JPH10150996A - 連続発酵によるｌ−グルタミン酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 Ｌ−グルタミン酸発酵の生産性を高める為
に、簡便に、長時間にわたり安定して高生産性を維持す
るＬ−グルタミン酸の連続発酵法を提供すること。 【解決手段】 Ｌ−グルタミン酸生産能を有する微生物
を炭素源及び窒素源を含む液体培地に接種し、炭素源及
び菌体増殖促進効果を持つ栄養素の両方を流加しつつ、
菌体増殖を伴うＬ−グルタミン酸の連続培養を行い、培
養終了後に培養液中に生成蓄積したＬ−グルタミン酸を
採取することを特徴とする連続発酵によるＬ−グルタミ
ン酸の製造法である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】Ｌ−グルタミン酸は調味料な
どの食品素材や各種化成品の原料として広く利用されて
いる。本発明は連続発酵法によりＬ−グルタミン酸を効
率よく製造する方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】近年、Ｌ−グルタミン酸の需要の増大に
より工業的に有利な製造法の開発が望まれており、下記
の様な製造方法が発明されている。

【０００３】（１）バッチ（Ｂａｔｃｈ）培養法、流加
培養法（Ｆｅｄ−Ｂａｔｃｈ培養法） これらの培養法は、連続培養法と比較して設備的には簡
素であり、短時間で培養が終了し、雑菌汚染による被害
が少ないというメリットがある。しかし、時間経過とと
もに培養液中のＬ−グルタミン酸濃度が高くなり、浸透
圧あるいは生成物阻害等の影響により生産性及び収率が
低下してくる。このため、長時間にわたり安定して高収
率かつ高生産性を維持するのが困難である。

【０００４】（２）連続培養法 連続培養法は、発酵槽内で目的物質が高濃度に蓄積する
のを回避することによって、長時間にわたって高収率か
つ高生産性を維持できるという特徴がある。連続培養法
の中で最も単純で一般的な形式は単槽連続培養法であ
り、アミノ酸発酵においてもＬ−リジン発酵、Ｌ−アル
ギニン発酵など多くの報告がなされている（Ｌｙｓ：To
shihiko Hirao et. al. Appl. Microbiol. Biotechno
l., 32,269-273 (1989)、Ａｒｇ：Tomoki Azuma et. a
l. J. Ferment. Technol., 66(3), 285-290(1988)）。
これらＬ−リジンやＬ−アルギニンの発酵では、通常、
菌体増殖と目的アミノ酸の生成が同時に起こるため、単
槽連続培養法の適用は容易であった。

【０００５】一方、Ｌ−グルタミン酸発酵は実用レベル
の単槽連続培養法は困難とされてきた。すなわち、従
来、Ｌ−グルタミン酸発酵は菌体生長因子であるビオチ
ンの除去、ペニシリン等の抗生物質添加、界面活性剤の
添加、温度変換等なんらかの方法で菌体増殖を停止させ
なければ、Ｌ−グルタミン酸は多量に生成しないとされ
ていた（発酵工学会誌, Vol.41, No.12, 645-651(196
3)、近代工業化学, Vol.23, 121-142, 朝倉書店）。
Ｂａｔｃｈ培養法やＦｅｄ−Ｂａｔｃｈ培養法でＬ−グ
ルタミン酸を多量に生成させるためには、菌体増殖を停
止させる培養条件にするのである。従って、Ｌ−グルタ
ミン酸発酵を連続培養で製造する場合、従来の菌体増殖
を停止させる培養条件では菌体が流出するのみで、菌体
を発酵槽内に維持できないから不適と考えられてきた。
そのため、Ｌ−グルタミン酸発酵における連続培養法の
研究は、当初、上田氏ら（発酵工学会誌, Vol.41, No.
9, 450-458, 1963）や三村氏ら（発酵工学会誌, Vol.4
2, No.2, 70-78, 1964）のように、第１槽で菌体の増殖
を行わせ、第２槽以降で菌体の増殖を抑制しＬ−グルタ
ミン酸の生成を行わせる多槽連続培養法の研究が行われ
た。

【０００６】その後、菌体増殖工程とＬ−グルタミン酸
生成工程を別々に行うと言う発想に基づく培養方法とし
て、セルリサイクル培養法と固定化菌体培養法の二法が
開発されてきた。

