中将样品在氮气下蒸发至干燥;(2)将0.5mL乙腈和0.5mL BSTFA试剂加入;(3)在50℃孵育30分钟;(4)进样到GC-MS。
LC-MS:对于LC1峰馏分的LC-MS分析,将样品注入到配有多波长检测器和LC/MSD Trap质谱仪(离子阱)的Agilent 1100系列高效液相色谱(HPLC)系统。通过质谱仪监测分离物,以提供对样品组分的鉴定。对于进样,将质谱仪以大气压力化学电离(APCI)模式运行。使用正和负APCI模式进行分析。仅在负电离模式中观察到了“未知峰”检测。使用MSn进行分析以获得样品分析物的碎片数据。使用具有5μm粒子的4.6×150mm Agilent ZorbaxSB C-18色谱柱实现了分离。使用等度方法运行样品,该方法使用90%HPLC水和10%甲醇的洗脱液。对于样品溶液的分析,使用10μL的进样量。还旁通色谱柱分析了样品。
DHIV及其异构体DH2MB在LC1中以相同的保留时间洗脱。与这些化合物相关的峰与发酵样品中的其它峰分离。通过HPLC采集峰,并用于进一步的分析。
在LC1中DHIV(和DH2MB)所见的RI检测器信号与UV检测器信号的信号比为普通的有机酸(例如乳酸、乙酸等)所特有;共轭酸(例如,丙酮酸)具有非常不同的RI/UV信号比。回收的“峰DHIV”具有非共轭酸的特征:
比率(RI/UV):回收的DHIV/DH2MB峰(130);DHIV标准品(150);丙酮酸(14)。
通过从LC1回收的峰馏分与DNPH之间完全不反应,确认了“神秘峰”中不含羰基部分:在LC3色谱系统中无明显的加合物峰。
然后通过方法LC4分析了从LC1回收的峰馏分,该方法在碱性条件下运行,并且能够分离DHIV和乙酰乳酸。该结果与标准混合物的叠加图一起示于图9中。其清楚地表明DH2MB(随后得到鉴定)与DHIV之间的分离。在DH2MB峰的收集中,也一起带入了一些丙酮酸。
NMR分析:将从方法LC1中回收的样品峰进行中和并冻干,然后送去进行NMR分析。通过1H-COSY NMR进行的2-D相关性分析(图10)以及质子NMR光谱(图11)得出了良好的结果。
与DHIV一起洗脱的“神秘峰”的2-D分析(图10):向低场迁移的一个甲基未被任何相邻的质子分裂,其中0.95ppm的甲基被邻近羟基的一个质子分裂成双峰。该质子继而被相邻的甲基分裂成四重峰。3.1和3.7ppm之间的复杂模式表明在“DHIV”的峰采集中一起携带了葡萄糖的不同异头物。
在下面的光谱图(图11)中示出了NMR峰的分配,清楚地表明“神秘峰”的身份为2,3-二羟基-2-丁酸(DH2MB)。
1H NMR和COSY光谱支持2,3-二羟基-2-甲基丁酸的存在,这是二羟基异戊酸的结构异构体。这些光谱中的其它信号支持异头蛋白质并因此支持糖组分的存在。此外,3.1-3.8ppm之间信号的复杂分分组通常为低聚糖所见。13C NMR光谱非常弱,并似乎为基于落在基线之下的45ppm处信号的质子连接实验(APT)。
还对LC1峰馏分进行了LC-MS。LC-MS足以证实该化合物具有134的质量(DHIV和DH2MB两者)(图12)。
该分最后地鉴定出未知副产物为2,3-二羟基-2-甲基丁酸(CAS#14868-24-7)。该化合物以4种不同的立体异构形式存在。2,3-二羟基-2-甲基丁酸作为一组顺反式非对映体存在,其每一者又作为一组对映体存在。这四种化合物示于图13中。
如本文所述,DH2MB衍生自(2S)-2-羟基-2-甲基-3-氧代丁酸(乙酰乳酸)。该反应的产物会是(2S,3R)-2,3-二羟基-2-甲基丁酸、(2S,3S)-2,3-二羟基-2-甲基丁酸或两种非对映体的混合物,具体取决于催化该转化的内源性酶的立体选择性。
实施例8:DH2MB的产生和纯化
本实施例的目的是说明如何产生并纯化DH2MB。
将含有表达质粒pGV2247(用于表达Ec_ilvC_P2D1-A1、Ll_ilvD、Ll_kivD2和L1_adhA的2微米G418抗性质粒)的ALS活性的工程化酿酒酵母CEN.PK2菌株(GEVO3160,酿酒酵母CEN.PK2:MATa ura3 leu2 his3trp1 gpd1Δ::PCCW12:Hph gpd2Δ::TK1_URA3_short:PFBA1:Kl_URA3:TK1_URA3pdc1Δ::PCUP1:Bs_alsS_coSc:TCYC1:PPGK1:Ll_kivD:PENO2_Sp_HIS5pdc5Δ::LEU2:bla:PTEF1:ILV3ΔN:PTDH3:ilvC_coSc_Q110V pdc6Δ::PTEF1:Ll_ilvD_PTDH3:Ec_ilvC_coSc_P2D1-A1:PENO2:Ll_adhA:PFBA1:Sc_TRP1{向C2补充剂非依赖性、葡萄糖耐性和更快生长进化})用于在分批发酵中产生10g/L DH2MB,该发酵使用2L顶驱马达DasGip容器,其充有1L培养基(10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨、80g/L葡萄糖、1%v/v乙醇、100μMCuSO45H2O、0.2g/L G418),在30℃、pH6.0和约10mmol/h的OTR下进行。
将无细胞的发酵液用浓H2SO4酸化到pH 2。使用Büchi Rotovapor R-215将酸化的发酵液减压(0-100毫巴)下浓缩到350mL。在蒸发期间,将容纳发酵液的摇瓶在水浴中加热到20-30℃。将70mL体积的MeOH加到浓缩的发酵液中,并将混合物转移到500mL的液-液萃取器(Sigma-Aldrich cat.#Z562432),其根据制造商规范进行设置以用于通过乙酸乙酯(EtOAc)连续萃取。每天用新鲜EtOAc替换EtOAc萃取物,进行3天的连续萃取。
萃取后,将前两批EtOAc中的DH2MB萃取物合并,用无水MgSO4干燥,然后过滤。将干萃取物在真空下浓缩到500mL,并在室温下通过搅拌用3g活性炭(Fluka cat#05105)处理30分钟。将脱色的溶液过滤,并在真空下浓缩到大约50mL(0-100毫巴,使用Büchi Rotovapor R-215)。将溶液在4℃孵育两天。过滤所得的晶体,并用冰冷的乙醚和丙酮洗涤。使用冻干机将晶体在减压(0.05毫巴)下干燥1天。
通过1H(图14)和13C(图15)NMR分析了分离的DH2MB。1H NMR(TSP)1.1(d,6.5Hz,3H),1.3(s,3H),3.9(q,6.5Hz,3H)。13C光谱表明样品中存在五个不同的碳原子。在181ppm下的共振表明样品中存在羧酸碳。总之,基于NMR光谱,可以估计分离的DH2MB的纯度为99%。
实施例9:在发酵中DH2MB的产生对异丁醇得率的影响
本实施例的目的是展示在包含ALS和TMA29活性的酵母菌株中DH2MB蓄积到显著的水平。
本实施例中公开的菌株和质粒分别示于表34和35中。
表34.酿酒酵母菌株GEVO3160的基因型。
表35.质粒pGV2247的基因型。
如所述,将酿酒酵母菌株GEVO3160用pGV2247转化。进行了发酵以表征转化的菌株。将在含有0.2g/L G418的YPD琼脂平板上生长的单个分离的细胞菌落转移到5mL YPD培养基,该培养基含有80g/L葡萄糖、1%v/v乙醇、100μM CuSO4.5H2O和0.2g/L G418,并且在30℃、250rpm孵育24h。接下来,将此培养物转移到500mL带挡板的摇瓶中,其包含80mL的相同培养基,然后在轨道式震荡器中以250rpm在30℃孵育24h。将摇瓶培养物转移到2L顶驱马达发酵罐容器中,其具有0.9L相同培养基的工作体积,以达到0.5的起始OD600。在基于氧传递速率(OTR)的2阶段有氧条件下,使发酵罐在30℃以及用6N KOH控制在pH 6.0下运行。在两实验中,最初通过700rpm的固定搅拌速度以及5sL/h的空气覆盖使发酵罐以10mM/h的生长期OTR运行。让培养物生长约20h达到约8的OD600,然后立即切换到生产曝气。通过将搅拌从700rpm降至350rpm,维持1mM/h的OTR。接种后93h,通过将搅拌从350rpm降至180rpm,将各菌株的一个重复容器进一步降低到OTR=0.3。定期地,取出各发酵罐中的样品以测量OD600并准备用于气相色谱(GC1)和液相色谱(LC1)分析。对于GC1和LC1,取2mL样品加到Eppendorf管中,在微量离心机中以最大速度离心10分钟。通过GC1分析1mL上清液(异丁醇、其它代谢产物),通过高效液相色谱(LC1)分析1mL中的有机酸和葡萄糖。
图16示出用pGV2247转化的酿酒酵母GEVO3160的产物和副产物曲线。这些曲线是产生异丁醇Pdc-负型、Gpd-负型酵母菌株的代表性曲线。Pdc-负型/Gpd-负型酵母生产菌株在共同拥有和共同未决的专利公开US2009/0226991和US 2011/0020889中有所描述,它们均全文以引用方式并入本文以用于所有目的。图16显示了异丁醇(13.9g/L)和未知化合物(定量为“DHIV”,并且现在鉴定为DH2MB)(8.4g/L)是微氧生产OTR过程中产生的主要产物。假定使用DHIV的响应因子进行的定量导致DH2MB的准确定量,则消耗的碳的约12-13%转向DH2MB的产生。如果转化成DH2MB的乙酰乳酸相反被转化成异丁醇,则在图16所示的发酵的整个时间中异丁醇的得率会明显更高。
实施例10:ALS表达为DH2MB产生所必需
本实施例的目的是展示外源表达的ALS活性为酿酒酵母中DH2MB的蓄积所必需。
进行该实验以确定ALS是否为DH2MB的产生所必需。用于该实验的菌株为GEVO1187(酿酒酵母CEN.PK2;MATa ura3-52 leu2-3_112 his3Δ1trp1-289 ADE2)和GEVO2280(酿酒酵母CEN.PK2;MATa ura3 leu2 his3trp1 ADE2 pdc1Δ::PCUP1-1:Bs_alsS2:TRP1)。在发酵前,如所述,将两种菌株均用2微米质粒pGV2082(PTDH3:Ec_ilvC_coScQ110V、PTEF1:Ll_ilvD_coSc、PPGK1:Ll_kivD_coEc和PENO2:Dm_ADH,2μori,bla,G418R)转化。
为了测量ALS活性,制备了得自GEVO1187和GEVO2280的酵母细胞提取物。让细胞生长到约1的OD600,用1mM CuSO4诱导2小时,然后收获。为了准备用于测定的细胞,以2700×g进行离心收集50ml细胞。除去培养基后,将细胞重悬在无菌dH2O中,以2700×g离心,然后用1ml移液枪头小心除去剩余的培养基。将细胞沉淀称重(对空管预先称重),然后冷冻在-80℃直至使用。使用如下所述的SOP制备细胞裂解液。将细胞在冰上解冻,并重悬在裂解缓冲液(250mM KPO4(pH 7.5)、10mM MgCl2和1mMDTT)中使得结果为20质量%的细胞悬液。将体积为1000μl玻璃珠(0.5mm直径)加到1.5ml Eppendorf管中,然后加入875μl细胞悬液。使用RetschMM301混磨机(Retsch Inc.Newtown,PA)裂解酵母细胞,其中以全速混合6×1分钟,每次之间具有1分钟的冰冻步骤。将管在4℃以23,500×g离心10分钟,然后移除上清液。将提取物保持在冰上,直至进行测定。如所述,裂解液蛋白质浓度使用BioRad Bradford蛋白质测定试剂盒(Cat# 500-0006,BioRad Laboratories,Hercules,CA)并使用BSA用于标准曲线而测定。简而言之,对于每种裂解液,具有和不具有底物,所有ALS测定均一式三份进行。要测定各裂解液,将按1:2的比例用裂解缓冲液稀释的100μL裂解液与900μL缓冲液(50mM磷酸钠缓冲液(pH 6.0)、1mM MgSO4、1mM硫胺素焦磷酸盐、110mM丙酮酸)混合,然后在30℃孵育15分钟。在室温下配制缓冲液。也包括无底物对照(无丙酮酸的缓冲液)和无裂解液对照(裂解缓冲液代替裂解液)。孵育后,将各反应的175μL与25μL 35%H2SO4混合,并在37℃孵育30分钟。将样品提交分析部门进行LC1分析。使用该方法,据确定,野生型菌株GEVO1187无可检测的ALS活性,而ALS表达菌株GEVO2280具有0.65单位/mg裂解液的ALS活性。
将两种菌株(具有或不具有异源ALS整合表达构建体)的性能使用以下摇瓶发酵条件进行比较。将菌株贴片到含0.2mg/mL G418的YPD平板上。过夜生长后,用无菌牙签将细胞从平板取出,并重悬在4mL含0.2g/L G418的YPD中。测定各培养物的OD600。将细胞加到50mL含50g/L葡萄糖和0.2mg/mL G418的YPD中,使得获得0.1的最终OD600。为了诱导CUP1启动子驱动的ALS表达,将1mM硫酸铜在24小时时间点时加入。将未使用的培养基储存在4℃,以作为GC和LC的培养基空白,以及作为发酵的t=0样品。在t=24、48和72小时时,制备样品用于GC1分析,并且在72小时时,另外通过LC1分析样品。在24和48小时时,通过YSl分析各培养物上清液的1:10稀释液。如果需要50%,则将含0.2g/L G418的葡萄糖加入直到100g/L葡萄糖的最终浓度。在30℃和250RPM的震摇下进行发酵。
对于无ALS的WT菌株(BUD1187)以及表达PCUP1:Bs_alsS2 at PDC1的菌株(BUD2280)均使用LC1方法测定了摇瓶发酵72小时时达到的DH2MB滴度。将各菌株用4元件质粒pGV2082转化。如所述进行发酵。无外源ALS表达时,菌株未产生DH2MB,而具有ALS表达的菌株产生了高达1.4g/L的DH2MB+DHIV。
实施例11:只有ALS表达为DH2MB的产生所必需
本实施例的目的是展示仅ALS活性负责酿酒酵母中DH2MB的蓄积。
进行本实验以确定是单独的还是与KARI、DHAD、KIVD、ADH表达质粒相结合的ALS负责DH2MB的产生。本实验中所用的菌株为GEVO2618(MATa ura3 leu2 his3 trp1 pdc1Δ::[PCUP1:Bs_alsS1_coSc:TRP1)。本实验中测试的质粒为pGV2227,其包含其余的四个途径基因(-PTEF1:Ll_ilvD_coSc:PTDH3:Ec_ilvC_coScQ110V:PSc_TPI1:G418:PPGK1:Ll_kivD2_coEc:PDC1-3’区:PENO2:Ll_adhA 2μbla,pUC-ori);以及pGV2020,其为空载体对照(PSc_TEF1,PSc_TPI1,G418R,APr,2μ)。
将用pGV2020转化的GEVO2618以及用pGV2227转化的GEVO2618的摇瓶培养物在含有200mM MES(pH6.5)和0.4g/L G418的YPD(15%葡萄糖)中以OD600约为0.1起始,并在培养摇床中以30℃和75rpm运行。在24h和48h采集样品,并且通过HPLC(LC1)和GC(GC1)分析样品的代谢产物水平。48小时后,两菌株均将培养基中的所有葡萄糖消耗完。含空载体的菌株(GEVO2618+pGV2020)产生了4.6g/L DHIV+DH2MB,代表了3.8%的得率。含表达另外四个途径基因的载体的菌株(GEVO2618+pGV2227)产生了5.6g/L DHIV+DH2MB的类似滴度,代表了3.1%的得率。
实施例12:增强的KARI活性对DH2MB的产生的影响
本实施例的目的是展示增强的KARI活性导致含ALS活性的酵母中DH2MB的产生减少。
本实施例中公开的菌株和质粒分别示于表36和37中。
表36.实施例12中所公开的菌株的基因型。
表37.实施例12中所公开的质粒。
如所述,将酿酒酵母菌株GEVO2843用2μ质粒pGV2377、pGV2466、pGV2398和pGV2400转化,以确定野生型或工程化KARI的表达是否导致更多的DH2MB蓄积。
将使用2μ质粒(pGV2377、2466、2398、2400)转化的GEVO2843的预培养物在含1%乙醇和0.2g/L G418的YPD中起始,然后在30℃和250rpm过夜孵育。将这些预培养物用于接种带挡板摇瓶中的50mL相同培养基,并在30℃和250rpm孵育,直到达到约5的OD600。将它们在50mL Falcon管中以2700rcf在25℃沉降5分钟。接下来,将各50mL培养物中的细胞重悬在50mL含8%葡萄糖、1%(v/v)乙醇、麦角固醇、Tween-80、0.2g/L G418和200mM MES pH6.5的YPD中。将培养物加到250mL无挡板的摇瓶中,然后置于30℃和75rpm的摇床中。72h后采集样品以测定OD600并通过GC1和LC1分析发酵液的细胞外代谢产物。
表38显示了用pGV2377转化的菌株(不通过质粒过表达任何KARI基因)产生了15%的组合DH2MB+DHIV最高碳得率,而具有pGV2466(含Ec_ilvC_coSchis6)、pGV2398(含Ec_ilvC_coScQ110V-his6)和pGV2400(含Ec_ilvC_coScP2D1-A1-his6)的菌株具有8-10%的类似组合DH2MB+DHIV碳得率。同样,用pGV2377转化的菌株以6%的最低碳得率产生异丁醇。在质粒上包含KARI基因的其余菌株以较高的碳得率产生异丁醇。对减少的DH2MB产生与增加的异丁醇产生相关的观察结果与DH2MB通过不涉及KARI的反应由乙酰乳酸产生的发现相符。
表38.异丁醇和组合DH2MB+DHIV碳得率
进行第二实验,其中菌株未从质粒表达KARI、表达低水平的KARI或表达高水平的KARI。在该实验中,测量了细胞裂解液的KARI活性。
用表37所述的质粒组合如所述转化酿酒酵母菌株GEVO2843;无KARI菌株含有pGV2377+pGV2196并且无质粒携带的KARI,低KARI菌株含有pGV2377+pGV2406并且由低拷贝质粒表达KARI,而高KARI菌株含有pGV2398+pGV2196并由高拷贝质粒表达KARI。如所述进行发酵和取样。如所述进行GC1和LC1方法。将用于KARI测定的细胞如所述进行裂解,不同的是缓冲液为250mM KPO4(pH 7.5)、10mM MgCl2和1mM DTT。如所述测定裂解液的蛋白质浓度。
