CN118256380A - 以甘油为碳源发酵生产琥珀酸的大肠杆菌菌株及生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以甘油为碳源发酵生产琥珀酸的大肠杆菌Escherichia coli.菌株，所述菌株的保藏号为CCTCC NO：M 2024430。本发明还公开了使用上述菌株以甘油为碳源两阶段发酵生产琥珀酸的方法。本发明以用于琥珀酸生产的大肠杆菌NZN111菌株为出发菌，在好氧条件下通过适应性进化提高乙酸耐受性和利用能力，从而提高该菌株厌氧条件下利用甘油生产琥珀酸能力。本发明以甘油和乙酸或其他盐为混合碳源，有氧增殖细胞。在此阶段中，甘油和乙酸可以同时被代谢。本发明优选实施例中，在有氧阶段乙酸或乙酸盐上的生长速率提高20倍左右，厌氧琥珀酸生产速率和得率提高10％‑60％。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体地说，是关于一种以甘油为碳源发酵生产琥珀酸的大肠杆菌菌株及生产方法。
背景技术
琥珀酸，又名丁二酸(Succinic acid，SA)，是一种重要的有机酸，被广泛地应用于食品、医药和可降解塑料等领域。琥珀酸作为三羧酸循环的中间产物，广泛存在于动物、植物、微生物和人体中，在生物的代谢中占有非常重要的地位。琥珀酸是许多大宗化学产品如1，4-丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯和已二酸等的中间原料，可以取代很多基于苯和石化中间产物的商品。传统的琥珀酸生产是以不可再生战略资源石油为原料，而目前石油储量在不断减少，价格在不断增长，并且石油工业对环境有很大的负面影响，这促使了琥珀酸生物合成工业的研究和发展。利用微生物发酵法转化可再生资源生产丁二酸，价格低廉、污染小、且在发酵过程中可吸收固定CO2，开辟了温室气体利用的新途径，绿色环保，具有附加的环境效益。
甘油作为生物柴油的主要副产物大量产生，价格快速下降，可以被一些微生物厌氧代谢并转化成多种重要的产物。由于甘油是一种高还原力的碳源，在缺少外源电子受体的情况下，大肠杆菌代谢甘油产生的NADH不能被有效地利用，积累的NADH抑制了甘油的代谢，存在甘油代谢缓慢等问题，影响琥珀酸的生产速率，阻碍甘油在工业规模上实现维生物转化生产琥珀酸的可能。
适应性进化是一种有效的菌株改造手段，目前被广泛的用于生物质能源及化学品生产领域，能够在较短时间内有效地改变菌株的某些表型和生理特性。通过模拟自然进化中的变异和选择过程，在人工选择的压力下将微生物连续传代培养，最后从进化菌群中筛选出具有优异性状的目标菌株的技术。由于NZN111在好氧条件下的乙酸代谢和在厌氧条件下的甘油代谢路径有较大范围的重合，同时具有大量公用的酶系，因此，在富含乙酸的培养基中将NZN111连续传代培养，理论上不仅可以提高NZN111在好氧条件乙酸的代谢能力，也能增强厌氧条件下利用甘油生产琥珀酸的能力。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用适应性进化提高大肠杆菌菌株以甘油为碳源发酵生产琥珀酸的方法，大肠杆菌菌株在富含乙酸盐的培养基中适应性进化，利用进化后的菌株通过好氧(乙酸+甘油)-厌氧(甘油)两阶段培养高效生产琥珀酸。
为实现上述目的，本发明的第一个方面，提供了一种以甘油为碳源发酵生产琥珀酸的大肠杆菌Escherichia coli.菌株，所述菌株的保藏号为CCTCC NO：M 2024430。
本发明的第二个方面，提供了一种发酵生产琥珀酸的方法，所述方法是使用上述的大肠杆菌Escherichia coli.菌株，以甘油为碳源，通过两阶段发酵生产琥珀酸。
根据本发明，所述两阶段发酵包括好氧阶段和厌氧阶段，其中：
所述好氧阶段是以乙酸和甘油混合作为碳源用于菌株生长；
所述厌氧阶段是以甘油为碳源生产琥珀酸。
本发明的第三个方面，提供了上述的大肠杆菌Escherichia coli.菌株用于以甘油为碳源进行两阶段发酵生产琥珀酸的应用。
根据本发明，所述两阶段发酵包括好氧阶段和厌氧阶段，其中：
所述好氧阶段是以乙酸和甘油混合作为碳源用于菌株生长；
所述厌氧阶段是以甘油为碳源生产琥珀酸。
本发明的第四个方面，提供了一种大肠杆菌Escherichia coli.菌株基因工程菌株，所述基因工程菌株是以上述的大肠杆菌菌株为出发菌株，转入了来自Synechococcussp.PCC 7002的HCO3 -转运蛋白基因BicA、以及来自Synechococcus sp.PCC 7002的催化CO2和HCO3 -转化的碳酸酐酶基因CA，并且以J23100为启动子。
本发明的第五个方面，提供了一种大肠杆菌Escherichia coli.菌株基因工程菌株，所述基因工程菌株是以上述的大肠杆菌菌株为出发菌株，转入了来源于Mannheimiasucciniciproducens的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因pckM。
本发明的第六个方面，提供了一种大肠杆菌Escherichia coli.菌株基因工程菌株，所述基因工程菌株是以上述的大肠杆菌菌株为出发菌株，转入了来源于Anaerobiospirillum succiniciproducens的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因pckAn。
本发明的第七个方面，提供了一种大肠杆菌Escherichia coli.菌株基因工程菌株，所述基因工程菌株是以上述的大肠杆菌菌株为出发菌株，转入了来源于Actinobacillus succinogenes的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因pckAct。
本发明的第八个方面，提供了一种大肠杆菌Escherichia coli.菌株基因工程菌株，所述基因工程菌株是以上述的大肠杆菌菌株为出发菌株，转入了来自Synechococcussp.PCC 7002的催化CO2和HCO3 -转化的碳酸酐酶基因CA，以及以下所列的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因中的一种：
来源于Mannheimia succiniciproducens的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因pckM；