【０００７】まず、セルリサイクル培養法は、菌体の増
殖が停止しているＬ−グルタミン酸が生成した培養液を
引き抜いた後、菌体とＬ−グルタミン酸を分離して菌体
だけをリサイクルする方法であり（特開昭５２−１３６
９８５、特開昭６０−１３３８９１または特開昭６２−
４８３９４）、高収率及び高生産性を比較的長時間維持
できる。しかし、この方法は菌体分離装置が必要となる
ため培養装置が複雑になるという欠点があった。更に、
セルリサイクル培養法は、菌体増殖を停止した菌体をリ
サイクルするため、時間経過とともに菌体そのもののＬ
−グルタミン酸生産能が低下してしまうことから、培養
時間には限りがあった。

【０００８】一方、固定化菌体培養法もＬ−グルタミン
酸を高収率及び高生産性で得ることが可能である(H.S.K
IM et al. Biotechnology and Bioengineering, Vol.2
6, 2167-2174(1982))が、菌体を固定化する方法を実用
化するためには固定化担体が高価であることと合わせ、
担体交換の技術など解決すべき課題が多く、工業化には
必ずしも適さない。

【０００９】このように、Ｂａｔｃｈ培養法やＦｅｄ−
Ｂａｔｃｈ培養法でＬ−グルタミン酸を高収率で生成す
る培養条件では、菌体の増殖を完全に停止させるため、
培養後半における発酵菌のＬ−グルタミン酸生産能力が
低下し、生産性の向上が困難であった。また、従来の連
続培養法は、菌体を発酵槽に追加添加するか若しくはリ
サイクルするための装置が必要となることで、装置全体
が複雑になること及び雑菌汚染の可能性が増加するこ
と、更には菌体増殖が停止する条件で培養するため高生
産性の持続が困難であること等、工業化を達成するため
には課題が多い。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】Ｌ−グルタミン酸の需
要拡大に応え、より安価に製造するためには、従来以上
にＬ−グルタミン酸発酵の生産性を高める必要があっ
た。そこで、本発明が解決しようとする課題は、菌体増
殖とＬ−グルタミン酸生成を同時に発酵槽内で行い、か
つ簡便な装置でＬ−グルタミン酸の高生産性連続培養法
を発明することである。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者は、従来の発酵
法によるＬ−グルタミン酸の製造法を改良すべく鋭意検
討した結果、ブレビバクテリウム属またはコリネバクテ
リウム属に属し、かつＬ−グルタミン酸生産能を有する
微生物を、炭素源及び窒素源を含む液体培地に接種し、
炭素源及び菌体増殖促進効果を持つ栄養素の両方を流加
しつつ培養を続けることにより、菌体増殖を止めること
なく、温度、界面活性剤、抗生物質、ビオチンの濃度等
により菌体増殖を制御・維持しながら同時にＬ−グルタ
ミン酸を連続培養で生成させ、高い生産性と収率を得ら
れることを発見した。つまり、従来考えられてきたよう
な菌体増殖を停止する培養条件でＬ−グルタミン酸生成
を行うのではなく、生成活性の高いフレッシュな菌体を
増殖させつつＬ−グルタミン酸生成が効率よく行われる
ことを見い出したこと、及びフレッシュな菌体の増殖が
あるために、培養液の引き抜きを行っても、培養槽内の
菌体量が維持され、連続培養が長時間に渡って、高生産
性を維持するという知見に基づき本発明を完成させるに
至った。

【００１２】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に使用する菌株は、Ｌ−グルタミン酸生成能を有
するものであれば、特に制限されるものではなく、Ｌ−
グルタミン酸発酵に使用されている通常の発酵菌を使用
することができる。例えば、下記のような菌株が挙げら
れる。