要测量体外KARI活性,通过将50μl乙基-2-乙酰氧基-2-甲基-乙酰乳酸与990μl水混合而制备乙酰乳酸底物。接下来,将10μl 2N NaOH按顺序加入,在加入之间涡旋混合15秒,直到加入了260μl NaOH。在室温下将乙酰乳酸搅拌20分钟,然后保持在冰上。在0.01N NaOH中制备NADPH达到50mM的浓度。通过在分光光度计中在340nm处读取稀释样品的OD并使用6.22M-1cm-1的摩尔消光系数以计算精确浓度,从而确定浓度。制备三种缓冲液并保持在冰上。反应缓冲液含有250mM KPO4(pH 7.5)、10mMMgCl2、1mM DTT、10mM乙酰乳酸和0.2mM NADPH。无底物缓冲液不含乙酰乳酸。无NADPH缓冲液不含NADPH。使用10μl细胞提取物与90μl反应缓冲液通过96孔板在SpectraMax 340PC多功能酶标仪(MolecularDevices,Sunnyvale,CA)中一式三份地进行反应。在30℃,通过在340nm测量动力学曲线5分钟跟踪反应,每10秒读取一次OD。在从完整缓冲液的读数中减去无底物对照的背景读数后,确定各提取物的Vmax。
表39显示了KARI活性的数据,以及异丁醇和组合DH2MB+DHIV的碳得率(以%表示)。随着KARI活性升高,异丁醇碳得率升高,而组合DH2MB+DHIV碳得率降低。
表39.KARI活性、异丁醇和组合DH2MB+DHIV碳得率。
*该数据仅含一个样品
实施例13:增强的DHAD活性的影响
本实施例的目的是展示增强的DHAD活性导致包含ALS活性的酵母中DH2MB的产生减少。
本实施例中公开的菌株和质粒分别示于表40和41中。
将GEVO2843用不同的质粒对转化。菌株A含有pGV2227+pGV2196。菌株B含有pGV2284+pGV2196。菌株C含有pGV2284+pGV2336。将具有三种2-质粒组合之一的BUD2843的单一转化体在含有潮霉素的YPD平板上进行单菌落纯化,并将贴片细胞用于接种3mL含1%乙醇(v/v)、0.2g/L G418和0.1g/L潮霉素的YPD。将培养物在使用前在30℃、250rpm孵育过夜,然后接种到3mL含1%乙醇(v/v)、0.2g/L G418和0.1g/L潮霉素的YPD。将这些培养物在30℃、250rpm过夜孵育。第二天,将培养物用于接种50ml含8%葡萄糖、200mM MES(pH6.5)、麦角固醇和Tween80的YPD,达到约0.1的OD600。将这些培养物在30℃、250rpm孵育过夜。第二天,将培养物在50mL的相同培养基中稀释达到约0.1的OD600。将培养物在30℃、250rpm孵育,并在孵育0、24、47、70和92小时后取出1.5mL样品。如所述制备样品用于GC和LC分析。92小时后,将其余的所有样品离心,并对沉淀称重,然后储存在-80℃。如所述,用由冷冻沉淀制得的裂解液进行DHAD测定。如所述进行LC1和GC1分析。
表40.实施例13中所公开的菌株的基因型。
表41.实施例13中所公开的质粒。
表42显示了DHAD活性、异丁醇得率以及组合DHIV+DH2MB得率。用pGV2284+pGV2196转化的菌株(无从质粒表达的DHAD)产生了19%的组合DH2MB+DHIV最高碳得率,以及9%的异丁醇最低碳得率。用pGV2227+pGV2196转化的菌株(从质粒最高表达DHAD)具有9%的组合DH2MB+DHIV最低碳得率,以及18%的异丁醇最高碳得率。用pGV2284+pGV2336转化的菌株(从质粒低拷贝表达DHAD)具有16%的组合DH2MB+DHIV中等碳得率,以及12%的异丁醇碳得率。
表42.发酵92小时时的DHAD活性、异丁醇和组合DH2MB+DHIV碳得率。
在第二实验中,如上所述将GEVO2843用不同的质粒对(表43)转化并在摇瓶发酵中评估。菌株D含有pGV2196+pGV2589。菌株E含有pGV2529+pGV2589。菌株F含有pGV2196+pGV2485。用pGV2196+pGV2589转化的菌株(无质粒携带的DHAD)产生了1.25g/L异丁醇和5.67g/LDH2MB+DHIV。具有由高拷贝质粒(pGV2196+pGV2485)表达的DHAD的菌株产生了2.74g/L异丁醇和3.71g/L DH2MB+DHIV,表明DHAD表达的增加导致DH2MB+DHIV蓄积减少。具有从低拷贝质粒(pGV2529+pGV2485)表达的DHAD的菌株产生了中等水平的两种代谢产物,与中等水平的DHAD活性相符。
表43.实施例13中所公开的附加质粒。
表44.发酵72小时的DHAD活性、异丁醇滴度和得率以及组合DH2MB+DHIV滴度。
实施例14:通过靶向缺失使酿酒酵母缺失TMA29
以下实施例示出了从酿酒酵母基因组中缺失TMA29基因在过表达乙酰乳酸合酶时消除DH2MB的产生。
在酿酒酵母基因组中鉴定了可催化DH2MB产生的多种候选还原酶,包括TMA29基因产物。使用URA3标记物的整合,使编码这些还原酶的基因在酿酒酵母菌株GEVO2618中缺失,这是一种已知产生g/L量级DH2MB的菌株。用这些菌株进行了发酵,以确定缺失任何候选基因(包括TMA29)是否减少或消除了DH2MB的产生。
菌株、质粒和引物序列分别列于表45、46和47。
表45.实施例14中所公开的菌株的基因型。
表46.实施例14中所公开的质粒。
质粒名称 | 基因型 |
pGV1299 | Kl_URA3,bla,pUC-ori. |
pGV2129 | Kl_URA3-5’,bla. |
表47.实施例14中所公开的寡核苷酸序列。
菌株构建:通过用二分整(bipartite integration)SOE PCR产物转化GEVO2618而构建酿酒酵母菌株GEVO3638、GEVO3639和GEVO3640以用URA3标记物替代TMA29。使用与URA3片段同源的20bp序列来设计扩增还原酶基因5’和3’靶向序列的引物。这样做使得SOE PCR能用于创建含有URA3标记物以及所关注还原酶基因的侧翼同源区的片段。在Eppendorf(Cat# 71086,Novagen,Madison WI)上进行PCR。对用于产生SOE PCR片段的引物组采用了以下PCR程序:94℃持续2分钟,然后30个循环(94℃30sec,53℃30sec,72℃1.5min),然后72℃持续10分钟。将以下引物对和模板用于SOE反应的第一步。
为了产生5’URA3片段,使用pGV2129作为模板将oGV2232和oGV2862用于扩增5’URA3片段。将1364bp片段通过凝胶电泳进行纯化。为了产生3’URA3片段,使用pGV1299作为模板将oGV2231和oGV893用于扩增3’URA3片段。将1115bp片段通过凝胶电泳进行纯化。
为了产生5’TMA29片段,使用酿酒酵母S288c基因组DNA作为模板将oGV2867和oGV2891用于扩增5’TMA29片段。酿酒酵母S288c菌株购自ATCC(ATCC#204508)。将412bp片段通过凝胶电泳进行纯化。为了产生3’TMA29片段,使用酿酒酵母S288c基因组DNA作为模板将oGV2869和oGV2870用于扩增3’TMA29片段。将305bp片段通过凝胶电泳进行纯化。
将以下引物对和模板用于产生SOE PCR产物。为了产生5’TMA29 SOEPCR产物,使用了oGV2232和oGV2867。将5’URA3片段和5’TMA29片段用作模板。为了产生3’TMA29 SOE PCR产物,使用了oGV2231和oGV2870。将3’URA3片段和3’TMA29片段用作模板。
如所述,用二分整合SOE PCR产物对酿酒酵母菌株GEVO2618进行转化。转化后,将细胞通过离心进行收集(18,000×g,10秒,25℃)然后重悬在400μL SCD-HLWU培养基中。通过将转化细胞接种到SCD-Ura琼脂培养基上对整合转化体进行选择。一旦将转化体进行单菌落纯化后,即将其维持在SCD-Ura平板上。
使用菌落PCR确认正确的整合。为了筛选正确的5’-末端,使用URA3:TMA29 5’接点引物oGV2915和oGV2902给出991bp的预期条带。为了筛选正确的3’-末端,使用URA3:TMA29 3’接点引物oGV2904和oGV2916给出933bp的预期条带。为了筛选TMA29基因的缺失,使用了引物oGV2913和oGV2914,预期如果CDS缺失将不存在288bp。
发酵:使用tma29Δ菌株GEVO3638、GEVO3639和GEVO3640以及亲本TMA29菌株GEVO2618进行发酵。在30℃和250rpm的震摇下在YPD中起始培养。繁殖四代后,测定各培养物的OD600。将细胞加到含15%葡萄糖的50mL YPD,使得获得0.05的最终OD600。在t=24h时,取出2mL培养基,将25μL按1:40稀释使用以测定OD600。将剩余的培养物以最大速度在微量离心机中离心10分钟,取出1mL上清液,并提交用于LC1和LC4分析。在t=48h时,取出2mL培养基,并将25μL按1:40稀释使用以测定OD600。将1mL上清液提交用于LC1分析。此外,通过以2700×g离心收集14mL。除去培养基后,将细胞重悬在无菌dH2O中,以2700×g离心,并且然后用1mL移液枪头将剩余的培养基小心除去。对细胞沉淀称重(对空管预先称重)然后冷冻在-80℃,直到解冻用于如所述的ALS测定。
DH2MB的产生取决于异源ALS表达,例如Bs_alsS1_coSc基因。如所述测量了细胞裂解液的ALS活性以证实TMA29缺失对ALS表达和/或活性无影响。来自携带TMA29缺失的菌株的提取物的ALS活性不低于而是略高于来自亲本菌株的提取物的活性。24h(对于ALS活性为48h)时的结果汇总在表48中,并清楚地表明在TMA29缺失的菌株中不产生DH2MB。LC4分析确认了GEVO3527未产生DHIV。
表48.TMA29缺失菌株中DH2MB的产生。
实施例15:通过缺失文库使酿酒酵母中的TMA29缺失
以下实施例示出了从酿酒酵母基因组缺失TMA29基因在过表达乙酰乳酸合酶时消除了DH2MB的产生。
菌株、ORF缺失和质粒在表49、50和51中列出。
表49.实施例15中所公开的菌株的基因型。
表50.实施例15中所公开的ORF缺失。
表51.实施例15中所公开的质粒。
质粒 | 相关基因 |
pGV2435 | PScCUP1:Bs_alsS1_coSc:PScTPI1:hph:TScCYC1,CEN/ARS,bla,pUC-ori |
将每个菌株具有一个缺失的基因/ORF的酿酒酵母菌株商业文库用于筛选可能催化DH2MB的产生的缺失。选择了含有TMA29(即YMR226C)ORF缺失的候选菌株。由于外源ALS表达为DH2MB的产生所必需,因此如所述将含有由CUP1启动子驱动的Bs_alsS1_coSc基因的CEN质粒(pGV2435)转化进菌株。在30℃、250rpm过夜复苏转化体,然后接种到含有0.2g/L潮霉素的YPD平板上。然后将转化体贴片到含有0.2g/L潮霉素的YPD平板上,并在30℃孵育。
用这些菌株进行了发酵以确定缺失TMA29(YMR226C)是否减少或消除了DH2MB的产生。将各菌株三个独立的转化体用于接种发酵预培养物,其在30℃和250rpm的含0.2g/L潮霉素的YPD中过夜生长至饱和。第二天,测量预培养物的OD600,并且计算对于各培养物需要接种50mL培养物达到0.1OD600所需的过夜培养物体积。用计算量的过夜培养物接种250mL不带挡板摇瓶中的50mL含有150g/L葡萄糖、200mM MES(pH 6.5)和0.2g/L潮霉素的YPD。将细胞在轨道式震荡器中在30℃和75rpm孵育。在24h时,通过向各摇瓶添加8.8mL 50%的葡萄糖溶液而向所有培养物加料另外75g/L的葡萄糖,然后回到30℃和75rpm的孵育。在72h时,从各摇瓶中取样1.5mL(在两根Eppendorf管之间分成750μL)。测量各培养物(按1:40稀释在H2O中)的OD600。通过在微量离心机中以≥14000×g离心10分钟从样品中除去细胞。收集样品的上清液,并储存在4℃直至通过LC1进行分析,并将细胞沉淀储存在-80℃,直至解冻用于如所述的ALS测定。
在两菌株之间的生长存在某些变化,在72h时,对于GEVO3527,OD600值为13.7,对于TMA29缺失菌株为15.7(表52)。到72h时,菌株消耗了约223g/L的相同量的葡萄糖(表52)。到72h时,GEVO3527产生了2.8g/L的DH2MB。YMR226C缺失菌株(tma29Δ)未产生可检测水平的DH2MB。GEVO3527的比DH2MB滴度为0.2g/L/OD;YMR226C缺失菌株(tma29Δ)未产生可检测水平的DH2MB。LC4分析确认了GEVO3527未产生DHIV。
表52.72h时的细胞生长、消耗的葡萄糖和DH2MB的产生。
实施例16:在酿酒酵母中通过缺失TMA29基因改善了异丁醇速率、得
率和滴度
以下实施例示出了酿酒酵母基因组中TMA29基因的缺失导致所需产物-异丁醇的生产率、得率和滴度升高。此外,其还导致DH2MB生产率、得率和滴度降低。
DH2MB为酵母中乙酰乳酸代谢的副产物。在异丁醇发酵中,DH2MB可占碳得率的10%或更高。具有野生型TMA29的菌株在表达的乙酰乳酸合酶(ALS)(由Bs_alsS1_coSc(SEQ ID NO:23)编码)存在下产生DH2MB。TMA29缺失的菌株在表达的Bs_alsS1_coSc存在下未产生DH2MB。使缺失所有PDC和GPD基因的从染色体表达ALS(Bs_alsS1_coSc)的酵母菌株缺失TMA29,并用高拷贝四元件异丁醇途径质粒pGV2550转化,该质粒具有DHAD(Ll_ilvD_coSc)、KARI(Ec_ilvC_coScP2D1-A1-his6)、KIVD(Ll_kivD2_coEc)和ADH(Ll_adhA_coScRE1-his6)的基因。在摇瓶发酵和发酵罐两者中,将该菌株的异丁醇滴度、得率和生产率与未缺失TMA29基因的亲本菌株进行比较。菌株和质粒分别列于表53和54中。
表53.实施例16中所公开的菌株的基因型。
表54.实施例16中所公开的质粒。
酵母菌株构建:如所述,通过用实施例14中所述的二分整合SOE PCR产物转化GEVO3351而构建GEVO3663,以将TMA29用URA3标记物替代,不同的是,在转化后,将细胞重悬在350μL SCD-Ura培养基中,然后平铺到SCD-Ura平板上。
酿酒酵母菌株GEVO3690、GEVO3691和GEVO3692通过用质粒pGV2550转化GEVO3351而构建。酿酒酵母菌株GEVO3694、GEVO3695和GEVO3697通过用质粒pGV2250转化GEVO3663而构建。简而言之,通过从新平板上将细胞移入100μL 100mM乙酸锂而制备感受态细胞。将细胞悬液在室温孵育30分钟。如所述,转化质粒DNA。转化后,将细胞重悬在含有1%乙醇的400μL YPD中,并以250rpm震摇下在30℃孵育6h。然后将细胞平铺到含0.2g/L G418的YPD平板上。将转化体单菌落纯化到含有0.2g/L G418的YPD平板上。一旦将转化体单菌落纯化后,即将它们维持在含0.2g/L G418的YPD平板上。
发酵:进行摇瓶发酵,以将GEVO3690-GEVO3692(TMA29)的性能与GEVO3694-GEVO3695和GEVO3697(tma29Δ)进行比较。使培养物(3mL)在含有1%乙醇和0.2g/L G418的YPD中起始,然后在30℃和250rpm过夜孵育。大约20h后测量这些培养物的OD600。将适量的各培养物用于接种250mL带挡板摇瓶中50mL含有1%乙醇和0.2g/L G418的YPD,达到约0.1的OD600。将这些预培养物在30℃和250rpm孵育过夜。当培养物达到约5的OD600时,将它们在50mL Falcon管中于25℃以2700rcf离心5分钟。将各50mL培养物中的细胞如所述重悬在50mL发酵培养基中。然后将培养物转移到250mL无挡板的带小通气口的螺旋盖摇瓶中,并在30℃和75rpm孵育。24和48h后,取出各摇瓶中的样品,以测量OD600并准备用于GC1分析。对于GC1,取2mL样品加到Eppendorf管中,在微量离心机中以最大速度离心10分钟。将1mL上清液通过GC1分析。在72h时,使用相同的程序收集细胞以用于OD600测量和GC分析,并且此外,通过高效液相色谱(LC1)分析样品的有机酸(包DH2MB和DHIV)以及葡萄糖。
72h时的结果汇总在表55中。TMA29基因缺失时异丁醇滴度、得率和速率升高,而DH2MB的产生减少。
表55.72h时异丁醇滴度、得率和速率增加。
此外,还在发酵罐容器进行的发酵中将GEVO3690-GEVO3691(TMA29)的性能与GEVO3694-GEVO3696(tma29Δ)进行了比较。接种的培养物转移到500mL带挡板的摇瓶中,其含有80mL YPD培养基,该培养基含有20g/L葡萄糖、1%v/v乙醇、100μM CuSO4.5H2O和0.2g/L G418,并然后将其在轨道式震荡器中以250rpm在30℃孵育34.5h。将摇瓶培养物转移到各个2L顶驱马达发酵罐容器中,其工作体积为1.2L,含有80mLYP培养基,该培养基含20g/L葡萄糖、1%v/v乙醇、100μM CuSO4.5H2O和0.2g/L G418,以达到0.2的起始OD600。在两阶段有氧发酵中,将发酵罐在30℃和用6NKOH控制在pH 6的条件下运行。最初通过850rpm的固定搅拌速度以及5sL/h的空气覆盖将发酵罐以10mM/h的生长期氧气传递速率(OTR)运行。让培养物生长31h达到约6-7的OD600,然后立即通过将搅拌速度从850rpm降到300rpm切换到0.5mM/h的生产曝气OTR,以进行剩余的111h发酵。定期地,将各发酵罐中的样品取出以测量OD600并准备用于气相色谱(GC1)分析。对于GC,取2mL样品加到Eppendorf管中,并在微量离心机中以最大速度离心10分钟。将1mL上清液通过GC1分析(异丁醇、其它代谢产物)。在72h时,使用相同的程序收集细胞以用于OD600测量和GC分析,并且此外,通过高效液相色谱(LC1)分析样品的有机酸和葡萄糖。
