DE69737409T2

DE69737409T2 - Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure durch kontinuierliche Gärung

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Publication number: DE69737409T2
Application number: DE69737409T
Authority: DE
Inventors: Tatsuya Kawasaki-shi Yoshioka; Toshimasa Kawasaki-shi Ishii; Yoshio Kawasaki-shi Kawahara; Yosuke Kawasaki-shi Koyama; Eiko Kawasaki-shi Shimizu
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1996-11-21
Filing date: 1997-11-21
Publication date: 2007-10-31
Anticipated expiration: 2017-11-22
Also published as: DE69737409D1; CN1186857A; ID18916A; IN184015B; EP0844308B1; PE27699A1; BR9705819A; EP1772520A1; US5869300A; BR9705819B1; MY117611A; AU4528497A; ATE355386T1; JPH10150996A; CN1218043C; AU706876B2; JP3812019B2; EP0844308A3; EP0844308A2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur effizienten Produktion von L-Glutaminsäure durch ein kontinuierliches Fermentationsverfahren. L-Glutaminsäure wird als Nahrungsmittelmaterial, beispielsweise als Würzmittel, und als Ausgangsmaterial für verschiedene chemische Produkte weit verbreitet eingesetzt.
Durch die Erhöhung des Bedarfs an L-Glutaminsäure in den letzten Jahren besteht der Wunsch nach der Entwicklung eines industriell vorteilhaften Produktionsverfahrens, wobei die nachstehend beschriebenen Produktionsverfahren erfunden worden sind.
(1) Chargen-Kulturverfahren, Chargeneinspeisungs-Kulturverfahren
Im Vergleich mit dem kontinuierlichen Kulturverfahren sind diese Kulturverfahren dahingehend vorteilhaft, daß die dafür erforderliche Ausrüstung einfach ist und die Kultivierung während eines kurzen Zeitraums unterbrochen wird und dass der durch kontaminierte Bakterien verursachte Schaden gering ist. Die Konzentration von L-Glutaminsäure in der Kulturbrühe wird jedoch im Lauf der Zeit erhöht, und die Produktivität und Ausbeute werden unter dem Einfluß des osmotischen Druckes oder der Inhibition aufgrund der Produkte verringert. Somit ist es schwierig, eine stabil hohe Ausbeute und eine hohe Produktivität über einen langen Zeitraum aufrechtzuerhalten.
(2) Kontinuierliches Kulturverfahren
Das kontinuierliche Kulturverfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß eine hohe Ausbeute und eine hohe Produktivität über einen langen Zeitraum aufrechterhalten werden können, indem die Anhäufung des Zielprodukts in einer hohen Konzentration in dem Fermenter vermieden wird.
Das einfachste und allgemeine Verfahren einer kontinuierlichen Kultivierung ist ein kontinuierliches Einfermenter-Kulturverfahren, und es ist eine große Zahl an Berichten über kontinuierliche Einfermenter-Kulturverfahren in der Aminosäurefermentation, einschließlich der L-Lysin-Fermentation und der L-Argin-in-Fermentation, veröffentlicht worden (Lys: Toshihiko Hirao et. al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 32, 269-273 (1989), Arg: Tomoki Azuma et. al., J. Ferment. Technol., 66 (3), 285-290 (1988)). Während einer solchen Fermentation von L-Lysin und L-Arginin kommt es im allgemeinen zu Bakterienwachstum und der gleichzeitigen Produktion der Zielaminosäuren, so daß das kontinuierliche Einfermenter-Kulturverfahren auf diese Fermentationen auf einfache Weise übertragen werden konnte.
Andererseits ist jedoch angenommen worden, daß die Anwendung des kontinuierlichen Einfermenter-Kulturverfahrens auf die L-Glutaminsäure-Fermentation schwierig ist. Mit anderen Worten ist es herkömmlich als schwierig angesehen worden, daß L-Glutaminsäure bei einer hohen Konzentration durch eine solche L-Glutaminsäure-Fermentation nicht angehäuft werden kann, solange das Bakterienwachstum durch ein Verfahren nicht beendet wurde, beispielsweise durch Limitation von Biotin, welches ein essentieller Faktor für das Bakterienwachstum ist, die Zugabe von Antibiotika, wie Penicillin, Zugabe von oberflächenaktiven Mitteln und Temperaturänderung (1. Japanese Journal of Fermentation Engineering Association, Vol. 41, Nr. 12, 645-651 (1963)); 2. Recent Japanese Industrial Chemistry, Vol. 23, 121-142, Asakura Shoten). Um eine größere Menge der L-Glutaminsäure durch das Chargenkulturverfahren und das Einspeisungs-Chargenkulturverfahren zu produzieren, sollten die Kulturbedingungen so festgesetzt werden, daß das Bakterienwachstum beendet wird. Somit ist vorgeschlagen worden, daß die Fermentation der L-Glutaminsäure durch kontinuierliche Kultivierungsverfahren ungeeignet ist, weil die Bakterien unter den herkömmlichen Kultivierungsbedingungen zur Beendigung des Bakterienwachstums einfach ausgewaschen werden, so daß die Bakterien nicht in dem Fermenter gehalten werden können. Was die Forschungsarbeiten bezüglich des kontinuierlichen Kultivierungsverfahrens für L-Glutaminsäure-Fermentation betrifft, wurden deshalb schon früh Arbeiten zum kontinuierlichen Mehrfermenter-Kulturverfahren, welches das Fördern des Bakterienwachstums in einem ersten Fermenter und das Unterdrücken des Bakterienwachstums in einem zweiten Fermenter umfaßt, zur Produktion von L-Glutaminsäure durchgeführt, beispielsweise von Mr. Ueda, et. al. (Japanese Journal of Fermentation Engineering Association, Vol. 41, Nr. 9, 450-458, 1964) und Mr. Mimura, et. al. (Japanese Journal of Fermentation Engineering Association, Vol. 42, Nr. 2, 70-78, 1964).