【００１３】 ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム ＡＴＣＣ １３８６９ ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム ＦＥＲＭ ＢＰ−４１７２ （ＡＪ１２８２１） ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム ＦＥＲＭ ＢＰ−１３６３ （ＡＪ１２３００） ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム ＦＥＲＭ ＢＰー５１８９ （ＡＪ１３０２９） ブレビバクテリウム・フラバム ＡＴＣＣ １４０６７ ブレビバクテリウム・フラバム ＦＥＲＭ ＢＰ−４１７３ （ＡＪ１２８２２） ブレビバクテリウム・ディバリカタム ＡＴＣＣ １４０２０ ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ＡＴＣＣ １４０６６ コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ １３０３２ コリネバクテリウム・グルタミカム ＦＥＲＭ ＢＰ−４１７４ （ＡＪ１２８２３） コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ＡＴＣＣ １３８７０

【００１４】一般に、Ｌ−グルタミン酸生産菌の中に
は、過剰量のビオチン含有培地中において、ビオチン作
用抑制物質の存在下でＬ−グルタミン酸を生産する菌株
とビオチン作用抑制物質が非存在下でＬ−グルタミン酸
を生産する菌株が存在することは良く知られているとこ
ろである。これらのうち、ビオチン作用抑制物質が非存
在下でＬ−グルタミン酸を生産する微生物は本発明にお
いて好ましい微生物である。具体的には、Ｌ−グルタミ
ン酸生産能を有する微生物が、ビオチン濃度１０μｇ／
ｌ以上、例えば１０−１０００μｇ／ｌの液体栄養培地
中でビオチン作用抑制物質を添加せずに培養せしめた場
合、Ｌ−グルタミン酸を生成蓄積できる性質を有する微
生物が本発明において好ましい微生物として上げられ
る。

【００１５】更には、ＦＥＲＭ ＢＰ−４１７２（ＡＪ
１２８２１），ＦＥＲＭ ＢＰ−４１７３（ＡＪ１２８
２２）、ＦＥＲＭ ＢＰ−４１７４（ＡＪ１２８２３）
のように、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が
低下し、かつＬ−グルタミン酸生産能を有する変異株を
ビオチン濃度が１０μｇ／ｌ以上、例えば１０−１００
０μｇ／ｌの液体栄養培地中でビオチン作用抑制物質を
添加せずに培養を行った場合にＬ−グルタミン酸を生成
蓄積できる性質を有する菌株（特開平６−２３７７７９
公報）を用いれば、界面活性剤や抗生物質等のビオチン
作用抑制物質の添加を必要としないことから長時間にわ
たり培養管理が簡単であり、また、コスト面で安価にＬ
−グルタミン酸が製造できる。さらには、ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−５１８９（ＡＪ１３０２９）のような、ビオチン作
用抑制物質に対する温度感受性変異を有し、過剰量のビ
オチンを含有する培地中にてビオチン作用抑制物質の非
存在下でＬ−グルタミン酸を生産する能力を有する変異
株（ＷＯ９６／０６１８０国際公開パンフレットに記載
の微生物）についても、同様なことが言える。

【００１６】本発明で使用する培地としては炭素源、窒
素源、無機塩類、及び必要に応じてアミノ酸、ビタミン
などの有機微量栄養素を適宜含有する通常の液体培地が
良い。炭素源としては、グルコ−ス、シュ−クロ−ス、
フラクト−ス、ガラクト−ス、ラクト−ス等の糖類、こ
れら糖類を含有する澱粉糖化液、甘藷糖蜜、甜菜糖蜜、
ハイテストモラセス、更には酢酸等の有機酸、エタノ−
ルなどのアルコ−ル類、グリセリンなども使用される。
窒素源としてはアンモニアガス、アンモニア水、アンモ
ニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的に使用され
る有機窒素源、例えば油粕類、大豆加水分解液、カゼイ
ン分解物、その他のアミノ酸、コ−ンスティ−プリカ
−、酵母または酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペ
プチド類、各種発酵菌体およびその加水分解物などが使
用される。無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム
塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等を適宜添加する
ことができる。

【００１７】本発明に使用する微生物が生育のために特
定の栄養素を必要とする場合にはその栄養物を標品もし
くはそれを含有する天然物として添加する。また、消泡
剤も必要に応じて使用する。

【００１８】本発明では、培地中の炭素源濃度は５ｇ／
ｌ以下に保持される様にするのが好ましい。その理由
は、培養液の引き抜きによる糖分の流失を最小限にする
ためである。

