TW493003B - Process for producing protein - Google Patents

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經濟部中央標準局員工消費合作社印製 493003 A7 B7 五、發明説明（3 ) 持術領域 本發明偽有關培養工程中控制培養基中之基質添加速 率以達成有效率地生産蛋白質的方法。詳言之，本發明偽 有關以比增殖速率w作為指標，藉控制培養基中基質之添 加速率以達成批式流入塔養条（fed batch culture;係藉 於批式培養與連續培養之間之培養方式之最適化培養環境 而有效率地生産蛋白質之方法。 桔術背暑 目前，大部分具有商業價值之蛋白質偽藉培養能夠表 現遣傳基因之宿主細胞而進行生産。 以培養技術或遣傳基因轉型技術生産蛋白質時，雖然 偽利用宿主細胞之指數關偽增殖而伴隨著標的蛋白質之生 産，但是，為了提高蛋白質之生産效率，則必須藉由控制 其培養環境以逹到宿主細胞之機能的有效利用。因此，在 培養工程方面必須撿討適當之培養條件，以逹成標的蛋白 質在短時間内具有高效率及高收量之生産方法。 宿主細胞之比增殖速率與標的蛋白質之生産具有密切 之關傜。為達到標的蛋白質之最佳生産效率，則必須控制 宿主細胞之比增殖速率為最適值。因此，以往對宿主細胞 (微生物）産生量與比增殖速率之關像有很多研究，並提出 許多模式条統。 根據這些模式条統，為達到最大之産生量，於培養途 中至少必須將細胞之增殖速率改變一次（醱酵工學會誌， 第 70卷，第 5號，3 9 5 - 4 0 4， 1 9 9 2 )。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

493003 A7 B7 五、發明説明（4 ) 但是，根據本發明人等之研究發現，為達成上述培養 蛋中：率産 。 産際增 的 高速的 生之比 標提 © 標 以養之 高 以增産 条培胞 提胞比生 養入細 到 細之地 培流主 達 主胞率 入式宿 能宿細效 流批制 不)0養主有 式施控 並11培宿能 枇實以 變 U 用變而 用於率 改 f 利改性 利：速 之rl對在能 種為入 率JI針討機 一徵流 速MJ乃探之 供特的 殖 等 ，胞 提其質 增 U 人法細 為 ，基 爾 比' 明方主 的法之 參 由ί 發之宿 。目方基 藉量本質饗法之之養 , 産 ，白影方明質培 化生此蛋會養發白制 適之因的不培本蛋控 最質 標際之 的藉 之白 産之物 標， Ε 〇 § 的的 目 標 之産 質生 白地 蛋率 的效 標 高 産能 生種 量 一 大供 。 内提法 間為方 時的養 短目培 成一的 達另胞 而之細 , 明 主 Μ 發宿 率本之 速 質 殖 白 示 ^ 明 0 值 的 作 3 巨 制 { 抑值 饋適 回 最 無為 在 W 求率 尋速 為殖 等增 人比 明之 發胞 本細 主 宿 用 制 而 控因 成 ， 逹法 下方 件之 條丨 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) %. 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 之果 胞結 細 ， 主條 宿關 與互 率相 速之 入量 流産 之之 質丨 基 中 統 条物 養産 培的 入標 流及 式率 批速 在殖 討增 撿比 質 白 蛋 培的 變標 改及 以能 率機 速之 入胞 流細 的對 質 ， 基時 之 α 基率 養速 培殖 變增 改比 地的 缅胞 «田 由之 藉中 : 程 現過 發養 之 物 産 的 標 高 提 而 此 因 饗 影 良 不 成 造 會 不 量 産 生 之 物 産 明 發 本 成 完 而 是 如 ο 性 産 生 以 bB 是 好 較 胞 細 主 宿 用 使 &PB 種 1 有 明 發 本 即 亦 細 主 宿 使 可 質 物 導 誘 由 0 或 者 質 白 i 的 標 現 表 因 基 構 結 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 4 493003