Danach sind zwei Verfahren, nämlich ein Zellrezyklierungskulturverfahren und ein Kulturverfahren unter Einsatz immobilisierter Bakterien als Kulturverfahren entwickelt worden, die auf dem Konzept beruhen, daß ein Verfahren zum Bakterienwachstum und ein Verfahren zur Produktion von L-Glutaminsäure unabhängig voneinander durchgeführt werden sollten.
Das Zellrezyklierungskulturverfahren ist ein Verfahren, bei dem die Kulturbrühe, in der L-Glutaminsäure angehäuft wird, jedoch das Bakterienwachstum beendet wird, extrahiert wird und die L-Glutaminsäure aus den Bakterien abgetrennt werden, um nur die Bakterien zurückzuführen (ungeprüfte offengelegte japanischen Patent Anmeldung Nr.. 52-136985; ungeprüfte offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 60-133891 oder ungeprüfte offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 62-48394), und das Verfahren kann eine hohe Ausbeute und eine hohe Produktivität über einen relativ langen Zeitraum aufrechterhalten. Das Verfahren erfordert jedoch ein System, um die Bakterien aus der Kulturbrühe abzutrennen, was unvorteilhaft ist, so daß das Kultivierungssystem komplex ist. Weil die Bakterien, die das Bakterienwachstum beenden, in dem Zellrezyklierungs-Kulturverfahren zurückgeführt werden, nimmt außerdem die Fähigkeit der Bakterien zur Produktion von L-Glutaminsäure über die Zeit ab, was zu einer Limitierung der Kultivierungsdauer führt.
Obwohl das Kultivierungsverfahren unter Einsatz immobilisierter Bakterien L-Glutaminsäure auch in einer hohen Ausbeute und hohen Produktivität bereitstellen kann (H. S. KIM et. al., Biotechnology and Bioengineering, Vol. 26, 2167-2174 (1982)), ist im Gegensatz dazu ein Träger zur Immobilisierung der Bakterien im Hinblick auf die praktische Anwendung für die Produktion von L-Glutaminsäure kostenaufwendig, und zudem ist das Verfahren mit einer großen Anzahl an Problemen behaftet, wie bei der Trägeraustauschtechnologie. Deshalb ist das Verfahren für die industrielle Anwendung im wesentlichen nicht geeignet.
Wie vorstehend beschrieben wurde, erfordern die Kultivierungsbedingungen zur Produktion von L-Glutaminsäure in einer hohen Ausbeute durch das Chargenkultivierungsverfahren und das Einspeisungs-Chargenkultivierungsverfahren die vollständige Beendigung des Bakterienwachstums, so daß die Fähigkeit eines Bakteriums zur Produktion von L-Glutaminsäure in einer späteren Stufe der Kultivierung verringert wird, was Schwierigkeiten bei der Verbesserung der Produktivität verursacht. Durch das herkömmliche kontinuierliche Kultivierungsverfahren wird außerdem ein System benötigt, um Bakterien in den Fermenter weiter zuzugeben oder die Bakterien zu rezyklieren, so daß das Verfahren mit vielen Problemen behaftet ist, um eine industrielle Anwendung zu ermöglichen: Das gesamte System ist komplex, und die Möglichkeit der bakteriellen Kontamination wird verringert, und die hohe Produktivität kann nur unter großen Schwierigkeiten aufrechterhalten werden, weil die Kultivierung unter Bedingungen zur Beendigung des Bakterienwachstums durchgeführt wird.
FR-A-2 459 287 offenbart ein Fermentationsverfahren für die Produktion von L-Glutaminsäure auf diskontinuierliche Weise.
US-A-3 402 104 offenbart die kontinuierliche Fermentation von L-Glutaminsäure in einem Dreistufenverfahren.
FR-A-1 413 906 offenbart ein Verfahren zur Produktion von L-Glutaminsäure durch kontinuierliche Fermentation. Vorzugsweise wird L-Glutaminsäure in einem Mehrstufenverfahren unter Einsatz mehrerer Fermentationsgefäße hergestellt.
K. Ueda, "Some fundamental problems of continuous L-glutamic acid fermentation", FERMENTATION ADVANCES, SYMP. XVI, ACAD., PRESS NY, 1969, S. 43-62, XP-002107644, offenbart eine Glutaminsäurefermentation, wobei die kontinuierliche Kultivierung unter Einsatz eines einzigen Fermenters oder einer Kette von Fermentern durchgeführt werden kann.
Um den erhöhten Bedarf an L-Glutaminsäure zu befriedigen und L-Glutaminsäure kostengünstiger herzustellen, sollte die Produktivität der L-Glutaminsäure-Fermentation über die herkömmliche Produktivität erhöht werden.