【００１９】微生物の培養は通常ｐＨ５−８、温度２５
−４０℃の範囲で好気的条件で行われる。培養液のｐＨ
は無機あるいは有機の酸、アルカリ性物質、さらには尿
素、炭酸カルシウム、アンモニアガスなどによって上記
範囲内のあらかじめ定められた値に調節する。酸素の供
給速度を上げる必要があれば、空気に酸素を加えて酸素
濃度を２１％以上に保つ、あるいは培養を加圧する、攪
拌速度を上げる、通気量を上げるなどの手段を用いるこ
とができる。

【００２０】一方、ビオチン作用抑制物質の存在下でＬ
−グルタミン酸を有利に製造する菌株の場合は、適度な
温度（２５−４０℃）、適度な界面活性剤濃度（ポリオ
キシエチレンソルビタンモノパルミテ−ト；１００−５
０００mg/l）、適度な抗生物質濃度（ペニシリン；０．
１−５０U/ml）、適度なビオチン濃度（５−５０００μ
g/l）で菌体増殖をある程度制御・維持しながら連続培
養を行うと、菌体増殖と同時に高収率、高生産性でＬ−
グルタミン酸を生産する。

【００２１】例えば、ブレビバクテリウム・ラクトフェ
ルメンタムＡＴＣＣ１３８６９の場合、ポリオキシエチ
レンソルビタンモノパルミテートで制御・維持するので
あればその濃度は１００−１０００mg/lが好ましい。

【００２２】Ｌ−グルタミン酸を効率よく産生させるた
めに、必要により培地中にビオチンまたはその誘導体を
適宜添加することができる。それに加えて、脂肪酸若し
くはそのエステル、またはペニシリン若しくはその誘導
体を添加することも有効である。ビオチンまたはその誘
導体の添加は発酵菌のＬ−グルタミン酸生産能を長時間
にわたって維持させるために有効である。添加量は培養
液中の濃度が５−５０００μg/l程度になるようにする
のがよい。 一方、脂肪酸は炭素数１２−１８の飽和高
級脂肪酸が良く、そのエステルはグリセロ−ルエステ
ル、ソルビタンエステル、シュクロ−スエステル、ポリ
エチレングリコ−ルエステル、ポリオキシエチレンソル
ビタンエステルなどから選ばれる。脂肪酸またはそのエ
ステル及びペニシリンまたはその誘導体を添加する場
合、その培養液中の濃度は通常濃度以下、つまり増殖を
停止することなく増殖が維持し続ける濃度まで添加でき
る。例えば、脂肪酸またはそのエステルを添加する場合
はその濃度は１００−１０００mg/l程度が適当であり、
ペニシリンまたはその誘導体を添加する場合は、反応液
中の濃度として０．２−１０U/ml程度が適当である。

【００２３】さて、本発明の培養初期にＢａｔｃｈ培養
またはＦｅｄ−Ｂａｔｃｈ培養を行ってＬグルタミン酸
濃度及び菌体濃度を高くした後に連続培養（引き抜き）
を開始しても良いし、高濃度の菌体をシ−ドし、培養開
始とともに連続培養を行っても良い。

【００２４】適当な時期から流加液の供給及び引き抜き
を行う。流加液供給と引き抜きの開始時期は必ずしも同
じである必要はない。また、流加液の供給と引き抜きは
連続的であってもよいし、間欠的であってもよい。流加
液には上記に示したような菌体増殖に必要な栄養素を添
加し、菌体増殖が連続的に行われるようにすればよい。

【００２５】生産性は、次の式で計算する。

【００２６】本発明の方法によれば、Ｆｅｄ−Ｂａｔｃ
ｈ培養法（培養時間４０時間）と比較して、Ｌ−グルタ
ミン酸の生産性は２倍程度向上する。

【００２７】また、本培養法のＬ−グルタミン酸生成活
性は、セルリサイクル法と比較して、明らかに長時間維
持できるという長所がある。これは、本連続培養法とセ
ルリサイクル法におけるＬ−グルタミン酸の生成活性経
時変化結果（図１）から明らかである。図１の培養条件
は、特開昭６２ー４８３９４に掲載されている方法で行
った。ただし、本連続培養法については、ポリオキシエ
チレンソルビタンモノパルミテートを５００ｍｇ／ｌ濃
度添加した後、グルコース、ＫＨ₂ＰＯ₄、ＭｇＳＯ₄、
大豆蛋白酸加水分解物及びポリオキシエチレンソルビタ
ンモノパルミテートを含む基質溶液の連続的な供給およ
び反応培養液の引き抜きを行った。こうして、本発明の
方法は、セルリサイクル連続培養よりも安定的にＬ−グ
ルタミン酸の高生産性を維持できるのである。

