KR100405944B1 - 단백질 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 목적 단백질을 발현시킬 수 있는 숙주세포를 공급-회분배양(fed-batch culture)하여 성장시킴에 있어서, 숙주세포의 성장을 조절하는 기질의 첨가율을 연속적으로 변화시켜 숙주세포의 특이 성장속도를 초기속도로부터 예정된 속도까지 변화시킴을 특징으로하여 목적 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 배지에 대한 기질 첨가율의 변화양상에 따라, 특이 성장속도 μ 및 특이 생성속도 ρ의 최적 패턴이 공급-회분배양 시스템을 최적화할 수 있게 되었으며, 그 결과, 공급-회분배양에 의해 숙주세포를 고밀도 배양하는 것이 가능해졌고, 목적 단백질을 단기간에 효율적으로 제조할 수 있게 되었다.

Description

단백질 제조방법
기술 분야
본 발명은 단백질을 효과적으로 제조하기 위하여 배양과정중에 배지에 대한 기질의 첨가율을 조절함을 특징으로하여 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다. 좀더 구체적으로, 본 발명은 특이 성장속도 μ를 지표로 사용하여 공급-회분 배양(fed-batch culture) 시스템의 배양조건을 최적화하기 위해서 배지에 대한 기질의 첨가율을 조절함을 특징으로하여 단백질을 효과적으로 제조하는 방법에 관한 것이다.
배경 기술
대부분의 상업적으로 가치있는 단백질들은 일반적으로 그 단백질의 유전자를 발현시킬 수 있는 숙주세포의 배양에 의해 제조된다.
배양기술 또는 유전자 재조합에 의한 단백질의 제조는 숙주세포의 지수함수적 증식에 따라 목적 단백질이 제조되는 메카니즘에 기초한다. 단백질의 생산성을 증가시키기 위하여, 숙주세포의 작업능률(세포의 기능)이 가장 효과적으로 이용될 수 있도록 숙주세포의 배양환경을 준비하거나 조절할 필요가 있다. 이러한 목적으로, 단기간에 높은 생산효율 및 고수율로 목적 단백질을 제조하기 위한 배양방법과 관련하여 배양제조에 적합한 다양한 방법들이 연구되었다.
숙주세포의 특이 성장속도 및 이 숙주세포에 의해 제조된 단백질의 양 사이에는 밀접한 관련이 있으므로, 단백질을 최대로 생산하기 위해서는 숙주세포의 특이 성장속도가 최적으로 유지되도록 조절해주어야 한다. 이러한 목적을 달성하기 위해서, 숙주세포(미생물)에 의해 제조된 생성물의 양과 숙주세포의 특이 성장속도 사이의 관계가 지금까지 다양한 각도에서 연구되어 왔으며, 이에 따라 많은 모델이 제시되었다.
이들 모델에 따르면, 때때로 우연히도 생산량을 증가시키기 위해서는 배양중에 적어도 한 번 세포의 특이 성장속도가 변화되어야 하는 것으로 나타났다(참조 :Hakko KogakuKaishi, vol. 70, No. 5, pp. 395-404 (1992)).
그러나, 연구결과 본 발명자들은 최초로 배양의 최적화를 목적으로 특이 성장속도를 변화시키는 것이 목적 생성물의 생산량을 바람직한 정도까지 증가시키지는 않음을 밝혀냈다(본원 명세서, 실시예 1).
그러므로, 숙주세포의 작업능률에 세포의 특이 성장속도에 있어서의 변화로 인한 영향을 주지않고도 생성물을 효율적으로 제조할 수 있으며, 숙주세포에 의해 제조되는 목적 생성물의 생산성을 증가시킬 수 있는 배양방법이 요구된다.
따라서, 본 발명은 공급-회분배양 시스템에서 배지에 기질을 첨가하는 속도를 변화시킴으로써 숙주세포의 특이 성장속도 μ를 조절함을 특징으로 하여 목적 단백질을 단기간에 다량으로 제조하기 위한 단백질 제조방법을 제공함을 목적으로 한다.
본 발명의 또다른 목적은 고도로 효율적인 방법으로 목적 단백질을 제조할수 있는 숙주세포의 배양방법을 제공하는 것이다.
