DE3427494A1 - Verbessertes verfahren zur herstellung von l-aminosaeuren aus (alpha)-ketosaeuren durch chargenweise gespeiste fermentation - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft allgemein die biologische Herstellung von L-Aminosäuren. In der gleichzeitig eingereichten deutschen Patentanmeldung "Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren aus a-Ketosäuren" mit der Priorität der US-Anmeldung Serial Nr. 520 632 vom 5. 8. 1983 (Anwaltsakte 20665) ist offenbart, daß eine L-Aminosäure aus der korrespondierenden ot-Ketosäure als Ausgangsverbindung hergestellt werden kann, indem man die a-Ketosäure einer aktiven, in der logarithmischen Wachstumsphase befindlichen Mikroorganismenkultur in einem Nährmedium zuführt. Eine Vielzahl von Mikroorganismen sind in der Lage, a-Ketosäuren biologisch in L-Aminosäuren umzuwandeln.

Es hat sich gezeigt, daß die optimale Zuführungsgeschwindigkeit für die α-Ketosäuren direkt mit pH-Änderungen in der Kultur korreliert werden kann, die durch Änderungen in der Wachstumsrate der Kultur verursacht werden. Eine derartige Zuführung der α-Ketosäuren kann eine höheren Umwandlungsgrad der Ausgangsverbindung in die L-Aminosäure zur Folge haben. Ferner regelt das erfindungsgemäße Verfahren das Kulturmedium in einer Weise, daß durch optimale Umgebungsbedingungen für die Mikroorganismen eine Fortsetzung der logarithmischen Wachstumsphase erreicht wird.

Es ist bekannt, daß α-Ketosäuren enzymatisch in ihre korrespondierenden L-Aminosäuren umgewandelt werden können. Beispielsweise beschreibt die US-PS 2 749 279 ein

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Verfahren, bei dem a-Ketoglutarsäure und Ammoniak mit einem biologischen Enzym-Coenzym-Katalysator behandelt wenden. Geeignete biologische Katalysatoren können aus tierischem Gewebe, aus schnell wachsenden Pflanzen oder aus Bakterien als Autolysate oder Zellkulturextrakte gewonnen werden. Die US-PS 4 3Θ4 858 beschreibt ebenfalls die Umwandlung von wasserlöslichen a-Ketocarbonsäuren in die korrespondierenden Aminosäuren in Gegenwart einer substratspezifischen Dehydrogenase, Ammoniumionen und Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD+/NADH). Die Überführung von a-Ketosäuren in Aminosäuren unter Verwendung von Suspensionen ruhender Zellen wurde von Yamada et al. "The Production of Amino Acids", Seiten 440-446 (1972) beschrieben.

Zahlreiche Mikroorganismen sind fähig, a-Ketosäuren biologisch in L-Aminosäuren umzuwandeln. Bei dem Verfahren der oben genannten parallelen Patentanmeldung, wird das in diesen Mikroorganismen gefundene gekoppelte Enzymsystem verwendet, um die Transaminierungsreaktion zu katalysieren, im Verlauf derer die a-Ketosäure in die L-Aminosäure umgewandelt wird. Es hat sich gezeigt, daß durch die derartige Verwendung der aktiv wachsenden Kultur die Reaktion im wesentlichen bis zum Ende katalysiert wird und daß eine kontinuierliche Rückführung des Aminogruppendonators (L-Glutamat) und des Coenzyms (NADPH oder NADH) stattfindet. Die L-Aminosäure kann aus der Kulturbrühe gewonnen werden.

Das beschriebene Verfahren wurde erfindungsgemäß verbessert, indem die Rate der Beschickung mit a-Ketosäure an die Wachstumsrate der Kultur gekoppelt wurde. Es wurden Mikroorganismen identifiziert, die in der aktiven Wachstumsphase verschiedene Säuren bilden. Das daraus resultierende Absinken des pH-Wertes in der Kulturbrühe

dient als natürliches Regulativ für das Zellwachstum und beeinflußt das Wachstum und den Metabolismus negativ, wenn er nicht kontrolliert wird. Die erfindungsgemäße Verbesserung schließt die Zugabe einer basischen Lösung der a-Ketosäuren in solchen Mengen ein, daß das natürlich auftretende Absinken des pH-Wertes korrigiert wird. Demgemäß wird die a-Ketosäure als Ausgangsverbindung der Kultur mit einer Rate zugeführt, die der Wachstumsrate etwa proportional ist. Gleichzeitig ist diese Rate etwa dem Maß proportional, in dem das gekoppelte Enyzmsystem der wachsenden Mikroorganismen für die biologische Umwandlung zur Verfugung steht. Es hat sich ferner gezeigt, daß durch die Kontrolle der pH-Obergrenzen der Kulturbrühe optimale Umgebungsbedingungen für aktiven Metabolismus aufrechterhalten werden.

Bei diesem erfindungsgemäß verbesserten Verfahren soll der Zeitpunkt und die Rate der a-Ketosäuren-Zugabe durch die Kultur selbst reguliert werden. 20

Damit im Zusammenhang steht die Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zu schaffen, bei dem optimale Umgebungsbedingungen für das Wachstum und den Metabolismus der Mikroorganismen aufrechterhalten werden.

Es ist ferner Aufgabe der Erfindung, bei der biologischen Umwandlung einen Verfahrensschritt einzusparen, indem man der Kultur eine a-Ketosäurelösung zuführt, die nicht zuvor neutralisiert werden muß.

Eine damit im Zusammenhang stehende Aufgabe ist es, durch Weglassen dieses Neutralisationsschrittes den möglichen Verlust aktiver Bestandteile zu vermeiden.

Es ist fenner vorgesehen, das erfindungsgemäße Verfahren mit einen Vielzahl von Mikroorganismen und zun Herstellung einen Vielzahl von L-Aminosäuren zu verwenden.
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Es ist ferner Aufgabe den Enfindung ein Venfahnen zu schaffen, bei dem ein einzelner Mikroonganismenstamm ausneichende Mengen sämtlichen enfonderliehen Enzyme zun Umwandlung einen bestimmten ot-Ketosäure in die L-Aminosäune pnoduzient.

Es ist fenner Aufgabe den Enfindung für einen hohen Umwandlungsgnad den a-Ketosäuren in L-Aminosäunen innerhalb einer kurzen Reaktionszeit zu sorgen.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es', ein Verfahren zu schaffen, bei dem eine hohe L-Aminosäure-Ausbeute in Gegenwart einer niedrigen Konzentration des Aminogruppendonators erhalten wird.

Bakteriumwachstum kann allgemein in drei aufeinanderfolgende Phasen eingeteilt werden. Die lag-Phase ist ein Zeitraum, innerhalb dessen die Mikroorganismenzahl in der Kultur wenig oder gar nicht ansteigt. In der logarithmischen oder exponentiellen Wachstumsphase steigt die Zellzahl exponentiell in Abhängigkeit von der Zeit. In der stationären Phase findet wenig oder kein Zellwachstum oder Zellteilung statt.

Es wurde gefunden, daß die mikrobiologische Transaminierung einer a-Ketosaure in die L-Aminosäuren mit gesteigerter Wirksamkeit durchgeführt werden kann, wenn man die σ-Ketosäune einer geeigneten Mikroorganismenkultur in der logarithmischen Wachstumsphase zuführt.

