CN103562375A - 用于产生异丁酸的细胞和方法 - Google Patents
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Abstract
本文公开了用于可再生性产生异丁酸的细胞和方法。在某些情况下，所述细胞可包含异源DNA，所述异源DNA编码至少一种催化异丁醛转化为异丁酸的酶。在其它情况下，所述细胞可包含遗传修饰的酶，与所述酶的野生型形式相比，所述酶更大程度地催化异丁醛转化为异丁酸。在其它情况下，所述细胞可包含一种或多种催化2-酮缬氨酸转化为异丁酸的酶。一般而言，所述方法包括在包含碳源的培养基中培养所述细胞，其中所述细胞能够将所述碳源转化成异丁酸。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2011年2月11提交的美国临时专利申请序号61/441,939的优先权。
背景
异丁酸(isobutyric acid) (本文亦称为“isobutyrate”)被用于纤维、树脂、塑料和染料的生产，并且在药物、化妆品和食品添加剂的制备中被用作中间体。异丁酸还可进一步转化成甲基丙烯酸(methacrylate)
(即methacrylic acid-MAA)，这是一种大量生产型的化学品。
MAA常被酯化成为MMA (甲基丙烯酸甲酯)，一种用于塑料生产的主要商品。MMA常被用于生产聚甲基丙烯酸甲酯塑料，但也用于生产例如甲基丙烯酸亚乙酯(EMA)、甲基丙烯酸丁酯(BMA)、丙烯酸涂料、黏合剂、离子交换树脂、皮革处理化学品、润滑添加剂和交联剂。有许多通过传统化学合成技术生产MAA的路线。大多数路线始于作为原料的天然气或原油。
有需要从可再生原料生产大量生产型化学品的新的方法。从可再生原料生产大量生产型化学品降低源于耗尽不可再生原料的经济影响的可能性，并且可刺激经济发展提供可再生原料。
发明概述
一方面，本发明提供与野生型对照相比经修饰以显示异丁酸生物合成增加的重组微生物细胞。在某些情况下，重组微生物细胞是真菌细胞，例如酵母科(Saccharomycetaceae)的成员，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。在其它情况下，重组细胞可以是细菌细胞，例如变形菌门(Protobacteria)的成员，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的成员(例如大肠杆菌(Escherichia coli))或假单胞菌科(Pseudomonaceae)的成员(例如恶臭假单胞菌(Pseudomonas
putida))。在其它情况下，重组细胞可以是细菌细胞，例如厚壁菌门(Firmicutes)的成员，例如芽胞杆菌科(Bacillaceae)的成员(例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))或链球菌科(Streptococcaceae)的成员(例如乳酸乳球菌(Lactococcus
lactis))。
在一些实施方案中，重组微生物细胞包含至少一种异源DNA分子，其编码催化异丁醛转化为异丁酸的多肽。
在某些情况下，催化异丁醛转化为异丁酸的多肽包括醛脱氢酶例如大肠杆菌苯乙醛脱氢酶(PadA)、大肠杆菌乙醛脱氢酶(AldB)、大肠杆菌3-羟基丙醛脱氢酶(AldH)、大肠杆菌琥珀酸半醛脱氢酶(GabD)、大肠杆菌γ-氨基丁醛脱氢酶(YdcW)、B. ambifaria α-酮戊二酸半醛脱氢酶(KDHba)或恶臭假单胞菌α-酮戊二酸半醛脱氢酶(KDHPP)。
在一些实施方案中，催化异丁醛转化为异丁酸的多肽包括与SEQ ID NO: l-SEQ ID NO: 106中任一个的氨基酸序列具有至少80%氨基酸序列相似性的多肽。在其它实施方案中，催化异丁醛转化为异丁酸的多肽包括与SEQ ID NO: l-SEQ
ID NO: 106中任一个的氨基酸序列具有至少80%氨基酸序列同一性的多肽。
在一些实施方案中，所述异源DNA分子包括编码与SEQ ID NO: l-SEQ
ID NO: 106中任一个的氨基酸序列具有至少80%氨基酸序列相似性的多肽的DNA分子。在其它实施方案中，所述异源DNA分子包括编码与SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 106中任一个的氨基酸序列具有至少80%氨基酸序列同一性的多肽的DNA分子。
在另外其它的实施方案中，重组细胞可包括至少一种异源DNA分子，所述异源DNA分子编码其为催化2-酮缬氨酸转化为异丁酸的途径的成员的多肽。在这些实施方案中，其为催化2-酮缬氨酸转化为异丁酸的途径的成员的多肽包括支链酮酸脱氢酶。在一些实施方案中，其为催化2-酮缬氨酸转化为异丁酸的途径的成员的多肽包括硫酯酶。在这些实施方案的一些中，硫酯酶可包括TesA或TesB。
另一方面，本发明提供遗传修饰的细胞，其包含至少一种经修饰以提高其将异丁醛转化成异丁酸的能力的内源酶。在某些情况下，修饰的酶催化异丁醛转化为异丁酸。在其它情况下，修饰的酶提高细胞耐受包含高水平异丁酸的环境的能力。
在重组微生物细胞或遗传修饰的微生物细胞的一些实施方案中，所述细胞还包含催化异丁醛转化为异丁醇的多肽的遗传修饰形式，其中与野生型多肽相比，所述遗传修饰形式的多肽显示催化活性降低。在某些情况下，所述遗传修饰的多肽包括醇脱氢酶，例如，由遗传修饰的adhE或遗传修饰的adhP编码的多肽。在其它情况下，所述遗传修饰的多肽包括乙醇胺利用蛋白(ethanolamine
utilization protein)，例如，由遗传修饰的eutG编码的多肽。在另外其它的情况下，所述遗传修饰的多肽包括由遗传修饰的yiaY、遗传修饰的yqhD或遗传修饰的yigB编码的多肽。
在重组微生物细胞或遗传修饰的微生物细胞的一些实施方案中，所述细胞还包含催化丙酮酸转化为乳酸、甲酸和乙酸中任何一种或多种的多肽的遗传修饰形式，其中与野生型多肽相比，所述遗传修饰形式的多肽显示催化活性降低。在某些情况下，所述遗传修饰的多肽包括乳酸脱氢酶，例如由遗传修饰的ldhA编码的多肽。在其它情况下，所述遗传修饰的多肽包括丙酮酸甲酸裂解酶I，例如由遗传修饰的pflB编码的多肽。在其它情况下，所述遗传修饰的多肽包括丙酮酸氧化酶，例如由遗传修饰的poxB编码的多肽。
在重组微生物细胞或遗传修饰的微生物细胞的一些实施方案中，所述细胞还包含催化乙酰辅酶A转化为乙醇或乙酰基-P的多肽的遗传修饰形式，其中与野生型多肽相比，所述遗传修饰形式的多肽显示催化活性降低。在某些情况下，所述遗传修饰的多肽包括醇脱氢酶，例如由遗传修饰的adhE编码的多肽。在其它情况下，所述遗传修饰的多肽包括磷酸乙酰转移酶，例如由遗传修饰的pta编码的多肽。
在重组微生物细胞或遗传修饰的微生物细胞的一些实施方案中，所述细胞还包含催化2-酮异戊酸转化为异丁醛的多肽，例如2-酮酸脱羧酶。
在重组微生物细胞或遗传修饰的微生物细胞的一些实施方案中，所述细胞还包含序贯催化丙酮酸转化为2-酮异戊酸的多种多肽，例如二羟酸脱水酶、酮醇酸还原异构酶(ketol-acid reductoisomerase)和乙酰乳酸合酶。
另一方面，本发明提供一种方法，所述方法包括在对本文所述重组细胞或遗传修饰的细胞产生异丁酸有效的条件下，将所述细胞在包含碳源的培养基中孵育，其中所述碳源包括以下的一种或多种：葡萄糖、图1的化合物6、图1的化合物7、图1的化合物8、图1的化合物9和图1的化合物10。在某些情况下，所述方法还包括将异丁酸转化成另一种化合物的一个或多个步骤。
另一方面，本发明提供一种方法，所述方法包括将与启动子有效连接的异源多核苷酸导入宿主细胞，使得修饰的宿主细胞催化异丁醛转化为异丁酸，其中所述异源多核苷酸编码催化异丁醛转化为异丁酸的多肽。
本发明的以上概述并不意旨描述本发明的每个公开的实施方案或每种实施。接下来的描述更具体地例举了说明性实施方案。在整个申请的数处，通过实例的列表提供指导，所述实例可以各种组合使用。在每种情况下，所引用的列表仅仅作为代表性的类型，不应解释为排它性的列表。
附图简述
图1. (a)异丁酸自石油化学原料的化学合成及其代表性应用。(b)异丁酸自可再生性碳源葡萄糖的生物合成的代谢途径的设计。酶“X”将异丁醛(10)有效地转化成异丁酸(1)。
图2. 用合成代谢途径生物合成异丁酸。(a)驱使碳流向异丁酸的基因过量表达的两种合成操纵子的构建。(b)用不同的醛脱氢酶的生产水平：(i)无醛脱氢酶；(ii) aldB；(iii)
aldH；(iv) gabD；(v) kdhba ；(vi) kdhpp ；(vii) padA；(viii)
ydcW。
图3. 剔除竞争途径对生物合成的影响。(a)内源醇脱氢酶例如YqhD与PadA竞争异丁醛，并产生副产物异丁醇。(b) YqhD敲除极大地提高异丁酸产量并降低异丁醇水平。
图4. pIBA1的质粒图。
图5. pIBA3的质粒图。
图6. 大肠杆菌中的异丁酸合成途径。缩略语：AlsS，乙酰乳酸合酶；IlvC，2,3-二羟基-异戊酸:NADP+氧化还原酶；IlvD，2,3-二羟基-异戊酸脱水酶；KTVD，α-酮异戊酸脱羧酶；PadA，苯乙醛脱氢酶。
图7. 醇脱氢酶敲除对摇瓶中异丁酸发酵的影响。(A)不同敲除的菌株中异丁酸的产生。(B)相应的敲除菌株中异丁醇的形成。(i) IBA1-1C，ΔyqhD；(ii) IBA11-1C，ΔyqhDΔadhE；(iii) IBA12-1C，ΔyqhDΔadhP；(iv) IBA13-1C，ΔyqhDΔeutG；(v) BIA14-1C，ΔyqhDΔyiaY；(vi) IBA15-1C，ΔyqhDΔyjgB。
图8. PadA表达水平对摇瓶中异丁酸产生的影响。(A)具有两拷贝PadA的不同敲除菌株中异丁酸的水平。(B)相应的异丁醇形成。(i) IBA1-2C，ΔyqhD；(ii) IBA13-2C，ΔyqhDΔeutG；(iii) IBA14-2C，ΔyqhDΔyiaY；(iv) IBA15-2C，ΔyqhDΔyjgB。
图9. 在生物反应器中通过分批补料培养的异丁酸放大发酵。(A)
50% NH4OH；IBA15-2C菌株。(B) 10N NaOH；IBA15-2C菌株。(C) 20% Ca(OH)2悬浮液；IBA15-2C菌株。(D) 20% Ca(OH)2悬浮液，IBA1-2C菌株。符号：实心正方形，生物量；实心正三角形，乙酸；空心圆，异丁酸。
图10. 大肠杆菌中的异丁酸合成途径。缩略语：AlsS，乙酰乳酸合酶；IlvC，2,3-二羟基-异戊酸:NADP+氧化还原酶；IlvD，2,3-二羟基-异戊酸脱水酶；BKDH，支链酮酸脱氢酶；TesA，硫酯酶A；TesB，硫酯酶B。
图11. pIBA16的质粒图
图12. pIBA17的质粒图。
图13. pIBA18的质粒图。
说明性实施方案详述
异丁酸是一种具有许多各种各样的应用的平台化学物质。制备异丁酸的现有方法包括使用不可再生的、不可持续的石油原料和/或有毒原料。天然生物无一可生产商用的大量异丁酸。然而，我们构建了重组细胞，该细胞具有自可再生性原料(例如葡萄糖)进行高水平生物合成异丁酸的合成代谢途径。因此，我们提供用于不依赖于石油合成异丁酸的新的途径。我们还提供用于合成异丁酸的新的重组微生物。
如在接下来的描述中所用，术语“和/或”意指所列要素的一个或全部或者所列要素的任两个或更多个的组合；术语“包含”及其各种变化在说明书和权利要求书中出现时，这些术语不具有限制性含义；除非另有说明，“a”、“an”、“the”和“至少一个”可互换使用，意指一个或超过一个；而列举的由端点限定的数值范围包括归入该范围内的全部数值(例如1-5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。
基于化石的资源通常被开采用于能源和作为化学原料。由于石油储量的消耗，因此在探索基于石油的产品的代替物方面具有越来越多的关注。生物合成是一种有前景的方法，能够从可再生性碳源持续地生产某些燃料或某些化学制品。(Atsumi等, 2008 Nature 451:86-89；Steen等, 2010 Nature 463:559-562；Causey等, 2003 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:825-832；Lin等, 2005 Metab.