ZUSAMMENFASSENDE DARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Eine Aufgabe, die die vorliegende Erfindung löst, ist die Entwicklung eines kontinuierlichen Kultivierungsverfahrens für die L-Glutaminsäure-Fermentation bei hoher Produktivität in einem einfachen System, welches das gleichzeitige Fördern des Bakterienwachstums und der L-Glutaminsäure-Produktion in einem Fermenter umfaßt. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben Untersuchungen durchgeführt, um das Verfahren zur Produktion von L-Glutaminsäure durch herkömmliche Fermentationsverfahren zu modifizieren, und haben als Ergebnis gefunden, daß durch das Einimpfen eines Mikroorganismus mit der Fähigkeit zur Produktion von L-Glutaminsäure der Gattung Brevibacterium oder Corynebacterium in ein flüssiges Medium, enthaltend eine Kohlenstoffquelle und eine Stickstoffquelle, und durch Fortsetzen der Kultivierung unter Einspeisung sowohl einer Kohlenstoffquelle als auch eines Nährstoffs mit der Wirkung, daß das Bakterienwachstum gefördert wird, L-Glutaminsäure mit einer hohen Produktivität und einer hohen Ausbeute während der kontinuierlichen Kultivierung produziert wird, während das Bakterienwachstum durch Temperatur, oberflächenaktive Mittel, Antibiotika und Biotinkonzentration ohne Beendigung des Bakterienwachstums produziert wird. Anders ausgedrückt haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung die vorliegende Erfindung auf der Grundlage der Ergebnisse gemacht, daß L-Glutaminsäure, während eine frische Zelle mit einer höheren Produktivität gezüchtet wird, nicht unter herkömmlichen Bedingungen zur Beendigung des Bakterienwachstums effizient hergestellt wird, und daß das Bakterienzellgewicht in dem Fermenter aufgrund des Wachstums der Bakterien selbst nach Extraktion der Kulturbrühe aufrechterhalten werden kann, so daß eine hohe Produktivität über die gesamte kontinuierliche Kultivierung über einen langen Zeitraum aufrechterhalten wird.
In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Herstellen von L-Glutaminsäure durch kontinuierliche Fermentation mit einem einzigen Fermenter bereitgestellt, welches das Einimpfen eines Mikroorganismus in ein flüssiges Medium, das eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und 10 μg/l oder mehr Biotin enthält, das Durchführen einer kontinuierlichen L-Glutaminsäure-Fermentation, wobei sowohl eine Kohlenstoffquelle als auch eine Stickstoffquelle, anorganische Salze und Biotin eingespeist werden, so dass der Mikroorganismus wächst und gleichzeitig L-Glutaminsäure produziert, das kontinuierliche Entnehmen der selben Menge der Kulturbrühe aus dem Fermenter und das anschließende Gewinnen der in der Kulturbrühe hergestellten und angehäuften L-Glutaminsäure umfaßt, wobei der Mikroorganismus zur Gattung Brevibacterium oder Corynebacterium gehört und die Eigenschaft hat, dass er L-Glutaminsäure produziert, wenn der Mikroorganismus in einem flüssigen Medium kultiviert wird, das 10 μg/l oder mehr Biotin enthält und keine Substanzen enthält, welche die Biotinwirkung unterdrücken.
In einer bevorzugten Ausführungsform hat der Mikroorganismus eine reduzierte α-Ketoglutarat-Dehydrogenaseaktivität oder eine Mutation der Temperaturempfindlichkeit gegenüber Substanzen, welche die Biotinwirkung unterdrücken.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Änderung der Aktivität bei der Produktion von L-Glutaminsäure über die gesamte Kultivierung durch das vorliegende Kultivierungsverfahren und das Zellrezyklierungs-Kultivierungsverfahren.
2 zeigt ein Beispiel eines Fermenters für die Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren (ein einziger Fermenter).
3 zeigt die Änderung der spezifischen Wachstumsrate übe die Zeit, beobachtet für das kontinuierliche Kultivierungsverfahren des Beispiels 1 und das Vergleichschargeneinspeisungskulturverfahren.
4 zeigt die Änderung der spezifischen Wachstumsrate über die gesamte Kultivierung, beobachtet für das kontinuierliche Kultivierungsverfahren des Beispiels 1 und das Vergleichschargeneinspeisungskulturverfahren.
5 zeigt die Änderung der Aktivität der Produktion von L-Glutaminsäure über die gesamte Kultivierung, beobachtet für das kontinuierliche Kultivierungsverfahren des Beispiels 3.
EINGEHENDE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Erfindungsgemäß kann jeder Mikroorganismus mit der Fähigkeit zur Anhäufung von L-Glutaminsäure ohne besondere Einschränkung eingesetzt werden. Beispielsweise können die folgenden Bakterienstämme eingesetzt werden:
Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869
Brevibacterium lactofermentum FERM BP-4172 (AJ 12821)
Brevibacterium lactofermentum FERM BP-1363 (AJ 12300)
Brevibacterium lactofermentum FERM BP-5189 (AJ 13029)
Brevibacterium flavum ATCC 14067
Brevibacterium flavum FERM BP-4173 (AJ 12822)
Brevibacterium divaricatum ATCC 14020
Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
Corynebacterium glutamicum FERM BP-4174 (AJ 12823)
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870
Es ist allgemein bekannt, daß unter den L-Glutaminsäure anhäufenden Bakterien einige Bakterien L-Glutaminsäure in einem Kulturmedium, das eine überschüssige Menge an Biotin enthält, in Anwesenheit einer Substanz, welche die Wirkung von Biotin unterdrückt, anhäufen, während einige Bakterienstämme unter den Bakterien L-Glutaminsäure in Anwesenheit einer Substanz anhäufen, welche die Wirkung von Biotin unterdrückt. Unter diesen sind L-Glutaminsäure anhäufende Bakterien in Abwesenheit einer Substanz, welche die Wirkung von Biotin unterdrückt, bevorzugte erfindungsgemäße Mikroorganismen. Genauer gesagt ist gemäß der vorliegenden Erfindung der Mikroorganismus mit der Fähigkeit zur Anhäufung von L-Glutaminsäure ein Mikroorganismus mit der Fähigkeit zur Produktion und Anhäufung von L-Glutaminsäure, wenn er in einem flüssigen Medium, enthaltend Biotin bei einer Konzentration von 10 μg/l oder mehr, beispielsweise 10 bis 1000 μg/l, ohne Zugabe einer Substanz, welche die Wirkung von Biotin unterdrückt, kultiviert wird.