Das Verfahren macht von einem in den wachsenden Mikro-

Organismen vorhandenen gekoppelten Enzymsystem Gebrauch, um die Transaminierungsreaktion vollständig ablaufen zu lassen.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird das biologische Transaminierungs-Verfahren verbessert, indem man die Zuführungsrate der a-Ketosäure so wählt, daß sie direkt mit der Säureproduktionsrate übereinstimmt, die ihrerseits im wesentlichen mit der Wachstumsrate der Kultur übereinstimmt. Die a-Ketosäure wird der Kultur als wäßrige basische Lösung zugeführt. Die Base wird in solchen Mengen zugegeben, daß die von den Mikroorganismen während der Wachstumsphase gebildeten Säuren kompensiert werden. Als Ergebnis wird der pH-Wert des Kulturmediums im wesentlichen in einem "steady state" gehalten. Dieses Verfahren der "Beschickung nach Bedarf" (demand feeding) nutzt die gesteigerte metabolische Leistungsfähigkeit der Kultur bei Eintreten in die logarithmische Wachstumsphase. Ferner schafft der stabile pH-Wert eine optimierte Umgebung für erhöhtes Bakterienwachstum und -metabolismus. Nach vollständiger Fermentation kann das L-Aminosäure-Produkt aus der Kulturbrühe gewonnen werden.

Bei der biologischen Umwandlung der α-Ketosäure in die L-Aminosäure handelt es sich um eine enzymatische Transaminierungsreaktion. Die biologische Umwandlung wird durch ein gekoppeltes Enzym-Coenzym-System vermittelt, das eine Transaminase, eine Glutamatdehydrogenase, das Coenzym NADP+/NADPH (oder NAD+/NADH) und eine Dehydrogenase umfaßt. Alternativ kann letztere Komponente des Enzymsystems eine Hydrogenase für die Rückführung des NADP+ (oder NAD+) in NADPH (NADH) sein.

Das gekoppelte Reaktionssystem kann wie folgt dargestellt werden:

(NADPH)

oder (NADH)

\genase/

oder

/be- \

ι hydro-I \genase/

(3)

(NADP

oder (NAD+)

a-Ketoglutarat

I Gluta- 1
I mat- I
Vdehydro-I
\genase /

(2)

s Mure

> f

L-Glutamat

— /'Trans-Vaminase/

a-Ketosäure

(D

25

Die gewünschte Transaminierungsneaktion (Stufe 1), a-Ketosäure zu L-Aminosäure, ist normalerweise reversibel und würde nur bis zur Einstellung des Gleichgewichts fortschreiten, wodurch die Umwandlungseffizienz in die Aminosäure begrenzt würde. Durch Kopplung der Transaminierungsreaktion an andere enzymatische Reaktionen kann man die Transaminierung theoretisch vollständig ablaufen lassen; es können jedoch chemische Abbaureaktionen stattfinden, die die tatsächliche Ausbeute senken.

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35

Die oben als Stufe 2 bezeichnete gekoppelte enzymatische Reaktion führt eines der Transaminierungsprodukte, das a-Ketoglutarat, zurück in L-Glutamat. Dieser Schritt, eine reduktive Aminierung, wird durch die GIutamatdehydrogenase vermittelt und macht die Gegenwart von Ammoniumionen erforderlich. Das für die Transaminierung der a-Ketosäure in die L-Aminosäure zur Verfügung

stehende L-Glutamat wind durch diesen RUckfUhrungsschritt kontinuierlich ersetzt.

In Stufe 2) wird von einem der Coenzyme NADPH oder NADH Gebrauch gemacht, die zu NADP+ oder NAD+ umgewandelt werden. In einer dritten enzymatischen Reaktion in Stufe 3) wird dieses NADP+ (NAD+) entweder durch eine Dehydrogenasereaktion oder eine Hydrogenasereaktion wieder in NADPH (NADH) umgewandelt. Demgemäß wird auch das in Stufe 2) erforderliche NADPH (NADH) kontinuierlich aufgefüllt. Das in Stufe 2) erforderliche NH.+ wird durch das Nährmedium bereitgestellt.

Das enzymatische Reaktionssystems selbst ist bekannt.

Bei den bekannten Anwendungen dieses Systems ist jedoch der Zusatz von drei verschiedenen Mikrorganismen, vgl. US-PS 3 183 170, oder der Zusatz von Mikroorganismen, Aminogruppendonatoren und Cofaktoren, vgl. Yamada et al., "The Microbial Production of Amino Acids", Seiten 440-446 (1972), erforderlich, um die Reaktionskomponenten der vorstehend dargestellten drei Stufen bereitzustellen. Ferner werden bei diesen bekannten Verfahren Suspensionen ruhender Zellen verwendet.

Gemäß dem Verfahren der parallelen deutschen Patentanmeldung mit der Priorität der US-Anmeldung Nr. 520 632 vom 5. 8. 1984 wird ein einzelner Mikroorganismenstamm verwendet, der das gesamte gekoppelte enzymatische Reaktionssystem liefert. Eine Kultur geeigneter Mikroorganismen in der logar-ithmischen Wachstumsphase, mit Ammoniumionen in dem Kulturmedium versorgt, vermittelt alle drei Stufen der biologischen Umwandlung der a-Ketosäuren in ihre jeweiligen L-Aminosäuren. In dem Verfahren der oben genannten parallelen Patentanmeldung wird in Stufe (3) des gekoppelten Enzymsystems von einer Dehy-

drogenasereaktion Gebrauch gemacht, um NADP+ (NAD+) in NADPH (NADH) zu überführen.

Das beschriebene gekoppelte enzymatische Reaktionssystem ist in aktiv wachsenden Mikroorganismen vorhanden. Dieses natürlich auftretende System kann nun für eine effiziente Umwandlung von a-Ketosäuren in L-Aminosäuren verwendet werden. Bei Einsatz geeigneter Mikroorganismen mit dem richtigen Substrat wird die Umwandlung mit hohen Ausbeuten durch die Mikroorganismen selbst durchgeführt.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren sind sehr unterschiedliche Mikroorganismentypen verwendbar. So ist beispielsweise in der parallelen Patentanmeldung (entsprechend US 520 623) angegeben, daß als Glutaminsäurebildner bekannte Bakterienstämme verwendet werden können. Diese schließen die Gattungen §£,ej£i~£Ji~i.ii!IL> und Cor_y_- —^.————Li.— ^sowi-^e E_j 9.2.Ü HBiOI ein. Es wurde gezeigt

(vgl. die angegebenen Beispiele), daß das erfindungsgemäße verbesserte Verfahren mit Brevibacterium thiogeni-

tal.i_s_ ATCC Nr. 31723, Bu^ikaEiEILiuiH 1 actofermeηtum

ATCC Nr. 22420 und B^ev^bacte^u^flavum ATCC Nr. 13826 durchgeführt werden kann. Die ATCC-Nummern geben die Hinterlegungsnummern an, unter denen jede der oben genannten Kulturen bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 30852 hinterlegt worden ist. Es wird davon ausgegangen, daß andere Mikroorganismen, die fähig sind, die basische biologische Umwandlung durchzuführen und die signifikante Säuremengen während der logarithmischen Wachstumsphase ausscheiden, ebenfalls in dem erfindungsgemäßen, verbesserten Verfahren geeignet sind.