經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 胞增殖而達到實質上能Μ结構基因表現標的蛋白質者，利 用批式流入培養使其增殖以生產標的蛋白質之方法，其特 激為：於宿主细胞之比增殖速率^欲由初比增殖速率轉變 為所定之比增殖速率時，係經由連缅地改變支配宿主细胞 增殖之基質的添加速率而達成生產檷的蛋白質之方法。 _而：> 筋盟說明 第1圖係培養基中甲酵之添加速率的經時變化圖（實施 例1)。 第2圖係甲酵之添加速率為連鑛變動之糸統（本發明） 的比增殖速率/i的經時變化（第a圖），Μ及甲酵之添加速 率為瞬間變動之条統（對照①）的比增殖速率u的經時變化 (第b圖）。 第3圖係甲酵之添加速率為連續變動之糸統（本發明 -△-)及添加速率為瞬間變動之糸統（對照①-籲-)的增殖 菌體濃度之比較圖。 琎明夕詳Μ說明 於本發明中之「檷的蛋白質之结構基因表現」係指檷 的蛋白質係與宿主细胞之生育條件無翮而能常態表現者。 又，本發明中之「可賴誘導物質使宿主细胞增殖，而 使標的蛋白質實質上達成结構基因表現」係指宿主细胞之 生育條件與蛋白質之表琨間存在者某種關係，使當宿主细 胞增殖所必需之物質與誘導物質相同時，則於宿主细朐增 殖時能同時表琨檷的蛋白質者。 又，此處之「誘導物質」係指能使編碼標的蛋白質之 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2 10X 297公釐） 5 (修正頁） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ .4 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 493003 A7 _ B7 五、發明説明（6 ) 基因開始轉錄、轉譯之物質，例如甲醇、半乳糖、蔗糖等 Ο 本發明使用之「能表現標的蛋白質之宿主細胞」（以 下簡稱宿主細胞）為，例如，自然表現之天然由來的細胞 或可表現外來蛋白質之變異細胞（以下稱為適當的轉型細 胞）等。 又，宿主細胞之來源並無特別限制，例如，徹生物[ 細菌（例如，埃克利希（Escherich)氏菌屬、捍菌屬等細gj )，酵母菌（例如，酵母菌颶，畢赤氏菌屬等）。具體之例 舉為埃克利希氏菌屬之大腸桿菌（以下簡稱L· coin K12DH1 , M103 , JA221, HB 1 0 1, X6 0 0 , XL-1 Blue, JM109 等；桿菌屬之祜草桿菌（B a c i 1.1. sjjJUlLIIsJ Μ 111 4 , 207-21等；酵母菌之麵包酵母（Saccharomycfi巧 c e r i v i i a ^ ) AH22 , A Η 2 2 R ' N A 8 7 - 11 A , D K D - 5 D 等；以及 畢赤氏菌屬之巴斯德畢赤氏菌（P.1.C h,i...a,.. p a..s.t q_t i s )等，並 無特別限制。較好是使用酵母菌。 又，使用酵母菌作為宿主細胞時，亦可使用甲醇營養 型酵母菌。適當之甲醇營養型酵母菌為，例如，在甲醇中 可增殖之漢遜氏菌屬（H a n s e n u 1 a )或畢赤氏菌屬之酵母菌， 但不受限於此（The Biochemistry of Methylotrophs, 269(1982)]。較好是畢赤氏菌颶之甲醇營養型酵母菌，例 如，營養要求性之巴斯德畢赤氏菌GTS U5(NRRL Y-15851 )，巴斯德畢赤氏菌GS 190(NRRL Y-18014),巴斯德畢赤 氏IgPPF 1(NRRL Y-18017),野生型巴斯德畢赤氏菌株（ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 本紙浪尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 '乂297公釐） 6 493003 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（7 ) HRRL 卜 1 1 4 3 0、NRRL Y-11431) ^ 〇 「宿主細胞」較好是能表現標的物為異種蛋白質（以 下簡稱適當之異種蛋白質）的轉型細胞。該細胞只要具有 能編碼異種蛋白質胺基酸序列的外來DNA且能將該DNA之訊 息予以表現以生産該標的蛋白質者即可。其取得方法並無 待別限制。例如，使用DNA轉型技術將编碼標的蛋白質的 D N A載持於質體上或噬菌體上進行轉型作用而取得者。 本發明所稱「宿主細胞」之一具體例為生産H S A之宿 主細胞，該細胞之製備及利用該細胞對H S A之表現及生産 等均可依照公知方法或相似方法實施。 具體例為，例如，使用一般人類血清白蛋白之方法（ 持開昭5 8 - 5 6 6 8 4號、特開昭5 8 - 9 0 5 1 5號、特開昭5 8 -150517號公報），使用新穎人類血清白蛋白基因之方法（特 開昭6 2 - 2 9 9 8 5號，特開平1 - 9 8 4 8 6號公報），使用合成訊號 序列之方法（待開平1 - 2 4 0 1 9 1號公報），使用血清白蛋白訊 號序列之方法（特開平2 1 6 7 0 9 5號公報），使用將轉型質體 插入染色體中之方法（待開平3 - 7 2 8 8 9號公報），宿主間相-互融和之方法（特開平3 - 5 3 8 7 7號公報），於含有甲醇之培 養基中引起變異之方法，使用變異型A 0X2,啓動子之方法 (特開平4 - 2 9 9 9 8 4號公報），利用祜草捍菌表現H S A之方法（ 恃開昭6 2 - 2 5 1 3 3號公報），利用酵母菌表現H S A之方法（特 開昭60-41487號，特開昭63-39576號，恃開昭63-74493號 公報），利用畢赤氏酵母菌表現H S A之方法（待開平2_ 1 0 4 2 9 0號公報）等。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐) 7 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