111h时的结果汇总在表56中。TMA29基因缺失时异丁醇滴度、得率和速率升高。DH2MB的产生降低到不可检测的水平。
表56.111h时异丁醇滴度、得率和速率增加。
a葡萄糖、异丁醇和DH2MB滴度为最终滴度,即发酵111h时。
b异丁醇得率和速率只基于生产期计算而得,即从发酵31至111h。
实施例17:酿酒酵母中TMA29活性的测定
以下实施例示出了(S)-2-乙酰乳酸还原活性在tma29Δ菌株中显著降低。
表57.实施例17中所公开的菌株的基因型。
将TMA29(YMR226C)基因从其缺失的酵母菌株GEVO3939及其亲本GEVO3527均一式三份地进行培养,方法是对于各菌株一式三份地接种14mL培养管中的3mLYPD培养基。对于GEVO3527,通过YPD琼脂平板上的贴片起始培养,对于GEVO3939和GEVO3940,通过含有0.2g/L G418的YPD琼脂平板上的贴片起始培养。将培养物在30℃和250rpm孵育过夜。第二天,测量过夜培养物的OD600,并计算各培养物接种50mL培养基达到0.1OD600所需的体积。将各培养物的计算体积用于接种250mL带挡板摇瓶中的50mL YPD,然后将培养物在30℃和250rpm孵育。
在生长7h后OD为1.6-2.1时的对数中期收获细胞。将培养物转移到预称重的50mL Falcon管中,并通过以3000×g离心5分钟收集细胞。移除培养基后,将细胞用10mL MilliQ H2O洗涤。除去水后,将细胞以3000×g再次离心5分钟,并且使用1mL移液枪头小心除去剩余的水。将细胞沉淀称重,并且然后储存在-80℃,直至进一步使用。
将细胞沉淀在冰上解冻,并且重悬在裂解缓冲液(10mM磷酸钠(pH7.0)、1mM二硫苏糖醇、5%w/v甘油)中,使得结果为20质量%的细胞悬液。对于各样品,将1mL玻璃珠(0.5mm直径)加到1.5mL Eppendorf管中,并且加入850μL细胞悬液。使用Retsch MM301混磨机(Retsch Inc.Newtown,PA)裂解酵母细胞,其中以全速混合6×1分钟,每次之间在冰上孵育1分钟。将管以21,500×g在4℃离心10分钟,并将上清液转移到新的管中。将提取物保持在冰上,直至如所述使用TMA29测定法对其进行测定。
还原(S)-2-乙酰乳酸的GEVO3527裂解液中的酿酒酵母TMA29的比活性(一种野生型MATα酿酒酵母菌株)为6.9±0.2mU/mg。tma29Δ菌株GEVO3939具有0.7±0.3mU/mg的比活性。野生型GEVO3527菌株的比TMA29活性为约缺失菌株的10倍高。
实施例18:乳酸克鲁维酵母中TMA29活性的测定
以下实施例示出了(S)-2-乙酰乳酸还原活性在tma29Δ菌株中明显降低。
表58.实施例18中所公开的菌株的基因型。
表59.实施例18中所公开的寡核苷酸序列。
如下,由GEVO1742构建乳酸克鲁维酵母菌株GEVO4458。使用SOEPCR制备DNA构建体以缺失乳酸克鲁维酵母的TMA29基因座。通过引物oGV3103和oGV3065,使用GEVO1287基因组DNA作为模板通过PCR扩增5’靶向序列。将376bp片段通过凝胶电泳纯化。通过引物oGV3106和oGV3067,使用GEVO1287基因组DNA作为模板通过PCR扩增3’靶向序列。将405bp片段通过凝胶纯化。通过引物oGV3066和oGV3068,使用pGV2701(PTEF1-Hph,CEN/ARS,pUC-ori,bla)作为模板通过PCR扩增Hph标记物。将1,165bp片段通过凝胶纯化。接下来,将5’靶向序列和hph标记物使用所述PCR产物作为模板接合在一起。使用引物oGV3068和oGV3103扩增反应。将1,984bp片段通过凝胶纯化。接下来,通过引物oGV3103和oGV3106使用PCR将5’靶向序列加Hph标记物PCR片段与3’靶向序列相接合。将2,331bp片段通过凝胶纯化并用于转化。使用Zymo Research ZR真菌/细菌DNA试剂盒(Zymo Research Orange,CA;Catalog#D6005)分离酵母DNA。使GEVO1287在带挡板的125mL摇瓶的12.5mL YPD中生长至饱和。将整个培养物收集在15mL Falcon管中,并以2700rcf离心5分钟收集细胞。根据制造商说明分离基因组DNA。测量DNA浓度,并将所有基因组DNA制备物稀释到25ng/μL的终浓度。
如下转化GEVO1742。将250mL带挡板摇瓶中的50mL YPD用新平板中的GEVO1742细胞接种。将培养物在30℃和250rpm孵育过夜。第二天早上,将培养物按1:50稀释在YPD培养基中并使其生长6h。通过以2700rcf在30℃离心2分钟收集细胞。通过用50mL无菌MilliQ水完全重悬而洗涤细胞。通过以2700rcf在30℃离心2分钟收集细胞。通过用25mL无菌MilliQ水重悬而洗涤细胞。通过以2700rcf在30℃离心2分钟收集细胞。将细胞重悬在1mL 100mM乙酸锂中,然后转移到Eppendorf管,并再以14,000rcf离心10秒而收集。移除上清液,并将细胞用4倍沉淀体积的100mM LiOAc重悬。为各转化制备DNA(15μL PCR产物)、72μL 50%PEG、10μL 1M乙酸锂和3μL变性鲑精DNA(10mg/mL)的混合物。在1.5mL的管中,将15μL细胞悬液加到DNA混合物(170μL)中,然后将转化悬液涡旋5个短脉冲。将转化物在30℃孵育30分钟,然后在42℃孵育22分钟。通过离心(18,000×g,10秒,25℃)收集细胞。将细胞重悬在400μLYPD培养基中,并使其在30℃和250rpm下复苏过夜。第二天早上,将细胞平铺到YPE平板上,其含有1%(w/v)酵母提取物、2%(w/v)蛋白胨、25mL/L乙醇,补充了0.1g/L潮霉素。将转化体单菌落纯化到补充了0.1g/L潮霉素的YPE平板上。
将单菌落分离物贴片到补充了0.1g/L潮霉素的YPE平板上,通过菌落PCR筛选贴片的正确整合。使用琼脂糖凝胶电泳确认了正确的PCR产物的存在。为了筛选内部TMA29编码区,使用引物oGV3103和oGV3106。为了筛选5’整合连接,使用引物oGV3069和oGV821。为了筛选3’整合连接,使用引物oGV2320和oGV3070。
对于各菌株,通过一式三份地接种14mL培养管中的3mLYPD培养基(1%(w/v)酵母提取物、2%(w/v)蛋白胨、2%(w/v)葡萄糖)而培养酵母细胞。通过在含有1%(w/v)酵母提取物、2%(w/v)蛋白胨、2%(w/v)葡萄糖、2%糖的YPD平板上的贴片起始培养。将培养物在30℃和250rpm孵育过夜。第二天,测量过夜培养物的OD600,并计算接种50mL培养基达到0.1OD600的各培养物的体积。将各培养物的计算体积用于接种250mL带挡板摇瓶中的50mL YPD,并将培养物在30℃和250rpm过夜孵育。在OD为1.8-2.2的对数中期收获细胞。将培养物转移到预称重的50mL Falcon管中,并通过以3000×g离心5分钟收集细胞。移除培养基后,将细胞用10mL MilliQ H2O洗涤。除去水后,将细胞以3000×g再次离心5分钟,并且然后使用1mL移液枪头小心除去剩余的水。对细胞沉淀称重,并然后储存在-80℃。
将细胞沉淀在冰上解冻,并然后重悬在裂解缓冲液(10mM磷酸钠(pH7.0)、1mM二硫苏糖醇、5%w/v甘油)中,使得结果为20质量%的细胞悬液。对于各样品,将1mL玻璃珠(0.5mm直径)加到1.5mL Eppendorf管中,然后加入850μL细胞悬液。使用Retsch MM301混磨机(Retsch Inc.Newtown,PA)裂解酵母细胞,其中以全速混合6×1分钟,每次之间在冰上孵育1分钟。将管以21,500×g在4℃离心10分钟,然后将上清液转移到新的管中。将提取物保持在冰上,直至如所述使用TMA29测定法对其进行测定。
还原(S)-2-乙酰乳酸的具有TMA29基因的Gevo1742比活性为0.0043±0.0005μmol/min/mg裂解液。缺失TMA29基因的Gevo4459的比活性为0.0019±0.0003μmol/min/mg裂解液。
实施例19:在包含ALD6缺失、TMA29缺失以及具有升高k
cat
和降低
K
M
的醇脱氢酶的酿酒酵母菌株中异丁醇得率升高
以下实施例示出了ALD6缺失、TMA29缺失以及编码具有改善动力学性质的ADH的基因过表达的组合导致异丁醇的产生和理论得率升高。
通过用2μ质粒pGV2603(PTDH3:Ec_ilvC_coScP2D1-A1-his6,PTEF1:Ll_ilvD_coSc,PENO2:Ll_adhARE1,2μ-ori,pUC-ori,bla,G418R)转化酿酒酵母CEN.PK2菌株GEVO3956而构建酿酒酵母CEN.PK2菌株GEVO3991,所述酿酒酵母CEN.PK2菌株GEVO3956由其染色体DNA表达改良的醇脱氢酶(乳酸乳球菌ADH*,LI_ADH*)和脱羧酶(乳酸乳球菌KIVD,LI_kivD2),所述质粒表达编码以下酶的基因:KARI、DHAD和改良的ADH(分别为Ec_ilvC_coScP2D1-A1-his6、Ll_ilvD_coSc和Ll_adhARE1)。
表60.实施例19中所公开的菌株的基因型。
在四个重复发酵罐中,进行发酵以确定GEVO3991(LI_adhARE1,ALD6Δ,TMA29Δ)的性能。在发酵过程中测量了葡萄糖消耗、异丁醇产生、异丁酸产生、乙酸产生和OD600。对于这些发酵,将在YPD琼脂平板上生长的单个分离的细胞菌落转移到500mL带挡板的含有80mLYPD的摇瓶中,而该YPD含有80g/L葡萄糖、5g/L乙醇、0.5g/L MgSO4和0.2g/L G418,并在250rpm的轨道式震荡器中在30°C孵育30h。将摇瓶培养物转移到四个单独的2L顶驱马达发酵罐容器中,每个容器具有0.9LYPD的工作体积,该YPD含有80g/L葡萄糖、5g/L乙醇、0.5g/L MgSO4和0.2g/L G418,以达到0.3的起始OD600。在基于氧传递速率(OTR)的2阶段有氧条件下,将发酵罐在30℃以及用6N KOH控制在pH 6.0下运行。最初,通过700rpm的固定搅拌速度以及5sL/h的空气覆盖将发酵罐以10mM/h的生长期OTR运行。让培养物生长22.5h达到约10-11的OD600,然后立即切换到生产曝气条件持续40.7h。生产期的细胞密度达到13-14OD600。通过300rpm的固定搅拌速度以0.5mM/h的OTR运行生产期。定期地,从各发酵罐取出样品以测量OD600并准备用于气相色谱(GC)和液相色谱(LC)分析。对GC于和LC,取2mL样品加到Eppendorf管中,并在微量离心机中以最大速度离心10分钟。如所述,通过GC1分析1mL上清液(异丁醇、其它代谢产物),并通过高效液相色谱(LC1)分析1mL中的有机酸和葡萄糖。
GEVO3991在22.5h的生长期中达到了13.8的细胞密度。在实验的整个持续过程中(63.2h)产生的异丁醇为18.6±0.9g/L,并产生了0.84±0.10g/L异丁酸和0.15±0.02g/L乙酸。在实验的生产期中(22.5-63.5h)实现的理论异丁醇得率为80.3±1.1%,而异丁酸得率仅为0.013±0.001g/g葡萄糖。未检测到DH2MB的产生。
此外,还在摇瓶中表征了三个独立的GEVO3991转化体。使菌株在30℃和250rpm下在3mL含1%乙醇和0.2g/L G418的YPD中生长。将这些培养物稀释到带挡板的250mL摇瓶中的50mL相同培养基中达到0.1的OD600,并生长过夜。测量了OD600,并对于各培养物,通过以2700rcf离心2分钟收集了约等于250OD600的细胞量,并将细胞重悬在50mL发酵培养基(含有80g/L葡萄糖、0.03g/L麦角固醇、1.32g/L Tween80、1%v/v乙醇、200mMMES pH6.5的YPD)中,并转移到无挡板的通气螺旋盖250mL摇瓶中。检查OD600,并将培养物置于30℃和75rpm以引发微氧发酵。大约以24h间隔采集用于液相色谱(LC)、气相色谱(GC)分析和OD600的样品。将样品(2mL)以18,000×g离心10分钟,并将1.5mL澄清的上清液用于GC1和LC1分析。
发酵以约4的OD600起始。微氧发酵72h时,细胞生长到约8的OD600。72h后,异丁醇滴度为12.3g/L,并且异丁醇得率为67.2%(理论)。异丁酸滴度和得率如下:以0.013g/g葡萄糖的得率产生了0.6g/L的异丁酸。未检测到DH2MB的产生。
实施例20:马克斯克鲁维酵母中TMA29缺失的影响
本实施例的目的是展示包含ALS活性的马克斯克鲁维酵母菌株中TMA29的缺失导致DH2MB的产生减少。
本实施例中所公开的菌株、质粒和寡核苷酸序列分别列于表61、62和63中。
表61.实施例20中所公开的菌株的基因型。
表62.实施例20中所公开的质粒。
表63.实施例20中所公开的寡核苷酸序列。
菌株构建:如下使编码马克斯克鲁维酵母TMA29蛋白质(SEQ ID NO:23)的马克斯克鲁维酵母TMA29基因同源物从亲本马克斯克鲁维酵母菌株GEVO2348中缺失,从而产生菌株GEVO6403和GEVO6404。
如所述,从GEVO1947中分离基因组DNA。如所述,通过SOE PCR制备构建体以将大肠杆菌hph(潮霉素抗性)盒整合到GEVO2348的TMA29基因座中。PCR步骤1由产生5’TMA29靶向序列、3’TMA29靶向序列和hph标记物的三个反应组成。通过引物oGV3498和oGV3137由制备的GEVO1947基因组DNA扩增5’靶向序列。将385bp片段通过凝胶电泳进行纯化。通过引物oGV3140和oGV3499由制备的GEVO1947基因组DNA扩增3’靶向序列。将473bp片段通过凝胶纯化。通过引物oGV3138和oGV3139由pGV2701扩增PTEF1:hph:TCYC1(部分)盒。将1,651bp片段通过凝胶纯化。最终SOE PCR步骤接合得自步骤1的3种产物(5’靶向序列/hph标记物/3’靶向序列)。使用引物oGV3498和oGV3499扩增反应。将2,414bp片段如所述进行凝胶纯化,并用于如所述的GEVO2348转化。用于使转化用细胞生长的培养基为YPE。在转化后,将150μL转化培养物平铺到含有0.1g/L潮霉素的YPE平板上。将平板在30℃孵育,并将转化的菌落进行单菌落分离,然后贴片到用于菌落PCR的含0.1g/L潮霉素的YPE平板上。
如所述,将酵母菌落PCR用于筛选合适的3’整合连接、5’整合连接以及不存在TMA29编码区。使用引物oGV3501和2320确认了正确的3’整合连接。使用引物oGV3500和oGV0821确认了正确的5’整合连接。最后,为了筛选TMA29内部编码区的缺失,使用引物oGV3500和oGV3141。
发酵:如所述,对菌株GEVO2348(TMA29)、GEVO6403(tma29Δ)和GEVO6404(tma29Δ)每一种均一式三份地进行了摇瓶发酵,以确定表达Bs_alsS的菌株中TMA29的缺失是否会导致DH2MB的产生减少。将tma29Δ菌株的单菌落分离转化体贴片到含0.1g/L潮霉素的YPE平板,而将亲本菌株贴片到YPE平板。将贴片中的细胞用于接种3mLYPE培养物。将培养物在30℃和250rpm孵育过夜。孵育过夜后,通过在水中按1:40稀释而测定这些培养物的OD600。将适量的培养物加到250mL无挡板摇瓶中的50mLYPE中,以得到0.1的OD600,并在30℃和250rpm孵育。24h孵育后,通过在水中按1:40稀释而测定这些培养物的OD600。将适量的培养物加到含8%、葡萄糖和200mM MES(pH 6.5)的50mLYPD中,以得到5的OD600。将发酵培养物在无挡板的250mL摇瓶中在30℃和75rpm进行孵育。还采集了培养基的一个15mL等分试样以用作LC4分析的空白,并保持在4℃直至样品提交。72h后,取出1.5mL培养物,并如上制备样品用于OD600和LC4分析。此外,在72h时,通过将80OD的合适样品转移到两根15mL Falcon管中并以3000×g在4℃离心5分钟而收获用于酶测定的样品。将沉淀重悬在3mL冷的无菌水中,并在台式离心机的浮桶式转头中以5000×g在4℃离心2分钟。通过真空抽吸器除去水。将锥形管储存在-80℃。
如所述测量了裂解液的体外ALS酶活性。表64显示了72h后菌株裂解液的平均体外ALS酶活性。ALS活性在GEVO2348(平均为3.14单位/毫克裂解液)以及在tma29Δ菌株GEVO6403和GEVO6404两者(平均值分别为1.63和1.58单位/毫克裂解液)中均可测。
表64还显示了通过LC4对这些菌株分析的DH2MB和DHIV滴度。GEVO2348(TMA29)菌株产生了平均0.89g/L的DH2MB滴度,而未检测出DHIV。DH2MB滴度在tma29Δ菌株GEVO6403和GEVO6404中明显降低,分别测得为0.16和0.15g/L。虽然ALS活性在tma29Δ菌株中降低,但这并不能解释缺失菌株中DH2MB滴度>80%的降低。例如,GEVO2348的一个技术重复表现出2.5单位/毫克裂解液的ALS活性,并产生了0.83g/LDH2MB,而tma29Δ菌株GEVO6404的技术重复之一具有1.9单位/毫克裂解液的类似活性,并且只产生了0.16g/L DH2MB。
表64.72h发酵后tma29Δ菌株中ALS活性、DH2MB和DHIV滴度以及百分比DH2MB降低。
n.d.=未检出
实施例21:乳酸克鲁维酵母中TMA29缺失的影响