Es zeigt sich, daß eine große Vielzahl von Mikroorganismen in dem erfindungsgemäßen biologischen Umwandlungsverfahren verwendbar sind. Es ist primär erforderlich, daß die Mikroorganismen fähig sind, eine a-Ketosäure zu resorbieren und in die korrespondierende L-Aminosäure umzuwandeln. Um die biologische Umwandlung mit größter Wirksamkeit durchzuführen, sollten die Mikroorganismen in der Lage sein, die in den Stufen (1) bis (3) beteiligten Enzyme des gekoppelten Enzymsystems in ausreichenden Mengen zu bilden, um die Transaminierungsreaktion über den Gleichgewichtspunkt hinaus im wesentlichen bis zum Ende zu katalysieren. Schließlich sollten die Mikroorganismen vorzugsweise fähig sein, die L-Aminosäure in das Kulturmedium abzugeben, um eine bequeme und ökonomische Gewinnung möglich zu machen.

Es ist zweitens erforderlich, daß die Mikroorganismen während der logarithmischen oder exponentiellen Wachstumsphase signifikante Säuremengen bilden und ausscheiden. Beispiele für die typischten Säuren, die ausgeschieden werden, sind Milchsäure, Glutaminsäure und Bernsteinsäure, obgleich die Ausscheidung anderer Säuren für den Zweck des erfindungsgemäßen Verfahrens ebenfalls geeignet ist.

Die ausgeschiedenen Mengen sollten genügen, um den pH-Wert des Kulturmediums bis in einen Bereich von etwa 4 bis 6 zu senken, wenn dieser nicht durch Zugabe einer Base von außen geregelt wird.

Die Auswahl der in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten a-Ketosäure hängt von dem gewünschten L-Aminosäureprodukt ab. Beispielsweise wird phenylbrenztraubensäure zu L-Phenylalanin, a-Ketoisocapronsäure zu L-Leuein, a-Ketoisovaleriansäure zu L-Valin, Brenztraubensäu-

re zu L-Alanin, Oxalessigsäure zu L-Asparginsäure, ß-Hydroxy-a-ketobuttersäure zu L-Threonin, p-Oxyphenylbrenztraubensäure zu L-Tyrosin, Indolbrenztraubensäure zu L-Tryptophan, a-Keto-ß-methylvaleriansäure zu L-Isoleuein umgewandelt. Es ist offensichtlich, daß die herkömmlichen Ausgangsverbindungen für L-Aminosäuren in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird die a-Ketosäure als wäßrige, basische Lösung verwendet. Beispielsweise kann die cx-Ketosäure bequem in 0,1 bis 0,6 M wäßrigem Kaliumhydroxid gelöst werden. Natriumhydroxid, Ammoniumhydroxid oder Harnstoff können auch verwendet werden, ebenso wie jegliche andere Base, die mit der wachsenden Kultur und der Transaminierungsreaktion kompatibel ist. Es wurde gefunden, daß KOH bevorzugt ist, wenn Phenylbrenztraubensäure (PPA) als Ausgangsverbindung benutzt wird, da PPA in KOH löslicher ist. Es wird davon ausgegangen, daß aus Gründen der Löslichkeit bestimmte Basen für die Verwendung mit bestimmten a-Ketosäuren bevorzugt sind. Die Konzentration zur Aufrechterhaltung des gewünschten pH-Werts in dem Fermenter kann schwanken, wobei die Beschickungsrate entsprechend angepaßt wird. Im typischen Fall liegt die Konzentration der Base jedoch zwischen etwa 0,1 und etwa 20 Gew./ Vol.%.

Wird die a-Ketosäure als Natrium- oder Kaliumhydrolysat verwendet, so wird es normalerweise nicht nötig sein, die a-Ketosäure in einer Base zu lösen. Beispielsweise wird ein Natriumhydrolysat (Natriumphenylbrenztraubensäure) von 5-Benzylidenhydantoin (5-BH), hergestellt durch Kochen des 5-BH mit Wasser und NaOH und anschliessendes Kühlen in einem Eisbad (vgl. Beispiel 3), eine Lösung mit einem pH-Wert von etwa 13,5 liefern. In

gleicher Weise besitzt Natrium-a-ketoisocapronsäure als Hydrolysat von Isobutylidenhydantoin einen pH-Wert von etwa 13,5 und Natrium-a-ketoisovaleriansäure als Hydrolysat von Isopropylidenhydantoin einen pH-Wert von etwa 13,8. Diese sind erfindungsgemäß zur pH-Wert-Kontrolle geeignet.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird die a-Ketosäure der Kultur als wäßrige, eine geeignete Base enthaltende Lösung zugesetzt, da diese Form das Pumpen der Ausgangsverbindung in die Kulturbrühe erleichtert. Falls gewünscht, kann die a-Ketosäure jedoch in einer eine geeignete Base enthaltenden Aufschlämmung verwendet werden .

Die Konzentration der wäßrigen a-Ketosäurelösung kann, wenn dies die Form ist, in der sie in die Kultur eingespeist wird, erheblich variieren. Wird beispielsweise das erfindungsgemäße Verfahren bei einer kontinuierliehen Fermentation verwendet, so wird die Lösung verdünnter sein als für eine Batch-Fermentation. Die obere Konzentrationsgrenze hängt in erster Linie von der Löslichkeit der a-Ketosäure in dem gewünschten Lösungsmittel ab. Es wird davon ausgegangen, daß Spiegel von etwa 1,0 bis 200 g/l geeignet sind, wobei die Konzentration von der jeweiligen α-Ketosäure sowie den zuvor diskutierten Faktoren abhängig ist. Es ist am bequemsten, die α-Ketosäure in Wasser zu lösen, aber auch andere Lösungsmittel, die mit dem System verträglich sind, beispielsweise Kulturmedium, können falls gewünscht verwendet werden.

Das Wachstumsmedium sollte so gewählt werden, daß optimale Wachstumsbedingungen für die verwendeten Mikroorganismen geschaffen werden. Auswahl, Änderung und Anpas-

sung der Medien liegen im Rahmen der Fähigkeiten des Fachmanns und müssen erfindungsgemäß nicht im einzelnen diskutiert werden.

Zusätzlich zu den Nährstoff-Grunderfordernissen sollte das Medium jedoch eine Quelle für NH.+ enthalten. Die Ammoniumionen werden von den Mikroorganismen sowohl zur Steigerung der Zellmasse als auch für die Stufe (2) des gekoppelten enzymatischen Reaktionssystems verwendet.

Demgemäß sollte der Ammoniumionenspiegel in dem Kulturmedium im Hinblick auf die gewünschte Aminosäurenproduktion und Zellmasse gesteuert werden. Die Einstellung des (NH.+)-Spiegels ist dem Fachmann ebenfalls geläufig. Beispielsweise können die Ionen bequem durch Zusatz von Ammoniumsulfat in einer Konzentration von etwa 10 bis etwa 50 g/l zu dem Nährmedium geliefert werden. Alternativ können Harnstoff, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat usw. als (NH,+)-Donatoren verwendet werden.

Das erfindungsgemäße biologische Umwandlungsverfahren erfordert eine Kultur von aktiv wachsenden Mikroorganismen. Diese Kultur kann hergestellt werden, indem man steriles Nähr- oder Wachstumsmedium mit einer Impfkultür des gewünschten Stammes animpft. Die zum Animpfen des Nährmediums verwendete Impfkultur läßt man vorzugsweise 6 bis 40 Stunden vor der Verwendung als Inokulum wachsen. Der Zeitraum, während dessen man die Impfkultur vor dem Animpfen anzieht, variiert abhängig von dem verwendeten Bakterienstamm. Es ist wünschenswert, daß die Impfkultur eine gesunde, wachsende Zellmasse enthält, die ausreicht, um eine gute Basis für die Bildung und das Wachstum der Fermentationskultur zu bilden.

