CN111662848A

CN111662848A - 耐盐地衣芽孢杆菌a-a2-10的培养方法及应用

Info

Publication number: CN111662848A
Application number: CN202010631595.6A
Authority: CN
Inventors: 赵晨; 赵林; 岳秋林; 李昆仑; 李宝君; 苏乐
Original assignee: Jinan Hangchen Biotechnology Co ltd; Qilu University of Technology
Current assignee: Jinan Hangchen Biotechnology Co ltd; Qilu University of Technology
Priority date: 2020-03-25
Filing date: 2020-07-03
Publication date: 2020-09-15
Anticipated expiration: 2040-07-03
Also published as: CN111876347B; CN111876347A; CN111662848B

Abstract

本发明属于微生物培养技术领域，具体涉及一株耐盐菌Bacillus licheniformis A‑A2‑10，还涉及上述的耐盐菌的应用。本发明的耐盐菌，Bacillus licheniformis A‑A2‑10,该菌株已于2020年3月6日保藏于中国典型微生物保藏中心，保藏编号CCTCC NO.M 2020051。通过本发明的方法所培养的耐盐菌，可应用于高盐环境下利用谷氨酸废水中残留的谷氨酸合成聚谷氨酸并同时降解废水，并可将残糖将至0.2%以下，实现废液直接浓缩干燥回收硫酸铵，解决了传统谷氨酸母液残糖高、无法浓缩干燥问题。

Description

耐盐地衣芽孢杆菌A-A2-10的培养方法及应用

技术领域

本发明属于微生物培养技术领域，具体涉及一株耐盐地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis A-A2-10的培养方法，还涉及上述的耐盐菌的应用。

背景技术

CN110684690A披露了一种能够去除高盐分溶液中硝酸盐的耐盐菌的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：1)向装有废液的搅拌罐内加入氯化钠溶液，搅拌并进行微量曝气，控制氯化钠浓度在 25-35g/L；2)继续向搅拌罐内加入硝化污泥，再加入葡萄糖控制COD含量为1800-2200mg/L，培养 2-4天，加入硝酸钾，控制NO^3-浓度为400-600mg/L，反应60-84小时后，清空水样，留存活性污泥，即得耐盐菌。

通过上述方法能培养出高耐盐微生物，培养时间短，成本低且占地面积小，且微生物生存条件宽裕，可以承受温度及pH变化(快速变化除外)，应用于高盐分溶液中去除硝酸盐效果好。

上述的耐盐菌，主要是应用于高盐分溶液中去除硝酸盐，而关于应用于谷氨酸生产废水处理的耐盐菌，鲜有披露。

谷氨酸废水处理工艺，以下的文献进行过披露：

《谷氨酸生产废水处理工艺改造》对某谷氨酸生产废水水质及原有处理系统在运行过程中存在的问题进行了分析，在充分利用原有设施的前提下．设计了合理的改造工艺。结果表明：改造后的处理系统对COD、BOD、SS、氨氮的去除率分别为96．4％、94．6％、92．7％、91．9％，出水pH在7．0左右，出水水质达到了《味精工业污染物排放标准》（GB19431-2004）的要求。

《电渗析处理氨基酸废水的试验研究》披露了如下的方案：用电渗析技术对低浓度微酸性L－谷氨酸－水物系的分离进行了可行性研究。在实验条件下，氨基酸溶液经多次循环，浓相达饱和浓度0.05mol/L，稀相出料COD值小于100mg/L，达到排放标准，同时得到描述设备特性的经验模型。

上述的方案虽然在一定程度上对谷氨酸废水进行了处理，但是其并不能达到零排放，并且上述的方案中也无法做到对副产品加以回收和利用。

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种耐盐地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis A-A2-10，采用该菌株能显著的降低谷氨酸生产废水的处理成本，且克服了微生物受酸性生活环境影响生理活动无法正常进行从而影响处理能力的缺陷。

耐盐地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis A-A2-10的培养方法，该培养方法中所涉及到的耐盐地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis A-A2-10菌株已于2020年3 月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 2020051；保藏地址：中国湖北省武汉市武汉大学保藏中心202号。