本实施例的目的是展示包含ALS活性的乳酸克鲁维酵母菌株中TMA29的缺失导致DH2MB的产生减少。
本实施例中所公开的菌株、质粒和寡核苷酸引物分别列于表65、66和67中。
表65.实施例21中所公开的菌株的基因型。
表66.实施例21中所公开的质粒。
表67.实施例21中所公开的寡核苷酸序列。
菌株构建:如下,使编码乳酸克鲁维酵母TMA29蛋白质(SEQ ID NO:7)的乳酸克鲁维酵母TMA29基因同源物从亲本乳酸克鲁维酵母菌株GEVO1742中缺失,从而产生如实施例18中所述的菌株GEVO4458。
如所述,将乳酸克鲁维酵母菌株GEVO1742(亲本,TMA29)和GEVO4458(tma29Δ)用质粒pGV1429(空对照载体)、pGV1645(表达Bs_alsS)或用AhdI线性化质粒pGV1726(导致Bs_alsS的随机整合)转化,重悬在400μL 1.25×SC–HWLU中,然后平铺到SCD-W平板上以选择经转化的细胞。如所述,AhdI线性化pGV1726在GEVO1742和tma29Δ菌株GEVO4458两者中的随机整合通过用对内部Bs_alsS编码区异性的引物oGV1321和oGV1324的菌落PCR进行证实。菌株GEVO6316、GEVO6317、GEVO6324和GEVO6325为基因整合阳性。
发酵:如所述,对多种GEVO菌株(表65)进行了摇瓶发酵,以确定表达Bs_alsS的菌株中TMA29的缺失是否会导致DH2MB的产生减少。将单菌落分离的转化体贴片到SCD-W平板上,将非转化的亲本菌株贴片到YPD上。将贴片中的细胞用于接种YPD(亲本菌株和整合菌株)或3mL SCD-W中的3mL培养物。将培养物在30℃和250rpm孵育过夜。孵育过夜后,通过在水中按1:40稀释而测定这些培养物的OD600。将适量的培养物添加到250mL带挡板摇瓶中的50mL含有5%葡萄糖的YPD或含有5%葡萄糖的SCD-W中,以得到0.1的OD600,并在30℃和250rpm孵育。孵育24h后,在水中按1:40稀释而测定这些培养物的OD600。将适量的培养物加到含有8%葡萄糖、200mM MES(pH 6.5)的50mLYPD或含有8%葡萄糖的SCD-W中,以得到5的OD600。当250OD不能起始发酵时,使用整个50mL培养物。将发酵培养物在无挡板的250mL摇瓶中在30℃和75rpm进行孵育。如所述,还收集了15mL锥形管用于LC1和LC4分析的培养基空白,并保持在4℃直至样品提交。在72h时间点,收集1.5mL培养物。测定了OD600值,并通过在14,000rpm离心10分钟并取1mL待分析的上清液而制备用于LC1和LC4分析的样品。此外,在72h时间点收获了用于酶测定的样品。将60OD的合适样品转移到15mL Falcon管中,并以3000×g在4℃离心5分钟。将沉淀重悬在3mL冷的无菌水中,然后转移到3根1.5mL Eppendorf管(每管各1mL)中以制备3×20OD重复。在台式离心机的浮桶式转头中,将管以5000×g在4℃离心2分钟。通过真空抽吸器除去水。将Eppendorf管储存在-80℃。
如所述测量了裂解液的体外ALS酶活性。表68显示了72h后菌株裂解液的平均体外ALS酶活性。ALS活性只在具有随机整合的(GEVO6316、GEVO6317、GEVO6324、6325)或由质粒表达的(GEVO6313-6315、GEVO6321-6323)的Bs_alsS的菌株中可测。在具有整合的Bs_alsS的菌株中的ALS活性低于由质粒表达Bs_alsS的菌株中的活性。然而,在具有整合Bs_alsS的TMA29菌株(GEVO6316、GEVO6317)中0.25单位/mg裂解液的活性仍足以产生1.06g/L的DHIV+DH2MB组合滴度。
表68显示了基于LC1分析的在发酵72h后多种菌株的DHIV+DH2MB组合滴度。菌株GEVO1742(亲本,TMA29)仅在Bs_alsS随机整合(1.06g/L)或由质粒pGV1645表达(0.45g/L)时才产生了可测的DHIV+DH2MB组合滴度。这些DHIV+DH2MB滴度在tma29Δ菌株GEVO4458中当通过随机整合(GEVO6324、GEVO6325)或质粒(GEVO6321-6323)表达Bs_alsS时为零。LC4分析表明,DHIV+DH2MB组合滴度的大部分事实上为DH2MB。
表68.ALS活性、组合DHIV+DH2MB滴度以及组合DHIV+DH2MB滴度中的DH2MB百分比。
n/a=不适用,样品无LC1可检测的峰,因此未通过LC4进行分析
实施例22:东方伊萨酵母中TMA29缺失的影响
以下实施例示出了东方伊萨酵母TMA29基因的缺失导致TMA29活性降低,并且还导致包含ALS活性的菌株中DH2MB的产生减少。
表69.实施例22中所公开的菌株的基因型。
菌株构建:使用标准酵母遗传学和分子生物学方法,构建了衍生自PTA-6658的东方伊萨酵母菌株,它们为TMA29基因的野生型(GEVO4450、GEVO12425)、缺失TMA29基因一个拷贝的杂合体(GEVO6155)、或完全缺失TMA29基因(GEVO6158、GEVO12473、GEVO12474)。这些菌株还携带枯草芽孢杆菌alsS基因的拷贝。
TMA29酶测定:对于TMA29体外测定,通过用新鲜YPD平板中的细胞接种125mL带挡板摇瓶中的25mL YPD,使东方伊萨酵母菌株GEVO4450(TMA29/TMA29)、GEVO6155(tma29Δ/TMA29)和GEVO6158(完整tma29Δ/tma29Δ)生长。使培养物在30℃和250rpm过夜生长。将这些培养物用于接种250mL带挡板摇瓶中的50mLYPD以达到0.05的OD600。让这些培养物在30℃和250rpm生长,直至它们达到约5-8的OD600(对数后期)。通过在50mL Falcon管中收集80OD的细胞并在2,700×g离心3分钟而收获细胞。除去上清液后,将细胞置于冰上,并用5mL冷水洗涤。将细胞以2,700×g离心3分钟,然后除去水。将细胞沉淀储存在-80℃直至使用。此外,通过接种新鲜平板上的3mLYPD并在30℃和250rpm生长,使相同的菌株生长。将这些培养物用于接种250mL带挡板摇瓶中的50mL YPD达到0.01的OD600,并且使培养物在30℃和250rpm生长直至它们达到约4-8的OD600。通过在50mL Falcon管中以2,700×g将适量的培养物离心3分钟,然后将细胞沉淀重悬在50mL起始培养基中,而将此培养物用于接种50mL含有8%葡萄糖、200mM MES pH 6.5的YPD以达到4-5的最终OD600。将细胞在250mL无挡板摇瓶中在30℃和75rpm孵育48h(发酵阶段)。如所述收获八十OD细胞沉淀。将细胞重悬、裂解并如所述测定TMA29活性。
表70显示了东方伊萨酵母菌株GEVO4450、6155和6158裂解液的比TMA29活性,单位为U/mg总蛋白质。与GEVO4450(TMA29/TMA29)相比,GEVO6155(tma29/TMA29)和GEVO6158(完全tma29缺失)的比TMA29活性降低。
表70.东方伊萨酵母菌株中的TMA29活性。
发酵:对于发酵,通过用新鲜YPD平板中的细胞接种125mL带挡板摇瓶中的12mL YPD,使东方伊萨酵母菌株GEVO12425(TMA29/TMA29)、GEVO12473(tma29/tma29)和GEVO12474(tma29/tma29)生长。使培养物在30℃和250rpm过夜生长。测定了12mL过夜培养物的OD600,并将适量培养物用于接种250mL带挡板摇瓶中的50mL含有5%葡萄糖的YPD,达到0.1的OD600。将摇瓶在30℃和250rpm孵育过夜。测定了50mL培养物的OD600。在50mL Falcon管中,将适量的培养物以2700rcf在25℃离心5分钟,然后除去上清液。将各50mL培养物中的细胞重悬在50mL含8%葡萄糖、200mM MES(pH 6.5)的YPD中。然后将培养物转移到250mL无挡板的螺旋盖摇瓶中,并在30℃和75rpm进行孵育。72h时,取出各摇瓶中的样品,测量OD600,并通过将1mL样品转移到Eppendorf管中并以18,000×g在25℃离心10秒钟制备用于LC4分析的样品。离心后,将0.75mL上清液转移到微量滴定板并通过LC4进行分析。也在72h时,通过如所述转移80OD样品到15mL Falcon管中收集用于酶测定的细胞。如所述,将用于ALS测定的细胞重悬、裂解和进行测定。
表71显示了在72h时GEVO12425、12473和12474的DH2MB产生和ALS活性。通过LC4测定了DH2MB滴度。ALS活性在所有菌株中都相似。
表71.72h发酵时东方伊萨酵母中DH2MB的产生和ALS活性。
实施例23:粟酒裂殖酵母中TMA29缺失的影响
以下实施例示出了(S)-2-乙酰乳酸还原活性在粟酒裂殖酵母tma29Δ菌株中与粟酒裂殖酵母TMA29菌株相比明显降低。
表72.实施例23中所公开的菌株的基因型。
让具有完整TMA29基因(SEQ ID NO:161)的酵母菌株GEVO6444和缺失TMA29基因的GEVO6445在250rpm和30℃下在125mL带挡板摇瓶的12mL YPD中生长过夜。第二天,测定了OD600值,并以大约0.3的OD600在50mL含5%葡萄糖的YPD中起始技术重复培养。使培养物在250rpm和30℃生长一整天。在当天结束时,将培养物在含5%葡萄糖的YPD中稀释达到约0.15的OD600,然后在250rpm和30℃孵育过夜。达到4与6之间的OD600时收获细胞。为了收获用于酶测定的沉淀,将80OD的合适样品转移到两根15mL Falcon管(用于两平行样)中并以3000×g在4℃离心5分钟。将沉淀重悬在3mL冷的无菌水中,并在台式离心机的浮桶式转头中以5000×g在4℃离心2分钟。通过真空抽吸器除去水。将沉淀储存在-80℃。制备了裂解液,并如所述进行了TMA29酶测定。
还原(S)-2-乙酰乳酸的粟酒裂殖酵母GEVO6444裂解液的比活性为0.018±0.002U/mg总蛋白质。tma29Δ菌株GEVO6445的裂解液具有0.001±0.002U/mg总蛋白质的比活性。
实施例24:马克斯克鲁维酵母中ALD6缺失的影响
本实施例的目的是展示马克斯克鲁维酵母菌株中ALD6的缺失导致异丁醛氧化活性和异丁酸产生的降低。
本实施例中所公开的菌株、质粒和寡核苷酸引物分别列于表73、74和75中。
表73.实施例24中所公开的马克斯克鲁维酵母菌株的基因型。
表74.实施例24中所公开的质粒。
表75.实施例24中所公开的寡核苷酸序列。
菌株构建:如下,使编码马克斯克鲁维酵母ALD6蛋白质(SEQ ID NO:39)的马克斯克鲁维酵母ALD6基因同源物从亲本马克斯克鲁维酵母菌株GEVO1947和GEVO2087中缺失,从而分别产生菌株GEVO6264/GEVO6265和GEVO6270/GEVO6271。
如所述,从GEVO1947中分离基因组DNA。如所述,通过SOE PCR制备构建体以将大肠杆菌hph(潮霉素抗性)盒整合到GEVO1947和GEVO2087的ALD6基因座中。PCR步骤1由三个反应构成:5’ALD6靶向序列、3’ALD6靶向序列和hph标记物。通过引物oGV3490和oGV3492由制备的GEVO1947基因组DNA扩增5’靶向序列。将635bp片段通过凝胶电泳进行纯化。通过引物oGV3493和oGV3495由制备的GEVO1947基因组DNA扩增3’靶向序列。将645bp片段通过凝胶纯化。通过引物oGV3491和oGV3494由pGV2701扩增PTEF1:hph:TCYC1(部分)盒。将1,665bp片段通过凝胶纯化。最终SOE PCR步骤接合得自步骤1的3种产物(5’ALD6靶向序列/hph/标记物/3’ALD6靶向序列)。使用引物oGV3490和oGV3495扩增反应。将2,826bp片段进行凝胶纯化,并用于如所述GEVO1947和GEVO2087的转化。用于使转化用细胞生长的培养基为YPD。转化后,将150μL的各转化培养物平铺到补充了0.2g/L潮霉素的YPD平板上。将平板在30℃进行孵育。将转化的菌落进行贴片,以用于初始的菌落PCR筛选,然后进行单菌落分离,并再重新贴片到补充了0.2g/L潮霉素的YPD平板上。
如所述,将酵母菌落PCR用于筛选合适的3’整合连接、5’整合连接以及不存在ALD6编码区。使用引物oGV3497和oGV2320证实了正确的3’整合连接。使用引物oGV3496和oGV0821证实了正确的5’整合连接。最后,使用引物oGV3495和oGV0706证实了ALD6内部编码区的缺失。
发酵:使用ald6Δ菌株GEVO6264/GEVO6265和GEVO6270/GEVO6271及其相应的ALD6亲本菌株GEVO1947和GEVO2087的技术三重复,如所述进行具有2g/L异丁醛的摇瓶发酵。
将经证实的ald6Δ菌株的单菌落分离的转化体贴片到补充了0.2g/L潮霉素的YPD平板上,并将亲本贴片到YPD平板上。将贴片中的细胞用于接种技术三重复的3mLYPD培养基。将培养物在30℃和250rpm过夜孵育。过夜孵育后,通过在水中按1:40稀释测定了这些培养物的OD600。将适量的培养物添加到250mL带挡板摇瓶中的50mL含有5%葡萄糖的YPD,以得到0.1的OD600,并在30℃和250rpm孵育培养物。孵育24h后,在水中按1:40稀释而测定这些培养物的OD600。将适量的培养物加到含有8%葡萄糖、200mM MES(pH 6.5)和2g/L异丁醛的50mL YPD中,以得到为5的OD600。将发酵培养物在无挡板的250mL摇瓶中在30℃和75rpm进行孵育。收集未使用的培养基作为LC分析的培养基空白,并保持在4℃直至样品提交。在48h时,如下采集各摇瓶中的样品。取1.5mL培养物到1.5mL Eppendorf管中。测定了OD600值,并制备了用于LC1分析的样品。将各管以14,000rpm离心10分钟,并且通过LC1分析上清液。此外,在48h后收获用于酶测定的样品。将80OD的合适样品转移到两根15mL Falcon管(用于两重复样)中并以3000×g在4℃离心5分钟。将沉淀重悬在3mL冷的无菌水中,在浮桶式转头中以5000×g在4℃离心2分钟。通过真空抽吸器除去水。将锥形管储存在-80℃。
表76显示了发酵48h后的异丁酸滴度。ALD6亲本菌株GEVO1947产生了分别为0.19g/L和0.013g/L/OD的平均总异丁酸滴度和比异丁酸滴度。这些总异丁酸滴度和比异丁酸滴度在ald6Δ菌株GEVO6264中(分别为0.06g/L和0.004g/L/OD)以及在ald6Δ菌株GEVO6265中(分别为0.05g/L和0.003g/L/OD)明显降低。ALD6亲本菌株GEVO2087产生了分别为0.15g/L和0.008g/L/OD的总异丁酸滴度和比异丁酸滴度。这些总异丁酸滴度和比异丁酸滴度在ald6Δ菌株GEVO6270中(分别为0.05g/L和0.003g/L/OD)以及在ald6Δ菌株GEVO6271中(分别为0.08g/L和0.005g/L/OD)明显降低。
表76.ALD6亲本菌株和衍生自所述ALD6亲本菌株的ald6Δ菌株的异丁酸产生。
实施例25:乳酸克鲁维酵母中ALD6缺失的影响
本实施例的目的是展示乳酸克鲁维酵母菌株中ALD6的缺失导致异丁醛氧化活性和异丁酸产生的降低。
本实施例中所公开的菌株、质粒和寡核苷酸引物分别列于表77、78和79中。
表77.实施例25中所公开的乳酸克鲁维酵母菌株的基因型。
表78.实施例25中所公开的质粒。
质粒名称 | 基因型 |
pGV2701 | PTEF1:hph,CEN,pUC ori,bla |
表79.实施例25中所公开的寡核苷酸序列。
菌株构建:如下,使编码乳酸克鲁维酵母ALD6蛋白质(SEQ ID NO:29)的乳酸克鲁维酵母ALD6基因同源物从亲本乳酸克鲁维酵母菌株GEVO1287和GEVO1830中缺失,从而分别产生菌株GEVO6242和GEVO6244/GEVO6245。
如所述,从GEVO1287中分离基因组DNA。如所述,通过SOE PCR制备构建体以将大肠杆菌hph(潮霉素抗性)盒整合到GEVO1287和GEVO1830的ALD6基因座中。PCR步骤1由三个反应构成:5’ALD6靶向序列、3’ALD6靶向序列和hph标记物。通过引物oGV3502和oGV3504由制备的GEVO1287基因组DNA扩增5’靶向序列。将639bp片段通过凝胶电泳进行纯化。通过引物oGV3505和oGV3507由制备的GEVO1287基因组DNA扩增3’靶向序列。将628bp片段通过凝胶纯化。通过引物oGV3503和oGV3506由pGV2701扩增PTEF1:hph:TCYC1(部分)盒。将1,663bp片段通过凝胶纯化。最终SOE PCR步骤接合得自步骤1的3种产物(5’靶向序列/hph标记物/3’靶向序列)。使用引物oGV3502和oGV3507扩增反应。将2,810bp片段进行凝胶纯化,并用于如所述GEVO1287和GEVO1830的转化。在补充了0.1g/L潮霉素的YPD平板上选择潮霉素抗性菌落。如所述,将酵母菌落PCR用于筛选合适的3’整合连接、5’整合连接以及不存在ALD6编码区。使用引物oGV3509和oGV2320确认了正确的3’整合连接。使用引物oGV3508和oGV0821确认了正确的5’整合连接。最后,使用引物oGV3508和oGV3510确认了ALD6内部编码区的缺失。