Wenn ein Bakterienstamm mit der Fähigkeit zur Produktion und Anhäufung von L-Glutaminsäure, beispielsweise mutierte Stämme mit einer reduzierten α-Ketoglutaratdehydrogenase-Aktivität und der Fähigkeit zur Produktion von L-Glutaminsäure, wen er in einem flüssigen Medium einer Biotinkonzentration von 10 μg/l oder mehr, beispielsweise 10 bis 1000 μg/l, wie FERM BP-4172 (AJ 12821), FERM BP-4173 (AJ 12822), und FERM BP-4174 (AJ 12823) (ungeprüfte offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 6-23779), verwendet wird, erfordert der Bakterienstamm nicht die Zugabe einer Substanz, welche die Wirkung von Biotin unterdrückt, beispielsweise oberflächenaktive Mittel und Antibiotika, wobei die Kontrolle der Kultur bei der L-Glutaminsäure-Fermentation über einen langen Zeitraum durchgeführt werden kann und L-Glutaminsäure kostengünstig hergestellt werden kann. Das gleiche gilt außerdem für einen mutierten Stamm mit einer Mutation der Temperaturempfindlichkeit gegenüber Substanzen, welche die Wirkung von Biotin unterdrücken und die Fähigkeit zur Anhäufung von L-Glutaminsäure in einem Kulturmedium, welches Biotin im Überschuß enthält, in Abwesenheit jeglicher Substanz haben, welche die Wirkung von Biotin unterdrückt, wie FERM BP-5189 (AJ 13029) (internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 96/06180).
Als Medium, das gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden soll, sind gewöhnliche flüssige Medien, die zweckmäßigerweise eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Salze und organische Mikronährstoffe, wie Aminosäuren und Vitamine enthalten, zufriedenstellend. Als Kohlenstoffquelle können Zucker, wie Glucose, Saccharose, Fructose, Galactose und Lactose; saccharifizierte Stärkelösungen, die diese Zucker enthalten; süße Kartoffelmelasse, Zuckerrübenmelasse und Zuckerrohrmelasse; und daneben organische Säuren, wie Essigsäure, Alkohole, wie Ethanol und Glycerin, eingesetzt werden. Als Stickstoffquelle können Ammoniakgas, wässeriges Ammoniak, Ammoniumsalze, Harnstoff, Nitrate, organische Stickstoffquellen für die ergänzende Verwendung, beispielsweise Ölkuchen, Sojabohnenproteinhydrolyselösung (Hydrolysat), Caseinabbauprodukte, andere Aminosäuren, Maisquellwasser, Hefeextrakt, Fleischextrakte und Peptide, wie Pepton, Extrakte verschiedener Bakterien, die für die Fermentation eingesetzt werden, und Hydrolyseprodukte davon zugegeben werden. Als organische Salze können Phosphate, Magnesiumsalze, Calciumsalze, Eisensalze und Mangansalze zweckmäßigerweise zugegeben werden
Wenn nun ein in der vorliegenden Erfindung einzusetzender Mikroorganismus einen spezifischen Nährstoff für sein Wachstum benötigt, wird der Nährstoff als eine Zubereitung oder ein natürliches Produkt, welches diesen enthält, zugegeben. Daneben können bei Bedarf Entschäumungsmittel zugegeben werden.
Erfindungsgemäß wird die Konzentration der Kohlenstoffquelle in dem Kulturmedium vorzugsweise bei 5 g/l oder weniger gehalten. Der Grund dafür ist, daß der Verlust des Zuckeranteils aufgrund der Extraktion der Kulturbrühe bei einem Minimum gehalten wird.
Die Kultivierung des Mikroorganismus wird im allgemeinen unter aeroben Bedingungen innerhalb eines Bereichs von pH 5 bis 8 und einem Temperaturbereich von 25 bis 40°C durchgeführt. Der pH-Wert der Kulturbrühe wird auf einen vorbestimmten Wert innerhalb des Bereichs eingestellt, indem anorganische oder organische Säuren und alkalische Substanzen und daneben Harnstoff, Calciumcarbonat und Ammoniakgas verwendet werden. Wenn die Sauerstoffeinspeisungsrate erhöht werden soll, können Mittel, wie die Zugabe von Sauerstoff in Luft, um die Sauerstoffkonzentration bei 21% oder höher zu halten, die Kultivierung unter Druck oder unter Erhöhung der Schüttelgeschwindigkeit und die Erhöhung der Belüftungsrate, eingesetzt werden.
Wenn die kontinuierliche Kultur eines Bakterienstammes, der vorteilhafterweise L-Glutaminsäure in Anwesenheit einer Substanz, welche die Wirkung von Biotin unterdrückt, anhäuft, durchgeführt wird, indem das Bakterienwachstum auf ein gewisses Maß bei einer geeigneten Temperatur (25 bis 40°C), eine geeignete Konzentration an oberflächenaktivem Mittel (Polyoxyethylensorbitanmonopalmitat; 100 bis 5000 mg/l), eine geeignete Konzentration an Antibiotika (Penicillin; 0,1 bis 50 U/ml), und eine geeignete Biotinkonzentration (5 bis 5000 μg/l) kontrolliert und gehalten werden, wird L-Glutaminsäure in einer höheren Ausbeute und einer höheren Produktivität gleichzeitig mit dem Bakterienwachstum produziert.
