JPS62210982A - 細菌の高生産性発酵方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、細菌による単細胞蛋白質製造のための高生産
性方法に関する。

１里亘１１ 各種炭素含有基質上での各種微生物の生育による、単細
胞蛋白質（ＳＣＰ）の獲得および／または各種化学変換
の達成のため、様々な発酵方法の開発には多くの努力が
払われてきた。５ＣＰＷ１品は蛋白質食品源として有用
であり、一方、化学変換は、バイオ−ポリマー、医薬品
および醇素のような新しい化学品の原料のみでなく有用
な一般化学品を提供できる。さらに遺伝子修飾を行った
微生物は、価値あるポリペプチド製品の製造に使用でき
る。

微生物の生育に用いられる炭素エネルギー基質は、比較
的安価で、入手が容易であり、また好ましくは水溶性で
なければならない。最初は、ＳＣＰのための炭素エネル
ギー源としては、炭化水素が考慮された。しかしながら
、アルコールや糖のような酸化された炭化水素の方が、
水性発酵体中への比較的高い水溶性および微生物変換−
生育過程における分子状酸素必要量の低下という点で、
単独または部分基質として好ましい。

様々の発酵方法を商業化する努力に際しての制限因子は
、水性発酵体を適度の細胞密度以上、すなわち水性発酵
体１１あたり約４０ｇ（細胞＋発酵液１１あたりの洗浄
、乾燥細胞グラム数）の細胞密度以上に維持することが
不可能であったことである。このため、適度の量のＳＣ
Ｐまたは他の生成物を回収するためには、一般に、大容
量の発酵液の処理が必要になる。大容量の発酵液の処理
は、遠心分離機のような装置の使用を要する、さらには
洗浄、乾燥やその他の回収工程が必須になる等、ＳＣＰ
または他の生成物の濃縮工程を複雑にすることになる。

ｗＩ母を約１５０ｇ／Ｊまでの細胞密度で生育させる方
法が最近、開示されている（米国特許第４゜４１４．３
２９号、ｗｅｇｎｅｒ、１９８３年１１月８日参照）。

この著しい進歩により、水性発酵体から、細胞濃縮工程
を組込む必要なく、ＳＣＰを回収することがはじめて実
行可能になったのである。

しかも、この−ｅｇｎｅｒ法は、水性発酵体中に有用な
生成物を高濃度に産生させることを可能にし、生成物の
回収を容易にした。これらの２つの利点は、さらに操作
する液体の容認を著しく減少させ、電力消費を著しく低
下させ、装置の規模による費用を低減することを可能し
た。

酵母発酵の分野におけるｗｅｏｎｅｒの成功にもかかわ
らず、細菌の高ＩＩ胞密度を達成しようとする同種の努
力は未だ実を結んでいない。

−細菌は、ＳＣＰの原料としては、酵母よりもいくつか
の点で有利である。細菌の方が生育が速く、蛋白質金層
が高く、高い発酵温度に対し耐性が強い場合が多く（高
温で発酵させる方が経済性が高い）、外部生長因子たと
えばビタミンを必要とせず、一般に収率が高い。細菌は
酵母よりも良好な核酸源であり、核酸金員は約２倍であ
る。核酸は、味覚増強剤として、また化学および医薬工
業における化学構築素材としての用途がある。

多くの細菌が、酵素たとえばアミラーゼ、化学物質たと
えばアミノ酸および抗生物質を産生ずるので、工業的に
重要である。さらに、粗換えＤＮＡ技術の応用により、
ある種のＮ菌たとえば、ＥＳＣｈＯｒｉＣｈｉａおよび
Ｂａｃｉｌｌｕｓ種の細菌に有用な酵素、化学物質およ
びポリペプチドを産生きせることが可能になった。しか
しながら、残念なことに、慣用の発酵方法ではＩＩｌ胞
密度約３０〜４０９／１までの生育しか可能ではないの
で、所望の生成物の生産性は全く限られている。したが
って、炭素含有基質の発酵における培地１１あたり１時
間に産生される細胞グラム数（９／１／時）の改良が切
望されていた。

本発明は、従来高生産性発酵が可能ではなかった細菌を
、高い細胞生産性で細菌発酵液中に生育させる発酵方法
を発見し、完成されたものである。

すなわち、細菌を接種した水性発酵体に特異的なバラン
スの高塩栄養源を与えることにより、驚りべきことに、
水性発酵体中に細菌細胞の高い生産性が達成されたので
ある。

遺伝子的に修飾された細菌、たとえば、Ｅ、ＣＯＩ＋お
よび１旧ロユ１！ＬＬＪ工が組換えＤＮＡ生成物の商業
化に重要になってきた現在、本発明は著しくＮ要′であ
り、真に画期的な遊歩を提供するものである。

本発明の高塩／高生産性方法は、細胞密度を増大させる
ための物理的手段を用いないで、発ＷＪ機内に高ＩＩＡ
胞密度を達成させるのに有効である。このような物理的
手段には、水性発酵体の除去および発酵機に再循環させ
るためのＩＢ胞の分離、あるいは細胞数を増加させるた
めに発酵機に液体を除去する内部分離装置の使用等が包
含される。このような旧式の方法は、高価につき、実施
が難しく、細胞に有害な場合が多く、適切な制御が困難
で、装置や電力に経費がかかる。