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Die Größe des Fermenters hängt von der speziellen Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens ab. Dem Fachmann ist es geläufig, die Mengen des Mediums und der Impfkultur den Erfordernissen eines spezifischen Reaktors oder der gewünschten Ausbeute anzupassen.

Man läßt die Kultur in dem Fermenter wachsen, bis sie sich an die Reaktorumgebung gewöhnt hat und sich zu einer Zellmasse entwickelt hat, die ausreicht, um der Zugabe der a-Ketosäure standzuhalten. Dieses ist besonders wichtig, wenn eine unreine Ausgangsverbindung verwendet wird. Die optische Dichte kann als geeignetes Maß für das Zellwachstum dienen. Eine optische Dichte ("O.D.", 640 nm) von etwa 10 deutet im allgemeinen daraufhin, daß die Kultur für die Zugabe der a-Ketosäure bereit ist. Dies entspricht einer Wachstumszeit von etwa 6 bis 40 Stunden, abhängig von dem Organismus und den Wachstumsbedingungen. Dies kann jedoch etwas variieren und sollte nicht als strenges Erfordernis angesehen werden, sondern eher der Erfahrung und dem Ermessen des Ausführenden überlassen bleiben.

Die Kultur wird bei einer Temperatur angezogen, die mit maximalem Wachstum des verwendeten Bakterienstammes vereinbar ist. Der allgemeine Bereich reicht von Raumtemperatur bis hinzu etwa 37⁰C. Für Corj/;ne_bac^e_r_i^a und die Gattungen §_r_e_v iba^e^r^^m beträgt die bevorzugte Temperatur etwa 30⁰C. Der pH-Wert der Kultur sollte vor dem Absinken des pH-Wertes, der mit dem Beginn des logarithmischen Wachstums verbunden ist, vorzugsweise etwa 7 bis 8 betragen. Falls dies für den gewählten Bakterienstamm notwendig ist, kann belüftet werden.

Während der lag- und logarithmischen Wachstumsphase bilden zahlreiche Mikroorganismen, beispielsweise die

Gattungen Br^v^b^cj^ej^iüOl und Q. ο rjm e_b a^e_r.i_unn, verschiedene Säuren und scheiden diese aus. Diese Säuren können Glutaminsäure, Milchsäure, Bernsteinsäure und andere einschliessen. Durch Zuführen dieser Säuren zu dem KuI-turmedium wird äer pH-Wert auf etwa 4 bis 6 gesenkt, wenn er nicht durch Zugeben einer Base kontrolliert wird. Dieser erniedrigte pH-Bereich hat eine signifikant nachteilige Wirkung auf die Raten des Bakterienwachstums und des Metabolismus.

Umgekehrt wurde beobachet, daß dann, wenn das Wachstum in die stationäre Phase eintritt, die Säurproduktion der Mikroorganismen zurückgeht und fast aufhört. Da Teile der Zellpopulation zugrundegehen, werden basische Komponenten wie Amine in die Kulturbrühe entlassen. Ohne Kontrolle steigern diese freigesetzten Basen den pH auf Werte oberhalb etwa 8. Hohe pH-Werte sind ebenfalls nachteilig für die Kultur und hemmen sowohl den Metabolismus als töten auch zumindest Teile der verbliebenen lebensfähigen Zellpopulation.

Die aktiv wachsende und metabolisierende Zellkultur bildet das gekoppelte Enzymsystem, das die Transaminierungsreaktion des erfindungsgemäßen Verfahrens katalysiert. Es wurde gefunden, daß dann, wenn man der Kultur eine basische Lösung der a-Ketosäure als Ausgangsverbindung als Reaktion auf den pH-Bedarf zuführt, die Ausgangsverbindung den Mikroorganismen mit einer Rate angeboten wird, die im wesentlichen ihrer Fähigkeit zur Umwandlung derselben in das L-Aminosäureprodukt entspricht. Wenn die Kultur in die logarithmische Wachstumsphase eintritt und der pH-Wert zu sinken beginnt, wird die basische Lösung der a-Ketosäure mit einer Rate eingespeist, die den pH-Wert bei oder oberhalb einer bestimmten Grenze, vorzugsweise im Bereich von etwa 6,5 bis etwa 7,5 hält.

Es kann ferner erwünscht sein, eine Obergrenze für den pH-Wert in dem Bereich von etwa 7,5 bis etwa 8 zu setzen. Dies dient dazu, die Gesundheit und metabolische Aktivität der Mikroorganismen auch nach Verlangsamung des aktiven Wachstums aufrechtzuerhalten. Diese Obergrenze des pH-Wertes kann aufrechterhalten werden, indem man der Kultur irgendeine mit der Fermentation kompatible Säure zuführt. Geeignete Säuren sind beispielsweise konzentrierter Eisessig, Schwefelsäure, Zitronensäure und Phosphorsäure. Es kann jegliche Säure verwendet werden, die mit dem Wachstum oder dem Metabolismus der Mikroorganismen und mit der Transaminierungsreaktion kompatibel ist.

Es können jegliche geeignete Mittel verwendet werden, um den pH-Wert der Kulturbrühe kontinuierlich zu überwachen und die zum Kontrollieren des pH-Wertes innerhalb bestimmter vorgegebener Grenzen notwendige Base oder Säure zuzugeben. Aus Bequemlichkeits- und Genauigkeitsgründen ist es bevorzugt, ein automatisches pH-Meß- oder -Regelgerät zu verwenden, das den Ausstoß der Base oder Säure in den Fermenter mit einer vorausbestimmten Rate aus einer oder mehreren Pumpen signalisiert. Auf diese Weise wird eine sofortige und geeignete Reaktion auf die Änderungen oder Fluktuationen des pH-Wertes der Brühe erhalten. Dies entspricht im wesentlichen einer sofortigen Reaktion auf Änderungen der Zellwachstums- und Metabolismusraten.

Die Zuführgeschwindigkeit der Base oder Säure hängt selbstverständlich von dem pH-Wert und der Konzentration der zuzugebenden Lösung sowie dem pH-Bedarf der Kulturbrühe ab. Es ist ferner vorgesehen, daß die Base oder Säure entweder kontinuierlich oder portionsweise zugeführt wird, bis die gewünschte pH-Grenze erreicht

ist. Es hat sich gezeigt, daß für einen 700 ml Fermenter Zuführraten von etwa 1 bis 3 ml/min geeignet sind, wobei die Zuführzeiten von 1 ,0 Sekunden bis etwa 10 Minuten basierend auf dem Bedarf betragen.

Während der anfänglichen lag-Wachstumsphase, d.h. nach Animpfen mit der Impfkultur, können die Untergrenzen des pH-Wertes durch Zugabe jeglicher Base kontrolliert werden, die mit der wachsenden Kultur kompatibel ist.

