CN103243064B

CN103243064B - 一种大肠杆菌工程菌株及其好氧-微好氧-厌氧全阶段发酵生产琥珀酸的应用

Info

Publication number: CN103243064B
Application number: CN201310203945.9A
Authority: CN
Inventors: 祁庆生; 梁泉峰; 李宜奎
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2013-05-28
Filing date: 2013-05-28
Publication date: 2015-04-22
Anticipated expiration: 2033-05-28
Also published as: CN103243064A

Abstract

本发明公开了一种大肠杆菌工程菌株及其好氧-微好氧-厌氧全阶段发酵生产琥珀酸的应用，所述工程菌株名为埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)YL106,菌株的基因型为MG1655ΔptsGΔpoxBΔptaΔiclRΔsdhAΔarcAΔldhAΔadhE pckA*glf_ZM，该菌已于2013年4月17日保藏在“中国典型培养物保藏中心”，保藏编号为CCTCC NO:M2013149。本发明的工程菌株在好氧-微好氧-厌氧全阶段条件下发酵生产琥珀酸，能够高效积累大量的琥珀酸，其总生产力（2.13g/(L·h)）是目前利用大肠杆菌生产琥珀酸相关文献报道中最高的，预示本发明所述工程菌和好氧-微好氧-厌氧全阶段琥珀酸发酵工艺具有可观的工业化应用价值和前景。

Description

一种大肠杆菌工程菌株及其好氧-微好氧-厌氧全阶段发酵生产琥珀酸的应用

技术领域

本发明涉及一种大肠杆菌工程菌株及其好氧-微好氧-厌氧全阶段发酵生产琥珀酸的应用，属于代谢工程和微生物发酵领域。

背景技术

琥珀酸是一种天然的二元四碳羧酸，是生物体三羧酸（Tricarboxylic acid，TCA）循环中的一个中间产物，同时又是许多厌氧和兼性厌氧微生物的发酵终产物之一。琥珀酸作为一种重要的有机合成中间体，被广泛应用于食品、医药、香料、农药、染料、油漆和塑料等领域中，并且被用于生产许多化工产品如己二酸、1,4-丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯、n-甲基吡咯烷酮和2-吡咯烷酮等，因此有着广阔的需求市场。并且随着一些新应用领域的不断拓展，琥珀酸的需求量继续猛增。以碳水化合物等可再生资源作为原料利用微生物发酵法生产琥珀酸可以替代目前人类基于石油化工原料生产琥珀酸，是一种环境友好的绿色技术。

能够发酵积累琥珀酸的微生物菌株有很多，目前用于研究的菌株主要集中在产琥珀酸厌氧螺菌（Anaerobiospirillum succiniciproducens）、产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillussuccinogenes）、产琥珀酸曼海姆菌（Mannheimia succiniciproducens）、谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）和大肠杆菌（Escherichia coli）。作为厌氧菌，产琥珀酸厌氧螺菌发酵条件较为苛刻，营养需求丰富，发酵周期较长，无法耐受高浓度的葡萄糖和琥珀酸，并且具有潜在的致病性；产琥珀酸放线杆菌和产琥珀酸曼海姆菌属于瘤胃菌，发酵过程需要绝对厌氧，而且其生理、代谢和遗传背景并不十分清楚，遗传工具发展也不成熟，使得发酵副产物的产生不可避免。

大肠杆菌是一种兼性厌氧菌，即可以在好氧条件下进行快速生长，又可以在厌氧条件下进行混合酸发酵。作为一种模式生物，大肠杆菌遗传背景和代谢途径清楚，分子操作技术发展较为成熟，菌种筛选和代谢途径的改造比较容易，培养条件相对简单，可利用碳源范围广，生长速度快，因此成为研究琥珀酸发酵途径和提高琥珀酸产量的理想载体。大肠杆菌代谢工程菌株生产琥珀酸可以在好氧、微好氧或厌氧条件下进行：（1）好氧条件下，大肠杆菌工程菌株具有较快的生长和碳源代谢速率，但是当菌株进入稳定期或高细胞密度发酵时，往往会出现溶氧不足，而造成琥珀酸产生速率的降低和厌氧发酵副产物乳酸等的积累。（2）微好氧条件下，培养过程简单、容易扩大，能够降低发酵工业中最大的能量消耗成本----通气搅拌成本。工程菌株具有较快的碳源代谢速率，但是微好氧生长较为缓慢，发酵周期长，不利于设备的周转。（3）厌氧发酵条件下，具有最高的琥珀酸转化率（理论转化率较好氧条件下提高71.4%），但是厌氧条件下大肠杆菌生长较为缓慢，发酵周期长，不利于设备的周转。（4）目前通常采用的好氧生长-厌氧发酵的两阶段策略，这一方法虽然解偶联了生物量的积累和产物的产生过程，琥珀酸的生产能力通常受限于由好氧生长转移至厌氧发酵时刻细胞的生理状态；而且好氧生长过程没有琥珀酸的积累，不仅降低了碳源总转化率，而且降低了整个发酵过程中琥珀酸的总生产力（overall volumetric productivity）。针对以上琥珀酸生产过程中的优势与瓶颈，如果能够构建了一株好氧-微好氧-厌氧全阶段发酵生产琥珀酸的大肠杆菌工程菌株，该菌株能够快速生长并偶联琥珀酸的好氧生产，当菌株进入稳定期时控制发酵进入微好氧条件，更快地积累琥珀酸，最后转为厌氧条件，更高地转化葡萄糖为琥珀酸，并降低通气搅拌成本，琥珀酸的生产能力不再受限于转移时刻细胞的生理状态，而且无需像严格厌氧发酵那样需要在氮气或二氧化碳保护等辅助手段下进行。这样一株大肠杆菌琥珀酸生产菌株和全阶段发酵策略，将能够很好地解决了好氧琥珀酸发酵碳源转化率低、微好氧和厌氧琥珀酸发酵周期长和设备周转率低、及好氧生长-厌氧发酵的两阶段策略中琥珀酸生产能力不稳定和总生产力低的缺点。

经检索，利用好氧-微好氧-厌氧全阶段发酵生产琥珀酸的大肠杆菌工程菌还未见报道。

发明内容

针对利用大肠杆菌好氧、厌氧和好氧-厌氧两阶段发酵琥珀酸过程中存在的缺陷，本发明提供了一种大肠杆菌工程菌株及其好氧-微好氧-厌氧全阶段发酵生产琥珀酸的应用。

本发明通过基因工程技术，利用基因敲除技术构建了一株用于好氧-微好氧-厌氧全阶段发酵生产琥珀酸的大肠杆菌工程菌株，所述菌株名为埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)YL106,菌株的基因型为MG1655ΔptsGΔpoxBΔptaΔiclRΔsdhAΔarcAΔldhAΔadhE pckA*glf_ZM，该菌已于2013年4月17日保藏在“中国典型培养物保藏中心”，保藏编号为CCTCC NO:M2013149。

上述大肠杆菌（Escherichia coli）YL106，属于革兰氏阴性菌。该菌呈杆状，大小为0.4～0.6微米×1～3微米，有普通菌毛和性菌毛，无芽孢，生长温度范围在15～46℃之间，最适生长温度为37℃。

上述大肠杆菌工程菌株的出发菌株是大肠杆菌K-12系列MG1655，其基因组序列号为NC_000913.2。

上述大肠杆菌工程菌株的构建及检测步骤是：

(1).ptsG基因的敲除

通过Red重组系统在大肠杆菌MG1655中敲除ptsG基因（gene ID94565;编码磷酸转移酶系统（PTS）中IICB^Glc蛋白）。所得缺失ptsG基因的大肠杆菌MG1655(ΔptsG)。

(2).poxB基因的敲除

通过Red重组系统在大肠杆菌MG1655(ΔptsG)中敲除poxB基因（gene ID946132；编码丙酮酸氧化酶）。所得缺失poxB基因的大肠杆菌MG1655(ΔptsGΔpoxB)。

(3).pta基因的敲除

通过Red重组系统在大肠杆菌MG1655(ΔptsGΔpoxB)中敲除pta基因（gene ID946778;编码磷酸转乙酰基酶）。所得缺失pta基因的大肠杆菌MG1655(ΔptsGΔpoxBΔpta)。

(4).iclR基因的敲除

通过Red同源重组系统在大肠杆菌MG1655(ΔptsGΔpoxBΔpta)中敲除iclR基因（gene ID948524;编码aceBAK操纵子阻遏物）。所得缺失iclR基因的大肠杆菌MG1655(ΔptsGΔpoxBΔptaΔiclR)。

(5).sdhA基因的敲除

通过Red同源重组系统在大肠杆菌MG1655(ΔptsGΔpoxBΔptaΔiclR)中敲除sdhA基因（gene ID945402;编码琥珀酸脱氢酶A亚基）。所得缺失sdhA基因的大肠杆菌MG1655(ΔptsGΔpoxBΔptaΔiclRΔsdhA)，命名为E.coli QZ1111。