발명의 개시
본 발명자들은 피이드백(feedback) 조절없이 숙주세포의 특이 성장속도 μ를 최적치(목적치)로 조정 또는 조절하기 위한 방법을 발견하고자 공급-회분배양에 기질을 첨가하는 속도와 숙주세포의 특이 성장속도 사이의 관계를 연구하였으며, 또한 첨가속도와 제조되는 목적 생성물(단백질)의 양 사이의 관계를 연구하였다. 그 결과, 본 발명자들은 배양중 세포의 특이 성장속도 μ를 변화시킬 목적으로 배지에 기질을 첨가하는 속도를 연속적으로 변화시키면 세포기능 또는 목적 생성물의 제조에 대한 역효과없이 목적 생성물의 생산성을 증가시킬 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
즉, 본 발명은 숙주세포, 바람직하게는 목적 단백질을 구조적 발현할 수 있는 숙주세포 또는 유발인자에 의해 숙주세포가 증식할 수 있을 때 목적 단백질을 실질적으로 구조적 발현할 수 있는 숙주세포를 공급-회분배양하여 성장시킴에 있어서, 숙주세포의 증식을 조절하는 기질의 첨가율을 연속적으로 변화시켜 숙주세포의 특이 성장속도 μ를 초기 특이 성장속도로부터 예정된 속도까지 변화시킴을 특징으로하는 목적 단백질의 제조방법을 제공한다.
도면의 간단한 설명
제 1 도는 배지에 대한 메탄올 첨가율의 경시변화를 나타낸다(실시예 1).
제 2 도는 본 발명의 시스템에서 메탄올 첨가율의 연속적인 변화에 따른 특이 성장속도 μ의 경시변화를 나타낸 것이고(제 2a 도), 대조군 ① 시스템에서 메탄올 첨가율의 순간적인 변화에 따른 특이 성장속도 μ의 경시변화를 나타낸 것이다 (제 2b 도).
제 3 도는 메탄올 첨가율이 연속적으로 변화되는 시스템(본 발명, -△-) 및 순간적으로 변화되는 시스템(대조군 ①, -●-)에서 성장세포의 밀도를 비교하여 나타낸 것이다.
발명의 상세한 설명
본 발명에서, "목적 단백질의 구조적 발현"이란 목적 단백질이 숙주세포의 성장조건에 관계없이 일정하게 발현되는 것을 의미한다.
또한, 본 발명에서, "숙주세포가 유발인자에 의해 증식할 수 있을 때, 목적 단백질의 실질적인 구조적 발현"이란 숙주세포의 성장조건과 단백질의 발현사이에 어떤 관계가 있으며, 숙주세포의 증식에 필요한 물질 및 유발인자가 동일할 때 숙주세포의 증식 및 목적 단백질의 발현이 동시에 일어남을 의미한다.
여기서, "유발인자"란 목적 단백질을 코드화하는 유전자의 전사 및 해독을 개시하게 하는 물질을 의미하며, 메탄올, 갈락토오스 및 수크로오스를 예로 들 수 있다.
본 발명에서 사용된 "목적 단백질을 발현시킬 수 있는 숙주세포"(이하에서는 간단히 "숙주세포"라 한다)는 자연적으로 발생하는 세포 및 외래 단백질을 제조할 수 있도록 돌연변이된 세포(이하에서는 적절히 "형질전환된 세포"라 한다)를 포함한다.
숙주세포의 기원은 특별히 제한되지 않으며, 박테리아(예를들어, 에쉐리치아속(genusEscherichia) 및 바실러스 속(genusBacillus)에 속하는 것) 및 효모(예를들어, 사카로마이세스 속(genusSaccharomyces) 및 피치아 속(genusPichia))와 같은 미생물을 예로 들 수 있다. 특히, 에쉐리치아 속 미생물은 예를들어, 에쉐리치아 콜리(Escherichia coli; 이하에서는 E.coli 라 한다) K12DH1, M103, JA221, HB101, X600, XL-1 블루 및 JM109를 포함한다. 바실러스 속 미생물은 예를들어, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) MI114 및 207-21을 포함한다. 효모는 예를들어, 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) AH22, AH22R-, NA87-11A 및 DKD-5D 및 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)를 포함한다. 상기 예시된 것으로만 세포의 기원이 제한되는 것이 아님을 주의해야 한다. 물론, 바람직한 것은 효모이다.