来源于Anaerobiospirillum succiniciproducens的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因pckAn；以及
来源于Actinobacillus succinogenes的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因pckAct。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明以用于琥珀酸生产的大肠杆菌NZN111菌株为出发菌，在好氧条件下通过适应性进化提高乙酸耐受性和利用能力，从而提高该菌株厌氧条件下利用甘油生产琥珀酸能力。
2、本发明使用进化后的菌株用于两阶段发酵生产琥珀酸，厌氧阶段加入碱式碳酸镁维持pH，采用这样的技术方案培养的大肠杆菌，甘油摄取和代谢的酶系及合成琥珀酸的酶系均处于加强的状态，证明了进化后的菌株具有更高的甘油代谢速率，以及更强的琥珀酸生产能力。
3、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PCK)是琥珀酸合成途径中的重要羧化酶，而BicA是重要的碳酸氢根转运蛋白。本发明通过比较调节CO2摄取和固定的基因共同过表达，以及单独过表达，进一步改善了琥珀酸的生物合成。
4、本发明采用的技术方案与传统的技术不同，具体表现在：以甘油和乙酸或其他盐为混合碳源，有氧增殖细胞。在此阶段中，甘油和乙酸可以同时被代谢。本发明优选实施例中，在有氧阶段乙酸或乙酸盐上的生长速率提高20倍左右，厌氧琥珀酸生产速率和得率提高10％-60％。
附图说明
图1为实施例4中PG23-05和NZN111的有氧生长特异性曲线。
图2显示了实施例4中PG23-05和NZN111以甘油为碳源进行两阶段发酵中的甘油消耗及琥珀酸生产情况。
图3显示了实施例4中PG23-05和NZN111两阶段发酵中的甘油消耗量比较。
图4显示了实施例4中PG23-05和NZN111两阶段发酵中的琥珀酸生成量比较。
图5为实施例5中PG23-05和NZN111的有氧生长特异性曲线。
图6显示了实施例5中PG23-05和NZN111以甘油为碳源进行两阶段发酵中的甘油消耗及琥珀酸生产情况。
图7显示了实施例5中PG23-05和NZN111两阶段发酵中的甘油消耗量比较。
图8显示了实施例5中PG23-05和NZN111两阶段发酵中的琥珀酸生成量比较。
图9为实施例6中优化菌株PG23-05以及重组菌株PG23-05,yghX::PJ23100-bicA和PG23-05,yghX::PJ23100-CA的有氧生长特异性曲线。
图10显示了实施例6中优化菌株PG23-05以及重组菌株PG23-05,yghX::PJ23100-bicA和PG23-05,yghX::PJ23100-CA以甘油为碳源进行两阶段发酵中的甘油消耗及琥珀酸生产情况。
图11显示了实施例6中优化菌株PG23-05以及重组菌株PG23-05,yghX::PJ23100-bicA和PG23-05,yghX::PJ23100-CA两阶段发酵中的甘油消耗量比较。
图12显示了实施例6中优化菌株PG23-05以及重组菌株PG23-05,yghX::PJ23100-bicA和PG23-05,yghX::PJ23100-CA两阶段发酵中的琥珀酸生成量比较。
图13为实施例7中优化菌株PG23-05以及重组菌株PG23-05,yeep::Prmf-pckM，PG23-05,yeep::Prmf-pckAn和PG23-05,yeep::Prmf-pckAct的有氧生长特异性曲线。
图14显示了实施例7中优化菌株PG23-05以及重组菌株PG23-05,yeep::Prmf-pckM，PG23-05,yeep::Prmf-pckAn和PG23-05,yeep::Prmf-pckAct以甘油为碳源进行两阶段发酵中的甘油消耗及琥珀酸生产情况。
图15显示了实施例7中优化菌株PG23-05以及重组菌株PG23-05,yeep::Prmf-pckM，PG23-05,yeep::Prmf-pckAn和PG23-05,yeep::Prmf-pckAct两阶段发酵中的甘油消耗量比较。
图16显示了实施例7中优化菌株PG23-05以及重组菌株PG23-05,yeep::Prmf-pckM，PG23-05,yeep::Prmf-pckAn和PG23-05,yeep::Prmf-pckAct两阶段发酵中的琥珀酸生成量比较。
图17为实施例8中重组菌株PG23-05,yghX::PJ23100-CA、PG23-05,yghX::PJ23100-CA,yeep::Prmf-pckM，PG23-05,yghX::PJ23100-CA,yeep::Prmf-pckAn和PG23-05,yghX::PJ23100-CA,yeep::Prmf-pckAct的有氧生长特异性曲线。
图18显示了实施例8中重组菌株PG23-05,yghX::PJ23100-CA、PG23-05,yghX::PJ23100-CA,yeep::Prmf-pckM，PG23-05,yghX::PJ23100-CA,yeep::Prmf-pckAn和PG23-05,yghX::PJ23100-CA,yeep::Prmf-pckAct以甘油为碳源进行两阶段发酵中的甘油消耗及琥珀酸生产情况。
图19显示了实施例8中重组菌株PG23-05,yghX::PJ23100-CA、PG23-05,yghX::PJ23100-CA,yeep::Prmf-pckM，PG23-05,yghX::PJ23100-CA,yeep::Prmf-pckAn和PG23-05,yghX::PJ23100-CA,yeep::Prmf-pckAct两阶段发酵中的甘油消耗量比较。
图20显示了实施例8中重组菌株PG23-05,yghX::PJ23100-CA、PG23-05,yghX::PJ23100-CA,yeep::Prmf-pckM，PG23-05,yghX::PJ23100-CA,yeep::Prmf-pckAn和PG23-05,yghX::PJ23100-CA,yeep::Prmf-pckAct两阶段发酵中的琥珀酸生成量比较。
