DE2747510A1

DE2747510A1 - Verfahren zur herstellung von coenzym q

Info

Publication number: DE2747510A1
Application number: DE19772747510
Authority: DE
Inventors: Keiichi Kagotani; Hajime Kawaharada; Norio Noda; Yoshio Shimada; Kiyoshi Watanabe
Original assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1976-10-26
Filing date: 1977-10-22
Publication date: 1978-04-27
Also published as: FR2369342B1; JPS5352690A; SE7712016L; CH632787A5; JPS5642912B2; FR2369342A1; US4194065A; SE433502B; GB1589172A

Description

51 150 - Dr. T

Verfahren zur Herstellung von Coenzym Q

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Coenzym Q (nachfolgend abgekürzt als " Co-Q " bezeichnet); sie betrifft insbesondere ein Verfahren zur vorteilhaften Herstellung von Co-Q aus Hefezellen, die aufwirksame Weise erzeugt werden und große Mengen Co-Q enthalten.

Bei Co-Q handelt es sich um ein Chinonderivat, das eine bedatsame Rolle in dem Terminalelektronentransportsystem von Organismen spielt. Die Struktur von Co-Q ist diejenige eines 2,3-Ditnethoxy-5-methyl-l,4-benzochinons mit einer Isoprenoid-Seitenkette in der 6-Stellung und es gibt verschiedene Homologe, wie z. B. Co-Qg bis Co-Q._, je nach der Anzahl der Isopreneinheiten in der Seitenkette. Co-Q kommt in verschiedenen Arten von Organismen vor und diejenigen, die in Hefen vorkommen, sind bekannt als Co-Q^ bis ^co~Qi₀· Ihre (physiologischen Aktivitäten und pharmakologischen Wirkungen wurden vor kurzem aufgeklärt.

808817/09*5

Co-Q wurde bisher hergestellt durch Extraktion aus Tieren und Pflanzen und teilweise durch chemische Synthese, die Kosten sind jedoch so hoch, daß die industrielle Herstellung in einem großtechnischen Maßstab bisher schwierig war, weshalb neuerdings Versuche durchgeführt werden, um Co-Q durch Fermentation herzustellen. Der Co-Q-Gehalt der nach der üblichen Methode der Kultivierung von Mikroorganismen gebildeten Zellen ist jedoch sehr gering. Es ist zwar ein Verfahren bekannt, bei dem eine Hefe des Genus Candida in einem Medium kultiviert wird, das n-Alkan enthält, unter Zugabe eines Vorläufers von Co-Q, wie z. B. ß-Hydroxybenzoesäure, um den Co-Q-Gehalt der Zellen zu erhöhen (japanisches Patent 673 128) ·, die bei diesem Verfahren gebildeten Mengen an Co-Q pro Kulturbrühe sind jedoch gering und die verwendbare Kohlenstoffquelle ist auf n-Alkan begrenzt.

Um die fermentative Herstellung von Co-Q zu ermöglichen, wurden verschiedene Hefearten, die Zusammensetzung der Medien und die Kultivinmgsbedingungen untersucht und es wurde ein Kultivierungsverfahren entwickelt, nach dem Hefezellen, die große Mengen an Co-Q enthalten,in hohen Konzentrationen erzeugt werden können.

Die Herstellung von Co-Q unter Verwendung von Mikroorganismen wurde sodann in bezug sowohl auf den Co-Q-Gehalt der Zellen als auch in bezug auf die Zellenproduktivität vom Standpunkt der Produktionskosten aus untersucht. Bei der Herstellung von Co-Q unter Verwendung von Hefen, wobei bei dem Kultivierungsverfahren Bedeutung auf eine Erhöhung des Co-Q-Gehaltes gelegt wurde, ging dies auf Kosten der Produktivität der Zellen, während andererseits die Anwendung des üblichen Verfahrens zur

809817/094S

wirksamen Herstellung von Zellen zu einer Abnahme des Co-Q-Gehaltes der Zellen führte.

Es wurde nun angenommen, daß die Aufrechterhaltung von stark oxydierenden Bedingungen während der Kultivierung feinen günstigen Einfluß auf die Bildung von Co-Q im Hinblick auf die bedeutsame Rolle des Co-Q in oxydativen Reaktionen in Organismen ausüben würde. Um den Oxydationszustand der Umgebung, in der die Zellen wachsen, aufrechtzuerhalten, muß die Konzentration an gelöstem Sauerstoff in einem Kulturmedium erhöht werden. Eine Erhöhung der Sauerstoffzufuhr oder eine Verringerung des Sauerstoffverbrauchs führt zu einer Erhöhung des gelösten Sauerstoffs in einem Kulturmedium.