493003 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（8 ) 本發明方法之標的蛋白質並無待別限制，可為上述天 然由來之宿主細胞産生之結構蛋白質，亦可為轉型細胞生 産之外來基因表現之蛋白質。 具體而言，宿主細胞之結構蛋白質為，例如，RNA聚 合酶、肌動蛋白、呼吸条或解醣条等相關之酵素等；異種 蛋白為，例如，干擾素（interferon)、尿激酶、尿激酶原 、t-PA(組織血蛋白纖維溶原酶活化因子），G-CSF(顆粒球 ♦群落剌激因子），M-CSF (巨噬細胞♦群落剌激因子）， HSA(人類血清白蛋白）、IGF (胰島素類成長因子），尿液抽 取之胰蛋白酶抑制劑（UIT)等。較好是HSA,干擾素，尿激 酶，尿激酶原，I G F , U T I等，最好是H S A。 又，宿主細胞與異種蛋白質之配合亦無持別限制，只 要適當配合即可。例如，大腸桿菌與干擾素，麺包酵母菌 與尿激酶原，麵包酵母ϋ與HSA,巴斯德畢赤氏菌與HSA等 Ο 宿主細胞（轉型細胞）之培養偽採用批式流入培養，可 使用含有各種磺源及/或營養源之培養基進行培養。亦即， 在一定期間内使用含有適宜宿主細胞增殖之磺源及/或營 養素之培養基（初期培養基）進行培養，待達到適當之對應 時期時，開始追加支配宿主細胞增殖之基質，標的蛋白質 在培養終了前不必油出糸統外（待開平3 - 8 3 5 9 5號公報）。 本發明中「支配宿主細胞增殖之基質」像指適合宿主 細胞增殖之基質，宜為碩源物質。 上述基質為，例如，甲醇、甘油、山梨糖醇、«萄糖 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（210Χ 297公釐） 8 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