Während dieser Anfangsperiode hat die Kultur die logarithmische Wachstumsphase, während derer die a-Ketosäure als Ausgangsverbindung aktiv in die L-Aminosäure umgewandelt wird, noch nicht erreicht. Die basische a-Ketosäurelösung könnte zwar während der lag-Phase zur

-| 5 pH-Kontrolle verwendet werden, dies könnte sich jedoch nachteilig auf die Gesundheit der Kultur auswirken, insbesondere wenn eine unreine Ausgangsverbindung verwendet wird. Eine volle Verwertung der Ausgangsverbindung findet jedenfalls bis zum Erreichen der logarithmischen Wachstumsphase nicht statt. Aus diesem Grunde ist es bevorzugt, während der anfänglichen Wachstumsphase eine geeignete Base, d.h. eine mit der wachsenden Kultur kompatible Base zu verwenden, die die Ausgangsverbindung nicht enthält. Beispiele für geeignete Basen sind Amrhoniumhydroxid , Harnstoff, Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid und Ammoniakgas.

Beginnend nach etwa 6 bis 10 Stunden, wenn der O.D. (640 nm) etwa 10 erreicht hat und der pH-Wert auf etwa 6,8 bis 7 gesunken ist, wird weiteres Absinken des pH-Wertes durch Zugeben der a-Ketosäuren in basischer Lösung wie zuvor beschrieben kontrolliert. Die Zuführrate während dieser logarithmischen Wachstumsphase (oder Säurebildungsphase) wird im wesentlichen durch den pH-Bedarf bestimmt, es ist jedoch ebenfalls wünschenswert,

die α-Ketosäurekonzentration in den Brühe unterhalb etwa 15 g/l zu halten. Konzentrationen oberhalb dieses Wertes können sich nachteilig auf die wachsende Kultur auswirken, insbesondere wenn eine unreine Ausgangsverbindung verwendet wird.

Als Reaktion auf den pH-Bedarf wird so viel als möglich von der Ausgangsverbindungslösung in das Kulturmedium eingespeist. Wenn die Säurebildung durch die Bakterien soweit abnimmt, daß der pH-Wert des Mediums nicht mehr unter etwa 6,8 bis etwa 7,5 und vorzugsweise etwa 7,2 sinkt, so kann die pH-Grenze angehoben werden, um zusätzliche Ausgangsverbindung auf Basis des pH-Bedarfs einzuspeisen. Beispielsweise kann die untere pH-Grenze auf etwa 7,8 angehoben werden.

Nach Abschluß der Zufuhr aufgrund des pH-Bedarfs wird das gesamte verbleibende Volumen der a-Ketosäure, die in L-Aminosäure umgewandelt werden soll, in die Brühe eingespeist. Es hat sich gezeigt, daß dann, wenn die verbleibende a-Ketosäure über einen Zeitraum bis zu 24 Stunden oder langer, vorzugsweise 2 bis 8 Stunden, eingespeist wird, diese in wesentlichen Mengen in L-Aminosäure umgewandelt wird. Ist beispielsweise vorgese-

hen, 300 bis 400 cm einer 80 g/l Lösung der Ausgangs-

3
verbindung in 700 cm Medium einzuspeisen, so kann etwa ein Drittel oder die Hälfte der Ausgangsverbindung als Reaktion auf den pH-Bedarf während der logarithmischen Wachstumsphase eingespeist werden. Der Rest wird während der nächsten 2 bis 8 Stunden oder mehr eingespeist.

Die obere pH-Grenze wird auf einen vorbestimmten Wert im Bereich von etwa 7,5 bis 8,0, vorzugsweise etwa 7,8 festgesetzt. Wie oben beschrieben, wird auch diese Grenze zugunsten der optimalen Gesundheit und metabolischen

Aktivität der Kultur kontrolliert. Wie für die Kontrolle der Untergrenze des pH-Wertes ist es bevorzugt, einen automatischen pH-Sensor zu verwenden, der die Zugabe der Säure zu dem Kulturmedium auslöst. Die Säure wird mit einer Rate zugegeben, die ausreicht, um den pH-Wert der Brühe unterhalb der vorgesehenen Obergrenze zu halten. Die Konzentration der Säure kann variieren, beispielsweise von etwa 1 bis etwa 30 Gew. /Vol. %. Es werden jedoch konzentrierte Lösungen bevorzugt, insbesondere in Batchverfahren, da sie das Gesamtvolumen der Fermentationsmedien in geringerem Ausmaß steigern.

In einem Batchverfahren kann das L-Aminosäureprodukt aus der Kulturbrühe gewonnen werden, nachdem die Kultur die stationäre Wachstumsphase erreicht hat, was durch 0.D.-Werte in dem Bereich von etwa 20 bis 70 angezeigt wird. Wird das erfindungsgemäße Verfahren kontinuierlich durchgeführt, so kann das Produkt kontinuierlich gewonnen werden. Die L-Aminosäure kann nach herkömmliehen Verfahren aus der Kulturbrühe gewonnen werden.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen erläutert.

Impfkultur- und Wachstumsmedien wurden je Liter entioni siertem Wasser wie folgt hergestellt:

Impf kulturmedium Bestandteile Wachstumsmedium

30,0 g Glukose

2,5 g Maisquellflüssigkeit

(corn steep liquor)

NZ Amin B²

K₂HPO₄

MgSO₄ · 7H₂O

2,5	g	g	g
1,0	g	cm
0,25	cm
10,0
1,0
1,0

1,0 cm^w Thiamin-HCl-Stammlösung

20,0 g CaDO₃

Biotinstammlösung i ⁵

100,0	g	g
2,5	g	g
2,5	g	cm
1,0	g	cm
0,25
40,00
1,0
1,0

1 - eine 70 Gew./Vol.%-ige Glukosestammlösung.
2 - Sheffield Company.

3 - 100 mg d-Biotin je Liter entionisiertem Wasser.
4-1,Og Thiamin-HCl je Liter entionisiertem Wasser.
5 - Dem Impfkulturmedium als Puffer zugegeben.

Alle Bestandteile wurden vereinigt und bei 110⁰C 10 Minuten lang zum Sterilisieren autoklaviert. Nach dem Autklavieren wurde der pH-Wert der Medien mit NaOH auf 7,4 eingestellt.

3 3

50 cm Teilmengen des Impfkulturmediums in 250 cm

Schüttelkolben wurden mit Brevibacterium t hi og_e n_:i t al.is ATCC Nr. 31723 beimpft. Man ließ die Kulturen bei 30⁰C unter Schütteln bei 300 UpM (Umdrehungen pro Minute) bei 30 C 17 Stunden lang wachsen, bevor sie als Inoku-Ium für den Fermenter verwendet wurden.

Es wurde ein 2 Liter (Arbeitsvolumen 1 Liter) gerätegesteuerter MuItigen-Fermenter (New Brunswick Co.) verwendet. Vor der Verwendung wurden etwa 0,2 ml Polyethylenglykol 2000 in den Fermenter gegeben, um Schaum-

bildung zu unterdrücken. Der Fermenter wurde anschließend 10 Minuten lang bei 110⁰C autoklaviert. Ein Anfangsvolumen von 700 ml des Wachstumsmediums wurde in den Fermenter gegeben. Es wurden etwa 50 ml der Impfkultür (O.D. bei 640 nm = 22) zugegeben. Der Fermenter wurde bei 30 C und 600 UpM betrieben, wobei 1,0 bis 1,25 Liter je Minute (LpM) Luft zum Belüften in den Fermenter eingeführt wurden.

