JPS60214888A - ポリ−ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸のバイオテクノロジ−による製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は微生物を二つの分離し、連続する発酵段階で連
続的に培養して細菌菌体中でＰＨＢの高い収益率及び改
良された蓄積によりボＩＪ　］）（−）−］！ｓ−ヒド
ロキシ酪酸ＰＵＢ）をバイオテクノロジーにより製造す
る方法に関するものである。

従来から原核性質の微生物の多数はＰＨＢをエネルギー
及び炭素に関する貯蔵物質として細胞内部に蓄積するこ
とができることは公知である。

微生物の細胞から単離されたＰＨＢは有効な物理的性質
を有する熱可塑性ポリエステルである。

この性質は今日たとえばポリエチレン又はポリスチロー
ルが使用される目的と同一の目的にポリエステルを使用
するのに期待されるものである。しかしこの今日慣用の
ポリマーに比してＰＨＥはバイオテクノロジー法で入手
で巻、更に生物学的方法で再び分解することもできると
いう利点憂有する。

ＰＨＢ−貯蔵微生物の通気培養が栄養媒体の特異的組成
によって、好ましくは細胞分裂及び増殖の方向に又は細
胞内のＰＵＢ−貯蔵の方向に進むとともすでに公知であ
る。微生物の細胞中でのＰＨＢの蓄積は公知方法に於て
栄養媒体中で炭素源の濃度がその他の、増殖に必要な栄
養素、たとえば窒素及びリンの供給量に比して大きく、
微生物の培養がたとえばアンモニウムを制限した増殖条
件下で行われる時に得られる。

この認識に基づ（ＰＨＢの二段階製造法はたとえばヨー
ロッパ特許第１５６６９号明細書中に記載されている。

この方法でＭｅｔｈｙｌｏｂａｃｔθｒｉｕｍＯｒｇａ
ｎｏｐｈｉｌｉｕｍ属の微生物を先ず窒素及びリンの完
全かつ十分な供給も含めて栄養素の無制限な供給に於て
微生物母集団が培養液体１１あたり好ましくは菌体２０
〜２５ｇの濃度に達するまで培養する。その際この増殖
層中に細胞内ＰＨＢ−蓄積が生じない。次いで第二発酵
段階で培養媒体の窒素−及び（又は）リン−供給の完全
な中止は再生産及び菌増殖の停止を生せしめる。

この場合この層中に初めて細胞内ＰＨＢ−蓄積が生じる
。ヨーロッパ特許第１５Ｓ６９号明細書中の記載によれ
ばこの方法で細胞乾燥重量精々２５〜４７重量％のＰＨ
Ｂ−含有量を有する菌体が得られる。

ヨーロッパ特許第４６５４４号明細書中にこれに対する
改良されたＰＨＢの製造に関する発酵法が記載されてい
る。これはＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓθｕｔｒｏｐｈｕｅ
　１１の微生物の連続通気培養に基づいている。その記
載によればこの方法で微生物母集団の調節されメζ増殖
及び同時に細胞内ＰＨＢ　−蓄積が次のことによって得
るととがで縫る。すなわちヨーロッパ特許第１５６６．
９号明細書の方法と反対に増殖に主要な栄養素及び微量
物質の供給、特に窒素の供給を培養の開始から制限する
ことによる。

処理変法として先ず制限された栄養素供給下ですでに２
５重１．％ＰＨＢに増加した微生物を含有する培養液体
を第二発酵段階へ移行させ、そこで５０〜８０重量％Ｐ
ＨＢに増加させることも予め考慮される。この場合各々
の栄養素成分−千の濃度はす、でに第一段階で増殖の抑
制のために制限されるーを第二段階で栄養溶液にもはや
全く添加しない。というのは貯蔵層中で増殖はもはや全
く望まれないからである。

ヨーロッパ特許第４６３４４号明細書の方法によれば栄
養媒体中での炭素源の改良された利用及びＰＨＢの改良
された貯蔵が得られるが、増殖に必要な栄養素の供給に
よって特異的な増殖速度及びＰＨＢ−形成速度は明らか
に減少するという欠点が認められる。

この方法に於けるその他の欠点はＡｌｃａｌｉｇｅｎｅ
日ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ種の場合、発酵に対する最適温度
範囲が比較的に低く存在することにある。しだがって微
生物を強い冷却下５０〜３４℃で培養しなければならな
い。この温度範囲で増殖及びＰＨＢ−貯蔵は高められた
温度で培養することができる微生物−これは比較的大き
い温度公差を有する−に於て培養されるよりもゆっくり
進行する。