【００２８】本発明の方法に使用される発酵装置の代表
的な一例を図２に示す。生成活性のあるフレッシュな菌
体を増殖しつつ、Ｌ−グルタミン酸を生成する連続培養
操作は、通常、単一の発酵槽で行うのが、培養管理上好
ましい。しかしながら、菌体を増殖しつつ、Ｌ−グルタ
ミン酸を生成する連続培養法であれば、発酵槽の数は問
わない。発酵槽の容量が小さい等の理由から、複数の発
酵槽を用いることもあり得る。この場合、複数の発酵槽
を配管で並列または直列に接続して連続培養を行って
も、各発酵槽の培養条件を菌体増殖を行いつつＬ−グル
タミン酸を生成する条件でさえあれば、Ｌ−グルタミン
酸の高生産性は得られるのである。

【００２９】

【実施例】以下、実施例により、本発明を詳細に説明す
る。

【００３０】

【実施例１】グルコ−ス ３０g/l、ＫＨ₂ＰＯ₄ １g/l、
ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ 0.4g/l、尿素４g/l、ＦｅＳＯ₄・７
Ｈ₂Ｏ ２０mg/l、ＭｎＳＯ₄・４Ｈ₂Ｏ ２０mg/l、大豆蛋
白酸加水分解物 １５ml/l、ビオチン ３００μg/lを含
む培地３０mlを５００ml容振とうフラスコに入れ、１１
５℃、１０分加熱殺菌した。これを室温まで冷やし、ブ
レビバクテリウム・ラクトフェルメンタムＡＴＣＣ１３
８６９を接種して２４時間３０℃にて種培養した。

【００３１】グルコ−ス ６０g/l、ＫＨ₂ＰＯ₄ １g/d
l、ＭｇＳＯ₄ １g/l、大豆蛋白酸加水分解物 １５ml/
l、ビオチン ３００μg/lを含む基質溶液２７０mlを予
め滅菌した１l容小型ガラス反応槽に入れ、これに前述
の種培養液３０mlを加え、３０℃に保温した。除菌酸素
を毎分３００ml通気し、ｐＨをNH₃ガスにて７．５に保
ちつつ攪拌培養を行った。

【００３２】培養開始後５時間目にポリオキシエチレン
ソルビタンモノパルミテートを５００mg/lの濃度になる
ように添加した。反応槽へは毎時３０mlずつ、グルコ−
ス１８０g/l、ＫＨ₂ＰＯ₄ １g/dl、ＭｇＳＯ₄ １g/dl、
大豆蛋白酸加水分解物 １５ml/l、ポリオキシエチレン
ソルビタンモノパルミテート ５００mg/lを含む基質溶
液を連続的に供給し、同量の反応培養液を引き抜き、反
応槽内の液量を一定に保った。

【００３３】引き抜いた培養液の糖濃度は、いずれも５
ｇ／ｌ以下であった。

【００３４】図３は比増殖速度の経時変化を示したもの
である。ここで、比増殖速度とは、微小時間ｄｔ内に増
殖する菌体濃度ｄＸは、その時点に存在する菌体濃度Ｘ
に正比例すると考えた時の比例定数を示し、単位は１／
ｈである。また、比増殖速度相対値とは、対数増殖初期
の比増殖速度を１としたときの相対値を意味する。Ｆｅ
ｄ−Ｂａｔｃｈ培養法とは異なり、本連続培養法は菌体
増殖が培養を通じて連続的に行われていることがわか
る。