图21为大肠杆菌NZN111(CGSC:7726)厌氧阶段利用甘油生产琥珀酸的代谢图；图中，Glycerol：甘油；PEP：磷酸烯醇式丙酮酸；PYR：丙酮酸；Acetyl-CoA：乙酰辅酶A；OAA：草酰乙酸；MAL：苹果酸；FUM：延胡索酸；SUC：琥珀酸；Suc-CoA：琥珀酰辅酶A；α-KG：α-酮戊二酸；ICT：异柠檬酸；GOX：乙醛酸；CIT：柠檬酸；Lactate：乳酸；Formate：甲酸；Acetate：乙酸；Ethanol：乙醇；GlpF：甘油蛋白通道；NADH：还原型辅酶Ⅰ；NAD+：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；ATP：三磷酸腺苷；ADP：二磷酸腺苷；Pi：磷酸；pykAF：丙酮酸酶；pps：磷酸烯醇式丙酮酸合成酶；pckA：磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶；ppc：磷酸烯醇式丙酮酸羧酸酶；mdh：苹果酸脱氢酶；fumABC：富马酸合酶；frdABCD：琥珀酸脱氢酶；sdhABCD：琥珀酸脱氢酶；sucCD：琥珀酰辅酶A合成酶；sucAB：α-酮戊二酸脱氢酶；icd：异柠檬酸脱氢酶；acnAB：乌头酸酶；gltA：柠檬酸合成酶；pdh：ldhA：乳酸脱氢酶；pflB：丙酮酸甲酸裂解酶；poxB：丙酮酸氧化酶；pta：磷酸转乙酰酶；ackA：乙酸激酶；adhE：乙醇脱氢酶；aceA：异柠檬酸裂解酶；aceB：苹果酸合成酶。
图22显示了过表达HCO3 -转运蛋白以及羧化酶协同调控二氧化碳的吸收和固定机制；图中，Glycerol：甘油；PEP：磷酸烯醇式丙酮酸；OAA：草酰乙酸；Succinate：琥珀酸；bicA：HCO3 -转运蛋白；CA：碳酸酐酶；pckA：磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶；ppc：磷酸烯醇式丙酮酸羧酸酶。
保藏事项
本发明所得到的能够以甘油为碳源发酵生产琥珀酸的大肠杆菌Escherichiacoli.进化菌株PG23-05（分类命名Escherichia coli PG23-05）已于2024年03月08日提交位于中国武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCC NO：M2024430。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、NZN111适应性进化
本实施例通过将大肠杆菌NZN111(CGSC:7726)在添加乙酸钠的M9培养基中进行连续传代培养，以提高菌株对乙酸的耐受性和利用乙酸的能力，使其在富含乙酸的培养基中的延滞期缩短，生长速度加快。
连续传代培养操作：
取大肠杆菌NZN111的甘油菌1μL(含25％甘油，-80℃保存)于LB培养基固体平板上划线分离，置于恒温培养箱，培养条件为37℃、12h。挑取平板上的单菌落接种于装有4mL LB液体培养基的试管中，置于摇床培养箱中培养，培养条件为37℃、220rpm、12h。然后将NZN111菌液按2％的接种量转接到装有50mL M9培养基的250mL锥形瓶中(培养基中添加5g/L的乙酸钠)，置于摇床培养箱中培养，每12h使用移液枪于超净工作台取样测量细胞浓度(OD600)和pH值，培养过程中使用3M H2SO4维持培养基的pH值为7，培养24h～48h(进入生长稳定期)后制备甘油菌保种，培养条件为37℃、220rpm，该过程为第1次传代培养，对应的菌株标记为PG01。
随后，将菌液按2％～5％的接种量(确保接种后初始OD600约为0.1)转接到另一瓶装有50mL M9培养基的250mL锥形瓶中，培养24h～48h(进入生长稳定期)，培养条件为37℃、220rpm，每12h使用移液枪于超净工作台取样测量细胞浓度(OD600)和pH值，培养过程中利用3M H2SO4维持培养基的pH值为7，该过程为第2次传代培养，对应的菌株标记为PG02。
随后，按照此方法进行连续传代培养，培养条件均为37℃、220rpm。当连续多代(3～10代)菌株0～24h的平均生长速率不再变化时，提高培养基中的乙酸盐浓度(由5g/L的乙酸钠逐级提升至30g/L的乙酸钠，详见表1)，以增加筛选压力；本实施例共传了49代(PG01～PG49)，传代过程中菌株的生长情况如表1所示。
本实施例中使用的培养基如下：
液体LB培养基：Tryptone 10g/L，Yeast Extract 5g/L，NaC1 10g/L。
固体LB培养基：在液体LB培养基中添加1.6％(w/v)的琼脂粉。
M9培养基：Na2HPO4·12H2O 15.12g/L，KH2PO4 3g/L，NH4Cl 1g/L，NaC1 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，CaCl2 0.011g/L，微量元素混合液(TE)0.1mL/L，1％VB1 0.2mL/L。
TE组成：Na2MoO4·2H2O 2.0g/L，FeSO4·7H2O 8.0g/L，MnSO4·H2O 10g/L，ZnSO4·7H2O2.0g/L，CoCl2 4.0g/L，CuCl2·2H2O 1.0g/L，H3BO4 0.5g/L，AlCl3·6H2O 10g/L。
细胞浓度的测定：采用分光光度计法测定600nm下的吸光值。
表1：NZN111进化过程中菌株的生长情况
实施例2、NZN111适应性进化菌株的表型筛选
本实施例在分别含有10g/L、20g/L、30g/L乙酸钠的M9培养基中分别测试部分进化后菌株的生长情况，以筛选乙酸代谢能力最强(在乙酸中生长速度最快)的菌株，用于琥珀酸的生产。
生长曲线测定方法：分别将5μL甘油菌接种至装有4mL LB的试管中培养过夜；然后转接到装有50mL M9培养基的250mL锥形瓶中，接种量为2％，培养条件均为37℃、220rpm；每隔12h测量细胞浓度(OD600)。
LB和M9培养基组成以及细胞浓度的测定方法同实施例1。
测定生长曲线用的M9培养基中分批添加10g/L、20g/L、30g/L的乙酸钠。
NZN111初始菌株以及进化菌株在添加10g/L、20g/L和30g/L乙酸钠的M9培养基中的生长情况分别如表2、表3和表4所示。
表2：NZN111及其进化菌株在10g/L乙酸钠培养基中的生长情况
表3：NZN111及其进化菌株在20g/L乙酸钠培养基中的生长情况
