CN107881186B - 利用乙酸生产羟基丙酸的代谢工程大肠杆菌菌株的构建方法与应用 - Google Patents

利用乙酸生产羟基丙酸的代谢工程大肠杆菌菌株的构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种利用乙酸生产羟基丙酸代谢工程大肠杆菌菌株的构建方法，代谢工程改造的大肠杆菌以乙酸为原料发酵生产羟基丙酸，其改造途径为构建乙酰CoA生产羟基丙酸的代谢途径，并和/或过表达乙酸摄入途径的相关基因以增强乙酸的运输速率，并和/或阻断TCA循环或下调TCA循环以增加流向目标代谢产物的乙酰CoA代谢流，并和/或减少苹果酸和草酰乙酸的脱羧反应以缺失副产物生成途径，和/或缺失乙醇生产途径中关键基因以调节乙酰CoA节点代谢流，和/或辅酶工程调节胞内氧化还原平衡。本发明通过构建外源表达羟基丙酸生产途径，并对代谢途径和调控的分析，利用基因工程手段对大肠杆菌进行了改造，获得的菌株能够在以乙酸为碳源的培养基中生产羟基丙酸。

Description

利用乙酸生产羟基丙酸的代谢工程大肠杆菌菌株的构建方法 与应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，更具体地讲，涉及构建利用乙酸生产羟基丙酸的重组大肠杆菌菌株。
背景技术
3-羟基丙酸(3-HP)是一种重要的平台化合物，2004年美国能源部(DOE)提出了12种重要的平台化合物，3-HP排在第四位。3-HP是一种三碳化合物，其化学性质活泼，两端分别带有一个羧基和一个羟基，使得其具有广泛的应用。3-HP可以用来生产许多化合物，如，丙烯酸、1,3-丙二醇、丙烯酰胺、丙二酸等等，还可以作为聚合涂料和金属润滑油的交联剂及纺织品的抗静电剂。目前，生产3-HP的方法主要是化学合成法，如溴3-羟基丙醛氧化法、丙酸水解法和2-氰基乙醇酸碱法。有报道指出，在高温下利用丙烯酸与水直接反应来生产3-HP，得到的产率、转化率和含量分别为62.3％、31.1％和98.4％。这种化学合成法与传统的化学合成法相比工艺简单，无需催化剂，产品含量高，后期的分离也相对容易。因此，这种方法生产3-HP成为市场上的主要来源。但是，化学合成法存在很多问题，如生产难度大，工艺需要高温高压，安全性低，生产成本高。因此，近几年来越来越多的国内外研究者试图通过生物合成法生产3-羟基丙酸。相比与化学合成法，微生物发酵法生产3-HP具有条件温和，节约能源，可利用非石油的可再生资源，环境友好等的特点。但天然微生物生产3-HP的产量很低，因此，要想提高3-HP的产量，对微生物的遗传特性进行修饰改造是有必要的。
目前利用代谢工程手段构建的3-HP的生产菌通常以E.coli或K.pneumoniae为宿主。K.pneumoniae是兼性厌氧菌，其能够天然生产微生素B12，且其具有较高的甘油耐受力和较高的转化率，由于其生化特性与大肠杆菌非常相近，从而使其成为研究甘油生物歧化过程的工具菌，使其能够利用甘油为底物来生产3-HP，且其甘油的代谢机理已经研究的很透彻。但利用K.pneumoniae以甘油为底物厌氧生产3-HP，但也存在不少问题：DhaB对氧很敏感，在有氧条件下很快失活；DhaB的催化作用严格依赖辅酶B12，克雷伯氏菌虽能生产辅酶B12，但在有氧条件下生成量很少，必须额外加入；克雷伯氏菌生长较慢，发酵条件不好控制等，由于这些因素的限制使得3-HP工业化受到限制。另一方面，E.coli的遗传学背景、分子生物学、生物化学以及生理学方面的研究已非常深入，有不少的研究报道选择E.coli为宿主菌并对其进行分组改造来生产3-HP。在大肠杆菌中以葡萄糖为底物生产3-HP，Park课题组通过过表达来自橙色绿屈挠菌的NADPH依赖的丙二酰-CoA还原酶基因(mcr),重组菌在好氧条件下摇瓶培养24h生产3-HP为0.71mM，同时过表达乙酰-CoA羧化酶和生物素酶，3-HP最终浓度提高了2倍，再过表达NADH转氢酶编码基因pntAB，3-HP的浓度提高到2.14mM。但利用重组大肠杆菌生产3-HP，往往需要在培养基中额外添加昂贵的辅酶B12。但利用乙酸来生产3-HP目前仍未有报道。
乳酸广泛用于食品、酿酒、饮料、医药、皮革、饲料、塑料化工、农药等领域。乳酸的生产包括化学合成法、酶法、生物发酵法。乳酸的化学合成途径有多种，最常见的是乳腈法，此法合成过程较为复杂，使用了大量的有毒有害的物质作为中间产物或原料；酶法需要特定的底物，反应后不能得到纯的L-乳酸，另外酶的纯化与提取也是此法的限制因素。发酵法是以淀粉、蔗糖、糖蜜等为主要原料，经发酵、提取、浓缩等生产工艺精制而得。目前可以应用到工业上的生产菌株主要有霉菌中的根霉属和细菌中的乳酸菌属。通过糖分解代谢将糖转化为乳酸是革兰氏阳性菌和乳酸菌中主要的代谢途径，乳酸脱氢酶(LDH)以NADH为辅酶，能将丙酮酸转化为乳酸，是乳酸菌合成乳酸过程中的关键酶。另外，乳酸作为厌氧代谢产物，在好氧条件下，可以通过控制呼吸链的强弱来积累乳酸。Wu等(Metab.Eng.2015(28):159–168)研究表明，在好氧条件下，通过缺失ubiX基因降低细胞内辅酶Q8的含量，进而降低呼吸链的强度，从而在好氧条件下实现乳酸的积累。但目前利用乙酸来生产乳酸的菌株构建及发酵条件仍没有报道。