Eng. 7:116-127；Zeng和Biebl,
2002 Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 2002:239-259；Alper等, 2005 Nat. Biotechnol. 23:612-616)。一个挑战是许多有用的化学制品不是通过生物系统天然产生的。因此，常常必需设计或研究出用于产生非天然代谢物的新的代谢途径。(Zha等, 2004 J. Am. Chem. Soc. 126:4534-4535；Zhang等, 2008 Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 105:20653-20658；Yan等, 2005 Appl. Environ. Microbiol. 71:3617-3623；Zhang等, 2010 Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 107:6234-6239)。在此我们报道了用于产生异丁酸的生物合成途径的发展。
异丁酸(图1(a)，化合物1)是有用的平台化学物质。它可通过催化氧化脱氢转化成甲基丙烯酸(图1(a)，化合物2)。(Millet，1998 Catal.
Rev.-Sci. Eng. 40:1-38)。每年以220万吨的量生产甲基丙烯酸的酯甲基丙烯酸甲酯用于合成聚(甲基丙烯酸甲酯)。(Nagai，2001 Appl.
Catal. Α-Gen. 221:367-377)。异丁酸还可用于制造乙酸异丁酸蔗糖酯(图1(a)，化合物3)，一种用于油墨、汽车油漆和饮料添加剂的乳化剂，其市场规模每年为100,000吨。(Godshall，"Sustainability
of the Sugar and Sugar-Ethanol Industries (糖与糖-乙醇产业的可持续性)," ACS专题研讨会丛刊1058；American Chemical Society：Washington，DC，2010；第253-268页)。异丁酸的另一种应用是用于合成2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇单异丁酸(图1(a)，化合物4；TEXANOL，Eastman Chemical Co.，Kingsport，TN)或二异丁酸(TXIB)。TXIB是一种非邻苯二甲酸酯增塑剂，TEXANOL是常用的助成膜剂。("Screening Information Data Set (SIDS) for High
Production Volume Chemicals (用于高产量化学品的筛选信息数据集(SIDS)),"
Organization for Economic Cooperation and Development 2005)。异丁酸的其它示例性应用包括通过脱羧偶联制备异丙基酮类例如二异丙基甲酮(图1(a)，化合物5) (参见例如美国专利4,754,074)。
异丁酸的一种现有生产方法包括丙烯的酸催化的Koch羰基化(图1(a)；参见例如美国专利4,452,999)。这种化学方法引起至少两个问题。第一，起始原料丙烯通过裂解较大的烃分子而产生，所述烃分子最普遍来源于不可再生资源例如石油和天然气，其长期可持续供应得不到保证。第二，使用一氧化碳和氟化氢可引起环境损害。可通过用微生物生物合成替代化学合成来缓解这类问题。
虽然有一些细菌可过量产生丁酸(Liu等，2006 Enzyme
Microb. Technol. 38:521-528)，但已知没有天然生物产生商业有用量的异丁酸。我们开发了合成代谢途径，其基于从例如葡萄糖产生异丁醛的天然代谢路线。所述天然代谢路线增加至少一个工程改造的代谢步骤，该步骤将天然代谢途径转向产生异丁酸(例如图1(b)和图10)。
在图1(b)所示的一个工程改造的途径中，葡萄糖通过糖酵解代谢为丙酮酸(化合物6)。丙酮酸然后通过缬氨酸生物合成酶AlsS、IlvC和IlvD转化为2-酮缬氨酸(化合物9)。(Atsumi等，2008 Nature 451:86-89)。2-酮缬氨酸可通过来自乳酸乳球菌的Ehrlich途径的酶2-酮酸脱羧酶(KIVD)脱羧成为异丁醛。(de la Plaza等，2004 FEMS Microbiol. Lett. 238:367-74)。对于该合成途径，我们需要鉴定图1(b)中标示为“X”的酶，其可有效地催化异丁醛转化为异丁酸。
我们鉴定出能够催化异丁醛氧化成异丁酸的酶，即使异丁醛不是任一种所述酶的已知的天然或实验底物。我们选择7种醛脱氢酶作为可能的候选酶：大肠杆菌乙醛脱氢酶AldB、大肠杆菌3-羟基丙醛脱氢酶AldH、大肠杆菌琥珀酸半醛脱氢酶GabD、大肠杆菌苯乙醛脱氢酶PadA、大肠杆菌γ-氨基丁醛脱氢酶ydcW、Burkholderia ambifaria α-酮戊二酸半醛脱氢酶(KDHba)和恶臭假单胞菌KT2440 α-酮戊二酸半醛脱氢酶(KDHpp)。这些酶几乎没有同源性，并且涉及广泛的醛底物，尽管所述广泛的醛底物不包括异丁醛。在KIVD后克隆了编码所述醛脱氢酶之一的寡核苷酸以在高拷贝质粒上构建表达盒kivd-x (图2(a)，其中X代表编码醛脱氢酶的寡核苷酸)。还在中拷贝质粒上构建了以转录顺序ilvD-alsS的另一个操纵子(图2(a))以驱动碳流向2-酮缬氨酸(ilvC不克隆，因为染色体拷贝可在通过其底物乙酰乳酸诱导时过量表达；Wek和Hatfield，1988 Mol. Biol.
203:643-663)。对每种醛脱氢酶进行这种重复，产生表达盒的文库，各个表达盒表达所述醛脱氢酶中的一种。
将克隆的质粒转化至野生型大肠杆菌菌株BW25113中。在30℃下进行摇瓶发酵达48小时。使培养物在含有40 g/L葡萄糖作为碳源的M9基本培养基中生长，并加入0.1
mM IPTG以诱导蛋白质表达。通过具有折光率检测的HPLC分析定量测定发酵产物。如可从图2(b)中观察到的一样，醛脱氢酶提供不同的异丁酸生产水平。在没有任何编码醛脱氢酶的质粒的情况下，检出1.3 g/L异丁酸(i，图2(b))，这应该来自内源醛脱氢酶的作用。GabD、Kdhba、Kdhpp和YdcW略微提高异丁酸的生产水平(分别为图2(b) iv、v、vi和viii)。相比之下，具有AldB和AldH的转化株产生2.3 g/L和3.8 g/L异丁酸(分别为图2(b) ii、iii)。具有PadA的转化株产生4.8 g/L异丁酸(图2(b) vii)。
由于PadA产生最大量的异丁酸，所以我们选择PadA用于进一步的研究。为了表征该酶，用N端6xHis标签给PadA加标签，过量表达，并通过Ni-NTA柱纯化。通过在340 nm处测量NAD+至NADH的还原，来测定用于通过PadA转化异丁醛的动力学参数。结果见表1。PadA对异丁醛的活性比对其天然生理底物苯乙醛的活性低得多。虽然k cat值仅为1/4(1494分钟-1相对于5810分钟-1)，但是K m值高230倍(2.67 mM相对于0.0116 mM)。因此PadA对苯乙醛的特异性常数k cat/K m比其对非天然底物异丁醛几乎高1000倍。
表1. PadA的动力学常数。
由于PadA对异丁醛具有相对高的K m，因此内源醇脱氢酶例如YqhD (K m 1.8 mM；Atsumi等，2010 Appl.