Der pH-Wert in dem Fermenter wurde während, der anfänglichen 8-stündigen Wachstumszeit manuell mit konzentrierter NH.OH-Lösung (29 %) kontrolliert.. Während der ersten 4 Stunden änderte sich der pH-Wert wenig oder gar nicht. Während der zweiten 4 Stunden wurde das pH-Meter ständig visuell beobachtet. Wenn nötig wurde NH.OH zugegeben, wobei während dieses Zeitraums ein

^ 3

Gesamtvolumen von etwa 2,0 cm zugegeben wurde.

Nach der Anfangszeit von 8 Stunden wurde der pH automatisch kontrolliert, wobei ein pH-Kontrollgerät Modell 5997 (Horizon Ecology Co.) und eine pH-Elektrode (200 mm, Ingold) verwendet wurde. Das System wurde so programmiert, daß der pH-Wert der Kulturbrühe oberhalb 6,8 und unterhalb 7,8 eingestellt wurde. Der pH-Regler war so programmmiert, daß dann, wenn der pH-Wert in dem Medium unter 6,8 sank, ein Signal an eine peristaltische Pumpe (CoIe Parmer Co.) gegeben wurde, welches die Zufuhr der Base mit einer Rate von etwa 1 bis 3 ml/min auslöste, um den pH-Wert oberhalb 6,8 zu halten.

Die Base enthielt Phenylpyruvat in wäßriger Kaliumhydroxidlösung. Gereinigtes Phenylpyruvat (PPA) wurde von Aldrich Chemical Co. als Na-PPA-H₂O (98 %, MW 204,16) erhalten. Dieses wurde in 0,6 M wäßrigem KOH

gelöst, so daß eine Lösung mit einer Konzentration von

3 98 g/l oder 0,144 M in einem Gesamtvolumen von 300 cm gebildet wurde.

Nach etwa 8 Stunden wurde die wäßrige PPA-Lösung du,rch das System zur Regelung des pH-Wertes in dem Fermentationsansatz verwendet und dies wurde nach etwa 24 Stun-

3
den beendet. Es wurden insgesamt 175 cm dieser Lösung während der logarithmischen Wachstumsphase automatisch in den Fermenter eingespeist. Die Gesamtmenge an Na*PPA'H₂O, die während dieses Zeitraums eingespeist wurde, betrug 17,15 g (84 mM).

An diesem Punkt - nach 24-stündiger Fermentationzeit - reichte die Säureproduktion der Mikroorganismen nicht länger aus, um den pH-Wert des Mediums auf oder unter 6,8 zu senken. Daher wurden die verbleibenden

3
125 cm der wäßrigen PPA-Lösung, die 12,25 g (60 mM) enthielten, während eines Zeitraums von 2 Stunden 3
(62,5 cm /h) in den Fermenter gepumpt. Die Fermentation wurde weitere 24 Stunden bis zu einer Gesamtfermentationszeit von 48 Stunden fortgeführt. Während der letz-

3
ten 17 Stunden wurden 25 cm 5N KOH als Kontrollbase verwendet.

Der pH-Regler wurde ferner so programmiert, daß der pH-Wert 7,8 nicht überschritt, indem an eine zweite peristaltische Pumpe (CoIe Parmer Co.) ein Signal zur Zugabe von konzentriertem Eisessig gegeben wurde. Es 3
wurden insgesamt 15 cm zugegeben.

Es wurde so viel Glukose (70 Gew./Vol.%-ige Stammlösung) zugegeben, wie erforderlich war, um das Absinken der Glukosekonzentration in der Fermentationsbrühe auf Null zu verhindern. Diese Maßnahme diente dazu, sicher-

Λ *

zustellen, daß Glukose anstelle der Ausgangsverbindung oder des Produktes als Kohlenstoffquelle verwendet wur-

de. Das erhaltene Endvolumen betrug 1029 cm . Das berechnete Endvolumen betrug:

Ausgangsmedium Inokulum
wäßrige Na·PPA 10 Essigsäure NH₄OH
Glukose
5 N KOH

Zwischensumme =
3

entnommen 7 χ 10 cm Proben =

3
Summe = 1122 cm

700	cm
50	cm
300	cm
15	cm
2	3 cm
100	cm
25	cm
1192	cm
70	cm

Der Verdampfungsverlust während der 58-stündigen Fermentationszeit betrug etwa 8,3 %.

Proben der Fermentationsbrühe wurden mit Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) hinsichtlich L-Phenylalanin analysiert. Milliporenfiltrierte (0,22 [im Porengröße) Mediumproben wurden vor der Injektion in den 25

HPLC nach einem Dansylchlorid-Verfahren derivatisiert. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:

24 Stunden - 13,20 g/l L-Phenylalanin

28 Stunden - 17,06 g/l

31 Stunden - 19,20 g/l

48 Stunden - 18,69 g/l "

Die niedrigere Ausbeute nach 48 Stunden war auf den Abbau des Produktes zurückzuführen.

Während der Fermentation wurden aus insgesamt 144 mM Na'PPA'HpO (29,4 g) insgesamt 115,93 mM L-Phenylalanin (19,15 g) gebildet. Die molare Ausbeute betrug:

m_M_L—P_ h e nj/_la. l_an_ i_n_
M NH

mM Na·PPA-H₂O

Bei.spi.e^l^ 2

Es wurden die Medien, der Mikroorganismenstamm und die Grundverfahren gemäß Beispiel 1 verwendet, mit dem Unterschied, daß die folgenden Änderungen in der Menge und der pH-Kontrolle vorgenommen wurden. Die wäßrige Na»PPA-Lösung wurde etwa 7 Stunden nach dem Beimpfen des Fermenters als Kontrollbase verwendet. Die programmierte pH-Kontrolle wurden auf die Werte 7,2 und 7,8 eingestellt.

Die wäßrige Na-ΡΡΑΉ O-Lösung enthielt 168 mMole

^ 3

(34,3 g) in einem Gesamtvolumen von 350 cm . Das Volumen der während des nach 7 Stunden beginnenden und nach 24 Stunden endenden Zeitraums als Kontrollbase verwende-

3
ten wäßrigen Na·PPA-Lösung betrug 175 cm . Zur Kontrolle der PH-Obergrenze wurde gemäß Beispiel 1 Essigsäure

3
zugegeben, wobei eine Gesamtmenge von 41 cm zu dem Fermenter gegeben wurde. Nach 24 Stunden wurde der untere eingestellte Wert auf dem pH-Regler für die restliche Fermentationszeit auf 7,5 angehoben. Beginnend mit diesem Zeitpunkt wurde der Rest der Na·PPA-Lösung

3
(175 cm ) während eines Zeitraums von 2 Stunden in den

Reaktor gepumpt. Die Fermentation wurde weitere 24 Stunden fortgeführt, wobei eine Gesamtfermentationszeit von 48 Stunden erreicht wurde.
35

Das erhaltene Endvolumen betrug 1025	29 % NH,)	cm .	Das berechne-
te Endvolumen betrug:	Zwischensumme =
Ausgangsmedium	3 15 cm Proben =	700	cm
Inokulum	Summe =	50	cm
Na· PPA	350	3 cm
Essigsäure	41	cm
Glukose	100	3 cm
NH OH (konzentriert,	2	3 cm
	1243	cm
entnommen 11 χ	165	cm
	1078	3 cm

Der Verdampfungsverlust während der 48-stündigen Fermentationszeit betrug etwa 4,92 %.
15

Die Medienproben wurden gemäß Beispiel 1 analysiert. Es wurden die folgenden HPLC-Ergebnisse erhalten:

24 Stunden - 16,7 g/1 L-Phenylalanin

26 Stunden - 17,4 g/l

29 Stunden - 19,5 g/l "

32 Stunden - 20,1 g/l

48 Stunden - 21,8 g/l

Aus insgesamt 168,00 mM Na-PPA-HpO (34,3 g) wurden wurden während der Fermentation insgesamt 145,77 mM L-Phenylalanin (24,08 g) gebildet. Die molare Ausbeute betrug 86,8 %.