효모가 숙주세포로 사용되는 경우, 그것은 메틸요구성(methylotrophic) 효모일 수 있다. 적당한 메틸요구성 효모의 예로는 한세눌라 속(genusHansenula) 또는 피치아 속의 효모를 들 수 있으나 이들로만 제한되는 것은 아니며, 이들은 메탄올중에서 성장할 수 있다(참조: The Biochemistry of methylotrophs, 269 (1982)). 바람직한 것은 영양요구성(auxotrophic) 피치아 파스토리스 GTS115 (NRRL Y-15851), 피치아 파스토리스 GS190 (NRRL Y-18014), 피치아 파스토리스 PPF1 (NRRL Y-18017), 및 야생 피치아 파스토리스 균주 (NRRL Y-11430, NRRL Y-11431)과 같은 피치아 속에 속하는 메틸요구성 효모이다.
바람직한 숙주세포는 예를들어, 숙주세포에 대한 이종의 목적 단백질(이하에서는 적절히 "이종 단백질"이라 한다)을 제조할 수 있는 형질전환된 세포를 포함한다. 이들 세포는 이종 단백질의 아미노산 서열을 코드화하는 외래 DNA를 갖고 있으며, 이 DNA 코드에 따른 목적하는 이종 단백질을 발현 및 생산한다. 세포의 수득방법은 특별히 제한되지 않는다. 예를들어, 재조합 DNA 기술을 사용하여 목적 단백질을 코드화하는 DNA를 운반하는 플라스미드 또는 파아지에 의해 형질 전환시킴으로써 세포를 수득할 수 있다.
본 발명의 범위내에서 숙주세포의 한가지 특이적 예는 HSA를 제조하는 숙주세포이다. 상기 세포의 제조 및 이 세포를 이용한 HSA의 발현 및 제조는 공지방법 또는 공지방법에 따른 방법에 의해 수행될 수 있다.
방법의 특정 예로는 공지의 인간 혈청 알부민 유전자를 사용하는 방법(참조: Japanese Patent Unexamined Publication Nos. 56684/1983, 90515/1983 및 150517/1983), 신규한 인간 혈청 알부민 유전자를 사용하는 방법 (참조: Japanese Patent Unexamined Publication Nos. 29985/1987 및 98486/1989), 합성 시그널 서열을 사용하는 방법(참조:Japanses Patent Unexamined Publication No. 240191/1989), 혈청 알부민 시그널 서열을 사용하는 방법(참조: Japanese Patent Unexamined Publication No. 167095/1990), 염색체상에 재조합 플라스미드를 결합시키는 방법(참조: Japanese Patent Unexamined Publication No. 72889/1991), 숙주들을 융합시키는 방법(참조: Japanese Patent Unexamined Publication No. 53877/1991), 메탄올을 함유하는 배지에서 돌연변이시키는 방법, 돌연변이체 AOX2프로모터를 사용하는 방법(참조: Japanese Patent Unexamined Publication No. 299984/1992), 바실러스 서브틸리스에 의해 HSA를 발현시키는 방법(참조: Japanese Patent Unexamined Publication No. 25133/1987), 효모에 의해 HSA를 발현시키는 방법(참조:Japanese Patent Unexamined Publication Nos. 41487/1985, 39576/1989 및 74493/1989)및 피치아 효모에 의해 HSA를 발현시키는 방법(참조: Japanese Patent Unexamined Publication No.104290/1990)을 들 수 있다.
본 발명에 따른 방법이 목적하는 단백질은 특별히 제한되지 않으며, 상기 언급된 천연 숙주세포의 구조단백질로서 그 세포에 의해 제조되는 단백질 및 형질 전환된 세포에 의해 제조되는 외래 단백질 등 여하한 단백질일 수 있다.