Microbiol. Biotechnol. 85:651-657)可竞争醛底物，并产生异丁醇而不是异丁酸(图3(a))。这可以部分地解释发酵产物中4.8 g/L异丁醇的蓄积(等于异丁酸的浓度) (图3(b))。我们从BW25113的染色体中剔除yqhD基因。与野生型菌株相比，ΔyqhD突变体降低异丁醇产量至0.8
g/L，并增加异丁酸产量至11.7 g/L (图3(b))。因此，在摇瓶发酵中，这种修饰菌株可产生产量为0.29 g/g葡萄糖的异丁酸(图3(b))，这是理论最大值的59%。
因此，我们开发出由葡萄糖生物合成异丁酸的合成代谢途径。我们发现我们研究的7种醛脱氢酶的每一种将异丁醛转化成异丁酸。这7种醛脱氢酶中，PadA是体内将异丁醛氧化成异丁酸的最有效的酶。从染色体剔除yqhD基因(其编码与PadA竞争异丁醛的酶)，异丁酸产量从40 g/L葡萄糖进一步增加至11.7 g/L。
在图10所示的一个替代的工程改造的途径中，2-酮缬氨酸(化合物9)转化为异丁酸(化合物1)。支链酮酸脱氢酶BKDH可将2-酮缬氨酸转化为支链辅酶A，其进而可被硫酯酶转化成异丁酸。
我们从恶臭假单胞菌基因组DNA克隆得到bkdh，并且从野生型大肠杆菌基因组DNA克隆得到tesA和tesB。质粒pIBA16含有bkdh，pIBA17含有bkdh和TesA，而pIBA18含有bkdh和TesB。包含BKDH而无TesB或TesA的构建体(pIBA16)蓄积异丁酸至5.61 ± 0.67 g/L的浓度(表4)，略高于在敲除yqhD前由PadA构建体显示的异丁酸产量(图3(a))。然而，加入硫酯酶进一步提高异丁酸产量。例如，BKDH加上TesB (pIBA18)从40
g/L葡萄糖产生8.6 g/L异丁酸(0.22
g/g葡萄糖，或理论最大产量的约44%)。
因此，我们证实了不同的修饰代谢路线以实现异丁酸的生物合成。此外，我们证实了可由沿不天然产生异丁酸的内源生物合成途径的各个点通过使生物合成转向，来实现有效的异丁酸生物合成。因此，我们建立了用于异丁酸生物合成的通用平台。
敲除对异丁酸产生的影响
接下来，我们通过研究进一步的工程改造是否可进一步提高碳产量，得出了我们的初步结论。我们构建了6种大肠杆菌敲除菌株，发现一种双敲除(ΔyqhD、ΔyjgB)比单敲除菌株(ΔyqhD)产生多17%的异丁酸。我们然后在质粒中在组成型启动子下引入额外拷贝的醛脱氢酶。PadA过量表达进一步减少异丁醇形成，并进一步增加异丁酸产生。因此我们成功地构建了异丁酸产量为0.39 g/g葡萄糖(理论最大值的80%)的工程改造菌株。
我们还将该发酵方法从摇瓶放大到生物反应器。我们发现Ca(OH)2在发酵期间作为调节pH的碱比NH4OH或NaOH好得多。使用Ca(OH)2保持发酵培养物的pH增加细胞密度，减少乙酸蓄积，并增加异丁酸的最终蓄积至90
g/L。
在图1(b)和图6所示的工程改造的生物合成途径中，异丁醛是异丁酸的直接前体。在许多生物中，异丁醛通过内源醇脱氢酶例如在大肠杆菌中的AdhE、AdhP、EutG、YiaY、YjgB和YqhD自然还原为异丁醇。已知YqhD参与异丁醇形成，因为yqhD敲除可显示异丁酸产量提高50%。(Zhang等，2011 ChemSusChem
4:1068-1070)。然而，甚至在yqhD敲除后，异丁醇仍作为发酵副产物以0.8
g/L的浓度存在(图7B，i)。因此，我们研究了其它醇脱氢酶基因敲除(与yqhD缺失组合)是否能减少异丁醛转化为异丁醇，从而增加细胞可用的异丁醛的量以转化成异丁酸。adhE或adhP的额外缺失略为增加异丁醇蓄积至0.90 g/L (分别为图7B，ii和iii)，而异丁酸产生不受影响(分别为图7A，ii和iii)。敲除eutG降低异丁醇水平至0.76 g/L，并增加异丁酸浓度至12.2 g/L (分别为图7B，iv和图7A，iv)。引人关注的是，虽然yiaY或yjgB的额外缺失不减少异丁醇形成(分别为图7B，v和vi)，但是它们提高异丁酸生产水平至12.4 g/L和12.9
g/L (分别为图7A，v和vi)。因此，与IBA1-1C菌株(ΔyqhD，i)相比，IBA15-1C菌株(ΔyqhD，ΔyjgB，vi)显示异丁酸生产增加。ΔadhE菌株中的结果与最新发表的报道不同(Trinh等，2011 Appl. Environ. Microbiol. 77:4894-4904)。然而，该项研究使用厌氧条件以调查adhE对异丁醇产生的作用，而我们的发酵条件是半厌氧的。已知AdhE酶被氧灭活(Holland-Staley等，2000
J. Bacteriol. 182:6049)。
PadA表达水平对异丁酸产生的影响
接下来，我们研究了引导异丁醛转化为异丁酸的备选方法，所述方法包括提高PadA的蛋白质表达水平以对使异丁醛转化为异丁醇的醇脱氢酶更有竞争性。将额外拷贝的padA引入高拷贝质粒中的组成型启动子下。我们将第二拷贝的padA加入单敲除菌株IBA1
(ΔyqhD)和双敲除菌株IBA13 (ΔyqhDΔeutG)、IBA14
(ΔyqhDΔyiaY)和IBA15 (ΔyqhDΔyjgB)中，所述双敲除菌株中的每一种均比携带一拷贝padA的单敲除IBA1菌株产生更多的异丁酸(图7A)。
与得自单个PadA的亲代菌株IBA1-1C的11 g/L (图7A，i)相比，双重PadA菌株IBA1-2C产生13.7 g/L异丁酸(图8A，i)。另一方面，异丁醇浓度从0.82 g/L (图7B，i)降至0.35 g/L (图8B，i)。这些结果证实，PadA表达增加减少异丁醇蓄积，并增加异丁酸产生。异丁醇降低(0.47 g/L)小于异丁酸增加(2.7
g/L)。这种差异的非一致性的一个可能原因可能是产生的异丁酸比产生的异丁醇对细胞产生较少的应激，使得含有2拷贝padA的细胞产生较少量的副产品，因此使更多的生物合成能量集中到异丁酸的产生上。例如，另一种副产物乙酸的蓄积也从IBA1-1C中的0.6 g/L降至IBA1-2C中的0.1 g/L。
同样在IBA13-2C、IBA14-2C和IBA15-2C菌株中证实了PadA过量表达的影响。带有2拷贝的padA，这些菌株产生约0.4 g/L异丁醇(图8B，ii-iv)，显著低于携带1拷贝PadA的菌株(图7B，iv-vi)。更重要的是，与其相应的单一PadA亲代菌株(图7A，iv-vi)相比，IBA13-2C、IBA14-2C和IBA15-2C还增加了异丁酸的蓄积(分别为14.3 g/L、14.6 g/L和15.6 g/L (图8A，ii-iv))。
此外，在PadA过量表达的双敲除IBΑ-13-2C、EBA14-2C和IBA15-2C中的异丁酸蓄积高于在PadA过量表达的单(Δyqh)敲除IBA1-2C中的异丁酸蓄积，这证实了双敲除增加异丁酸的产生。
因此，可对微生物进行工程改造，通过过量表达PadA (这有利于异丁醛转化为异丁酸)和/或敲除可与PadA竞争异丁醛但有利于异丁醛转化为异丁醇的一种或多种醛脱氢酶，以利于产生异丁酸而非异丁醇。PadA过量表达的双敲除(Δyqh，ΔyjgB)菌株IBA15-2C产率为0.39 g/g葡萄糖，为理论最大值的80%。
优化分批补料生物反应器中的发酵条件
接下来我们研究了当发酵由摇瓶放大到生物反应器时是否保持了上述影响。我们用菌株IBA15-2C进行了生物反应器发酵实验。为了避免乙酸在生物反应器中过量蓄积，调节葡萄糖进料速率以保持葡萄糖的水平低于10
g/L。因为每产生一分子的异丁酸，产生2分子的NADH，因此保持10%的溶解氧(DO)水平以氧化过量的NADH。避免较高的DO水平，以防止底物通过TCA循环过度氧化成CO2。
在异丁酸的生物合成期间，如果不将碱加入发酵培养基中，则pH会急剧下降。我们研究了3种不同的碱NH4OH、NaOH和Ca(OH)2保持pH为7.0的效果。如图9Α-C (实心正方形)所见，对于所有条件，生物量在最初20小时期间呈指数增加，然后逐步下降。使用NH4OH或NaOH所得到的最大生物量约为7.5 g/L，而用Ca(OH)2所得到的最大生物量约为10
g/L。这个结果表明，过量的铵离子或钠离子可能对细胞生长有负面影响。氢氧化铵之前被用来控制pH，并且提供氮源供应，但对于使异丁酸生产最大化而言，这种碱显然绝非最适宜的。在140小时后，使用NH4OH，异丁酸蓄积达到51.1
g/L (图9A，空心圆)，用NaOH达到65.4 g/L (图9B，空心圆)，而用Ca(OH)2达到90.3
g/L (图9C，空心圆)。一般而言，在各培养物中异丁酸的最终蓄积与乙酸的最终蓄积负相关：NH4OH调节的培养物蓄积12.6 g/L乙酸，而在NaOH调节的培养物中乙酸下降至7.1 g/L，在Ca(OH)2调节的培养物中仅3.4 g/L (图9Α-C，实心三角形)。这与乙酸是大肠杆菌发酵的主要抑制剂的先前报道一致(Eiteman和Altman，2006 Trends Biotechnol. 24:530-536；Koh等，1992 Biotechnol.