したがって前記理由から公知方法の場合ＰＨＢ−製造の
経済性は満足なＰＩ（Ｂ−貯蔵量を有する菌体の培養に
不可欠である発酵槽中での長い滞留時間によって妨害さ
れる。

炭化水素のうちの炭素源としてヨーロッパ特許第４６．
５４４号明細書による方法の場合第一にフルクトースが
使用され、特異的にＡ１ｃａｌｉｇθｎｅｓｅｕｔｒｏ
ｐｈｕｅ　Ｈ１６株から由来する変異株を使用する場合
のみ栄養素源としてグルコースに変えるととができる。

親株からの変異株の培養及び淘汰は操作に経費がかかる
という事情の他に、この変異株の使用によってＰ　Ｈ４
３を経済的に製造す１ るととができる使用可能な栄養素源の供給が著しく増加
しない。というのは多量に使用される三糖類−−−−こ
れはグルコースに対する主供給物として使用するー、た
とえば糖蜜中に又は工業的製造された砂糖溶液中に含有
されるショ糖がＡ１ｃａ’１ｉＢｅｎｅｓ　ｅｕｔｒｏ
ｐｈｕｓ　Ｈ１６から由来する変異株に対しても使用す
ることができないからである０ Ａ１ｃａ’ｌｉｇｏｎｅ８ｅｕｔｒｏｐｈｕｓの他にヨ
ーロッパ特許第４６．５４４号明細書中に更にＡｌｃａ
ｌｉｇｅｎｅｅ鵬のその他の１重、たとえばＡＩＣ，ｆ
ａｅｃａ’ｌｉ日、　Ａｌｃ。

ｒｕｈｌａｎｄ、ｉｉ、　Ａｌｃ、　１ａｔｕｅ、　Ａ
ｌｅ、　ａｑｕａｍａｒｉｎｕｅもＰＨＢ−貯蔵に対し
て使用できるものとして述べられているが、この種に対
して培養−及び蓄積条件に関する詳細な記載は全くなく
、発明の実施法は発明の詳細な説明及び実施例中にＡｌ
ｃａｌｉｇｅｎｅｓ田λｔｒｏｐｈｕ、ｎの株を用いて
しか開示されていない。

これに対して本発明の課題は少ない炭素源の利用上微生
物の菌体中でＰＨＢの高収益率及び改良された蓄積でも
ってＰＨＢのバイオテクノロジーによる経済的な二段階
連続発酵製造方法を枡供することにある。この方法に於
ては公知方法に付随する欠点は回避される。

今や、この課題を解消するにあたシ、 Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｅ　１ａｔｕｅ種の菌株及びその
変異株を３６〜４２℃の温度範囲で二段階発酵法で従来
ＰＨＢの発酵製造に於て知られていない条件下で培養し
た場合、微生物母集団の極めて急速な増殖が同時の有効
なＰＨＢ−貯蔵と共に発酵槽中での比較的短い滞留時間
で得られ、微生物の使用されうる炭素源の性質に対する
依存性を著しく除去することができることは驚ろくべき
ことである。

従来技術に反して最適な、無制限の栄養素供給−これは
窒素及びリンの完全かつ十分な供給を含めて−によって
微生物母集団の再製造及び急速な増殖を促進し、その際
驚くべきことに培養を制限された増殖条件下で行うこと
なく同時に有効なπ１１１胞内ＦＩＢ−貯蔵を生じるこ
とはＰＨＨに対するこの新しい製造方法の著しく顕著な
特色である。

本発明は微生物を連続的に２つの分離し、連続した培養
段階で無制限の栄養素供給に於て培養し、しかも第二段
階で培養を栄養媒体中で第一段階に比してより少ない溶
存酸素含有量に於て続ける場合、この条件下でＰＨＢ−
製造を特に多産方法で実施し、栄養媒体中での炭素源の
良好な利用が得られうろことを見い出した。

この方法で発酵槽中で比較的短い滞留時間内で従来技術
によるＰＨＢ−蓄積に比して著しく改良された蓄積を有
する菌体を生じる。それによってＰＨＢの製造及び単静
は従来可能である方法に比してよシ経済的方法でう寸く
ゆく。