(6).arcA基因的敲除

通过Red同源重组系统在大肠杆菌MG1655(ΔptsGΔpoxBΔptaΔiclRΔsdhA)中敲除arcA基因（gene ID948874;编码氧气感应器双组分系统ArcAB中的ArcA组分）。所得缺失arcA基因的大肠杆菌MG1655(ΔptsGΔpoxBΔptaΔiclRΔsdhAΔarcA)，命名为E.coli QMJ03。

(7).ldhA基因的敲除

通过Red同源重组系统在大肠杆菌MG1655(ΔptsGΔpoxBΔptaΔiclRΔsdhAΔarcA)中敲除ldhA基因（gene ID946315;编码乳酸脱氢酶）。所得缺失ldhA基因的大肠杆菌MG1655(ΔptsGΔpoxBΔptaΔiclRΔsdhAΔarcAΔldhA)，命名为E.coli QMJ05。

(8).adhE基因的敲除

通过Red同源重组系统在大肠杆菌MG1655(ΔptsGΔpoxBΔptaΔiclRΔsdhAΔarcAΔldhA)中敲除adhE基因（gene ID945837;编码乙醇脱氢酶）。所得缺失adhE基因的大肠杆菌MG1655(ΔptsGΔpoxBΔptaΔiclRΔsdhAΔarcAΔldhAΔadhE)，命名为E.coli QMJ09。

(9).pckA基因的点突变

利用Red同源重组系统在大肠杆菌MG1655(ΔptsGΔpoxBΔptaΔiclRΔsdhAΔarcAΔldhAΔadhE)中对pckA基因（gene ID945667;编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶）进行点突变。所得pckA基因定点突变的大肠杆菌MG1655(ΔptsGΔpoxBΔptaΔiclRΔsdhAΔarcAΔldhAΔadhE pckA*)，命名为E.coli YL102。

(10).glf_ZM基因的整合

通过Red同源重组系统在大肠杆菌MG1655(ΔptsGΔpoxBΔptaΔiclRΔsdhAΔarcAΔldhAΔadhE pckA*)中整合来自于基因组序列编号为NC_017262.1的运动假单胞杆菌（Zymomonasmobilis subsp.mobilis ATCC10988）的gene ID为12280841的glf_ZM（编码糖运输载体）。所得整合glf_ZM基因的大肠杆菌MG1655(ΔptsGΔpoxBΔptaΔiclRΔsdhAΔarcAΔldhAΔadhEpckA*glf_ZM)，命名为E.coli YL106，该菌已于2013年4月17日保藏在“中国典型培养物保藏中心”，保藏编号为CCTCC NO:M2013149.

上述Red同源重组系统，是利用质粒pKD46表达重组酶Gam，Bet和Exo，通过设计引物以pKD3或pKD4为模板扩增出带有同源臂和筛选标记kan(卡那霉素抗性基因)或筛选标记cat（氯霉素抗性基因）的重组片断。然后将重组片断通过电穿孔仪电击而转入表达λ噬菌体重组酶Gam，Bet和Exo的目的菌株中。重组片断在重组酶的作用下与基因组上的目的基因发生重组，从而将原来的基因缺失或定点突变或插入基因组。而抗性基因是通过质粒pCP20表达FLP内切酶，从而将其从基因组上切除掉。

(11).工程菌株E.coli QZ1111好氧条件生产琥珀酸

我们对工程菌株E.coli QZ1111在无机盐培养基中以葡萄糖为唯一碳源进行好氧琥珀酸发酵。方法如下：将平板中的单克隆挑至装有50ml LB培养基的300ml的三角瓶中。置于37℃下培养12h，然后按照5%的接种量转入装有80ml添加40g/L葡萄糖的LB培养基的500ml的三角瓶中，置于37℃培养10h，转速为250转/min。然后按照10%的接种量转入装有800ml添加40g/L葡萄糖的无机盐培养基的1,200ml的四联罐中，37℃培养，转速为350转/min，通气量为1vvm，每间隔6h取样。

代谢产物分析采用高压液相色谱（HPLC）分析。方法：将所取得样品置于12,000转/min,离心2min。然后将上清利用孔径为0.2μm的滤膜过滤。过滤样品如果不及时检测则置于-20℃下保存一周。葡萄糖、乙酸和琥珀酸均采用示差检测器。检测样品前，葡萄糖、乙酸及琥珀酸标准样品进行梯度检测并绘制标准曲线。然后样品再进行检测。

(12).工程菌株E.coli QMJ03好氧-微好氧条件生产琥珀酸

我们对工程菌株E.coli QMJ03在无机盐培养基中以葡萄糖为唯一碳源进行好氧-微好氧两阶段琥珀酸发酵。方法如下：将平板中的单克隆挑至装有50ml LB培养基的300ml的三角瓶中。置于37℃下培养12h，然后按照5%的接种量转入装有80ml添加40g/L葡萄糖的LB培养基的500ml的三角瓶中，置于37℃培养10h，转速为250转/min。然后按照10%的接种量转入装有800ml添加40g/L葡萄糖的无机盐培养基的1,200ml的四联罐中，37℃培养，转速为350转/min，通气量为1vvm，每间隔6h取样。

代谢产物分析采用高压液相色谱（HPLC）分析(同上)。

(13).工程菌株E.coli QMJ09好氧-微好氧-厌氧条件生产琥珀酸的比较

我们对工程菌株E.coli QMJ09在无机盐培养基中以葡萄糖为唯一碳源进行好氧-微好氧-厌氧全阶段琥珀酸发酵。方法如下：将平板中的单克隆挑至装有50ml LB培养基的300ml的三角瓶中。置于37℃下培养12h，然后按照5%的接种量转入装有80ml添加40g/L葡萄糖的LB培养基的500ml的三角瓶中，置于37℃培养10h，转速为250转/min。然后按照10%的接种量转入装有800ml添加40g/L葡萄糖的无机盐培养基的1,200ml的四联罐中，37℃培养，转速为350转/min。起始通气量为1vvm，当菌株生长至对数生长后期时，即停止对发酵液进行通气，每间隔6h取样。

代谢产物分析采用高压液相色谱（HPLC）分析(同上)。

(14).工程菌株E.coli YL102和YL106好氧-微好氧-厌氧条件生产琥珀酸的比较

我们对工程菌株E.coli YL102和YL106在无机盐培养基中以葡萄糖为唯一碳源进行好氧-微好氧-厌氧全阶段琥珀酸发酵。方法如下：将平板中的单克隆挑至装有50ml LB培养基的300ml的三角瓶中。置于37℃下培养12h，然后按照5%的接种量转入装有80ml添加40g/L葡萄糖的LB培养基的500ml的三角瓶中，置于37℃培养10h，转速为250转/min。然后按照10%的接种量转入装有800ml添加40g/L葡萄糖的无机盐培养基的1,200ml的四联罐中，37℃培养，转速为350转/min。起始通气量为1vvm，当菌株生长至对数生长后期时，即停止对发酵液进行通气，每间隔6h取样。

代谢产物分析采用高压液相色谱（HPLC）分析。方法：将所取得样品置于12,000转/min,离心2min。然后将上清利用孔径为0.2μm的滤膜过滤。过滤样品如果不及时检测则置于-20℃下保存一周。葡萄糖、乙酸、甲酸、乳酸、乙醇和琥珀酸均采用示差检测器。检测样品前，葡萄糖、乙酸及琥珀酸标准样品进行梯度检测并绘制标准曲线。然后样品再进行检测。

(15)工程菌株E.coli Q106生产琥珀酸的好氧-微好氧-厌氧全阶段发酵模式的确定

好氧-微好氧-厌氧全阶段发酵模式包括：（i）菌体快速生长时保持高的通气量；（ii）当菌株进入对数生长后期时降低通气量，以避免碳的浪费，保持细胞高的葡萄糖代谢和琥珀酸产生速率；（iii）当琥珀酸积累到一定程度，停止对发酵液通气，使菌体处于厌氧发酵环境，利于提高碳源转化率。

具体实施方案：接种400mL种子到装有3.6L发酵培养基的7L发酵罐中，初始葡萄糖浓度为40g/L，以5M K₂CO₃和10M KOH维持pH在6.5-7.0之间。发酵过程为：

（i）好氧发酵阶段：发酵温度为37℃、搅拌转速为500转/分、pH6.5-7.0、溶氧在20%以上、培养时间为10h-14h；

（ii）微好氧发酵阶段：发酵温度为37℃、搅拌转速为500转/分、pH6.5-7.0、溶氧在5%～10%之间、培养时间为16h-36h；

(iii)厌氧发酵阶段：发酵温度为37℃、搅拌转速为500转/分、pH6.5-7.0、停止对发酵液通气、培养时间为10h-20h。

上述发酵培养基组成为：(NH₄)₂HPO₄·12H₂O，2.63g/L；NH₄H₂PO₄，0.87g/L；KCl，0.15g/L；MgSO₄·7H₂O，0.37g/L；微量元素（1000×：FeCl₃·6H₂O，2.4g/L；CoCl₂·6H₂O，0.3g/L；CuCl₂·2H₂O，0.15g/L；ZnCl₂，0.3g/L；Na₂MoO₄·H₂O，0.3g/L；H₃BO₃，0.075g/L；MnCl₂·4H₂O，0.5g/L；HCl，120mM）；蛋白胨，20g/L；酵母粉，10g/L；余量为水。