従来、細菌培養により単細胞蛋白質物質を製造する場合
の連続方法では、通常、比較的低いｍ菌細胞数の発酵液
、たとえば発酵体１１あたり約２０〜４０９の細胞が用
いられ、生産性は約５〜１０ｇ／１７時の範囲であった
。しかしながら、本発明は、きわめて高いレベル、すな
ｊち１（１／１／時以上から発酵体１１あたり少なくと
も５０９の密度の生産性が得られる発酵方法を提供する
ものである。発酵体中におけるこのような高い生産性お
よび細胞密度は、細菌細胞の高収率と伴って、とくに連
続発酵条件下で、より効率的な生物休出のおよび関連細
胞生成物の産生を可能にする。

本発明に従い、高生産性条件を採用したところ５５９／
１／時の高い生産性が得られた。保持時間を十分高いレ
ベルに維持すると、発酵液１１あたり乾燥ベースで約８
０〜１５０、好ましくは約１００〜１２０ｇ細菌細胞の
範囲内の細胞密度を高収率に得ることができる。

本明細書における説明中、細胞密度は醗酵体の８旦あた
りの乾燥ベースでの細胞の重ｆｆ１ｌ１１度と定義され
る。発酵体は、細胞を含めた、水性発酵培地または液体
の非通気総液体容量と定義される。

細胞密度は通常、９／１で表ぶれる。

収率は、発酵機に供給された炭素エネルギー源または基
質の与えられた消費重量あたり産生された細Ｉｎ　＠ｆ
ｉｌと定義され、通常９／ｇ（すなわち、供給された基
質１ｇあたりの産生細胞９数）で表される。収率は水性
発酵体１１あたりの乾燥発酵体として報告されている場
合があるが、水性ＲＮ・休１１あたりの洗浄、乾燥細胞
として報告すべきであって、これの方が正確である。本
明細書では、とくに指示のない限り、収率は常に、水性
発酵体１１あたりの洗浄、乾燥細胞として表示する。

本発明によれば、細菌は、実質的に連続の好気性水性発
酵条件下、適当な非炭化水素基質上、適当な酸素源、同
化可能窒素源、所定の比率の高度な栄養無機塩を用い、
高生産性に生育させる。

本発明者らの経験ではこのような高生産性、高細胞密度
、およびＩｌｌ菌の高収率を達成できることは全り驚り
べきことである。本発明の実施によって達成される生産
性は５５ｇ／Ｊ／時程度と高く、一方、本発明の高温供
給方法によって達成される高細胞密度は、水性発酵体１
１あたり約１５０ｇにもなる。

培養は、水性無機塩メジウム、炭素エネルギー源物質と
して非炭化水素基質、分子状酸素、同化可能窒素源、そ
してもちろん使用される１種もしくは２種以上の特定の
細菌種からなる生育メジウム中で行われる。

適切な細菌生育を確保し、微生物変換過程における細胞
による炭素エネルギー源の同化を最大にし、水性発酵メ
ジウム中における最大の生産性と細胞密度をもつ最大細
胞収率を達成するためには、選ばれた無機栄養の適当口
を適当な割合で給送メジウム中に供給する必要がある。

本発明によれば、水性発酵体の組成は、一部使用される
細菌および基質に依存するが広い範囲で変動させること
かできる。しかしながら、発酵体すなわち液体と細胞中
の無機質含量は比較的高い。

本発明の実施に際しては、実際、発酵体中の無機質含量
は、従来ｍ菌発酵の先行技術により適当と考えられてい
るより高いレベルに維持される。以下に示す第１表には
、水性発酵体中に存在さゼることが必要な各種元素の、
最小濃度範囲（すなわち、広い範囲）、好ましい濃度範
囲および現時点で最も好ましい濃度範囲を示す。８例と
も濃度は元素の濃度として表示したが、それぞれそのす
べてまたは一部は、可溶性イオンの形たとえばＰの場合
はたとえばリン酸塩のような化合した形で存在させる。

各元素の岳は、発酵体（細胞を包含した水相）１１１あ
たりの元素のｇ数またはη数で表示しである。

硫黄は硫酸塩の形で使用するのが好ましい。必要な金属
の一部は硫酸塩の形で添加するのが有利である。すなわ
ち、硫黄は通常、最小ｍ麿を越えている。マグネシウム
、カルシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガンおよびコバルト
は、硫酸塩の形で、または発酵液内で硫酸塩に変換され
る化合物の形で使用するのが好ましい。モリブデンおよ
びホウ素はそれぞれモリブデン酸塩およびホウ酸塩とし
て使用するのが好ましい。カリウムは、硫酸塩もしくは
リン酸塩としてまたは発酵液内で硫酸塩もしくはリン酸
塩に変換される化合物の形で使用するのが好ましい。リ
ンは、リン酸またはリン酸塩、−水素リン酸塩もしくは
二水素リン酸塩の形で、たとえばカリウムもしくはアン
モニウム塩として、または発酵液中でこのような塩に変
換される化合物として使用するのが好ましい。

主要無機塩メジウムをＰ、ＫＳＭＱ、ＳおよびＣａから
なる栄養素を含有させるために、また微量無機塩メジウ
ムをＦｅ、ＺｎＳＭｎ、Ｍｏ。

ＣＯ，ＳおよびＣＵからなる栄養素を供給するために、
便利に使用できる。

少なくとも微量含有させる他の元素については、ナトリ
ウムはたとえば硫酸塩として、セレンはたとえば亜セレ
ンｌｌＩ塩またはセレン酸塩として、ヨウ素はヨウ化物
として含有させる。

