DE69530176T3

DE69530176T3 - Verfahren zur Herstellung von Protein

Info

Publication number: DE69530176T3
Application number: DE69530176T
Authority: DE
Inventors: Kaoru 2-chome KOBAYASHI; Kenji 2-chome TOMOMITSU; Shinobu 2-chome KUWAE; Tomoshi 2-chome OHYA; Toyoo 2-chome OHDA; Takao 2-chome OHMURA
Original assignee: Mitsubishi Pharma Corp
Current assignee: Mitsubishi Pharma Corp
Priority date: 1994-10-25
Filing date: 1995-10-25
Publication date: 2008-04-10
Anticipated expiration: 2015-10-26
Also published as: ES2191064T3; US6068995A; DE69530176D1; CN1254545C; EP0736605B2; WO1996012816A1; KR100405944B1; DE69530176T2; EP0736605B1; CA2179825C; EP0736605A4; KR970700775A; CA2179825A1; DK0736605T3; EP0736605A1; TW493003B; CN1141652A; JP3661191B2; ES2191064T5

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Herstellen eines Proteins, das das Steuern der Zugaberate eines Substrats zu einem Medium während eines Kultivierungsverfahrens zum Erzielen einer wirkungsvolleren Herstellung des Proteins umfaßt. Genauer bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zum wirkungsvollen Herstellen eines Proteins, das das Steuern der Zugaberate eines Substrats zu einem Medium unter Optimieren der Kulturumgebung eines absatzweisen Kultursystems mit Zufütterung ("Fed-Batch-Kultur") durch Verwenden einer spezifischen Wachstumsrate μ als Index umfaßt.
Hintergrund der Technik
Die meisten handelsüblichen wertvollen Proteine werden derzeit durch Kultur einer Wirtszelle hergestellt, die das Gen eines derartigen Proteins zu exprimieren vermag.
Die Herstellung eines Proteins durch eine Kulturtechnik oder genetische Rekombination beruht auf dem Mechanismus, der die Produktion eines gewünschten Proteins zusammen mit der Vermehrung der Wirtszelle als Exponentialfunktion erlaubt. Zum Erhöhen der Produktivität ist es nötig, die Kulturumgebung der Wirtszelle vorzubereiten oder zu kontrollieren, so daß das Leistungsverhalten der Wirtszelle (Zellfunktion) am wirkungsvollsten genützt werden kann. Zu diesem Zweck ist eine Vielfalt zur Produktion in Kultur geeigneter Verfahren hinsichtlich des Kulturverfahrens zum Herstellen des gewünschten Proteins in kurzer Zeit mit hoher Produktionsleistung und hoher Ausbeute untersucht worden.
Es besteht eine enge Beziehung zwischen der spezifischen Wachstumsrate der Wirtszelle und der Menge des durch die Wirtszelle produzierten Proteins und die maximale Produktion des Proteins erfordert die Steuerung der spezifischen Wachstumsrate der Wirtszelle, um sie bei einem optimalen Wert zu halten. Um dies zu erreichen ist die Beziehung zwischen der Menge des durch die Wirtszelle (Mikroorganismus) produzierten Produkts und deren spezifischer Wachstumsrate vordem unter verschiedenen Aspekten untersucht worden, was zum Vorschlag zahlreicher Modelle führte.
Nach diesen Modellen kommt es manchmal vor, daß die spezifische Wachstumsrate der Zelle wenigstens ein Mal während der Kultur zum Erhöhen der Produktionsmenge verändert werden muß [Hakko Kogaku Kaishi, Bd. 70, Nr. 5, S. 395–404 (1992)].
Die Untersuchungen der Erfinder haben jedoch zuerst gezeigt, daß die Änderung der spezifischen Wachstumsrate mit dem Ziel des Optimierens der Kultur nicht zu einer Erhöhung der Produktionsmenge des angestrebten Produkts im gewünschten Ausmaß (vorliegende Beschreibung, Beispiel 1) führt.
Somit wird ein Kulturverfahren, zum Erhöhen der Produktivität bei dem durch die Wirtszelle produzierten gewünschten Produkt gefordert, das das Produkt wirkungsvoll zu produzieren vermag, ohne das Leistungsverhalten der Wirtszelle aufgrund der Änderungen bei der spezifischen Wachstumsrate der Wirtszelle zu beeinflussen.
Es ist daher ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Herstellen eines Proteins bereitzustellen, das bei einer absatzweisen Kultur mit Zufütterung das Steuern der spezifischen Wachstumsrate μ der Wirtszelle durch Ändern der Zugaberate eines Substrats zu einem Medium umfaßt, um dadurch das gewünschte Protein in großen Mengen in kurzer Zeit herzustellen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung handelt von der Bereitstellung eines Verfahrens zum Kultivieren der Wirtszelle, die zum Produzieren des gewünschten Proteins auf äußerst wirkungsvolle Weise befähigt ist.