493003 A7 B7五、發明説明（9 ) 、果糖、半乳糖、蔗糖等。又，該等不限於一種成分，兩 種以上亦可。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 如時 例菌 , 母 為酵 質包 基麵 之為 好胞 較細 , 主 時宿 〇 氏合 赤組 畢之 德 當 斯適 巴其 為及 胞油 細甘 主 、 宿醇 甲 菌 桿 腸 大 用 使 ο 等 糖 蔗 、 ο 糖等 乳糖 半乳 如如 例例 為為 質好 基較 之質 好基 較 ， , 時 至 加分 添成 質他 基其 於合 關配 , 可 又亦 質 獨 單 為 可 式 方 之 基 養 培 如 例 素 生 維 等 塩 機 無 基組 該成 加形 添丨 狀 形 固 為 可 態 形 之 加 添 〇 加 添 式 方 之 物 成 者 狀 體 液 用 使 是 好 〇 較中 , 基 可養 均培 等於 狀解 體溶 液地 , 勻 狀均 粒而 顆速 ，快 狀可 末是 粉如 宿源 依磺 可 〇 源源 養養 營營 或或 / / 及及 源源 磺碳 之知 用公 使之 養當 培適 期用 初採 在而 泡 類 s_r: f_ = f 細種 主之 宿胞 細 主 例 α銨 源酸 氮磷 > 、 如氨 例 、 , 物 為解 源水 養白 營蛋 ; 酷 等 ， J4 nu tasr vv— DH 甘 白 E r 5 糖 ， 萄物 葡取 , 萃 如母 例酵 f , 為如 等 銨 酸 磷 r 酸 磷 如 例 /IV 源 塩 酸 磷 \J/ 等 銨 酸 乙 鉬等 1X r B 0 素 、 生 錳維 > I 鎂酸 、 泛 銅 ， 、 素 鋅物 、 生 鐵 ， , 如 如例 /ί\ 例 丨素 素生 元維 量及 徹以 及 ， 物等 機鈷 無 、 不連比 指作初 偽率由 J 速/i 率加率 速添速 加將殖 添是增 之而比 質 ，之 基斷胞 動中細 變然主 地突宿 續加將 連添可 Γ 之 ， 稱質是 所基如 中中 。 明槽變 發養改 本培的 將性 要纊 位 單 指 偽 J 〇 率 率速 速殖 殖增 增比 比 之 之胞 定細 所主 為宿 變 Γ 轉 稱 地所 慢中 慢明 率發 速本 殖 間 時 量 殖 增 的 胞 細 主 宿 之 量 胞 細 位 單 下 以 係 般 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 9 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 493003 A7 B7 五、發明説明（10 ) 式表不。

1 Δ XV u = - X - XV Δ t [式中，X為菌體濃度（g/L); V為培養基量（L); t為培 養時間（h r ) ; △ X V , △ t分別為X V及t之變化量。] 本發明中所稱「由初比增殖速率改變為所定之比增殖 速率」傺指宿主細胞由當初之比增殖速率在批式流入培養 過程之途中改變為所定之不同的比增殖速率。較好是將當 初之比增殖速率、所定之比增殖速率及改變之時間（換言 之，亦即保持初比增殖速率之時間）藉比增殖速率//與比 生産速率P之相關性求得（醱酵工學會誌，第70卷，第5號 ,395-404, 1992)〇 上述比生産速率/〇偽指單位時間（h r ),單位細胞量之 蛋白質生産增加量，一般係以下式表示。

1 △ PV p = - X - * XV Δ t [式中，P為蛋白質生産量（g/L); V為培養基量（L); t為培養時間（h r ) ; △ P V及△ t分別表示P V及t之變化量。] 又，上述之改變次數亦可為多次改變。 本發明中使用之培養溫度最好是能適合宿主細胞之增 殖及標的蛋白質之生産的溫度。宿主細胞傺大腸桿薗時為 20〜461C,較好是36〜381C;宿主細胞偽酵母菌時為20〜 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

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五

~ ~ 3 6 2 3 約為 大好 為較 好 ， 較 P 為 時 菌 桿 草 祜 係 胞 细 主 宿 標氧 及溶 殖和 增飽 之在 胞可 细量 主氧 宿溶 於之 合基 適養 用培 採 ， 可又 » ο Η Η ρ ρ 之的 基產 養生 培 之 於質 闞白 5 的 說 细 詳 之 步1 。 進 擇更 選作 之明 。 當發例 適本施 作對實 間例於 圍考限 範參受 之及不 % 例並 70施明 ~ 實發 10藉本 約下而 大以然 之 。 量 明 例 管 nu fcE - 產 母報 酵公 鼷號 氏84 赤99 峰 2 曷 I - 4 Γ Co 0¾ Η , 產特 生於 及載 現記 表法 夠方 能備 用製 ✓fv 使 株 菌 3 率 速 殖 增 比 之 始 初 由 /i 率 速 殖 增 比 iu 率 殖 增 比 之 言 而 體 具 定實 所法 至方 變述 改下 25照 ο依 ο係 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 施 法 方 養 培 萃 母 酵 % 1X r 陳 白 蛋 ¾ 2 液 養 培 D Ρ Υ 用 使 係 養 培 養前 培 前 Θ 將 係 之 言 詳 ο \1/ 糖 萄 葡 ¾ 2 % 物 取 之 结 凍 中 油 甘 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 菌 母 酵 鼷 氏 赤 a? Υ 於 之 -11 η 中 50瓶 有燒 含角 至 三 種的 養 培 主 ② 液 浮 懸 株 菌