代谢产物分析采用高压液相色谱（HPLC）分析(同上)。

本发明是以最大化菌株生长过程中琥珀酸的产生速率为目的，构建了一株大肠杆菌工程菌株：（1）阻断好氧条件下副产物（乙酸）的产生途径（poxB，pta）和目标产物琥珀酸的代谢途径（sdhA），敲除乙醛酸支路抑制因子（iclR）激活目标产物琥珀酸的另外一条产生途径；（2）敲除工程菌株中氧气感应器（arcA），解除低溶氧对菌株代谢的抑制；（3）阻断厌氧混合酸发酵中与琥珀酸产生竞争还原力的其它副产物（乳酸和乙醇）的产生途径（ldhA，adhE）；（4）增加PEP羧化流量和ATP的产生（pckA*）；（5）基因组整合外源的葡萄糖运输系统（glf_ZM），加快葡萄糖的运输速率。

通过上述对大肠杆菌野生型菌株的一系列改造，所构建的大肠杆菌工程菌株具有以下能力：（1）有氧条件下，琥珀酸的生产与菌株有氧生长相偶联，可获得非常高的生物量并积累一定量的琥珀酸；（2）微好氧条件下，更快的代谢葡萄糖和积累琥珀酸；（3）厌氧条件下，以更高的转化率发酵葡萄糖生产琥珀酸；（4）产生更多的生物量和更高的琥珀酸/葡萄糖转化率；（5）更快的葡萄糖代谢速率和琥珀酸产生速率；（6）好氧-微好氧条件下，菌株快速生长并偶联琥珀酸的好氧生产，当菌株进入稳定期时控制发酵进入微好氧条件，更快地积累琥珀酸，降低通气搅拌成本；（7）好氧-微好氧-厌氧条件下，菌株快速生长并偶联琥珀酸的好氧生产，当菌株进入稳定期时控制发酵进入微好氧条件，更快地积累琥珀酸，最后转为厌氧条件，更高地转化葡萄糖为琥珀酸，并降低通气搅拌成本，琥珀酸的生产能力不再受限于转移时刻细胞的生理状态，而且无需像严格厌氧发酵那样需要在氮气或二氧化碳保护等辅助手段下进行。

本发明最终确定，所构建的大肠杆菌工程菌株在好氧-微好氧-厌氧全阶段发酵模式下，能够实现好氧生长偶联琥珀酸的好氧生产、微好氧发酵更快地生产琥珀酸及厌氧发酵更高地转化葡萄糖为琥珀酸而高效生产琥珀酸。

结果表明，本发明所述工程菌株利用好氧-微好氧-厌氧全阶段生产策略的琥珀酸产量较单一好氧生产提高2.26倍，较好氧-微好氧双阶段生产提高79.5%。进一步经过调整代谢流分配和加快碳源葡萄糖的跨膜运输，好氧-微好氧-厌氧全阶段生产琥珀酸的产量达到32.30g/L，这一产量较单一好氧生产提高4.33倍，较好氧-微好氧双阶段生产提高1.93倍。最终的7L发酵罐结果显示，在好氧-微好氧-厌氧全阶段条件下，工程菌的琥珀酸产量达到104g/L，特别是总生产力（2.13g/(L·h)）是目前利用大肠杆菌生产琥珀酸相关文献报道中最高的。因此本发明所述工程菌和好氧-微好氧-厌氧全阶段琥珀酸发酵工艺具有可观的工业化应用价值和前景。

本发明所构建的大肠杆菌琥珀酸生产菌株和全阶段发酵策略，很好地解决了好氧琥珀酸发酵碳源转化率低、微好氧和厌氧琥珀酸发酵周期长和设备周转率低、及好氧生长-厌氧发酵的两阶段策略中琥珀酸生产能力不稳定和总生产力低的缺点。在这一全阶段琥珀酸生产过程中，副产物积累较少，降低了琥珀酸的分离纯化成本，且能实现高生产速率，提高设备周转率，满足琥珀酸微生物发酵工业化的要求。

附图说明

本发明所述埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)YL106菌株已于2013年4月17日保藏在“中国典型培养物保藏中心”，保藏编号为CCTCC NO:M2013149（地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072）。

图1为本发明构建的好氧-微好氧-厌氧全阶段生产琥珀酸途径平台。

图2为本发明所构建菌株E.coli QZ1111在1.2L发酵罐好氧条件生产琥珀酸结果。

图3为本发明所构建菌株E.coli QMJ03在1.2L发酵罐好氧-微好氧条件生产琥珀酸结果。

图4为本发明所构建菌株E.coli QMJ09在1.2L发酵罐好氧-微好氧-厌氧条件生产琥珀酸结果。

图5为本发明所构建菌株E.coli YL106在7L发酵罐好氧-微好氧-厌氧全阶段生产琥珀酸应用一结果。

图6为本发明所构建菌株E.coli YL106在7L发酵罐好氧-微好氧-厌氧全阶段生产琥珀酸应用二结果。

具体实施方式

本发明所用大肠杆菌菌株E.coli MG1655（GenBank ID:NC_000913.2）购自普如汀生物技术（北京）有限公司。所述质粒pKD3（GenBank ID:AY048742.1）、pKD4（GenBank ID:AY048743.1）、pKD46（GenBank ID:AY048746.1）和pCP20（GenBank ID:HB393402.1）质粒购自ATCC(美国菌种保藏中心)。所述pUC19质粒（GenBank ID:L09137.2）为大肠杆菌克隆质粒，购自Invitrogen公司；限制性内切酶EcoRI购于Fermentas公司；T4DNA聚合酶购于New England Biolabs公司。glf_ZM基因（Gene ID:12280841）来源于运动假单胞杆菌Zymomonas mobilis ATCC10988（GenBank ID:NC_017262.1）；启动子为不需要IPTG诱导的组成型trc启动子（核酸序列为：

5’-AGCTTATATTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAATGTGTGG-3’）。

实施例1工程菌株的构建

(1).ptsG基因的敲除：

菌种：大肠杆菌MG1655

所述LB培养基为:蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L，氨苄青霉素100mg/L，氯霉素50mg/L。

所述氨苄霉素抗性平板为含有100mg/L的氨苄青霉素，1.5%的琼脂粉的LB固体培养基。

所述氯霉素抗性平板为含有50mg/L的氯霉素，1.5%的琼脂粉的LB固体培养基。

所述SOB培养基为：蛋白胨2g/L，酵母粉0.5g/L，NaCl0.0585g/L，KCl0.0186g/L，MgCl₂0.203g/L。

a同源重组片断的克隆

利用Red重组系统对目的基因进行敲除。根据Genbank公布的基因组序列号为

NC_000913.2的大肠杆菌MG1655中基因ID为945651的ptsG基因序列和GenBank ID为AY048742.1的质粒pKD3序列设计引物：

pKD-ptsG F:

5'-ACGTAAAAAAAGCACCCATACTCAGGAGCACTCTCAATTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'

pKD-ptsG R:

5'-AGCCATCTGGCTGCCTTAGTCTCCCCAACGTCTTACGGAATGGGAATTAGCCATGGTCC-3'

以GenBank ID为AY048742.1的质粒pKD3为模板，通过PCR(聚合酶链式反应)体外扩增获得带有氯霉素抗性的重组片断。PCR反应条件：95℃预变性5min，94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸60s，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。回收纯化浓缩同源重组片断。

b电转化感受态细胞的制备

(I)挑取带有pKD46质粒的大肠杆菌MG1655，接入5mL LB培养基中过夜培养，1%转入SOB培养基中，同时加入0.2%的阿拉伯糖，30℃培养OD₆₀₀至0.5；

(II)冰浴15min，离心菌体，然后利用冰冷的无菌ddH₂O洗涤三次；

(III)加入冰冷的无菌ddH₂O，浓缩至50倍，分装获得电转感受态。

c电转化，筛选重组子

(I)吸取1mg的同源重组片断，加入100μl的电转感受态细胞中，混匀。调节电穿孔仪，2.5Kv，电击；

(II)加入900μl的SOB培养基，37℃，150rpm，培养1h；

(III)涂布氯霉素抗性平板，挑取重组子利用

ptsG test F:5'-CCTGTACACGGCGAGGCTCT-3'

ptsG test R:5'-AATAACACCTGTAAAAAAGGCAGCC-3'

进行PCR检测，通过PCR产物测序进一步证实ptsG基因已被氯霉素抗性基因替换。

(IV)FRT位点专一性重组

将pCP20转入氯霉素阳性克隆，30℃培养8h，后提高至42℃过夜，热诱导FLP重组酶表达，质粒也逐渐丢失。利用接种环蘸取菌液在无抗性培养基上划线，将长出的单克隆同时转入无抗性平板和氯霉素抗性平板上培养，在无抗性平板上生长而在氯霉素抗性平板上不生长的说明已被FLP重组酶将氯霉素抗性基因删除。利用检测引物ptsG test F和ptsG test R进一步鉴定。

(V)获得工程菌株MG1655(ΔptsG)。

(2).poxB基因的敲除：

菌种：大肠杆菌MG1655(ΔptsG)