Es wurde das folgende Impfkulturmedium hergestellt:

~™ ™2.i ^ ^e _ Glukose

Bacto-Pepton (Difco) Hefeextrakt
NaCl
10

Die Bestandteile wurden vereinigt und der pH-Wert mit 5N. NaOH auf 7,2 eingestellt. Das Medium wurde 10 Minuten lang bei 110 C autoklaviert.

Es wurde das folgende Wachstumsmedium hergestellt:

Zuckerrohrmelasse (10 % als Glukose) 100,00 g

K₂HPO₄ 0,50 g

KH₂PO₄ 0,50 g

MgS0₄«7H₂0 0,25 g

NH₄SO₄ 20,00 g

Maisquellflüssigkeit

(Corn Steep Liquor) 5,00 g

CaCO₃ 20,00 g

Die Bestandteile wurden vereinigt und der pH-Wert mit 5N NaOH auf 7,2 eingestellt. Das Medium wurde 10 Minuten lang bei 110⁰C autoklaviert.

Die Impfkultur wurde gemäß Beispiel 1 von einer 18 Stunden alten Auxo-Sy Agar (Difco )-Platte von Br_ey_:Lba_c--

te£i.um ^actofer^mentum ATCC Nr. 21420 übertragen. Man

ließ die Impfkultur 7 Stunden wachsen, wobei ein O.D.

(640 nm) von 25 erreicht wurde. Der pH-Wert des Fermen-

- 3-f -

termediums wurde mit Na₄OH von 6,5 auf 7,0 eingestellt. Es wurden 20 ml des Impfkulturmediums verwendet, um den Fermenter nach dem Verfahren gemäß Beispiel 1 zu beimpfen. Der Fermenter wurde bei 30 C, 400 UpM (Umdrehungen pro Minute) und 1,0 LpM (Liter pro Minute) betrieben. Für die ersten 24 Stunden wurde die untere pH-Grenze auf 6,8 und die obere pH-Grenze auf 7,8 eingestellt.

Eine wäßrige Kaliumphenylbrenztraubensäurelösung (K-PPA) wurde als a-Ketosäurenausgangsverbindung verwendet. Die Lösung war ein ungereinigtes Natriumhydroxidhydrolysat von 5-Benzylidenhydantoin. Die Herstellung des Hydrolysats von 5-Benzylidenhydantoin (Hamsphire Chemical Co.) erfolgte nach folgendem Verfahren:

-j5 1598,85 g eritionisiertes Wasser und 168,3 g KOH wurden in einem 3 Liter Becher aus rostfreiem Stahl vereinigt und bis zum Sieden erhitzt. Unter fortgesetztem Sieden wurden 188,2 g 5-Benzylidenhydantoin zugefügt und bis zum Lösen gemischt. Der Siedevorgang wurde 2 Stunden lang fortgesetzt. Es wurde nach Bedarf Wasser zugegeben, um das ursprüngliche Volumen aufrechtzuerhalten. Nach dem Sieden wurde die Mischung schnell in einem Eiswasserbad abgekühlt. Eine 1 molare Lösung von Kaliumphenylpyruvathydrolysat enthielt etwa 1,2M KOH, etwa 0,5M Kaliumcarbonat und etwa 0,5M Harnstoff. Das Hydrolysat wurde anschließend unter Verwendung eines Milliporenfilters (0,22 μηη Porengröße)' sterilisiert.

Dieses Hydrolysat, dessen pH-Wert etwa 13 betrug, wurde 3Q von Beginn der Fermentation an als Kontrollbase verwendet. Während 40 Stunden wurden insgesamt 225 ml zugegeben .

Zur Senkung des pH-Wertes wurde konzentrierter Eisessig verwendet. Während der ersten 17 Stunden wurden 5 ml

zugegeben. In den späteren Fermentationsstadien stieg der pH-Wert des Mediums nicht über 7,8 an, so daß keine weiteren Säurezugaben erforderlich waren.

Nach einer Fermentationszeit von 24 Stunden wurden die festgesetzten pH-Grenzwerte auf 7,8 und 8,0 eingestellt. An diesem Punkt wurde eine Glukosemenge von 50 ml zugegeben, um die Konzentration in dem Medium auf 10 % zu bringen. Nach 65 Stunden wurden 20 ml Glukose zugegeben.

Medienproben wurden gemäß Beispiel 1 analysiert.

Es wurden die folgenden HPLC-Ergebnisse erhalten: 15

40	Stunden	6	,8	g/	1	L-Phenylalanin
43	Il		,8	g/	1	it
45	Il	8	,4	g/	1	Il
48	Il	9	,4	g/	1	Il
65	Il	- 10	,2	g/	1	Il

Aus insgesamt 111,23 mM eingespeister K-Phenylbrenztraubensäure wurden während der Fermentation insgesamt 75,67 mM L-Phenylalanin gebildet. Die molare Ausbeute betrug 68,0 %. Der Verdampfungsverlust wurde in diesem Versuch nicht berücksichtigt.

Die Impfkultur- und Wachstumsmedien gemäß Beispiel 1 wurden verwendet, mit dem Unterschied, daß sowohl in dem Impfkultur- als auch in dem Wachstumsmedium 30 g (NH₄J₂SO₄ und anstelle des CaCO 20,9 g MOPS (Morpholinopropansulfonsäure) als Puffer verwendet wurden. Die Kultivierungs- und Impfverfahren gemäß Beispiel 1

- 33 -

wurden unter Verwendung von Brevibacterium fl&vuro ATCC Nr. 13626 durchgeführt. Den Fermenten wurde in diesem Versuch für die ersten 18 Stunden bei 500 bis 600 UpM

und anschließend bei 650 UpM betrieben.
5

Die für die pH-Kontrolle verwendete Base war das K-Phenylpyruvathydrolysat gemäß Beispiel. 3. Der pH-Wert wurde mit COp auf 10 eingestellt. Der untere pH-Grenzwert wurde bei 7,2 und der obere bei 7,8 festgesetzt. Das

Ί0 Hydrolysat wurde von Beginn der Fermentation an als Kontrollbase verwendet. Es wurden insgesamt 400 ml als Reaktion auf den pH-Bedarf in den Fermenter eingeführt. Nach einer Fermentationszeit von etwa 25 Stunden wurden 50 ml Glukose zu den verbliebenen 60 ml Hydrolysat-Basenlösung gegeben, die weiter als Kontrollbase zugegeben wurde. Nach etwa 48 Stunden wurden weitere 25 ml Glukose zugegeben. Es wurde konzentrierter Eisessig verwendet, um die obere pH-Grenze aufrechtzuerhalten und die Zugabe weiterer Hydrolysat-Basenlösung zu der KuI-tür zu ermöglichen. Dem Fermenter wurden insgesamt 42 ml zugegeben.