发酵:使用ald6Δ菌株GEVO6242和ALD6野生型亲本菌株GEVO1287的技术三重复,执行在培养基中含2g/L异丁醛的第一摇瓶发酵。将经确认的ald6Δ缺失菌株的单菌落分离的转化体贴片到补充了0.1g/L潮霉素的YPD平板上,将亲本菌株贴片到YPD上。将贴片中的细胞用于接种技术三重复的3mLYPD培养基。将培养物在30℃和250rpm孵育过夜。过夜孵育后,通过在水中按1:40稀释而测定这些培养物的OD600。将适量的培养物添加到250mL带挡板摇瓶中的50mL含5%葡萄糖的YPD,以得到0.1的OD600,然后在30℃和250rpm孵育培养物。孵育24h后,在水中按1:40稀释而测定这些培养物的OD600。将适量的培养物加到含8%葡萄糖、200mMMES(pH 6.5)和2g/L异丁醛的50mLYPD中,以得到为5的OD600。将发酵培养物在无挡板的250mL摇瓶中在30℃和75rpm进行孵育。收集未使用的培养基作为LC1分析的培养基空白,并保持在4℃直至样品提交。在24h时,如下采集各摇瓶中的样品。取1.5mL培养物到1.5mL Eppendorf管中。如所述,测定了OD600值,并制备了用于LC1分析的样品。将各管以14,000rpm离心10分钟,并收集上清液用于如所述的LC1分析。
使用ald6Δ缺失菌株GEVO6244/GEVO6245及其相应的ALD6亲本菌株GEVO1830,如所述执行含有2g/L异丁醛的第二摇瓶发酵。如所述,对此发酵在24和48h时进行采样。表80显示了这两种发酵的异丁酸滴度。异丁酸滴度在ald6Δ菌株中与ALD6亲本菌株相比明显降低。
表80.ALD6亲本菌株和衍生自所述ALD6亲本菌株的ald6Δ菌株的异丁酸产生。
n.d.=未在本实验中测定
*基于0.025g/L异丁酸的LOQ
实施例26:TMA29对2-乙酰-2-羟基丁酸的活性
以下实施例示出了酿酒酵母TMA29蛋白质对(S)-2-乙酰乳酸((S)-AL)和2-乙酰-2-羟基丁酸(AHB)具有活性。
表81.实施例26中所公开的菌株的基因型。
将TMA29(YMR226C)基因从其缺失的酵母菌株GEVO3939及其亲本GEVO3527均一式三份地进行培养,方法是对于各菌株一式三份地接种14mL培养管中的3mL YPD。对于GEVO3527,通过YPD琼脂平板上的贴片起始培养,并且对于GEVO3939,通过含有0.2g/L G418的YPD琼脂平板上的贴片起始培养。将培养物在30℃和250rpm过夜孵育。第二天,测量过夜培养物的OD600,并计算各培养物接种50mL培养基达到0.1OD600所需的体积。将各培养物的计算体积用于接种250mL带挡板摇瓶中的50mLYPD,然后将培养物在30℃和250rpm孵育。
在生长8h后OD为2.2-2.7时的对数中期收获细胞。将培养物转移到预称重的50mL Falcon管中,并通过以3000×g离心5分钟收集细胞。移除培养基后,将细胞用10mL MilliQ H2O洗涤。除去水后,将细胞以3000×g再次离心5分钟,然后使用1mL移液枪头小心除去剩余的水。将细胞沉淀称重,然后储存在-80℃,直至进一步使用。
将细胞沉淀在冰上解冻,然后重悬在裂解缓冲液(10mM磷酸钠(pH7.0)、1mM二硫苏糖醇、5%w/v甘油)中,使得结果为20质量%的细胞悬液。对于各样品,将1mL玻璃珠(0.5mm直径)加到1.5mL Eppendorf管中,并加入850μL细胞悬液。使用Retsch MM301混磨机(Retsch Inc.Newtown,PA)裂解酵母细胞,其中以全速混合6×1分钟,每次之间在冰上孵育1分钟。将管以21,500×g在4℃离心10分钟,并将上清液转移到新的管中。将提取物保持在冰上,直至将其如所述使用TMA29测定法进行测定,以确定TMA29对(R/S)-AHB和(R/S)-AL的活性。
还原(R/S)-AHB的GEVO3527裂解液中酿酒酵母TMA29的比活性(一种野生型MATα酿酒酵母菌株)为10.5±0.6mU/mg。tma29Δ菌株GEVO3939具有4.8±0.1mU/mg的比活性。野生型GEVO3527菌株的比TMA29活性为缺失菌株的约2倍高。
还原(R/S)-AL的GEVO3527裂解液中酿酒酵母TMA29的比活性(一种野生型MATα酿酒酵母菌株)为12.3±0.2mU/mg。tma29Δ菌株GEVO3939具有2.9±0.3mU/mg的比活性。野生型GEVO3527菌株的比TMA29活性为缺失菌株的约4倍高。
实施例27-30的一般方法
实施例27-30中所述的菌株、质粒、基因/氨基酸序列和引物序列分别列于表82、83、84和85中。
表82.实施例27-30中所公开的菌株的基因型。
基因型或参考 |
大肠杆菌BL21(DE3)(Lucigen Corporation,Middleton,WI) |
大肠杆菌DH5α(Novagen,Gibbstown,NJ) |
酿酒酵母CEN.PK2(Euroscarf,Frankfurt,Germany) |
表83.实施例27-30中所公开的质粒。
GEVO号 | 基因型或参考 |
pET22(b)+ | Novagen,Gibbstown,NJ |
pGV1102 | PSc_TEF1-HA-tag-MCS-TCYC1,URA3,2-micron,bla,pUC-ori |
pGV1662 | PSc_TEF1-乳酸乳球菌kivD-TSc_CYC1,bla,ColE1 ori,URA3,2μori. |
pGV1947 | PSc_TEF1-Ll_adhA-TSc_CYC1 bla URA3 pMB1 ori 2μori |
pGV1947his | PSc_TEF1-Ll_adhAhis6-TSc_CYC1 bla URA3 pMB1 ori 2μori |
pET1947 | PT7::Ll_adhAhis6,bla,oripBR322,lacI |
pGV2274 | 含Ll_adhA_coSc序列的克隆载体(通过DNA2.0合成,Menlo Park,CA) |
pGV2475 | PSc_TEF1-Ll_adhA_coSc28E7-his6-TSc_CYC1,bla,URA3,pMB1 ori,2μori |
pGV2476 | PSc_TEF1-Ll_adhA_coSchis6-TSc_CYC1,bla,URA3,pMB1 ori,2μori |
pGV2477 | PSc_TEF1-Ll_adhA_coScRE1-his6-TSc_CYC1,bla,URA3,pMB1 ori,2μori |
pGV30C11 | PSc_TEF1-Ll_adhA_coSc30C11-his6-TSc_CYC1,bla,URA3,pMB1 ori,2μori |
表84.实施例27-30中所公开的核酸和蛋白质序列。
表85.实施例27-30中所公开的引物序列(从5’至3’示出)。
*A(腺嘌呤)、G(鸟嘌呤)、C(胞嘧啶)、T(胸腺嘧啶)、U(尿嘧啶)、R(嘌呤-A或G)、Y(嘧啶-C或T)、N(任何核苷酸)、W(弱-A或T)、S(强-G或C)、M(氨基-A或C)、K(酮基-G或T)、B(非A-G或C或T)、H(非G-A或C或T)、D(非C-A或G或T)和V(非T-A或G或C)
培养基和缓冲液:
SC-URA:6.7g/L DifcoTM酵母氮源基础、14g/L SigmaTM合成缺陷型培养基补充物(含组氨酸、色氨酸和亮氨酸之外的氨基酸和营养物)、10g/L酪蛋白氨基酸、20g/L葡萄糖、0.018g/L腺嘌呤半硫酸盐和0.076g/L色氨酸。
SD-URA:在MP Biomedicals(Irvine,CA)商购获得。组成:17g/L酵母氮源基础(YNB)、5g/L硫酸铵、20g/L葡萄糖,含酪蛋白氨基酸不含尿嘧啶的CSM-URA。
YPD(酵母蛋白胨胨葡萄糖)培养基:10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖。
Tris-DTT:每1mL1M的TrisHCl含0.39g1,4-二硫苏糖醇,pH 8.0,除菌过滤。
缓冲液A:20mM Tris、20mM咪唑、100mM NaCl、10mM MgCl2,调节到pH 7.4,除菌过滤。
缓冲液B:20mM Tris、300mM咪唑、100mM NaCl、10mM MgCl2,调节到pH 7.4,除菌过滤。
缓冲液E:每1L去离子水含1.2gTris碱、92.4g葡萄糖和0.2gMgCl2,调节到pH 7.5,除菌过滤。
pET1947的构建:将乳酸乳球菌adhA(Ll_adhA)基因用引物His_Not1_1947_fwd和Sal1_rev克隆出pGV1947,并连接到pET22b(+)中,从而产生质粒pET1947。
pGV2476的构建:质粒pGV2274用作使用正向引物adhAcoSc_SalIin_for和反向引物adhAcoSC_NotIin_his_rev的PCR的模板。对PCR产物进行纯化,用NotI和SalI进行限制性内切酶消化,然后连接到已用NotI和SalI切割并纯化的pGV1662中。
酿酒酵母的转化:在进行计划的转化前的晚上,用单个酿酒酵母CEN.PK2菌落接种YPD培养基,并在30℃和250rpm孵育过夜。第二天早上,在250mL无挡板的Erlenmeyer摇瓶中用OD600为0.1的过夜培养物起始20mL YPD培养基。将该培养物在30℃和250rpm下孵育,直至其达到1.3-1.5的OD600。当培养物达到所需的OD600时,将200μL Tris-DTT加入,并使培养物在30℃和250rpm再孵育15分钟。然后将细胞在4℃和2,500×g沉降3分钟。除去上清液后,将沉淀重悬在10mL冰冷的缓冲液E中,如上所述再次离心沉降。然后,将细胞沉淀重悬在1mL冰冷的缓冲液E中,并再如前所述离心沉降一次。用移液枪除去上清液后,加入200μL冰冷的缓冲液E,然后将沉淀温和重悬。将6μL插入物/主链混合物分成两半,并加到50μL细胞悬液中。将DNA/细胞混合物转移到0.2cm电穿孔比色皿(BIORAD)中,并以0.54kV和25μF在无脉冲控制器的情况下进行电穿孔。迅速地将1mL预热的YPD加入,并使转化的细胞在15mL圆底培养管(Falcon)中在30℃和250rpm下再生。1小时后,将细胞在4℃和2,500×g离心沉降3分钟,并将沉淀重悬在1mL预热的SD-URA培养基中。将不同量的转化细胞接种到SD-URA平板上,并在30℃孵育1.5天,或直至菌落足够大以用无菌牙签挑取。
酵母细胞的质粒小量制备:将ZymoprepTM II–酵母质粒小量制备试剂盒(Zymo Research,Orange,CA)用于根据制造商的液体培养物方案(进行了略微改变)由酿酒酵母细胞制备质粒DNA。将200μL酵母细胞的等分试样在600×g离心沉降2分钟。滗析上清液后,将200μL溶液1加入以重悬沉淀。向样品中加入3μL ZymolyaseTM,并通过用手指轻叩而温和混合细胞/酶悬液。将样品在37℃孵育1小时后,将溶液2和3加入,并每次添加后均混合均匀。然后将样品在最大速度和4℃离心沉降10分钟。根据制造商说明进行了以下在Zymo柱上的净化。通过10μL PCR级水洗脱质粒DNA。将此体积的一半用于转化大肠杆菌DH5α。
大肠杆菌中的异源ADH表达:使用0.5mL携带质粒pET1947的单菌落的LBamp过夜培养物,将含有50mL Luria-Bertani(LB)培养基(每升10g胰蛋白胨、10g NaCl、5g酵母提取物)以及氨苄青霉素(最终浓度0.1mg/mL)的摇瓶(500mL Erlenmeyer)接种到0.1的初始OD600。使50mL LB表达培养物在250rpm和37℃下生长3-4h。通过添加IPTG到0.5mM的最终浓度,以约1的OD600诱导蛋白质表达。使蛋白质表达在225rpm和25℃继续24h。在5300×g和4℃处理10分钟而收获细胞,然后将细胞沉淀冷冻在-20℃直至进一步使用。
酿酒酵母CEN.PK2中的异源表达:将灌装有100mL SC-URA的摇瓶(1000mL Erlenmeyer)用1mL过夜培养物(5mL用单CEN.PK2菌落接种的SC-URA,在30℃和250rpm生长)接种。使表达培养物在30℃和250rpm生长24小时。使细胞在5300×g沉降5分钟。丢弃上清液,并再次离心沉淀。将残余的上清液用移液器枪吸走。将沉淀冷冻在-20℃直至进一步使用。
用于高通量测定的96孔板中CEN.PK2的异源表达:将浅96孔板(每孔1mL容量,填充有300μL SC-URA)用携带编码L1_adhAhis6或其变体的质粒的单CEN.PK2菌落进行接种。将深96孔板(每孔2mL容量,填充有600μL SC-URA)用50μL这些过夜培养物接种。使平板在30℃和250rpm生长24h,然后在5300×g和4℃处理5分钟进行收获,并储存在-20℃。
由大肠杆菌制备含ADH的提取物:将含有表达的ADH的大肠杆菌细胞沉淀解冻,并重悬(0.25g湿重/mL缓冲液)在缓冲液A中。将重悬的细胞通过超声以50%占空比裂解1分钟,在11000×g和4℃沉降10分钟。将提取物储存在4℃。
由酿酒酵母CEN.PK2制备含ADH的提取物:将含有表达的ADH的酿酒酵母CEN.PK2细胞沉淀解冻,并称重以获得沉淀的湿重。然后将细胞重悬在缓冲液A中,使得结果为20质量%的细胞悬液。将0.5mm直径的玻璃珠加到0.5mm直径的1.5mL Eppendorf管的1000μL刻度线,然后加入875μL细胞悬液。使用Retsch MM301混磨机(Retsch Inc.Newtown,PA)通过珠磨裂解酵母细胞,其中以全速混合6×1分钟,每次之间在冰上处理1分钟。将管在4℃以23,500×g离心10分钟,并移除上清液。将提取物储存在4℃。
ADH的纯化:使用Akta purifier FPLC系统(GE Healthcare)在预装镍的1mL Histrap高效(histrap HP)色谱柱(GE Healthcare)上通过IMAC(固定化金属离子亲和色谱)纯化ADH。将色谱柱用四倍柱体积(cv)的缓冲液A平衡。将粗提取物上样到色谱柱后,用2cv的缓冲液A洗涤柱,然后线性梯度到15cv的100%洗脱缓冲液B,最后收集到96孔板中。合并含有蛋白质的馏分,并储存在4℃。
ADH比色皿测定:通过测量340nm的吸光度监测NADH浓度的降低,来从动力学上测定ADH活性。制备含有100mM Tris/HCl(pH 7.0)、1mMDTT、11mM异丁醛和200μM NADH的反应缓冲液。通过将100μL适当稀释的粗提取物或纯化蛋白质加到900μL反应缓冲液中,从而引发反应。
ADH微滴定板活性测定:微滴定板中的活性测量是规模缩减的比色皿测定。总体积为100μL。将适当稀释的10μL粗裂解液或纯化酶置于测定板中。如上所述制备反应缓冲液(仅异丁醛底物),将其90μL加入板中的酶溶液。在Infinite M200酶标仪(TECAN Trading AG,Switzerland)中,在340nm记录NADH的消耗。
ADH高通量活性测定:将96孔板中的冷冻酵母细胞沉淀在室温解冻20分钟,然后加入100μLY-Per(Pierce,Cat#78990)。使平板短暂涡旋以重悬细胞沉淀。在室温和130rpm下的60分钟孵育期后,将300μL 100mM Tris-HCl(pH 7.0)加入平板以稀释粗提取物。在5,300×g和4℃持续10分钟的离心步骤后,使用自动移液器将40μL所得的粗提取物转移到测定板(平底,Rainin)中。使测定板在4,000rpm和室温短暂离心沉降。制备每块板12mL的测定缓冲液(100mM Tris-HCl(pH 7.0),1mM、0.5mM、0.25mM或0.125mM异丁醛,1mM DTT,200μM NADH),并将其100μL加到各孔中以起始反应。在2分钟内在Infinite M200酶标仪(TECAN Trading AG,Switzerland)中于340nm处监测NADH的耗尽。
基于活性测定中获得的数据确定比活性:使用Quick StartTM Bradford试剂盒(Bio-Rad,Hercules,CA)根据制造商的说明,测量了含异源表达的乳酸乳球菌AdhA的样品(诸如粗提取物和纯化蛋白质)的蛋白质浓度。将1单位的酶活性(1U)定义为在测定方法的规定条件下每分钟催化1微摩尔底物转化的酶的量。
热稳定性测量:测量了亲本Ll_adhA及其变体的T50值(孵育15分钟的时间后50%的酶活性得以保留的温度)以获得热稳定性数据。将纯化酶的30μL等分试样转移到PCR管中。将各管分配到特定的孵育温度,其对应于用涵盖20℃温度范围的梯度进行编程的PCR仪器(Eppendorf,Hamburg,Germany)模块上的狭槽。将管在其狭槽中孵育15分钟。然后,将反应在冰上猝灭。使用如上所述的ADH微量滴度板活性测定法测定了残余的活性。
使用组氨酸标签纯化:在下述各实施例中,参考了含组氨酸标签的ADH酶。如本领域所理解,此类组氨酸标签有助于蛋白质纯化。通过本公开,本领域的技术人员将会理解,不含所述组氨酸标签的ADH酶等价地或更适于将异丁醛转化成异丁醇。本文所述的不含使能够进行纯化的组氨酸标签的修饰ADH酶的实例见于SEQ ID NO:206-224。
实施例27:通过随机诱变定向进化
以下实施例示出了改进ADH动力学性质的方法,并且还描述了此类改进ADH酶的动力学性质。
携带Ll_adhA_coSchis6基因的质粒pGV2476(质粒pGV1662的衍生物)用作使用正向引物pGV1994ep_for和反向引物pGV1994_rev的易错PCR的模板。这些引物对主链pGV1662具有特异性,并结合ADH插入物上游和下游的50bp以形成重叠,用于酵母中的同源重组。三个易错PCR反应的组成汇总在表86中。温度曲线如下:95℃3min的预变性、95℃30s变性、55℃30s退火、72℃2min延伸、25个循环、72℃5min最终延伸。
表86.易错文库的PCR条件。
最终MnCl2浓度[μM] | 100 | 200 | 300 |
模板[ng] | 2 | 2 | 2 |
正向引物[μM] | 0.2 | 0.2 | 0.2 |
反向引物[μM] | 0.2 | 0.2 | 0.2 |
dNTP[μM] | 400 | 400 | 400 |
Taq缓冲液(10×储备溶液)[μL] | 10 | 10 | 10 |
MgCl2[μM] | 7 | 7 | 7 |
Taq聚合酶[U] | 8 | 8 | 8 |
MnCl2(1mM储备溶液)[μM] | 100 | 200 | 300 |