■ 本発明の高生産性、高細胞密度細菌法によれば、水性発
酵条件下、適当な炭素含有基質上で細菌培養物を生育さ
せる。

本発明による生育には、一般に細菌の属、種が適してい
るが、本発明の実施に際しては、生育細胞の生存能に有
害な影響を与える阻止性化合物の有意な品を分泌しない
微生物を使用することが好ましい。とくに、現時点では
次の３Ｉｉｌの特異的な種／株が好ましい。これらは、
米国農務省に寄託され受入番号ＮＲＲＬ　　Ｂ−１５４
１６と指定されたＭｅｔｈ　Ｉｏｍｏｎａｓ　ｓｐ、　
”　Ｌ　３　”　（以下１ゝＰ　Ｌ　３　”とも呼ぶ）
、＾ｍａｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃ０
ＩＩｅＣｔｉＯｎ（ＡＴＣＣ）からＡＴＣ０１０７９８
として得られる［’、ｃｏｌｉ株、およびＵ、Ｓ、Ａｒ
ｍｙ　ＬａｂＯｒａｔＯｒｉｆ！Ｓ（ＮａｔｉＣｋ、　
５ａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）から得られるＢａｃｉｌ
ｌｕｓａ＋ｅｇａｔｅｒｉＵ−株ＱＭ　　８１５５１で
ある。

他の細菌種の例としては、 Ｅ、　ｂｌａｔｔａ（３ Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｌｉｓおよび Ｈｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ　ｓｐ、株は、Ｐｕｒｄｕｅ
大学の１ｌｅｎｒｙ　Ｃ。

Ｌｉ５ｌｌ±（彼がＬ３〃と命名した）によって恵与さ
れた株であり、・本出願に際してその公衆による入手を
保証するために本発明者らによってＵＳＤＡ−ＮＲＲＬ
に寄託されたものである。

Ｐ１３は当寄託機関により、受入番号ＮＲＲＬ８−１５
４１６と指定されている。この株につぃては、ｆｌｉｒ
ｔ、　Ｐａｐｏｕｔｓａｋｉｓ、　Ｋｉｎｇ　＆　Ｌｉ
ｍによるＦｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ　　Ｉｎｃｏｒｐｏ
ｒａｔｉｏｎ　ｂｙ　ａ　ＮｅｗｔｔｃｔｈＶｌｏｔｒ
ＯＤｈ　（Ｌ　３　）　”と題する報告（Ａｐｐｌｉｅ
ｄａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｎ＋ｅｎｔａｌ　Ｈｉｃｒｏ
ｂｉｏｌｏｇＶ、　１９７８年７月号、５６−６２頁）
がある。

ＮＲＲＬ　　Ｂ−１５４１６の名称は、［Ｉ菌ＰＬ３　
（１３）の培養物が好適寄託機関である米国農務省のＡ
ｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　５ｅｒｖ
ｉｃｅ。

Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅｏｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｐｅｏｒｉａ、　１ｌｌｉ
ｎｏｉｓ　Ｇ１６０４）ニ寄託されタコトラ示すもので
ある。寄託はＰａｔｅｎｔ　ａｎｄ　Ｔｒａｄｅａ＋ａ
ｒｋＯＨｉｃｅの実務に従って行われたものであって、
本枕を主題とする本出願の特許登録時に、本枕の公衆に
よる入手の１１１１１限はすべて最終的に解除される。

したがって、本枕は、本発明に従った利用のため公衆が
入手できるものである。

■ 本発明の高生産性、高細胞密度の細菌発酵においては、
炭素含有基質は、 １分子中に１個〜４個の炭素原子を有する低級脂肪族、
水溶性アルコールまたはアミンの１種または２種以上、 炭水化物、たとえば３個〜６個の炭素原子を右する単糖
類、複活類、オリゴ糖類、多糖類等、よりなる群から選
ばれる。現在のところ、ＨｅｔｈｙｌｏｌｌｌｏｎａＳ
　Ｓｐ、にはメタノールが、Ｅｓｃｈｃｒｉｃｈｉａお
よびＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、にはグルコースおよびシ
ュクロースのような炭水化物が好ましい。

ｌＬｊ糺立 本発明の方法においては、水性液体中に比較的高レベル
に無機塩類が添加され、それによって比′校内に高い生
産性における連続的発酵方法が完成し、高い細菌細胞密
度、そして細菌細胞の高収率が達成されるものである。

本発明の高細胞密度Ｉｌｌ菌発酵においては、水性発酵
体は、言回で約半農の上澄液すなわち細胞を含まない液
体と、半通の５１１ｍ細胞からなる。しかしながら、こ
の半容量の［ｌ菌細胞は発酵体の無口塩含樋の少なくと
も２／３を含有している。

塩は、生育中の増殖細胞に高度に取り込まれるので、上
澄液中の塩の濃度は比較的低い。細胞中では無機塩は供
給または適用されたままの形ではなく、一部は結合した
有機塩の形になっている。

水性醗酵体の無機分析によってもちろん、総無機質含量
を測定できる。

発酵は分子状酸素を要求する好気性の方法であり、細菌
の生育と基質の盛んな生化学的変換を支持するのに有効
な酸素分圧を醗酵体内に維持できるように、分子状酸素
含有基体たとえば空気、酸素増湯空気または純粋な分子
状Ｍ索が供給される。

発酵体への分子状酸素の供給速度は、細菌の生育が酸素
の不足によって制限されないようにすべきである。発Ｗ
装置の設計で培養液への酸素の移送能は大幅に変動する
。酸素の不足が細胞の高生産性および／または高細胞密
度への生育に際し問題とならないためには、少なくとも
約６００　ｖ＋＋ｏｌＯ２／１／時の酸素移送能を有す
る発酵装置を使用することが好ましい。