Medienproben wurden gemäß Beispiel 1 analysiert.
Es wurden die folgenden HPLC-Ergebnisse erhalten:

17	Stunden	- 3,33	g/	1	L-Phenylalanin
19	Il	3,96	g/	1	Il
22	It	6,19	g/	1	ti
24	Il	7,60	g/	1	"
42	It	- 11,60	g/	1	Il
45	Il	- 14,10	g/	1	Il
65	Il	- 11,90	g/	1	Il

„j- Die geringere Ausbeute nach 65 Stunden war auf den Abbau des Produktes zurückzuführen.

Aus insgesamt 176,33 mM eingespeistem K-Phenylpyruvat wurden innerhalb von 45 Stunden insgesamt 111,99 mM L-Phenylalanin gebildet. Die molare Ausbeute betrug nach 45 Stunden 63,5 %.

Der Verdampfungsverlust wurde in diesem Versuch nicht berücksichtigt.

Claims (11)

1. UEXKÜLL & STOLBERG

   PATENTANWÄLTE

   BESELERSTRASSE 4 D 2000 HAMBURG 52

   EUROPEAN PATENT ATTORNEYS

   DR JD FRHR von UEXKULL DR. ULRICH GRAF STOLBERG DIPL. ING. JÜRGEN SUCHANTKE DIPL ING. ARNULF HUBER DR. ALLARD von KAMEKE

   W.R. Grace & Co.

   1114 Avenue of the Americas New York, N.Y. 10036

   V.St.A.

   (Prio.: 5. August 1983

   US 520 631 672/ÜGS/VOE/wo)

   Juli 1984

   Verbessertes Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren
   aus a-Ketosäuren durch chargenweise gespeiste

   Fermentation

   Patentansprüche

   Verfahren zur Herstellung von !..--Aminosäuren, dadurch gekennzeichnet, daß man

   a) in einem Nährmedium Mikroorganismen anzieht, die a-Ketosäuren in die korrespondierenden L-Aminosäuren umwandeln und die während der Wachstumsphase Säuren bilden und ausscheiden,

   b) die gewünschten α-Ketosäuren der wachsenden Mikroorganismenkultur mit einer Rate zuführt, die im wesentlichen mit der Wachstumsrat'j der Kultur übereinstimmt, und

   c) die α-Ketosäuren durch die Mikrooganismen in die korrespondierenden Aminosäuren umwandeln läßt.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die L-Aminosäure aus dem Fermentationsmedium gewinnt.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zuführungsrate der a-Ketosäure in Stufe b) von dem pH-Wert des Kulturmediums abhängig macht.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man etwa 6 bis 10 Stunden nach dem Inokulieren

   -15 des Nährmediums mit den Mikroorganismen mit dem Zuführen der a-Ketosäure beginnt.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man mit dem Zuführen der α-Ketosäure beginnt, wenn die optische Dichte (640 nm) der wachsenden Kultur etwa 10 erreicht hat.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man den pH-Wert der Kultur vor Beginn der

   a-Ketosäurezuführung durch Zugabe einer Base kontrolliert, die mit der Fermentation kompatibel ist, wobei man eine Base verwendet, die frei oder im wesentlichen frei von der α-Ketosäure ist.
7. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man den pH-Wert der Kultur vor Beginn der a-Ketosäurezuf ührung in dem Bereich von etwa 6,8 bis 7,2 hält.
8. 8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Base Ammoniumhydroxid, Kaliumhydroxid, Natriumhydroxid, Harnstoff oder Ammoniakgas verwendet.
9. 9. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die ot-Ketosäure in einer Lösung zuführt, die eine mit der Fermentation kompatible Base enthält.
10. 10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet,

    daß man als Base Ammoniumhydroxid, Kaliumhydroxid oder Harnstoff verwendet.

    -J5
11. 11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man mit dem Zuführen der a-Ketosäure beginnt, wenn der pH-Wert in dem Kulturmedium in den Bereich von etwa 7,2 bis etwa 7,5 sinkt.

    Ί2. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man die a-Ketosäure so zuführt, daß der pH-Wert des Kulturmediums bei oder oberhalb einer vorbestimmten Grenze in dem Bereich von etwa 6,8 bis eta 7,5 gehalten wird.

    13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man die basische a-Ketosäurelösung auf ein Signal aus einem automatischen pH-Regler hin in das Kulturmedium pumpt.

    14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man einen pH-Regler verwendet, der das Zuführen der basischen Lösung automatisch durch ein Signal an eine Pumpe auslöst, wenn der pH-Wert

    _oc in dem Kulturmedium unter eine vorbestimmte Grenze

    innerhalb des genannten Bereiches sinkt.

    15. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man mit dem Zuführen einer mit der Fermentation kompatiblen Säure beginnt, wenn der pH-Wert des Kulturmediums in den Bereich von etwa 7,5 bis etwa 7,8 steigt.

    16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man die Säure so zuführt, daß der pH-Wert des Kulturmediums bei oder unterhalb etwa 8,0 gehalten wird.

    17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man zum Kontrollieren des pH-Wertes des Kulturmediums einen automatischen pH-Regler verwendet.

    18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man einen pH-Regler verwendet, der das Zuführen der Säure zu dem Kulturmedium automatisch durch ein Signal an eine Pumpe auslöst, wenn der pH-Wert des ..Kulturmediums über eine vorbestimmte Grenze innerhalb des genannten Bereiches ansteigt.

    19. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man der Kultur einen ersten Teil der a-Ketosäure-Gesamtmenge, die der wachsenden Kultur zur biologischen Umwandlung zugeführt werden soll, auf Basis des pH-Bedarfs zuführt und der Kultur einen zweiten Teil während eines Zeitraums von bis zu 24 Stunden nach Beendigung des Zuführens gemäß dem pH-Bedarf zuführt.

    20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß man als ersten Teil eine Menge verwendet, die 1/3 bis 1/2 der Gesamtmenge bildet.

    21. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß man der Kultur den zweiten Teil der

    ■ a-Ketosäurelösung über einen Zeitraum von bis zu 8 Stunden zuführt.

    22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß man der Kultur den zweiten Teil in einer oder mehreren Portionen oder kontinuierlich zuführt.

    23. Verfahren zur biologischen Umwandlung von a-Ketosäuren als Ausgangsverbindungen in L-Aminosäuren durch Zuführen der Ausgangsverbindungen zu einer in der logarithmischen Wachstumsphase befindlichen Mikroorganismenkultur, die zu der biologischen Umwandlung fähig ist und die während der aktiven Wachstumsphase Säuren ausscheidet, dadurch gekennzeichnet, daß man

    a) die pH-Änderungen in dem Medium der wachsenden

    Kultur überwacht und

    b) die a-Ketosäure als Ausgangsverbindung in einer basischen Lösung in solchen Mengen zuführt, daß die durch die Mikroorganismen ausgeschiedenen Säuren kompensiert werden.

    24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß man mit dem Zuführen der a-Ketosäure beginnt, wenn der pH-Wert in dem Kulturmedium bis auf eine vorbestimmte Grenze in dem Bereich von etwa 7,2 bis etwa 7,5 sinkt.

    25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß man die α-Ketosäure so zuführt, daß der pH-Wert des Kulturmediums bei oder oberhalb einer vorbestimmten Grenze in dem Bereich von etwa 6,8 bis etwa 7,5 gehalten wird.