I 接 為 量 容 之 板 擋 有 附 之 液 養 培

時 小 4 2 養 培 盪 振 V 基 養 培 基 初 /IV 基 養 培 之 成 組 示 所 ii 表 用 使 係 養 培 主 續 率 速 入 流 示 所 圖 11 第 依 後 間 時 定1 養 培 式 批 以 酵 甲 加 添 地 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公f ) 1 1 (修正頁） 493003 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（12 ) 表1 初期培養基之組成 成 分 濃度（/ 1 ) 甘油 40 . 0 g Η 3 P 0 4 ( 8 5 % ) 14.0 in 1 CaS〇4 * 2H2〇 0 . 6 g K2SO4 9 . 5 g MgS〇4 · 7H2〇 7 . 8 g KOH 2 . 6 g 0 . 2 g / 1生物素溶液 1.6 in 1 YTM溶液= 4.4 in 1 Y T Μ溶液=之組成 成 分 濃度u/1 ) PeS〇4 * 2H2〇 65.0 CuS〇4 ♦ 5H2〇 6 . 0 MnS〇4 ♦ 4-5H20 4.11 ZnS〇4 * 7H2〇 20.0 H2SO4 5 . 0 (in 1 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐）12 493003 Α7 Β7 丨之 明言 明 發 五 有 含 於 槽 酵 發 之 L ο 1 為 量 容 之 基 養 培 Γ 型 ARM 種 接 中 進 後 然 液 菌 之 養 培 前 劑 泡 消 PI加 or添 90可 度 ， 速時 拌泡 攪消 M要 ο 需 V 果 30如 為 。 度85 溫5. 養為 ί Η 培 Ρ 。 制 養控 培。 氣養 通培 行式 批 行 is (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 當初期培養基中之甘油全部消耗殆盡之際（培養24小 時後）開漿進行甲醇之添加。 甲酵之添加速率係依下式予以控制[但是，t係指甲酵 開始添加後之經時（h r )]。 OS t 彡 72 期間，F (t) = 3 · 712 X exp (0 · 0 2 5 X t) (g/hr) 72$ 92 期間，F(t) = 22·456Χ exp[-0.025x (卜 72)] 92S t 期間，F(t) = 13·62Χ exp[0.002x (t-92)] 第1圖示甲醇添加速率之經時變化（培養約2 4〜9 6小時 以實線表示，培養約96〜116小時為细虛線表示，及培養 約1 1 6〜3 6 0小時以實線表示）。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 於培着約2 4小時後開始至約9 6小時期間係藉控制甲酵 之添加速率來控制畢赤氐羼酵母菌之初比增殖速率/i ’為 0.025,接著將甲酵之添加速率依照圖中细虛線所示情形 媛慢地減少，接著使舉赤氏酵母菌之比增殖速率逐漸達到 所定之值μ”為0.002。 又，作為比較之對照組實驗為：①v值由0.025改變 為0.002之際，甲酵之添加速率係瞬間地予以變更之培養 糸統，Μ及②μ值不予改變之糸統。 ①之μ值在改變之際，甲酵之添加速率係瞬間地變動 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1 3 (修正頁） 493003 A7 B7