上述耐盐地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis A-A2-10的培养方法的步骤是：将Bacillus licheniformis A-A2-10接种于种子培养基中，在37～42℃下培养12～18h；然后按照4～6%的接种量接入发酵培养基中，在37～42℃下培96～120h，获得含有γ-聚谷氨酸的发酵液。

上述的耐盐地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis的种子培养基由以下重量百分比的原料组成：酵母粉0.35～0.65%，蛋白胨0.8～1.2%，氯化钠0.35～0.65%。

上述耐盐地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis的发酵培养基由以下重量百分比的原料组成：含有质量浓度为12～20%硫酸铵的谷氨酸废液，余量为无菌水，采用1MNaOH调节pH值为7.0～7.5。

上述耐盐地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis是通过以下的重量百分比的原料的分离培养基分离培养所获得的：含有质量12～15%硫酸铵的谷氨酸高浓废液，琼脂1.8～2.2%，采用1MNaOH调节pH值为7.0～7.5。

上述耐盐地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis是通过如下的分离方法所获得的：

取海水、盐碱地环境中的样品，置于盛有种子培养基的容器中，振荡培养后，取稀释后的增殖液，用涂布法将样品接种于筛选培养基上进行培养，培养结束后挑选单菌落转接至斜面保藏培养基，经鉴定选育获得聚谷氨酸产生菌，保存得到目的菌株。

上述耐盐地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis的制作为菌剂的方法如下：

（1）将低温保存的地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis A-A2-10菌株在LB固体培养基上活化，挑取单菌落在LB斜面培养基上37℃培养24小时，获得活化的菌种；

（2）用无菌的接种环从LB斜面上刮取一环活化的菌种，接种于50mL LB液体培养基180rpm，37℃振荡24h，收集菌体，并调整菌体浓度为108cfu/mL，获得种子液；

（3）发酵培养按体积比1.5％将步骤(2)得到的种子液接种于发酵培养基，于37℃，180r/min摇培96 h；摇培得到的发酵液离心后，菌体用无菌水洗涤两次，离心，刮取沉淀的菌体置于无菌水中，配制得到只含菌体的菌剂；摇培得到的发酵液于4℃，12000rpm离心20min，获得耐盐菌Bacillus licheniformis菌剂。

上述耐盐地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis A-A2-10在牛肉膏蛋白胨培养基中，于37℃下培养24h后，培养基中呈现白色不透明的单菌落，表面湿润有光泽，边缘为圆锯齿，直径4-5mm；革兰氏染色阳性G+,细胞为杆状，芽孢染色后呈椭圆形；接触酶阳性，V.P.反应阳性，硝酸盐还原阳性，D-葡萄糖发酵阳性，D-木糖发酵阳性，阿拉伯糖发酵阳性，甘露醇发酵阳性，淀粉水解阳性。

通过上述的方法培养获得的耐盐地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformisA-A2-10在高盐环境下利用谷氨酸废水中残留的谷氨酸合成聚谷氨酸并同时降解废水中的残糖的应用，以及耐盐菌在高盐环境下利用谷氨酸废水生产肥料的应用，是本发明所要重点保护的范围。

上述的谷氨酸生产废水是指谷氨酸发酵及后续味精生产离交、中和各环节汇合而成的浓缩水；

优选的，谷氨酸生产废水谷氨酸发酵及后续味精生产离交、中和各环节汇合而成的未浓缩废水；

优选的，谷氨酸生产废水中的硫酸铵含量在5～40%之间。

上述的耐盐地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformisA-A2-10在高盐环境下利用谷氨酸废水中残留的谷氨酸合成聚谷氨酸并同时降解废水中的残糖的应用，也是本发明所要保护的范围。