Offenbarung der Erfindung
Die Erfinder haben die Beziehung zwischen der Zuführungsrate eines Substrats zu einer absatzweisen Kultur mit Zufütterung und der spezifischen Wachstumsrate der Wirtszelle untersucht. Weiterhin ist die Beziehung zwischen der Zuführungsrate und der Menge des erzeugten angestrebten Produkts (Protein) untersucht worden, um ein Verfahren zum Einstellen oder Steuern der spezifischen Wachstumsrate μ der Wirtszelle auf den optimalen Wert (Zielwert) ohne selbsttätige Regelung aufzufinden. Die Erfinder haben gefunden, daß eine kontinuierliche Änderung der Zuführungsrate des Substrats zu dem Medium zum Zwecke des Änderns der spezifischen Wachstumsrate μ der Zelle während der Kultur zu einer erhöhten Produktivität des angestrebten Produkts ohne einen nachteiligen Einfluß auf die Zellfunktion oder die Produktion des angestrebten Produkts auszuüben führt.
Das heißt, die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Herstellen eines gewünschten Proteins zur Verfügung, das das Anzüchten einer zum Exprimieren des Proteins befähigten Wirtszelle durch eine absatzweise Kultur mit Zufütterung umfaßt, wobei die spezifische Wachstumsrate der Wirtszelle von der Anfangs- bis zu einer vorbestimmten Rate durch kontinuierliches Ändern der Zugaberate des Substrats, das das Wachstum der Wirtszelle steuert, verändert wird und wobei die Zeitspanne, während der die spezifische Anfangswachstumsrate aufrechterhalten wird, aus der Beziehung zwischen der spezifischen Wachstumsrate und der spezifischen Produktionsrate bestimmt wird. Vorzugsweise exprimiert die Wirtszelle das gewünschte Protein konstitutiv oder exprimiert das gewünschte Protein, wenn die Wirtszelle in Gegenwart eines Induktors gezüchtet wird.
Kurze Erläuterung der Zeichnungen
1 zeigt den zeitlichen Verlauf der Änderungen der Zugaberate von Methanol zu einem Medium (Beispiel 1).
2 zeigt den zeitlichen Verlauf der Änderungen der spezifischen Wachstumsrate μ in dem System (vorliegende Erfindung) einschließlich kontinuierlicher Änderungen der Zugaberate von Methanol [Figur (a)] und des zeitlichen Verlaufes der Änderungen der spezifischen Wachstumsrate μ in dem System (Kontrolle ➀) einschließlich der sofortigen Änderung der Zugaberate von Methanol [Figur (b)].
3 zeigt einen Vergleich der Dichte der wachsenden Zellen in dem System, bei dem die Methanolzugaberate kontinuierlich verändert wird (vorliegende Erfindung, -Δ-) und in dem System, bei dem die Rate momentan verändert wird (Kontrolle ➀, -•-).
Genaue Beschreibung der Erfindung
In der vorliegenden Erfindung bedeutet "konstitutive Exprimierung des gewünschten Proteins", daß das gewünschte Protein ungeachtet der Wachstumsbedingungen der Wirtszelle konstant exprimiert wird.
In der vorliegenden Erfindung bedeutet weiterhin "im wesentlichen konstitutive Exprimierung des gewünschten Proteins, wenn sich die Wirtszelle durch einen Induktor vermehren kann", daß zwischen den Wachstumsbedingungen der Wirtszelle und der Exprimierung des Proteins irgendeine Beziehung besteht und wenn die zur Vermehrung der Wirtszelle benötigte Substanz und der Induktor dieselben sind, die Vermehrung der Wirtszelle und die Exprimierung des gewünschten Proteins gleichzeitig erfolgen.
Hierin verwendet wird unter "einem Induktor" eine Substanz verstanden, die die Transkription und Translation des das gewünschte Protein kodierenden Gens auslöst und die durch Methanol, Galaktose und Sucrose veranschaulicht wird.
Beispiele der in der vorliegenden Erfindung zu verwendenden "Wirtszelle, die zum Exprimieren des gewünschten Proteins befähigt ist" (hierin nachstehend kurz als "Wirtszelle" bezeichnet) schließen natürlich vorkommende Zellen und Zellen ein, die dazu mutiert wurden, ein Fremdprotein produzieren zu können (hierin nachstehend auch entsprechend als "transformierte Zelle" bezeichnet).