したがって本発明の対象は同化しうる炭素、窒素及びリ
ンの源並びに微生物の増殖に必要な有機又は無機の倣量
栄養素の供給物を含有する水性栄養媒体中でＡｌｃａｌ
ｉｇｅｎｅｅ属の微生物を通気培養してポリ−Ｄ（→−
６−ヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）を製造するにあたり、Ａ
ｌｃａｌｉｇｅｎｅｅ　１ａｔｕｓの菌株又はこの微生
物から由来するＰＨＢ−貯蔵変異株を完全なかつ微生物
の増殖に最適な栄養素の供給と同時に制限されていない
増殖条件下３６ないし４２℃の温度範囲で２つの分離し
かつ連続する発酵段階で無菌条件下に連続的に培養し、
その際第一段階で空気に対する飽和値２０〜５０％の溶
存酸素含有量で培養され九Ｐ）ＩＢ　−含有微生物母集
団を培養溶液と共に連続的に第二発酵段階に移し、そこ
で培養を空気に対する飽和値８〜１５％の溶存酸素含有
量で続け、その際に得られた菌体からＰＨＢを常法で抽
出して得ることを特徴とする、前記ＰＨＢのバイオテク
ノロジーによる製造法である。

この方法を実施するためにＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｅ　１
ａｔｕｅのすべて公知の菌株、たとえば菌株ＤＳＭ（Ｄ
ｅｕｔｓｃｈｅＥｌａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｋｒ
ｏｏｒｇａｎｉｅｍｅｎ　）Ａ　１１２２　、　ＤｓＭ
／Ｖｈ１１２３又はＤＳＭＡ１１２４が適する。

この菌株の形態学的性質はＰａ１ｌｅｒｏｎｉ等による
文献、工ｎｔ、Ｊｏｕｒｎ、　ｏｆ　Ｓｙ、ｓｔｅｍａ
ｔｉｃ１３ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　２Ｂ　、第４１６
−４２８頁、（１９７Ｂ）中に記載され、培養コレクシ
ョンのカタログ、たとえばＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ
　Ｃｕ１ｔｕｘｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ（八Ｔ（ｊｃ
）に収録されている。ＤＥＩＭ−ナンバーによって同定
される微生物の培養試料は微生物に対するドイツコレク
ションによって当栗者に自由に入手でへる（バイオテク
ノロジー研究協会、ゲッチンゲン、ＭＢＨ、ステークハ
イム、西ドイツ）。

本発明による方法の実施に関して常法で親株から得られ
る菌株Ａｌｃａｌｉｇｅｎθｅ　１ａｔｕｅのＰＨＢ　
−貯蔵変異株も適する。

菌株Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　１ａｔｕＢは経済的ＰＨ
Ｂ−製造に有利な性質を有するので、一般に増殖及びＰ
ＨＢ−貯蔵のだめに炭素源の広い範囲を使用することか
で西る。炭素源としてたとえば炭化水素、たとえばＤ−
グルコース、を−宍茫チーホＤ−フルクトース、ラクト
ース、マルトース、ショ糖、でんぷん、糖蜜、ベタイン
、グリーンシロップ、ヒトロール、繊維素加水分解物；
有機酸又はそのエステル及び塩、たとえばグＡコン酸、
２−ケト−グルコン酸、ギ酸、酢酸、５酪酸、イソ酪酸
、Ｌ−マロン酸、Ｄ−（→−酒石酸、アコニット酸、イ
タコン酸、ｍ−ヒドロキシ安息香酸、ｐ−ヒドロキシ安
息香酸、ゲンチシン酸、プロトカテキュ酸及びマンデル
酸；アルコール、たとえばｎ−プロパツール、イソプロ
パツール、２，３−ブチレングリコール、プロピレング
リコール、グリセリン；アぽ）酸、たとえばβ−アラニ
ン、Ｌ−アラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−
ロイシン、Ｌ−シトルリン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−アミ
ノブチラード、Ｌ−アスパルタート、Ｌ−アスパラギン
、Ｌ−グルｐ−ｒ−ト、Ｌ−プロリン、ヒプラート、サ
ルコシン及びクレアチン；あるいは更にアミン、たとえ
ばプチルアミシが挙げられる。

しかし通性無機自己栄養微生物としてのその性質に従っ
て菌株Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　１ａｔｕｓは、水素と
酸素との混合物の形で二酸化炭素を唯一の炭素源として
供給する場合、一般に従来性え上げられている炭素源の
共に二酸化炭素を使用することもでへる。

ＰＨＢのバイオテクノロジーによる製造法の経済性は栄
養物質中の炭素源の価格に極めて著しく依存するので、
本発明による発酵法に於て大とができるからである。

容易に入手できる三糖類の優れた利用可能性は栄養物質
の使用可能性及びＢＩＢ−製造の経済性を顧慮して本発
明による方法の驚くべきかつ有利な特色である。好まし
い実施形態で微生物に産業用砂糖溶液、たとえばグリー
ンシロップ又は砂糖収得の廃棄物、たとえばテンサイ糖
密中に含有されるショ糖を炭素源として供給する。