表4：NZN111及其进化菌株在30g/L乙酸钠培养基中的生长情况
由表2、表3和表4的结果可知，菌株PG23、PG26、PG32、PG46、PG48在较高浓度乙酸钠(20g/L和30g/L)中具有最快的生长速度和最短的延滞期，具有最强的乙酸利用能力。
实施例3、进化后的菌株用于两阶段发酵生产琥珀酸
本实施例以被证明在有氧条件下能够更有效地利用乙酸的进化菌株PG23、PG26、PG32、PG46和PG48为例，对这些生长优势菌株及其后一次传代菌株进行两阶段(好氧阶段和厌氧阶段)发酵，以验证其琥珀酸生产能力。
好氧阶段：分别将5μL甘油菌接种至装有4mL LB的试管中培养过夜，然后转接到装有50mL M9培养基的250mL锥形瓶中，接种量为2％，培养基中额外添加10g/L的乙酸钠，培养条件均为37℃、220rpm；培养过程中用3M H2SO4维持pH值为7。当OD600停止增加时，使用50mL离心管收集菌体，离心条件：5500rpm、5min、4℃，随后使用厌氧阶段的培养基洗涤一次并重悬菌体，重悬后收集的菌体OD600＝10。
厌氧阶段：将重悬菌液转移至装有25mL M9培养基的50mL厌氧瓶，其中厌氧瓶添加60g/L的葡萄糖，以及适量的MgCO3粉末(每1g/L葡萄糖添加0.75g/L MgCO3)，使用气袋向厌氧瓶中通CO2 1～2min，用止水夹将导气管夹紧使厌氧瓶处于密闭状态，培养条件为37℃、150rpm。每隔12h用注射器进行取样。
LB和M9培养基组成以及细胞浓度的测定方法同实施例1。
葡萄糖及琥珀酸的测定方法：注射器抽取的样品转移至1.5mL的EP管中，12000rpm离心10min，分离菌体及上清，取上清用0.22μm微孔膜过滤，采用安捷伦高效液相色谱仪检测发酵液上清中的葡萄糖及琥珀酸。
色谱柱为BioRadAminex HPX-87离子色谱柱(300mm*7.8mm)，配有紫外检测器和示差折光检测器。流动相为5mM H2SO4，流速0.6mL/min，柱温65℃。
通过向厌氧阶段培养基中添加60g/L的葡萄糖，筛选琥珀酸生产能力更强的菌株，两阶段的发酵结果如表5所示。
表5：两阶段发酵生产琥珀酸的产量及得率
由表5的结果可知，PG23菌株生产琥珀酸的能力最强，琥珀酸产量为43.22g/L，得率达0.97g/g，为最大理论产量的86.6％。
根据以上结果，进化后的PG23菌株在有氧条件下能够更有效地利用乙酸，且琥珀酸生产能力更强。为筛选出琥珀酸生产能力最强的单克隆菌株，对PG23菌株进行平板划线分离，并进行两阶段发酵，验证其琥珀酸生产能力，结果如表6所示。
表6：两阶段发酵生产琥珀酸的产量及得率
表6中，PG23-01～PG23-09分别为由PG23划线得到单克隆菌株。
根据表6的结果，划线得到的单克隆菌株PG23-05菌株生产琥珀酸的能力最强，琥珀酸产量为45.96g/L，得率达0.94g/g，为最大理论产量的84.0％。
所得到的单克隆大肠杆菌Escherichia coli.进化菌株PG23-05已于2024年03月08日提交中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCC NO：M 2024430。
实施例4、通过低细胞密度进化优势菌株以甘油为碳源进行两阶段发酵生产琥珀酸
由于菌株在好氧条件下的乙酸代谢和在厌氧条件下的甘油代谢路径有较大范围的重合，同时具有大量公用的酶系，因此，本实施例以在有氧条件下能够更有效利用乙酸的进化优势菌株PG23-05为例，用于厌氧条件下利用甘油生产琥珀酸，以验证其琥珀酸生产能力，菌株厌氧阶段利用甘油生产琥珀酸的代谢途径如图21所示。
好氧阶段：分别将5μL甘油菌接种至装有4mL LB的试管中培养过夜，然后转接到装有50mL M9培养基的250mL锥形瓶中，接种量为2％，培养基中额外添加5g/L甘油以及10g/L乙酸钠，培养条件均为37℃、220rpm。培养过程中每4小时取样，测定OD600以检测底物消耗情况。当OD600停止增加时，使用50mL离心管收集菌体，离心条件：5500rpm，5min，4℃；随后使用厌氧阶段的培养基洗涤一次并重悬菌体，重悬后收集的菌体，其中低密度收集菌体的菌浓为OD600＝20，高密度收集菌体的菌浓为OD600＝80。
厌氧阶段：将重悬菌液转移至装有10mL M9培养基的25mL厌氧瓶，其中厌氧瓶添加适量的MgCO3粉末(每1g/L甘油添加0.75g/L MgCO3)，使用气袋向厌氧瓶中通CO21～2min，用止水夹将导气管夹紧使厌氧瓶处于密闭状态，培养条件为37℃、220rpm。培养过程中每隔12h取样，测定甘油的消耗速率以及琥珀酸的生成速率。
LB和M9培养基组成以及细胞浓度的测定方法同实施例。
细胞浓度的测定：采用分光光度计法测定600nm下的吸光值。
甘油及琥珀酸的测定方法：注射器抽取的样品转移至1.5mL的EP管中，12000rpm离心10min，分离菌体及上清，取上清用0.22μm微孔膜过滤，采用安捷伦高效液相色谱仪监测发酵液上清中的甘油及琥珀酸。
色谱柱为：BioRadAminex HPX-87离子色谱柱(300mm*7.8mm)，配有紫外检测器和示差折光检测器。流动相为5mM H2SO4，流速0.6mL/min，柱温65℃。
低密度摇瓶发酵时，向厌氧阶段培养基中添加15g/L的甘油，分别以优化菌株PG23-05菌株和初始菌株NZN111进行两阶段发酵，发酵结果如表7所示。
表7：以甘油为碳源两阶段发酵生产琥珀酸的产量及得率
由表7的结果可见，PG23-05菌株的琥珀酸产量为19.15g/L，得率达1.28g/g，得率相对于初始菌株NZN111提高了4.84％。
图1显示了有氧阶段PG23-05的有氧生长特异性曲线。由图1的结果可见，有氧生长增值阶段利用乙酸和甘油混合作为碳源进行培养，生长周期20h，PG23-05相比初始菌株NZN111有着更快的底物消耗速率。
图2显示了厌氧阶段底物甘油的消耗速率以及琥珀酸的生成速率，图3和图4分别显示了厌氧阶段甘油的消耗量以及琥珀酸的生成量。由图2～图4的结果可知，PG23-05在厌氧阶段能够有效地增加甘油消耗和琥珀酸生成，相比NZN111有着更快地甘油消耗速率以及琥珀酸生成速率，12h左右15g/L甘油已全部被消耗。
实施例5、通过高细胞密度进化优势菌株以甘油为碳源进行两阶段发酵生产琥珀酸
为进一步研究进化菌株PG23-05的发酵性能，探究甘油浓度对大肠杆菌生产琥珀酸的影响，本实施例通过优化底物浓度，以期进一步提高琥珀酸产量，菌株厌氧阶段利用甘油生产琥珀酸的代谢途径如图21所示。