本発明の実施にあたって使用される発酵装置の形式には
とくに制限はないが、泡沫充填発酵装置内での操作が現
時点では好ましい。生成した泡沫を増強し維持するよう
に設計された発酵装置は通常、所望の高細胞密度および
高生育速度を維持するのに必要な高い酸素移送を達成す
る方法に有利である。

総通気速度はかなりの範囲にわたって変動するが、酸素
移送効率の高い発酵装置では、発酵装置内の液体１容あ
たり１分間に約０．５〜８、好ましくは約１〜６容（採
用圧力下、２５℃で）の分子状酸素含有基体の速度で一
般に通気が行われる。

この段は、反応器に供給される通常の酸素含けの′空気
に基づくものであって、純粋な酸素とすればそれぞれの
範囲は、発酵装置内の液体１容あたり１分間に約０．１
〜１．７、好ましくは約０．２〜１．３容（採用圧力下
、２５℃で）となる。

微生物発酵工程に採用される圧力は、広範囲に変動させ
ることができる。採用される代表的な圧力は約０〜１５
０ｐＳｉＯであり、現時点では約０〜６０　ｐｓｉｏが
好ましい。とくに好ましい圧力としては３５〜４０ｐＳ
ｉＯが採用される。このような好ましい圧力では、装置
および操作経費対酸素溶解性の合理的なバランスが達成
される。大気圧より高くする方が、水性発酵体中に溶解
する酸素の濃度が増大し、結局、細胞の生育速度が増大
するので有利である。しかしながら、高圧にすると装置
および操作経費が増大し、効果は相殺される。

発酵温度もある程度変動させることができるが、一般に
は約り５℃〜約８０℃の範囲であり、約３０〜６０℃が
現時点では好ましい。特定の細菌に対する最も好ましい
温度は、本技術分野の熟練者によれば容易に決定できる
。

ａｌｌ菌は同化可能な窒素源を要求する。同化可能な窒
素は、微生物による代謝的利用に適した形で窒素を放出
できる任意の窒素含有化合物によって供給できる。各種
の有機窒素源化合物たとえば蛋白質加水分解物等も使用
できるが、通常はもつと安価な窒素含有化合物、たとえ
ばアンモニア、水酸化アンモニウム、尿素、およびリン
酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、ビロリン酸アンモ
ニウム、塩化アンモニウムのようなアンモニウム塩が使
用できる。大規模の操作ではアンモニアガス自体が便利
で、水性微生物発酵体中に適当量を通気して使用できる
。アンモニアは同時にｐＨの調整にも使用できる。

細菌の水性発酵体中におけるｔａｌｌ範囲は、一般には
、約５〜８、好ましくは約６〜７．５に維持されなけれ
ばならない。ある種の細菌の至適ｐＨ範囲は、その特定
の細菌によるばかりでなく使用するメジウムにもある程
度依存する。したがって、メジウムの変化に応じて、本
技術分野の熟練者に容易に決定できる結果に従いｐＨを
変化させることもできる。

発酵装置内への水性発酵体の平均保持時間は、一部、発
酵温度により、また酸素利用性、使用する細菌培養物に
よりかなり変動する。一般に、保持時間は平均保持時間
として、約１〜２０時間、現時点では好ましくは約２〜
８時間である。

ある種の基質が高濃度に存在すると細菌の満足できる生
育を抑制する場合があり、発酵中の微生物に対し連作を
示すことさえある。したがって、メタノールのような基
質の比較的高濃度は回避すべきであり、一般に醗酵体中
のメタノール濃度は最大耐性レベルに維持することが好
ましい。この醗酵体中のレベルは一般に約０．００５〜
１容量％、好ましくは約０．００３〜０．０１容漬％の
範囲である。

発酵は、基質の細菌細胞および細胞外生成物への良好な
変換ならびに未変化基質の損失回避が達成される限り、
基質が律速因子となって制御されるように行われるのが
便利である。

＆ＩＪ　ａｌｌの容易さ、均°質な細胞または細胞外生
成物の産生“、およびとくに全装置の経済的な使用とい
う点から連続操作が好ましい。連続方法においては、基
質、水性無機質メジウム、同化可能窒素源および分子状
酸素含有気体は発酵装置内の発酵体に連続的に添加され
、同時に発酵体の連続的排出が行われる。添加炭素エネ
ルギー基質と水性無機質メジウムの容晶比は、炭素含有
基質の性質により広範囲に変動させることができるが、
一般的には約１：９ん６：４の範囲であり、約２二８〜
５：５の範囲が好ましい。

本技術分野の熟練者には容易に理解できるように、得ら
れる最大細菌細胞密度は、細胞収率（供給基質１ｇあた
りの細胞び数）および発酵装置への総供給ｍの中の基質
百分率の函数である。この場合、総供給囲とは炭素基質
と無機質メジウムおよび水を含めた量である。

所望により、基質の一部もしくはすべておよび／または
同化可能窒素源たとえばアンモニアの一部は、発酵装置
に水性無Ｉｉｌ質メジウムを通過させる前に水性無機質
メジウムに加えておくこともで゛きる。本発明の高細胞
密度細菌発酵を実施するに際しては、約３０１ａ％のＭ
質と約７０％の無機塩メジウムを含有する供給材料を使
用するのが便利である。

反応器に導入される供給材料の多流ｍは予め設定された
速度にａＩｌｌｌｌｌｌされるか、醗酵体中の炭素およ
びエネルギー基質のｍ度、ｐＨ、溶存酸素、光透過性で
測定可能な細胞密度等、ならびに発酵装置から排ガス中
の酸素または二酸化炭素をモニターすることによって決
定できる要求に応じて制御されることが好ましい。各種
材料の供給流速は、炭素およびエネルギー基質の効率的
な利用と呼応した可能な限り迅速な細胞生育速度が得ら
れるように、付加した基質に応じて可能な限り高収率の
細菌細胞Ｊ３よび／または細胞外生成物が得られるよう
に、あるいは実施される特定の生化学的変換が最大にな
るように変動させることができる。すなわち、本発明に
よれば、細菌細胞は、一部採用した生育条件および使用
した特定の基質により、供給した基質１００ｇあたり約
４５〜５５ｇの収率で得られる。