この際再び菌株Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｅ　１ａｔｕｅ　
Ｄ日Ｍ　Ａ１１２！＋をショ糖で培養することは高いＰ
ＨＢ−生成物形成速度のゆえに特に有利である。

微生物に分子中に同時に窒素を有する様な同化しうる炭
素化合物の群から供給した場合、炭素−及び窒素要求は
同一の源からおぎなうことがでらる。窒素源としてＡｌ
ｃａｌｉｇｅｎｅｎ　１ｔｕｅ　−菌株のうち更にアン
モニア、アンモニウム塩、たとえば塩化アンモニウム又
は硫酸アンモニウム及び硝酸塩を利用する。更に不可欠
な窒素要求は産業用及び生物学的廃水の窒素含有量によ
って著しくおぎなうとともできる。

その他のその鉱物性成分に関する栄養溶液の組成はリン
を、たとえばリン酸水素ナトリウム又はリン酸水素カリ
ウムの形で、マグネシウムを、たとえば硫酸マグネシウ
ムとして、カルシウムを、たとえば塩化カルシウム及び
鉄をたとえば塩化鉄（ｌＩ）、硫酸鉄又はクエン酸アン
モニウム鉄（Ｉ）の形で包含する。増殖に必要なその他
の微量鉱物を栄養媒体に好ましくは微量要素溶液の形で
加えることができる。これはたとえば次の組成を有する
： ＺｎＳ　Ｏ＜　−７Ｒ２０１００”ｆｉ’／　１１Ｍｎ
Ｃ４，４Ｈ２０５０’９７／　７！Ｈ，Ｂｏ、　５　ｏ
　ａｍｇ／　１ ＣｏＣ１１２・／；ｌＩ２０　２０　Ｕｎ９／ｇ０１１
８０４．５Ｈ２０１０ｒＰ９／　／Ｎｉｐ／！２．６Ｈ
３０２０ｍ９／ｌ ＮａＭｏＯ４，２Ｈ２０３０ｍ９／　１本発明による方
法の実施にあたり、先ず１又は数種の前培養をたとえば
液状栄養媒体中で製造し、次いで製造発酵槽中で予め潤
製された前記組成の栄養溶液に十分に増殖した前培養を
約１：５〜１：１５の割合で植菌する様にして行うのが
好ましい。

培養の全期間の間、消費される栄養物質の補充によって
炭素、窒素及びリンに対する源並びにすべての微量栄養
素に対する源を細菌増殖に最適な濃度に保つ仁とが考慮
される。本発明に於ける最適な栄養素供給とは発酵の全
期間にわたって完全な栄養素供給のすべての成分を培養
状態に於て増殖条件は制限されず、微生物は増殖に必要
な栄養素、たとえば窒素又はリンの供給に於て不足もな
くかつ制限もうけない様な濃度で含有する培養媒体中で
の微牛物培巷のことである。

細菌増殖に対する窒素の最適供給は”ＭａｎＯｍθｔｒ
ｉＣＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”、　Ｕｍｂｒｅｉｔ　Ｗ、
　Ｗ、、　Ｂｕｒｒ−１ｅ　Ｒｏｌｌ、　。

８ｔａｕｆｆｅｒ　；ｆ、Ｂ、、　Ｂｕｒｇｅｓ出版社
、ミネアポリス、ナメリカ（１９６４）に記載されたＷ
ａｒｂｕｒｇの方法に従ってＷａｒｂｕｒｇ呼吸マスク
で測定する。

Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　１ａｔｕｅ菌株に対して最適
な窒素供給は増殖に対して制限された条件を調えること
なく一般に培養媒体中で全発酵期間の間に培養液体１１
あたシ窒素濃度少なくとも４５ｍ９７ｅに対して少なく
とも２００ｐ９の硫酸アンモニウム濃度が存在する時に
行われる。この際第一発酵段階で約５０〜７　ｏ　ｏ　
ｍｙ／ｅの窒素濃度が特に好ましい。

最適なリン供給に関して少なくとも５００ｍ９７ｅのリ
ン濃度が好ましい。この場合更に６００ｍ９７１〜１．
２ｆ／ｌの濃度の維持が特に好ましい。

炭素源として最適な栄養溶液はたとえば培養媒体１ノあ
たりシヨ糖１．５〜ａｏｇを含有する。

この場合第一発酵段階でショ糖４〜１０　ｆ／ｌの−囲
がＩｒイに好オしい。

本発明による生作下でＡ１ｃａ］、ｉｇｅｎｅｒ＋　１
ａｔｕ８菌株の培養にあたり驚くべきことに栄養素の制
限に依存して、たとえば車床の供給によって著ｌ−いＰ
　ＨＢ貯蔵が生じるのではなく、増殖に伺随する極めて
効果的なＰＨＢ−貯蔵が微生物に有効な増殖８　ｆｌ：
’Ｆ−完全な栄養素供給に於て観、察される。