乙酸主要由甲醇的羰基化制备，即甲醇和一氧化碳制备，是一种大量而廉价的碳源，同时也是木质纤维素材料酸水解中形成的主要副产物之一；乙酸也能通过生物法由CO2、CO、CH4等一碳化合物转化而来；同时，乙酸是许多微生物厌氧代谢的终产物和有氧代谢的不完全氧化产物。大肠杆菌可以好氧代谢乙酸进行生长，已报道，乙酸可以用来生产脂肪酸、琥珀酸等。本发明通过对大肠杆菌进行途径改造，使其能够以乙酸为碳源生产羟基丙酸。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种利用乙酸生产羟基丙酸代谢工程大肠杆菌菌株的构建方法。
本发明的第二个目的在于提供利用上述构建方法得到的代谢工程大肠杆菌菌株。
本发明的第三个目的在于提供利用上述构建方法得到的代谢工程大肠杆菌菌株在以乙酸为碳源发酵生产羟基丙酸中的应用。
为实现以上目的，本发明公开以下技术方案：一种利用乙酸生产羟基丙酸代谢工程大肠杆菌菌株的构建方法，其特征在于，代谢工程改造的大肠杆菌以乙酸为原料发酵生产羟基丙酸，所述羟基丙酸是指3-羟基丙酸、或乳酸、或3-羟基丙酸和乳酸混合物，其改造途径为构建乙酰CoA生产羟基丙酸的代谢途径，并和/或过表达乙酸摄入途径的相关基因以增强乙酸的运输速率，并和/或阻断TCA循环或下调TCA循环以增加流向目标代谢产物的乙酰CoA代谢流，并和/或减少苹果酸和草酰乙酸的脱羧反应以缺失副产物生成途径，和/或缺失乙醇生产途径中关键基因以调节乙酰CoA节点代谢流，和/或辅酶工程调节胞内氧化还原平衡。
作为一个优选方案，若目标产物为3-羟基丙酸，过表达来源于谷氨酸棒杆菌的乙酰-CoA羧化酶编码基因(acc)与来源于绿曲绕丝状菌(C.aurantiacua)丙二酰-CoA还原酶编码基因(mcr)，实现3-羟基丙酸合成；通过过表达来源于Candida boidinii菌株的甲酸脱氢酶编码基因fdh以增加胞内可利用的NADH含量，通过过表达来源于E.coli的转氢酶编码基因(pntAB、udhA)和/或NAD激酶编码基因(nadK)以增加胞内NADH转变成NADPH的含量，从而为3-羟基丙酸的生产提供所需的辅酶。
作为一个优选方案，若目标代谢产物为乳酸，过表达丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶编码基因(pfor)，过表达乳酸脱氢酶编码基因(ldh)，实现乳酸合成，通过过表达来源于Candida boidinii菌株的甲酸脱氢酶编码基因fdh以增加胞内可利用的NADH含量，从而为乳酸的生产提供所需的辅酶。
作为一个优选方案，丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶编码基因来源于Clostridiumthermocellum、Clostridium sp.BNL1100、Clostridium clariflavum、Clostridiumbutyricum、Clostridium pasteurianum BC1、Clostridium baratii str.Sullivan、Alkaliphilus oremlandii或Desulfotalea psychrophila LSv54菌株。
作为一个优选方案，若目标代谢产物为3-羟基丙酸和乳酸混合物，过表达来源于Propionibacterium freudenreichii的甲基丙二酰-CoA羧基转移酶编码基因(mmc)，与来源于绿曲绕丝状菌丙二酰-CoA还原酶编码基因(mcr),过表达乳酸脱氢酶编码基因(ldh)，实现3-羟基丙酸和乳酸联产；通过过表达来源于E.coli的转氢酶编码基因(pntAB、udhA)和/或NAD激酶编码基因(nadK)以增加胞内NADPH含量；通过过表达来源于Candidaboidinii菌株的甲酸脱氢酶编码基因fdh以增加胞内可利用的NADH含量，从而为3-羟基丙酸和乳酸的生产提供所需的辅酶。
作为一个优选方案，对宿主菌的改造包括以下一种或几种：
(1)过表达acs
(2)过表达ackA和pta
(3)下调gltA表达
(4)缺失pckA
(5)缺失adhE
(6)缺失icdA
(7)缺失maeB和/或scfA
(8)缺失ubiX和/或ubiD和/或ubiE和/或ubiG
(9)缺失poxB。
作为一个优选方案，对宿主菌的改造包括：过表达acs或过表达ackA和pta。
作为一个优选方案，对宿主菌的改造包括：过表达ackA和pta，下调gltA表达水平。