Es wurdohun die Beziehung zwischen der Konzentration des gelösten Sauerstoffs in einem Kulturmedium (nachfolgend abgekürzt mit "D.O.") und sowohl dem Co-Q-Gehalt der Zellmals auch der Zellenproduktivität bei verschiedenen Hefen untersticht und dabei wurde gefunden, daß die unter hohen D.ÜTBedingungen erzeugten Hefezellen große Mengen an Co-Q enthielten.

Es sind bereits viele Verfahren zur wirksamen Erzeugung von Hefezellen bekannt, z. B. ein solches, bei dem die Belüftung und die Rührung (Bewegung) erhöht werden, um die Sauerstoffzuführungsgeschwindigkeit zu erhöhen, ein solches, bei dem der Partialdruck des Sauerstoffs in den Belüftungsgasen erhöht wird, ein solches, bei dem die Kultivierung unter erhöhten Drucken durchgeführt wird, und ein solches, bei dem die Kultivierungsvorrichtung verbessert ist. Die Erhöhung der Sauerstoffzufuhr zu der Kulturbrühe in den üblichen Kultivierungsverfahren zur Herstellung einer Zellmasse führt je-

809817/0948

Τ-

doch zu einer Erhöhung der Zellenproduktivität (nachfolgend abgekürzt als ",uJ?¹ bezeichnet - g der gebildeten Zellen pro Liter pro Stunde) und zu einer Erhöhung des Sauerstoffverbrauahs proportional zur Zunahme der /UX und wegen des geringeren D*0. ist es dann schwierig,eine für die Bildung von Co-Q geeignete oxidative Iftngebung aufrechtzuerhalten. Der Co-Q-Gehalt von HefezeIlen, die unter solchen Bedingungen wachsen, bei denen D.O.-Werte von nicht weniger als 2 ppm aufrechterhalten werden durch Zuführung ausreichender Mengen an Sauerstoff für das Wachstum der Zellen ungeachtet der Produktionskosten,ist manchmal höher alt diejenige von Hefezellen, die bei D.O.-Werten von nicht mehr als 1 ppm kultiviert worden sind. Durch eine Erhöhung des D.0.-Wertes wird aber nicht notwendigerweise der Co-Q-Gehalt der Hefezellen erhöht, der abhängt von den Hefearten, den Kultivierungsbedingungen (der Temperatur und dem pH-Wert) und der Zusammensetzung der Medien.

Bei der Kultivierung von Hefen unter Einstellung des D.O.Wertes auf nicht weniger als 2 ppm und Änderung der Kultivierungsbedingungen und der Zusammensetzung der Medien wurde nun die Beziehung zwischen dem Co-Q-Gehalt der Zellen, bezogen auf die Zellenkonzentration (nachfolgend mit "X*' bezeichnet), der spezifischen W.achstumsgeschwindigkeit (nachfolgend mit "yu" bezeichnet) und /UX bei jeder Kultivierungsdauer untersucht und dabei wurde gefunden, daß eine eindeutige Beziehung zwischen dem Co-Q-Gehalt der Zellen und M besteht. Der Co-Q-Gehalt der Zellen nimmt zu, wenn unter optimalen Kultivierungsbedingungen eine Hefe kultiviert wird, die eine maximale spezifische V.achetumsgeschwindigkeit von nicht weniger als 0,15 Stunden" aufweist, während die durch-

8Q9I17/Om

schnittliehe spezifische Wachsturnsgeschwindigkeit (M von Beginn bis zum Ende der Kultivierung) durch die KuItivierungsbedingungen und die Zusammensetzung der Medien gesteuert wird. Insbesondere dann, wenn die Hefe bei der durchschnittlichen spezifischen Wachs turns geschwindigkeit von nicht mehr als 0,1 Stunde kultiviert wurde, nahm der Co-Q-Gehalt der Zellen deutlich zu.