【００３５】本培養を４０時間続けることにより、Ｌ−
グルタミン酸は収率は５６％、生産性は５ｇ／ｌ／ｈｒ
の成績が得られた。

【００３６】一方、比較のため、Ｆｅｄ−Ｂａｔｃｈ培
養法により検討した。すなわち、グルコ−ス ６０g/l、
ＫＨ₂ＰＯ₄ １g/dl、ＭｇＳＯ₄ １g/l、大豆蛋白酸加水
分解物 １５ml/l、ビオチン ３００μg/lを含む基質溶
液270mlを予め滅菌した１l容小型ガラス反応槽に入れ、
これに上述の種培養液３０mlを入れ、同様の条件にて攪
拌培養した。

【００３７】培養開始後５時間目にポリオキシエチレン
ソルビタンモノパルミテートを２０００mg/lの濃度にな
るように多量に添加した。反応槽へは毎時６mlずつ、グ
ルコ−ス ４００g/l、ポリオキシエチレンソルビタンモ
ノパルミテート ２０００mg/lを含む基質溶液を連続的
に供給した。しかし、同量の反応培養液の引き抜きは行
わず、反応槽内の液量を増加せしめた。菌体増殖は図３
に見られるように、培養２０時間を立たずに停止してい
る。こうして、４０時間まで反応を続け、Ｌ−グルタミ
ン酸は収率５６％、生産性２．６ｇ／ｌ／ｈｒの成績を
得た。

【００３８】本連続培養法は，Ｆｅｄ−Ｂａｔｃｈ培養
法と比較して、単位時間当たり２倍のＬ−グルタミン酸
が生成され、生産性が著しく向上した。

【００３９】

【実施例２】グルコ−ス ３０g/l、ＫＨ₂ＰＯ₄ １g/l、
ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ 0.4g/l、尿素４g/l、ＦｅＳＯ₄・７
Ｈ₂Ｏ ２０mg/l、ＭｎＳＯ₄・４Ｈ₂Ｏ ２０mg/l、大豆蛋
白酸加水分解物 １５ml/l、ビオチン ３００μg/lを含
む培地３０mlを５００ml容振とうフラスコに入れ、１１
５℃、１０分加熱殺菌した。これを室温まで冷やし、ブ
レビバクテリウム・ラクトフェルメンタムＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−４１７２（ＡＪ１２８２１）を接種して２４時間３
０℃にて種培養した。

【００４０】グルコ−ス ６０g/l、ＫＨ₂ＰＯ₄ １g/
l、ＭｇＳＯ₄ １g/l、大豆蛋白酸加水分解物 １５ml/
l、ビオチン ３００μg/lを含む基質溶液２７０mlを予
め滅菌した１l容小型ガラス反応槽に入れ、これに上述
の種培養液を入れ、３０℃に保温した。除菌酸素を毎分
３００ml通気し、ｐＨをNH₃ガスにて７．５に保ちつつ
攪拌培養を行った。反応槽へは毎時２５mlずつ、グルコ
−ス ３００g/l、ＫＨ₂ＰＯ₄ １g/dl、ＭｇＳＯ₄ １g/d
l、大豆蛋白酸加水分解物 １５ml/lを含む基質溶液を連
続的に供給し、同量の反応培養液を引き抜き、反応槽内
の液量を一定に保った。

【００４１】引き抜いた培養液の糖濃度は、いずれも５
ｇ／ｌ以下であった。

【００４２】図４は比増殖速度の経時変化を示したもの
である。菌体増殖が培養を通じて連続的に行われている
ことがわかる。

【００４３】本培養を４０時間続けることにより、Ｌ−
グルタミン酸は収率５６％、生産性６．６ｇ／ｌ／ｈｒ
の成績を得た。

【００４４】一方、比較のため、Ｆｅｄ−Ｂａｔｃｈ培
養法により検討した。すなわち、グルコ−ス ６０g/l、
ＫＨ₂ＰＯ₄ １g/l、ＭｇＳＯ₄ １g/l、大豆蛋白酸加水
分解物 １５ml/l、ビオチン３００μg/lを含む基質溶液
２７０mlを予め滅菌した１l容小型ガラス反応槽に入
れ、これに上述の種培養液を３０mlを入れ、同様の条件
にて攪拌培養した。反応槽へは毎時７mlずつ、グルコ−
ス ５００g/lの基質溶液を供給し、４０時間まで反応を
続け、Ｌ−グルタミン酸は収率５４％、生産性３．２ｇ
／ｌ／ｈｒの成績を得た。