作为一个优选方案，对宿主菌的改造包括：过表达ackA和pta，下调gltA表达水平，缺失icdA,缺失pckA。
作为一个优选方案，对宿主菌的改造包括：过表达ackA和pta，下调gltA表达水平，缺失icdA,缺失pckA，缺失adhE。
作为一个优选方案，对宿主菌的改造包括：过表达ackA和pta，下调gltA表达水平，缺失icdA,缺失pckA，缺失adhE缺失maeB或scfA。
作为一个优选方案，对宿主菌的改造包括：过表达ackA和pta，下调gltA表达水平，缺失icdA,缺失pckA，缺失poxB，缺失adhE。
作为一个优选方案，对宿主菌的改造包括：过表达ackA和pta，下调gltA表达水平，缺失icdA，缺失pckA，缺失poxB，缺失adhE,缺失maeB和/或scfA,缺失ubiX和/或ubiD和/或ubiE和/或ubiG。
对于3-羟基丙酸及同时生产3-羟基丙酸和乳酸，作为一个优选方案，对宿主菌的改造还可以敲除基因maeB。
为实现本发明第二个目的，本发明公开以下技术方案：利用上述构建方法得到的代谢工程大肠杆菌菌株。
为实现本发明第三个目的，本发明公开以下技术方案：利用上述构建方法得到的代谢工程大肠杆菌菌株在以乙酸为碳源发酵生产羟基丙酸中的应用。可以乙酸为唯一碳源，在大肠杆菌常用的发酵培养基M9中发酵生产羟基丙酸。
上述每一优选方案均作为改造的方向，但可以不全部进行改造。多种组合仅是为了提高生产效率和产量。
本发明构建高效利用乙酸生产羟基丙酸的大肠杆菌，即根据已有信息对大肠杆菌途径进行分析，利用基因工程手段对大肠杆菌基因进行改造，获得好氧条件下能够以乙酸作为唯一碳源生产羟基丙酸的代谢工程大肠杆菌，并利用改造后的代谢工程菌株以乙酸为唯一碳源生产羟基丙酸。
本发明的方法是利用分子生物学技术构建外源表达的羟基丙酸生产途径，另外，采用CRISPR-dCas9技术下调gltA表达，并利用Red重组技术敲除maeB、pckA、adhE、icdA缺失菌或组合缺失菌。
本发明以野生型大肠杆菌MG1655为出发菌，构建3-羟基丙酸、乳酸及共同生产3-羟基丙酸与乳酸的合成途径。同时，本发明以乙酸为碳源，通过对乙酸摄入途径ACK-PTA的改造，可以进一步提高乙酸的吸收速率。乙酰CoA作为羟基丙酸关键前体物质，同时也是中心代谢的关键节点，因此，通过下调gltA调节乙酰CoA代谢流可以增加乙酰CoA流向目标产物的代谢流可以提高羟基丙酸的产量，也能够维持中心代谢，保证能量和生长必需的前体物质供应。通过敲除基因maeB和pckA可以减少TCA循环中间代谢物进入糖异生途径，敲除基因adhE可以减少乙酰CoA进入乙醇合成途径。
本发明的优点在于：本发明通过构建外源表达羟基丙酸生产途径，并对代谢途径和调控的分析，利用基因工程手段对大肠杆菌进行了改造，获得的菌株能够在以乙酸为碳源的培养基中生产羟基丙酸。
附图说明
图1为重组大肠杆菌利用乙酸生产3-羟基丙酸代谢图
图2为重组大肠杆菌利用乙酸生产乳酸代谢图
图3为重组大肠杆菌利用乙酸共同生产3-羟基丙酸和乳酸代谢图
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1.构建3-羟基丙酸、乳酸及同时生产3-羟基丙酸和乳酸代谢途径
以乙酸为碳源，生产3-羟基丙酸、乳酸及同时生产3-羟基丙酸和乳酸，乙酸首先转化为乙酰-CoA，部分乙酰-CoA转化为目标代谢产物，部分乙酰-CoA进入中心代谢途径。为了使乙酰-CoA转化为不同目标代谢产物，构建不同质粒。具体操作如下：
构建3-羟基丙酸生产途径：由乙酰-CoA首先在乙酰-CoA羧化酶的作用下，生成丙二酰-CoA，进而在丙二酰-CoA还原酶的作用下生成3-HP。因此，可以选择不同来源的乙酰-CoA羧化酶及丙二酰-CoA还原酶编码基因进行过表达。本专利选用来源于谷氨酸棒状杆菌的乙酰-CoA羧化酶编码基因(两个亚基，对应的基因分别为dtsR1、accBC)与来源于绿曲绕丝杆菌(Chloroflexus aurantiacus)的丙二酰-CoA还原酶编码基因(mcr)在大肠杆菌表达，其中MCR通过密码子优化合成而成。通过T4连接酶或无缝克隆构建以下质粒：pTrc-99a-mcr-dstR1-accBC(pTrc99a-MDA)、pET-28a-mcr-dstR1-accBC(pET28a-MDA)。
构建乳酸生产途径：乙酰-CoA可以在不同菌株来源的丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶(PFOR)作用下结合一分子CO2生成丙酮酸，丙酮酸在一定条件下通过乳酸脱氢酶生成乳酸。因此，通过直接PCR扩增或密码子优化后合成不同来源的PFOR编码基因，通过无缝克隆连接构建重组质粒pTrc99a-pfor。