Die Beziehung zwischen dem Co-Q-Gehalt und dem D;0., λι und yuX sowie Verfahren zur Regulierung von λχ wurden weiter im Detail untersucht und dabei ist es gelungen, ein Kultivierungs· verfahren zu tntwickeln, das für die Co-Q-Herstellung günstig ist. Es wurde nämlich gefunden, daß Hefezellen, die Co-Q in großen Mengen enthalten, auf wirksame Weise gebildet werden, wenn man die durchschnittliche spezifische Wachsturnsgeschwindigkeit bei nicht mehr als 0,1 Stunden und den D.OrWert bei nicht weniger als 2 ppm hält,und dies führte zu der in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Erfindung.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur vorteilhaften Herstellung von Co-Q, bei dem eine Hefe, deren maximale spezifische Wachstumsgeschwindigkeit unter den optimalen Kultivierungsbedingungen nicht weniger als 0,15 Stunden beträgt, in einem Nährmedium kultiviert wird, in dem Hefe wachsen kann, wobei die Konzentration des gelösten Sauerstoffs in der Kulturbrühe bei einem Wert von nicht weniger als 2 ppm gehalten wird, während die durchschnittliche spezifische Wachstumsgeschwindigkeit während der gesamten Kultivierungsdauer so gesteuert (kontrolliert) wird, daß sie nicht mehr als 0,1 Stunde beträgt, und bei dem dann das Co-Q aus den dabei erhaltenen Hefezellen gewonnen wird.

809817/094$

Das erfindungsgemäße Verfahren ist unabhängig von den Arten der Co-Q-Homologen (Co-Qg - Co-Q₁₀), die in Hefezellen enthalten sind, anwendbar.

Zur wirksamen Herstellung von Hefezellen, wie zur SCP-Produktion (Herstellung von Einzelzellenprotein), wird der D.O.-Gehalt in der Regel auf etwa 0,5 ppm einreguliert, weil Sauerstoff keinen geschwindigkeitsbestimmenden Faktor für AiX bei einem D,O.-Gehalt von mehr als 0,5 ppm'darstellt. Das erfindungsgemäße Kultivierungsverfahren, bei dem /U reguliert wird, während der D.O.-Gehalt bei hohen Konzentrationen von nicht weniger als 2 ppm gehalten \ird, kann als ein neues charakteristisches Verfahren zur Herstellung von Co-Q angesehen werden.

Bei der Kultivierung von Hefezellen in einem üblichen Fermentier-Behälter unter vermindertem/u nimmt der Co-Q-Gehalt der Zellen zu, die Zunahme der Produktivität von Co-Q ist jedoch nicht so hoch wegen des niedrigen *uX. Das erfindungsgemäße Kultivierungsverfahren ist vorteilhaft für die Co-Q-Herstellung durch Fermentation, mit dessen Hilfe es möglich ist, die Nachteile der konventionellen Verfahren zu beseitigen. Bei diesem Verfahren können sowohl Übliche als auch speziell konstruierte Fermentationsbehälter verwendet werden.

Durch Regulierung von Ai und D.O. während der Kultivierung können Zellen, die große Mengen an Co-Q enthalten, auf wirksame und beständige (konstante) Weise erzeugt werden.

Obgleich die Herabsetzung von Ai manchmal zu einer Abnahme von AiX führt, ist es möglich, Zellen mit einem hohen Co-Q-Gehalt

zu erzeugen, ohne daß eine Abnahme an AiX auftritt, durch KuI-

809817/Om

tivierung bei hohen Konzentrationen (entweder durch diskontinuierliche oder kontinuierliche Kultivierung), bei denen eine Abnahme des ,u durch eine Zunahme des X ausgeglichen wird. Als brauchbares erfiddungsgemäßes Verfahren kann eine Belüftung mit Sauerstoffgas und die Kultivierung unter erhöhten Drucken angewendet werden, die wegen ihrer hohen Kosten im allgemeinen nicht angewendet werden*

Bei der Hefe, die erfindungsgemäß verwendet werden kann, kann es sich um irgendeine! beliebigen Hefetyp handeln, der Co-Q enthält und dessen maximale spezifische Wachsturnsgeschwindigkeit (bzw.-rate) unter den optimalen Kultivierungsbedingungen nicht weniger als 0,15, Stunden beträgt. Insbesondere kann mit Voreil! eine Hefe verwendet werden, die zu dem Genus Rhodotorula, Cryptococcus, Candida, Trichosporon oder Totülopsis gehört. Als Stämme können z. B. Rhodotorula mucilaginosa AHU 3946, Cryptococcus Albiduo AHU 3922, Candida utilis IAM 4200, Trichosporon fermentans ATCC 10675 und Torulopsis magnoliae IFO 0705 verwendet werden.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren können übliche Nährmedien verwendet werden. Es kann irgendeine beliebige Kohlenstoffquelle, die von der zu verwendenden Hefe assimiliert werden kann, eingesetzt werden. Zu Beispielen für geeignete Kohlenstoff quellen gehören Zucker, wie Glukose, Saccharose, Fructose, Stärkehydrolysat, Molassen, Sulfit-Abfallauge oder die Flüssigkeit, die bei der Holzverzuckerung erhalten wird, organische Säuren, wie Essigsäure, Fumarsäure, Citronensäure, Maleinsäure oder Milchsäure, Alkoholeywie Methanol, Äthanol oder Propanol, und außerdem flüssige Kohlenwasserstoffe, Fette und öle, Glycerin,