숙주세포 구조단백질의 특정 예로는 RNA 폴리머라제, 액틴, 및 호흡계 또는 해당작용계(glycolysis system)에 포함된 효소들을 들 수 있고; 이종 단백질의 예로는 인터페론, 유로키나아제, 프로유로키나아제, t-PA(조직 플라스미노겐 활성인자), G-CSF (과립구 콜로니 자극인자), M-CSF (대식세포 콜로니 자극인자), HSA (인간 혈청 알부민), IGF (인슐린-유사 성장인자) 및 요성 트립신 억제제(UTI)를 들 수 있으며, 바람직하게는 HSA, 인터페론, 유로키나아제, 프로유로키나아제, IGF 및 UTI를, 좀더 바람직하게는 HSA를 들 수 있다.
숙주세포와 이종 단백질의 조합에는 특별한 제한이 없으며 그들은 적절하게 조합될 수 있다. 에쉐리치아 콜리와 인터페론의 조합, 사카로마이세스 세레비지에와 프로유로키나아제의 조합, 사카로마이세스 세레비지에와 HSA의 조합, 및 피치아 파스토리스와 HSA의 조합이 예시된다.
숙주세포(형질전환된 세포)는 다양한 탄소 에너지원 및/또는 영양분을 함유하는 배지에서 공급-회분배양법으로 배양될 수 있다. 즉, 숙주세포는 증식에 적합한 다양한 탄소 에너지원 및/또는 영양분을 함유하는 배지(일차 배지)에서 일정 기간동안 배양된 후, 일정 시점에 숙주세포의 증식을 조절하는 기질이 상기 배지에 첨가되고, 목적 단백질을 시스템으로부터 제거함 없이 배양이 완료된다 (참조: Japanese Patent Unexamined Publication No. 83595/1991).
본 발명에서 "숙주세포의 증식을 조절하는 기질"이란 숙주세포의 증식에 적합한 기질로서 바람직하게는 탄소 에너지원일 수 있는 것을 의미한다.
기질의 예로는 메탄올, 글리세린, 솔비톨, 글루코오스, 프락토오스, 갈락토오스 및 수크로오스를 들 수 있으며, 이들을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
피치아 파스토리스를 숙주세포로 사용하는 경우에 바람직하게 사용되는 기질의 예로는 메탄올, 글리세린, 및 이들의 조합을 들 수 있다. 사카로마이세스 세레비지에를 숙주세포로 사용하는 경우에 바람직하게 사용되는 기질의 예로는 갈락토오스 및 수크로오스를 들 수 있고, 에쉐리치아 콜리를 사용하는 경우의 기질의 예로는 락토오스를 들 수 있다.
배지에 첨가하는 기질의 형태는 기질 자체이거나 비타민류 및 무기염류와 같은 다른 성분들을 포함하는 조성물일 수 있다. 첨가시, 기질은 고체, 분말, 과립, 액체 또는 다른 형태일 수 있으며, 바람직한 것은 신속하고 균일하게 배지중에 용해될 수 있는 액체 형태이다.
숙주세포의 일차배양에 사용되는 다양한 탄소 에너지원 및/또는 영양분은 숙주세포를 배양하기에 적합한 공지의 탄소 에너지원 및/또는 영양분이다. 탄소 에너지원으로는 글루코오스 및 글리세린 등을 사용할 수 있고, 영양분으로는 질소원(예를들어, 효모추출물, 박토펩톤, 카사미노산, 암모니아, 암모늄포스페이트 및 암모늄아세테이트), 인산염원(예를들어, 인산 및 암모늄포스페이트),무기원 및 기타 미량성분(예를들어, 철, 아연, 구리, 마그네슘, 망간, 칼슘, 몰리브덴 및 코발트), 및 비타민(예를들어, 바이오틴, 판토텐산 및 티아민) 등을 사용할 수 있다.
본 발명에서 "기질 첨가율의 연속적인 변화"란 배양탱크에 대한 기질 첨가율을 경과를 두지않고 연속적으로 변화시키는 것을 의미한다. 결론적으로, 숙주세포의 특이 성장속도 μ는 초기속도로부터 예정된 속도까지 적당히 변화한다.