好氧阶段和厌氧阶段的操作方法同实施例4。
LB和M9培养基组成以及细胞浓度的测定方法同实施例1。
高密度摇瓶发酵时，向厌氧阶段培养基中添加100g/L的甘油，分别以优化菌株PG23-05菌株和初始菌株NZN111进行两阶段发酵，发酵结果如表8所示。
表8：以甘油为碳源两阶段发酵生产琥珀酸的产量及得率
由表8的结果可知，PG23-05菌株琥珀酸产量为70.44g/L，得率达1.19g/g，得率相对于初始菌株NZN111提高了13.52％。
图5显示了有氧阶段PG23-05的有氧生长特异性曲线。由图5的结果可见，有氧生长增值阶段利用乙酸和甘油混合作为碳源进行培养，生长周期19h，PG23-05相比初始菌株NZN111有着更快的底物消耗速率。
图6显示了厌氧阶段底物甘油的消耗速率以及琥珀酸的生成速率，图7和图8分别显示了厌氧阶段甘油的消耗量以及琥珀酸的生成量。由图6～图8的结果可知，PG23-05在厌氧阶段能够有效地增加甘油消耗和琥珀酸生成，相比NZN111有着更快地甘油消耗速率以及琥珀酸生成速率，72h左右琥珀酸产量提升了17.20％。
实施例6、过表达碳酸酐酶加快羧化速度增加HCO3 -的吸收
为了提高琥珀酸生产过程中的CO2供应，本实施例在优化菌株PG23-05中表达来自Synechococcus sp.PCC 7002的HCO3 -转运载体(BicA)以及催化CO2和HCO3 -转化的碳酸酐酶(CA)，以浓缩胞内CO2浓度，机制如图22所示。
碳酸氢盐转运蛋白参与了蓝藻CO2浓缩机制(CCM)的积累，从而积累了CO2并改善了光合碳固定。将蓝藻的碳浓缩机制(CCM)引入到大肠杆菌中，目的是提高细胞内的无机碳浓度，以提高羧化效率和琥珀酸产量。bicA是CCM中的关键蛋白，是一种高通量低亲和力的HCO3 -转运蛋白(转运过程需要Na+)。在大肠杆菌中，琥珀酸是通过基于CO2固定的C3代谢物的羧化反应合成的。有相关研究证明bicA、CA可以在异源宿主中功能性表达，包括大肠杆菌，其表达已被用于在琥珀酸发酵过程中增强Ci的吸收和固定CO2。整合涉及两个步骤：CO2吸收到细胞中和通过羧化酶固定CO2。
将Synechococcus sp.PCC 7002的bicA基因(SEQ ID No.1)和CA基因(SEQ IDNo.2)分别与载体骨架pTrc99a(商业化质粒)连接，选择J23100组成型启动子(SEQ IDNo.6)构建CO2浓缩载体。为了稳定表达外源基因，在大肠杆菌PG23-05的基因组上，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术分别将PJ23100启动子控制的bicA、CA基因整合至yghX假基因位点，构建重组菌株PG23-5,yghX::PJ23100-bicA和PG23-5,yghX::PJ23100-CA。
重组菌株PG23-05,yghX::PJ23100-bicA和PG23-5,yghX::PJ23100-CA的制备方法如下：
电转感受态PG23-05-Cas9制备：先制备PG23-05电转感受态，然后将pRED-Cas9质粒(以商业化质粒pCas9cur为模板，用引物Cas9-F/Cas9-R扩增用于表达Cas9和固化gRNA质粒的区域；以商业化质粒pTKRED为模板，用引物Red-F/Red-R扩增IPTG诱导型λ-Red重组系统。这两部分经BglII/SalI消化后连接在一起，构建得到pRED-Cas9质粒；其中的引物序列见表9)电转入感受态PG23-05中，获得电转感受态PG23-05-Cas9。
以质粒pTrc99a为模板，分别以pTrc99a-F/pTrc99a-R、J23100-RBS-bicA-F/J23100-RBS-bicA-R、J23100-RBS-CA-F/J23100-RBS-CA-R为引物，PCR扩增获得约2.6kb的片段pTrc99a、约1.8kb的片段J23100-bicA、约700bp的片段J23100-CA，使用无缝克隆连接，获得质粒pTrc99a-PJ23100-bicA、pTrc99a-PJ23100-CA。
以质粒pTrc99a-PJ23100-bicA、pTrc99a-PJ23100-CA为模板，分别以pTr-J23100-RBS-bicA-F/pTr-J23100-RBS-bicA-R、pTr-J23100-RBS-CA-F/pTr-J23100-RBS-CA-R为引物，PCR扩增获得约1.9kb的片段pTr-PJ23100-bicA、约800bp的片段pTr-PJ23100-CA。
以PG23-05为模板，以yghX-upF/yghX-upR、yghX-downF/yghX-downR为引物，PCR扩增获得yghX假基因插入位点的上下游同源臂，使用PrimesSTAR Mix DNA聚合酶预混液(Takara公司)，以yghX-upF、yghX-downR为引物分别与片段pTr-PJ23100-bicA、片段pTr-PJ23100-CA扩增出Donor片段，Donor即用于yghX假基因位点进行替换的基因片段。
以质粒pGRB(商业化质粒)为模板，sgRNA-F/sgRNA-R为引物，PCR扩增获得约2kb的片段pGRB-sgRNA，钙转入DH5α感受态中，自环化形成质粒pGRB-sgRNA-yghX。
利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，将Donor片段、pGRB-sgRNA-yghX电转入电转感受态PG23-05-Cas9中，进行基因替换。后续将单菌落PCR验证的阳性菌落接入含有奇霉素和阿拉伯糖抗性的试管中于30℃连续培养，若菌液划线于含有氨苄的平板上培养不生长，则证明成功消除了质粒pGRB-sgRNA-yghX。取上一步的菌液接入无抗性的LB试管中于42℃连续培养，若菌液划线于含有奇霉素的平板上培养不生长，则证明成功消除了质粒pRED-Cas9。获得重组菌株PG23-5,yghX::PJ23100-bicA和PG23-5,yghX::PJ23100-CA，用于两阶段发酵验证。
引物序列如以下表9所示：
表9：引物序列
好氧阶段和厌氧阶段的操作方法同实施例4。
LB和M9培养基组成以及细胞浓度的测定方法同实施例1。