Lett. 14:1115-1118)。总之，与使用NH4OH或NaOH相比，使用Ca(OH)2保持培养物7.0的pH增加细胞密度，增加异丁酸蓄积，并降低乙酸副产物。
作为对照，还研究了PadA过量表达的单基因(yqhD)敲除菌株IBA1-2C在生物反应器中的发酵。在122小时后，该菌株产生57.6 g/L异丁酸和1.0 g/L乙酸(图9D)，这证实了氢氧化钙有助于降低乙酸形成，并增加异丁酸产生。然而在相同条件下，IBA15-2C菌株比IBA1-2C菌株产生多57%的异丁酸，这表明在ΔyqhD/Δygj双敲除的摇瓶培养物中观察到的异丁酸产生增加可放大至生物反应器体积。
该研究证实，可从工程改造的微生物中以高蓄积和高产率产生异丁酸。由于该研究中描述的异丁酸的产生可适于微生物发酵，因此本文所述修饰的微生物菌株和方法可提供用于异丁酸大规模生产的新的平台。
因此，我们开发出用于以可再生方式产生异丁酸的平台。我们克服了与化学合成有关的问题，例如不可持续的石油原料和有毒原料的使用。我们的生物合成方法提供了有益于经济和环境两者的有吸引力的选择(Dale，2003 J. Chem. Technol. Biotechnol. 78:1093-1103)。
因此，一方面，本发明提供经修饰的重组微生物细胞，其与野生型对照相比显示异丁酸生物合成增加。本文所用“增加的产量”可被描述为与野生型对照相比异丁酸的生物合成相对增加，被描述为对微生物细胞的培养而言足以蓄积异丁酸至预定浓度的生物合成，被描述为通过细胞产生的异丁酸:异丁醇的比率提高，或被描述为使用指定的参比原料(例如葡萄糖)的最大理论产量的百分比提高。
指定参比原料(例如葡萄糖)不需要使用指定的参比原料作为碳源或能源供微生物培养物生长。实际上，如下文更详细的描述，原料可包括例如图1(b)所示化合物6-9中的任一种。然而，本领域普通技术人员能够将使用任何备选原料的理论最大产量以算术方法换算成基于代谢上等量的任何参比原料的相应的理论最大产量。
因此，在某些情况下，修饰的微生物细胞可显示异丁酸的生物合成增加，所述增加反映通过合适的野生型对照产生的异丁酸的至少110%、至少125%、至少150%、至少175%、至少200% (2倍)、至少250%、至少300% (3倍)、至少400% (4倍)、至少500% (5倍)、至少600% (6倍)、至少700% (7倍)、至少800% (8倍)、至少900% (9倍)、至少1000% (10倍)、至少2000% (20倍)、至少3000% (30倍)、至少4000% (40倍)、至少5000% (50倍)、至少6000% (60倍)、至少7000% (70倍)、至少8000% (80倍)、至少9000% (90倍)、至少10,000% (100倍)、或至少100,000%) (1000倍)，直到并包括对于给定宿主细胞以0.49 g异丁酸/g葡萄糖的理论最大值产生异丁酸是必然的倍数增加。
在其它情况下，当修饰的微生物细胞在培养基中生长规定的时间时，所述微生物细胞可显示通过异丁酸蓄积至预定浓度所反映的异丁酸生物合成的增加。预定浓度可以是适于特定应用的异丁酸的任何预定浓度。因此，预定浓度可以是例如至少0.1 g/L的浓度，例如至少0.5
g/L、至少1.0 g/L、至少2.0
g/L、至少3.0 g/L、至少4.0
g/L、至少5.0 g/L、至少6.0
g/L、至少7.0 g/L、至少8.0
g/L、至少9.0 g/L、至少10 g/L、至少20 g/L、至少50 g/L、至少55 g/L、至少60 g/L、至少65 g/L、至少70 g/L、至少75 g/L、至少80 g/L、至少85 g/L、至少90 g/L、至少95 g/L、至少100 g/L、至少110 g/L、至少120 g/L、至少130 g/L、至少140 g/L、至少150 g/L、至少160 g/L、至少170 g/L、至少180 g/L、至少190 g/L或至少200 g/L。
在分批培养中，指定的时间可具有最低至少12小时，例如至少24小时、至少36小时、至少48小时、至少60小时、至少72小时、至少84小时、至少96小时、至少108小时、至少120小时、至少132小时或至少144小时。在分批培养中，指定的时间可具有最大不超过240小时，例如不超过216小时、不超过192小时、不超过168小时、不超过144小时、不超过120小时、不超过108小时、不超过96小时、不超过84小时、不超过72小时、不超过60小时或不超过48小时。在分批培养中，指定的时间还可表示为具有由任何最短时间和任何合适的最长时间限定的端值的范围。在连续培养中，指定的时间可以与分批培养相同的方式表示为时间的绝对量。或者，连续培养中指定的时间可用培养物的阶段(例如稳定状态)表示。
因此，在某些实施方案中，修饰的细胞可显示异丁酸生物合成增加，这可描述为在48小时后产生至少4.7 g/L异丁酸。在其它示例性实施方案中，异丁酸产量增加可用在培养120小时后蓄积至少90 g/L异丁酸来表示。
在其它情况下，修饰的微生物细胞可显示异丁酸生物合成增加，所述增加用由所述细胞产生的异丁酸:异丁醇的比率来描述。异丁酸生物合成的增加可表示为至少1:1的异丁酸:异丁醇比率，例如至少2:1、至少3:1、至少4:1、至少5:1、至少6:1、至少7:1、至少8:1、至少9:1、至少10:1、至少11:1、至少12:1、至少13:1、至少14:1、至少15:1、至少20:1、至少25:1、至少30:1、至少50:1、至少60:1、至少70:1、至少80:1、至少90:1或至少100:1。
在另外其它的情况下，修饰的微生物细胞可显示异丁酸生物合成增加，所述增加反映自指定的参比原料(例如葡萄糖)的理论产量的至少40%的预定异丁酸产量。预定的异丁酸产量可为例如理论最大产量的至少40%、理论最大产量的至少50%、理论最大产量的至少60%、理论最大产量的至少70%、理论最大产量的至少80%、理论最大产量的至少90%、理论最大产量的至少95%、理论最大产量的至少96%、理论最大产量的至少97%、理论最大产量的至少98%或理论最大产量的至少99%。某些实施方案可以自葡萄糖的理论最大产量的约44%、约59%或约80%产生异丁酸。
重组细胞可以是或可源自于任何合适的微生物，包括例如原核微生物或真核微生物。在一些实施方案中，细胞可包括至少一种异源DNA分子。本文所用术语“或源自于”与微生物有关时，只考虑在经修饰以包括异源DNA分子前具有一个或多个遗传修饰的“宿主细胞”，所述异源DNA分子编码参与引起异丁酸生物合成的工程改造的生物合成途径的多肽。因此，术语“重组细胞”包括可在具有所述异源DNA分子前含有来自一种以上物种的核酸原料的“宿主细胞”，所述异源DNA分子编码导入细胞的多肽，所述多肽涉及例如使异丁醛转化为异丁酸或使2-酮缬氨酸转化为异丁酸。
在一些实施方案中，重组细胞可以是或源自于真核微生物，例如真菌细胞。在这些实施方案的一些中，真菌细胞可以是或源自于酵母科的成员例如酿酒酵母、念珠菌属(Candida)的成员例如白色念珠菌(Candida albicans)、克鲁维酵母属(Kluyvermyces)的成员或毕赤酵母属(Pichia)的成员例如巴斯德毕赤酵母(Pichia
pastoris)。在其它实施方案中，真菌细胞可以是双足囊菌科(Dipodascaceae)的成员例如解脂耶罗威亚酵母(Yarrowia lipolytica)。
在其它实施方案中，重组细胞可以是或源自于原核微生物，例如细菌。在这些实施方案的一些中，细菌可以是变形菌门的成员。变形菌门的示例性成员包括例如肠杆菌科的成员(例如大肠杆菌)和例如假单胞菌科的成员(例如恶臭假单胞菌)。在其它情况下，细菌可以是厚壁菌门的成员。厚壁菌门的示例性成员包括例如芽胞杆菌科的成员(例如枯草芽孢杆菌)和例如链球菌科的成员(例如乳酸乳球菌)。
在接下来的描述中，各种实施方案的描述涉及编码遗传修饰的异源DNA分子。各种实施方案的组合也是可能的。在这类实施方案中，一种以上的遗传修饰可包括在单一异源DNA分子(例如质粒载体)中。或者，不同的遗传修饰可包括在不同载体中，每种所述载体都被引入宿主细胞。
在一些实施方案中，细胞可包括至少一种异源DNA分子，其编码催化异丁醛转化为异丁酸的多肽。在一些实施方案中，催化异丁醛转化为异丁酸的多肽包括醛脱氢酶。本文所用术语“醛脱氢酶”是指催化异丁醛化为异丁酸的多肽，不论其通用名称或原有功能如何。示例性醛脱氢酶包括例如大肠杆菌苯乙醛脱氢酶(PadA)、大肠杆菌乙醛脱氢酶(AldB)、大肠杆菌3-羟基丙醛脱氢酶(AldH)、大肠杆菌琥珀酸半醛脱氢酶(GabD)、大肠杆菌γ-氨基丁醛脱氢酶(YdcW)、B. ambifaria α-酮戊二酸半醛脱氢酶(KDHba)或恶臭假单胞菌α-酮戊二酸半醛脱氢酶(KDHPP)。在某些实施方案中，重组细胞可包括编码两种或更多种醛脱氢酶的组合的一种异源DNA分子(或多种异源DNA分子)。
在其它实施方案中，催化异丁醛转化为异丁酸的由异源DNA分子编码的多肽(即异源编码的多肽)包括或结构上类似于包含SEQ ID NO: 1-SEQ
ID NO: 106中一个或多个的氨基酸序列的参比多肽。
如本文所用，如果与参比多肽相比，异源编码的多肽的氨基酸序列具有特定量的相似性和/或同一性，则异源编码的多肽“在结构上类似于”参比多肽。可通过比对两个多肽(例如异源编码的多肽和例如SEQ ID NO: 1-SEQ
ID NO: 106中任一个的多肽)的残基以使沿其序列长度的相同氨基酸的数目优化，来测定两个多肽的结构相似性；在进行比对时允许任一个或两个序列中的空位，目的是使相同氨基酸的数目最优化，尽管每个序列中的氨基酸仍必须保持其适当顺序。
可应用GCG程序包(10.2版，Madison，WI)中的BESTFIT算法，来进行氨基酸序列的成对比较分析。或者，可应用Tatiana等人(1999 FEMS Microbiol Lett，174:247-250)描述的并且可获自美国国家生物技术信息中心(National
Center for Biotechnology Information，NCBI)网站的BLAST 2搜索算法的Blastp程序来比较多肽。可采用所有BLAST 2搜索参数的默认值，包括矩阵=
BLOSUM62；开放空位罚分= 11，延伸空位罚分= 1，空位x_衰减= 50，预期= 10，字号= 3和筛选(filter)打开。
在两个氨基酸序列的比较中，结构相似性可用百分比“同一性”表示，或者可用百分比“相似性”表示。“同一性”是指存在相同的氨基酸。“相似性”是指不仅存在相同的氨基酸，而且还存在保守取代。本发明多肽中的氨基酸的保守取代可选自所述氨基酸所属类别中的其它成员。例如，蛋白质生物化学领域众所周知的是，属于具有特定大小或性质(例如电荷、疏水性和亲水性)的氨基酸分组的氨基酸可被未改变蛋白质的活性的另一个氨基酸取代，特别是不与生物活性直接有关的蛋白质区域。例如，非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。保守取代包括例如Lys取代Arg和反之亦然以保持正电荷；Glu取代Asp和反之亦然以保持负电荷；Ser取代Thr使得保持游离-OH；Gln取代Asn以保持游离-NH2。同样地，还考虑了含有一个或多个连续或非连续氨基酸的缺失或添加的多肽的生物活性类似物，所述氨基酸的缺失或添加不会消除多肽的功能活性。
异源编码的多肽可包括与参比氨基酸序列有以下序列相似性的多肽：至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%。
异源编码的多肽可包括与参比氨基酸序列有以下序列同一性的多肽：至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%。
示例性参比氨基酸序列包括SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 106中任一个的氨基酸序列。
1WNB是与NADH和甜菜醛复合的大肠杆菌蛋白质YdcW的晶体结构(Gruez等, 2004 J. Mol.