無制限の栄養素供給に於ける増殖に（−１随するＰＨＢ
−貯蔵は判異的な増り〕α速度も、ＰＨＢ−生成物形成
速度も栄養素不足によって減少せず、したがって改良さ
れだＰＨＢ−蓄積を有する菌体の比較的大きい濃度は制
限された栄養素供給下に操作する公知方法に比して著し
く短い発酵時間内に得ることができるという利点を有す
る。

この高い増殖−及び生成物形成−速度に基づき本発明に
よる方法の場合第一発酵段階で７０重量％より多い細胞
乾燥軍属のＰＨＢ−貯蔵に於てたとえばｏ、３ｏｈ”〜
（、Ｉｔ　１　ｈ　’の希釈割合りが得られ、第二段階
で依然として０．２８　ｈ　’〜ｒ］、３３．ｈ　の希
釈割合りが得られる。

Ｆ　発酵槽への添加又は流出ｈ） 及びディメンション／ｈ−”／を有スる。）栄養溶液を
第一発酵段階で、好ましくは連続供給法で好ましくは発
酵釜である発酵槽中で発酵槽の最大処理容量が得られる
まで加える。最大処理容量の達成後、処理を連続的に更
に続ける。この場合培養液に一方では一定の流れで新ら
たな栄養溶液を供給し、他方では発酵槽から供給量と等
量の形成されたＰＨＢ−含有徽生物母集団を有する栄養
溶液を取シ除き、第二発酵槽に移す。

培養は通気条件下、たとえば酸素−又は空気供給下で行
われる。この際溶存酸素含有量を時間単位あたり導入さ
れる空気−又は酸素量の変化によって空気に関して２５
〜５０％飽和値の範囲に維持する。妨害されない増殖及
びＰＨＢ　−蓄積の促進のために無菌の空気を撹拌され
た培養媒体中に加える。撹拌回転数の変化によって溶存
酸素含有量を所望の範囲に維持するとともできる。

前記条件下で微生物母集団を第一発酵槽中で無菌の四−
重置状態の達成後、培養液体１１あたり細菌の乾燥体約
１５〜２５．９の濃度に少なくとも６０重量％のＰＨＢ
−含有量で保つ様に希釈割合を選択するのが好ましい。

この場合少なくとも７０重月％のＰＨＢ含有量が処理の
紅済的実施に特に増刊である。

／″ ：／／。

／　・ 第二発酵槽は八−と同一の形であることができ、撹拌釜
として形成することができる。第二発酵槽中の希釈割合
は一般に第一段階に於けるよシも少ないので、連続処理
の維持のために第二段階に於ける微生物の培養を比較的
大きい発酵槽中で続けなければならない。その処理′８
量は第−及び第二段階で種々の希釈割合及び付加的な栄
養素供給を考慮する様にして測定する。

供給によシ第−発酵槽から得られる栄養素の残存濃度を
新らたな栄養素の添加によって第二段階でも最適なかつ
完全な栄養素供給を保証する様な程度に連続的に補充す
る。この操作によって増殖層を発酵の全期間維持し、細
胞内Ｐｌ（Ｂ−貯蔵が増殖に付随して高い速度で行われ
る。

更に増殖条件下で篤くべきことに貯蔵細胞の相対的増加
が第二発酵段階で観察されるので、栄養溶液からの菌体
の分離を比較的簡単に実施する。それによって菌体をた
とえば簡単ない過によって良好に分離することができ、
経費のかかる装置、たとえば分離処理のための遠心分離
機の調達を省くことができる。

第二発酵段階で微生物母集団の最大指数増殖の時点はす
でに越えているので、栄養素濃度を上記の最適な栄養素
供給にｉｉ８載された範囲の下限にｆ（ＩＩ持し、使用
された栄養素のできるかぎシの良好な利用を生じるのが
有利である。

したがって栄養媒体の組成及び新らたな栄養素の供給を
第二発ｒ！γ段階で培養液体中の炭素源の丞；ｊ度が培
養液体１ｔあたシショ糖約１．５ｇの値に達する様に制
限する。この場合１．５ｇ〜２．５９のと１度が特に好
ましい。窒素濃度は培養液体１１あたシ少なくとも４５
り、好ましくはほぼ５０〜６０ワである。