构建共同生产3-羟基丙酸和乳酸途径：来源于Propionibacterium的甲基丙二酰-CoA羧基转移酶(MMC)能够催化乙酰-CoA和草酰乙酸生成丙酮酸和丙二酰-CoA。其中丙二酰-CoA可以在丙二酰-CoA还原酶作用下进一步生成3-羟基丙酸；丙酮酸在一定条件下通过乳酸脱氢酶催化生成乳酸。甲基丙二酰-CoA羧基转移酶由多个蛋白组成，包括M18870、MmdA、HY、BCCP。通过密码子优化合成以上四段基因，每段基因起始密码子前加上经过计算获得的最优的RBS位点，将其串联连接在质粒pTrc99a上，得到重组质粒pTrc99a-mmc。通过无缝克隆方式将mcr基因连接到重组质粒pTrc99a-mmc，得到新的重组质粒pTrc99a-mmc-mcr，以实现3-羟基丙酸和乳酸联产。
实施例2.对宿主菌相关基因(ack、pta、ldh)启动子替换
对于利用MG1655为出发菌，以乙酸为唯一碳源生产3-HP、乳酸及同时生产3-HP和乳酸，通过替换替换ack与pta的启动子以增强其表达，进而提高乙酸的摄取速率。启动子替换方式采用Red重组方式，替换的启动子来源于trc启动子突变且为组成型表达。将所得的菌株命名为HY01，该菌株由实验室保藏。
对于生产乳酸及同时生产乳酸和3-羟基丙酸，在HY01菌株基础上采用Red重组方式替换乳酸脱氢酶编码基因(ldh)启动子，将该菌株命名为HY011。具体操作为：首先通过设计引物扩增带有目标启动子的卡那片段，通过Dpn I消化以除去甲基化的模板质粒。宿主菌中钙转化导入质粒pKD46，以氨苄青霉素筛选重组子。导入pKD46的重组菌30℃培养至OD600约为0.3时，加入L-阿拉伯糖诱导1小时，然后使用10％的甘油制备电转感受态。将以上获得的卡那片段转入制备好的电转感受态中。电转化采用细菌模式1(1.8KV，5ms)进行，使用卡那霉素筛选发生同源重组的转化子。设计替换验证引物，采用菌落PCR方法验证启动子是否替换成功，对PCR验证的阳性克隆子进一步测序验证，以确保替换的启动子区域没有发生突变。
对启动子替换成功的重组菌，37℃培养5-6小时后，转入42℃培养过夜，分离单菌落，然后验证抗性。只有卡那霉素抗性无氨苄青霉素抗性的为pKD46已消除的菌落。然后在该菌中转入质粒pCP20，30℃培养一段时间后，转入42℃培养过夜，分离单菌落，然后验证抗性。挑取只在无抗性平板上生长，而卡那霉素抗性平板和氨苄青霉素抗性平板上均不生长的菌落进行鉴定。使用以上的验证引物进行菌落PCR，抗性消除成功的转化子与野生菌PCR得到的目的片段大小相似，而与抗性未消除菌株PCR片段大小存在明显的差异，能够判定抗性基因是否消除重组成功。
Figure BDA0001437153040000081
Figure BDA0001437153040000091
以上序列参见SEQ ID NO.1—SEQ ID NO.18。
实施例3.相关基因敲除以提高目标产物的产量及得率
对于乳酸的生产，通过敲除ubiX降低呼吸链强度，以积累乳酸，在HY 011菌株中敲除ubiX,得到HY 012菌株。
由于在以乙酸为碳源的培养基中，糖异生途径的基因表达上调，以致于过多的碳源流向糖异生途径。因此，采用Red重组的方法敲除基因pckA、adhE、和sfcA。将在HY 01及HY012基础上敲除pckA的菌株命名为HY 02、HY 022,在HY 02和HY 022基础上敲除icdA的菌株命名为HY 03、HY 032，对于3-羟基丙酸的生产，在HY 02的基础上上进一步敲除maeB，将该菌株命名为HY 031。
基因敲除的具体操作如下：对于基因ubiX的敲除，由本实验室保藏的E.coliMG1655单缺失ubiX菌株为模板，首先设计引物，通过PCR克隆约1700bp的带有卡那抗性的DNA片段。通过电转将该片段转入宿主菌的电转感受态中，宿主菌的电转感受态的制备及敲除的验证和卡那抗性的消除同上述ack-pta启动子替换部分所述。
基因pckA、icdA、adhE、sfcA、maeB，与基因ubiX的敲除方法相同。
实施例4.通过反义RNA技术或CRASPR-dCas9系统下调gltA表达
本专利采用两种方法下调gltA基因的表达，以增强乙酰CoA流向目标产物的代谢流。
采用反义RNA技术下调gltA基因的表达：从NCBI上查找来源于E.coli K12系列菌株的柠檬酸合梅的编码基因(gltA)，根据获得的序列及其5，端上游调控区域序列，设计不同的反义RNA引物,通过PCR扩增得到不同序列及长短的反义RNA。
采用CRISPR-dCas9技术下调gltA基因的表达:根据获得的gltA序列及其启动子区域的序列，利用Cas-Designer网站(http://www.rgenome.net/cas-designer/)设计不同的sgRNA。具体操作如下：
获得宿主菌的电转感受态，将predcas9质粒通过电转转入宿主菌中，涂布含终浓度为50mg/L的奇霉素平板。由于predcas9质粒为温敏性的质粒，因此，在32℃过夜培养。挑单克隆，抽质粒验证目的质粒是否成功转入。对成功转入目的质粒的单克隆进一步制备电转感受态。3mL LB在32℃过夜培养E.coli-predcas9，转接0.5-1mL试管菌液至50mL LB,32℃培养至OD600＝0.5，冰上放置10min，冰水洗两遍后，每1mL菌液浓缩至50μL感受态分装，用于电转pGRB-sgRNA。
