CN114854809B - 一种微氧诱导大肠杆菌发酵重组蛋白质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种微氧诱导大肠杆菌发酵重组类人源胶原蛋白质的方法,包括菌种活化、种子液的培养和分批补料发酵,其特征在于,所述分批补料发酵的过程包括:细胞快速繁殖阶段:将二级种子液接种至基础发酵培养基中进行培养;在培养过程中,溶氧维持在30%‑33%,通过向发酵液中补加第一种补料培养基来控制基因工程菌的比生长速率在0.1‑0.5之间;微氧诱导表达重组蛋白阶段:向发酵液中流加乳糖诱导基因工程菌表达蛋白,并将第一种补料培养基更换为第二种补料培养基;根据发酵液中的溶氧量进行反馈补料以及流加乳糖诱导剂,溶氧维持在0%‑5%,直至发酵结束。
Description
技术领域
本发明涉及重组蛋白生物制品技术领域,特别是涉及一种微氧诱导大肠杆菌发酵重组蛋白质的方法。
背景技术
大肠杆菌是一种常用的宿主菌,它的基因组、代谢组和蛋白质组已被研究人员广泛研究,常用于生产重组蛋白和酶,其表达重组蛋白具有以下特点:易于生长控制、用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵、缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工,常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。大肠杆菌诱导表达目的蛋白常用IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)、乳糖作为诱导物,IPTG是一种人工合成的乳糖类似物,性质稳定,具有不被菌体消耗的优点,但是IPTG对人体存在潜在毒性,可能会存在一些不安全因素,同时其较强的诱导效果可能会造成蛋白表达过量,形成包涵体;而乳糖作为天然诱导剂,在β-半乳糖透过酶的作用下,进入细胞,转变为异乳糖诱导操纵子启动,其具有价格低,无毒性,适于工业放大生产,还可作为碳源促进细胞生长,诱导强度低,促进蛋白可溶性表达等优点。
大肠杆菌作为一种兼性厌氧菌,对氧浓度具有极强的适应能力,能够通过感知有氧、微氧和无氧环境来改变其代谢模式。在有氧环境下,菌体将丙酮酸氧化,同时将电子传递给氧气,并产生ATP(腺嘌呤核苷三磷酸)。在微氧或者无氧条件下,菌体的代谢途径主要为混合酸代谢,通过使用替代电子受体(例如甲酸盐、硝酸盐和亚硝酸盐)来维持生存。大肠杆菌的耗氧能力是有限的,而在微氧条件下其可以快速消耗氧气,以提供一个压力较小、最小化消耗ATP的环境,用来维持稳态。有研究证明,细菌在微氧条件下的低呼吸率会增加其对乳糖的摄取率以及代谢率。而乳糖代谢的高通量有助于激活核糖体的合成、氨基酸生物量合成和低应激调节,从而导致大肠杆菌中蛋白质产量增加。
发明内容
本发明在传统大肠杆菌需氧化酵重组胶原蛋白方法的基础上,提供了一种在微氧条件下诱导大肠杆菌发酵重组胶原蛋白的方法,该方法具有可增强细菌运输乳糖、合成核糖体和氨基酸的能力,提高蛋白质表达量以及菌体浓度等优点。
本发明提供了一种微氧诱导大肠杆菌发酵重组蛋白质的方法,包括菌种活化、种子液的培养和分批补料发酵,所述分批补料发酵的过程包括:
步骤(1)、细胞快速繁殖阶段:将二级种子液接种至基础发酵培养基中进行培养,其中,培养温度为33℃-35℃,通气比控制在3-5立方米/(立方米*分钟),转速控制在150-900rpm,发酵液的溶氧量为30-33%,发酵液的pH值为7.0-7.5;在培养过程中,通过向发酵液中补加第一种补料培养基来控制基因工程菌的比生长速率在0.1-0.5之间;
步骤(2)、微氧诱导表达重组蛋白阶段:向发酵液中流加乳糖诱导基因工程菌表达蛋白,并将第一种补料培养基更换为第二种补料培养基;根据发酵液中的溶氧量进行反馈补料以及流加乳糖诱导剂,直至发酵结束;其中,培养温度为30℃-33℃,发酵液的pH值为7.3-7.8,发酵液的溶氧量为5%,通过向发酵液补加第二种补料培养基来控制基因工程菌的比生长速率为0.02-0.06之间;
所述基础发酵培养基为:10.0-15.0g/L胰蛋白胨,5.0-10.0g/L酵母浸粉,8.0-12.0g/L甘油,14.0-15.0g/L磷酸二氢钾,3.0-4.0g/L磷酸氢二钠,4.5-5.5g/L氯化钠,0.8-1.2g/L硫酸镁,0.8-1.2g/L一水合柠檬酸,3.0-3.5g/L氢氧化钠,0.8-1.0mL微量元素;
所述第一种补料培养基为:20.0-30.0g/L胰蛋白胨,20.0-30.0g/L酵母浸粉,170.0-380.0g/L葡萄糖,350.0-570.0g/L甘油,4.0-15.0g/L硫酸镁,1.0-5.0g/L一水合柠檬酸,3.0-7.0g/L磷酸二氢钾,1.0-6.0g/L磷酸氢二钠,0.8-1.0mL微量元素;