所述SOB培养基为：蛋白胨2g/L，酵母粉0.5g/L，NaCl0.0585g/L，KCl0.0186g/L，MgCl₂0.203g。

(1)同源重组片断的克隆

利用Red重组系统对目的基因进行敲除。根据Genbank公布的基因组序列号为NC_000913.2的大肠杆菌MG1655中基因ID为946132的poxB基因序列和GenBank ID为AY048742.1的质粒pKD3序列设计引物：

pKD-poxB F:

5′-AAACTTGTTACCGTTATCACATTCAGGAGATGGAGAACCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3′

pKD-poxB R:

5′-CATGGCATGTCCTTATTATGACGGGAAATGCCACCCTTTATGGGAATTAGCCATGGTCC-3′

以GenBank ID为AY048742.1的质粒pKD3为模板，通过PCR(聚合酶链式反应)体外扩增获得带有氯霉素抗性的重组片断。PCR反应条件：95℃预变性10min，94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸60s，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。回收纯化浓缩同源重组片断。

(2)电转化感受态细胞的制备

(I)挑取带有pKD46质粒的大肠杆菌MG1655(ΔptsG)，接入5mL LB培养之中过夜培养，1%转入SOB培养基中，同时加入0.2%的阿拉伯糖，30℃培养OD₆₀₀至0.5；

(III)加入冰冷的无菌ddH₂O，浓缩至50倍，分装电转感受态。

(3)电转化，筛选重组子

(I)吸取1mg的同源重组片断，加入100μl的感受态细胞中，混匀。调节电穿孔仪，2.5Kv，电击；

(II)加入900μl的SOB培养基，37℃，150rpm，培养1h；

(III)涂布氯霉素抗性平板，调取重组子利用

poxB test F:5′-TCCCCCTCCGTCAGATGA-3′

poxB test R:5′-GGTATCACTGCGTAAATCAA-3′

进行PCR检测，通过PCR产物测序进一步证实poxB基因已被氯霉素抗性基因替换。

(IV)FRT位点专一性重组

将pCP20转入氯霉素阳性克隆，30℃培养8h，后提高至42℃过夜，热诱导FLP重组酶表达，质粒也逐渐丢失。利用接种环蘸取菌液在无抗性培养基上划线，将长出的单克隆同时转入无抗性平板和氯霉素抗性平板上培养，在无抗性平板上生长而在氯霉素抗性平板上不生长的说明已被FLP重组酶将氯霉素抗性基因删除。利用检测引物poxB test F和poxB test R进一步鉴定。

(V)获得工程菌株MG1655(ΔptsGΔpoxB)。

(3)pta基因的敲除

菌种：大肠杆菌MG1655(ΔptsGΔpoxB)

(1)同源重组片断的克隆

利用Red重组系统对目的基因进行敲除。根据Genbank公布的基因组序列号为NC_000913.2的大肠杆菌MG1655中基因ID为946778的pta基因序列和GenBank ID为AY048742.1的质粒pKD3序列设计引物：

pKD-pta F

5′-GTAACCCGCCAAATCGGCGGTAACGAAAGAGGATAAACCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3′

pKD-pta R

5′-TCAGATATCCGCAGCGCAAAGCTGCGGATGATGACGAGAATGGGAATTAGCCATGGTCC-3′

(2)电转化感受态细胞的制备

(I)挑取带有pKD46质粒的大肠杆菌MG1655(ΔptsGΔpoxB)，接入5mL LB培养之中过夜培养，1%转入SOB培养基中，同时加入0.2%的阿拉伯糖，30℃培养OD₆₀₀至0.5；

(III)加入冰冷的无菌ddH₂O，浓缩至50倍，分装感受态。

(3)电转化，筛选重组子

(II)加入900μl的SOB培养基，37℃，150rpm，培养1h；

(III)涂布氯霉素抗性平板，调取重组子利用

Pta test F5′-TCAGCTGGCGGTGCTGTTT-3′

Pta test R5′-ACCGGAAATAGTGATTATTTCCGG-3′

进行PCR检测，通过PCR产物测序进一步证实pta已被氯霉素抗性基因替换。

(IV)FRT位点专一性重组

将pCP20转入氯霉素阳性克隆，30℃培养8h，后提高至42℃过夜，热诱导FLP重组酶表达，质粒也逐渐丢失。利用接种环蘸取菌液在无抗性培养基上划线，将长出的单克隆同时转入无抗性平板和氯霉素抗性平板上培养，在无抗性平板上生长而在氯霉素抗性平板上不生长的说明已被FLP重组酶将氯霉素抗性基因删除。利用检测引物Pta test F和Pta test R进一步鉴定。

(V)获得工程菌株MG1655(ΔptsGΔpoxBΔpta)。

（4）iclR基因的敲除：

菌株：MG1655(ΔptsGΔpoxBΔpta)

所使用的LB培养基为：1%蛋白胨，1%NaCl，0.5%酵母粉。

所使用的氨苄霉素抗性平板为含有100mg/L氨苄霉素和1.5%琼脂粉的LB固体培养基。

所使用的卡那霉素抗性平板为含有50mg/L卡那霉素和1.5%琼脂粉的LB固体培养基。

a．同源重组片段的克隆

利用Red同源重组系统对目的基因进行敲除。根据Genbank公布的基因组序列号为NC_000913.2的大肠杆菌MG1655中基因ID为948524的iclR基因序列和GenBank ID为AY048743.1的质粒pKD4序列设计引物：

pKD-iclR F:

5’-ATGAAAATGATTTCCACGATACAGAAAAAAGAGACTGTCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’

pKD-iclR R:

5’-TATGATGGGCAGAATATTGCCTCTGCCCGCCAGAAAAAGATGGGAATTAGCCATGGTCC-3’

以GenBank ID为AY048743.1的质粒pKD4为模板，通过PCR（聚合酶链式反应）扩增获得带有卡那霉素抗性的重组片段。

PCR反应条件：95℃预变性5min，94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸2min，30个循环后72℃终延伸10min，4℃保存。回收纯化浓缩同源重组片断备用。

b．电转化感受态细胞的制备

1)挑取带有pKD46质粒的大肠杆菌MG1655(ΔptsGΔpoxBΔpta)，接入5mL LB培养基中过夜培养，1%接种到SOB培养基中，同时加入1ml10%阿拉伯糖，30℃培养OD₆₀₀至0.6；

2)冰浴10min，收集菌体后利用冰冷的无菌ddH₂O洗涤三次；

3)用100μl冰冷的无菌ddH₂O重悬即得到电转化感受态细胞，置于冰上备用。

c.电转化，筛选重组子

1)取1mg纯化好的重组片段，加入到100μl电转化感受态细胞中，混匀并置于冰上2min后，2.5Kv电击。

2)迅速加入900μl SOB培养基，37℃，150rpm恢复培养1h。

3)将菌体涂布于卡那霉素抗性平板上，挑取重组子划线后，利用检测引物

iclR test F:5’-AAAATCGGCTTCGTTCAGTC-3’

iclR test R：5’-CGAGGAATACGAGTAATCA-3’

进行PCR检测。

d.抗性筛选标记的去除

将质粒pCP20转入阳性重组子，30℃培养6h，然后转入到42℃培养过夜。用接种环蘸取菌液在无抗性平板上划线，将长出的单克隆转接到无抗性平板和卡那霉素抗性平板上，能够在无抗性平板上生长而不能在卡那霉素抗性平板上生长的即为卡那霉素抗性基因已去除的重组子，然后利用iclR test F和iclR test R进一步PCR检测确定是否去除成功。

e.成功去除抗性基因的菌株即为工程菌株MG1655(ΔptsGΔpoxBΔptaΔiclR)。

（5）sdhA基因的敲除

菌株：MG1655(ΔptsGΔpoxBΔptaΔiclR)

所使用的LB培养基为：1%蛋白胨，1%NaCl，0.5%酵母粉。

a．同源重组片段的克隆

利用Red同源重组系统对目的基因进行敲除。根据Genbank公布的基因组序列号为NC_000913.2的大肠杆菌MG1655中基因ID为945402的sdhA基因序列和GenBank ID为AY048743.1的质粒pKD4序列设计引物：

pKD-sdhA F:

5’-TTACGTGATTTATGGATTCGTTGTGGTGTGGGGTGTGTGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’

pKD-sdhA R:

5’-ATAAATTGAAAACTCGAGTCTCATTTTCCTGTCTCCGCAATGGGAATTAGCCATGGTCC-3’

b．电转化感受态细胞的制备

1)挑取带有pKD46质粒的大肠杆菌MG1655(ΔptsGΔpoxBΔptaΔiclR)，接入5mL LB培养基中过夜培养，1%转接到SOB培养基中，同时加入1ml10%阿拉伯糖，30℃培养OD₆₀₀至0.6；

2)冰浴10min，收集菌体后利用冰冷的无菌ddH₂O洗涤三次；

c.电转化，筛选重组子

2)迅速加入900μl SOB培养基，37℃，150rpm恢复培养1h。

3)将菌体涂布于卡那霉素抗性平板上，挑去重组子划线后，利用检测引物

sdhA test F:5’-AAGCAACGCCTCCGCATTAG-3’

sdhA test R：5’-TAAACCTGGCAGCGGGCGAAT-3’