全発酵装置、たとえば反応器、容器もしくはコンテナー
、配管部、付属循環デバイスまたは冷却デバイスは、一
般に滅菌される。この目的では、通常、たとえば約２５
０下（１２１℃）の蒸気を少なくとも約１５分間使用す
る。滅菌反応器に、分子状酸素および基質を含めてすべ
ての必要な栄養の存在下に、特定の微生物の培養物を接
種する。

連続発酵の開始に際して、水性無機質メジウム、適当な
濃度の基質、同化可能窒素源、および所望による微量成
分を滅菌する。これらの供給材料は加熱して、または一
連のフィルターたとえば０．７μ、０．４５μおよび０
．２μのフィルターのセットで濾過して滅菌する。滅菌
発酵装置に、滅菌材料および所望の菌株の接種材料を取
り、酸素および各種供給材料の適猶の流入を徐々に開始
させる。水性発酵体中の無機塩は低レベルで開始し、高
ｍ度に無機塩を含有する水性無機質メジウムを発酵体に
供給することにより高い無機質レベルを作っていくこと
もできるが、通常は最初から発酵装置に高濃度の塩を含
むメジウムを添加し、そのまま操作を開始する。本技術
分野の熟練者には自明なように、開始時、接種微生物が
塩および基質を有効に利用して完全に取り込むだけの細
胞を作り上げるまでには通常短い潜時がある。

笈胤ｌ立月１ 本発明の高細胞密度方法に従って産生された細菌細胞は
、常法により、たとえば沈殿、泡沫濃縮、遠心分離また
は濾過によって発酵体から回収できる。

微生物細胞は、発酵装置排出液から細胞を分離する前ま
たは後に、所望により、熱または化学的手段で殺滅する
ことができる。

所望より、濃縮された細胞をついでたとえば水と混合し
て洗浄し、再遠心分離によって分離するか、または遠心
分離前ま太は分離中に水を加えて細胞から無機質メジウ
ムを実質的に除去し、分離された無機質メジウムを含め
た洗液を水および無機質メジウムの補給として発酵装置
に戻して、無駄な使い捨ての問題を減少または回避でき
る。

回収された細胞は乾燥し、将来使用される乾燥生成物を
製造することができる。所望により、高細胞密度発酵の
排出液をそのまま乾燥して、乾燥細菌Ｉｌｌ胞と塩を含
めた残留水溶性物質からなる全乾燥生成物を製造し、こ
の全乾燥生成物を高蛋白高温性の動物試料として使用す
ることもできる。

ヒトに使用する場合は細胞を処理して必要に応じ核酸伝
を減少させるが、動物試料の目的ではこのような処理は
現在のところ不必要と考えられている。

細胞外生成物は、常法により、細胞を含まない上澄液か
ら回収できる。細胞を含まない上澄液をたとえばアセト
ンまたはメタノールもしくはエタノールのような低級ア
ルコールで処理して、細胞外重合物質を沈殿させること
ができる。また、細胞を含まない排出液は溶媒抽出およ
び／または塩基抽出によって処理し、所望により他の細
胞外生成物、たとえば培養過程で生成した色素、ビタミ
ンもしくは有ａｒｔを回収することも可能である。

細胞を含まない排出液は、このような中間処理を行って
または行うことなく、水の補給の一部としてまたはその
大部分として反応装置に戻し、無駄な使い捨ての問題を
可能な限り回避する。

本発明の方法で得られる高細胞密度はきわめて能率的で
、［ｌ菌からの単細胞蛋白質産生の経費を著しく低減す
る。生成した単ｍｍを蛋白質生成物として使用するため
の多くの例での濃縮の必要性は著しく減少し、また消失
する場合さえある。細胞生成物は、所望により、消費さ
れなかった残留塩および細胞外生成物たとえばアミノ酸
、バイオポリマー、細胞外酵素等を洗浄除去することが
できる。ついで洗浄された細胞を直接、乾燥手段たとえ
ばスプレー乾燥器に給送することができる。

発酵工程に対する水の所要量はこのように著明に低下し
、使い捨てになる無駄な水はほとんどまたは全くないこ
とはきわめて重要である。別法として、所望により、残
留した塩を含め全発酵体を乾燥させることもできる。

以下の実施例ｔユ木技術分野の熟練音に対し本発明の理
解をより容易にするための例示であって、本発明の合理
的な範囲を不当に限定するものではない。特定の反応材
料、条件、比率等はすべて本発明を例示するものであり
、合理的かつ適切な本発明の範囲をいかなる意味でも限
定する意図はない。

し ダラム陰性、メタノール利用細菌Ｌ３は、Ｐｕｒｄｕｅ
大学から入手した。ｍ菌Ｌ３は振盪フラスコ中、１．０
％メタノールを含有する１Ｍ２メジウム１００−内にお
いて３０℃で生育させた。

１Ｍ２の処方 ト１２　０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　１１ＫＨ２ＰＯ４２，
ＣＩ Ｋ　２　　トＩＰＯ４３，Ｏ’ｉ ＭＱＳ０　　・７Ｈ２００，４ｇ ＣａＣＪ　　−２）−１２００，４ｇ ＮａＣ１０，１ｇ （ＮＨ４）２　ＳＯ２２，Ｏｇ 微溌無機物　　　　　　　　０．０５ｄ微ω無機物溶液
は、１１に対し以下の各物質を混合して調整した。