所述第二种补料培养基为:700-750g/L甘油,9.5-10.0g/L硫酸镁,2.5-3.5g/L一水合柠檬酸,4.5-5.0g/L磷酸二氢钾,1.0-1.5g/L磷酸氢二钠,0.8-1.2mL微量元素。
可选的,表达所述重组类人源胶原蛋白的基因工程菌为大肠杆菌E.coil BL21(DE3)。
可选的,所述步骤(1)中,菌种在发酵培养基中分批培养4-6小时且溶氧升至60%以上时,再向发酵液中补加第一种补料培养基。
可选的,所述步骤(1)中,第一种补料培养基中的葡萄糖与甘油的含量比设置为1:(1-3)。
可选的,所述步骤(2)中,在当发酵液中基因工程菌的细菌光密度达到OD600=100-120、发酵液的溶氧量调控至0-5%、通气比控制在1.6-2.8立方米/(立方米*分钟),形成微氧条件后再向发酵液中流加乳糖诱导基因工程菌表达蛋白。
可选的,补入第二种补料培养基的流加速度与乳糖的流加速相同,以进行共同补料。
可选的,所述菌种的活化过程包括:
采用接种环取菌种管内的-80℃甘油管保藏的表达重组类人源胶原蛋白的基因工程菌在含卡那抗性的LB琼脂固体培养基表面上划线,平板倒置于37℃恒温培养箱,培养15小时。
可选的,所述种子液的培养过程包括:
将活化后的重组类人源胶原蛋白的基因工程菌再接种到30mL的含卡那霉素的LB液体培养基中,37℃下振荡培养15小时,得到一级种子液;然后将一级种子液移入300mL的含卡那抗性的LB液体培养基中,37℃下振荡培养2小时,得到二级种子液。
可选的,所述一级种子液和二级种子液均为含卡那霉素的LB液体培养基,10g/L的胰蛋白胨,5g/L的酵母浸粉,10g/L的氯化钠,调pH至7.0-7.2,121℃高压灭菌20分钟,接种前加入卡那霉素浓度为100μg/mL。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
(1)本发明工艺将补料分批发酵阶段人为的分成两个阶段并严格控制各阶段的培养条件,尤其是在诱导阶段,采取微氧条件,诱导剂与补料培养基共流加,在一定程度上模拟了工业化生产条件,利于后期放大,且提高了重组胶原蛋白工程菌的菌浓度(以湿重计达到280-300g/L)和胶原蛋白的表达量,最高表达量可达到8.5g/L的发酵液。
(2)本发明工艺大大减少了设备投资,使用小吨位的发酵罐发酵重组胶原蛋白,即可满足大规模工业化的重组胶原蛋白的需求,简化了发酵设备、降低了对公用工程的要求。
除了上面所描述的目的、特征和优点之外,本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照图,对本发明作进一步详细的说明。
附图说明
构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。在附图中:
图1是本发明实施例1中的SDS-PAGE电泳图;
图2是本发明实施例2中的SDS-PAGE电泳图;
图3是本发明实施例3中的SDS-PAGE电泳图;
图4是本发明实施例4中的SDS-PAGE电泳图;
图5是本发明实施例5中的SDS-PAGE电泳图;
图6是本发明实施例6中的SDS-PAGE电泳图。
其中:
M、蛋白质标准分子量,1、BSA蛋白标准品,2、重组胶原蛋白。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点等能够更加明确易懂,下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。需说明的是,本发明附图均采用简化的形式且均使用非精确比例,仅用以方便、清晰地辅助说明本发明实施;本发明中所提及的若干,并非限于附图实例中具体数量;本发明中所提及的‘前’‘中’‘后’‘左’‘右’‘上’‘下’‘顶部’‘底部’‘中部’等指示的方位或位置关系,均基于本发明附图所示的方位或位置关系,而不指示或暗示所指的装置或零部件必须具有特定的方位,亦不能理解为对本发明的限制。
实施例1:
(1)菌种的构建
采用大肠杆菌BL21(DE3)菌株,在类人源胶原蛋白质基因末端引入6个组氨酸标签,连接于载体pET-24a(+),构建表达质粒col-pET-24a(+),将验证正确的重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中,并将含卡那霉素的LB平板鉴定、菌落PCR鉴定以及测序鉴定均为阳性的表达重组类人源胶原蛋白的基因工程菌E.coil BL21(DE3)/pET-24a(+)-col菌株保存至-80℃冰箱待用。
具体的,上述重组类人源胶原蛋白的基因工程菌的重组类人源胶原蛋白碱基序列由一个八次重复的Ⅰ型人源胶原蛋白序列片段和一个Ⅲ型人源胶原蛋白的序列片段人工拼接合成(详细序列及方法详见现有技术:Design,Expression and Characterization ofCollagen-Like Proteins Based on the Cell Adhesive and Crosslinking SequencesDerived from Native Collagens),工程菌采用大肠杆菌E.coil BL21(DE3)作为宿主菌,以pET-24a(+)作为载体。