进行PCR检测。

d.抗性筛选标记的去除

将质粒pCP20转入重组子，30℃培养8h，然后转入到42℃培养过夜。用接种环蘸取菌液在无抗性平板上划线，将长出的单克隆转接到无抗性平板和卡那霉素抗性平板上，能够在无抗性平板上生长而不能在卡那霉素抗性平板上生长的即为卡那霉素抗性基因已去除的重组子，然后利用sdhA test F和sdhA test R进一步PCR检测确定是否去除成功。

e.成功去除抗性基因的菌株即为工程菌株MG1655(ΔptsGΔpoxBΔptaΔiclRΔsdhA)，命名为E.coli QZ1111。

（6）arcA基因的敲除

菌株：MG1655(ΔptsGΔpoxBΔptaΔiclRΔsdhA)

所使用的LB培养基为：1%蛋白胨，1%NaCl，0.5%酵母粉。

a．同源重组片段的克隆

利用Red同源重组系统对目的基因进行敲除。根据Genbank公布的基因组序列号为NC_000913.2的大肠杆菌MG1655中基因ID为948874的arcA基因序列和GenBank ID为AY048743.1的质粒pKD4序列设计引物：

pKD-arcA F:

5’-CTTCCTGTTTCGATTTAGTTGGCAATTTAGGTAGCAAACGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’

pKD-arcA R:

5’-GCTAAAAAGCGCCGTTTTTTTTGACGGTGGTAAAGCCGAATGGGAATTAGCCATGGTCC-3’

b．电转化感受态细胞的制备

1)挑取带有pKD46质粒的大肠杆菌MG1655(ΔptsGΔpoxBΔptaΔiclRΔsdhA)，接入5mLLB培养基中过夜培养，1%转接到SOB培养基中，同时加入1ml10%阿拉伯糖，30℃培养OD₆₀₀至0.6；

2)冰浴10min，收集菌体后利用冰冷的无菌ddH₂O洗涤三次；

c.电转化，筛选重组子

2)迅速加入900μl SOB培养基，37℃，150rpm恢复培养1h。

arcA test F:5’-GGATTCACCACGTTTATTAG-3’

arcA test R：5’-GGGCGATAATGAACGGTA-3’

进行PCR检测。

d.抗性筛选标记的去除

将质粒pCP20转入重组子，30℃培养8h，然后转入到42℃培养过夜。用接种环蘸取菌液在无抗性平板上划线，将长出的单克隆转接到无抗性平板和卡那霉素抗性平板上，能够在无抗性平板上生长而不能在卡那霉素抗性平板上生长的即为卡那霉素抗性基因已去除的重组子，然后利用arcA test F和arcA test R进一步PCR检测确定是否去除成功。

e.成功去除抗性基因的菌株即为工程菌株MG1655(ΔptsGΔpoxBΔptaΔiclRΔsdhAΔarcA)，命名为E.coli QMJ03。

（7）ldhA基因的敲除

菌株：MG1655(ΔptsGΔpoxBΔptaΔiclRΔsdhAΔarcA)

所使用的LB培养基为：1%蛋白胨，1%NaCl，0.5%酵母粉。

a．同源重组片段的克隆

利用Red同源重组系统对目的基因进行敲除。根据Genbank公布的基因组序列号为NC_000913.2的大肠杆菌MG1655中基因ID为946315的ldhA基因序列和GenBank ID为AY048743.1的质粒pKD4序列设计引物：

pKD-ldhA F:

5’-GTAGCTTAAATGTGATTCAACATCACTGGAGAAAGTCTTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’

pKD-ldhA R:

5’-TCTGAATCAGCTCCCCTGGAATGCAGGGGAGCGGCAAGAATGGGAATTAGCCATGGTCC-3’

b．电转化感受态细胞的制备

1)挑取带有pKD46质粒的大肠杆菌MG1655(ΔptsGΔpoxBΔptaΔiclRΔsdhAΔarcA)，接入5mL LB培养基中过夜培养，1%转接到SOB培养基中，同时加入1ml10%阿拉伯糖，30℃培养OD₆₀₀至0.6；

2)冰浴10min，收集菌体后利用冰冷的无菌ddH₂O洗涤三次；

c.电转化，筛选重组子

2)迅速加入900μl SOB培养基，37℃，150rpm恢复培养1h。

ldhA test F:5’-TGCAATACGTGTCCCGAG-3’

ldhA test R:5’-CAGTTTGCCTTCACCGCT-3’

进行PCR检测。

d.抗性筛选标记的去除

将质粒pCP20转入重组子，30℃培养8h，然后转入到42℃培养过夜。用接种环蘸取菌液在无抗性平板上划线，将长出的单克隆转接到无抗性平板和卡那霉素抗性平板上，能够在无抗性平板上生长而不能在卡那霉素抗性平板上生长的即为卡那霉素抗性基因已去除的重组子，然后利用ldhA test F和ldhA test R进一步PCR检测确定是否去除成功。

e．去除抗性成功的菌株即为工程菌株MG1655(ΔptsGΔpoxBΔptaΔiclRΔsdhAΔarcAΔldhA)，命名为E.coli QMJ05。

（8）adhE基因的敲除

菌株：MG1655(ΔptsGΔpoxBΔptaΔiclRΔsdhAΔarcAΔldhA)

所使用的LB培养基为：1%蛋白胨，1%NaCl，0.5%酵母粉。

所使用的卡那霉素抗性平板为含有50mg/L氯霉素和1.5%琼脂粉的LB固体培养基。

a．同源重组片段的克隆

利用Red同源重组系统对目的基因进行敲除。根据Genbank公布的基因组序列号为NC_000913.2的大肠杆菌MG1655中基因ID为945837的adhE基因序列和GenBank ID为AY048742.1的质粒pKD3序列设计引物：

pKD-adhE F:

5’-ATTCGAGCAGATGATTTACTAAAAAAGTTTAACATTATCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’

pKD-adhE R:

5’-ATCGGCATTGCCCAGAAGGGGCCGTTTATGTTGCCAGACATGGGAATTAGCCATGGTCC-3’

以GenBank ID为AY048742.1的质粒pKD3为模板，通过PCR（聚合酶链式反应）扩增获得带有氯霉素抗性的重组片段。

PCR反应条件：95℃预变性5min，94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸1.5min，30个循环后72℃终延伸10min，4℃保存。回收纯化浓缩同源重组片断备用。

b．电转化感受态细胞的制备

1)挑取带有pKD46质粒的大肠杆菌MG1655(ΔptsGΔpoxBΔptaΔiclRΔsdhAΔarcAΔldhA)，接入5mL LB培养基中过夜培养，1%转接到SOB培养基中，同时加入1ml10%阿拉伯糖，30℃培养OD₆₀₀至0.6；

2)冰浴10min，收集菌体后利用冰冷的无菌ddH₂O洗涤三次；

c.电转化，筛选重组子

2)迅速加入900μl SOB培养基，37℃，150rpm恢复培养1h。

3)将菌体涂布于氯霉素抗性平板上，挑去重组子划线后，利用检测引物

adhE-F：5’-AAGCGATGCTGAAAGGTG-3’

adhE-R：5’-AAAGCGTCAGGCAGTGTT-3’

进行PCR检测。

d.抗性筛选标记的去除

将质粒pCP20转入重组子，30℃培养8h，然后转入到42℃培养过夜。用接种环蘸取菌液在无抗性平板上划线，将长出的单克隆转接到无抗性平板和氯霉素抗性平板上，能够在无抗性平板上生长而不能在氯霉素抗性平板上生长的即为氯霉素抗性基因已去除的重组子，然后利用adhE test F和adhE test R进一步PCR检测确定是否去除成功。

e．去除抗性成功的菌株即为工程菌株MG1655(ΔptsGΔpoxBΔptaΔiclRΔsdhAΔarcAΔldhAΔadhE)，命名为E.coli QMJ09。

（9）pckA基因的定点突变

菌株：MG1655(ΔptsGΔpoxBΔptaΔiclRΔsdhAΔarcAΔldhAΔadhE)

所使用的LB培养基为：1%蛋白胨，1%NaCl，0.5%酵母粉。

a．同源重组片段的获取

利用Red同源重组系统对目的基因进行定点突变。根据Genbank公布的基因组序列号为NC_000913.2的大肠杆菌MG1655中基因ID为945667的pckA基因启动子序列，设计引物构建带有氯霉素抗性的突变：

1）pColE1复制子的获得：以大肠杆菌克隆质粒GenBank ID为L09137.2的pUC19为模

板，通过PCR（聚合酶链式反应）扩增获得600bp高拷贝pColE1复制子片段。引物序

列为：

pColE1ori-F：

5’-GCAGGAAAGAACATGTGAGCAA-3’

pColE1ori-R：

5’-TGAGCGTCAGACCCCGTAGA-3’

PCR反应条件：95℃预变性5min，94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸60s，30个循环后72℃终延伸10min，4℃保存。回收纯化浓缩复制子片断备用。