pGRB-sgRNA构建：根据上述方法得到的sgRNA，设计带有20bp sgRNA突出序列的引物扩增pGRB质粒。在该上下游的引物的5，端均含有20bp sgRNA，且其序列反向互补，便于PCR得到的线性化载体转化后能够自连接形成环状质粒pGRB-sgRNA。将PCR扩增得到的片段通过钙转转入E.coli感受态中。从而在细胞内该片段能自连接形成环状质粒pGRB-sgRNA。涂布氨苄抗性平板，挑菌后测序验证该质粒中是否带有目标sgRNA。对于测序阳性质粒以上所述方法转入E.coli-predcas9感受态中。涂布含100mg/L氨苄抗生素和50mg/L奇霉素平板。
实施例5.通过辅酶工程策略以增加胞内可利用的NADPH或NADH
对于3-HP的生产，由于丙二酰-CoA还原酶MCR需要辅因子NADPH，增强胞内NADPH含量可以提高3-HP产量。因此，过表达NAD激酶及转氢酶酶以增加胞内NADPH含量，包括来源于大肠杆菌的PntAB、UdhA、NadK。由于质粒pBAD33启动子由阿拉伯糖诱导，因此，替换其启动子为Trc启动子，以IPTG诱导。获得如下质粒：pBAD33-Trc-pntAB,pBAD33-Trc-udhA,pBAD33-Trc-nadK。其构建方法采用无缝克隆连接。
对于乳酸的生产，乳酸脱氢酶LDH需要辅因子NADH，通过过表达来源于Candidaboidinii的甲酸脱氢酶编码基因(fdh)可以提高胞内NADH含量，从而提高乳酸产量。用T4DNA连接酶构建重组质粒pBAD33-Trc-fdh。引物列表如下：
表1引物列表
Figure BDA0001437153040000111
以上序列参见SEQ ID NO.19—SEQ ID NO.34。
实施例6.通过摇瓶发酵生产3-HP、乳酸及同时生产3-HP和乳酸
以MG1655或构建的工程菌为出发菌(3-HP的生产还用BL21(DE3)菌株为宿主菌)，通过钙转转入相应的质粒，得到生产目标产物的代谢工程菌。上述菌株构建完成后，保存于甘油中(25％v/v)。
摇瓶发酵操作：保存在甘油管中的种子接种于装有3mL LB的试管中培养过夜，然后转接到装有50mL LB培养基的锥形瓶中，接种量2％，培养条件均为37℃，220rpm。二级种子培养10h后，转入摇瓶发酵培养基(M9培养基)。M9培养基中添加5g/L乙酸钠和2g/L酵母提取物。接种量为2％，培养条件为37℃，220rpm，至OD600达到1.0左右，添加诱导剂IPTG至终浓度为0.1mM。诱导后培养条件为25℃，220rpm。
M9培养基组成为(每升)：Na2HPO4·12H2O 15.12g，KH2PO4 3g，NaCl 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCl2 0.011g，NH4Cl 1g，1％维生素B1 0.2mL以及微量元素(TE)混合液0.2mL。微量元素(TE)混合液组成为(每升)：Na2MoO4·2H2O 2.0g，FeSO4·7H2O 80g，MnSO4·H2O10g，ZnSO4·7H2O 2.0g，CoCl2 4.0g，CuCl2·2H2O 1.0g，H3BO4 0.5g，AlCl3·6H2O 10g。
3-HP、乳酸及乙酸的测定方法：摇瓶发酵培养期间，间隔12h取样，12000rpm离心10min分离菌体和上清。发酵液上清经0.22μm微孔膜过滤，采用日本岛津高效液相色谱仪监测发酵液上清中的3-HP、乳酸、乙酸及其他的中间代谢产物。色谱柱为BioRadAminex HPX-87离子色谱柱(300mm*7.8mm)，配有紫外检测器和示差折光检测器。流动相为2.5mM的H2SO4，流速0.5mL/min，柱温50℃。
生物量的测定采用分光光度计法测定600nm下的吸光值。
摇瓶发酵结果如下：
表2 3-羟基丙酸摇瓶发酵结果
Figure BDA0001437153040000121
Figure BDA0001437153040000131
ND：未检测到产物。
表3乳酸摇瓶发酵结果
Figure BDA0001437153040000132
ND：未检测到产物。
表4同时生产3-羟基丙酸和乳酸菌株摇瓶发酵结果
Figure BDA0001437153040000133
ND：未检测到产物。
实施例7.产羟基丙酸菌株在补料分批发酵罐中的发酵
使用补料分批培养的方式，在5L发酵罐中培养以验证上述基因工程菌的发酵性能。
发酵培养基为：同摇瓶发酵培养基，只是用5g/L酵母提取物替换2g/L酵母提取物。