(2)菌种的活化
采用接种环取菌种管内的-80℃甘油管保藏的表达重组类人源胶原蛋白的基因工程菌E.coil BL21(DE3)/pET-24a(+)-col,在含卡那霉素的LB琼脂固体培养基表面上划线,平板倒置于37℃恒温培养箱,培养15小时。
(3)种子液的制备
(3.1)一级种子液的制备
将活化后的重组类人源胶原蛋白的基因工程菌E.coil BL21(DE3)/pET-24a(+)-col再接种到30mL含卡那霉素的LB液体培养基中,37℃、220r/min下振荡培养15小时至对数生长期,作为一级种子液。
(3.2)二级种子液的制备
将一级种子液转接至300ml含卡那霉素的LB液体培养基中,37℃、220r/min下振荡培养2小时,菌种光密度(OD600)0.6-0.8,作为二级种子液。
(4)分批补料发酵
(4.1)发酵各类培养基的组分及含量
以3L发酵液为例,所述发酵基本培养基的组成成分及含量如下:
以3L发酵液为例,第一种补料培养基的组分及含量如下:
以3L发酵液为例,第二种补料培养基的组成成分及含量如下:
(4.2)发酵工艺
(A)细胞快速繁殖阶段:在5L发酵罐中加入3L以甘油为主要碳源的基础发酵培养基,将二级种子以10%的接种量接入罐中分批培养;在有氧条件下,菌种在基础发酵培养基中分批培养4小时且溶氧上升至60%时,进行补料,流加第一种补料培养基,其中第一种补料培养基中葡萄糖与甘油的浓度比为1:1,补料量根据发酵液中的溶氧量(以大于30%的溶氧量)进行反馈补料,菌种在分批培养和补料培养阶段的温度为33℃,发酵液的pH值为7.0,转速与溶氧相关联,最高转速为900rpm,通气比逐渐增加,最大通气比(vvm)为5立方米/(立方米*分钟);
(B)微氧诱导表达重组蛋白阶段:当菌体光密度(OD600)达到120左右,进行诱导,将通气比(vvm)调小至2.5立方米/(立方米*分钟),溶氧调整至5%,以实现微氧条件,诱导剂乳糖与第二种补料培养基以相同的速度进行流加,流加量根据发酵液中的溶氧量(大于5%)进行反馈流加,菌种在诱导阶段的温度为30℃,发酵液的pH值为7.3,最高转速为900rpm,诱导剂乳糖浓度为245g/L;发酵完毕后得到OD600=169.2,菌体经分离菌体得率为289g湿菌体/发酵液(L),目的蛋白表达量可达8g/L(每升发酵液)。蛋白表达SDS-PAGE见图1所示。
实施例2:
(1)菌种的构建
采用大肠杆菌BL21(DE3)菌株,在胶原蛋白质基因末端引入6个组氨酸标签,连接于载体pET-24a(+),构建表达质粒col-pET-24a(+),将验证正确的重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中,并将含卡那霉素的LB平板鉴定、菌落PCR鉴定以及测序鉴定均为阳性的表达重组类人源胶原蛋白的基因工程菌E.coil BL21(DE3)/pET-24a(+)-col菌株保存至-80℃冰箱待用。
具体的,上述重组类人源胶原蛋白的基因工程菌的重组类人源胶原蛋白碱基序列由一个八次重复的Ⅰ型人源胶原蛋白序列片段和一个Ⅲ型人源胶原蛋白的序列片段人工拼接合成(详细序列及方法详见现有技术:Design,Expression and Characterization ofCollagen-Like Proteins Based on the Cell Adhesive and Crosslinking SequencesDerived from Native Collagens),工程菌采用大肠杆菌E.coil BL21(DE3)作为宿主菌,以pET-24a(+)作为载体。
(2)菌种的活化
采用接种环取菌种管内的-80℃甘油管保藏的表达重组类人源胶原蛋白的基因工程菌E.coil BL21(DE3)/pET-24a(+)-col,在含卡那霉素的LB琼脂固体培养基表面上划线,平板倒置于37℃恒温培养箱,培养15小时。
(3)种子液的制备
(3.1)一级种子液的制备
将活化后的重组类人源胶原蛋白的基因工程菌E.coil BL21(DE3)/pET-24a(+)-col再接种到30mL含卡那霉素的LB液体培养基中,37℃、220r/min下振荡培养15小时至对数生长期,作为一级种子液。
(3.2)二级种子液的制备
将一级种子液转接至300ml含卡那霉素的LB液体培养基中,37℃、220r/min下振荡培养2小时,菌种光密度(OD600)0.6-0.8,作为二级种子液。
(4)分批补料发酵
(4.1)发酵各类培养基的组分及含量
以3L发酵液为例,所述发酵基本培养基的组成成分及含量如下:
以3L发酵液为例,第一种补料培养基的组分及含量如下:
以3L发酵液为例,第二种补料培养基的组成成分及含量如下:
(4.2)发酵工艺