PCR级水[μL] | 41.4 | 31.4 | 21.4 |
将PCR产物在1%分析型TAE琼脂糖凝胶上进行检查,在37℃进行1h的DpnI消化以除去痕量的模板DNA,然后使用1%制备型TAE琼脂糖凝胶进行净化。将含有PCR产物的琼脂糖片用Freeze‘n’Squeeze管(BIORAD,Hercules,CA;目录#732-6166)清洗,然后根据制造商方案进行共沉淀(pelletpaint)程序(Novagen,catalog#69049-3)。同时,将质粒pGV1662通过NotI和SalI进行限制性内切酶消化,然后将消化混合物进行琼脂糖凝胶电泳并进行共沉淀。将各500ng的质粒和插入物混合在一起,进行共沉淀,重悬在6μLPCR级水中,并用于按一般方法中所述转化电感受态酿酒酵母细胞。
将得自100、200和300μM MnCl2文库的各自总共88个克隆与含亲本质粒pGV2476的四个克隆和含pGV1102的作为无ADH对照的三个克隆一起挑取到96孔板中。将一个孔留空,并作为无菌对照。如一般方法(用于高通量测定的96孔板中CEN.PK2的异源表达,ADH高通量活性测定)下所述筛选这些文库后,选择300μM文库,并按相同的方式筛选另外4,000个克隆。总共24个变体相比于野生型具有超过1.5倍的改善,并被选来一式三份地重新筛选。让其前十个变体如一般方法(酿酒酵母CEN.PK2中的异源表达)下所述在100mL培养基中生长和表达,以及如一般方法(ADH微滴定板测定)下所述测定它们在粗酵母提取物中的比活性。两个变体Ll_AdhA28E7-his6和Ll_AdhA30C11-his6与野生型Ll_AdhAhis6(0.1U/mg总裂解液蛋白质)相比表现出超过2倍的活性改善(分别为0.3和0.25U/mg总裂解液蛋白质),并更详细地进行了表征。
如一般方法(酵母细胞的质粒小量制备)下所述提取这两个变体中的质粒DNA,并经历DNA测序(Laragen,Los Angeles,CA),其揭露出每个变体存在两个突变,如表87中所列。这些突变中的两个(Y50F和L264V)位于活性位点附近,该活性位点为底物结合结构域(蓝绿色)和辅因子结合结构域(绿色)之间的间隙。突变I212T和N219Y位于辅因子结合结构域的表面上(如图17所示)。为了突出显示辅因子结合位点突变的位置,图17采用了关于结构比对的两个视图。
表87.存在于第一易错文库(第1代)的两个改进变体中的突变列表。
变体 | 突变 |
Ll_adhA28E7-his6 | N219Y,L264V |
Ll_adhA30C11-his6 | Y50F,I212T |
以较大的规模(各100mL培养物)分别由质粒pGV2475和pGV30C11表达两种酶变体Ll_AdhA28E7-his6和Ll_AdhA30C11-his6,进行纯化,以及更详细地表征,如一般方法(酿酒酵母CEN.PK2中的异源表达、由酿酒酵母CEN.PK2制备含ADH的提取物、ADH的纯化)下所述。将野生型Ll_AdhAhis6酶通过质粒pGV2476表达,并按相同的方式纯化。如一般方法(ADH比色皿测定)下所述,表征了酶的动力学性质。表88显示了用异丁醛和NADH测量的动力学参数。对于两个变体均观察到了降低的KM值,而只有Ll_AdhA28E7的kcat值得到了改善。
表88.与亲本酶相比的两个变体(第1代)对异丁醛的动力学参数。
如一般方法(热稳定性测量)下所述,测定了野生型酶和两个变体的热稳定性。所发现的突变除了对变体催化效率的有益效果外对变体的稳定性也具有积极影响。表89汇总了为亲本和变体测得的T50。
表89.亲本酶和变体的T50汇总。
变体 | T50[℃],15min |
Ll_AdhAhis6 | 54.4±0.5 |
Ll_AdhA28E7-his6 | 62.3±0.3 |
Ll_AdhA30C11-his6 | 57.6±0.6 |
实施例28:通过重组定向进化
以下实施例示出了改进ADH动力学性质的方法,并且还示出了此类改进ADH酶的动力学性质。
构建了第二基因文库(第2代)以重组存在于第一易错文库中的有益突变以及位于这些位点每一个的野生型残基(表90)。
表90.重组文库中所含的氨基酸突变。
氨基酸位置 | 野生型 | 突变 | 总数(包括野生型) |
50 | Y | F | 2 |
212 | I | T | 2 |
219 | Y | N | 2 |
264 | L | V | 2 |
使用以下引物产生四个PCR片段:RecombADHY50_rev和pGV1994ep_for(片段1)、RecombADHY50_for和RecombADHI212_Y219_rev(片段2)、RecombADHI212_Y219_for和RecombADHL264_rev(片段3)以及RecombADHL264_rev和pGV1994ep_rev(片段4)。将片段在分析型1%TAE凝胶上分析,进行DpnI消化,在1%制备型TAE琼脂糖凝胶上分离,进行Freeze’n’Squeeze(BIORAD)处理,最后进行共沉淀(Novagen)。干净的片段作为拼接PCR的模板。成功进行拼接PCR后,如实施例27中所述处理PCR产物,如实施例27中所述与pGV1662主链混合,并将混合物用于如实施例27-30的一般方法中所述转化酿酒酵母。挑取重组文库的八十个单一克隆,并在高通量筛选中与野生型和存在于易错文库中的两个变体进行比较。
将总共80个单一克隆与原始亲本和两个改进的变体一起挑取到96孔板中。如一般方法(用于高通量测定的96孔板中CEN.PK2的异源表达、ADH高通量活性测定)下所述筛选重组平板后,使均表现出与亲本Ll_AdhA28E7-his6或Ll_AdhA30C11-his6相比活性为至少两倍高的十二个变体如一般方法(酿酒酵母CEN.PK2中的异源表达)下所述在100mL培养基中生长和表达,以及如一般方法(ADH微滴定板测定)下所述测定了它们在粗酵母提取物中的活性。两个变体在粗提取物中具有非常相似的比活性。选择Ll_AdhARE1用于进一步的修饰,因为其活性优于Ll_AdhA28E7-his640%,优于Ll_AdhA30C11-his664%。
如一般方法(酵母细胞的质粒小量制备)下所述提取该变体中的质粒DNA,并经理DNA测序(Laragen,Los Angeles,CA),其揭露出突变Y50F、I212T和L264V(见于Ll_AdhARE1)有助于观察到的改善结果,然而第219位的突变对变体的活性不利,并且不存在于重组文库的任何改进变体中。
以较大的规模(各100mL培养物)由质粒pGV2477表达变体Ll_AdhARE1-his6,进行纯化,以及更详细地表征,如一般方法(酿酒酵母CEN.PK2中的异源表达、由酿酒酵母CEN.PK2制备含ADH的提取物、ADH的纯化)下所述。由质粒pGV2476表达野生型Ll_AdhAhis6酶,并按相同方式纯化。如一般方法(ADH比色皿测定)下所述,表征了酶的动力学性质。表91显示了用异丁醛和NADH测量的动力学参数。与Ll_AdhAhis6、Ll_AdhA28E7-his6、Ll_AdhA30C11-his6相比,对于Ll_AdhARE1-his6观察到了降低的KM和升高的kcat。
表91.对异丁醛测得的Ll_AdhARE1的生化特性。
变体L1_adhARE1-his6表现出61.6±0.1℃的T50值,其比wt的T50高5度,并且比该轮重组的最稳定亲本Ll_AdhA28E7-his6低约1度。
实施例29:通过随机诱变、定点饱和诱变和重组进行的乳酸乳球菌AdhA
定向进化
以下实施例示出了改进ADH动力学性质的方法,并且还描述了此类改进ADH酶的动力学性质。
Ll_adhARE1-his6基因作为第二轮易错PCR和筛选(第3代)的模板。筛选测定使用了0.125mM的异丁醛。以高通量方式,表达和筛选了根据以上实施例1通过200μM MnCl2使用易错PCR产生的文库的约3,000个克隆。选择多个筛选结果用于一式三份地重新筛选,并鉴定出两个变体Ll_AdhA7A4-his6和Ll_AdhA4A3-his6具有改善的活性。这些变体的突变示于表92中。
表92.第3代变体Ll_AdhA7A4-his6和Ll_AdhA4A3-his6中积累的突变列表。
变体 | 突变 |
Ll_AdhA7A4-his6 | Y50F,I212T,L264V,Q77R,V108A |
Ll_AdhA4A3-his6 | Y50F,I212T,L264V,Y113F |
在pH 7.0以生物学三重复测量了Ll_AdhA7A4-his6和Ll_AdhA4A3-his6以及亲本的裂解液中的比活性(U/mg)(表93)。
表93.pH 7.0时Ll_AdhA7A4-his6和Ll_AdhA4A3-his6的生化特性。
Ll_AdhA7A4-his6(59.4℃)和Ll_AdhA4A3-his6(57.6℃)的T50值均高于Ll_AdhAhis6并低于Ll_AdhARE1-his6。
在两轮易错PCR和一轮重组后,在六个位点的每一个进行了定点饱和诱变,从而产生了六个文库(文库50、77、108、113、212和264)。将最初的亲本Ll_AdhAhis6用作各NNK片段的模板。将各文库的两个片段用表4中所列的引物扩增(pGV1994ep_for和NNKADHF50_rev用于文库50的片段1,NNKADHF50_for和pGV1994ep_rev用于文库50的片段2;pGV1994ep_for和NNKADHR77_rev用于文库77的片段1,NNKADHR77_for和pGV1994ep_rev用于文库77的片段2;pGV1994ep_for和NNKADHA108_rev用于文库108的片段1,NNKADHA108_for和pGV1994ep_rev用于文库108的片段2;pGV1994ep_for和NNKADHF113_rev用于文库113的片段1,NNKADHF113_for和pGV1994ep_rev用于文库113的片段2;pGV1994ep_for和NNKADHT212_rev用于文库212的片段1,NNKADHT212_for和pGV1994ep_rev用于文库212的片段2;pGV1994ep_for和NNKADHV264_rev用于文库264的片段1,NNKADHV264_for和pGV1994ep_rev用于文库264的片段2),并且然后用作拼接PCR的模板。如前所述,对拼接PCR产物进行处理,以在酵母中产生NNK文库。对于每个NNK文库,挑取九十个克隆,然后单独进行筛选。重新筛选后,从酵母中对六个文库的九个克隆进行小量制备,将质粒用于转化大肠杆菌,并对所得的质粒进行测序。它们的裂解液活性和测序结果汇总在表94中。
表94.定点饱和诱变汇总(第4代)。
将存在于定点饱和诱变文库中的多个突变使用SOE PCR以组合方式重组,并使用非密码子优化的亲本pGV1947his构建文库。表85中所述的引物也考虑到了六个靶向位点的野生型序列。使用以下引物产生了六个片段:Recomb2F50Minilib_rev以及pGV1994ep_for(片段1),Recomb2F50Minilib_for以及Recomb2Q77Gen5_rev4、Recomb2R77Gen5_rev6和Recomb2S77Gen5_rev8的混合物(片段2),Recomb2Q77Gen5_for3、Recomb2R77Gen5_for5和Recomb2S77Gen5_for7的混合物以及Recomb2Y113 Gen5_rev10、Recomb2F113 Gen5_rev12和Recomb2G113Gen5_rev14的混合物(片段3),Recomb2Y113 Gen5_for9、Recomb2F113Gen5_for11和Recomb2G113 Gen5_for13的混合物以及Recomb2T212Mini_rev16(片段4),Recomb2T212 Mini_for15以及Recomb2V264Mini_rev18(片段5),和Recomb2V264 Mini_for17以及pGV1994ep_rev(片段6)。将片段PCR在分析型1%TAE凝胶上分析,并然后将产物在37℃进行1h的DpnI消化,在1%制备型TAE琼脂糖凝胶上分离,进行Freeze’n’Squeeze(BIORAD)处理,并且最后进行共沉淀(Novagen)。干净的片段作为拼接PCR的模板。成功进行拼接PCR后,使用同源重组(如上所述)创建文库。使用0.125mM的异丁醛浓度筛选了超过一千个单独的克隆。编制了由前60个变体组成的重新筛选平板,并用0.125mM异丁醛进行了测定。
选择了十个变体用于在100mL SC-URA培养基中表达以测定其在裂解液中的比活性。对其中四个进行了测序(参见表95的突变)、纯化以及更详细地表征(表96)。新的变体显示出与Ll_AdhARE1在裂解液中相似的比活性。值得注意的是,变体4A3作为具有高比活性的酶而突出。
表95.第5代变体中的突变列表。
变体 | 突变 |
Ll_AdhA1H7-his6 | Y50F,I212A,L264V,Y113F |
Ll_AdhA10F10-his6 | Y50F,I212T,L264V,Q77S,Y113F |
Ll_AdhA8F11-his6 | Y50F,I212A,L264V,Q77R,Y113F |
Ll_AdhA8D10-his6 | Y50F,I212V,L264V,Q77S,Y113F |
表96.第5代变体的生化特性。
实施例30:同源ADH酶的工程化
以下实施例示出了如何鉴定另外的ADH酶,并进行工程化以改善另外ADH酶的动力学性质。
按以下检索参数,使用乳酸乳球菌AdhA(SEQ ID NO:185)的氨基酸序列,通过公共可用数据库的BlastP检索鉴定了与乳酸乳球菌AdhA同源的酶:期望阈值=10,字长=3,矩阵=Blosum62,空位开放=11,空位扩展=1。选择了前一百个命中(代表具有约高于60%序列同一性的同源物),并列于表97中。通过以下参数,使用Vector NTI Advance 10.3.1的组件-多序列比对工具AlignX对序列进行了比对:空位开放罚分=10,空位扩展罚分=0.05,空位分离罚分范围=8。多序列比对表明对应于以下氨基酸的残基当中非常高的保守水平:(a)乳酸乳球菌AdhA(SEQ ID NO:185)第50位酪氨酸;(b)乳酸乳球菌AdhA(SEQ ID NO:185)第77位谷氨酰胺;(c)乳酸乳球菌AdhA(SEQ ID NO:185)第108位缬氨酸;(d)乳酸乳球菌AdhA(SEQ ID NO:185)第113位酪氨酸;(e)乳酸乳球菌AdhA(SEQ ID NO:185)第212位异亮氨酸;以及(f)乳酸乳球菌AdhA(SEQ ID NO:185)第264位亮氨酸,其中AdhA(SEQ ID NO:185)由乳酸乳球菌醇脱氢酶(ADH)基因adhA(SEQ ID NO:184)或其密码子优化形式(SEQ ID NO:206)编码。
表97.与乳酸乳球菌AdhA具有>60%序列同一性的同源酶
仅为了便于清晰理解而给出了上述详细说明,并不应理解为由其产生不必要的限制,因为修改对于本领域的技术人员而言将显而易见。
虽然已结合其具体实施方案对本发明进行了描述,但是应当理解能够进行进一步的修改,并且本申请旨在涵盖整体上遵循本发明原理的对发明的任何变型、使用或改型,并包括符合本发明所属领域已知或常规实践的和可应用于上文所述基本特征的以及落在所附权利要求范围内的与本公开的此类偏离。
本公开(包括本文所引用的每篇专利、专利申请和专利公开的权利要求、数据和/或附图)据此全文以引用方式并入本文。
Claims (165)
1.一种包含使用3-酮酸作为中间体的生物合成途径的重组微生物,其中所述重组微生物被工程化以降低或消除催化所述3-酮酸向3-羟基酸副产物转化的一种或多种酶的表达或活性。
2.根据权利要求1所述的重组微生物,其中所述3-酮酸中间体为乙酰乳酸并且所述3-羟基酸副产物为2,3-二羟基-2-甲基丁酸(DH2MB)。
3.根据权利要求2所述的重组微生物,其中来自乙酰乳酸的所述DH2MB碳得率与不包括降低或消除催化乙酰乳酸向DH2MB转化中涉及到的一种或多种酶的表达或活性的亲本微生物相比被降低至少约50%。
4.根据权利要求2所述的重组微生物,其中来自乙酰乳酸的所述DH2MB碳得率与不包括降低或消除催化乙酰乳酸向DH2MB转化中涉及到的一种或多种酶的表达或活性的亲本微生物相比被降低至少约75%。
5.根据权利要求2所述的重组微生物,其中来自乙酰乳酸的所述DH2MB碳得率与不包括降低或消除催化乙酰乳酸向DH2MB转化中涉及到的一种或多种酶的表达或活性的亲本微生物相比被降低至少约95%。
6.根据权利要求2所述的微生物,其中所述重组微生物产生乙酰乳酸衍生的产物。
7.根据权利要求6所述的重组微生物,其中所述乙酰乳酸衍生的产物选自异丁醇、2-丁醇、1-丁醇、2-丁酮、2,3-丁二醇、乙偶姻、二乙酰、缬氨酸、亮氨酸、泛酸、异丁烯、3-甲基-1-丁醇、4-甲基-1-戊醇和辅酶A。
8.根据权利要求1所述的重组微生物,其中所述3-酮酸中间体为2-乙酰-2-羟基丁酸并且所述3-羟基酸副产物为2-乙基-2,3-二羟基丁酸。
9.根据权利要求8所述的重组微生物,其中来自2-乙酰-2-羟基丁酸的所述2-乙基-2,3-二羟基丁酸碳得率与不包括降低或消除催化2-乙酰-2-羟基丁酸向2-乙基-2,3-二羟基丁酸转化中涉及到的一种或多种酶的表达或活性的亲本微生物相比被降低至少约50%。
10.根据权利要求8所述的重组微生物,其中来自2-乙酰-2-羟基丁酸的所述2-乙基-2,3-二羟基丁酸碳得率与不包括降低或消除催化2-乙酰-2-羟基丁酸向2-乙基-2,3-二羟基丁酸转化中涉及到的一种或多种酶的表达或活性的亲本微生物相比被降低至少约75%。
11.根据权利要求8所述的重组微生物,其中来自2-乙酰-2-羟基丁酸的所述2-乙基-2,3-二羟基丁酸碳得率与不包括降低或消除催化2-乙酰-2-羟基丁酸向2-乙基-2,3-二羟基丁酸转化中涉及到的一种或多种酶的表达或活性的亲本微生物相比被降低至少约95%。