본 발명에서 "숙주세포의 특이 성장속도 μ"란 단위 시간(hr) 및 단위 세포량당 숙주세포의 증식량을 의미하며, 일반적으로 하기 식으로 나타내어진다:
상기식에서, X는 세포밀도(g/L)를 나타내고, V는 배지량(L)을 나타내며, t는 배양시간(hr)을 나타내고, △XV 및 △t 는 XV 및 t에 있어서의 변화량을 각각 나타낸다.
본 발명에서 숙주세포의 특이 성장속도 μ를 초기속도로부터 예정된 속도까지 변화시키는 것은 공급-회분배양중에 숙주세포의 초기 특이성장속도를 다른, 예정된 속도로 변화시키는 것을 의미한다. 바람직한 초기 특이성장속도, 예정된 특이성장속도 및 변화시키는 시점(예를들어, 초기 특이성장속도가 유지되는 기간)은 특이 성장속도 μ와 특이 생성속도 ρ와의 관계로부터 결정될 수 있다(참조:Hakko Kogaku Kaishi, vol. 70, No. 5, pp. 395-404 (1992)).
여기서, 특이 생성속도 ρ는 단위 시간(hr) 및 단위 세포량당 생성된 단백질의 증가량을 의미하며, 일반적으로 하기 식으로 나타내어진다:
상기식에서, P는 생성된 단백질 양(g/L)을 나타내고, V는 배지량(L)을 나타내며, t는 배양시간(hr)을 나타내고, △PV 및 △t는 PV 및 t에 있어서의 변화량을 각각 나타낸다.
특이 성장속도는 여러번 변화할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 배양온도는 바람직하게는 숙주세포의 증식 및 목적 단백질의 제조에 적합하게 정해지며, 배양되는 숙주세포에 따라 변화한다. 숙주세포가 에쉐리치아 콜리인 경우, 온도는 20 내지 46℃, 바람직하게는 36 내지 38℃이고; 효모인 경우, 온도는 약 20 내지 35℃, 바람직하게는 약 23 내지 30℃이며; 바실러스 서브틸리스인 경우, 온도는 28 내지 40℃, 바람직하게는 36 내지 38℃이다.
배지의 pH 는 숙주세포의 증식 및 목적 단백질의 제조에 적합한 수치로 조정될 수 있으며, 배양되는 숙주세포에 따라 변화한다. 배양탱크중의 용존 산소 함량은 포화의 약 10 내지 70％ 범위에서 적당히 선택된다.
본 발명은 하기 실시예 및 참고예를 통하여 좀더 구체적으로 설명되지만, 본발명의 범위가 이들로 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1
HSA를 발현, 생산할 수 있는 피치아 효모 UHG42∼3 균주의 특이 성장속도 μ를 초기 특이성장속도 μ'=0.025 로부터 예정된 특이 성장속도 μ"=0.002 까지 변화시킴을 특징으로 하는 배양시스템에서 HSA를 제조하였다. 여기서, 균주는 문헌(참조: Japanese Patent Unexamined Publication No. 29984/1992)에 기재되어 있는 바에 따라 제조하였다. 특히, 배양은 다음의 단계를 포함한다.
(1) 배양방법
① 예비배양
균주를 YPD 육즙(2％ 박토펩톤, 1％ 효모추출물, 2％ 글루코오스)에서 예비배양하였다. 구체적으로, 20％ 글리세롤에 냉동보관된 피치아 효모 UHG42-3의 세포현탁액(OD540≒10) 1㎖를 YPD 육즙 50㎖를 함유하며 배플(baffles)이 부착된 300㎖ 에틀렌마이어 플라스크에 접종하고 30℃에서 24시간동안 진탕배양하였다.
② 주배양
표 1에 나타낸 조성물을 포함하는 배지(일차 배지)중에서 예정된 시간동안 육즙을 회분배양한 다음, 제 1 도에 나타낸 첨가율로 메탄올을 연속적으로 첨가하면서 배양하였다.
표 1.
구체적으로, 예비배양액(34㎖)을 회분배지(일차 배지) 1.7ℓ를 함유하는 10ℓ 좌(jar) 발효기 (Biomaster D 타입, 10ℓ)에 접종하고 통기 교반배양하였다. 배양온도는 30℃이었다. 회분배양중의 교반속도는 900rpm으로 일정하게 유지시켰다. pH 는 일정하게 5.85로 조정하였다. 거품을 제거하기 위하여, 필요에 따라 소포제를 첨가하였다.