Die Herkunft der Wirtszelle ist nicht besonders eingeschränkt und die Wirtszelle wird durch Mikroorganismen wie etwa Bakterien (z. B. die der Gattung Escherichia angehörenden und die der Gattung Bacillus angehörenden) und Hefe (z. B. die Gattung Saccharomyces und die Gattung Pichia) veranschaulicht. Genauer schließt die Gattung Escherichia zum Beispiel Escherichia coli (hierin nachstehend E. coli) K12DH1, M103, JA221, HB101, X600, XL-1 Blue und JM109 ein. Die Gattung Bacillus schließt zum Beispiel Bacillus subtilis MI114 und 207-21 ein. Die Hefe schließt zum Beispiel Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R", NA87-11A und DKD-5D und Pichia pastoris ein. Es ist anzumerken, daß die Herkunft nicht auf die vorstehend veranschaulichte beschränkt ist. Von diesen ist Hefe am bevorzugtesten.
Wenn eine Hefe als Wirtszelle verwendet wird, kann es eine methylotrophe Hefe sein. Beispiele einer geeigneten methylotrophen Hefe schließen, ohne darauf beschränkt zu sein, der Gattung Hansenula angehörende Hefen oder der Gattung Pichia angehörende Hefen ein, die in Methanol wachsen können [The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)]. Bevorzugt sind der Gattung Pichia angehörende methylotrophe Hefen wie etwa auxotrophe Pichia pastoris GTS115 (NRRL Y-15851), Pichia pastoris GS190 (NRRL Y-18014), Pichia pastoris PPF1 (NRRL Y-18017) und der Wildstamm Pichia pastoris (NRRL Y-11430, NRRL Y-11431).
Bevorzugte Wirtszellen schließen zum Beispiel transformierte Zellen ein, die ein gewünschtes Protein produzieren können, das zu der Wirtszelle heterolog ist (hierin nachstehend entsprechend als "heterologes Protein" bezeichnet). Derartige Zellen weisen eine Fremd-DNA auf, die die Aminosäuresequenz des heterologen Proteins kodiert und das gewünschte heterologe Protein gemäß diesen DNA- Kodes exprimiert und produziert. Das Verfahren zum Erhalten der Zelle ist nicht besonders eingeschränkt. Die Zelle kann zum Beispiel durch Anwenden der rekombinanten DNA-Technik durch Transformation mit einem Plasmid oder Phagen, der die für das gewünschte Protein kodierende DNA trägt, erhalten werden.
Ein spezifisches Beispiel der Wirtszelle in der Bedeutung der vorliegenden Erfindung ist eine Wirtszelle, die HSA produziert. Die Herstellung dieser Zelle und die Exprimierung und Produktion von HSA durch Verwenden dieser Zelle kann durch ein bekanntes Verfahren oder gemäß einem bekannten Verfahren ausgeführt werden.
Spezifische Beispiele des Verfahrens schließen ein Verfahren unter Verwenden eines bekannten Humanserumalbumingens ( japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 56684/1983 , 90515/1983 und 150517/1983 ), ein Verfahren unter Verwenden eines neuen Humanserumalbumingens ( japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 29985/1987 und 98486/1989 ), ein Verfahren unter Verwenden einer synthetischen Signalsequenz ( japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 240191/1989 ), ein Verfahren unter Verwenden einer Serumalbuminsignalsequenz ( japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr.167095/1990 ), ein den Einbau eines rekombinanten Plasmids in ein Chromosom umfassendes Verfahren ( japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr.72889/1991 ), ein die Fusion von Wirten umfassendes Verfahren ( japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 53877/1991 ), ein die Mutation in einem Methanol enthaltenden Medium, ein Verfahren unter Verwenden eines Mutanten-AOX₂-Promotors ( japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr.299984/1992 ), ein die Exprimierung von HSA durch Bacillus subtilis umfassendes Verfahren ( japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 25133/1987 ), ein die Exprimierung von HSA durch Hefe umfassendes Verfahren ( japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 41487/1985 , 39576/1989 und 74493/1989 ) und ein die Exprimierung von HSA durch P/c/7/a-Hefe umfassendes Verfahren ( japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 104290/1990 ) ein.