809817/0945

Molke und landwirtschaftliche Abfallprodukte, die von der zu verwendenden Hefe ausgenutzt werden können. Als Stickstoffquellen werden anorganische oder organische Verbindungen, wie Aimnoniumsulfat, Ammoniumchlor id, Ammoniumphosphat, Ammoniakwasser, Harnstoff, Aminosäuren, Pepton und das Hydrolyat von Sojabohnenprotein, verwendet· Als Mineralsalze können die Salze von (..Kalium, Magnesium,Phosphorsäure, Zink, Eisen, Mangan, Kupfer und Calcium verwendet v/erden» Erforderlichenfalls können auch andere Metallsalze in geringeren Mengen, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Maisquellwasser, Vitamine und von Nucleinsäuren abgeleitete Verbindungen den Medien zugesetzt werden·

Die Kultivierung'wird aerob auf diskontinuierliche (ansatzweise durchgeführte) oder kontinuierliche Weise bei beliebigem pH-Wert und bei einer Temperatur durchgeführt, welche das Wachstum der Hefe erlaubt, d. h. bei pH 2 bis 8 und einer Temperatur von 20 bis 45 C. Sauerstoff wird zugeführt durch Belüftung mit Luft, Sauerstoffgas oder Mischungen davon. Als Kultivierungsvorrichtung können die üblicherweise verwendeten Kultivierungsvorrichtungen, wie z. B. solche vom Belüftungs-Rühr- oder Luft-Förder-Typ oder speziell konstruierte Vorrichtungen verwendet werden·

Zur Steuerung des D. 0.-Gehaltes während der Kultivierung können Belüftungsverfahren, wie z. B. die Änderung des Sauerstoff partialdruckes durch Belüftung mit Luft, Sauerstoff oder Mischungen davon, die Änderung der Kontaktfläche oder der Kontaktzeit zwischen den Belüftungsgasen und der Kulturflüssigkeit, die Kultivierung unter erhöhten Drucken oder eine Kombination der vorstehend genannten Verfahren angewendet werden.

8Q9817/UÖ45

_mJr-_m

Die spezifische Wachstumsgeschwindigkeit (-rate) ( λχ) wird nach der folgenden Formel er recline t durch Bestimmung der Zellenkonzentration bei jeder Kultivierungszeit:

Bei.der diskontinuierlichen Kultivierung:

log_l0(~·) χ 2.302

X ■ die Anfangs-Zellenkonzentration ο

X ■ die Zellenkonzentration nach t Stunden t «■ Kultivierungszeit (Stunden)

Bei der kontinuierlichen Kultivierung: Zellenmasse' im Überlauf während t Stunden

_u»

Zellenmasse in einem Gefäß χ t

t ■» die Dauer der kontinuierlichen Kultivierung (Stunden)

Die durchschnittliche spezifische Wachstumsgeschwindigkeit ist definiert als der /U-Wert, der von Beginn bis zum Ende der Kultivierung im Falle der diskontinuierlichen Kultivierung errechnet wird, oder als der /U-Wert vom Beginn bis zum Ende der kontinuierlichen Kultivierung im Falle der kontinuierlichen Kultivierung.