12.根据权利要求8所述的重组微生物,其中所述重组微生物产生2-乙酰-2-羟基丁酸衍生的产物。
13.根据权利要求12所述的重组微生物,其中所述2-乙酰-2-羟基丁酸衍生的产物选自2-甲基-1-丁醇、异亮氨酸、3-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-己醇和5-甲基-1-庚醇。
14.根据前述权利要求中任一项所述的重组微生物,其中所述催化3-酮酸向3-羟基酸副产物转化的酶为3-酮酸还原酶。
15.根据权利要求14所述的重组微生物,其中所述3-酮酸还原酶为酿酒酵母(S.cerevisiae)YMR226(SEQ ID NO:1)或其同源物或变体。
16.根据权利要求14所述的重组微生物,其中所述3-酮酸还原酶选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23或其同源物或变体。
17.一种包含使用醛作为中间体的生物合成途径的重组微生物,其中所述重组微生物被工程化以降低或消除催化所述醛向酸副产物转化的一种或多种酶的表达或活性。
18.根据权利17所述的重组微生物,其中来自所述醛中间体的所述酸副产物碳得率与不包括降低或消除催化醛向酸副产物转化中涉及到的一种或多种酶的表达或活性的亲本微生物相比被降低至少35%。
19.根据权利17所述的重组微生物,其中来自所述醛中间体的所述酸副产物碳得率与不包括降低或消除催化醛向酸副产物转化中涉及到的一种或多种酶的表达或活性的亲本微生物相比被降低至少75%。
20.根据权利17所述的重组微生物,其中来自所述醛中间体的所述酸副产物碳得率与不包括降低或消除催化醛向酸副产物转化中涉及到的一种或多种酶的表达或活性的亲本微生物相比被降低至少95%。
21.根据权利要求17所述的重组微生物,其中所述使用醛作为中间体的生物合成途径选自以下物质的生物合成途径:异丁醇、1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、1-丙醇、1-戊醇、1-己醇、3-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-己醇和5-甲基-1-庚醇。
22.根据权利要求17-21中任一项所述的重组微生物,其中所述催化醛向酸副产物转化的酶为醛脱氢酶。
23.根据权利要求22所述的重组微生物,其中所述醛脱氢酶为酿酒酵母ALD6(SEQ ID NO:25)或其同源物或变体。
24.根据权利要求22所述的重组微生物,其中所述醛脱氢酶选自SEQID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41或其同源物或变体。
25.一种包含使用3-酮酸和醛作为中间体的生物合成途径的重组微生物,其中所述重组微生物:
(i)被工程化以降低或消除催化所述3-酮酸向3-羟基酸副产物转化的一种或多种酶的表达或活性;以及
(ii)被工程化以降低或消除催化所述醛向酸副产物转化的一种或多种酶的表达或活性。
26.根据权利要求25所述的重组微生物,其中所述3-酮酸中间体为乙酰乳酸并且所述3-羟基酸副产物为2,3-二羟基-2-甲基丁酸(DH2MB)。
27.根据权利要求26所述的重组微生物,其中来自乙酰乳酸的所述DH2MB碳得率与不包括降低或消除催化乙酰乳酸向DH2MB转化中涉及到的一种或多种酶的表达或活性的亲本微生物相比被降低至少约50%。
28.根据权利要求26所述的重组微生物,其中来自乙酰乳酸的所述DH2MB碳得率与不包括降低或消除催化乙酰乳酸向DH2MB转化中涉及到的一种或多种酶的表达或活性的亲本微生物相比被降低至少约75%。
29.根据权利要求26所述的重组微生物,其中来自乙酰乳酸的所述DH2MB碳得率与不包括降低或消除催化乙酰乳酸向DH2MB转化中涉及到的一种或多种酶的表达或活性的亲本微生物相比被降低至少约95%。
30.根据权利要求26所述的微生物,其中所述重组微生物产生乙酰乳酸衍生的产物。
31.根据权利要求30所述的重组微生物,其中所述乙酰乳酸衍生的产物选自异丁醇、1-丁醇和3-甲基-1-丁醇。
32.根据权利要求25所述的重组微生物,其中所述3-酮酸中间体为2-乙酰-2-羟基丁酸并且所述3-羟基酸副产物为2-乙基-2,3-二羟基丁酸。
33.根据权利要求32所述的重组微生物,其中来自2-乙酰-2-羟基丁酸的所述2-乙基-2,3-二羟基丁酸碳得率与不包括降低或消除催化2-乙酰-2-羟基丁酸向2-乙基-2,3-二羟基丁酸转化中涉及到的一种或多种酶的表达或活性的亲本微生物相比被降低至少约50%。
34.根据权利要求32所述的重组微生物,其中来自2-乙酰-2-羟基丁酸的所述2-乙基-2,3-二羟基丁酸碳得率与不包括降低或消除催化2-乙酰-2-羟基丁酸向2-乙基-2,3-二羟基丁酸转化中涉及到的一种或多种酶的表达或活性的亲本微生物相比被降低至少约75%。
35.根据权利要求32所述的重组微生物,其中来自2-乙酰-2-羟基丁酸的所述2-乙基-2,3-二羟基丁酸碳得率与不包括降低或消除催化2-乙酰-2-羟基丁酸向2-乙基-2,3-二羟基丁酸转化中涉及到的一种或多种酶的表达或活性的亲本微生物相比被降低至少约95%。
36.根据权利要求32所述的重组微生物,其中所述重组微生物产生2-乙酰-2-羟基丁酸衍生的产物。
37.根据权利要求36所述的重组微生物,其中所述2-乙酰-2-羟基丁酸衍生的产物选自2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-己醇和5-甲基-1-庚醇。
38.根据权利要求25-37中任一项所述的重组微生物,其中所述催化3-酮酸向3-羟基酸副产物转化的酶为3-酮酸还原酶。
39.根据权利要求38所述的重组微生物,其中所述3-酮酸还原酶为酿酒酵母YMR226(SEQ ID NO:1)或其同源物或变体。
40.根据权利要求38所述的重组微生物,其中所述3-酮酸还原酶选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23或其同源物或变体。
41.根据权利要求25-40中任一项所述的重组微生物,其中来自所述醛中间体的所述酸副产物碳得率与不包括降低或消除催化醛向酸副产物转化中涉及到的一种或多种酶的表达或活性的亲本微生物相比被降低至少约35%。
42.根据权利要求25-40中任一项所述的重组微生物,其中来自所述醛中间体的所述酸副产物碳得率与不包括降低或消除催化醛向酸副产物转化中涉及到的一种或多种酶的表达或活性的亲本微生物相比被降低至少约75%。
43.根据权利要求25-40中任一项所述的重组微生物,其中来自所述醛中间体的所述酸副产物碳得率与不包括降低或消除催化醛向酸副产物转化中涉及到的一种或多种酶的表达或活性的亲本微生物相比被降低至少约95%。
44.根据权利要求25-43中任一项所述的重组微生物,其中所述催化醛向酸副产物转化的酶为醛脱氢酶。
45.根据权利要求44所述的重组微生物,其中所述醛脱氢酶为酿酒酵母ALD6(SEQ ID NO:25)或其同源物或变体。
46.根据权利要求44所述的重组微生物,其中所述醛脱氢酶选自SEQID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41或其同源物或变体。
47.根据前述权利要求中任一项所述的重组微生物,其中所述重组微生物被工程化以降低或消除丙酮酸脱羧酶(PDC)活性。
48.根据前述权利要求中任一项所述的重组微生物,其中所述重组微生物被工程化以降低或消除甘油3-磷酸脱氢酶(GPD)活性。
49.根据前述权利要求中任一项所述的重组微生物,其中所述重组微生物为酵母微生物。
50.根据权利要求49所述的重组微生物,其中所述重组微生物为酵母属(Saccharomyces)进化枝的酵母微生物。
51.根据权利要求49所述的重组微生物,其中所述重组微生物为Saccharomyces sensu stricto微生物。
52.根据权利要求51所述的重组微生物,其中所述Saccharomyces sensustricto微生物选自由下列组成的组:酿酒酵母、库德里阿兹威酵母(S.kudriavzevii)、S.mikatae、贝酵母(S.bayanus)、葡萄汁酵母(S.uvarum)、S.carocanis及其杂交体。
53.根据权利要求49所述的重组微生物,其中所述重组微生物为Crabtree-阴性酵母微生物。
54.根据权利要求53所述的重组微生物,其中所述Crabtree-阴性酵母微生物归类为选自由下列组成的组的属:酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、伊萨酵母属(Issatchenkia)和假丝酵母属(Candida)。
55.根据权利要求54所述的重组微生物,其中所述Crabtree-阴性酵母微生物选自由下列组成的组:可鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、异常毕赤酵母(Pichia anomala)、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)、库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)、东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)、异常汉逊酵母(Hansenula anomala)、产朊假丝酵母(Candida utilis)和克鲁雄酵母(Kluyveromyces waltii)。
56.根据权利要求49所述的重组微生物,其中所述重组微生物为Crabtree-阳性酵母微生物。
57.根据权利要求56所述的重组微生物,其中所述Crabtree-阳性酵母微生物归类为选自由下列组成的组的属:酵母属、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、毕赤酵母属、假丝酵母属和裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)。
58.根据权利要求57所述的重组微生物,其中所述Crabtree-阳性酵母微生物选自由下列组成的组:酿酒酵母、葡萄汁酵母、贝酵母、奇异酵母(Saccharomyces paradoxus)、芽殖酵母(Saccharomyces castelli)、耐热克鲁维酵母(Kluyveromyces thermotolerans)、光滑假丝酵母(Candida glabrata)、Zygosaccharomyces bailli、鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)、汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastorius)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和葡萄汁酵母。
59.根据权利要求49所述的重组微生物,其中所述重组微生物为后-WGD(全基因组倍增)酵母微生物。
60.根据权利要求59所述的重组微生物,其中所述后-WGD酵母微生物归类为选自由下列组成的组的属:酵母属或假丝酵母属。
61.根据权利要求60所述的重组微生物,其中所述后-WGD酵母微生物选自由下列组成的组:酿酒酵母、葡萄汁酵母、贝酵母、奇异酵母、芽殖酵母和光滑假丝酵母。
62.根据权利要求49所述的重组微生物,其中所述重组微生物为前-WGD(全基因组倍增)酵母微生物。
63.根据权利要求62所述的重组微生物,其中所述前-WGD酵母微生物归类为选自由下列组成的组的属:酵母属、克鲁维酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属、德巴利酵母属、汉逊酵母属、伊萨酵母属、管囊酵母属(Pachysolen)、耶氏酵母属(Yarrowia)和裂殖酵母属。
64.根据权利要求63所述的重组微生物,其中所述前-WGD酵母微生物选自由下列组成的组:可鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、耐热克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、克鲁雄酵母、乳酸克鲁维酵母、热带假丝酵母(Candidatropicalis)、巴斯德毕赤酵母、异常毕赤酵母、树干毕赤酵母、库德里阿兹威毕赤酵母、东方伊萨酵母、汉逊德巴利酵母、异常汉逊酵母、嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilis)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)和粟酒裂殖酵母。
65.一种产生由3-酮酸中间体衍生的有益代谢产物的方法,包括:
(a)提供根据权利要求1-16和25-64中任一项所述的重组微生物;
(b)在含有提供所述碳源的原料的培养基中培养所述重组微生物,直到产生可回收量的所述有益代谢产物;以及
(c)回收所述有益代谢产物。
66.根据权利要求65所述的方法,其中所述3-酮酸中间体为乙酰乳酸,并且所述有益代谢产物选自异丁醇、2-丁醇、1-丁醇、2-丁酮、2,3-丁二醇、乙偶姻、二乙酰、缬氨酸、亮氨酸、泛酸、异丁烯、3-甲基-1-丁醇、4-甲基-1-戊醇和辅酶A。
67.根据权利要求65所述的方法,其中所述3-酮酸中间体为2-乙酰-2-羟基丁酸,并且所述有益代谢产物选自2-甲基-1-丁醇、异亮氨酸、3-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-己醇和5-甲基-1-庚醇。
68.一种产生由醛中间体衍生的有益代谢产物的方法,包括:
(a)提供根据权利要求17-64任一项所述的重组微生物;
(b)在含有提供所述碳源的原料的培养基中培养所述重组微生物,直到产生可回收量的所述有益代谢产物;以及
(c)回收所述有益代谢产物。
69.根据权利要求68所述的方法,其中所述醛中间体选自:异丁醛、1-丁醛、2-甲基-1-丁醛、3-甲基-1-丁醛、1-丙醛、1-戊醛、1-己醛、3-甲基-1-戊醛、4-甲基-1-戊醛、4-甲基-1-己醛和5-甲基-1-庚醛。
70.根据权利要求69所述的方法,其中所述有益代谢产物选自异丁醇、1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、1-丙醇、1-戊醇、1-己醇、3-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-己醇和5-甲基-1-庚醇。
71.一种产生由3-酮酸和醛中间体衍生的有益代谢产物的方法,包括:
(a)提供根据权利要求25-64任一项所述的重组微生物;
(b)在含有提供所述碳源的原料的培养基中培养所述重组微生物,直到产生可回收量的所述有益代谢产物;以及
(c)回收所述有益代谢产物。
72.根据权利要求71所述的方法,其中所述3-酮酸中间体为乙酰乳酸,并且所述有益代谢产物选自异丁醇、1-丁醇和3-甲基-1-丁醇。
73.根据权利要求71所述的方法,其中所述3-酮酸中间体为2-乙酰-2-羟基丁酸,并且所述有益代谢产物选自2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-己醇和5-甲基-1-庚醇。
74.一种包含产生异丁醇的代谢途径的重组微生物,其中所述重组微生物被工程化以降低或消除催化乙酰乳酸向2,3-二羟基-2-甲基丁酸(DH2MB)转化的一种或多种酶的表达或活性。
75.根据权利要求74所述的重组微生物,其中来自乙酰乳酸的所述DH2MB碳得率与不包括降低或消除催化乙酰乳酸向DH2MB转化中涉及到的一种或多种酶的表达或活性的亲本微生物相比被降低至少约50%。
76.根据权利要求74所述的重组微生物,其中来自乙酰乳酸的所述DH2MB碳得率与不包括降低或消除催化乙酰乳酸向DH2MB转化中涉及到的一种或多种酶的表达或活性的亲本微生物相比被降低至少约75%。
77.根据权利要求74所述的重组微生物,其中来自乙酰乳酸的所述DH2MB碳得率与不包括降低或消除催化乙酰乳酸向DH2MB转化中涉及到的一种或多种酶的表达或活性的亲本微生物相比被降低至少约95%。
78.根据权利要求74-77任一项所述的重组微生物,其中所述催化乙酰乳酸向DH2MB转化的酶为3-酮酸还原酶。
79.根据权利要求78所述的重组微生物,其中所述3-酮酸还原酶为酿酒酵母YMR226(SEQ ID NO:1)或其同源物或变体。
80.根据权利要求78所述的重组微生物,其中所述3-酮酸还原酶选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23或其同源物或变体。
81.一种包含产生异丁醇的代谢途径的重组微生物,其中所述重组微生物被工程化以降低或消除催化异丁醛向异丁酸转化的一种或多种酶的表达或活性。
82.根据权利要求81所述的重组微生物,其中来自异丁醛的所述异丁酸碳得率与不包括降低或消除催化异丁醛向异丁酸转化中涉及到的一种或多种酶的表达或活性的亲本微生物相比被降低至少35%。
83.根据权利要求81所述的重组微生物,其中来自异丁醛的所述异丁酸碳得率与不包括降低或消除催化异丁醛向异丁酸转化中涉及到的一种或多种酶的表达或活性的亲本微生物相比被降低至少75%。
84.根据权利要求81所述的重组微生物,其中来自异丁醛的所述异丁酸碳得率与不包括降低或消除催化异丁醛向异丁酸转化中涉及到的一种或多种酶的表达或活性的亲本微生物相比被降低至少95%。
85.根据权利要求81-84任一项所述的重组微生物,其中所述催化异丁醛向异丁酸转化的酶为醛脱氢酶。