菌株种子培养阶段，使用装有3mL LB培养基的小试管，37℃培养9小时左右，所得培养物作为一级种子。然后将一级种子转接于装有100mL LB的三角瓶中，接种量2％，培养9小时，作为二级种子。将二级种子接入5L发酵罐中开始发酵。发酵温度37℃。调节搅拌和通气以保持溶解氧高于30％饱和氧浓度。使用3M硫酸调节pH为7.0。发酵初始，根据需要添加适当抗生素。培养物培养至OD600为15左右时，加入0.1mM IPTG诱导。发酵过程中补加乙酸钠，控制残乙酸浓度不高于2g/L。
HY031(pTrc99a-MDA,pBAD33-Trc-pntAB)发酵36h，产生7.1g/L 3-羟基丙酸。
HY022(pTrc99a-pfor,pBAD33-Trc-fdh)发酵36h，产生3.2g/L乳酸。
HY022(pTrc99a-mmc-mcr,pBAD33-Trc-pntAB-fdh)发酵36h产生5.0g/L3-羟基丙酸及2.1g/L乳酸。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 华东理工大学
<120> 利用乙酸生产羟基丙酸的代谢工程大肠杆菌菌株的构建方法与应用
<130> /
<160> 34
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 71
<212> DNA
<213> trc
<400> 1
agtgcatgat gttaatcata aatgtcggtg tcatcatgcg ctacgctcta ggcctttctg 60
ctgtaggctg g 71
<210> 2
<211> 71
<212> DNA
<213> trc
<400> 2
ttcagaacca gtactaactt actcgacatg gaagtaccta taattgatac ggtctgtttc 60
ctgtgtgaaa t 71
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> trc
<400> 3
agtgcatgat gttaatcata a 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> trc
<400> 4
ttcagaacca gtactaactt a 21
<210> 5
<211> 72
<212> DNA
<213> trc
<400> 5
cgaaaaatta agcattcaat acgggtattg tggcatgttt aaccgttcag ttcccttagg 60
cctttctgct gt 72
<210> 6
<211> 72
<212> DNA
<213> trc
<400> 6
ttcataagac tttctccagt gatgttgaat cacatttaag ctactaaaaa taggtctgtt 60
tcctgtgtga aa 72
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> trc
<400> 7
catgggtagt taatatcctg at 22
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> trc
<400> 8
tctccagtga tgttgaatca c 21
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> E.coli
<400> 9
gtaatgatga cgccaaagca 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> E.coli
<400> 10
atagcaggta tagcggttga 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> E.coli
<400> 11
caggcatggt attgctggat 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> E.coli
<400> 12
ttcgctgtgg tgcataaact 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> E.coli
<400> 13
gaatttctcc agatacgtaa 20
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> E.coli
<400> 14
gcagggcacg acaaaagaag g 21
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> E.coli
<400> 15