S6〇〇J>JL 五、發明説明（14) ，其添加速率係依下式予以控制[但是，t係指甲酵開始添 加後之經時（hr)]。又，此系統中甲酵添加速率之經時變 化為如第1圖中之實線及粗實線所示。 OS 72 期間，F (t) = 3 · 712 X exp (0 · 0 2 5 X t) (g/hr) 72蠤 t 期間，F(t)= 13·086Χ exp[0.002x (t-72)] 亦即，自培養約2 4小時至約9 6小時期間係藉控制甲醇 之添加速率使畢赤氏靥酵母菌株之初比增殖速率μ ’為 0.025,接著在達將畢赤氏屬酵母菌之比增殖速度轉換 為0.002之際，將甲酵之添加速率作瞬間之變動Μ使其比 增殖速率//逐漸達到所定之值0.002。 又，②之u值不改變之糸統中的甲酵添加速率係依下 式予Μ控制[但是，t係指甲醇開始添加後之經時（hr)]。 根據該式之控制，可適當地使/i值不發生改變。亦即，藉 甲醇之開始添加使α = 0.015,當溶氧濃度（培養基中溶解 之氧的濃度）低於一定濃度時則維持定速添加之方法。又， 此系統之甲酵添加速率之經時變化如第1圖中之虛線所示。 0 彡 tS127 期間，F(t)=2.176Xexp(0,015xt) + 1.632( g/hr) 127^ t 期間，F (t) = 16 · 253 第2圖示甲酵之添加速率為連讀變動系統（本發明）時 之u值的變化[第2U)圖],及添加速率為瞬間變動糸統（ 比較對照組①）時之/i值的變化[第2(b)圖]。此圖為兩者 之比較结果。 又，各培養之结果中有關菌體濃度之經時變化如第3圖 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 .< 29?公釐） 1 4 (修正頁） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

T 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 493003 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 Α7 Β7 五、發明説明（15 ) 所示（本發明與比較對照組①）；關於培養終了時之H S A的 相對生産率如表2所示（本發明，比較對照組①及②）。 表2 培養条統 HS A 相對 生産率 /i值之變動與否 添加速率之變化 無變動（對照②） - 100 % 有變動 瞬間變動（對照①） 1 07 % 有變動 連續變動（本發明） 1 56 % 比較培養約3 6 0小時後之H S A産量，發現改變^值之情 形（本發明及比較對照組①）較未改變/i值之情形（比較對 照②）為佳；在改變//值之情形下，又以連绩變動流入速 率之方式（本發明）較瞬間變動流入速率之方式（比較對照 組①）為佳。採用瞬間變動流入速率之方式（比較對照組⑦ )時，其HSA之相對産率為107 %;而採用連缅變動流入速 率之方式（本發明）時，其H S A之相對産率為1 5 6 % ,較比較 對照組①為優。此結果顯示，變動α值時，基質（甲醇）之 添加速率若採用連續變動方式添加，則對標的蛋白質（ HSA)之生産量有提高之效果。 實施例2 將主培養工程中添加之甲醇改用表3所示組成之流入 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) %. 訂 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 493003 A7 B7 五、發明説明（16 ) 培養基，其餘依照實施例1之方法同樣地實施。 結果得到與實施例1相同之結果。 表3流入培養基之組成 成 分 量U1) ΥΜΤ溶液 2 甲醇 1000 參者例1蘭騁遒 麼測宙 於任意之培養期間對培養液取樣，以蒸餾水稀釋至測 定0 D 5 4 〇之值為0 . 3以下。0 D 5 4 〇傜以分光光度計（U V 2 2 0 0型 ，島律製作所）測定。於5 4 0 n m下測定吸光度（0 D 5 4 〇 ),再 以下式計算出乾燥菌體之濃度。 (0D54〇/5.6)X稀釋倍數[0D54〇=5.6時相當於lg之乾 燥菌體]。 參者例2 HSA：>鴉麼測亩 於任意培養期間對培養液取樣，於1 5 , 0 0 0 r p m離心5分 鐘。所得上清液以ΙΠ t r a f r e e - C 3 Η V濾取上清液，然後在下 列條件以Η P L C凝膠過濾層析法進行分析。 管 柱：TSi(凝膠 G3000 SWxi 移動相：0 . 3 Μ N a c 丨，5 0 m Μ 磷酸鈉，0 · 1 % N a Ν 3， pH6 . 5 流 速：l.Oml/niin 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 】β (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