【００４５】本連続培養法は、Ｆｅｄ−Ｂａｔｃｈ培養
法に対して、単位時間当たり２倍のＬ−グルタミン酸を
生成し、生産性が著しく向上した。

【００４６】

【実施例３】グルコ−ス ３０g/l、ＫＨ₂ＰＯ₄ １g/l、
ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ 0.4g/l、尿素４g/l、ＦｅＳＯ₄・７
Ｈ₂Ｏ ２０mg/l、ＭｎＳＯ₄・４Ｈ₂Ｏ ２０mg/l、大豆蛋
白酸加水分解物 １５ml/l、ビオチン ３００μg/lを含
む培地３０mlを５００ml容振とうフラスコに入れ、１１
５℃、１０分加熱殺菌した。これを室温まで冷やし、ブ
レビバクテリウム・ラクトフェルメンタムＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−４１７２（ＡＪ１２８２１）を接種して２４時間３
０℃にて種培養した。

【００４７】グルコ−ス ６０g/l、ＫＨ₂ＰＯ₄ １g/l、
ＭｇＳＯ₄ １g/l、大豆蛋白酸加水分解物 １５ml/l、ビ
オチン ３００μg/lを含む基質溶液２７０mlを予め滅菌
した１l容小型ガラス反応槽に入れ、これに上述の種培
養液を入れ、３０℃に保温した。除菌酸素を毎分３００
ml通気し、ｐＨをNH₃ガスにて７．５に保ちつつ攪拌培
養を行った。反応槽へは毎時４０mlずつ、グルコ−ス
１８０g/l、ＫＨ₂ＰＯ₄ １g/dl、ＭｇＳＯ₄ １g/dl、大
豆蛋白酸加水分解物 １５ml/lを含む基質溶液を連続的
に供給し、同量の反応培養液を引き抜き、反応槽内の液
量を一定に保った。

【００４８】引き抜いた培養液の糖濃度は、いずれも５
ｇ／ｌ以下であった。

【００４９】本培養を１００時間続けることにより、Ｌ
−グルタミン酸は収率５５％、生産性８．３ｇ／ｌ／ｈ
ｒの成績を得た。

【００５０】図５はＬ−グルタミン酸生成活性の経時変
化を示したものである。長時間を通じて活性が持続して
いることがわかる。

【００５１】

【発明の効果】本発明の方法により、Ｌ−グルタミン酸
を高い生産速度で連続生産することができる。また、連
続生産方式の採用により長時間培養が可能となり、労力
負担を低下させることができる。更に、セルリサイクル
連続培養法や多段連続培養法等に較べ装置がシンプルで
あるため、固定費の削減、雑菌汚染に対しても有効であ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】本培養法とセルリサイクル法のＬ−グルタミン
酸生成活性の経時変化

【図２】本発明の方法に使用する発酵装置の一例（単
槽）

【図３】実施例１の連続発酵法及び比較のＦｅｄ−Ｂａ
ｔｃｈ培養法で得られた、比増殖速度の経時変化

【図４】実施例２の連続発酵法及び比較のＦｅｄ−Ｂａ
ｔｃｈ培養法で得られた、比増殖速度の経時変化

【図５】実施例３の連続発酵法で得られたＬ−グルタミ
ン酸生成活性の経時変化

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 小山 洋介 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社生産技術研究所内 (72)発明者 清水 栄厚 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社生産技術部内

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】Ｌ−グルタミン酸生産能を有する微生物を
   炭素源及び窒素源を含む液体培地に接種し、炭素源及び
   菌体増殖促進効果を持つ栄養素の両方を流加しつつ、菌
   体増殖を伴うＬ−グルタミン酸の連続培養を行い、培養
   終了後に培養液中に生成蓄積したＬ−グルタミン酸を採
   取することを特徴とする連続発酵によるＬ−グルタミン
   酸の製造法
2. 【請求項２】Ｌ−グルタミン酸生産能を有する微生物
   が、ビオチン濃度１０μｇ／ｌ以上の液体栄養培地中で
   ビオチン作用抑制物質を添加せずに培養せしめた場合、
   Ｌ−グルタミン酸を生成蓄積できる性質を有する微生物
   であることを特徴とする請求項１記載の製造法