栄養溶液の溶存酸素含有量を第二発酵段階で空気に対す
る飽和値８〜１５％、好ましくは８〜１０％に下げる。

溶存酸素含有量の減少は一方では酸素輸送に対するコス
トを減少し、同時に栄養媒体中の炭素源をより良好に利
用することができるという利点を有する。したがって特
に栄養素のよシ良好な利用が重要である。なぜならばそ
れによって流出物中の炭素物質の残存ｎ度を発酵の終了
後著しく減少することができるからである。

本発ツＪによる方法の条件下で微生物は細胞中のＰＨＢ
−含有量を細胞乾燥重量約８４％まで増加することがで
きる。処理の実質上の実施に於て第二発酵段階で希釈割
合を微生物母集団が培養液体１１あたり細胞乾燥重量１
５〜３５ｇの６度に細胞乾燥重量７０〜８０重景％、重
量しくは７５〜８０重量％のＰＨＢ−含有量で増加する
様に調製するのが好ましい。

Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｇ　１ａｔｕｓ菌株はＡｌｃａｌ
ｉｇｅｎｅｓθｕｔｒｏｐｈｕｓ種に反して篤くべきこ
とに熱公差体である。この高められた熱公差は発酵に対
する最適温度範囲が３６〜４２℃であることを示す。

この際３７〜３９℃の温度が好ましい。この湿度範囲で
の培養は増殖及びＰＵＢ−貯蔵の促進作用の他に発酵中
の冷却コストを著しく減少することができるという利点
を有する。比較的短い滞留時間と共に高められた温度で
培養するととによる冷却コストの節約は／ｌをに重要で
ある。というのは冷却コストは一般に発酵槽の作業に於
て生じるエネルギーコストの半分であるからである。

栄丁で浴液のｐｕ　ｈ！’−を糸゛Ｖ内溶液、たとえば
リン酸堪縛丙清１７Ｘ又ｔよ水性塩基、たとえば水酸化
−カリウム又は−ナトリウム溶液の連続的添加によって
有利に６．５〜７．５の値に、好ましくは６．８〜７．
２の値に−Ｈｊｊ、’４　：ｉｊ’くする。

前記条件下で処理の連続作業を１すられた菌体の組成に
於て又は収益率に於て変化が生じることなく数週間（（
ｆｊ持することができる。

炭素源として炭化水素を使用する場合、本発明による方
法で収益率Ｙ　ｘＡ＝　０．４２〜０．４６が２つの処
理段階で得られる。う゛なわち使用される炭化水素１ｇ
あたすＰＨＢ−含有菌体の形で０．４２〜０．４６９細
胞乾燥重量が得られる。

第二発酵槽への供給量に応じて、ＰＨＢを蓄積した微生
物母集団を有する培養溶液を取り出し、菌体をｊＹｔ常
の分離法によって、たとえばデカンテーション又は遠心
公邸、好ましくはｖｉ過によって分離し、それからＰＵ
Ｂが常法で抽出によって、たとえは米国特許第４，１０
１，５３３号明細書の方法に従ってイ↓）られる。

菌体を除去した栄養溶液は一般にほんの少量の栄養素濃
度を有する。　゛ 菌体を除去した栄養溶液を残存する栄養素の利用のため
に、循環により第一発酵４１１９中に回収し、最適な栄
養素濃度を得るために新らたな栄養溶液を加え、次の培
養に使用することができる。

、次の例によって本発明を詳Ａ１１ｌに説明する。

例 １５１の処理容量を有する無菌の発酵槽中に（ＮＨ４）
２Ｓｏ４１　、ｓ　！／ｌ及びシー１糖１５ｖ′ｔの含
有量を有する栄養媒体（１）　１０　ｔを予め存在させ
、これにＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　１ａｔｕｓ　ＤＳＭ
　１６１１２３の十分に増殖した前培養１ｔを植菌する
。

媒体（１１は次の組成を有する： ）Ｉａ２ＨＰＯ４，２Ｈ２０：　４．５　ＶｔＫＨ２Ｐ
Ｏ４１，５ｇ／１ Ｍｆ　ＥＩＯ４，７Ｈ２０：　０．２　Ｖｔｃａａｚ２
．２Ｈ２００，０２ｇ／を 微）■溶液　°２ｍら／ｌ Ｆｅ　Ｉｌｌ　−ＮＨ４−シトラード　：　ｏ、ｏｓｇ
／を微量溶液は次の組成を有する： ＺｕＳＯ４，７Ｈ２０１００Ｑ／１ Ｍｎｃｔ２．４Ｈ２ｏ　−３０１ｎｙ／ｌＨ，Ｂｏ、　
３００弔ｔ ００Ｃ！Ｚ２．６Ｈ２０・　２００）７１ｃｕｃｏ４．
５Ｈ，，０：　１０　”ｆ／ｌＮ１ｐ１２．６Ｈ２０−
２０ｍｆ／ｌ ＨａＭｏＯ４−２Ｈ２０：　５０１ｒｇ／Ｚ溶存酸素含
有量を撹拌回転数及び通気割合の変化によって空気に対
する飽和値２８〜３０％の範囲に保つ。処理温度ｌｌ″
ｌｌ：３７℃である。発酵の間栄養溶液のｐＨ−値を自
動滴定機によって１０％無菌の水性ＮａＯＨ−溶液を用
いて７．０で一定に保つ。