Das Protein, das das Ziel des Verfahrens der vorliegenden Erfindung sein soll, ist nicht besonders eingeschränkt und kann jedes Protein sein, wie etwa ein konstitutives Protein der vorstehend angeführten natürlichen Wirtszelle, wobei das Protein dadurch hergestellt wird, und ein durch transformierte Zellen produziertes Fremdprotein.
Spezielle Beispiele des konstitutiven Proteins der Wirtszelle schließen RNA-Polymerase, Actin und am respirativen System oder Glykolysesystem beteiligte Enzyme ein und Beispiele des heterologen Proteins schließen Interferon, Urokinase, Prourokinase, t-PA (Gewebeplasminogenaktivator), G-CSF (Granulozytenkolonie-stimulierender Faktor), M-CSF (Makrophagenkolonie-stimulierender Faktor), HSA (Humanserumalbumin), IGF (insulinähnlicher Wachstumsfaktor) und Urintrypsininhibitor (UTI) ein, wobei HSA, Interferon, Urokinase, Prourokinase, IGF und UTI der Vorzug gegeben wird und HSA der größere Vorzug gegeben wird.
Die Kombination der Wirtszelle und des heterologen Proteins unterliegt keiner besonderen Einschränkung und sie können geeignet kombiniert werden. Eine Kombination von Escherichia coli und Interferon, die von Saccharomyces cerevisiae und Prourokinase, die von Saccharomyces cerevisiae und HSA und die von Pichia pastoris und HSA wird veranschaulicht.
Die Wirtszelle (transformierte Zelle) kann durch eine absatzweise Kultur mit Zufütterung in einem Medium, das verschiedene Kohlenstoffenergiequellen und/oder Nährmittel enthält, kultiviert werden. Das heißt, eine Wirtszelle wird über einen gewissen Zeitraum in einem Medium (primäres Medium), das verschiedene Kohlenstoffenergiequellen und/oder Nährstoffe enthält, die zu seiner Vermehrung geeignet sind, kultiviert und nach einem gewissen Zeitpunkt wird das Substrat, das die Vermehrung der Wirtszelle steuert, dem Medium zugefügt und die Kultur wird abgeschlossen, ohne das angestrebte Protein aus dem System zu entfernen ( japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 83595/1991 ).
Das "Substrat, das die Vermehrung der Wirtszelle steuert" bedeutet in der vorliegenden Erfindung ein Substrat, das zur Vermehrung der Wirtszelle geeignet ist und das vorzugsweise eine Kohlenstoffenergiequelle sein kann.
Beispiele des Substrats schließen Methanol, Glycerin, Sorbit, Glucose, Fructose, Galaktose und Sucrose ein, die allein oder in Kombination verwendet werden können.
Beispiele des bevorzugten zu verwendenden Substrats, wenn Pichia pastoris als Wirtszelle verwendet wird, schließen Methanol, Glycerin und Kombinationen davon ein. Beispiele des bevorzugten zu verwendenden Substrats, wenn Saccharomyces cerevisiae als Wirtszelle verwendet wird, schließen Galaktose und Sucrose ein und Beispiele des zu verwendenden Substrats, wenn Escherichia coli als Wirtszelle verwendet wird, schließen Lactose ein.
Die Form des dem Medium zuzusetzenden Substrats kann das Substrat selbst oder eine Kombination sein, die andere Bestandteile wie etwa Vitamine und anorganische Salze einschließt. Wenn das Substrat zugefügt wird, kann es in fester, Pulver-, Granulat-, flüssiger oder irgendeiner anderen Form sein, wobei einer flüssigen der Vorzug gegeben wird, die sich in dem Medium rasch und gleichförmig lösen kann.
Die zu der Primärkultur der Wirtszelle zu verwendeten verschiedenen Kohlenstoffenergiequellen und/oder Nährstoffe sind bekannte Kohlenstoffenergiequellen und/oder Nährstoffe, die für die zu kultivierende Wirtszelle geeignet sind. Beispiele der Kohlenstoffenergiequelle schließen Glucose und Glycerin ein und Beispiele des Nährstoffs schließen Stickstoffquellen (z. B. Hefeextrakt, Bactopepton, Casaminosäure, Ammoniak, Ammoniumphosphat und Ammoniumacetat), Phosphatquellen (z. B. Phosphorsäure und Ammoniumphosphat), anorganische Quellen und andere Spurenelemente (z. B. Eisen, Zink, Kupfer, Magnesium, Mangan, Calcium, Molybdän und Kobalt) und Vitamine (z. B. Biotin, Pantothensäure und Thiamin) ein.