(A)细胞快速繁殖阶段:5L发酵罐中加入3L以甘油为主要碳源的基础发酵培养基,将二级种子以10%的接种量接入罐中分批培养,在有氧条件下,菌种在基础发酵培养基中分批培养5小时且溶氧上升至70%时,进行补料,流加第一种补料培养基,其中第一种补料培养基中葡萄糖与甘油的浓度比为1:2,补料量根据发酵液中的溶氧量(大于30%)进行反馈补料,菌种在分批培养和补料培养阶段的温度为33℃,发酵液的pH值为6.89,转速与溶氧相关联,最高转速为900rpm,通气比逐渐增加,最大通气比(vvm)为5立方米/(立方米*分钟);
(B)微氧诱导表达重组蛋白阶段:当菌体光密度(OD600)达到120左右,进行诱导,将通气比(vvm)调小至2.5立方米/(立方米*分钟),溶氧调整至5%,以实现微氧条件,诱导剂乳糖与第二种补料培养基以相同的速度进行流加,流加量根据发酵液中的溶氧量(大于5%)进行反馈流加,菌种在诱导阶段的温度为30℃,发酵液的pH值为7.3,最高转速为900rpm,诱导剂乳糖浓度为245g/L;发酵完毕后OD600=168,菌体经分离菌体得率为280g湿菌体/发酵液(L),目的蛋白表达量可达7.8g/L(每升发酵液)。蛋白表达SDS-PAGE见图2所示。
实施例3:
(1)菌种的构建
采用大肠杆菌BL21(DE3)菌株,在胶原蛋白质基因末端引入6个组氨酸标签,连接于载体pET-24a(+),构建表达质粒col-pET-24a(+),将验证正确的重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中,并将含卡那霉素的LB平板鉴定、菌落PCR鉴定以及测序鉴定均为阳性的表达重组类人源胶原蛋白的基因工程菌E.coil BL21(DE3)/pET-24a(+)-col菌株保存至-80℃冰箱待用。
具体的,上述重组类人源胶原蛋白的基因工程菌的重组类人源胶原蛋白碱基序列由一个八次重复的Ⅰ型人源胶原蛋白序列片段和一个Ⅲ型人源胶原蛋白的序列片段人工拼接合成(详细序列及方法详见现有技术:Design,Expression and Characterization ofCollagen-Like Proteins Based on the Cell Adhesive and Crosslinking SequencesDerived from Native Collagens),工程菌采用大肠杆菌E.coil BL21(DE3)作为宿主菌,以pET-24a(+)作为载体。
(2)菌种的活化
采用接种环取菌种管内的-80℃甘油管保藏的表达重组类人源胶原蛋白的基因工程菌E.coil BL21(DE3)/pET-24a(+)-col,在含卡那霉素的LB琼脂固体培养基表面上划线,平板倒置于37℃恒温培养箱,培养15小时。
(3)种子液的制备
(3.1)一级种子液的制备
将活化后的重组类人源胶原蛋白的基因工程菌E.coil BL21(DE3)/pET-24a(+)-col再接种到30mL含卡那霉素的LB液体培养基中,37℃、220r/min下振荡培养15小时至对数生长期,作为一级种子液。
(3.2)二级种子液的制备
将一级种子液转接至300ml含卡那霉素的LB液体培养基中,37℃、220r/min下振荡培养2小时,菌种光密度(OD600)0.6-0.8,作为二级种子液。
(4)分批补料发酵
(4.1)发酵各类培养基的组分及含量
以3L发酵液为例,所述发酵基本培养基的组成成分及含量如下:
以3L发酵液为例,第一种补料培养基的组分及含量如下:
以3L发酵液为例,第二种补料培养基的组成成分及含量如下:
(4.2)发酵工艺
(A)细胞快速繁殖阶段:5L发酵罐中加入3L以甘油为主要碳源的基础发酵培养基,将二级种子以10%的接种量接入罐中分批培养,在有氧条件下,菌种在基础发酵培养基中分批培养6小时且溶氧上升至90%时,进行补料,流加第一种补料培养基,其中第一种补料培养基中的葡萄糖与甘油的浓度比为1:3,补料量根据发酵液中的溶氧量(大于30%)进行反馈补料,菌种在分批培养和补料培养阶段的温度为33℃,发酵液的pH值为6.99,转速与溶氧相关联,最高转速为900rpm,通气比逐渐增加,最大通气比(vvm)为5立方米/(立方米*分钟);
(B)微氧诱导表达重组蛋白阶段:当菌体光密度(OD600)达到120左右,进行诱导,将通气比(vvm)调小至2.5立方米/(立方米*分钟),溶氧调整至5%,以实现微氧条件,诱导剂乳糖与第二种补料培养基以相同的速度进行流加,流加量根据发酵液中的溶氧量(大于5%)进行反馈流加,菌种在诱导阶段的温度为30℃,发酵液的pH值为7.3,最高转速为900rpm,诱导剂乳糖浓度为245g/L;发酵完毕后得到OD600=173,菌体经分离菌体得率为300g湿菌体/发酵液(L),目的蛋白含量达8.5/L(每升发酵液)。蛋白表达SDS-PAGE见图3所示。
实施例4:
(1)菌种的构建