2）上游同源臂的克隆：以基因组序列号为NC_000913.2的大肠杆菌MG1655基因组为模板，通过PCR（聚合酶链式反应）扩增获得200bp上游同源片段。引物序列为（斜体字母为EcoRI位点）：

ColE1-upHPpckA-F：

5’-TCTACGGGGTCTGACGCTCAGAATTCCCCAAAGGCGCTTCTGTTTA-3’

cat-upHPpckA-R：

5’-GAAGCAGCTCCAGCCTACACATGGATAACGTTGAACTTTC-3’

PCR反应条件：95℃预变性5min，94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸30s，30个循环后72℃终延伸10min，4℃保存。回收纯化浓缩上游同源片断备用。

3）氯霉素抗性基因盒的克隆：以pKD3为模板，通过PCR（聚合酶链式反应）扩增获

得1100bp氯霉素抗性基因盒。引物序列为：

FRTcatFRT-F：

5’-GTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’

FRTcatFRT-R：

5’-ATGGGAATTAGCCATGGTCC-3’

PCR反应条件：95℃预变性5min，94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸60s，30个循环后72℃终延伸10min，4℃保存。回收纯化浓缩氯霉素抗性基因盒片断备用。

4）突变启动子的克隆：以基因组序列号为NC_000913.2的大肠杆菌MG1655基因组为模板，通过PCR（聚合酶链式反应）扩增获得500bp突变的pckA启动子（下游同源片段）。引物序列为（小写字母为突变碱基G→a；斜体字母为EcoRI位点）：

PpckA-F：

5’-GGACCATGGCTAATTCCCATGTTGGTTATCCAGAATCAAA-3’

PpckA-R1：

5’-TTTTTGGGGGTGTTAACCGtGACAAGGCTCATAGATTTA-3’

PpckA-F1：

5’-TAAATCTATGAGCCTTGTCaCGGTTAACACCCCCAAAAA-3’

ColEl-PpckA-R：

5’-TTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGAATTCGGTGAACGACCGGTGAAGAT-3’

PCR反应条件：95℃预变性5min，94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸30s，30个循环后72℃终延伸10min，4℃保存。回收获得含有突变位点的启动子片断备用。

5）将上述五个两两重叠的DNA片段混合，利用T4DNA聚合酶室温处理2.5min，冰

上放置15min，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选具有氯霉素抗性的菌株提取质粒

并测序，获得带有上游同源臂、氯霉素抗性基因盒和已突变的pckA启动子的质粒，命

名为pUC19-cat-pckA*，质粒DNA序列见序列表中序列号为58。

6）利用EcoRI酶切pUC19-cat-pckA*获得带有氯霉素抗性的重组片段，PCR反应条件：95℃预变性5min，94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸2min，30个循环后72℃终延伸10min，4℃保存。回收纯化浓缩同源重组片断备用。

b．电转化感受态细胞的制备

1)挑取带有pKD46质粒的大肠杆菌MG1655(ΔptsGΔpoxBΔptaΔiclRΔsdhAΔarcAΔldhAΔadhE)，接入5mL LB培养基中过夜培养，1%转接到SOB培养基中，同时加入1ml10%阿拉伯糖，30℃培养OD₆₀₀至0.6；

2)冰浴10min，收集菌体后利用冰冷的无菌ddH₂O洗涤三次；

c.电转化，筛选重组子

2)迅速加入900μl SOB培养基，37℃，150rpm恢复培养1h。

pckA-F：5’-CCCAAAGGCGCTTCTGTTTA-3’

pckA-R：5’-GGTGAACGACCGGTGAAGAT-3’

进行PCR检测并测序，确定已成功突变。

d.抗性筛选标记的去除

将质粒pCP20转入重组子，30℃培养8h，然后转入到42℃培养过夜。用接种环蘸取菌液在无抗性平板上划线，将长出的单克隆转接到无抗性平板和氯霉素抗性平板上，能够在无抗性平板上生长而不能在氯霉素抗性平板上生长的即为氯霉素抗性基因已去除的重组子，然后利用pckA test F和pckA test R进一步PCR检测确定是否去除成功。

e．去除抗性成功的菌株即为工程菌株MG1655(ΔptsGΔpoxBΔptaΔiclRΔsdhAΔarcAΔldhAΔadhE pckA*)，命名为E.coli YL102。

（10）glf_ZM基因的整合

菌株：MG1655(ΔptsGΔpoxBΔptaΔiclRΔsdhAΔarcAΔldhAΔadhE pckA*)

所使用的LB培养基为：1%蛋白胨，1%NaCl，0.5%酵母粉。

a．同源重组片段的获取

利用Red同源重组系统对目的基因进行整合，整合位点选择在ldhA基因所处位置。根据Genbank公布的基因组序列号为NC_000913.2的大肠杆菌MG1655中基因ID为946315的ldhA基因序列设计引物：

1）pColE1复制子的获得：以GenBank ID为L09137.2的大肠杆菌克隆质粒pUC19为模

列为：

pColE1ori-F：

5’-GCAGGAAAGAACATGTGAGCAA-3’

pColE1ori-R：

5’-TGAGCGTCAGACCCCGTAGA-3’

2）上游同源臂的克隆：以MG1655(ΔptsGΔpoxBΔptaΔiclRΔsdhAΔarcAΔldhA::kan)基因组为模板，通过PCR（聚合酶链式反应）扩增获得带有200bp ldhA基因上游同源片段的卡那抗性基因盒。引物序列为（斜体字母为EcoRI位点）：

ColE1-upHldhA-kan-F：

5’-TCTACGGGGTCTGACGCTCAGAATTCGGTAGCCAGATGCCCGCCAG-3’

FRTkanFRT-R：

5’-ATGGGAATTAGCCATGGTCC-3’

PCR反应条件：95℃预变性5min，94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸120s，30个循环后72℃终延伸10min，4℃保存。回收纯化浓缩带有200bp ldhA基因上游同源片段的卡那抗性基因盒片断备用。

3）组成型trc启动子的克隆：

trc-rbs-F：

5’-GGACCATGGCTAATTCCCATAGCTTATATTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAAT CATCCGGCTCGTATAAT-3’

rbs-trc-R：

5’-TATGAGTTATTTCCTTTCTAGACTCTAGACCACACATTATACGAGCCGGATGATT-3’

将上述两条引物于95℃预变性5min，56℃退火45s，72℃延伸60s，4℃保存。回收纯化浓缩获得组成型trc启动子和核糖体结合位点rbs片断备用。

4）glf_ZM基因的克隆：以Genbank公布的基因组序列号为NC_017262.1的运动假单胞杆菌Zymomonas mobilis ATCC10988基因组为模板，通过PCR（聚合酶链式反应）扩增获得基因ID为12282841的glf_ZM基因。引物序列为：

rbs-glf-F：

5’-TCTAGAAAGGAAATAACTCATAATGAGTTCTGAAAGTAGT-3’

glf-R：

5’-CTACTTCTGGGAGCGCCACATC-3’

PCR反应条件：95℃预变性5min，94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环后72℃终延伸10min，4℃保存。回收获得glf_ZM基因片断备用。

5）下游同源臂的克隆：以MG1655(ΔptsGΔpoxBΔptaΔiclRΔsdhAΔarcAΔldhA::kan)基因组为模板，通过PCR（聚合酶链式反应）扩增获得200bp ldhA基因下游同源片段。引物序列为（斜体字母为EcoRI位点）：

downHldhA-F：

5’-GATGTGGCGCTCCCAGAAGTAGTCTTGCCGCTCCCCTGCATTCC-3’

ColE1-downHldhA-R：

5’-TTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGAATTCGGGTCATTGCCAGCCCTTTG-3’

PCR反应条件：95℃预变性5min，94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸60s，30个循环后72℃终延伸10min，4℃保存。回收纯化浓缩获得200bp ldhA基因下游同源片段备用。

6）将上述五个两两重叠的DNA片段混合，利用T4DNA聚合酶室温处理2.5min，冰上放置15min，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选具有卡那抗性的菌株提取质粒并测序，获得带有ldhA基因上游同源臂、卡那霉素抗性基因盒、trc-rbs-glf_ZM操纵子和ldhA基因下游同源臂的质粒，命名为pUC19-trc-rbs-glf_ZM，质粒DNA序列见序列表中序列号为59。

7)利用EcoRI酶切pUC19-trc-rbs-glf_ZM获得带有卡那霉素抗性盒的重组片段，回收纯化浓缩同源重组片断备用。

b．电转化感受态细胞的制备

1)挑取带有pKD46质粒的大肠杆菌MG1655(ΔptsGΔpoxBΔptaΔiclRΔsdhAΔarcAΔldhAΔadhE pckA*)，接入5mL LB培养基中过夜培养，1%转接到SOB培养基中，同时加入1ml10%阿拉伯糖，30℃培养OD₆₀₀至0.6；

2)冰浴10min，收集菌体后利用冰冷的无菌ddH₂O洗涤三次；

c.电转化，筛选重组子

2)迅速加入900μl SOB培养基，37℃，150rpm恢复培养1h。

ldhA test F:5’-TGCAATACGTGTCCCGAG-3’

ldhA test R:5’-CAGTTTGCCTTCACCGCT-3’