进行高密度摇瓶发酵时，向厌氧阶段培养基中添加100g/L的甘油，通过过表达碳酸酐酶加快羧化速度增加HCO3 -的吸收来验证两阶段的发酵结果。发酵结果如表10所示。
表10：增加HCO3 -的吸收重组菌株两阶段发酵生产琥珀酸的产量及得率
由表10的结果可知，PG23-05,yghX::PJ23100-bicA菌株的琥珀酸产量为77.18g/L，得率达1.23g/g，产量相对于对照菌株PG23-05提高了7.70％，得率提升了4.53％。PG23-05,yghX::PJ23100-CA菌株的琥珀酸产量为84.80g/L，得率达1.27g/g，产量相对于对照菌株PG23-05提高了18.32％，得率提升了7.42％。
图9显示了有氧阶段优化菌株PG23-05以及重组菌株PG23-05,yghX::PJ23100-bicA和PG23-05,yghX::PJ23100-CA的有氧生长特异性曲线。由图9的结果可见，有氧生长增值阶段利用乙酸和甘油混合作为碳源进行培养，生长周期27h(PG23-05生长较快，生长周期19h)，PG23-05有着更快的底物消耗速率。
图10显示了厌氧阶段优化菌株PG23-05以及重组菌株PG23-05,yghX::PJ23100-bicA和PG23-05,yghX::PJ23100-CA对底物甘油的消耗速率以及琥珀酸的生成速率，图11和图12分别显示了厌氧阶段甘油的消耗量以及琥珀酸的生成量。由图10～图12的结果可知，重组菌株PG23-5,yghX::PJ23100-bicA和PG23-5,yghX::PJ23100-CA相对于PG23-05在厌氧阶段能够有效地增加琥珀酸的生成。
实施例7、过表达异源羧化酶加强羧化反应固定CO2
能够产琥珀酸的菌种种类繁多，目前研究的较多的有：产珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)、产珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillumsucciniciproducens)、曼海姆产珀酸菌(Mannheimia succiniciproducens)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)和大肠杆菌(Escherichia coli)。其中A.succinogenes，A.succiniciproducens和M.succiniciproducens属于天然珀酸生产菌株，能够积累琥珀酸。
研究表明，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCK)是大肠杆菌厌氧条件下产琥珀酸的关键酶，过表达PCK能有效提高甘油消耗和琥珀酸生产。酶活测定表明，PCK的过表达使异柠檬酸裂解酶(ICL)、PCK、苹果酸酶(ME)和苹果酸脱氢酶(MDH)分别提高5.9、4.0、1.5和1.5倍。
为了提高琥珀酸生产途径的活性，本实施例在大肠杆菌PG23-05中异源表达活性更高的PCKA。3种外源pckA基因取自3种不同的琥珀酸天然高产菌株(pckM代表PCK基因来源于Mannheimia succiniciproducens；pckAn代表基因PCK来源于Anaerobiospirillumsucciniciproducens；pckAct代表基因PCK来源于Actinobacillus succinogenes)，机制如图22所示。
重组菌株PG2305,yeep::Prmf-pckM、PG2305,yeep::Prmf-pckAn和PG2305,yeep::Prmf-pckAct的制备方法如下：
为了稳定表达外源基因，在大肠杆菌PG23-05的基因组上，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将由Prmf启动子控制的来自Mannheimia succiniciproducens的优化后的pckM基因(SEQ ID No.3)、Anaerobiospirillum succiniciproducens的优化后的pckAn基因(SEQIDNo.4)、Actinobacillus succinogenes的优化后的pckAct基因(SEQ ID No.5)整合至yeep假基因位点，构建重组菌株PG2305,yeep::Prmf-pckM、PG2305,yeep::Prmf-pckAn和PG2305,yeep::Prmf-pckAct。
重组菌株PG2305,yeep::Prmf-pckM、PG2305,yeep::Prmf-pckAn和PG2305,yeep::Prmf-pckAct的制备方法如下：
电转感受态PG23-05-Cas9制备：先制备PG23-05电转感受态，后将pRED-Cas9质粒电转入感受态PG23-05中，获得电转感受态PG23-05-Cas9。
以质粒pTrc99a质粒为模板，分别以pTrc99a-F/pTrc99a-R、rmf-RBS-pckM-F/rmf-RBS-pckM-R、rmf-RBS-pckAn-F/rmf-RBS-pckAn-R、rmf-RBS-pckAct-F/rmf-RBS-pckAct-R为引物，PCR扩增获得约2.6kb的片段pTrc99a、约1.8kb的片段rmf-pckM、约1.7kb的片段rmf-pckAn、约1.8kb的片段rmf-pckAct，使用无缝克隆连接，获得质粒pTrc99a-Prmf-pckM、pTrc99a-Prmf-pckAn、pTrc99a-Prmf-pckAct。
以质粒pTrc99a-Prmf-pckM、pTrc99a-Prmf-pckAn、pTrc99a-Prmf-pckAct为模板，分别以pTr-rmf-RBS-pckM-F/pTr-rmf-RBS-pckM-R、pTr-rmf-RBS-pckAn-F/pTr-rmf-RBS-pckAn-R、pTr-rmf-RBS-pckAct-F/pTr-rmf-RBS-pckAct-R为引物，PCR扩增获得约1.8kb的片段pTr-Prmf-pckM、1.8kb的片段pTr-Prmf-pckAn、1.8kb的片段pTr-Prmf-pckAct。