Die "kontinuierliche Änderung der Substratzugaberate" bedeutet in der vorliegenden Erfindung eine kontinuierliche Änderung der Zugaberate des Substrats zu dem Kulturtank ohne Unterbrechung. Infolgedessen ändert sich die spezifische Wachstumsrate μ der Wirtszelle gemäßigt von der Anfangsrate bis zu einer vorbestimmten Rate.
Die "spezifische Wachstumsrate μ der Wirtszelle" bedeutet in der vorliegenden Erfindung das Ausmaß der Vermehrung der Wirtszelle je Zeiteinheit (h) je Mengeneinheit Zelle, die im allgemeinen durch die folgende Formel ausgedrückt wird:
worin X die Zelldichte (g/l) ist, V die Menge Medium (l) ist, t die Kulturzeit (h) ist und ΔXV und ΔT das Ausmaß der Änderung von XV beziehungsweise t sind.
Die Veränderung der spezifischen Wachstumsrate μ der Wirtszelle von der anfänglichen Rate zu einer vorher bestimmten Rate in der vorliegenden Erfindung bedeutet die Veränderung der anfänglichen Rate des spezifischen Wachstums der Wirtszelle zu einer anderen, vorher bestimmten Rate während der absatzweisen Kultur mit Zufütterung. Die bevorzugt anfängliche Rate des spezifischen Wachstums, die vorher bestimmte spezifische Wachstumsrate und der Zeitpunkt der Veränderung (d.h. die Zeitspanne, während der die anfängliche spezifische Wachstumsrate aufrechterhalten wird) können aus der Beziehung zwischen der spezifischen Wachstumsrate μ und der spezifischen Produktionsrate ρ bestimmt werden [Hakko Kagaku Kaishi, Bd. 70, Nr. 5, S. 395–404 (1992)].
Die spezifische Produktionsrate ρ bedeutet hier die bei der Proteinherstellung je Zeiteinheit (h) und Mengeneinheit Zelle zunehmende Menge, die im allgemeinen durch die folgende Formel ausgedrückt wird:
worin P die Menge des produzierten Proteins ist (g/l), X die Zelldichte (g/l) ist, V die Menge des Mediums (l) ist, t die Kulturzeit (h) ist und ΔPV und ΔT das Ausmaß der Änderung von PV beziehungsweise t sind.
Die spezifische Wachstumsrate kann mehrmals geändert werden.
Die in der vorliegenden Erfindung anzuwendende Kulturtemperatur ist zur Vermehrung der Wirtszelle und der Herstellung des gewünschten Proteins besonders geeignet und schwankt in Abhängigkeit von der zu kultivierenden Wirtszelle. Wenn die Wirtszelle Escherichia coli ist, ist die Temperatur 20–46°C, vorzugsweise 36–38°C; wenn sie Hefe ist, ist die Temperatur etwa 20–35°C und vorzugsweise etwa 23–30°C und wenn sie Bacillus subtilis ist, ist die Temperatur 28–40°C, vorzugsweise 36–38°C.
Der pH des Mediums kann auf einen zur Vermehrung der Wirtszelle und Produktion des gewünschten Proteins geeigneten Wert eingestellt werden, der in Abhängigkeit von der zu kultivierenden Wirtszelle schwankt. Der Gehalt des Kulturtanks an gelöstem Sauerstoff wird entsprechend aus dem Bereich von 10–70% Sättigung ausgewählt.
Die vorliegende Erfindung wird unter Bezug auf Beispiele und Bezugsbeispiele, die nicht als begrenzend aufzufassen sind, genauer erläutert.
Beispiel 1
HSA wurde in einem Kultursystem hergestellt, das die Änderung der spezifischen Wachstumsrate μ der P/c/7/a-Hefe Stamm UHG42-3, die zur Exprimierung/Produktion von HSA befähigt ist, von der anfänglichen spezifischen Wachstumsrate μ' = 0,025 bis zur vorbestimmten spezifischen Wachstumsrate μ'' = 0,002 umfaßte, wobei die Herstellung des Stammes in der ungeprüften japanischen Patentveröffentlichung Nr. 29984/1992 beschrieben wird. Die Kultur umfaßte insbesondere die folgenden Schritte:
(1) Kulturverfahren
➀ Vorkultur
Der Stamm wurde in YPD-Brühe (2% Bactopepton, 1% Hefeextrakt, 2% Glucose) vorkultiviert. Genauer wurde 1 ml einer Zellsuspension (OD₅₄₀ ⇋ 10) aus in 20% Glycerin gefriergelagerter Pichia-Hefe UHG42-3 in einen 300-ml-Erlenmeyerkolben mit Schikanen eingeimpft, der 50 ml der YPD-Brühe enthielt, und 24 Stunden der Schüttelkultur bei 30°C unterzogen.
➁ Hauptkultur
Die Brühe wurde der ansatzweisen Kultur über eine vorbestimmte Zeit in einem Medium (primäres Medium) mit einer in Tabelle 1 dargestellten Zusammensetzung unterzogen und anschließend unter aufeinanderfolgender Methanolzugabe bei einer in 1 dargestellten Zuführrate kultiviert. Tabelle 1 Zusammensetzung des primären Mediums