cctggaagtg acgcattaga 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> E.coli
<400> 16
gcagatcatt gagaagtggc 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> E.coli
<400> 17
cctcaatgac gattaaacac 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> E.coli
<400> 18
ccttcatagt tcctcctttt 20
<210> 19
<211> 45
<212> DNA
<213> pTrc99a
<400> 19
gcgaattcga gctcggtacc gcgcaacgca attaatgtga gttag 45
<210> 20
<211> 35
<212> DNA
<213> pTrc99a
<400> 20
caattcgcat ggtctgtttc ctgtgtgaaa ttgtt 35
<210> 21
<211> 39
<212> DNA
<213> E.coli
<400> 21
gaaacagacc atgcgaattg gcataccaag agaacggtt 39
<210> 22
<211> 41
<212> DNA
<213> E.coli
<400> 22
ccgccaaaac agccaagctt ttacagagct ttcaggattg c 41
<210> 23
<211> 45
<212> DNA
<213> pTrc99a
<400> 23
gcgaattcga gctcggtacc gcgcaacgca attaatgtga gttag 45
<210> 24
<211> 35
<212> DNA
<213> pTrc99a
<400> 24
gaaatgatta ttcatgtttc ctgtgtgaaa ttgtt 35
<210> 25
<211> 35
<212> DNA
<213> E.coli
<400> 25
ttcacacagg aaacatgaat aatcatttca agtgt 35
<210> 26
<211> 45
<212> DNA
<213> E.coli
<400> 26
ccgccaaaac agccaagctt ttagaataat ttttttgacc agccg 45
<210> 27
<211> 45
<212> DNA
<213> pTrc99a
<400> 27
gcgaattcga gctcggtacc gcgcaacgca attaatgtga gttag 45
<210> 28
<211> 35
<212> DNA
<213> pTrc99a
<400> 28
gtaggaatgt ggcatgtttc ctgtgtgaaa ttgtt 35
<210> 29
<211> 35
<212> DNA
<213> E.coli
<400> 29
ttcacacagg aaacatgcca cattcctacg attac 35
<210> 30
<211> 41
<212> DNA
<213> E.coli
<400> 30
ccgccaaaac agccaagctt ttaaaacagg cggtttaaac c 41
<210> 31
<211> 29
<212> DNA
<213> C.boidinii
<400> 31
gtagaattca tgaagatcgt tttagtctt 29
<210> 32
<211> 29
<212> DNA
<213> C.boidinii
<400> 32
gcgggatcct tatttcttat cgtgtttac 29
<210> 33
<211> 29
<212> DNA
<213> C.boidinii
<400> 33
gtagagctcg cgcaacgcaa ttaatgtga 29
<210> 34
<211> 29
<212> DNA
<213> C.boidinii
<400> 34
gcggtcgact tatttcttat cgtgtttac 29

Claims (12)

1.一种利用乙酸生产羟基丙酸代谢工程大肠杆菌菌株的构建方法，其特征在于，代谢工程改造的大肠杆菌以乙酸为原料发酵生产羟基丙酸，所述羟基丙酸是指3-羟基丙酸、或乳酸、或3-羟基丙酸和乳酸混合物，其改造途径为构建乙酰CoA生产羟基丙酸的代谢途径，并和/或过表达乙酸摄入途径的相关基因以增强乙酸的运输速率，并和/或阻断TCA循环或下调TCA循环以增加流向目标代谢产物的乙酰CoA代谢流，并和/或减少苹果酸和草酰乙酸的脱羧反应以缺失副产物生成途径，和/或缺失乙醇生产途径中关键基因以调节乙酰CoA节点代谢流，和/或辅酶工程调节胞内氧化还原平衡；