以PG23-05为模板，以yeep-upF/yeep-upR、yeep-downF/yeep-downR为引物，PCR扩增获得yeep假基因插入位点的上下游同源臂，使用PrimesSTAR Mix DNA聚合酶预混液(Takara公司)，以yeep-upF、yeep-downR为引物分别与片段pTr-Prmf-pckM、片段pTr-Prmf-pckAn、pTr-Prmf-pckAct扩增出Donor片段，Donor即用于yeep假基因位点进行替换的基因片段。
以商业化质粒pGRB为模板，sgRNA-F/sgRNA-R为引物，PCR扩增获得约2kb的片段pGRB-sgRNA，钙转入DH5α感受态中，自环化形成质粒pGRB-sgRNA-yeep。
利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，将Donor片段、pGRB-sgRNA-yeep电转入电转感受态PG23-05-Cas9中，进行基因替换，后续在相应抗性的平板上消除质粒pRED-Cas9以及pGRB-sgRNA-yeep(具体方法同实施例6)，获得重组菌株PG2305,yeep::Prmf-pckM、PG2305,yeep::Prmf-pckAn和PG2305,yeep::Prmf-pckAct，用于两阶段发酵验证。
所使用的引物序列如以下表11所示：
表11：引物序列
好氧阶段和厌氧阶段的操作方法同实施例4。
LB和M9培养基组成以及细胞浓度的测定方法同实施例1。
进行高密度摇瓶发酵时，向厌氧阶段培养基中添加100g/L的甘油，通过过表达异源羧化酶加强羧化反应以固定CO2验证两阶段的发酵结果。发酵结果如表12所示。
表12：过表达pckA重组菌株以甘油为碳源两阶段发酵生产琥珀酸的产量及得率
由表12的结果可知，充足菌株PG23-05,yeep::Prmf-pckM菌株的琥珀酸产量为82.96g/L，得率达1.15g/g，产量相对于对照菌株PG23-05提高了15.76％。PG23-05,yeep::Prmf-pckAn菌株的琥珀酸产量为82.01g/L，得率达1.17g/g，产量相对于对照菌株PG23-05提高了14.43％。PG23-05,yeep::Prmf-pckAct菌株的琥珀酸产量为79.92g/L，得率达1.18g/g，产量相对于对照菌株PG23-05提高了11.52％。
图13显示了有氧阶段优化菌株PG23-05以及重组菌株PG23-05,yeep::Prmf-pckM、PG23-05,yeep::Prmf-pckAn和PG23-05,yeep::Prmf-pckAct的有氧生长特异性曲线。由图13的结果可见，有氧生长增值阶段利用乙酸和甘油混合作为碳源进行培养，生长周期27h(PG23-05生长较快，生长周期19h)，PG23-05有着更快地底物消耗速率。
图14显示了厌氧阶段优化菌株PG23-05以及重组菌株PG23-05,yeep::Prmf-pckM、PG23-05,yeep::Prmf-pckAn和PG23-05,yeep::Prmf-pckAct对底物甘油的消耗速率以及琥珀酸的生成速率，图15和图16分别显示了厌氧阶段甘油的消耗量以及琥珀酸的生成量。由图14～图16的结果可知，重组菌株PG23-05,yeep::Prmf-pckM、PG23-05,yeep::Prmf-pckAn和PG23-05,yeep::Prmf-pckAct相对于对照菌株PG23-05在厌氧阶段均能有效地增加甘油消耗和琥珀酸的生成，有着更快地甘油消耗速率以及琥珀酸生成速率。
实施例8、CO2运输和固定的协同代谢调节
磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PCK)是琥珀酸合成途径中的重要羧化酶，而BicA是重要的碳酸氢根转运蛋白。本实施例通过比较调节CO2摄取和固定的基因共同过表达，以及单独过表达，以改善琥珀酸的生物合成，机制如图22所示。
重组菌株PG23-05,yghX::PJ23100-CA,yeep；；Prmf-pckM、PG23-05,yghX::PJ23100-CA,yeep；；Prmf-pckAn和PG23-05,yghX::PJ23100-CA,yeep；；Prmf-pckAct的制备方法如下：
电转感受态PG23-05,yghX::PJ23100-CA-Cas9制备：先制备PG23-05,yghX::PJ23100-CA电转感受态，后将pRED-Cas9质粒电转入感受态PG23-05,yghX::PJ23100-CA中，获得电转感受态PG23-05,yghX::PJ23100-CA-Cas9。
利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，将pTr-Prmf-pckM/pTr-Prmf-pckAn/pTr-Prmf-pckAct对应的Donor片段、pGRB-sgRNA-yeep电转入电转感受态PG23-05,yghX::PJ23100-CA中，进行基因替换，后续在相应抗性的平板上消除质粒pRED-Cas9以及pGRB-sgRNA-yeep，获得重组菌株PG23-05,yghX::PJ23100-CA,yeep；；Prmf-pckM、PG23-05,yghX::PJ23100-CA,yeep；；Prmf-pckAn和PG23-05,yghX::PJ23100-CA,yeep；；Prmf-pckAct，用于两阶段发酵验证。
好氧阶段和厌氧阶段的操作方法同实施例4。
LB和M9培养基组成以及细胞浓度的测定方法同实施例1。
进行高密度摇瓶发酵时，向厌氧阶段培养基中添加100g/L的甘油，通过过表达碳酸酐酶加快羧化速度增加HCO3 -的吸收、以及过表达异源羧化酶加强羧化反应固定CO2，验证两阶段的发酵结果。发酵结果如表13所示。
表13：以甘油为碳源两阶段发酵生产琥珀酸的产量及得率
由表13的结果可知，PG23-05,yghX::PJ23100-CA,yeep；；Prmf-pckM菌株的琥珀酸产量为84.27g/L，得率达1.12g/g，产量相对于对照菌株PG23-5,yghX::PJ23100-CA提高了6.67％。PG23-05,yghX::PJ23100-CA,yeep::Prmf-pckAn菌株的琥珀酸产量为82.55g/L，得率达1.15g/g，产量相对于对照菌株PG23-5,yghX::PJ23100-CA提高了4.49％。PG23-05,yghX::PJ23100-CA,yeep::Prmf-pckAct菌株的琥珀酸产量为76.36g/L，得率达1.14g/g，产量相对于对照菌株PG23-5,yghX::PJ23100-CA提高了-3.34％。