Ｃｕ５Ｏ−５Ｈ２０５，（１／ｊ ＫＩ　　　　　　　　　　　　０・８ Ｎａ２ＭｏＯ−２Ｈ２０２，０ Ｈ３ＢＯ３０，５ ＺｎＳＯ−７ＨＯ２３，０ ＣＯＣｊ！　　・６ｌ−ＩＱ　　　　０．５ＦｅＳＯ−
７Ｈ２０８０，５ Ｍｎ５ｏ　　−Ｈ２Ｏ９，５ 翌日、−夜培養物を、炭素およびエネルギー源としてメ
タノール４．５％を含有するＦＭ１２メジウム２１を入
れた４１の発酵装置に接種した。

ＦＭ１２の処方 ８２０　　　　　　　　　　１．０７ Ｈ３ＰＯ４（８５％）　　　　２．０ａｄＫＣ１１，（
１ １ｖｌｓｏ　　・７Ｈ２０１，５ｇ ＣａＣ１−２ＨＯ０，２ｇ Ｎａｉｌ　　　　　　　　　０．１９ 微量無機物　　　　　　　　０．５ｍ 発酵装置に適当な通気を行った。最初に供給したメタノ
ールが消費されたときに、５％メタノールを含有するＦ
Ｍ１２の発酵装置への連続的供給を開始した。反応体の
容量は約２１に維持した。

希釈速度０．２４ｈ−１すなわち保持時間４．２時間で
、細胞塊収率はきわめて高かった（５３％）。

細胞密度は２１ｇ／１．細胞塊生産性は約５ｇ／ｌ／時
であった。

乳ｌ 細菌Ｌ３を４１の発酵装置中、２個の供給流で連続的に
、総容量の７０％の供給流は無機物メジウムＰＬ３、総
容量の３０％の供給流はメタノールとして、発酵材料を
供給した。

ＰＬ３の１１中組成は次のとおりであった。

７５％Ｈ３ＰＯ４１６，４ｄ ＣａＳＯ−２Ｈ２０１，５ｓ に２Ｓｏ４　　　　　　　　　４．５９ＭａＳＯ・７Ｈ
２０８，８ｇ 発酵装置からの総揚出液の乾燥重量１すなわち細胞と可
溶性排出成分は１３４ｇ／ｌで、細胞塊は１１４　’Ｊ
／１すなわち収率４８．６％、生産性は約２８．５ｆｉ
／１／時であった。

この場合に達成されたような高細胞密匪では、発酵装置
からの排出液は直接乾燥できる。回収による損失をなく
すほかに、このような直接乾燥法゛ではある種の日収装
置の必要がなくなり、回収時に起こる夾雑も回避できる
。

例３ 空気放出板、攪拌機、溶存酸素プローベ、ｐＨブローベ
、温度測定手段、ならびにメジウム、アンモニアおよび
基質（グルコース）添加用の適当な注入口および排出液
回収用の排出口が装備された連続操作用の４ｊ！の発酵
装置に、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｌ）ｅＣｕｌｔｕｒｅ
　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（Ａ　Ｔ　ＣＣ）　、Ｒｏｃ
ｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄから得た寄託番号ＡＴ
ＣＣ１０７９８の細菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ
　ｉａ　Ｋ　−１２の接種材料１１を充填した。連続操
業に使用する水性メジウムは例２に示した処方のＰＬ３
メジウムとした。

アンモニヤはｐＨの制御のために、また微生物の同化可
能窒素源として使用した。

炭素エネルギー源（基質）はグルコースとし、連続操作
中的５０ｗ／ｖ％グルコース水溶液として供給した。

発酵装置！ＩＩ　ＩＩＩはｐＨ約６．５、温度約３８℃
で作動するようにセットした。攪拌器は１０００ｒｕで
作動させた。

発酵装置排出液のサンプルを定期的に採取して分析に供
した。サンプルの一部（２０ｄ）を蒸発乾固して総置体
ｆｆ１（！？／ｊりを測定した。他の一部（８０〜１１
００ａ＞を遠心分離し、上澄液の一部（２０ａｄりを蒸
発乾固して上澄液中の固体含量を測定した。遠心分離さ
れた固相は水道水２０〜２５ＩＩｒｆｌに再懸濁し、再
び遠心分離した。１９られた固相を乾燥して、発酵装置
排出液１１中の洗浄細胞重量（ｇ）を求めた。

第２表には、指示した時間における操作条件および発酵
装置排出液についての相当する分析結果を示す。

連続発酵操作は１８８時間後に停止したが、所望により
さらに長期間継続することが可能である。

結果は、この連続発酵操作の間にＥ、Ｃ０１ｉのきわめ
て高い生産性と細胞密度が得られた。ことを示している
。

例４ 例３に記載したと同じく装備した発酵装置に、０、５ｆ
ｆｉａ１％のグルコースを含有するＩＭ−２メジウム（
例１参照）中で生育さゼた Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａ＋ｅｇａｔｅｒｉｕａ＋培養物１
００ｄを接種した。

この発酵装置には予め、連続培養操作の初期段階の間に
使用するためのシュクロース２０重量％を含有するＰＬ
３メリウム１１を充填しである。約２時間から約２６時
間までの操作時には、デンプン加水分解によるデキスト
ロース製造の副生物である「デキストロ−スゲリーン」
を基質に使用しＩこ　。