若目标产物为3-羟基丙酸，过表达来源于谷氨酸棒杆菌的乙酰-CoA羧化酶编码基因(acc)与来源于绿曲绕丝状菌(C. aurantiacua)丙二酰-CoA还原酶编码基因(mcr)，实现3-羟基丙酸合成；通过过表达来源于Candida boidinii菌株的甲酸脱氢酶编码基因fdh以增加胞内可利用的NADH含量，通过过表达来源于E.coli的转氢酶编码基因(pntAB、udhA)和/或NAD激酶编码基因(nadK)以增加胞内NADH转变成NADPH的含量，从而为3-羟基丙酸的生产提供所需的辅酶；
若目标代谢产物为乳酸，过表达丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶编码基因(pfor)，过表达乳酸脱氢酶编码基因(ldh)，实现乳酸合成，通过过表达来源于Candida boidinii菌株的甲酸脱氢酶编码基因fdh以增加胞内可利用的NADH含量，从而为乳酸的生产提供所需的辅酶；
若目标代谢产物为3-羟基丙酸和乳酸混合物，过表达来源于Propionibacterium freudenreichii的甲基丙二酰-CoA羧基转移酶编码基因(mmc)，与来源于绿曲绕丝状菌丙二酰-CoA还原酶编码基因(mcr),过表达乳酸脱氢酶编码基因(ldh)，实现3-羟基丙酸和乳酸联产；通过过表达来源于E.coli的NAD激酶(nadK)和/或转氢酶编码基因(pntAB、udhA)以增加胞内NADPH含量；通过过表达来源于Candida boidinii菌株的甲酸脱氢酶编码基因fdh以增加胞内可利用的NADH含量，从而为3-羟基丙酸和乳酸的生产提供所需的辅酶。
2.根据权利要求1所述的一种利用乙酸生产羟基丙酸代谢工程大肠杆菌菌株的构建方法，其特征在于，丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶编码基因来源于Clostridium thermocellum、Clostridium sp.BNL1100、Clostridium clariflavum、Clostridium butyricum、Clostridium pasteurianum BC1、Clostridium baratii str.Sullivan、Alkaliphilus oremlandii或Desulfotalea psychrophila LSv54菌株。
3.根据权利要求1所述的一种利用乙酸生产羟基丙酸代谢工程大肠杆菌菌株的构建方法，其特征在于，对宿主菌的改造包括以下一种或几种：
(1)过表达acs
(2)过表达ackA和pta
(3)下调gltA表达
(4)缺失pckA
(5)缺失adhE
(6)缺失icdA
(7)缺失maeB和/或scfA
(8)缺失ubiX和/或ubiD和/或ubiE和/或ubiG
(9)缺失poxB。
4.根据权利要求3所述的一种利用乙酸生产羟基丙酸代谢工程大肠杆菌菌株的构建方法，其特征在于，对宿主菌的改造包括：过表达acs或过表达ackA和pta。
5.根据权利要求3所述的一种利用乙酸生产羟基丙酸代谢工程大肠杆菌菌株的构建方法，其特征在于，对宿主菌的改造包括：过表达ackA和pta，下调gltA表达水平。
6.根据权利要求3所述的一种利用乙酸生产羟基丙酸代谢工程大肠杆菌菌株的构建方法，其特征在于，对宿主菌的改造包括：过表达ackA和pta，下调gltA表达水平，缺失icdA,缺失pckA。
7.根据权利要求3所述的一种利用乙酸生产羟基丙酸代谢工程大肠杆菌菌株的构建方法，其特征在于，对宿主菌的改造包括：过表达ackA和pta，下调gltA表达水平，缺失icdA,缺失pckA，缺失adhE。
8.根据权利要求3所述的一种利用乙酸生产羟基丙酸代谢工程大肠杆菌菌株的构建方法，其特征在于，对宿主菌的改造包括：过表达ackA和pta，下调gltA表达水平，缺失icdA,缺失pckA，缺失poxB，缺失adhE。
9.根据权利要求3所述的一种利用乙酸生产羟基丙酸代谢工程大肠杆菌菌株的构建方法，其特征在于，对宿主菌的改造包括：过表达ackA和pta，下调gltA表达水平，缺失icdA，缺失pckA，缺失poxB，缺失adhE,缺失maeB和/或scfA。
10.根据权利要求3所述的一种利用乙酸生产羟基丙酸代谢工程大肠杆菌菌株的构建方法，其特征在于，对宿主菌的改造包括：过表达ackA和pta，下调gltA表达水平，缺失icdA，缺失pckA，缺失poxB，缺失adhE,缺失maeB和/或scfA,缺失ubiX和/或ubiD和/或ubiE和/或ubiG。
11.利用权利要求1—10任一所述构建方法得到的代谢工程大肠杆菌菌株。
12.利用权利要求1—10任一所述构建方法得到的代谢工程大肠杆菌菌株在以乙酸为碳源发酵生产羟基丙酸中的应用。
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