进行PCR检测，确定glf_ZM以成功整合进ldhA基因所处位置。

d.抗性筛选标记的去除

e．去除抗性成功的菌株即为工程菌株MG1655(ΔptsGΔpoxBΔptaΔiclRΔsdhAΔarcAΔldhAΔadhE pckA*glf_ZM)，命名为E.coli YL106。

上述菌株已于2013年4月17日保藏在“中国典型培养物保藏中心”，保藏编号为CCTCCNO:M2013149。

所构建工程菌株的碳源代谢途径见图1。如图所示改造的工程菌株E.coli YL106(保藏编号为CCTCC NO:M2013149)的葡萄糖代谢途径中,ptsG的缺失将减少丙酮酸的积累，从而进一步减少流向乙酸的碳流量，提高细胞内琥珀酸的间接前体物质PEP的水平；poxB和pta基因的缺失阻断了乙酸盐的生成途径，从而降低了乙酸盐的生成；iclR的缺失使乙醛酸途径被激活，一方面进一步降低乙酸的产生，另一方面增加琥珀酸的生成；sdhA的缺失可以阻断琥珀酸的进一步氧化，使得工程菌株在好氧和微好氧条件下积累琥珀酸；arcA基因的敲除，有助于解除其在微好氧和厌氧条件下对琥珀酸产生途径TCA循环和乙醛酸支路的抑制；ldhA基因的敲除，阻断了乳酸的生成途径，在微好氧和厌氧条件下使得更多的碳流量（丙酮酸，pyruvate）和还原力（NADH）流向琥珀酸；adhE基因的敲除，阻断了乙醇的生成途径，在微好氧和厌氧条件下使得更多的碳流量（乙酰辅酶A，acetyl-CoA）和还原力（NADH）流向琥珀酸；pckA*基因的基因组定点突变，可以使糖异生途径的PCK转向催化磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）生成草酰乙酸（OAA），进一步提高TCA循环还原支路的流量，有利于在好氧、微好氧和厌氧条件下使得更多的碳流量流向琥珀酸，并产生细胞能量货币ATP，利于细胞的生物合成；glf_ZM基因的基因组插入，进一步提高碳源葡萄糖的转运速率，有利于好氧、微好氧和厌氧条件下提高琥珀酸的生产速率。

实施例2.工程菌株E.coli QZ1111好氧条件生产琥珀酸

我们对工程菌株E.coli QZ1111在无机盐培养基中以葡萄糖为唯一碳源进行好氧琥珀酸发酵。

菌种:E.coli QZ1111[菌种基因型为：MG1655(ΔptsGΔpoxBΔptaΔiclRΔsdhA)]

（注，未改造的原始菌株MG1655不生产琥珀酸）

种子培养基：LB培养基（蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L）。

发酵培养基：AM1培养基（组成为（g/L）：(NH₄)₂HPO₄·12H₂O，2.63；NH₄H₂PO₄，0.87；KCl，0.15；MgSO₄·7H₂O，0.37；微量元素（1000×：FeCl₃·6H₂O，2.4；CoCl₂·6H₂O，0.3；CuCl₂·2H₂O，0.15；ZnCl₂，0.3；Na₂MoO₄·H₂O，0.3；H₃BO₃，0.075；MnCl₂·4H₂O，0.5；HCl，120mM）；余量为水）。

培养方法：将平板中的单克隆挑至装有50ml LB培养基的300ml的三角瓶中。置于37℃下培养12h，然后按照5%的接种量转入装有80ml添加40g/L葡萄糖的LB培养基的500ml的三角瓶中，置于37℃培养10h，转速为250转/min。然后按照10%的接种量转入装有800ml添加40g/L葡萄糖的无机盐培养基的1,200ml的四联罐中，37℃培养，转速为350转/min，通气量为1vvm，每间隔6h取样。

分析方法：（1）将菌液置于室温下12,000转/min,离心2min。将上清倒掉，然后利用0.6M的NaCl溶液洗两次，重悬，在600nm波长下检测吸光度（1OD≈0.34g Cell Dry Weight(CDW)/L）。（2）代谢产物分析采用高压液相色谱（HPLC）分析。即将所取得样品置于12,000转/min,离心2min。然后将上清利用孔径为0.2μm的滤膜过滤。检测柱为BioRad HPX-87有机酸分析柱；柱温箱温度为65℃；流动相为5mM H2SO4，流速为0.6ml/min；检测器为示差检测器。检测样品前，葡萄糖、乙酸及琥珀酸标准样品进行梯度检测并绘制标准曲线。然后样品再进行检测。

分析结果如图2。如图所示，E.coli QZ1111在进行好氧培养的过程中，能够生产一定量的琥珀酸（6.05g/L），而且琥珀酸的产生与菌株生长相偶联。值得一提的是，野生型大肠杆菌MG1655在好氧条件下不能积累琥珀酸，而是产生大量的乙酸，所以，我们基于MG1655的前四步基因遗传改造，一方面降低副产物乙酸的产生，一方面对大肠杆菌代谢流进行一定的分配和部分琥珀酸产生途径（乙醛酸支路）的激活。

实施例3.工程菌株E.coli QMJ03好氧-微好氧条件生产琥珀酸

我们对工程菌株E.coli QMJ03在无机盐培养基中以葡萄糖为唯一碳源进行好氧-微好氧两阶段琥珀酸发酵。

E.coli QMJ03[菌种基因型为：MG1655(ΔptsGΔpoxBΔptaΔiclRΔsdhAΔarcA)]

发酵培养基：AM1培养基（同上）。

分析方法：（1）将菌液置于室温下12,000转/min,离心2min。将上清倒掉，然后利用0.6M的NaCl溶液洗两次，重悬，在600nm波长下检测吸光度（1OD≈0.34g Cell Dry Weight(CDW)/L）。（2）代谢产物分析采用高压液相色谱（HPLC）分析。将所取得样品置于12,000转/min,离心2min。然后将上清利用孔径为0.2μm的滤膜过滤。检测柱为BioRad HPX-87有机酸分析柱；柱温箱温度为65℃；流动相为5mM H₂SO4，流速为0.6ml/min；检测器为示差检测器。检测样品前，葡萄糖、乙酸及琥珀酸标准样品进行梯度检测并绘制标准曲线。然后样品再进行检测。

分析结果如图3。如图所示，E.coli QMJ03在进行好氧-微好氧培养过程中，能够生产更多的琥珀酸，琥珀酸的产生速率几乎保持恒定，不再受发酵液中低溶氧的影响，琥珀酸产量较E.coli QZ1111提高81.6%，至10.99g/L；而且发酵过程中所产生的副产物乙酸也降低了，较E.coli QZ1111降低60%，至0.69g/L。

实施例4.工程菌株E.coli QMJ09好氧-微好氧-厌氧条件生产琥珀酸的比较

我们对工程菌株E.coli QMJ09在无机盐培养基中以葡萄糖为唯一碳源进行好氧-微好氧-厌氧全阶段琥珀酸发酵。

菌种:

E.coli QMJ03[菌种基因型为：MG1655(ΔptsGΔpoxBΔptaΔiclRΔsdhAΔarcA)]

E.coli QMJ09[菌种基因型为：MG1655(ΔptsGΔpoxBΔptaΔiclRΔsdhAΔarcAΔldhAΔadhE)]

发酵培养基：AM1培养基（同上）。

培养方法：将平板中的单克隆挑至装有50ml LB培养基的300ml的三角瓶中。置于37℃下培养12h，然后按照5%的接种量转入装有80ml添加40g/L葡萄糖的LB培养基的500ml的三角瓶中，置于37℃培养10h，转速为250转/min。然后按照10%的接种量转入装有800ml添加40g/L葡萄糖的无机盐培养基的1,200ml的四联罐中，37℃培养，转速为350转/min。起始通气量为1vvm，当菌株生长至对数生长后期时，即停止对发酵液进行通气，每间隔6h取样。

分析方法：（1）将菌液置于室温下12,000转/min,离心2min。将上清倒掉，然后利用0.6M的NaCl溶液洗两次，重悬，在600nm波长下检测吸光度（1OD≈0.34g Cell Dry Weight(CDW)/L）。（2）代谢产物分析采用高压液相色谱（HPLC）分析。将所取得样品置于12,000转/min,离心2min。然后将上清利用孔径为0.2μm的滤膜过滤。检测柱为BioRad HPX-87有机酸分析柱；柱温箱温度为65℃；流动相为5mM H2SO4，流速为0.6ml/min；检测器为示差检测器。检测样品前，葡萄糖、乙酸及琥珀酸标准样品进行梯度检测并绘制标准曲线。然后样品再进行检测。

分析结果如图4。如图所示，E.coli QMJ09在进行好氧-微好氧-厌氧全阶段培养过程中，能够生产更多的琥珀酸，琥珀酸产量较E.coli QMJ03提高73.1%，至19.73g/L；而且发酵过程中检测不到乳酸和乙醇等副产物，仅有少量的乙酸（0.83g/L）和甲酸（0.75g/L）。