Bestandteil Konzentration (/l)

Glycerin H₃PO₄ (85%) CaSO₄ 2H₂O K₂SO₄ MgSO₄ 7H₂O KOH 0.2 g/l Biotinlösung YTM-Lösung* 40.0 g 14.0 ml 0.6 g 9.5 g 7.8 g 2.6 g 1.6 ml 4.4 ml

Zusammensetzung der YTM-Lösung*

Bestandteil Konzentration (g/l)

FeSO₄ 2H₂O CuSO₄ 5H₂O MnSO₄ 4–5H₂O ZnSO₄ 7H₂O 65.0 6.0 4.11 20.0

H₂SO₄ 5.0 (ml)
Genauer wurde die Vorkulturflüssigkeit (34 ml) in einen 10-l-Becherglasfermenter (Biomaster Typ D, 10 l), der 1,7 l Ansatzmedium (primäres Medium) enthielt, eingeimpft und der Rührkultur unter Belüften unterzogen. Die Kulturtemperatur war 30°C. Die Rührgeschwindigkeit wurde während der Ansatzkultur konstant bei 900 Upm gehalten. Der pH wurde konstant auf 5,85 eingestellt.
Zum Entschäumen wurde bei Bedarf ein Entschäumer zugesetzt.
Wenn das Glycerin in dem primären Medium während der Ansatzkultur vollständig verbraucht war (24 h Kultur), wurde die Methanolzugabe begonnen.
Die Zugaberate von Methanol wurde gemäß der folgenden Formeln gesteuert, worin t den Verlauf der Zeit (h) nach Beginn der Methanolzugabe bedeutet: wenn 0 ≤ t < 72, F(t) = 3,712xexp(0,025 × t) (g/h) wenn 72 ≤ t < 92, F(t) = 22,456xexp[–0,025 × (t-72)] wenn 92 ≤ t, F(t) = 13,62xexp[0,002 × (t-92)]
Der zeitliche Verlauf der Änderungen der Zugaberate von Methanol wird in 1 dargestellt, wobei von etwa Stunde 24 bis Stunde 96 der Kultur durch eine durchgezogenen Linie dargestellt wird; von etwa Stunde 96 bis Stunde 116 der Kultur durch eine dünne, durchbrochene Linie dargestellt wird und etwa Stunde 116 bis Stunde 360 der Kultur durch eine durchgezogene Linie dargestellt wird.
Während der Kultur von etwa Stunde 24 (Anfangszeit der Methanolzugabe) bis etwa Stunde 96 wurde Methanol zugefügt, um die anfängliche spezifische Wachstumsrate μ' der Pichia-Hefe auf 0,025 einzustellen und die Zugaberate von Methanol wurde wie durch die dünne durchbrochene Linie in der Figur dargestellt einmal mäßig erniedrigt und Methanol wurde kontinuierlich zugefügt, um die vorbestimmte spezifische Wachstumsrate μ'' der Pichia-Hefe auf 0,002 einzustellen.
Als Kontrollversuch wurde ➀ eine Kultur in einem System, bei dem μ von 0,025 durch momentanes Ändern der Zugaberate zu 0,002 geändert wurde und (D eine Kultur in einem System ohne Ändern von μ ausgeführt.
Zum Ändern von μ in ➀ wurde die Zugaberate von Methanol in dem die momentane Änderung der Zugaberate von Methanol umfassenden System gemäß den folgenden Formeln gesteuert, wobei t den Verlauf der Zeit (h) nach Beginn der Methanolzugabe bedeutet und durch eine durchgezogene Linie und eine dicke durchgezogene Linie in 1 ausgedrückt wird: wenn 0 ≤ t < 72, F(t) = 3,712xexp(0,025 × t) (g/h) wenn 72 ≤ t, F(t) = 13,086xexp[0,002 × (t-72)]
Während der Kultur von etwa Stunde 24 (Anfangszeit der Methanolzugabe) bis etwa Stunde 96 wurde Methanol zugefügt, um die anfängliche spezifische Wachstumsrate μ' der Pichia-Hefe auf 0,025 einzustellen und zum Ändern der spezifischen Wachstumsrate μ'' der Pichia-Hefe auf 0,002 und die Methanolzugaberate wurde zum Steuern von μ auf 0,02 momentan geändert.
Die Methanolzugaberate in dem System ➁ ohne Änderung von μ wurde gemäß den folgenden Formeln gesteuert, worin t den Verlauf der Zeit (h) nach dem Beginn der Methanolzugabe bedeutet. Die Steuerung gemäß den folgenden Formeln ist das entsprechende Kulturverfahren in dem System ohne Ändern von μ. Das heißt, die Zufuhr wird begonnen, um μ auf 0,015 einzustellen, und wenn die Konzentration des gelösten Sauerstoffs (Konzentration des in der Kulturflüssigkeit gelösten Sauerstoffs) niedriger als ein bestimmter Wert wird, wird die Zufuhr mit konstanter Rate begonnen. Der zeitliche Verlauf der Änderungen der Zugaberate von Methanol zu diesem System wird in 1 durch eine durchbrochene Linie ausgedrückt: wenn 0 ≤ t < 127, F(t) = 2,176xexp(0,015 × t) + 1,632 (g/h) wenn 127 ≤ t, F(t) = 16,253
2 zeigt den Vergleich der Änderungen bei μ in dem System, das die kontinuierliche Änderung der Zugaberate von Methanol [vorliegende Erfindung, 2(a)] und die Änderungen von μ in dem die momentane Änderung der Zugaberate umfassenden System [Kontrolle ➀, 2(b)].