Biol. 343:29-41)。根据晶体结构，残基Y150、D279、F436和L438位于甜菜醛底物α-碳的5Å半径以内。虽然PadA和YdcW的同源性低，但结合袋(binding pocket)却十分保守。PadA的活性部位上相应的残基是F175、V305、T461和I463。可进行类似分析以鉴定可被修饰但不干扰多肽的催化活性的氨基酸残基，就像鉴定可能参与底物结合和/或催化活性的氨基酸残基一样重要。
在一些实施方案中，重组细胞可包含编码与SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 106中任一个的氨基酸序列具有至少80%氨基酸序列相似性的多肽的异源DNA分子。因此，示例性异源DNA分子包括编码与参比氨基酸序列具有例如以下序列相似性的多肽的那些异源DNA分子：至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%。
在其它实施方案中，所述异源DNA分子编码与SEQ ID NO: 1-SEQ
ID NO: 106中任一个的氨基酸序列具有至少80%氨基酸序列同一性的多肽。因此，示例性异源DNA分子包括编码与参比氨基酸序列具有例如以下序列同一性的多肽的那些异源DNA分子：至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%。
可进一步设计异源编码的多肽以提供额外序列，例如，用于附加的C-端或N-端氨基酸的编码序列的添加，所述C-端或N-端氨基酸将通过在柱上俘获或使用抗体利于表达或纯化。这类标签包括例如允许在镍柱上纯化多肽的富含组氨酸的标签。这类基因修饰技术和合适的额外序列是分子生物学领域众所周知的。
在其它实施方案中，重组细胞可包含至少一种异源DNA分子，其编码催化2-酮缬氨酸转化为异丁酸的多肽。在一些实施方案中，催化异丁醛转化为异丁酸的多肽包括支链酮酸脱氢酶(BKDH)。本文所用术语“支链酮酸脱氢酶”是指催化2-酮缬氨酸转化为支链辅酶A的多肽，不论其通用名称或原有功能如何。示例性支链酮酸脱氢酶可包括例如恶臭假单胞菌的BKDH。在这些实施方案的一些中，重组细胞可包括至少一种编码硫酯酶的异源DNA。本文所用术语“硫酯酶”是指催化支链辅酶A转化为异丁酸的多肽，不论其通用名称或原有功能如何。示例性硫酯酶可包括例如大肠杆菌的TesA或TesB。
在一些实施方案中，重组细胞还可包括催化图1(b)所示生物合成转化的一种或多种多肽。因此，例如，重组细胞还可包括催化2-酮异戊酸转化为异丁醛的多肽，例如2-酮酸脱羧酶；或者例如催化在丙酮酸转化为2-酮异戊酸中某一步骤的任一种或多种多肽，例如以下的一种或多种：二羟酸脱水酶、酮醇酸还原异构酶和乙酰乳酸合酶。
另一方面，本发明提供遗传修饰的细胞，在所述细胞中至少一种内源酶经修饰以提高其将异丁醛转化为异丁酸的能力。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞可包括一种或多种内源酶的一个或多个突变。在其它实施方案中，遗传修饰的细胞可包括一种或多种多肽的一个或多个突变，其提高细胞耐受培养中高水平异丁酸的能力。可采用分子生物学技术来产生突变，所述分子生物学技术包括例如以下的一种或多种：转录物组分析、基因组测序、克隆、位点专一诱变和用包括编码一种或多种修饰的酶的多核苷酸的载体转化微生物。或者，可采用经典微生物遗传技术来产生突变，所述经典微生物遗传技术例如在经设计以选择和/或鉴定具有所需自发突变的微生物的培养基之中或之上生长。
在一些实施方案中，重组细胞或遗传修饰的细胞还可包含催化异丁醛转化成除异丁酸以外的产物(例如异丁醇、乳酸、乙醇或乙酰基-P)的多肽的遗传修饰形式，从而使更多的异丁醛流向异丁酸的生物合成。一般而言，与野生型多肽相比，遗传修饰形式的多肽可显示催化活性降低。这类遗传修饰可以引起除异丁酸以外产物(例如异丁醇、乳酸、乙醇或乙酰基-P)的生物合成的方式降低异丁醛代谢的程度，从而提高异丁醛转化为异丁酸的程度。
在某些情况下，重组细胞或遗传修饰的细胞可包括催化异丁醛转化为异丁醇的多肽的遗传修饰形式。这种类型的示例性多肽可包括例如可以是醇脱氢酶的遗传修饰形式，例如由遗传修饰的adhE或遗传修饰的adhP编码的多肽。在其它实施方案中，所述遗传修饰的多肽可以是乙醇胺利用蛋白的遗传修饰形式，例如由遗传修饰的eutG编码的多肽。在一些实施方案中，所述遗传修饰的多肽可以是由遗传修饰的dkgA、遗传修饰的yiaY、遗传修饰的yqhD或遗传修饰的yjgB编码的多肽。
在某些情况下，重组细胞或遗传修饰的细胞可包括催化丙酮酸转化为乳酸、甲酸和乙酸中任一种或多种的多肽的遗传修饰形式，其中与野生型多肽相比，遗传修饰形式的多肽显示催化活性降低。这种类型的示例性多肽可包括例如乳酸脱氢酶的遗传修饰形式，例如由遗传修饰的ldhA编码的多肽；丙酮酸甲酸裂解酶I的遗传修饰形式，例如由遗传修饰的pflB编码的多肽；或丙酮酸氧化酶的遗传修饰形式，例如由遗传修饰的poxB编码的多肽。
在某些情况下，重组细胞或遗传修饰的细胞可包括催化乙酰辅酶A转化为乙醇或乙酰基-P的多肽的遗传修饰形式，其中与野生型多肽相比，多肽的遗传修饰形式显示催化活性降低。这种类型的示例性多肽可包括例如醇脱氢酶的遗传修饰形式，例如由遗传修饰的adhE编码的多肽；或磷酸乙酰转移酶的遗传修饰形式，例如由遗传修饰的pta编码的多肽。
催化活性的降低可以定量测量，并描述为合适野生型对照催化活性的百分比。由遗传修饰的多肽显示的催化活性可为例如不超过合适野生型对照活性的95%、不超过90%、不超过85%、不超过80%、不超过75%、不超过70%、不超过65%、不超过60%、不超过55%、不超过50%、不超过45%、不超过40%、不超过35%、不超过30%、不超过25%、不超过20%、不超过15%、不超过10%、不超过5%、不超过4%、不超过3%、不超过2%、不超过1%，或为合适野生型对照活性的0%。
或者，催化活性的降低可表示为催化常数的适当变化。例如，催化活性的降低可表示为k cat的降低，例如酶转化的k cat值至少降低为1/2、至少降低为1/3、至少降低为1/4、至少降低为1/5、至少降低为1/6、至少降低为1/7、至少降低为1/8、至少降低为1/9、至少降低为1/10、至少降低为1/15或至少降低为1/20。
催化活性的降低还可用K m的增加来表示，例如K m增加至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍、至少75倍、至少100倍、至少150倍、至少200倍、至少230倍、至少250倍、至少300倍、至少350倍或至少400倍。
催化活性的提高可以定量测量，并描述为合适野生型对照催化活性的百分比。由遗传修饰的多肽所显示的催化活性可为例如合适野生型对照活性的至少110%、至少125%、至少150%、至少175%、至少200% (2倍)、至少250%、至少300% (3倍)、至少400% (4倍)、至少500% (5倍)、至少600% (6倍)、至少700% (7倍)、至少800% (8倍)、至少900% (9倍)、至少1000% (10倍)、至少2000% (20倍)、至少3000% (30倍)、至少4000% (40倍)、至少5000% (50倍)、至少6000% (60倍)、至少7000% (70倍)、至少8000% (80倍)、至少9000% (90倍)、至少10,000% (100倍)或至少100,000% (1000倍)。
或者，催化活性的提高可表示为k cat的增加，例如酶转化的k cat值的至少2倍增加、至少3倍增加、至少4倍增加、至少5倍增加、至少6倍增加、至少7倍增加、至少8倍增加、至少9倍增加、至少10倍增加、至少15倍增加或至少20倍增加。
催化活性的提高还可用K m的降低表示，例如酶转化的K m值至少降低为1/2、至少降低为1/3、至少降低为1/4、至少降低为1/5、至少降低为1/6、至少降低为1/7、至少降低为1/8、至少降低为1/9、至少降低为1/10、至少降低为1/15或至少降低为1/20。
另一方面，本发明提供一种方法，所述方法包括将与启动子有效连接的编码催化异丁醛转化为异丁酸的多肽的异源多核苷酸导入宿主细胞，使得修饰的宿主细胞催化异丁醛转化为异丁酸。在不同的实施方案中，所述方法还包括将编码上述遗传修饰和/或多肽的一种或多种异源多核苷酸导入细胞。这类异源多核苷酸可包括例如降低对异丁醛的生物合成竞争从而促进异丁醛的蓄积以用于随后转化为异丁酸的遗传修饰。这类异源多核苷酸还可编码催化碳源底物转化为异丁醛中的某一步骤的多肽。
另一方面，本发明提供一种方法，所述方法包括在对重组细胞产生异丁酸有效的条件下在包含碳源的培养基中孵育本文所述的重组细胞。参阅图1(b)，在一些实施方案中，重组细胞可如下将葡萄糖转化为异丁酸：通过将葡萄糖转化为丙酮酸，然后通过例如图1(b)所示生物合成途径将丙酮酸转化为异丁醛，然后通过异源编码的多肽的活性将异丁醛转化为异丁酸。然而，在其它实施方案中，异丁醛并不必然需要产生于任何特定原料通过任何特定的生物合成途径的代谢。例如，可将异丁醛直接供给培养基中的重组细胞。在其它实例中，培养基可包含图1(b)所示生物合成途径或者产生异丁醛或进入图1(b)所示生物合成途径的任何其它生物合成途径的一种或多种中间体以产生异丁醛。因此，在不同的实施方案中，碳源可包括以下的一种或多种：葡萄糖、图1(b)的化合物6、图1(b)的化合物7、图1(b)的化合物8、图1(b)的化合物9和图1(b)的化合物10。