Zur Steuerung (Kontrolle) von λχ kann jedes beliebige Verfahren angewendet werden, dessen Bedingungen die Bildung von Co-Q nicht hemmen und dennoch innerhalb der Grenzwerte für das Wachstum der Hefezellen liegen. So kann beispielsweise die Kontrolle der Kultivierungsbedingungen, wie z. B. der Temperatur und de« pH-Wertes, die Kontrolle der Zugabemenge an Kohlenstoff, Stickstoff und Mineralquellen und die Kontrolle der

809817/09*5

Menge der Wachstumsfaktoren, wie ζ. B. der Vitamine, Aminosäuren und von Nudeln -Säure abgeleiteten Verbindungen, als Maßnahme zur Kontrolle von ,u angewendet werden. Außerdem können zur Kontrolle von Ai Chemikalien, welche das Wachstum der Zellen vermindern und dennoch die Bildung von Co-Q nicht hemmen, wie z. B. organische Säuren, wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Caprylsäure, Pelargonsäure, Caprinsäure, Citronensäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Fumarsäure und Salze davon,und Alkohole, wie Methanol, Äthanol, Propanol, Amylalkohol und Octylalkohol, zugesetzt werden. Die vorstehend beschriebenen Verfahren zur Kontrolle von Ai, d. h. die Kontrolle der KuItivierungstemperatur, des pH-Wertes und der Zusammensetzung des Mediums sowie der Zugabe der wachstumshemmenden Chemikalien)können unabhängig voneinander oder in Kombination miteinander angewendet werden. Die W.ahl der Verfahren zur Kontrolle von Ai hängt von den Hefearten, der Kohlenstoffquelle und dgl. ab, die Kontrolle durch die Temperatur und den pH-Wert ist jedoch bevorzugt. Die Kontrolle von λι kann zu jedem beliebigen Zeitpunkt der Kultivierung und für jede beliebige Zeitdauer durchgeführt werden. Während der Kultivierung kann Ai bis zu jedem beliebigen Wert variiert werden, die Einstellung von Ai auf einen Wert von nicht mehr als 0,1 Stunde liefert jedoch ein gutes Ergebnis. In jedem Falle darf die durchschnittliche spezifische Wachsturnsgeschwin· digkeit während der gesamten Kultivierungsdauer nicht mehr als 0,1 Stunde" betragen·

Die Endzellenkonzentration kann irgendeinen beliebigen Wert haben, die Kultivierung bei hohen Zellenkonzentrationen von nicht weniger als 20 g trockenen Zellen pro Liter ist jedoch wegen der Zunahme des AiX. bevorzugt·

809817/0945

Der Co-Q-Gehalt der so erhaltenen Hefezellen ist hoch und die Kosten für die Extraktion und Reinigung pro Gewichtseinheit Co-Q können stark vermindert werden.

Für die Isolierung von Co-Q aus den nach dem erfindungsgeinäßen Verfahren erzeugten Hefezellen können konventionelle Verfahren angewendet werden. So können die Hefezellen beispielsweise mit methanolischem Alkali in Gegenwart von .Pyrogallol verseift und mit organischen Lösungsmitteln, swie Petroläther, Chloroform und dgl., extrahiert werden. Eine weitere Reinigung wird durchgeführt durch Adsorptionschromatographie an Aluminiumoxid, Silicagel, Florisil und dgl.,und durch Umkristallisation können reine Kristalle erhalten werden. Die dabei erhaltenen Kristalle sind vollständig identisch mit dem nach dem konventionellen Kultivierungsverfahren erhaltenen Co-Q im Hinblick auf die physikalischen und chemischen Eigenschaften, wie z. B. dem Schmelzpunkt, die UV-,IR- und Massenspektren.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.

Beispiel 1

Rhodotorula mucilaginosa AHU 3946 wurde in einem 20 L-Medium, das pro Liter enthielt 4 g KH₂PO₄, 1 g (NH₄)₂S0₄, 1 g MgSO₄. 7H₂O, 10 mg ZnSO₄.7H₂O, 100 mg FeSO₄.7H₂O, 1 g Hefeextrakt und 2 g Äthanol, bei 30 C und pH 5,0 unter Rühren mit 1000 UpM und unter Belüftung mit 1 wm (Belüftung mit Luft als Standardbedingung) in einer Kolben-Fermentier-Einrichtung kultiviert, bis die Zellenkonzentration 20 g (Trockengewicht)

809817/0945

■4*

pro Liter erreicht hatte.