Im Fall von Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 wird beispielsweise, wenn die Kontrolle und die Aufrechterhaltung des Bakterienwachstums mit Polyoxyethylensorbitanmonopalmitat durchgeführt wird, die Konzentration vorzugsweise in einem Bereich von 100 bis 1000 mg/l sein.
Um L-Glutaminsäure effizient anzuhäufen, kann Biotin oder ein Derivat davon bei Bedarf zu dem Kulturmedium gegeben werden. Zudem kann eine Fettsäure oder ein Ester davon, oder Penicillin oder ein Derivat davon vorteilhafterweise zugegeben werden. Die Zugabe von Biotin oder eines Derivats davon ist nützlich, um ein Bacterium dabei zu unterstützen, die Fähigkeit zur Produktion von L-Glutaminsäure über einen langen Zeitraum aufrechtzuerhalten. Die zuzugebende Menge wird in zufriedenstellender Weise auf eine Endkonzentration in der Kulturbrühe von 5 bis 5000 μg/l eingestellt. Als Fettsäure ist eine gesättigte höhere Fettsäure von 12 bis 18 Kohlenstoffatomen bevorzugt; der Ester davon ist unter Glycerinester, Sorbitanester, Saccharoseester, Polyethylenglycolester und Polyoxyethylensorbitanester ausgewählt. Wenn eine Fettsäure oder ein Ester davon und Penicillin oder ein Derivat davon zuzugeben sind, werden sie in einer Endkonzentration unter der normalen Konzentration zugegeben, nämlich in einer Konzentration, so daß das Wachstum ohne Unterbrechung des Wachstums aufrechterhalten werden kann. Wenn beispielsweise die Fettsäure oder der Ester davon zugegeben wird, ist deren Konzentration zweckmäßig bei 100 bis 1000 mg/l; wenn Penicillin oder das Derivat davon zugegeben wird, ist dessen Konzentration in einem Medium bei 0,2 bis 10 U/ml.
In der kontinuierlichen L-Glutaminsäure-Fermentation werden sowohl eine Kohlenstoffquelle als auch ein Nährstoff mit der Wirkung der Förderung des Bakterienwachstums (Wachstumsförderungsnährstoff) zugespeist. Beispiele der Kohlenstoffquelle umfassen solche, die vorstehend genannt worden sind. Der Wachstumsförderungsnährstoff ist nicht speziell eingeschränkt, mit der Maßgabe, daß der Nährstoff das Bakterienwachstum fördert. Der Ausdruck "Bakterienwachstum" bezieht sich auf die Erhöhung der Anzahl der Zellen. Beispiele des Wachstumsförderungsnährstoff umfassen eine Stickstoffquelle, anorganische Salze und organische Mikronährstoffe, wie Aminosäuren und Vitamine.
Die Kohlenstoffquelle und der Wachstumsförderungsnährstoff werden in Mengen zugegeben, die effektiv sind, um sowohl das Bakterienwachstum als auch die L-Glutaminsäure-Produktion aufrechtzuerhalten. Die Kohlenstoffquelle und der Wachstumsförderungsnährstoff werden vorzugsweise in der Form einer Lösung zugegeben. Eine Lösung, die beide enthält, oder Lösungen, die sie getrennt enthalten, können als Einspeisungslösung oder Einspeisungslösungen zugegeben werden.
Die Chargenkultur oder Chargeneinspeisungskultur kann zufriedenstellend in einer anfänglichen Stufe der kontinuierlichen Kultur gemäß der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden, um die Konzentration der L-Glutaminsäure und die Bakterienzellkonzentration zu erhöhen, so daß danach eine kontinuierliche Kultivierung (und Extraktion) begonnen werden kann; oder die Bakterien bei einer hohen Konzentration können eingeimpft werden und die kontinuierliche Kultivierung kann durchgeführt werden, sobald die Kultivierung initiiert worden ist.
Die Bereitstellung der Einspeisungslösung und die Extraktion sollten in einer geeigneten Stufe gestartet werden. Der Zeitpunkt der Einspeisung der Einspeisungslösung ist nicht notwendigerweise auf den Zeitpunkt der Extraktion eingestellt. Die Bereitstellung der Einspeisungslösung und die Extraktion können zufriedenstellend kontinuierlich oder in Abschnitten durchgeführt werden. Zu der Einspeisungslösung werden für das Bakterienwachstum erforderliche Nährstoffe, wie vorstehend beschrieben, zugegeben, um das kontinuierliche Bakterienwachstum zu fördern.
Die Produktivität wird durch die folgende Formel ausgerechnet:
Erfindungsgemäß wird die Produktivität von L-Glutaminsäure in etwa das 2-fache der Produktivität durch das Chargeneinspeisungskultivierungsverfahren (40 Stunden Kultivierungsdauer) erhöht.