采用大肠杆菌BL21(DE3)菌株,在胶原蛋白质基因末端引入6个组氨酸标签,连接于载体pET-24a(+),构建表达质粒col-pET-24a(+),将验证正确的重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中,并将含卡那霉素的LB平板鉴定、菌落PCR鉴定以及测序鉴定均为阳性的表达重组类人源胶原蛋白的基因工程菌E.coil BL21(DE3)/pET-24a(+)-col菌株保存至-80度冰箱待用。
具体的,上述重组类人源胶原蛋白的基因工程菌的重组类人源胶原蛋白碱基序列由一个八次重复的Ⅰ型人源胶原蛋白序列片段和一个Ⅲ型人源胶原蛋白的序列片段人工拼接合成(详细序列及方法详见现有技术:Design,Expression and Characterization ofCollagen-Like Proteins Based on the Cell Adhesive and Crosslinking SequencesDerived from Native Collagens),工程菌采用大肠杆菌E.coil BL21(DE3)作为宿主菌,以pET-24a(+)作为载体。
(2)菌种的活化
采用接种环取菌种管内的-80℃甘油管保藏的表达重组类人源胶原蛋白的基因工程菌E.coil BL21(DE3)/pET-24a(+)-col,在含卡那霉素的LB琼脂固体培养基表面上划线,平板倒置于37℃恒温培养箱,培养15小时。
(3)种子液的制备
(3.1)一级种子液的制备
将活化后的重组类人源胶原蛋白的基因工程菌E.coil BL21(DE3)/pET-24a(+)-col再接种到30mL含卡那霉素的LB液体培养基中,37℃、220r/min下振荡培养15小时至对数生长期,作为一级种子液。
(3.2)二级种子液的制备
将一级种子液转接至300ml含卡那霉素的LB液体培养基中,37℃、220r/min下振荡培养2小时,菌种光密度(OD600)0.6-0.8,作为二级种子液。
(4)分批补料发酵
(4.1)发酵各类培养基的组分及含量
以3L发酵液为例,所述发酵基本培养基的组成成分及含量如下:
以3L发酵液为例,第一种补料培养基的组分及含量如下:
以3L发酵液为例,第二种补料培养基的组成成分及含量如下:
(4.2)发酵工艺
(A)细胞快速繁殖阶段:5L发酵罐中加入3L以甘油为主要碳源的基础发酵培养基,将二级种子以10%的接种量接入罐中分批培养,在有氧条件下,菌种在基础发酵培养基中分批培养4小时且溶氧上升至60%时,进行补料,流加第一种补料培养基,其中第一种补料培养基中的葡萄糖与甘油的浓度比为1:1,补料量根据发酵液中的溶氧量(大于30%)进行反馈补料,菌种在分批培养和补料培养阶段的温度为33℃,发酵液的pH值为7.0,转速与溶氧相关联,最高转速为900rpm,通气比逐渐增加,最大通气比(vvm)为5立方米/(立方米*分钟);
(B)有氧诱导表达重组蛋白阶段:当菌体光密度(OD600)达到90左右,进行诱导,持续有氧条件,最大通气比(vvm)为5立方米/(立方米*分钟),最高转速为900rpm,诱导剂乳糖与第二种补料培养基以相同的速度进行流加,流加量根据发酵液中的溶氧量(大于22.5%)进行反馈流加,菌种在诱导阶段的温度为30℃,发酵液的pH值为7.3,诱导剂乳糖浓度为245g/L;发酵完毕后得到OD600=106.5,菌体经分离菌体得率为220g湿菌体/发酵液(L),目的蛋白含量达4.3g/L(每升发酵液)。蛋白表达SDS-PAGE见图4所示。
实施例5:
(1)菌种的构建
采用大肠杆菌BL21(DE3)菌株,在胶原蛋白质基因末端引入6个组氨酸标签,连接于载体pET-24a(+),构建表达质粒col-pET-24a(+),将验证正确的重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中,并将含卡那霉素的LB平板鉴定、菌落PCR鉴定以及测序鉴定均为阳性的表达重组类人源胶原蛋白的基因工程菌E.coil BL21(DE3)/pET-24a(+)-col菌株保存至-80℃冰箱待用。
具体的,上述重组类人源胶原蛋白的基因工程菌的重组类人源胶原蛋白碱基序列由一个八次重复的Ⅰ型人源胶原蛋白序列片段和一个Ⅲ型人源胶原蛋白的序列片段人工拼接合成(详细序列及方法详见现有技术:Design,Expression and Characterization ofCollagen-Like Proteins Based on the Cell Adhesive and Crosslinking SequencesDerived from Native Collagens),工程菌采用大肠杆菌E.coil BL21(DE3)作为宿主菌,以pET-24a(+)作为载体。
(2)菌种的活化
采用接种环取菌种管内的-80℃甘油管保藏的表达重组类人源胶原蛋白的基因工程菌E.coil BL21(DE3)/pET-24a(+)-col,在含卡那霉素的LB琼脂固体培养基表面上划线,平板倒置于37℃恒温培养箱,培养15小时。