Die Ergebnisse jeder Kultur werden in 3 als zeitlicher Verlauf der Änderungen der Zelldichte (die vorliegende Erfindung und die Kontrolle ➀ und Tabelle 2 zeigen das Verhältnis der HSA-Produktion beim Abschluß der Kultur (die vorliegende Erfindung, Kontrolle ➀ und Kontrolle ➁). Tabelle 2

Kultursystem		HSA-Produktionsverhältnis
Änderung von μ	Änderung der Zugaberate	HSA-Produktionsverhältnis
keine (Kontrolle ➁)	–	100%
erfolgt	momentane Änderung (Kontrolle ➀)	107%
erfolgt	kontinuierliche Änderung vorliegende Erfindung	156%

Der Vergleich der nach 360 Stunden Kultur produzierten HSA-Menge zeigt, daß während die Kultur bessere Ergebnisse zeigte, wenn μ geändert wurde (die vor liegende Erfindung, Kontrolle ➀), als wenn nicht (Kontrolle ➁), die produzierte HSA-Menge in dem eine kontinuierliche Änderung der Zuführrate umfassenden System (die vorliegende Erfindung) größer (156%) war, als in dem Fall, wo die Zuführrate momentan geändert wurde (Kontrolle ➀, 107%), wodurch verdeutlicht wurde, daß die kontinuierliche Änderung der Zuführrate des Substrats (Methanol) bei dem Versuch, μ zu ändern, zu einer erhöhten Menge des gewünschten produzierten Proteins (HSA) führte.
Beispiel 2
Auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1, außer daß das in Tabelle 3 dargestellte Zuführmedium anstatt Methanol verwendet wurde, wurde der Stamm kultiviert.
Die Ergebnisse waren den in Beispiel 1 erhaltenen ähnlich. Tabelle 3 Fütterungsmediumzusammensetzung

Bestandteil Menge (ml)