Im Vergleich mit dem Zellrezyklierungs-Kultivierungsverfahren kann die Aktivität von produzierter L-Glutaminsäure offensichtlich über einen langen Zeitraum in vorteilhafter Weise durch das erfindungsgemäße Kultivierungsverfahren aufrechterhalten werden. Dies geht aus den Ergebnissen der Änderung der Aktivität der Produktion von L-Glutaminsäure über die gesamte Kultivierung durch das erfindungsgemäße kontinuierliche Kultivierungsverfahren und das Zellrezyklierungs-Kultivierungsverfahren hervor. Die Kultivierungsbedingungen in 1 entsprechen dem in der ungeprüften offengelegten japanischen Patentanmeldung Nr. 62-48394 beschriebenen Bedingungen. Was das erfindungsgemäße kontinuierliche Kultivierungsverfahren betrifft, werden jedoch 500 mg/l Polyoxyethylensorbitanmonopalmitat zugegeben, danach wird kontinuierlich eine Einspeisungslösung, enthaltend Glucose, KH₂PO₄, MgSO₄, Sojabohnenproteinhydrolysat und Polyoxyethylensorbitanmonopalmitat, zugegeben und die Kulturbrühe wird extrahiert. Somit kann das erfindungsgemäße Verfahren die Produktion von L-Glutaminsäure in einem höheren Maß als bei dem kontinuierlichen Zellrezyklierungs-Kultivierungsverfahren stabil aufrechterhalten werden.
Ein repräsentatives Beispiel des Fermentationssystems, das in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden soll, ist in 2 gezeigt. Vorzugsweise werden kontinuierliche Kultivierungsverfahren zur Produktion von L-Glutaminsäure, während eine frische Bakterienzelle mit der hohen Produktivität gezüchtet wird, im allgemeinen in einem einzelnen Fermenter im Hinblick auf die praktische Kultivierungskontrolle durchgeführt. Jedes kontinuierliche Kultivierungsverfahren zur Produktion von L-Glutaminsäure, während Bakterien gezüchtet werden, kann jedoch unabhängig von der Anzahl der eingesetzten Fermenter zufriedenstellend sein. Mehrere Fermenter können manchmal eingesetzt werden, weil das Volumen des Fermenters gering ist. In diesem Fall werden Fermenter linear oder parallel für das kontinuierliche Verfahren miteinander verbunden, so daß die hohe Produktion an L-Glutaminsäure mit der Maßgabe erzielt werden kann, daß die Kultivierungsbedingungen jedes Fermenters Bedingungen sind, um L-Glutaminsäure unter Bakterienwachstum zu erzielen.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren kann L-Glutaminsäure kontinuierlich bei einer hohen Produktionsrate hergestellt werden. Eine verlängerte Kultivierung kann durch Verwenden eines kontinuierlichen Produktionsverfahrens erzielt werden, wobei eine Verringerung der arbeitsaufwendigen Tätigkeiten erzielt wird. Außerdem ist das dafür eingesetzte System im Vergleich mit Systemen des kontinuierlichen Zellrezyklierungs-Kultivierungsverfahrens und des kontinuierlichen Mehrstufen-Kultivierungsverfahrens einfach, so daß die vorliegende Erfindung zur Verringerung der festen Kosten und der Bakterienkontamination wirksam ist.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen eingehender beschrieben.
Beispiel 1
Ein Medium (30 ml) enthaltend 30 g/l Glucose, 1 g/l KH₂PO₄, 0,4 g/l MgSO₄·7H₂O, 4 g/l Harnstoff, 20 mg/l FeSO₄·7H₂O, 20 mg/l MnSO₄·4H₂O, 15 ml/l Sojabohnenproteinhydrolysat und 300 μg/l Biotin, wurde in einen 500-ml-Kolben gegossen, und danach wurde 10 Minuten unter Erhitzen bei 115°C sterilisiert. Das Medium wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, und danach wurde Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 eingeimpft, um die Animpfkultur bei 30°C während 24 Stunden herzustellen.
Ein Medium (270 ml) enthaltend 60 g/l Glucose, 1 g/l KH₂PO₄, 1 g/l MgSO₄, 15 ml/l Sojabohnenproteinhydrolysat und 300 mg/l Biotin, wurde in einen 1 l-Fermenter gegossen, der vorher sterilisiert worden war, und danach wurde die vorstehend beschriebene Animpfkulturbrühe (30 ml) zugegeben und die erhaltene Kultur wurde bei 30°C kultiviert. Die Belüftungsrate war 300 ml/min., und der pH-Wert wurde mit NH₃-Gas bei 7,5 gehalten.
Fünf Stunden nach Beginn der Kultivierung wurde Polyoxyethylensorbitanmonopalmitat in einer Endkonzentration von 500 mg/l zugegeben. Zu dem Fermenter wurde eine Einspeisungslösung, enthaltend 180 g/l Glucose, 1 g/l KH₂PO₄, 1 g/l MgSO₄, 15 ml/l Sojabohnenproteinhydrolysat und 500 mg/l Polyoxyethylensorbitanmonopalmitat, kontinuierlich in einer Rate von 30 ml pro Stunde zugegeben, und dasselbe Volumen der Kulturbrühe wurde extrahiert, um das Arbeitsvolumen in dem Reaktor konstant zu halten.
Die Zuckerkonzentrationen in allen extrahierten Kulturbrühen waren 5 g/l oder weniger.