(3)种子液的制备
(3.1)一级种子液的制备
将活化后的重组类人源胶原蛋白的基因工程菌E.coil BL21(DE3)/pET-24a(+)-col再接种到30mL含卡那霉素的LB液体培养基中,37℃、220r/min下振荡培养15小时至对数生长期,作为一级种子液。
(3.2)二级种子液的制备
将一级种子液转接至300ml含卡那霉素的LB液体培养基中,37℃、220r/min下振荡培养2小时,菌种光密度(OD600)0.6-0.8,作为二级种子液。
(4)分批补料发酵
(4.1)发酵各类培养基的组分及含量
以3L发酵液为例,所述发酵基本培养基的组成成分及含量如下:
以3L发酵液为例,第一种补料培养基的组分及含量如下:
以3L发酵液为例,第二种补料培养基的组成成分及含量如下:
(4.2)发酵工艺
(A)细胞快速繁殖阶段:5L发酵罐中加入3L以甘油为主要碳源的基础发酵培养基,将二级种子以10%的接种量接入罐中分批培养,在有氧条件下,菌种在基础发酵培养基中分批培养6小时且溶氧上升至90%时,进行补料,流加第一种补料培养基,其中第一种补料培养基中的葡萄糖与甘油的浓度比为2:3,补料量根据发酵液中的溶氧量(大于30%)进行反馈补料,菌种在分批培养和补料培养阶段的温度为33℃,发酵液的pH值为6.99,转速与溶氧相关联,最高转速为900rpm,通气比逐渐增加,最大通气比(vvm)为5立方米/(立方米*分钟);
(B)微氧诱导表达重组蛋白阶段:当菌体光密度(OD600)达到90左右,进行诱导,将通气比(vvm)调小至2.5立方米/(立方米*分钟),溶氧调整至5%,以实现微氧条件,诱导剂乳糖与补料培养基2以相同的速度进行流加,流加量根据发酵液中的溶氧量(大于5%)进行反馈流加,菌种在诱导阶段的温度为30℃,发酵液的pH值为7.3,最高转速为900rpm,诱导剂乳糖浓度为245g/L;发酵完毕后得到OD600=108,菌体经分离菌体得率为245g湿菌体/发酵液(L),目的蛋白含量达4.9/L(每升发酵液)。蛋白表达SDS-PAGE见图5所示。
实施例6:
(1)菌种的构建
采用大肠杆菌BL21(DE3)菌株,在胶原蛋白质基因末端引入6个组氨酸标签,连接于载体pET-24a(+),构建表达质粒col-pET-24a(+),将验证正确的重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中,并将含卡那霉素的LB平板鉴定、菌落PCR鉴定以及测序鉴定均为阳性的表达重组类人源胶原蛋白的基因工程菌E.coil BL21(DE3)/pET-24a(+)-col菌株保存至-80℃冰箱待用。
具体的,上述重组类人源胶原蛋白的基因工程菌的重组类人源胶原蛋白碱基序列由一个八次重复的Ⅰ型人源胶原蛋白序列片段和一个Ⅲ型人源胶原蛋白的序列片段人工拼接合成(详细序列及方法详见现有技术:Design,Expression and Characterization ofCollagen-Like Proteins Based on the Cell Adhesive and Crosslinking SequencesDerived from Native Collagens),工程菌采用大肠杆菌E.coil BL21(DE3)作为宿主菌,以pET-24a(+)作为载体。
(2)菌种的活化
采用接种环取菌种管内的-80℃甘油管保藏的表达重组类人源胶原蛋白的基因工程菌E.coil BL21(DE3)/pET-24a(+)-col,在含卡那霉素的LB琼脂固体培养基表面上划线,平板倒置于37℃恒温培养箱,培养15小时。
(3)种子液的制备
(3.1)一级种子液的制备
将活化后的重组类人源胶原蛋白的基因工程菌E.coil BL21(DE3)/pET-24a(+)-col再接种到30mL含卡那霉素的LB液体培养基中,37℃、220r/min下振荡培养15小时至对数生长期,作为一级种子液。
(3.2)二级种子液的制备
将一级种子液转接至300ml含卡那霉素的LB液体培养基中,37℃、220r/min下振荡培养2小时,菌种光密度(OD600)0.6-0.8,作为二级种子液。
(4)分批补料发酵
(4.1)发酵各类培养基的组分及含量
以3L发酵液为例,所述发酵基本培养基的组成成分及含量如下:
以3L发酵液为例,第一种补料培养基的组分及含量如下:
以3L发酵液为例,第二种补料培养基的组成成分及含量如下:
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(4.2)发酵工艺