アンモニアはｐＨの制御と同時に、微生物のための同化
可能な窒素源として使用した。発酵装置の制御はｐＨ約
６．５、温度約３４℃で作動するようにセットした。攪
拌機は、最初３５０ｒ＋）−で作動さｔ！）１７５０つ
いで操作後の後期段階には１０００ｒｐＩＩｌに攪拌速
度を上げた。

連続操作に入って約２６時間後に供給メジウムをシュク
ロース２５重量％含有ＰＬ−３メジウムに切り換えた。

例４と同様に、発酵装置の排出液のサンプルを定期的に
分析用に採取した。保持時間約７時間で、発酵は、細胞
密度１１１　’Ｊ／１洗浄ｉ胞、炭素基質に基づく収率
４４％、生産性１６．１７／ｊ！／時を達成した。これ
らの値は連続操作に入って７４時間で得られたものであ
る。９０時間後もほぼ同様の結果が得られ、細胞密度１
１０ｇ／ｌ洗浄細胞、収率４４％、生産性１５．９ｇ／
ｊ！／時であった。

上述の結果はバチルス種の Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ＩＩｌｅｇａｔｅｒｉｕｍ　　（株
ＱＭ　　Ｂ１５５１）が、発酵基質としてシュクロース
を利用した連続発酵方法において高細胞密度に生育する
ことを示している。株ＱＭ　　８１５５１はＩ１．　Ｓ
、　Ａｒｌｌ１ｙＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｎａｔ
ｉｃｋ、　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓから得た。

Ｂ、ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ　　Ｑ　Ｍ　　Ｂ　１５５１
は発酵培地の粘度を増大させる細胞外物質（ｃａｐｓｕ
　ｌ　）を産生ずるので、発酵が進行するにつれて発酵
体の移動速度は著しく低下した。慣用の発酵方法、すな
わち非高生産性方法では、本例に示された半分の生産性
を達成することも困難である。

叢１ 細菌１３（ＮＲＲＬ　　Ｂ−１５４１６＞を用いた様々
な連続操作を実施して、発酵装置への供給材料の総量中
における水性無機物メジウムに対する供給材料中の炭素
源容量％が、得られる最大細胞密度にどのように影響す
るかを検討した。その結果、特定の基質メタノールにつ
いて下表に示したような関係を見出した。

第３表 １５　　　　５６．３　　　０．４８　　　　　６５．
０３４　　　　１１３．４　　　０．４４　　　　１３
１．６１）　期待細胞密度は供給体１１あたりのメタノ
ール供給［１（ｇ）に収率を乗じて得られる計算値であ
る。

２）　単細胞生成物（ｇ）／供給メタノール（ｇ）供給
するｕ＊Ｆ！ｉの増加に適応させるために、供給する無
機物メジウムの濃度を調整することが好ましい。この場
合、たとえば細胞数が増大するに従い細胞密度は高くな
り、無機物を供給するために用いられる水の８吊が減少
する等、いくつかの因子を考慮に入れるべきである。す
なわち、第４表に示すように、４０容８％メタノール供
給時の生育に用いられる無機物メジウム供給液は、１０
容聞％メタノール供給時の生育に用いられる無機物メジ
ウム供給液に比べ濃度が６倍にされている。

さらにメタノールの供給を５０容量％に増加した場合に
は、無機物メジウムの組成は、４０容攬％メタノール供
給時に用いられた′ｍ度の約１．５倍に調整することが
好ましい。

第４表 メタノール供給量の函数としての 無機物メジウムの調整 １０　　　　　　　　１．０　　　　　　　　　　　−
２０　　　　　　　　２、２５　　　　　　　　２．２
５３０　　　　　　　　３．８６　　　　　　　　１．
７１４０　　　　　　　　６．００　　　　　　　　１
．５６５０　　　　　　　　９．０１　　　　　　　　
１．５０３）供給１０％メタノールに対して 総供給体（メタノールのような基質と水性無機物メジウ
ムの和）の総容量が、一定であるとすれば、基質ａが増
加すれば供給する無機物も増加させなければならないの
は当然である。

以上の実施例は、本発明の実際を単に例示したものであ
って、本発明の範囲すなわち特許請求の範囲をいかなる
意味においても限定するものと解すべきではない。本発
明の本質および精神から逸脱することのない改変および
改修は本発明のｔ！囲内に包含される。