实施例5.工程菌株E.coli YL102和YL106好氧-微好氧-厌氧条件生产琥珀酸的比较

我们对工程菌株E.coli YL102和YL106在无机盐培养基中以葡萄糖为唯一碳源进行好氧-微好氧-厌氧全阶段琥珀酸发酵。

菌种:

E.coli YL102[菌种基因型为：MG1655(ΔptsGΔpoxBΔptaΔiclRΔsdhAΔarcAΔldhAΔadhE pckA*)]

E.coli YL106[菌种基因型为：MG1655(ΔptsGΔpoxBΔptaΔiclRΔsdhAΔarcAΔldhAΔadhE pckA*glf_ZM)]

发酵培养基：AM1培养基（同上）。

分析方法：（1）将菌液置于室温下12,000转/min,离心2min。将上清倒掉，然后利用0.6M的NaCl溶液洗两次，重悬，在600nm波长下检测吸光度（1OD≈0.34g Cell Dry Weight(CDW)/L）。（2）代谢产物分析采用高压液相色谱（HPLC）分析。将所取得样品置于12,000转/min,离心2min。然后将上清利用孔径为0.2μm的滤膜过滤。检测柱为BioRad HPX-87有机酸分析柱；柱温箱温度为65℃；流动相为5mM H₂SO₄，流速为0.6ml/min；检测器为示差检测器。检测样品前，葡萄糖、乙酸及琥珀酸标准样品进行梯度检测并绘制标准曲线。然后样品再进行检测。

分析结果如表1。如表所示，E.coli YL102在进行好氧-微好氧-厌氧全阶段培养过程中，能够产生更多的生物量，并且生产更多的琥珀酸，琥珀酸产量较E.coli QMJ09提高18.6%，至23.4g/L；E.coli YL106在进行好氧-微好氧-厌氧全阶段培养过程中，能够加快葡萄糖的代谢，并且生产更多的琥珀酸，琥珀酸产量较E.coli QMJ09提高63.7%，较E.coli YL102提高38%，至32.3g/L。

表1E.coli YL102和YL106在1.2L发酵罐好氧-微好氧-厌氧全阶段生产琥珀酸结果

最终确定所构建的大肠杆菌工程菌株在好氧-微好氧-厌氧全阶段发酵模式下，能够实现好氧生长偶联琥珀酸的好氧生产、微好氧发酵更快地生产琥珀酸及厌氧发酵更高地转化葡萄糖为琥珀酸而高效生产琥珀酸。

结果表明，工程菌株利用好氧-微好氧-厌氧全阶段生产策略的琥珀酸产量较单一好氧生产提高2.26倍，较好氧-微好氧双阶段生产提高79.5%。进一步经过调整代谢流分配和加快碳源葡萄糖的跨膜运输，好氧-微好氧-厌氧全阶段生产琥珀酸的产量达到32.30g/L，这一产量较单一好氧生产提高4.33倍，较好氧-微好氧双阶段生产提高1.93倍。

实施例6.工程菌株E.coli YL106好氧-微好氧-厌氧全阶段发酵生产琥珀酸的应用一

冷冻甘油管保存的大肠杆菌YL106划线接种于LB平板（1%蛋白胨，1%NaCl，0.5%酵母粉，1.5%琼脂粉），37℃培养12h。

一级种子：将上述平板上长出的单菌落接入装有50ml的LB培养基（1%蛋白胨，1%NaCl，0.5%酵母粉）的250ml三角瓶中，37℃，250rpm震荡培养活化。

二级种子：取10ml活化的培养液转接到装有200ml AM1培养基的1,000ml三角瓶中，37℃，250rpm好氧培养8h。

好氧-微好氧-厌氧全阶段发酵：接种400mL二级种子到装有3.6L AM1培养基的7L发酵罐中，初始葡萄糖浓度为40g/L，当发酵液中葡萄糖浓度降低到10g/L以下时，补加800g/L的葡萄糖母液至20g/L左右；以5M K₂CO₃和10M KOH维持pH在6.5-7.0之间。发酵过程控制为：

（i）好氧发酵阶段：发酵温度为37℃、搅拌转速为500转/分、pH6.5-7.0、溶氧在20%以上、培养时间为12h；

（ii）微好氧发酵阶段：发酵温度为37℃、搅拌转速为500转/分、pH6.5-7.0、溶氧在5%～10%之间、培养时间为16h；

(iii)厌氧发酵阶段：发酵温度为37℃、搅拌转速为500转/分、pH6.5-7.0、停止对发酵液通气、培养时间为12h。

分析结果如图5。如图所示，E.coli YL106在7L发酵罐中进行好氧-微好氧-厌氧全阶段发酵过程中，好氧发酵阶段菌体快速生长，并以生长偶联的形式快速积累琥珀酸，至菌株对数后期琥珀酸的产量和对葡萄糖的产率分别达到20.3g/L和0.81mol/mol；微好氧发酵阶段，菌体快速代谢葡萄糖和积累琥珀酸，并以更高的转化率将葡萄糖转化为琥珀酸，琥珀酸的产量和对葡萄糖的产率分别为52.9g/L和1.05mol/mol，这一阶段的平均生产力为3.3g/(l h)；而最大生产力出现在降低通气量后的4h，为4.67g/(L h)；厌氧发酵阶段，菌体以更高的转化率将葡萄糖转化为琥珀酸，琥珀酸的产量和对葡萄糖的产率分别为12.1g/L和1.14mol/mol。

在好氧-微好氧-厌氧全阶段发酵过程中，工程菌的琥珀酸产量达到85.3g/L，其总转化率和总生产力分别为0.99mol/mol和2.13g/(L·h)。该工程菌株通过利用好氧-微好氧-厌氧全阶段生产策略所达到的总生产力（2.13g/(L·h)）是目前利用大肠杆菌生产琥珀酸相关文献报道中最高的。

实施例7.工程菌株E.coli YL106好氧-微好氧-厌氧全阶段发酵生产琥珀酸的应用二

（ii）微好氧发酵阶段：发酵温度为37℃、搅拌转速为500转/分、pH6.5-7.0、溶氧在5%～10%之间、培养时间为36h；

(iii)厌氧发酵阶段：发酵温度为37℃、搅拌转速为500转/分、pH6.5-7.0、停止对发酵液通气、培养时间为20h。

分析结果如图6。如图所示，E.coli YL106在7L发酵罐中进行好氧-微好氧-厌氧全阶段发酵过程中，好氧发酵阶段菌体快速生长，并以生长偶联的形式快速积累琥珀酸，至菌株对数后期琥珀酸的产量达到20.3g/L；微好氧发酵阶段，菌体快速代谢葡萄糖和积累琥珀酸，琥珀酸的产量为70.6g/L；厌氧发酵阶段，菌体以更高的转化率将葡萄糖转化为琥珀酸，琥珀酸的产量为13.56g/L。

在好氧-微好氧-厌氧全阶段发酵过程中，工程菌的琥珀酸产量达到104.3g/L。该工程菌株通过利用好氧-微好氧-厌氧全阶段生产策略所达到的琥珀酸产量（104.3g/L）是目前利用大肠杆菌生产琥珀酸相关文献报道中最高的。

Claims

1.一种大肠杆菌工程菌株，其特征在于：所述菌株名为埃希氏大肠杆菌(Escherichiacoli)YL106,菌株的基因型为MG1655 ΔptsG ΔpoxB Δpta ΔiclR ΔsdhA ΔarcA ΔldhAΔadhE pckA*glf_ZM，该菌已于2013年4月17日保藏在“中国典型培养物保藏中心”，保藏编号为CCTCC NO:M 2013149。

2.权利要求1所述大肠杆菌工程菌株在好氧-微好氧-厌氧全阶段发酵生产琥珀酸的应用，其特征在于，所述好氧阶段条件是发酵温度为37℃、搅拌转速为500转/分、pH6.5-7.0、溶氧在20％以上、培养时间为10h-14h；微好氧阶段条件是发酵温度为37℃、搅拌转速为500转/分、pH 6.5-7.0、溶氧在5％～10％之间、培养时间为16h-36h；厌氧阶段条件为发酵温度为37℃、搅拌转速为500转/分、pH 6.5-7.0、停止对发酵液通气、培养时间为10h-20h；在整个发酵过程中，初始葡萄糖浓度为40g/L，当其浓度降低到10g/L时，补充其浓度至20g/L，并用5M K₂CO₃和10M KOH维持pH在6.5-7.0；

其中上述权利要求1所述大肠杆菌工程菌株在好氧-微好氧-厌氧全阶段发酵生产琥珀酸所使用的发酵培养基组成为：

(NH₄)₂HPO₄·12H₂O，2.63g/L；NH₄H₂PO₄，0.87g/L；KCl，0.15g/L；MgSO₄·7H₂O，0.37g/L；FeCl₃·6H₂O，0.0024g/L；CoCl₂·6H₂O，0.0003g/L；CuCl₂·2H₂O，0.00015g/L；ZnCl₂，0.0003g/L；Na₂MoO₄·H₂O，0.0003g/L；H₃BO₃，0.000075g/L；MnCl₂·4H₂O，0.0005g/L；HCl，0.12mM；蛋白胨，20g/L；酵母粉，10g/L；余量为水。