(A)细胞快速繁殖阶段:5L发酵罐中加入3L以甘油为主要碳源的基础发酵培养基,将二级种子以10%的接种量接入罐中分批培养,在有氧条件下,菌种在基础发酵培养基中分批培养6小时且溶氧上升至90%时,进行补料,流加第一种补料培养基,其中第一种补料培养基中的葡萄糖与甘油的浓度比为1:3,补料量根据发酵液中的溶氧量(大于30%)进行反馈补料,菌种在分批培养和补料培养阶段的温度为33℃,发酵液的pH值为6.99,转速与溶氧相关联,最高转速为900rpm,通气比逐渐增加,最大通气比(vvm)为5立方米/(立方米*分钟);
(B)微氧诱导表达重组蛋白阶段:当菌体光密度(OD600)达到90左右,进行诱导,将通气比(vvm)调小至2.5立方米/(立方米*分钟),溶氧调整至5%,以实现微氧条件,诱导剂乳糖以0.9ml/s的流加速度恒速流加,补料培养基2以1.5ml/s的流加速度恒速流加流加量根据发酵液中的溶氧量(大于5%)确定,菌种在诱导阶段的温度为30℃,发酵液的pH值为7.3,最高转速为900rpm,诱导剂乳糖浓度为245g/L;发酵完毕后得到OD600=110,菌体经分离菌体得率为252g湿菌体/发酵液(L),目的蛋白含量达4.4/L(每升发酵液)。蛋白表达SDS-PAGE见图6所示。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种微氧诱导大肠杆菌发酵重组蛋白质的方法,包括菌种活化、种子液的培养和分批补料发酵,其特征在于,所述分批补料发酵的过程包括:
步骤(1)细胞快速繁殖阶段:将二级种子液接种至基础发酵培养基中进行培养,其中,培养温度为33℃-35℃,通气比控制在3-5立方米/(立方米分钟),转速控制在150-900rpm,发酵液的溶氧量为30-33%,发酵液的pH值为7.0-7.5;在培养过程中,通过向发酵液中补加第一种补料培养基来控制重组类人源胶原蛋白的基因工程菌的比生长速率在0.1-0.5之间;
步骤(2)微氧诱导表达重组蛋白阶段:向发酵液中流加乳糖诱导基因工程菌表达蛋白,并将第一种补料培养基更换为第二种补料培养基;根据发酵液中的溶氧量进行反馈补料以及流加乳糖诱导剂,直至发酵结束;其中,培养温度为30℃-33℃,发酵液的pH值为7.3-7.8,发酵液的溶氧量为5%,通过向发酵液补加第二种补料培养基来控制重组类人源胶原蛋白的基因工程菌的比生长速率为0.02-0.06之间;
所述基础发酵培养基为:10.0-15.0g/L胰蛋白胨,5.0-10.0g/L酵母浸粉,8.0-12.0g/L甘油,14.0-15.0g/L磷酸二氢钾,3.0-4.0g/L磷酸氢二钠,4.5-5.5g/L氯化钠,0.8-1.2g/L硫酸镁,0.8-1.2g/L一水合柠檬酸,3.0-3.5g/L氢氧化钠,0.8-1.0mL微量元素;
所述第一种补料培养基为:20.0-30.0g/L胰蛋白胨,20.0-30.0g/L酵母浸粉,170.0-380.0g/L葡萄糖,350.0-570.0g/L甘油,4.0-15.0g/L硫酸镁,1.0-5.0g/L一水合柠檬酸,3.0-7.0g/L磷酸二氢钾,1.0-6.0g/L磷酸氢二钠,0.8-1.0mL微量元素;
所述第二种补料培养基为:700-750g/L甘油,9.5-10.0g/L硫酸镁,2.5-3.5g/L一水合柠檬酸,4.5-5.0g/L磷酸二氢钾,1.0-1.5g/L磷酸氢二钠,0.8-1.2mL微量元素;
所述微量元素包括铁、锌、铜、锰、钙、硼和钴。
2.根据权利要求1所述的微氧诱导大肠杆菌发酵重组蛋白质的方法,其特征在于,表达所述重组类人源胶原蛋白的基因工程菌为大肠杆菌E.coil BL21(DE3)。
3.根据权利要求1所述的微氧诱导大肠杆菌发酵重组蛋白质的方法,其特征在于,所述步骤(1)中,菌种在发酵培养基中分批培养4-6小时且溶氧升至60%以上时,再向发酵液中补加第一种补料培养基。
4.根据权利要求3所述的微氧诱导大肠杆菌发酵重组蛋白质的方法,其特征在于,所述步骤(1)中,第一种补料培养基中的葡萄糖与甘油的含量比设置为1:(1-3)。
5.根据权利要求1所述的微氧诱导大肠杆菌发酵重组蛋白质的方法,其特征在于,所述步骤(2)中,在当发酵液中重组类人源胶原蛋白的基因工程菌的细菌光密度达到OD600=100-120、发酵液的溶氧量调控至0-5%、通气比控制在1.6-2.8立方米/(立方米分钟),形成微氧条件后再向发酵液中流加乳糖诱导基因工程菌表达蛋白。
6.根据权利要求5所述的微氧诱导大肠杆菌发酵重组蛋白质的方法,其特征在于,补入第二种补料培养基的流加速度与乳糖的流加速相同,以进行共同补料。
7.根据权利要求1所述的微氧诱导大肠杆菌发酵重组蛋白质的方法,其特征在于,所述菌种的活化过程包括:
采用接种环取菌种管内的-80℃甘油管保藏的表达重组类人源胶原蛋白的基因工程菌在含卡那抗性的LB琼脂固体培养基表面上划线,平板倒置于37℃恒温培养箱,培养15小时。
8.根据权利要求1所述的微氧诱导大肠杆菌发酵重组蛋白质的方法,其特征在于,所述种子液的培养过程包括:
将活化后的重组类人源胶原蛋白的基因工程菌再接种到30mL的含卡那霉素的LB液体培养基中,37℃下振荡培养15小时,得到一级种子液;然后将一级种子液移入300mL的含卡那抗性的LB液体培养基中,37℃下振荡培养2小时,得到二级种子液。