Während der Kultivierung wurde der pH-Wert mit Ammoniakwasser eingestellt und die Äthanol-Konzentration wurde durch Zuführung bei einen Wert von weniger als 1 g/1 gehalten. Die D.O.Konzentration wurde unter Verwendung des Beckman-D.O.-Meters gemessen und durch Belüftung mit einem Gemisch aus Luft, Sauerstöffgas und Stickstoffgas in einem geeigneten Verhältnis auf einen konstanten Wert einreguliert. Die spezifische Wachstumsgeschwindigkeit (^u) wurde bestimmt durch Messung der Zellenkonzentration bei jeder Kultivierungszeit (Stunde) und sie wurde kontrolliert durch Variieren der Temperatur innerhalb eines Bereiches yon 23 bis 33⁰C und des pH-Wertes innerhalb eines Bereiches von 3 bis 5, so daß der durchschnittliche ^u-Wert während der gesamten Kultivierungsperiode sich dem gewünschten Wert näherte. Die Beziehung zwischen D.O., der durchschnittlichen spezifischen Wachstumsgeschwindigkeit und dem Co-Q-Gehalt ist in der folgenden Tabelle I angegeben.

Tabelle I Co-Q-Gehalt der

D.O.

nicht

(ppm) kontrolliert

0-1 1-22-4 4-7

0.13 0.08 0.04

0.18 0.10 0.07

0.30

0.	25	0.	28	0	.38	0.	35
0.	31	0.	40	0	.91	0.	85
0.	41	0.	45	1	.15	1.	28

* kultiviert unter Standardbedingungen t D.O.: 7 bis 9 ppm am Beginn und 0 bis 1,5 ppm am Ende.

809617/0946

Die Ausbeuten an gebildetem Co-Q, bezogen auf die äthanolverbrauchten (YCo-Q)-Mengen an Co-Q, die pro Liter der Kulturbrühe gebildet wurden,und die Mengen der aus den Zellen erhaltenen Kristalle sind in der folgenden Tabelle II angegeben. '

Tabelle II .

D.O. (ppm)	/^U	1	0.15	, YCo-Q ^l) (mg/g)	gebildetesCo-Q *(mg/I)■*	Kristall-
	nicht kontrolliert^. 17	4	, 0.10	0.17	6.0	3.7
0 -	7	0.06	0.13	5.0	3.0
2 -	0.41	18.2	11.5
4 -	0.51	25.6	14.7

Durch Schmelzpunkt, UV- und Massenspektrum und Papierchromatogramm wurde bestätigt, daß es sich bei den Kristallen um Co-Q₁ handelte.

Beispiel 2

Cryptococcus albidus AHU 3922 wurde in einem 20 Liter-Medium, das pro Liter 30 g Palmitinsäure, 4 g KH₂PO₄, 1 g (UH₄)₂S0₄, 2 g MgSO₄.7H₂O, 10 mg ZnSO₄.7H₂O, 100 mg FeSO₄.7H₂O und 2 g Mais· " quel!wasser enthielt (der pH-Wert wurde auf 5 eingestellt), auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 angegeben kultiviert. Die folgende Tabelle III zeigt den D.O., das durchschnittliche ^u und den Co-Q-Gehalt der Zellen. Die Ausbeute für die Extraktion und Reinigung von Co-Q betrug 0,57 bis 0,62. Es wurde bestätigt, daß es sich bei den dabei erhaltenen Kristallen um

809817/0945

Co-Q₁₀ handelte.

Tabelle III

Co-Q-Gehalt der Zelle (mg/g)

durch-

D.O.

schnittl. /u (Shd-

nicht kon-*
trolliert

1-2 2-4 4-7

0.	1 -	0.	15	0	.15	0.	18	0.	21	.25	.20
0.	07	- 0	.09		-	0.	23	0.	32	.55	.61
0.	03	- 0	.05		-	0.	25	0.	30	.73	.66

* kultiviert unter Standardbedingungen: der D.O.-Wert betrug am Beginn7bis 9 ppm und am Ende 0 bis 1 ppm

Beispiel 3

Candida utilis IAM 4200 wurde unter Anwendung eines kontinuierlichen Kultivierungsverfahrens in einem 10 1-Medium, das pro Liter 3 g H₃PO₄, 2 g KCl, 2 g MgSO₄.7H₂O, 2 g (NH₄^SO₄, 30 mg ZnSO₄.7H₂O, 100 mg FeSO₄.7H₂O, 2 g Maisquellwasser, 2 mg Thiaminhydrochlorid und 3 g Essigsäure enthielt (der pH-Wert wurde mit Ammoniakwasser auf 6,5 eingestellt)»bei 33 C und pH 6,5 unter Rühren mit 700 UpM und unter Belüftung mit 1 wm (Belüftung mit Luft als Standardbedingung) kultiviert. Der pH-Wert während der Kultivierung wurde mit H₃SO₄ oder NaOH eingestellt und es wurde CH₃COONH₄ zugeführt, um die Konzentration bei 1 bis 3 g pro Liter als feie Säure zu halten. Der D.O.Wert während der Kultivierung wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 eingestellt (kontrolliert). Das ,u wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 in der Vorkultur kontrolliert und in der kontinuierlichen Kultur wurde /U errechnet