由于异丁酸是大量生产型的化学品，因此异丁酸合成可扩展到其它化合物的合成。例如，异丁酸可以是用于合成3-羟基丁酸(下文反应流程I的式5)的起始原料，3-羟基丁酸可脱水产生甲基丙烯酸。反应流程I说明3-羟基丁酸的合成。反应流程I由异丁酸合成下游的4个步骤组成。已经鉴定出编码催化这些步骤中每一个的酶的候选基因。可通过得自例如梭状芽胞杆菌SB4 (Clostridium SB4)或具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)的酶丁酰辅酶A:乙酰乙酸辅酶A转移酶(I，反应流程I)，使异丁酸转化为异丁酰辅酶A (反应流程I的式2)。然后可通过酶2-甲基酰基辅酶A脱氢酶(II，反应流程I)，例如得自除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)的acdH或来自褐家鼠(Rattus
norvegicus)的Acadsb，使异丁酰辅酶A脱氢为甲基丙烯酰辅酶A (反应流程I的式3)。然后可通过烯酰辅酶A水合酶(III，反应流程I)，例如得自黄牛(Bos taurus)的ECHS1或得自荧光假单胞菌(Pseudomonas
fluoresceins)的ech，使甲基丙烯酰辅酶A水化为3-羟基异丁酰辅酶A (式4，反应流程I)。通过3-羟基异丁酰辅酶A水解酶(IV，反应流程I)，例如来自褐家鼠的Hibch，使3-羟基异丁酰辅酶A转化为3-羟基丁酸。
反应流程I
参与反应流程I的示例性酶：
I：酶：丁酰辅酶A:乙酰乙酸辅酶A转移酶
物种：梭状芽胞杆菌SB4
物种：具核梭杆菌(Entrez Gene ID
993155、991616或992527、992528)
II：酶：2-甲基酰基辅酶A脱氢酶
基因：acdH登记号：G-9098
(MetaCyc)物种：除虫链霉菌
基因：Acadsb登记号：G-9097
(MetaCyc)物种：褐家鼠
III：酶：短链烯酰辅酶A水合酶
基因：ECHS1登记号：G-9101
(MetaCyc)物种：黄牛
酶：烯酰辅酶A水合酶
基因：ech登记号：G-9099
(MetaCyc)物种：荧光假单胞菌
IV：酶：3-羟基异丁酰辅酶A水解酶
基因：Hibch登记号：G-9102
(MetaCyc)物种：褐家鼠
自异丁酸的其它化合物的生物合成可通过将本文所述重组细胞或本文所述遗传修饰的细胞与以下微生物共培养来实现：所述微生物不论是天然的还是通过遗传操作，(a)可使用异丁酸作为唯一的碳源，并且(b)具有产生所需产物的代谢能力。
例如，工程改造的大肠杆菌可在发酵期间用作异丁酸源。为了合成例如(S)-3-羟基异丁酸，可将工程改造的大肠杆菌与恶臭假单胞菌的菌株(ATCC 21244)共培养，所述恶臭假单胞菌菌株可自异丁酸产生3-羟酸的S异构体，其收率为48%。为了合成R异构体，可将工程改造的大肠杆菌与酵母菌株皱褶念珠菌(Candida rugosa) (ATCC 10571)共培养。该物种可产生150 g/L (R)-3-羟基异丁酸，其自异丁酸的摩尔转化收率为81.8%。
或者，可通过将异丁酸同化能力导入微生物以进一步修饰本文所述的重组细胞或本文所述的遗传修饰的细胞(统称“生物催化剂”)，使得单一生物催化剂为生物转化所需，来实现自异丁酸的其它化合物的生物合成。例如，异丁酸可通过酰基辅酶A合成酶(Acs)转化为异丁酰辅酶A。异丁酰辅酶A然后可通过酰基辅酶A脱氢酶(AcdH)变成甲基丙烯酰辅酶A。甲基丙烯酰辅酶A通过烯酰辅酶A水合酶(Ech)的水合可形成3-羟基-异丁酰辅酶A，其可通过3-羟基异丁酰辅酶A水解酶(Hibch)水解成为3-羟基异丁酸。3-羟基异丁酸可通过3-羟基异丁酸脱氢酶(MmsB)氧化为甲基丙二酸半醛。最后，所述醛可通过甲基丙二酸半醛脱氢酶(MmsA)转化为丙酰辅酶A。丙酰辅酶A可进入生物合成的主要代谢以支持生长。Acs、AcdH、Hibch、MmsB和MmsA已由各种不同的生物克隆至大肠杆菌，并在新宿主中证明了合适的表达水平和酶活性。可以克隆编码这类蛋白质的基因并将其组织成合成操纵子用于最佳表达。
相比之下，Ech还未克隆至大肠杆菌并在大肠杆菌中表达。未进行研究以鉴定和表征细菌中的这种分解代谢酶。根据KEGG途径数据库，对于恶臭假单胞菌KT2440，10种酶(PP_1412、PP_1845、PP_2136、PP_2217、PP_3283、PP_3284、PP_3358、PP_3491、PP_3726、PP_3732和PP_4030)已被诠释为Ech候选物。可以分别将这些蛋白质克隆至带有其它途径的酶的大肠杆菌菌株，并测试转化株在以异丁酸作为碳源的培养基中的生长。如果在大肠杆菌中改进的酶活性是合乎需要的，则还可利用这种基于生长的选择策略开发出途径中的任何酶。可将Acs、AcdH、Ech和Hibch克隆至产异丁酸的大肠杆菌菌株中。所得到的新的大肠杆菌菌株将能够自葡萄糖生物合成3-羟基丁酸。
对于包括分立步骤的任何本文公开的方法，各步骤可以任何可行的顺序进行。并且在适当时，可同时进行两个或更多个步骤的任何组合。
通过下列实施例对本发明进行说明。要理解的是，将根据本文所述本发明的范围和精神在广义上解释具体的实施例、原料、量和程序。
实施例
实施例
1
1. 载体构建
所有克隆步骤在大肠杆菌菌株XL10-gold (Stratagene，Agilent Technologies，Inc.；Santa Clara，CA)中进行。引物(表2)购自Eurofins MWG Operon。PCR反应按照生产商说明书用PHUSION High-Fidelity DNA聚合酶(New England Biolabs, Inc.; Ipswich, MA)进行。自所有克隆步骤产生的质粒的序列使用限制酶切作图和DNA测序证实。
将编码lac阻抑蛋白LacI的基因片段分别插入质粒pZE12和pZA22
(Lutz和Bujard，1997
Nucleic Acids Res. 25:1203-1210)的SacI位点，得到质粒pZElac和pZAlac。大肠杆菌基因组DNA用引物ilvd_accfwd和ilvd_nherev扩增。所得到的ilvD基因片段用Acc65I和NheI消化。采用重叠PCR，用引物als_accremov/als_accremov_rev
(以除去alsS中的Acc65I位点)以及侧翼寡核苷酸als_nhefwd和als_blprev从枯草芽孢杆菌的基因组DNA中扩增芽孢杆菌乙酰乳酸合酶基因alsS。然后用NheI和BlpI消化alsS PCR产物。然后将纯化的ilvD和alsS基因片段连接至pZAlac以产生质粒pIBA1 (有关质粒图参见图4)。
使用引物kivd_accfwd和kivd_xbarev，自乳酸乳球菌(ATCC)的基因组DNA 扩增2-酮酸脱羧酶基因kivd。PCR产物用Acc65I和XbaI消化，并连接至pZElac以产生质粒pIBA2。Kivd另用kivd_accfwd和kivd_sphrev扩增，PCR产物用Acc65I和SphI消化。YdcW用引物ydcw_sphfwd和ydcw_xbarev自大肠杆菌基因组DNA扩增，其然后用SphI和XbaI消化。然后将纯化的kivd和ydcW基因片段连接至pZElac以产生质粒pIBA3 (有关质粒图参见图5)。AldB用引物aldB_sphfwd和aldB_xbarev自大肠杆菌基因组DNA扩增，用SphI和XbaI消化，然后插入到pIBA3，得到质粒pIBA4。AldH用引物aldH_sphfwd和aldH_sphremov (以除去aldH中的SphI位点)自大肠杆菌基因组DNA扩增。PCR产物再次用引物aldH_sphfwd和aldB_xbarev扩增，用SphI和XbaI消化，然后插入到pIBA3，得到质粒pIBA5。同样地，gabD用引物gabD_sphfwd和gabD_xbarev扩增，而padA用引物padA_sphfwd和padA_xbarev自大肠杆菌基因组DNA扩增。将它们克隆至pIBA3，得到质粒pIBA6和pIBA7。同时kdhba用引物kdhba_sphfwd和kdhba_xbarev自Burkholderia
ambifaria (ATCC BAΑ-244)扩增，消化并连接至pIBA3，得到质粒pIBA8。而kdhpp用引物kdhpp_sphfwd和kdhpp_xbarev自恶臭假单胞菌KT2440
(ATCC 47054D-5)扩增，消化并连接至pIBA3，得到质粒pIBA9。
PadA基因片段使用引物padA_bamfwd和padA_bamrev扩增。在用BamHI消化后，将该基因片段插入表达质粒pQE9
(Qiagen，Inc. Valencia，CA)，得到pIBA10。
表2. 用于克隆的寡核苷酸
2. 发酵步骤和产物分析
宿主菌株
野生型大肠杆菌K-12菌株BW25113
(rrnB T14 ΔlacZ WJ16 hsdR514 ΔaraBAD AH33 ΔrhaBAD LD78)用pIBA1和来自pIBA2-pIBA9的任何质粒转化用于异丁酸产生。
yqhD基因缺失菌株来自Keio collection (Baba等，2006
Mol. Syst. Biol. 2:10.1038)。将其用质粒pCP20转化以除去卡那霉素抗性标记。该ΔyqhD菌株用pIBA1和pIBA7转化用于异丁酸产生。
发酵过程