회분 배양동안에 일차 배지중의 글리세롤이 완전히 소모되었을 때(24시간 배양), 메탄올을 첨가하기 시작하였다.
메탄올의 첨가율은 하기 식에 따라 조절하였으며, 여기에서 t 는 메탄올 첨가시작후의 경과시간(hr)을 의미한다:
메탄올 첨가율의 경시 변화는 제 1 도에 나타내었으며, 여기에서 배양시간 약 24부터 96 까지는 실선으로 나타내었고; 배양시간 약 96 부터 116 까지는 고운(fine) 점선으로 나타내었으며; 배양시간 약 116 부터 360 까지는 실선으로 나타내었다.
약 24 시간(메탄올 첨가의 초기시간)부터 약 96 시간까지의 배양기간중, 피치아 효모의 초기 특이성장속도 μ'가 0.025로 되도록 메탄올을 첨가하였고, 도면 중의 고운 점선으로 나타낸 바와 같이 메탄올 첨가율을 일단 적당히 감소시켰으며, 피치아 효모의 예정된 특이 성장속도 μ"가 0.002로 되도록 메탄올을 연속적으로 첨가하였다.
대조군 실험으로는, ① 첨가율을 순간적으로 변화시킴으로써 μ가 0.025에서 0.002로 변화되는 시스템에서 배양하고 ② μ가 변화되지 않는 시스템에서 배양하였다.
①에서 μ를 변화시키기 위해 메탄올 첨가율의 순간적인 변화를 포함하여 시스템내의 메탄올 첨가율을 하기 식에 따라 조절하였으며, 여기에서 t 는 메탄올 첨가시작후의 경과시간(hr)을 의미한다. 이는 또한, 제 1 도에서 실선 및 굵은 실선으로 나타내었다:
약 24 시간(메탄올 첨가의 초기시간)부터 약 96 시간까지의 배양기간중, 피치아 효모의 초기 특이성장속도 μ'를 0.025로 되게하고 피치아 효모의 특이 성장속도 μ"를 0.002로 변화시키기 위하여 메탄올을 첨가하였는데, 이때 μ를 0.002 로 조절함에 있어 메탄올 첨가율을 순간적으로 변화시킨다.
μ를 변화시키지 않는 시스템 ② 에서의 메탄올 첨가율은 하기 식에 따라 조절하였으며, 여기에서 t 는 메탄올 첨가시작후의 경과시간(hr)을 의미한다. 하기 식에 따른 조절이 μ를 변화시키지 않는 시스템에 적합한 배양방법이다. 즉, μ가 0.015로 되도록 공급을 시작하고, 용존산소 농도(배양액중에 용해되어 있는 산소의 농도)가 일정수준 이하로 되었을 때 일정한 속도의 공급을 시작한다. 이 시스템에서의 메탄올 첨가율의 경시변화는 제 1 도에 점선으로 나타내었다:
제 2 도는 메탄올 첨가율을 연속적으로 변화시키는 시스템에서의 μ(본 발명, 제 2a 도)와 첨가율을 순간적으로 변화시키는 시스템에서의 μ(대조군①, 제 2b 도)를 비교하여 나타낸 것이다.
각 배양 결과는 세포밀도의 경시변화에 따라 제 3 도에 나타내었으며(본 발명 및 대조군 ①), 표 2 는 배양완료시의 HSA 생성율을 나타낸다(본 발명, 대조군① 및 대조군 ②).
표 2.
360시간의 배양후 생성된 HSA의 양을 비교해보면, μ가 변화하는 경우(본 발명, 대조군 ①)가 변화하지 않는 경우(대조군 ②)에 비해 더 좋은 결과를 나타내는 한편, 생성된 HSA의 양은 공급율을 연속적으로 변화시키는 시스템(본 발명, 156％)에서 공급율을 순간적으로 변화시키는 시스템(대조군 ①, 107％)에 비해 현저하게 증가하였다. 따라서, μ를 변화시키고자 할 때, 기질(메탄올)의 공급율을 연속적으로 변화시키면 제조되는 목적 단백질(HSA)의 양이 증가된다는 사실이 명백해졌다.