809817/0945

aus dem erforderlichen Volumen der Kulturbrühe, das aus dem Gefäß abgezogen wurde, um den Gleichgewichtszustand der Zellenkonzentration in der Kulturbrühe aufrechtzuerhalten, und es wurde gesteuert (kontrolliert) durch Variieren der Kultivierungstemperatur innerhalb eines Bereiches von 25 bis 35°C und des pH-Wertes innerhalb eines Bereiches von 5 bis 7. Die Ergebnisse der kontinuierlichen 96-stündigen Kultivierung sind in der folgenden Tabelle IV angegeben. Die Zellenausbeuten, bezogen auf verbrauchte Essigsäure,betrugen in jedem Falle 0,35 bis 0,41. Die Ausbeuten an Co-Q-Kristallen, die aus den Zellen erhalten wurden,betrugen 0,61 bis 0,70. Es wurde bestätigt, daß es sich bei den Kristallen um Co-Q₇ handelte.

Tabele IV

D.o. durchschnitt1,ZeIlenkon-_o ^C°~?~ (ppm) /^U(Std.- ^l) - zentration^Gehalt

Zellenpro- Co-Q-Produktivität duktivität ig/VStd.) img/V Std).

nicht kon trolliert	1	0.25	1.7	0.37
0 -	2	0.08	3.5	0.52
0.-	4	0.10	4.8	0.60
2 -	4	0.22	3.2	0.31
2 -	4	0.09	4.5	1.05
2 -	0.05	6.5	1.21

4.3

2.8
4.8
7.0
4.1
3.3

1.6

1.5 2.9 2.2 4.3 4.0

* kultiviert unter Standardbedingungen

809817/0945

Beispiel 4

Torulopsis magnoliae IFO 0705 oder Trichosporon fermentans ATCC 10657 wurde in einem 10 1-Medium, das pro Liter enthielt 4 g KH₂PO₄; 3 g (NH₄)₂SO₄, 2g MgS0₄.7H₂0, 20 mg ZnSO₄.7H₂O, 50 mg FeSO₄.7H„0, 1 g Hefeextrakt und 1 g Maisquellwasser (der pH-Wert wurde auf 5 eingestellt) sowie Glukose oder Glycerin als Kohlenstoffquelle,bei 33°C und einem pH-Wert.von 2 bis 6 unter Rühren mit 500 UpM und unter Belüftung mit 0,1 bis 2,0 wm (pH 5, 1 wm Belüftung mit Luft ist die Standardbedingung), so lange kultiviert, bis die Zellenkonzentration 30 g/Liter erreicht hatte. Intermittierend wurde eine Kohlenstoffquelle in einer Menge von 10 g/l jeweils so eingeführt, daß die Zellen nicht verkümmerten. Die Kontrolle des D.O.-Wertes wurden nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren durchgeführt. Die spezifische Wachstumsgeschwindigkeit wurde reguliert durch Zugabe eines Wachstumshemmittels und durch Variieren des pH-Wertes. Der D.O.-Wert, die durchschnittliche Wachstumsgeschwindigkeit und der Co-Q-Gehalt sind in der folgenden Tabelle V angegeben. Bei den aus den Zellen isolierten Kristallen von Co-Q handelte es sich um Co-Qg.

809817/0945

Tabelle V

Co-Q-Gehalt dor Zellen(ⁿⁱ'J/g)

Stamm

Torulopsis
magnoliae

Tricliosporon fermcntnns

Kohlenstoffquelie

^ose

Glycerin

Wachs- durchs ^D·⁰· tumshemin- schniti
mittel ,η (Std."^J)

nicht, i* nicht. ]*

kon- 2-4 kontrolliert trolliert

0.15 - 0.31 0.04 - 0.10

0.43
0.58

0.40 1.05

0.38 0.41

0.50 0.95

Methanol *² O.'l3 - 0.20 0.5 - 1.0% 0.05 - 0.09

0.39
0.60

0.55 1.21

0.43 0.40

0.73 1.15

Caprylsäure	0	.12	- 0.	18	0.	42	0.	51	0.	32	0	.41
. 0.5g/£	0	.03	- 0.	07	0.	55	1.	08	0.	41	i	.30

Ameisen	*2	*	0.	15 -	0.	25	0.	33	0.	61	0	.41	0.	38
säure
1 - 2g/£	0.	06 -	0.	10	0.	33	1.	35.	0	.50	1.	25

*1 kultiviert unter Standardbedingungen:der D.0_TWert betrug 8 bis 10 ppm am Beginn und 0 bis 1 ppm am Ende
*2

die Konzentration wurde durch Ergänzung konstant gehalten.