将在LB培养基中孵育的过夜培养物在125-ml锥形烧瓶中25倍稀释至5 mL补充有0.5%酵母提取物和4%葡萄糖的M9培养基中。适当加入抗生素(氨苄西林100 mg/L和卡那霉素25 mg/L)。加入0.1 mM异丙基-b-D-硫代半乳糖苷(IPTG)以诱导蛋白质表达。通过加入0.5 g CaCO3使培养基缓冲。将培养物置于30℃振荡器(250 rpm)中，孵育48小时。
使用Agilent 1100 Capillary HPLC，通过带有折光率检测的HPLC分析定量测定发酵产物。
3. 酶测定
蛋白质过量表达和纯化
将pIBA10转化至带有pREP4质粒(Qiagen；Valencia，CA)的BL-21大肠杆菌宿主中。将过夜的预培养物在300 mL 2X YT丰富培养基中稀释100倍，所述培养基含有50 mg/L氨苄西林、25 mg/L卡那霉素和0.1 mM IPTG。在30℃下过夜进行重组蛋白的表达。
将细胞沉淀在30 mL裂解缓冲液(250 mM NaCl、2 mM DTT、5 mM咪唑和50 mM Tris pH 8.0)中进行超声处理。通过以15,000
RPM离心20分钟除去细胞碎片。使上清液通过Ni-NTA柱。然后将柱用10 mL洗涤缓冲液(250 mM NaCl、20 mM咪唑和50 mM Tris pH 8.0)洗涤4次。最后，靶蛋白用10 mL洗脱缓冲液(250 mM NaCl、250 mM咪唑和50 mM Tris pH
8.0)洗脱。使用AMICON ULTRA离心过滤器(Millipore Corp.；Billerica，MA)，对洗脱液进行缓冲液交换并浓缩至贮存缓冲液(100 μΜ tris缓冲液(pH 8.0)和20%甘油)。通过在280 nm处测定UV吸光度(消光系数，75070 cm-1M-1)，来检测蛋白质浓度。将经浓缩的蛋白质溶液在PCR管中分成等分试样(100 μl)，并在-80℃下速冻用于长期贮存。
PadA活性的测量
底物异丁醛购自Fisher Scientific International，Inc. (Hampton，NH)，NAD+得自New
England Biolabs，Inc.，(Ipswich，MA)。反应混合物在测定缓冲液(50 mM NaH2PO4，pH 8.0，1 mM DTT)中含有0.5 mM NAD+和0.2-4
mM异丁醛，总体积为80 μl。通过加入2 μl KTVD (最终酶浓度25 nM)开始反应，在340 nm处监测NADH的产生(消光系数，6.22 mM-1cm-1)。通过应用Origin软件将初速度数据拟合至Michaelis-Menten方程式，来求出动力学参数(k cat和K m)。
实施例
2
细菌菌株和质粒。
所有引物均得自Eurofins MWG Operon (Huntsville，AL)并列于表3中。用于该研究的大肠杆菌菌株列于表3中，所述菌株均源自于具有yqhD缺失的野生型大肠杆菌K-12菌株BW25113。所有克隆步骤在大肠杆菌菌株XL10-gold
(Stratagene；Santa Clara，CA)中进行。用于产生异丁酸的质粒pIBA1和pIBA7来自前项研究(Zhang等，2011 ChemSusChem 4:1068-1070)。为了构建携带2拷贝padA的pIBA1质粒1，padA基因用寡核苷酸padA_SacIfwd和padA_SacIrev通过PCR扩增，用SacI消化，然后连接至pIBA7以产生pIBA11。在pIBA11中，额外拷贝的padA与氨苄西林抗性基因bla一起位于在组成型启动子下的相同的操纵子中。adhE、adhP、eutG、yiaY和yjgB的P1噬菌体获自Keio collection
(Baba等，2006 Mol. Syst. Biol. 2:10.1038)。使用噬菌体转染IBA1菌株以构建双敲除菌株。所有的敲除菌株然后用pCP20质粒转化以除去卡那霉素标记。通过PCR证实正确的敲除。为了产生异丁酸，每个菌株用质粒pIBA1加上pIBA7或pIBA1加上pIBA11转化。
表3. 用于该项研究的菌株、质粒和引物
细胞培养和摇瓶发酵。
除非另有说明，细胞在试管中在补充有100 mg/L氨苄西林和50 mg/L卡那霉素的2XYT丰富培养基(16 g/L细菌用胰蛋白胨、10 g/L酵母提取物和5 g/L NaCl)中于37℃培养。将200 μl在2XYT培养基中孵育的过夜培养物转移至125 ml锥形烧瓶中的5 ml M9基本培养基中，所述M9基本培养基补充有5 g/L酵母提取物、40 g/L葡萄糖、100 mg/L氨苄西林和50
mg/L卡那霉素。以0.1 mM的浓度加入异丁基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)以诱导蛋白质表达。发酵液通过存在0.5 g CaCO3而被缓冲。将发酵培养物于30℃下置于速度为250 rpm的振荡器中。
用于发酵罐的培养基。
下列组成是用于大肠杆菌培养的接种培养基(单位克/升)：葡萄糖，10；(NH4)2SO4，1.8；K2HPO4，8.76；KH2PO4，2.4；柠檬酸钠，1.32；酵母提取物，15；氨苄西林，0.1；卡那霉素，0.05。用于生物反应器培养的发酵培养基含有以下组成(单位克/升)：葡萄糖，30；(NH4)2SO4，3；K2HPO4，14.6；KH2PO4，4；柠檬酸钠，2.2；酵母提取物，25；MgSO4.7H2O，1.25；CaCl2.2H2O，0.015；泛酸钙，0.001；硫胺，0.01；氨苄西林，0.1；卡那霉素，0.05；和1 mL/L痕量金属溶液。痕量金属溶液含有(单位克/升)：NaCl，5；ZnSO4.7H2O，1；MnCl2.4H2O，4；CuSO4.5H2O，0.4；H3BO3，0.575；Na2MoO4.2H2O，0.5；FeCl3.6H2O，4.75；6N H2SO4，12.5 mL。进料溶液含有(单位克/升)：葡萄糖，600；(NH4)2SO4，5；MgSO4.7H2O，1.25；酵母提取物，5；CaCl2.2H2O，0.015；泛酸钙，0.001；硫胺，0.01；氨苄西林，0.1；卡那霉素，0.05，0.2 mM IPTG；和1 mL/L痕量元素。
发酵罐培养条件。
使用0.6 L的工作容积，在1.3 L Bioflo 115发酵罐(NBS；Edison，NJ)中进行大肠杆菌的培养。发酵罐用含接种培养基的10%过夜预培养物接种，然后使细胞在37℃、30%溶解氧(DO)水平和pH 7.0下生长。在OD600达到8.0后，加入0.2 mM IPTG，将温度转换到30℃以开始异丁酸生产。通过分别自动加入10 M氢氧化钠溶液、50%氢氧化铵溶液或200 g/L氢氧化钙悬浮液，来控制pH为7.0。在整个过程中保持空气流速在1 vvm。通过调节搅拌速度(300-800 rpm)，保持DO在相对于空气饱和的约10%。通过自动加入进料培养基，保持发酵罐中的葡萄糖水平约为10
g/L。如果DO超过40%且异丁酸水平不提高，则停止发酵过程。收集不同时间点上的发酵样品以测定光密度和代谢物浓度。
代谢物分析和细胞干重测定。
采用配备有Aminex HPX 87H柱(Bio-Rad；Hercules，CA)和折光率检测器的Agilent 1260 Infinity HPLC对发酵产物进行分析。流动相为5 mM
H2SO4，流速为0.6 mL/分钟。柱温度和检测温度分别为35℃和50℃。通过使5 mL培养物通过0.45 μm玻璃纤维过滤器(Michigan
Fiberglass Sales；St. Clair Shores，MI)过滤，来测定细胞干重。在除去培养基后，将过滤器用15 mL
MilliQ水洗涤，在烘箱中干燥，然后称重。一式三份测定细胞干重。
实施例
3
克隆步骤
用引物
bkdh_ecofwd (TgcatcgaattcAGGAGAAATTAACTatgAACGAGTACGCCCCCCTGCGTTTGC (SEQ
ID NO: 145))和bkdh_hindrev (TgcatcaagcttTCAGATATGCAAGGCGTGGCCCAG
(SEQ ID NO: 146))，自恶臭假单胞菌KT2440基因组DNA扩增BKDH酶复合物基因。PCR产物然后用EcoRI和HindIII消化，并插入到pZE12以制备pIBA16。
使用引物对
TesA_HindIII_F (GGGCCCaagcttaggagaaattaactatgATGAACTTCAACAATGTTTTCCG (SEQ
ID NO: 147))和TesA_XbaI__R (gggccctctagattaTGAGTCATGATTTACTAAAGGCT
(SEQ ID NO: 148))，自大肠杆菌菌株K12基因组DNA扩增tesA基因；用引物对TesB_HindIII_F
(GGGCCCaagcttaggagaaattaactatgatgAGTCAGGCGCTAAAAAATTTACT (SEQ ID NO: 149))和TesB_Xba1_R (gggccctctagattaATTGTGATTACGCATCACCCCTT (SEQ
ID NO: 150))扩增tesB。在PCR后，将DNA片段纯化，并用限制性内切酶HindIII和Xba1消化。将含有tesA的消化片段插入到pIBA16以制备pIBA17；将含有tesB的消化片段插入pIBA16以制备pIBA18。
发酵过程