실시예 2
주배양에서 메탄올 대신에 표 3에 나타낸 공급배지를 사용하는 점을 제외하고는 실시예 1 에서와 동일한 방법으로 균주를 배양하였다.
결과는 실시예 1에서 얻어진 것과 유사하였다.
표 3.
참고예 1 : 세포밀도의 측정
임의의 배양시간후 배양액을 취하여 OD540수치가 0.3을 초과하지 않도록 증류수로 희석한 다음, 분광광도계(UV 2200 타입, Shimazu Corporation)를 사용하여 540nm에서의 흡광도를 측정하였다. 얻어진 수치에 희석배수를 곱하여 배양액의 흡광도로 하였다. 식 OD540수치/5.6에 기초하여(OD540=5.6은 건조 세포 1 g에 상응한다), 흡광도로부터 건조 세포밀도를 계산하였다.
참고예 2: HSA 농도의 측정
임의의 배양시간 후 배양액을 취하여 15,000rpm에서 5분간 원심분리하였다. 수득된 상등액을 울트라프리(Ultrafree) C3HV로 여과하여 맑은 용액을 얻은 다음,하기 조건하에 HPLC로 겔여과하였다.
참고예 3: 메탄올 농도의 측정
임의의 배양시간 후 배양액을 취하여 15,000rpm에서 5분간 원심분리하였다. 수득된 상등액을 울트라프리(Ultrafree) C3HV로 여과하여 맑은 용액을 얻은 다음, 하기 조건하에 HPLC로 정량분석하였다.
산업적 적용성
본 발명의 배지에 대한 기질 첨가율의 변화양상에 따라, 특이 성장속도 μ 및 특이 생성속도 ρ의 최적 패턴이 공급-회분배양 시스템을 최적화할 수 있게 되었다. 그 결과, 공급-회분배양에 의해 숙주세포를 고밀도 배양하는 것이 가능해졌으며, 목적 단백질을 단기간에 효율적으로 제조할 수 있게 되었다.
따라서, 본 발명의 방법은 높은 상업적 가치를 갖는 HSA, IGF, 프로유로키나아제 및 UTI 와 같은 단백질의 산업적 제조방법으로서 극히 유용하다.

Claims (12)

  1. 목적 단백질을 발현시킬 수 있는 숙주세포를 공급-회분배양(fed-batch culture)하여 성장시킴에 있어서, 숙주세포의 성장을 조절하는 기질의 첨가율을 연속적으로 변화시켜 숙주세포의 특이 성장속도를 초기속도로부터 예정된 속도까지 변화시킴을 특징으로하여 목적 단백질을 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 숙주세포가 목적 단백질을 구성적으로(constitutively) 발현하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 숙주세포가 효모로부터 유래된 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 숙주세포가 메틸요구성(methylotrophic) 효모로부터 유래된 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 숙주세포가 피치아(Pichia) 효모로부터 유래된 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 숙주세포의 성장을 조절하는 기질이 탄소 에너지원인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 탄소 에너지원이 메탄올, 글리세린, 솔비톨, 글루코오스,프락토오스, 갈락토오스 및 수크로오스로 구성된 그룹중에서 선택된 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 숙주세포가 피치아(Pichia) 효모로부터 유래된 것이고, 숙주세포의 성장을 조절하는 기질이 메탄올, 글리세린 및 이들의 혼합물로 구성된 그룹중에서 선택된 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 숙주세포가 사카로마이세스(Saccharomyces) 속으로부터 유래된 것이고, 숙주세포의 성장을 조절하는 기질이 갈락토오스, 수크로오스 및 이들의 혼합물로 구성된 그룹중에서 선택된 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 숙주세포가 유발인자(inducer) 존재 하에 증식 시 목적 단백질을 발현하는 방법.
  11. 제1항 내지 5항 및 10항중의 어느 한 항에 있어서, 목적 단백질이 숙주 세포에 대해 이종단백질인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 이종 단백질이 인간 혈청 알부민인 방법.
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