培養が更に経過するにつれて、栄養物質を連続供給法に
よ多消費速度及び希釈に適合した新らたな栄養溶液の供
給によって一定に維持する。

新らたな溶液は濃度３００ルｌを有するショ糖溶液、濃
度２００　ｇ／ｌを有する（Ｎｎ４）２ｓｏ４−溶液及
び新らたな媒体（１）から成る。

反応容器の最大処理容量に達した時、培養液に一方では
一定の流れで新らたな栄養溶液を供給し、他方では供給
量と等量の栄養溶液を取シ出し、連続した流れで処理容
量２５１を有する第二発酵槽へ移す。新らたに培養され
た栄養液はショ糖を４０　Ｉｌｌの濃度で（ＮＨ４）、
、Ｂｏ４を４．６ｆ／ｌの濃度で及び新らたな媒体（１
）を上記組成で含有する。この方法で２〜６時間後、無
菌の同一重量状態がｌ得られる。この場合第一発酵段階
に於ける培養液はＰＨＢ含有量７１重月−％を有する乾
燥菌体１６．５ψを含有する。

第二発酵槽への溢流はまだ０．４５　Ｉｌｌの（ＮＨ４
）２ＳＯ４−残存濃度及び約４．１　Ｉｌｌのショ糖−
残存濃度を有する。同一重量状態で新らたな栄養媒体６
．０１／ｈを供給する。これは希釈割合Ｄ＝０．４ｈ　
”−１に相当する。

２５７！の最大処理容量を有する第二発酵槽中で温度及
びｐＨ−値を第一発酵槽に於けると同様に調製し一定に
保つ。これに反して通気割合及び撹拌回転数の変化によ
って溶存酸素濃度が空気に対する飽和値８〜１０％に減
少する。付加的に第一発酵段階からの供給のために、第
二発酵槽に硫酸アンモン２６−６４ψ及び２６６１の濃
度を有するショ糖を含有する無菌の水性栄養溶液Ｌ５１
！　（１時間あたり）を供給し、上記二つの物質の濃度
をこの層中でも制限しない。

この操作によって増殖層を全培養の間維持する。

このΦ件下で第二発酵段階の出口に一定のＰＨＢ−割合
７９重貸％を有する乾燥菌体３５．５ｇ（１１あたり）
を含有する培養液が得られる。

この第二段階で希釈割合Ｄ　＝　Ｏｊ　Ｏｈ−１が得ら
れる。とれは１時間あたり７．５１の全流量に相当す゛
る。

連続発酵を収益率ＹＸ／８　＝　０．４６又は菌体の組
成に関して変化が生じることなく５週間の期間にわたっ
て問題なく維持することができる。

次の表置中にＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　１ａｔｕｅ　１
４株］）８ＭＡ１１２５を用いてＰＨＢの連続二段階製
造に於ける処理条件を示す。

表１ 段階１　段階２ 処理容量　１５１　２５１ 撹拌機　横板　横板 湿　度　３７℃　３７℃ ｐＨ−値　７，０　７．０ ０２−濃度　２８−３０％　８−１０％（％空気飽和） 希釈割合Ｄ　Ｏ，４ｈ　’　０．３ｈ　’炭素源　ショ
糖　ショ糖 ショ糖濃度 （補給して）　４０ｖμ　− 窒素源　（ＮＨ４）２８０４（ＮＨ４）２８０４濃度（
ＮＨ４）２ｓ０４ （補給して）　４．６ｔ／ｌ　− ショ糖残存ｆ％ＩＪ：Ｃ４，１りＩｔ　２．１　ｆ／を
残存一度（Ｎ　Ｈ４）　２００４　０．４５　ｆ／Ｚ　
Ｏ，０８５ｆ／Ｚシヨ糖消費量　３５．９１　− （ＮＨ４）２Ｓｏ４−鎖式−Ｆ、）　４．１５　ｔ／ｌ
　−生産性菌体　９９　ｆ／ｈ　２６６．４　ｔ／ｈ生
産性ＰＪ（Ｂ　７０．４　ｆ／ｈ　２１０．４６ｆ／ｆ
ＹＸ＋シヨ糖　０，４６ｆ／ｆ　Ｏ，４６ｆ／９Ｙｘ、
　（ＮＨ４）２Ｓｏ４３．９１４　３．９８ｆ／ｆ（Ｎ
Ｈ４）２Ｓ０４−γ農１１“＋４　２６，６４　ｆ／を
分流発酵槽　２　（１，５４／ｈ） ショ糖−濃度　２３６成 分流発酵槽　２　（１，５ｔＡ） 菌体濃度（補給して）１３゜２　ｔ／を代理人江崎光好 代理人　江　崎　光　史