3 zeigt die Änderung der spezifischen Wachstumsrate über die gesamte Kultivierung. Der hier verwendete Ausdruck "spezifische Wachstumsrate" bedeutet eine proportionale Konstante mit der Maßgabe, daß die Konzentration dX der Bakterien, die innerhalb eines sehr kurzen Zeitraums dT wachsen, proportional zu der Konzentration X der zu dem Zeitpunkt vorhandenen Bakterien ist, wobei diese Konstante durch die Einheit Liter/h (l/h) dargestellt wird. Die Konzentration X ist ein Trockengewicht von Zellen, die in einem Einheitsvolumen der Kulturbrühe (ausgedrückt als "g/l") enthalten sind. Außerdem bedeutet der relative Wert der spezifischen Wachstumsrate einen relativen Wert, wenn die spezifische Wachstumsrate in der anfänglichen Stufe des exponentiellen Wachstums als 1 definiert wird. Anders als bei dem Chargeneinspeisungskultivierungsverfahren wird das Bakterienwachstum über die gesamte Kultivierung durch das vorliegende kontinuierliche Kultivierungsverfahren fortgesetzt.
Das Ergebnis der kontinuierlichen Kultivierung während 40 Stunden ist, daß die Ausbeute von L-Glutaminsäure 56% und die Produktion von L-Glutaminsäure 5 g/l/h war. Die Ausbeute wurde durch Teilen der Gesamtmenge der in der Kultivierung erhaltenen L-Glutaminsäure durch die Gesamtmenge des in der Kultivierung eingesetzten Zuckers berechnet, wobei die Mengen auf Gewichtsbasis angegeben werden. Die Produktivität wurde gemäß der vorstehend beschriebenen Formel berechnet.
Zum Vergleich wurde auch ein Chargeneinspeisungskultivierungsverfahren untersucht.
Genauer gesagt wurde ein Medium (270 ml) enthaltend 60 g/l Glucose, 1 g/l KH₂PO₄, 1 g/l MgSO₄, 15 ml/l Sojabohnenproteinhydrolysat und 300 mg/l Biotin in einen 1 l-Fermenter, der vorher sterilisiert worden war, gegossen, und danach wurde die vorstehend beschriebene Animpfkulturbrühe (30 ml) für die Kultivierung unter denselben Bedingungen zugegeben.
Fünf Stunden nach Beginn der Kultivierung wurde eine größere Menge Polyoxyethylensorbitanmonopalmitat in einer Endkonzentration von 2000 mg/l zugegeben. Eine Einspeisungslösung, enthaltend 400 g/l Glucose und 2000 mg/l Polyoxyethylensorbitanmonostearat, wurde bei 6 ml/h kontinuierlich zugegeben. Es wurde jedoch keine Extraktion desselben Volumens der Kulturbrühe durchgeführt, so daß das Arbeitsvolumen in dem Fermenter erhöht wurde. Wie 3 zeigt, wurde unter diesen Bedingungen das Bakterienwachstum vor 20 Stunden beendet. Somit wurde die Kultivierung bis zu einem Zeitraum von 40 Stunden fortgesetzt, wobei eine Ausbeute an L-Glutaminsäure von 56% und eine Produktion von 2,6 g/l/h erzielt wurden. Die Ausbeute wurde auf dieselbe Weise wie vorstehend beschrieben berechnet. Die Produktion wurde durch Teilen der Menge der L-Glutaminsäure, die in der Kultivierung pro Einheitsvolumen der endgültigen Kulturbrühe (g/l) produziert wurde, durch die Kultivierungsdauer (Stunde) berechnet.
Im Vergleich zu dem Einspeisenchargenkultivierungsverfahren ist die Produktion von L-Glutaminsäure die 2,5-fache pro Zeiteinheit in dem erfindungsgemäßen kontinuierlichen Kultivierungsverfahren, wobei die Produktivität erheblich verbessert wird.
Beispiel 2
Ein Medium (30 ml) enthaltend 30 g/l Glucose, 1 g/l KH₂PO₄, 0,4 g/l MgSO₄·7H₂O, 4 g/l Harnstoff, 20 mg/l FeSO₄·7H₂O, 20 mg/l MnSO₄·4H₂O, 15 ml/l Sojabohnenproteinhydrolysat und 300 μg/l Biotin, wurde in einen 500-ml-Kolben gegossen, und danach wurde 10 Minuten unter Erhitzen bei 115°C sterilisiert. Das Medium wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, und danach wurde Brevibacterium lactofermentum FERM BP-4172 (AJ 12821) eingeimpft, um während 24 Stunden bei 30°C eine Animpfkultur herzustellen.
Ein Medium (270 ml) enthaltend 60 g/l Glucose, 1 g/l KH₂PO₄, 1 g/l MgSO₄, 15 ml/l Sojabohnenproteinhydrolysat und 300 mg/l Biotin, wurde in einen 1 l-Fermenter gegossen, der vorher sterilisiert worden war, und danach wurde die vorstehend beschriebene Animpfkulturbrühe (30 ml) zugegeben, und die erhaltene Kultur wurde bei 30°C kultiviert. Die Belüftungsrate war 300 ml/min., und der pH-Wert wurde mit NH₃-Gas bei 7,5 gehalten. Zu der Kultur wurde eine Einspeisungslösung, enthaltend 300 g/l Glucose, 1 g/l KH₂PO₄, 1 g/l MgSO₄ und 15 ml/l Sojabohnenproteinhydrolysat, kontinuierlich bei 25 ml pro Stunde gegeben, und dasselbe Volumen der Kulturbrühe wurde extrahiert, um das Arbeitsvolumen in dem Fermenter bei einem konstanten Volumen zu halten.
Die Zuckerkonzentrationen in allen extrahierten Kulturbrühen waren 5 g/l oder weniger.
4 zeigt die Veränderung der spezifischen Wachstumsrate über die gesamte Kultivierung. Es zeigt sich, daß das Bakterienwachstum über die gesamte Kultivierung fortgesetzt wird.