9.根据权利要求8所述的微氧诱导大肠杆菌发酵重组蛋白质的方法,其特征在于,所述一级种子液和二级种子液均为含卡那霉素的LB液体培养基,10g/L的胰蛋白胨,5g/L的酵母浸粉,10g/L的氯化钠,调pH至7.0-7.2,121℃高压灭菌20分钟,接种前加入卡那霉素浓度为100μg/mL。
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Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR19990038719A (ko) * | 1997-11-06 | 1999-06-05 | 장호남 | 유가식 배양에 의한 산소 의존형 유도성 프로모터로부터의 단백질 제조방법 |
KR20010073720A (ko) * | 2000-01-19 | 2001-08-01 | 이종원 | 변이주 대장균내에서의 변형된 nar 프로모터로이루어진 산소의존형 프로모터계의 개발 및 이에 의한단백질 제조 방법 |
CN1542131A (zh) * | 2003-11-06 | 2004-11-03 | 华东理工大学 | 重组大肠杆菌的发酵方法 |
CN102747114A (zh) * | 2012-01-17 | 2012-10-24 | 浙江大学 | 一种用短暂厌氧发酵调节重组大肠杆菌代谢的方法 |
CN103243064A (zh) * | 2013-05-28 | 2013-08-14 | 山东大学 | 一种大肠杆菌工程菌株及其好氧-微好氧-厌氧全阶段发酵生产琥珀酸的应用 |
CN109161575A (zh) * | 2018-09-17 | 2019-01-08 | 河南省农业科学院 | 禽法氏囊病毒vp2蛋白的高表达发酵工艺 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20090269801A1 (en) * | 2005-01-19 | 2009-10-29 | Gardner Anne M | Vector to Induce Expression of Recombinant Proteins under Anoxic or Microaerobic Conditions |
-
2022
- 2022-05-31 CN CN202210613419.9A patent/CN114854809B/zh active Active
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR19990038719A (ko) * | 1997-11-06 | 1999-06-05 | 장호남 | 유가식 배양에 의한 산소 의존형 유도성 프로모터로부터의 단백질 제조방법 |
KR20010073720A (ko) * | 2000-01-19 | 2001-08-01 | 이종원 | 변이주 대장균내에서의 변형된 nar 프로모터로이루어진 산소의존형 프로모터계의 개발 및 이에 의한단백질 제조 방법 |
CN1542131A (zh) * | 2003-11-06 | 2004-11-03 | 华东理工大学 | 重组大肠杆菌的发酵方法 |
CN102747114A (zh) * | 2012-01-17 | 2012-10-24 | 浙江大学 | 一种用短暂厌氧发酵调节重组大肠杆菌代谢的方法 |
CN103243064A (zh) * | 2013-05-28 | 2013-08-14 | 山东大学 | 一种大肠杆菌工程菌株及其好氧-微好氧-厌氧全阶段发酵生产琥珀酸的应用 |
CN109161575A (zh) * | 2018-09-17 | 2019-01-08 | 河南省农业科学院 | 禽法氏囊病毒vp2蛋白的高表达发酵工艺 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
"重组大肠杆菌高密度发酵生产类人胶原蛋白 Ⅱ条件优化";常海燕等;《微生物学通报》>;第6卷(第36期);870-874 * |
"Oxygen transfer rate control in the production of human-like collagen by recombinant Escherichia coli.";Ma Xiaoxuan等;《Biotechnology and applied biochemistry》;第55卷(第4期);169-174 * |
受溶氧浓度调控的新型大肠杆菌表达系统;童芹, 杨胜利, 龚毅;生物工程学报(第03期) * |
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