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. （１）少なくとも１種の細菌を、好気性水性発酵条件下
   、細胞相と水性細胞外相からなる水性発酵体中、細胞を
   残してこの水性発酵体から水性メジウムだけを除去する
   物理的手段を使用しない発酵手段で、有効量の同化可能
   な炭素エネルギー基質、同化可能な窒素源、水、分子状
   酸素、ならびに水性発酵体１ｌあたりの重量として少な
   くともＰ１．３ｇ、Ｋ１．０ｇ、Ｍｇ０．４ｇ、Ｃａ１
   ．０ｇ、Ｓ０．５ｇ、Ｆｅ１０ｍｇ、Ｚｎ５ｍｇ、Ｃｕ
   １ｍｇ、Ｍｎ１ｍｇ、Ｃｏ０．１ｍｇ、Ｍｏ０．２ｍｇ
   およびＢ０．０５ｍｇの各元素を水性発酵体中に維持さ
   せるのに十分な量水性発酵体中に供給される無機塩類の
   存在下に、培養することを特徴とする少なくとも１０ｇ
   ／ｌ／時の生産性で細菌細胞を産生し、かつ炭素エネル
   ギー基質を発酵生成物に生化学変換するための連続発酵
   方法。
2. （２）細菌は、￥Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥、￥Ｅｓｃｈｅｒ
   ｉｃｈｉａ￥、￥Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ￥および￥
   Ｐｓｅｕｄｏｍａｓ￥よりなる属から選ばれる特許請求
   の範囲第１項に記載の発酵方法。
3. （３）細菌は、￥Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．￥
   ＮＲＲＬ　Ｂ１５４１６である特許請求の範囲第２項に
   記載の発酵方法。
4. （４）無機塩類は水性発酵体１ｌあたり、以下の量、す
   なわちＰ１．３〜６．５ｇ、Ｋ１．０〜４．０ｇ、Ｍｎ
   ０．４〜１．６ｇ、Ｃａ０．１〜０．７ｇ、Ｓ０．５〜
   ２．６ｇ、Ｆｅ１０〜８０ｍｇ、Ｚｎ５〜６５ｍｇ、Ｃ
   ｕ１〜５ｍｇ、Ｍｎ１〜６５ｍｇ、Ｃｏ０．１〜０．７
   ｍｇ、Ｍｏ０．２〜１０ｍｇおよびＢ０．０５〜０．４
   ｍｇを維持させる特許請求の範囲第１項から第３項まで
   のいずれかに記載の発酵方法。
5. （５）水性発酵条件には、発酵温度範囲２５℃〜８０℃
   、ｐＨ範囲５〜８、圧力範囲約０〜１５０ｐｓｉｇ、発
   酵時間は平均保持時間として約１〜２０時間の範囲が包
   含される特許請求の範囲第１項から第４項までのいずれ
   かに記載の発酵方法。
6. （６）細菌密度は水性発酵体１ｌあたり乾燥ベースで約
   ８０〜１５０ｇの範囲に維持する特許請求の範囲第５項
   に記載の発酵方法。
7. （７）細胞収率は供給した基質１００ｇにつき約３９〜
   ５５ｇに維持する特許請求の範囲第６項に記載の発酵方
   法。
8. （８）炭素エネルギー基質は、炭素原子１〜４個を有す
   るアルコールおよびアミン、ならびに炭水化物よりなる
   群から選ばれる特許請求の範囲第１項から第７項までの
   いずれかに記載の発酵方法。
9. （９）炭素エネルギー基質は、メタノール、エタノール
   、グルコースおよびシュクロースよりなる群から選ばれ
   る特許請求の範囲第８項に記載の発酵方法。
10. （１０）さらに以下の工程、すなわち（ａ）発酵手段か
    ら水性発酵体液流の除去、（ｂ）水性発酵体液流の、細
    胞含有分画および残存溶解無機物を含有する分離された
    水性メジウム分画への分離、（ｃ）細胞含有分画の水洗
    、それによる細胞からの痕跡の無機塩類の除去、（ｄ）
    細胞の乾燥による乾燥細胞の製造、および（ｅ）少なく
    とも１回の水洗液の少なくとも一部および分離された水
    性メジウム分画の培養液の再循環による培養液成分の少
    なくとも一部の水および無機塩類の供給の各工程を付加
    する特許請求の範囲１項から第９項までのいずれかに記
    載の発酵方法。
11. （１１）水性発酵体の分離は、除去された水性発酵体の
    遠心分離によつて行い、濃縮細胞流と細胞を含まない再
    循環無機塩水性液流とを生成させる特許請求の範囲第１
    ０項に記載の発酵方法。
12. （１２）工程（ｃ）は濃縮細胞の水洗からなり、さらに
    残つた無機塩類を含有する水洗液流と洗浄細胞流を生成
    させる特許請求の範囲第１０項および第１１項のいずれ
    かに記載の発酵方法。
13. （１３）工程（ｃ）で得られた細胞含有生成物はついで
    乾燥させる湿つた細胞塊である特許請求の範囲第１０項
    および第１１項のいずれかに記載の発酵方法。
14. （１４）さらに以下の工程、すなわち、細胞相および残
    存無機塩を含む水性細胞外相の両者を含有する発酵装置
    排出液として水性発酵体の一部を除去し、細胞相と水性
    相を含む水性発酵体排出液を乾燥して塩類を含む残存水
    溶性物質を含有する乾燥細胞生成物を生成させる工程か
    らなる特許請求の範囲第１項から第１３項までのいずれ
    かに記載の発酵方法。
15. （１５）水性発酵体中に、ナトリウム、ホウ素およびセ
    レンよりなる群から選ばれる少なくとも１種の元素をさ
    らに使用する特許請求の範囲第１項から第１４項までの
    いずれかに記載の発酵方法。
16. （１６）無機塩類は主要無機塩メジウムと微量無機塩メ
    ジウムからなり、主要無機塩メジウムはＰ、Ｋ、Ｍｇ、
    ＳおよびＣａを供給し、微量無機塩メジウムはＦｅ、Ｚ
    ｎ、ＭｎおよびＣｕ、ＣｏおよびＭｏを供給する特許請
    求の範囲第１項から第１５項までのいずれかに記載の発
    酵方法。
17. （１７）水性メジウム中、炭素エネルギー基質として酸
    化炭化水素、好気性水性発酵条件、無機塩類、同化可能
    窒素源および酸素を用い細菌 ￥Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａ　ｓｐ．￥ＮＲＲＬ　Ｂ−１
    ５４１６の生物学的に純粋 な培養液を培養し、生成した単細胞微生物から蛋白質物
    質を回収することを特徴とする蛋白質物質の製造方法。
18. （１８）酸化炭化水素は１分子あたり炭素原子１〜４個
    を有するアルコールである特許請求の範囲第１７項に記
    載の製造方法。
19. （１９）アルコールはメタノールである特許請求の範囲
    第１８項に記載の製造方法。