Das Ergebnis des Fortsetzens der Kultivierung während 40 Stunden ist, daß die Ausbeute von L-Glutaminsäure 56% war und die Produktivität 6,6 g/l/h war.
Zum Vergleich wurde auch ein Chargeneinspeisungskultivierungsverfahren untersucht.
Genauer gesagt wurde ein Medium (270 ml) enthaltend 60 g/l Glucose, 1 g/l KH₂PO₄, 1 g/l MgSO₄, 15 ml/l Sojabohnenproteinhydrolysat und 300 μg/l Biotin, in einen 1 l-Fermenter, der vorher sterilisiert worden war, gegossen, und danach wurde die vorstehend beschriebene Animpfkulturbrühe (30 ml) unter denselben Bedingungen zugegeben. Eine Einspeisungslösung, enthaltend 500 g/l Glucose, wurde bei 7 ml/h kontinuierlich in die Kultur während bis zu 40 Stunden gegeben. Das Ergebnis war eine Ausbeute von 54% L-Glutaminsäure und eine Produktion von 3,2 g/l/h.
Die Ausbeuten und die Produktivitäten wurden auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 berechnet.
Im Vergleich zu dem Einspeisenchargenkultivierungsverfahren ist die Produktion der L-Glutaminsäure die 2-fache pro Zeiteinheit in dem erfindungsgemäßen kontinuierlichen Kultivierungsverfahren, wobei die Produktivität signifikant verbessert wird.
Beispiel 3
Ein Medium (30 ml) enthaltend 30 g/l Glucose, 1 g/l KH₂PO₄, 0,4 g/l MgSO₄·7H₂O, 4 g/l Harnstoff, 20 mg/l FeSO₄·7H₂O, 20 mg/l MnSO₄·4H₂O, 15 ml/l Sojabohnenproteinhydrolysat und 300 μg/l Biotin, wurde in einen 500-ml-Kolben gegossen, und danach wurde 10 Minuten unter Erhitzen bei 115°C sterilisiert. Das Medium wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, und danach wurde Brevibacterium lactofermentum FERM BP-4172 (AJ 12821) eingeimpft, um während 24 Stunden bei 30°C eine Animpfkultur herzustellen.
Ein Medium (270 ml) enthaltend 60 g/l Glucose, 1 g/l KH₂PO₄, 1 g/l MgSO₄, 15 mg/l Sojabohnenproteinhydrolysat und 300 μg/l Biotin, wurde in einen 1 l-Fermenter gegossen, der vorher sterilisiert worden war, und danach wurde die vorstehend beschriebene Animpfkulturbrühe zugegeben und die erhaltene Kultur wurde bei 30°C kultiviert. Die Belüftungsrate war 300 ml/min., während der pH-Wert mit NH₃-Gas bei 7,5 gehalten wurde. Zu der Kultur wurde eine Einspeisungslösung, enthaltend 300 g/l Glucose, 1 g/l KH₂PO₄, 1 g/l MgSO₄ und 15 ml/l Sojabohnenproteinhydrolysat, kontinuierlich bei 40 ml pro Stunde zugegeben, und danach wurde dasselbe Volumen der Kulturbrühe extrahiert, um das Arbeitsvolumen in dem Fermenter konstant zu halten.
Die Zuckerkonzentrationen in allen extrahierten Kulturbrühen waren 5 g/l oder weniger.
Das Ergebnis des Fortsetzen der Kultivierung während 100 Stunden ist eine Ausbeute an L-Glutaminsäure von 55% und eine Produktivität von 8,3 g/l/h. Die Ausbeute und die Produktivität wurden auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 berechnet.
5 zeigt die Änderung der Aktivität der Produktion von L-Glutaminsäure über die gesamte Kultivierung. Es zeigt sich, daß über einen langen Zeitraum die Aktivität bei einem hohen Wert gehalten wurde. Die Aktivität der Produktion von L-Glutaminsäure wurde als die Menge an L-Glutaminsäure (g), die in einer Zeiteinheit (Stunde) produziert wird, bezogen auf das Gewicht der Zellen (Trockengewicht: g) ausgedrückt.

Claims

Verfahren zum Herstellen von L-Glutaminsäure durch kontinuierliche Fermentation mit einem einzigen Fermenter, welches das Einimpfen eines Mikroorganismus in ein flüssiges Medium, das eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und 10 μg/l oder mehr Biotin enthält, das Durchführen einer kontinuierlichen L-Glutaminsäure-Fermentation, wobei sowohl eine Kohlenstoffquelle als auch eine Stickstoffquelle, anorganische Salze und Biotin eingespeist werden, so dass der Mikroorganismus wächst und gleichzeitig L-Glutaminsäure produziert, das kontinuierliche Entnehmen der selben Menge der Kulturbrühe aus dem Fermenter und das anschließende Gewinnen der in der Kulturbrühe hergestellten und angehäuften L-Glutaminsäure umfasst, wobei der Mikroorganismus zur Gattung Brevibacterium oder Corynebacterium gehört und die Eigenschaft hat, dass er L-Glutaminsäure produziert, wenn der Mikroorganismus in einem flüssigen Medium kultiviert wird, das 10 μg/l oder mehr Biotin enthält und keine Substanzen enthält, welche die Biotinwirkung unterdrücken.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus eine verringerte á-Ketoglutarat-Dehydrogenaseaktivität oder eine Mutation der Temperaturempfindlichkeit gegenüber Substanzen aufweist, welche die Biotinwirkung unterdrücken.