86.根据权利要求85所述的重组微生物,其中所述醛脱氢酶为酿酒酵母ALD6(SEQ ID NO:25)或其同源物或变体。
87.根据权利要求86所述的重组微生物,其中所述醛脱氢酶选自SEQID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41或其同源物或变体。
88.一种包含产生异丁醇的代谢途径的重组微生物,其中所述重组微生物
(i)被工程化以降低或消除催化乙酰乳酸向2,3-二羟基-2-甲基丁酸(DH2MB)转化的一种或多种酶的表达或活性;以及
(ii)被工程化以降低或消除催化异丁醛向异丁酸转化的一种或多种酶的表达或活性。
89.根据权利要求88所述的重组微生物,其中来自乙酰乳酸的所述DH2MB碳得率与不包括降低或消除催化乙酰乳酸向DH2MB转化中涉及到的一种或多种酶的表达或活性的亲本微生物相比被降低至少约50%。
90.根据权利要求88所述的重组微生物,其中来自乙酰乳酸的所述DH2MB碳得率与不包括降低或消除催化乙酰乳酸向DH2MB转化中涉及到的一种或多种酶的表达或活性的亲本微生物相比被降低至少约75%。
91.根据权利要求88所述的重组微生物,其中来自乙酰乳酸的所述DH2MB碳得率与不包括降低或消除催化乙酰乳酸向DH2MB转化中涉及到的一种或多种酶的表达或活性的亲本微生物相比被降低至少约95%。
92.根据权利要求88-91中任一项所述的重组微生物,其中所述催化乙酰乳酸向DH2MB转化的酶为3-酮酸还原酶。
93.根据权利要求92所述的重组微生物,其中所述3-酮酸还原酶为酿酒酵母YMR226(SEQ ID NO:1)或其同源物或变体。
94.根据权利要求92所述的重组微生物,其中所述3-酮酸还原酶选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23或其同源物或变体。
95.根据权利要求88所述的重组微生物,其中来自异丁醛的所述异丁酸碳得率与不包括降低或消除催化异丁醛向异丁酸转化中涉及到的一种或多种酶的表达或活性的亲本微生物相比被降低至少35%。
96.根据权利要求88所述的重组微生物,其中来自异丁醛的所述异丁酸碳得率与不包括降低或消除催化异丁醛向异丁酸转化中涉及到的一种或多种酶的表达或活性的亲本微生物相比被降低至少75%。
97.根据权利要求88所述的重组微生物,其中来自异丁醛的所述异丁酸碳得率与不包括降低或消除催化异丁醛向异丁酸转化中涉及到的一种或多种酶的表达或活性的亲本微生物相比被降低至少95%。
98.根据权利要求88-97中任一项所述的重组微生物,其中所述催化异丁醛向异丁酸转化的酶为醛脱氢酶。
99.根据权利要求98所述的重组微生物,其中所述醛脱氢酶为酿酒酵母ALD6(SEQ ID NO:25)或其同源物或变体。
100.根据权利要求98所述的重组微生物,其中所述醛脱氢酶选自SEQID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41或其同源物或变体。
101.根据权利要求88-100中任一项所述的重组微生物,其中所述重组微生物被工程化以降低或消除丙酮酸脱羧酶(PDC)活性。
102.根据权利要求88-101中任一项所述的重组微生物,其中所述重组微生物被工程化以降低或消除甘油3-磷酸脱氢酶(GPD)活性。
103.根据权利要求88-102中任一项所述的重组微生物,其中所述重组微生物为酵母微生物。
104.根据权利要求103所述的重组微生物,其中所述重组微生物为酵母属进化枝的酵母微生物。
105.根据权利要求103所述的重组微生物,其中所述重组微生物为Saccharomyces sensu stricto微生物。
106.根据权利要求105所述的重组微生物,其中所述Saccharomycessensu stricto微生物选自由下列组成的组:酿酒酵母、库德里阿兹威酵母、S.mikatae、贝酵母、葡萄汁酵母、S.carocanis及其杂交体。
107.根据权利要求103所述的重组微生物,其中所述重组微生物为Crabtree-阴性酵母微生物。
108.根据权利要求107所述的重组微生物,其中所述Crabtree-阴性酵母微生物归类为选自由下列组成的组的属:酵母属、克鲁维酵母属)、毕赤酵母属、汉逊酵母属)、伊萨酵母属和假丝酵母属。
109.根据权利要求108所述的重组微生物,其中所述Crabtree-阴性酵母微生物选自由下列组成的组:可鲁弗酵母、乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、异常毕赤酵母、树干毕赤酵母、库德里阿兹威毕赤酵母、东方伊萨酵母、异常汉逊酵母、产朊假丝酵母和克鲁雄酵母。
110.根据权利要求103所述的重组微生物,其中所述重组微生物为Crabtree-阳性酵母微生物。
111.根据权利要求110所述的重组微生物,其中所述Crabtree-阳性酵母微生物归类为选自由下列组成的组的属:酵母属、克鲁维酵母属、接合酵母属、德巴利酵母属、毕赤酵母属、假丝酵母属和裂殖酵母属。
112.根据权利要求111所述的重组微生物,其中所述Crabtree-阳性酵母微生物选自由下列组成的组:酿酒酵母、葡萄汁酵母、贝酵母、奇异酵母、芽殖酵母、耐热克鲁维酵母、光滑假丝酵母、Zygosaccharomyces bailli、鲁氏接合酵母、汉逊德巴利酵母、巴斯德毕赤酵母、粟酒裂殖酵母和葡萄汁酵母。
113.根据权利要求103所述的重组微生物,其中所述重组微生物为后-WGD(全基因组倍增)酵母微生物。
114.根据权利要求113所述的重组微生物,其中所述后-WGD酵母微生物归类为选自由下列组成的组的属:酵母属或假丝酵母属。
115.根据权利要求114所述的重组微生物,其中所述后-WGD酵母微生物选自由下列组成的组:酿酒酵母、葡萄汁酵母、贝酵母、奇异酵母、芽殖酵母和光滑假丝酵母。
116.根据权利要求103所述的重组微生物,其中所述重组微生物为前-WGD(全基因组倍增)酵母微生物。
117.根据权利要求116所述的重组微生物,其中所述前-WGD酵母微生物归类为选自由下列组成的组的属:酵母属、克鲁维酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属、德巴利酵母属、汉逊酵母属、伊萨酵母属、管囊酵母属、耶氏酵母属和裂殖酵母属。
118.根据权利要求117所述的重组微生物,其中所述前-WGD酵母微生物选自由下列组成的组:可鲁弗酵母、耐热克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、克鲁雄酵母、乳酸克鲁维酵母、热带假丝酵母、巴斯德毕赤酵母、异常毕赤酵母、树干毕赤酵母、库德里阿兹威毕赤酵母、东方伊萨酵母、汉逊德巴利酵母、异常汉逊酵母、嗜鞣管囊酵母、解脂耶氏酵母和粟酒裂殖酵母。
119.一种产生异丁醇的方法,包括:
(a)提供根据权利要求74-118中任一项所述的重组微生物;
(b)在含有提供所述碳源的原料的培养基中培养所述重组微生物,直到产生可回收量的异丁醇;以及
(c)回收所述异丁醇。
120.一种包含使用3-酮酸作为中间体的生物合成途径的重组微生物,其中所述重组微生物:
(a)被工程化以降低或消除催化所述3-酮酸向3-羟基酸副产物转化的一种或多种酶的表达或活性;和/或
(b)基本上不含催化3-酮酸向3-羟基酸副产物转化的酶。
121.一种包含使用醛作为中间体的生物合成途径的重组微生物,其中所述重组微生物:
(a)被工程化以降低或消除催化所述醛中间体向酸副产物转化的一种或多种酶的表达或活性;和/或
(b)基本上不含催化醛中间体向酸副产物转化的酶。
122.一种包含使用3-酮酸和醛作为中间体的生物合成途径的重组微生物,其中所述重组微生物:
(a)被工程化以降低或消除催化所述3-酮酸向3-羟基酸副产物转化的一种或多种酶的表达或活性;和/或
(b)基本上不含催化3-酮酸向3-羟基酸副产物转化的酶;以及
(c)被工程化以降低或消除催化所述醛中间体向酸副产物转化的一种或多种酶的表达或活性;和/或
(d)基本上不含催化醛中间体向酸副产物转化的酶。
123.一种包含产生异丁醇的代谢途径的重组微生物,其中所述重组微生物:
(a)被工程化以降低或消除催化乙酰乳酸向2,3-二羟基-2-甲基丁酸(DH2MB)转化的酶的表达或活性;和/或
(b)基本上不含催化乙酰乳酸向2,3-二羟基-2-甲基丁酸(DH2MB)转化的酶。
124.一种包含产生异丁醇的代谢途径的重组微生物,其中所述重组微生物:
(a)被工程化以降低或消除催化异丁醛向异丁酸转化的一种或多种酶的表达或活性;和/或
(b)基本上不含催化异丁醛向异丁酸转化的酶。
125.一种包含产生异丁醇的代谢途径的重组微生物,其中所述重组微生物:
(a)被工程化以降低或消除催化乙酰乳酸向2,3-二羟基-2-甲基丁酸(DH2MB)转化的酶的表达或活性;和/或
(b)基本上不含催化乙酰乳酸向2,3-二羟基-2-甲基丁酸(DH2MB)转化的酶;以及
(c)被工程化以降低或消除催化异丁醛向异丁酸转化的一种或多种酶的表达或活性;和/或
(d)基本上不含催化异丁醛向异丁酸转化的酶。
126.一种重组微生物,包含:
(a)编码具有乙酰乳酸合酶活性的胞质内局限性多肽的基因,并且其中所述细胞将丙酮酸转化为乙酰乳酸;以及
(b)过表达的酮醇酸还原异构酶,其中所述KARI已被工程化以表现出与野生型或亲本KARI相比减小的乙酰乳酸KM和/或增大的乙酰乳酸kcat。
127.一种重组微生物,包含:
(a)编码具有至少0.5U/mg裂解液乙酰乳酸合酶活性的胞质内局限性多肽的基因,并且其中所述细胞将丙酮酸转化为乙酰乳酸;以及
(b)过表达的酮醇酸还原异构酶(KARI),其中所述KARI具有至少0.03U/mg裂解液KARI活性。
128.一种重组微生物,包含:
(a)编码具有至少0.5U/mg裂解液乙酰乳酸合酶活性的胞质内局限性多肽的基因,并且其中所述细胞将丙酮酸转化为乙酰乳酸;以及
(b)过表达的二羟酸脱水酶(DHAD),其中所述DHAD具有至少0.03U/mg裂解液DHAD活性。
129.一种重组微生物,包含:
(a)编码具有乙酰乳酸合酶活性的胞质内局限性多肽的基因,并且其中所述细胞将丙酮酸转化为乙酰乳酸;
(b)催化乙酰乳酸向2,3-二羟基-2-甲基丁酸(DH2MB)转化中涉及到的一种或多种内源性蛋白质的活性或表达的降低或缺失;以及
(c)过表达的酮醇酸还原异构酶。
130.一种包含产生异丁醇的代谢途径的重组微生物,其中所述重组微生物过表达能够将2,3-二羟基-2-甲基丁酸(DH2MB)转化成乙酰乳酸的内源或异源蛋白质。
131.一种包含产生异丁醇的代谢途径的重组微生物,其中所述重组微生物过表达能够将2,3-二羟基-2-甲基丁酸(DH2MB)转化成2,3-二羟基异戊酸(DHIV)的内源或异源蛋白质。
132.一种用于产生2,3-二羟基-2-甲基丁酸(DH2MB)的重组微生物,其中所述重组微生物过表达能够将乙酰乳酸转化成2,3-二羟基-2-甲基丁酸(DH2MB)的一种或多种酶。
133.根据权利要求132所述的重组微生物,其中所述能够将乙酰乳酸转化成2,3-二羟基-2-甲基丁酸(DH2MB)的酶为3-酮酸还原酶。
134.根据权利要求133所述的重组微生物,其中所述3-酮酸还原酶为酿酒酵母YMR226(SEQ ID NO:1)或其同源物或变体。
135.根据权利要求133所述的重组微生物,其中所述3-酮酸还原酶选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23或其同源物或变体。
136.一种用于产生2,3-二羟基-2-甲基丁酸(DH2MB)的方法,包括:
(a)提供根据权利要求132-135中任一项所述的重组微生物;
(b)在含有提供所述碳源的原料的培养基中培养所述重组微生物,直到产生可回收量的DH2MB;以及
(c)回收所述DH2MB。
137.一种用于产生2-乙基-2,3-二羟基丁酸的重组微生物,其中所述重组微生物过表达能够将2-乙酰-2-羟基丁酸转化成2-乙基-2,3-二羟基丁酸的一种或多种酶。
138.根据权利要求137所述的重组微生物,其中所述能够将2-乙酰-2-羟基丁酸转化成2-乙基-2,3-二羟基丁酸的酶为3-酮酸还原酶。
139.根据权利要求138所述的重组微生物,其中所述3-酮酸还原酶为酿酒酵母YMR226(SEQ ID NO:1)或其同源物或变体。
140.根据权利要求138所述的重组微生物,其中所述3-酮酸还原酶选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23或其同源物或变体。
141.一种用于产生2-乙基-2,3-二羟基丁酸的方法,包括:
(a)提供根据权利要求137-140中任一项所述的重组微生物;
(b)在含有提供所述碳源的原料的培养基中培养所述重组微生物,直到产生可回收量的2-乙基-2,3-二羟基丁酸;以及
(c)回收所述2-乙基-2,3-二羟基丁酸。
142.一种用于产生酸产物的重组微生物,其中所述重组微生物过表达能够将醛转化成酸副产物的一种或多种酶。
143.根据权利要求142所述的重组微生物,其中所述催化醛向酸副产物转化的酶为醛脱氢酶。
144.根据权利要求143所述的重组微生物,其中所述醛脱氢酶为酿酒酵母ALD6(SEQ ID NO:25)或其同源物或变体。
145.根据权利要求143所述的重组微生物,其中所述醛脱氢酶选自SEQID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41或其同源物或变体。
146.一种用于产生酸产物的方法,包括:
(a)提供根据权利要求142-145中任一项所述的重组微生物;
(b)在含有提供所述碳源的原料的培养基中培养所述重组微生物,直到产生可回收量的所述酸产物;以及
(c)回收所述酸产物。
147.根据权利要求146所述的方法,其中所述酸副产物选自异丁酸、丁酸、2-甲基-1-丁酸、3-甲基-1-丁酸、丙酸、戊酸、己酸、3-甲基-1-戊酸、4-甲基-1-戊酸、4-甲基-1-己酸和5-甲基-1-庚酸。
148.一种在对应于选自由下列组成的组的氨基酸的位置包含一种或多种修饰的修饰醇脱氢酶(ADH):(a)野生型乳酸乳球菌(L.lactis)AdhA(SEQ IDNO:2)第50位酪氨酸;(b)野生型乳酸乳球菌AdhA第77位谷氨酰胺;(c)野生型乳酸乳球菌AdhA第108位缬氨酸;(d)野生型乳酸乳球菌AdhA第113位酪氨酸;(e)野生型乳酸乳球菌AdhA第212位异亮氨酸;以及(f)野生型乳酸乳球菌AdhA第264位亮氨酸。
149.根据权利要求148所述的修醇脱氢酶(ADH),其中所述第50位酪氨酸残基被苯丙氨酸或色氨酸残基替代。
150.根据权利要求148所述的修饰醇脱氢酶(ADH),其中所述第77位谷氨酰胺残基被精氨酸或丝氨酸残基替代。
151.根据权利要求148所述的修饰醇脱氢酶(ADH),其中所述第108位缬氨酸残基被丝氨酸或丙氨酸残基替代。
152.根据权利要求148所述的修饰醇脱氢酶(ADH),其中所述第113位酪氨酸残基被苯丙氨酸或甘氨酸残基替代。
153.根据权利要求148所述的修饰醇脱氢酶(ADH),其中所述第212位异亮氨酸残基被苏氨酸、丙氨酸或缬氨酸残基替代。
154.根据权利要求148所述的修饰醇脱氢酶(ADH),其中所述第264位亮氨酸残基被缬氨酸残基替代。
155.根据权利要求148所述的修饰醇脱氢酶(ADH),其中所述修饰ADH将异丁醛转化成异丁醇的催化效率与所述野生型ADH相比增强至少约50%。
156.根据权利要求148所述的修饰醇脱氢酶(ADH),其中所述修饰ADH将异丁醛转化成异丁醇的催化效率与所述野生型ADH相比增强至少约100%。
157.根据权利要求148所述的修饰醇脱氢酶(ADH),其中所述修饰ADH将异丁醛转化成异丁醇的催化效率与所述野生型ADH相比增强至少约200%。
158.根据权利要求148所述的修饰醇脱氢酶(ADH),其中所述ADH衍生自选自以下的属:乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、片球菌属(Pediococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、纤毛菌属(Leptotrichia)、放线杆菌属(Actinobacillus)、链球菌属(Streptococcus)、链杆菌属(Streptobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、艾肯菌属(Eikenella)、魏斯氏菌属(Weissella)、金氏菌属(Kingella)、罗氏菌属(Rothia)和微小杆菌属(Exiguobacterium)。
159.根据权利要求158所述的修饰醇脱氢酶(ADH),其中对所述ADH进行密码子优化以在宿主细胞中表达。
160.根据权利要求159所述的修饰醇脱氢酶(ADH),其中所述宿主细胞为酵母。
161.根据权利要求159所述的修饰醇脱氢酶(ADH),其中所述宿主细胞为大肠杆菌(E.coli)。
162.一种用编码根据权利要求148-161中任一项所述的修饰醇脱氢酶(ADH)的核酸构建体转化的重组微生物。
163.根据权利要求15所述的重组微生物,其中所述重组微生物包含产生异丁醇的代谢途径,所述途径包含一种或多种选自以下的异丁醇代谢途径酶:乙酰乳酸合酶(ALS)、酮醇酸还原异构酶(KARI)、二羟酸脱水酶(DHAD)和2-酮酸脱羧酶(KIVD)。
164.根据权利要求163所述的重组微生物,其中所述重组微生物为酵母微生物。
165.一种产生异丁醇的方法,包括:
(a)提供根据权利要求148-164中任一项所述的重组微生物;以及
(b)在含有提供所述碳源的原料的培养基中培养所述重组微生物,直到产生可回收量的所述异丁醇。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20130109 |