YTM-Lösung Methanol 2 1000
Bezugsbeispiel 1: Messung der Zelldichte
Einer Kulturflüssigkeit wurden nach einer wahlfreien Kulturzeit Proben entnommen, mit destilliertem Wasser zum Einstellen des OD₅₄₀-Wertes bei der Bestimmung auf höchstens 0,3 verdünnt und der Bestimmung der Absorption bei 540 nm mittels eines Spektrophotometers (Typ UV 2200, Shimazu Corporation) unterzogen. Der erhaltene Wert wurde mit dem Verdünnungsverhältnis multipliziert und als Absorption der Kulturflüssigkeit verwendet. Unter Verwenden von OD₅₄₀/5,6 als Index wurde die Trockenzelldichte aus der erhaltenen Absorption berechnet.
Bezugsbeispiel 2: Messung der HSA-Konzentration
Einer Kulturflüssigkeit wurden nach einer wahlfreien Kulturzeit Proben entnommen und 5 Minuten bei 15000 Upm zentrifugiert. Der erhaltene Überstand wurde durch Ultrafree C3HV unter Ergeben einer klaren Lösung filtriert, die der Gelfiltration durch HPLC unter den folgenden Bedingungen unterzogen wurde.
Säule: TSKgel G3000SW_x1
Mobile Phase: 0,3 M NaCl, 50 mM Natriumphosphat, 0,1% NaN₃, pH 6,5
Durchflußgeschwindigkeit: 1,0 ml/min
Injektion: 50 μl
Nachweis: A₂₈₀, A₃₅₀ (zwei Wellenlängen)
Bezugsbeispiel 3: Messung der Methanolkonzentration
Einer Kulturflüssigkeit wurden nach einer wahlfreien Kulturzeit Proben entnommen und 5 Minuten bei 15000 Upm zentrifugiert. Der erhaltene Überstand wurde durch Ultrafree C3HV unter Ergeben einer klaren Lösung filtriert, die der quantitativen Analyse durch HPLC unter den folgenden Bedingungen unterzogen wurde.
Säule: Sugar-pak Ca (hergestellt von Waters)
Mobile Phase: 0,02% NaN₃
Säulentemperatur: 80°C
Injektion: 28 μl
Nachweis: Differentialrefraktometer
Industrielle Anwendbarkeit
Gemäß der Art und Weise der Änderung der Substratzugaberate zu dem Medium der vorliegenden Erfindung können zum Optimieren des absatzweisen Kultursystems mit Zufütterung optimale Modelle der spezifischen Wachstumsrate μ und der spezifischen Produktionsrate ρ verwirklicht werden. Als Folge der Durchfüh rung ist es möglich geworden, eine Kultur der Wirtszelle mit hoher Dichte durch die absatzweise Kultur mit Zufütterung auszuführen und das gewünschte Protein kann in kurzer Zeit wirkungsvoll produziert werden.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist daher als industrielles Herstellungsverfahren für Proteine wie etwa HSA, IGF, Prourokinase und UTI äußerst nützlich und weist einen hohen kommerziellen Wert auf.

Claims

Verfahren zum Herstellen eines gewünschten Proteins, das das Züchten einer zum Exprimieren des Proteins befähigten Wirtszelle durch eine absatzweise Kultur mit Zufütterung ("Fed-Batch-Kultur") umfaßt, wobei die spezifische Wachstumsrate der Wirtszelle durch kontinuierliches Ändern der Zugaberate eines Substrats, das das Wachstum der Wirtszelle steuert, von der Anfangs- bis zu einer vorbestimmten Rate verändert wird und wobei die Zeitspanne, während der die spezifische Anfangswachstumsrate aufrechterhalten wird, aus der Beziehung zwischen der spezifischen Wachstumsrate und der spezifischen Produktionsrate bestimmt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Wirtszelle das gewünschte Protein konstitutiv exprimiert.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Wirtszelle das gewünschte Protein exprimiert, wenn die Wirtszelle in Gegenwart eines Induktors gezüchtet wird.
Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Wirtszelle aus einer Hefe stammt.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die Wirtszelle aus einer methylotrophen Hefe stammt.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei die Wirtszelle aus Pichia-Hefe stammt.
Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Substrat, das das Wachstum der Wirtszelle steuert, eine Kohlenstoffenergiequelle ist.
Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei die Kohlenstoffenergiequelle aus Methanol, Glycerin, Sorbit, Glucose, Fructose, Galactose und Sucrose ausgewählt ist.
Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei die Wirtszelle aus Pichia-Hefe stammt und das Substrat, das das Wachstum der Wirtszelle steuert, aus Methanol, Glycerin und Kombinationen davon ausgewählt ist.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die Wirtszelle aus der Gattung Saccharomyces stammt und das Substrat, das das Wachstum der Wirtszelle steuert, aus Galactose, Sucrose und Kombinationen davon ausgewählt ist.
Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das gewünschte Protein zur Wirtszelle heterolog ist.
Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei das heterologe Protein Humanserumalbumin ist.