493003 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（17 ) 注入量：5 0 u 1 撿出方法：A28〇, A35〇(2波長） 縈者例3 甲_^漶麼測亩 於任意培養期間對培養液取樣，於15,OOOrpm離心5分 鐘。所得上清液以U 1 t r a f r e e - C 3 Η V濾取上清液，然後在下 列條件以Η P L C進行定量分析。 管 柱：Sugar-pak Ca(Waters公司製造） 移動相：0 . 0 2 % K a N 3 管柱溫度：8 0 1C 注入量：2 8 u 1 撿出方法：示差折射計 産_ h ：>利用件 根據本發明，藉由培養基中基質添加速率之變動形式 考量批式流入培養条之最適化，以求得可達成比增殖速率 u及比生産速率P最適化之組合。藉上述最適化之逹成， 可利用批式流入培養使宿主細胞之高密度培養變得可能， 並於短時間内有效率地生産標的蛋白質。 - 因此，本發明方法對HSA、 IGF、尿激酶原、UTI等高 商業價值之蛋白質的工業化生産極為有用。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ·% 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1 7

Claims (1)

1. 493003 附 件

   (89年10月4曰） .一種人類血清白蛋白之生產方法，係藉批式流入培養 (fed batch culture)使能夠表規人類血清白蛋白之酵 母菌宿主细胞增殖以生產該白蛋白，其特徼為：於宿 主细胞之比增殖速率欲由初比增殖速率轉變為所定之 比增殖速率時，係經由連續地變動支配宿主細胞增殖 之基質的添加速率以達成生產該白蛋白之方法。 法 方 E 違 生 之 白 § 白 清 血 類 人 之 項 11 第 圍 範 利 專 請 申 如 2 蛋 白 該 現 表 式 方 現 表 因 基 構 結Μ 係 胞 細 主 宿 該 中 其 基 構 結Μ 上 質 實 而 殖 增 夠 能 其 使 質 物 導 誘 由 經 或 \ 白 者 白 蛋 白 該 現 表 式 方 因 法 方 產 生 之 白 S 白 清 血 類 人 之 項 1 第 圍 範 利 專 請 Φ 如 3 胞 綑 之 菌 母 酵 型 養 營 酵 甲 係 胞0 主 宿 菌 母 酵 該 中 其 者 主 第宿 圍菌 範母 利酵 專該 請 * _ 中 如其 白 清 血 類 人 之 項 屬 氐 赤 畢 係 胞 细 經濟部中央標準局員工福利委員會印製 白 清 血 類 人 之 項 11 第 圍 範 利 專 請 申 如 5 法 方 產 生 之 白 白 白 酵 碳 S β S δ S 1 kRr 3» 者 胞 细 之 菌 母 法 方 產 生 之 者 源 碳 係 質 基 之 殖 增 胞 细 主 宿 該 配 支 中 其 白 清 血 類 人 、 之 — 酵 項 5 甲 第 自 圍選 範侥 利源 專碳 請 * 申 中 如其 6 法 方 產 生 之 酵 唐 梨 山 Λ 油 甘 糖 萄 葡 法 方 產 生 之 白 蛋 白 清 血 類 人 ο 之 者I W 糖 1 蔗第 及圍 糖範 乳利 半專 、 請 糖 申 果 如 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )Α4規格（210 X 297公爱) 1 3 7 9 1 4 493003 Η 而 合 ， 組 菌 其 母 及 酵油 屬甘 氐 、 赤酵 畢甲 ΤΓΠ 4ΠΙ 來選 愫 係 胞質 綑基 主之 宿 殖 菌 增 母胞 酵綑 該主 , 宿 中配 其支 者 8 法 方 產 生 之 白 蛋 白 清 血 類 人 之 項 糖 乳 半 自 選 係 質 基 之 殖 增 胞 第细 圍主 範 宿 利配 專 支 請 * 申中 如其 糖 蔗 者 合 組 其 及 經濟部中央標準局員工福利委員會印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )A4規格（210X 297公爱) 2 3 7 9 1 4