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　同化しうる炭素、窒素及びリンの源並びに微生
   物の増殖に必要な有機又は無機の微量栄養素の供給物を
   含有する水性栄養媒体中でＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｅ属の
   微生物を通気培養してポリ−Ｄ（−）ｉ−ヒドロキシ酪
   酸（ＰＨＢ　）を製造するにあたりＡｌｃａｌｉｇｅｎ
   ｅｅ　１ａｔｕｅの菌株又はこの微生物から由来するＰ
   ＨＢ−貯蔵変異株を完全なかつ微生物の増殖に最適な栄
   養素の供給と同時に制限されていない増殖条件下３６な
   いし４２℃の温度範囲で２つの分離しかつ連続する発酵
   段階で無菌条件下に連続的に培養し、その際第一段階で
   空気に対する飽和値２５〜５０％の溶存酸素含有量で培
   養されたＰＨＢ−含有微生物母集団を培養溶液と共に連
   続的に第二発酵段階に移し、そこで培養を空気に対する
   飽和値８〜１５％の溶存酸素含有量で続け、その際に得
   られた菌体からＰＨＢを常法で抽出して得ることを特徴
   とする、前記ＰＨＢのバイオテクノロジーによる製造法
   。 （２）　Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｅ　１ａｔｕｅ　ＤＳＭ
   　Ａ　１１２２　、ＤＳＭ、４１１２３又はＤＥＩＭＡ
   １１２４の菌株を使用することよりなる特許請求の範囲
   第１項記載の方法。 （３）炭素源としてショ糖を使用するととよりなる特許
   請求の範囲第１項又は第２項記載の方法。 （４）　菌株Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　１ａｔｕｅ　Ｄ
   ＳＭ　Ａ１１２３を唯一の炭素源としてショ糖を用いて
   培養することよりなる特許請求の範囲第１項ないし第５
   項のいずれかに記載した方法。 （５）培養液体１１あたシ炭素源としてシヨ糖１．５〜
   ４０ｇを含有する栄養媒体中で培養を実施することより
   なる特許請求の範囲第１項ないし第４項のいずれかに記
   載した方法。 （６）発酵の全時間、培養液体１１あだり少なくとも４
   ５ダの窒素を含有する栄養媒体中で培養を実施すること
   よりなる特許請求の範囲第１項ないし第５項のいずれか
   に記載した方法。 （７）培養液体１１あたり第一発酵段階で炭素源として
   ショ糖４〜１０Ｆ！及び窒素５０−４２０〜及び第二発
   酵段階で炭素源としてシ田糖１．５〜２．５ｇ及び窒素
   ５０〜６０ｍ９を含有する栄養媒体中で培養を実施する
   ことよりなる特許請求の範囲第１項ないし第６項のいず
   れかに記載した方法。 （８）培養液体１１あたり少なくとも５００ｍ９のリン
   を含有する栄養媒体中で培養を実施する（９）第一発酵
   段階で培養液体１１あたり細菌の乾燥体１５〜２５ｇの
   濃度を有する微生物母集団を少なくとも７０重重量のＰ
   ＵＢ−含有量で培養することよりなる特許請求の範囲第
   １項ないし第８項のいずれかに記載した方法。 （１０）　培養を第二発酵段階で空気に対する飽和値８
   −１０％の溶存酸素含有量に於て実施することよりなる
   特許請求の範囲第１項ないし第９項のいずれかに記載し
   た方法。 （１１）第二発酵段階で菌体のＰＨＢ−含有量を細胞乾
   燥重量７５−８ｇ重ｉ％に増加することよりなる特許請
   求の範囲第１項ないし第１０項のいずれかに記載した方
   法。 （１２）培養を３７〜３９℃の温度で実施することより
   なる特許請求の範囲第１項ないし第１１項のいずれかに
   記載した方法。 （１３）　６　、８〜７．２のｐＨ−値で培養を実施す
   ることよりなる特許請求の範囲第１項ないし第１２項の
   いずれかに記載した方法。