将在LB培养基中孵育的过夜培养物在125-mL锥形烧瓶中25倍稀释到5 mL补充有0.5%酵母提取物和4%葡萄糖的M9培养基中。适当加入抗生素(氨苄西林100 mg/L和卡那霉素25 mg/L)。加入0.1 mM异丙基-b-D-硫代半乳糖苷(IPTG)以诱导蛋白质表达。通过加入0.5 g CaCO3使培养基缓冲。将培养物置于30℃振荡器(250 rpm)中，并孵育48小时。
采用Agilent 1100 Capillary HPLC，通过具有折光率检测的HPLC分析定量测定发酵产物。结果见表4。
表4. 用新途径产生异丁酸
| 菌株 | 修饰 | 异丁酸 (g/L) |
| pIBA1+ pIBA16 | BKDH | 5.61±0.67 |
| pIBA1+ pIBA17 | BKDH+TesA | 6.47±0.22 |
| pIBA1+ pIBA18 | BKDH+TesB | 8.62±0.10 |
本文引用的全部专利、专利申请和出版物及电子可获取材料(包括例如在例如GenBank和RefSeq中的核苷酸序列提交和在例如SwissProt、PIR、PRF、PDB中的氨基酸序列提交，以及从GenBank和RefSeq中注释的编码区得到的翻译)的完整公开内容均通过引用以其整体予以结合。如果本申请的公开内容与通过引用结合到本文的任何文献的公开内容之间存在任何不一致性时，则应以本申请的公开内容为准。前面的发明详述和实施例仅为了清楚理解而提供。不应从其中理解为不必要的限制。本发明不限于已显示和描述的确切细节，因为对本领域技术人员而言明显的改变将包括在由权利要求书所限定的本发明范围内。
除非另有说明，用于本说明书和权利要求书的表示组分的量、分子量等的所有数值，要理解为在所有情况下都被术语“约”修饰。因此，除非有对相反情况的说明，本说明书和权利要求书所示数值参数是近似值，其可随本发明欲寻求的所需性质而改变。丝毫无企图限制相当于权利要求书范围的教义，每个数值参数至少应根据所报告的有效数字的数目并应用普通舍入技术来解释。
尽管本发明的宽范围给出的数值范围和参数是近似值，但是要尽可能准确地报告具体实施例给出的数值。然而，所有数值固有地包含必然产生于在其各自测定中存在的标准差的范围。
所有标题出于读者便利，不应用来限制该标题下的文本的含义，除非另有说明。
Claims (69)
1.一种重组微生物细胞，与野生型对照相比，其经修饰以显示异丁酸的生物合成增加。
2.权利要求1的重组微生物细胞，其中所述细胞是真菌细胞。
3.权利要求2的重组细胞，其中所述真菌细胞是酵母科的成员。
4.权利要求2的重组细胞，其中所述真菌细胞是酿酒酵母。
5.权利要求1的重组细胞，其中所述细胞是细菌细胞。
6.权利要求5的重组细胞，其中所述细菌细胞是变形菌门的成员。
7.权利要求6的重组细胞，其中所述细菌细胞是肠杆菌科的成员。
8.权利要求7的重组细胞，其中所述细菌细胞是大肠杆菌。
9.权利要求6的重组细胞，其中所述细菌细胞是假单胞菌科的成员。
10.权利要求9的重组细胞，其中所述细菌细胞是恶臭假单胞菌。
11.权利要求5的重组细胞，其中所述细菌细胞是厚壁菌门的成员。
12.权利要求11的重组细胞，其中所述细菌细胞是芽胞杆菌科的成员。
13.权利要求12的重组细胞，其中所述细菌细胞是枯草芽孢杆菌。
14.权利要求11的重组细胞，其中所述细菌细胞是链球菌科的成员。
15.权利要求14的重组细胞，其中所述细菌细胞是乳酸乳球菌。
16.前述权利要求中任一项的重组细胞，所述重组细胞包含至少一种异源DNA分子，所述异源DNA分子编码催化异丁醛转化为异丁酸的多肽。
17.权利要求16的重组细胞，其中所述催化异丁醛转化为异丁酸的多肽包括醛脱氢酶。
18.权利要求17的重组细胞，其中所述醛脱氢酶包括大肠杆菌苯乙醛脱氢酶(PadA)。
19.权利要求17的重组细胞，其中所述醛脱氢酶包括大肠杆菌乙醛脱氢酶(AldB)、大肠杆菌3-羟基丙醛脱氢酶(AldH)、大肠杆菌琥珀酸半醛脱氢酶(GabD)或大肠杆菌γ-氨基丁醛脱氢酶(YdcW)。
20.权利要求17的重组细胞，其中所述醛脱氢酶包括B.ambifariaα-酮戊二酸半醛脱氢酶(KDHba)。
21.权利要求17的重组细胞，其中所述醛脱氢酶包括恶臭假单胞菌α-酮戊二酸半醛脱氢酶(KDHpp)。
22.前述权利要求中任一项的重组细胞，其中所述细胞还包含催化异丁醛转化为异丁醇的多肽的遗传修饰形式，其中与野生型多肽相比，所述遗传修饰形式的多肽显示催化活性降低。
23.权利要求22的重组细胞，其中所述遗传修饰的多肽包括醇脱氢酶。
24.权利要求23的重组细胞，其中所述醇脱氢酶包括由遗传修饰的adhE或遗传修饰的adhP编码的多肽。
25.权利要求22的重组细胞，其中所述遗传修饰的多肽包括乙醇胺利用蛋白。
26.权利要求25的重组细胞，其中所述乙醇胺利用蛋白包括由遗传修饰的eutG编码的多肽。
27.权利要求22的重组细胞，其中所述遗传修饰的多肽包括由遗传修饰的yiaY、遗传修饰的yqhD或遗传修饰的yigB编码的多肽。
28.权利要求22-27中任一项的重组细胞，其中与野生型相比，所述催化活性的降低包括至少50％的降低。
29.权利要求1-15中任一项的重组细胞，所述重组细胞包含至少一种异源DNA分子，所述异源DNA分子编码其为催化2-酮缬氨酸转化为异丁酸的途径的成员的多肽。
30.权利要求29的重组细胞，其中所述其为催化2-酮缬氨酸转化为异丁酸的途径的成员的多肽包括支链酮酸脱氢酶。
31.权利要求30的重组细胞，其中所述其为催化2-酮缬氨酸转化为异丁酸的途径的成员的多肽包括硫酯酶。
32.权利要求31的重组细胞，其中所述硫酯酶包括TesA或TesB。
33.前述权利要求中任一项的重组细胞，其中所述细胞还包含多肽的遗传修饰形式，所述多肽催化丙酮酸转化为乳酸、甲酸和乙酸中的任何一种或多种，其中与野生型多肽相比，所述遗传修饰形式的多肽显示催化活性降低。
34.权利要求33的重组细胞，其中所述遗传修饰的多肽包括乳酸脱氢酶。
35.权利要求34的重组细胞，其中所述乳酸脱氢酶包括由遗传修饰的ldhA编码的多肽。
36.权利要求33的重组细胞，其中所述遗传修饰的多肽包括丙酮酸甲酸裂解酶I。
37.权利要求36的重组细胞，其中所述丙酮酸甲酸裂解酶I包括由遗传修饰的pflB编码的多肽。
38.权利要求33的重组细胞，其中所述遗传修饰的多肽包括丙酮酸氧化酶。
39.权利要求35的重组细胞，其中所述丙酮酸氧化酶包括由遗传修饰的poxB编码的多肽。
40.前述权利要求中任一项的重组细胞，其中所述细胞还包含多肽的遗传修饰形式，所述多肽催化乙酰辅酶A转化为乙醇或乙酰基-P，其中与野生型多肽相比，所述遗传修饰形式的多肽显示催化活性降低。
41.权利要求40的重组细胞，其中所述遗传修饰的多肽包括醇脱氢酶。
42.权利要求41的重组细胞，其中所述醇脱氢酶包括由遗传修饰的adhE编码的多肽。
43.权利要求40的重组细胞，其中所述遗传修饰的多肽包括磷酸乙酰转移酶。
44.权利要求43的重组细胞，其中所述磷酸乙酰转移酶包括由遗传修饰的pta编码的多肽。
45.前述权利要求中任一项的重组细胞，其还包含催化2-酮异戊酸转化为异丁醛的多肽。
46.权利要求45的重组细胞，其中所述多肽包括2-酮酸脱羧酶。
47.前述权利要求中任一项的重组细胞，其还包含序贯催化丙酮酸转化为2-酮异戊酸的多种多肽。
48.权利要求47的重组细胞，其中所述多种多肽包括以下的一种或多种：二羟酸脱水酶、酮醇酸还原异构酶和乙酰乳酸合酶。
49.一种方法，包括：
在对前述权利要求中任一项的重组细胞产生异丁酸有效的条件下，将所述重组细胞在包含碳源的培养基中孵育，其中所述碳源包括以下的一种或多种：葡萄糖、图1的化合物6、图1的化合物7、图1的化合物8、图1的化合物9和图1的化合物10。
50.一种方法，包括：
将与启动子有效连接的异源多核苷酸导入宿主细胞，使得修饰的宿主细胞催化异丁醛转化为异丁酸，其中所述异源多核苷酸编码催化异丁醛转化为异丁酸的多肽。
51.权利要求50的方法，其中所述宿主细胞是真菌细胞。
52.权利要求51的方法，其中所述真菌细胞是酵母科的成员。
53.权利要求52的方法，其中所述真菌细胞是酿酒酵母。
54.权利要求50的方法，其中所述细胞是细菌细胞。
55.权利要求54的方法，其中所述细菌细胞是变形菌门的成员。
56.权利要求55的方法，其中所述细菌细胞是肠杆菌科的成员。
57.权利要求56的方法，其中所述细菌细胞是大肠杆菌。
58.权利要求55的方法，其中所述细菌细胞是假单胞菌科的成员。
59.权利要求58的方法，其中所述细菌细胞是恶臭假单胞菌。
60.权利要求59的方法，其中所述细菌细胞是厚壁菌门的成员。
61.权利要求60的方法，其中所述细菌细胞是芽胞杆菌科的成员。
62.权利要求61的方法，其中所述细菌细胞是枯草芽孢杆菌。
63.权利要求60的方法，其中所述细菌细胞是链球菌科的成员。
64.权利要求63的方法，其中所述细菌细胞是乳酸乳球菌。
65.权利要求50-66中任一项的方法，其中所述宿主细胞包括权利要求16-48中任一项或多项的重组细胞。
66.权利要求49-68中任一项的方法，所述方法还包括将异丁酸转化成另一种化合物的一个或多个步骤。
67.一种遗传修饰的微生物细胞，其包含至少一种经修饰以提高其将异丁醛转化成异丁酸的能力的内源酶。
68.权利要求68的遗传修饰的微生物细胞，其中所述修饰的酶催化异丁醛转化为异丁酸。
69.权利要求68的遗传修饰的微生物细胞，其中所述修饰的酶提高细胞耐受包含高水平异丁酸的环境的能力。
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