COPY

Die oben erwähnten "optimalen Kultiv.1erim£Gbeaingur>£en^!' schwanken in gewissem Ausmaß in Abhängigkeit von der Art der Hofe« Im allgemeinen liegen die optimalen KultivrbedJngungon Jedoch unter den folgenden Verhältnissen vor: Als Kultivierungsgefäß wird eine Kolben-Ferment j er--Einricb~ tung (jar fermentor) verv/endet, v/ie er auch im Beispiel 1 eingesetzt vu.rde. Daß Medium enthält 20 g/l Glucose, 10 rj/3. Pepton und 5 g/l Hefeextrakt. Die Temperatur liegt bei 25 bis 35°C. Er, wird mit einer Geschwindigkeit von 700 UpM gerührt unter einer Belüftung mit 2 wm (Volumentoile Luft pro Volumenteile der Kulturbrüho pro Minute).

808817/0945

COPY

Claims

2747ρΊ0 51 150 - Dr. T Anmelder: KANEGAFUCHI KAGAKU KOGYO KABUSHIKI KAISHA No. 3, 3-chome, Nakanoshlma, Kita-ku, Osaka-Japan Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von Coenzym Q₁ dadurch gekennzeichnet, daß man eine Hefe, deren maximale spezifische Uachstumsgeschwiridigkeit unter optimalen Kultivierungsbedingungen nicht wen%r als 0,15 Stunden beträgt, in einem Nährmedium, in dem die Hefe wachsen kann, aerob kultiviert, wobei man die Konzentration des gelösten Sauerstoffs in der Kulturbrühe bei nicht weniger alc 2 ppm hält und die durchschnittliche spezifische Wachstumsgeschwindigkeit während der gesamten Kultivierungsdauer so kontrolliert, daß sie nicht mehr als 0,1 Stunde" beträgt, und das Coenzyn Q aus den dabei erhaltenen Hefezellen abtrennt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Hefe verwendet, die zu einem Genus gehört, der ausgewählt wird aus der Gruppe Rhodotorula, Cryptococcus, Candida, Trichosporon und Torulopsis.

809817/0845

ORIGINAL INSPECTED

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kohlenstoff quelle in dem Nährroediuni einen Vertreter verwendet, der ausgewählt wird aus der Gruppe der Zucker, der organischen Säuren, der Alkohole, der flüssigen Kohlenwasserstoffe, der Fette und Öle, Glycerin, Molke und der landwirtschaftlichen Abfälle.

A. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die aerobe Kultivierung durchführt, durch Belüftung mit einem Gas, das ausgewählt wird aus der Gruppe Luft, Sauerstoffgas und Mischungen davon»

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis '4,dadurch gekennzeichnet, daß main eine Fermentiereinrichtung verwendet, die ausgewählt wird aus der Gruppe der Fermentiereinrichtungen vom Luft-Rührungs-Typ und vom Luft-Förder-Typ.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die spezifische Wachstumsgeschwindigkeit der Hefe steuert durch Kultivierung bei hohen Konzentrationen

7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die spezifischeWachstumsgeschwindigkeit der Hefe steuert durch Kontrolle der Kultivierungstemperatur, durch Kontrolle des pH-Wertes des Mediums, durch Kontrolle der Menge der mineralischen Quellen in dem Medium und/oder durch Kontrolle der Menge der Wachstumsfaktoren in dem Medium,

8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die spezifische Wachstumsgeschwindigkeit

809817/0945

der Hefe steuert durch Zugabe eines Vertreters, der ausgewählt wird aus der Gruppe der organischen Säuren» der Salze davon und der Alkohole.

9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultivierung unter Anwendung eines Verfahrens durchführt, das ausgewählt wird aus der Gruppe der diskontinuierlichen (ansatzweise durchgeführten) oder der kontinuierliehen Verfahren.

10. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man als Coenzym Q das Coenzym Qc-Q-J₀ gewinnt.

809817/0945