图17显示了有氧阶段重组菌株PG23-5,yghX::PJ23100-CA、PG23-05,yghX::PJ23100-CA,yeep；；Prmf-pckM、PG23-05,yghX::PJ23100-CA,yeep::Prmf-pckAn和PG23-05,yghX::PJ23100-CA,yeep::Prmf-pckAct的有氧生长特异性曲线。由图17的结果可见，有氧生长增值阶段利用乙酸和甘油混合作为碳源进行培养，生长周期均为27h。
图18显示了厌氧阶段重组菌株PG23-5,yghX::PJ23100-CA、PG23-05,yghX::PJ23100-CA,yeep；；Prmf-pckM、PG23-05,yghX::PJ23100-CA,yeep::Prmf-pckAn和PG23-05,yghX::PJ23100-CA,yeep::Prmf-pckAct对底物甘油的消耗速率以及琥珀酸的生成速率，图19和图20分别显示了厌氧阶段甘油的消耗量以及琥珀酸的生成量。由图18～图20的结果可知，PG23-05,yghX::PJ23100-CA,yeep；；Prmf-pckM在厌氧阶段能够有效地增加甘油消耗和琥珀酸生成，对比PG23-5,yghX::PJ23100-CA有着更快的甘油消耗速率以及琥珀酸生成速率。
序列表信息:
DTD版本:V1_3
文件名:241027SEQ.xml
软件名称:WIPOSequence
软件版本:2.3.0
生成日期:2024-03-17
基本信息:
当前申请/申请人档案名:241027
申请人姓名或名称:华东理工大学
申请人姓名或名称/语言:zh
申请人姓名或名称/拉丁名称:ECUST
发明名称:以甘油为碳源发酵生产琥珀酸的大肠杆菌菌株及生产方法(zh)
序列总量:6
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ttgacggcta gctcagtcct aggtacagtg ctagc 35
END。
Claims (10)
1.一种以甘油为碳源发酵生产琥珀酸的大肠杆菌Escherichia coli.菌株，其特征在于，所述菌株的保藏号为CCTCC NO：M 2024430。
2.一种发酵生产琥珀酸的方法，其特征在于，所述方法是使用权利要求1所述的大肠杆菌Escherichia coli.菌株，以甘油为碳源，通过两阶段发酵生产琥珀酸。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述两阶段发酵包括好氧阶段和厌氧阶段，其中：
所述好氧阶段是以乙酸和甘油混合作为碳源用于菌株生长；
所述厌氧阶段是以甘油为碳源生产琥珀酸。
4.权利要求1所述的大肠杆菌Escherichia coli.菌株的应用，其特征在于，用于以甘油为碳源进行两阶段发酵生产琥珀酸。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述两阶段发酵包括好氧阶段和厌氧阶段，其中：
所述好氧阶段是以乙酸和甘油混合作为碳源用于菌株生长；
所述厌氧阶段是以甘油为碳源生产琥珀酸。
6.一种大肠杆菌Escherichia coli.基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株是以权利要求1所述的大肠杆菌菌株为出发菌株，转入了来自Synechococcus sp.PCC 7002的HCO3 -转运蛋白基因BicA、以及来自Synechococcus sp.PCC 7002的催化CO2和HCO3 -转化的碳酸酐酶基因CA，并且以J23100为启动子。
7.一种大肠杆菌Escherichia coli.基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株是以权利要求1所述的大肠杆菌菌株为出发菌株，转入了来源于Mannheimiasucciniciproducens的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因pckM。
8.一种大肠杆菌Escherichia coli.基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株是以权利要求1所述的大肠杆菌菌株为出发菌株，转入了来源于Anaerobiospirillumsucciniciproducens的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因pckAn。
9.一种大肠杆菌Escherichia coli.基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株是以权利要求1所述的大肠杆菌菌株为出发菌株，转入了来源于Actinobacillussuccinogenes的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因pckAct。
10.一种大肠杆菌Escherichia coli.基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株是以权利要求1所述的大肠杆菌菌株为出发菌株，转入了来自Synechococcus sp.PCC 7002的催化CO2和HCO3 -转化的碳酸酐酶基因CA，以及以下所列的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因中的一种：
来源于Mannheimia succiniciproducens的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因pckM；
来源于Anaerobiospirillum succiniciproducens的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因pckAn；以及
来源于Actinobacillus succinogenes的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因pckAct。
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