上述的谷氨酸生产废水谷氨酸发酵及后续味精生产离交、中和各环节汇合而成的浓缩水；

或者是，谷氨酸生产废水谷氨酸发酵及后续味精生产离交、中和各环节汇合而成的未浓缩废水；

优选的，谷氨酸生产废水中的硫酸铵含量在5～40%之间。

相对于背景技术中的方案，本发明是将废水中的谷氨酸聚合成具有非常高肥效的聚谷氨酸，产品效果方面有非常显著的提升。

除此之外，背景技术中所披露的方案是目前行业常用工艺，但随着行业对环保要求越来越高，该工艺已逐步被淘汰甚至关停。本发明正是基于以上的大背景下进行改进的，本发明能达到无废水排放、能源消耗低、可100%回收硫酸铵、并产生价格非常高的聚谷氨酸副产品，废水附加值较现有工艺可以提高5倍以上，因此前景非常好。

本发明基于海水、盐碱地等环境分离的耐高渗菌株库，通过选育获得了一株γ-聚谷氨酸高产菌株。经鉴定，该菌株为地衣芽孢杆菌，可在硫酸铵浓度高达120～200g/L的谷氨高浓废液中，通过直接利用废液中残存的残糖（含量约为25～30g/L）以及谷氨酸（含量约为12～20g/L）等有机物高效合成γ-聚谷氨酸，产量达到10～15g/L，其效能远优于已报道菌株。

本发明的有益效果在于：

（1）本发明所用菌株不仅可以在高盐环境下降解难利用残糖，还可以利用残留谷氨酸合成聚谷氨酸；

（2）本发明所用菌株及处理工艺可将残糖将至0.2%以下，实现废液直接浓缩干燥回收硫酸铵，解决了传统谷氨酸母液残糖高、无法浓缩干燥问题；

（3）本发明所用菌株及处理工艺操作成本低，能耗低，副产品价值高，可继续回用于工业生产，经济效益显著提升。

附图说明

图1为本发明的地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformisA-A2-10 A-A2-10的细胞形态照片；

图2为本发明的地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformisA-A2-10A-A2-10的菌落形态照片；

图3为实施例1中所述浓缩干燥后的粗品硫酸铵；

图4为实施例3中所述固液分离干燥后的聚谷氨酸铁盐。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis A-A2-10菌株的分离筛选步骤如下：

将从滨州盐碱地采集的土壤称取3g，在无菌条件下研碎，放入盛有无菌生理盐水的锥形瓶中，加入玻璃珠后，在37℃恒温摇床中进行振荡48h，使土壤与水充分混匀。将土壤悬液进行梯度稀释，取100μL不同稀释度的土壤溶液分别在含有15%硫酸铵的LB固体培养基（酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠5 g/L，硫酸铵150 g/L）上涂布，每个浓度溶液做一次重复，37℃培养24h后取出平板，观察各平板上的菌落数并记录。在无菌条件下，挑取各不同单菌落在新的平板上划线分纯，直至平板上菌落纯化。将形态特征不同的各单菌落分别接种入pH调节为7.0、硫酸铵浓度为13.5%的谷氨酸高浓废液中，筛选获得γ-聚谷氨酸高产菌株，其细胞形态照片如图1所示。

实施例2

实施例1中的地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis A-A2-10菌株的摇瓶发酵培养的方法如下：

发酵培养基为硫酸铵浓度13.5%的谷氨酸高浓度废水，采用氨水调节培养基初始pH7.0。用接种环从LB平板中挑取A-A2-10菌株单菌落，接种到含有LB液体培养基的试管中，37℃恒温摇床培养18h获得种子液，按照5%接种量接种到含有400mL发酵培养基的1L三角瓶中，37℃ 200rpm，培养5d得到发酵液，按照1:4的添加量向发酵液中添加乙醇，所得产品经3次复溶醇沉后，获得聚谷氨酸粗品。

实施例3

实施例1中地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis A-A2-10菌株的5L发酵罐发酵培养方法如下：

发酵培养基为硫酸铵浓度13.5%的谷氨酸高浓度废水。采用氨水调节培养基初始pH7.0，灭菌条件为117℃ 20 min。

用接种环从LB平板中挑取A-A2-10菌株单菌落，接种到含有LB液体培养基的试管中，37℃恒温摇床培养18h获得种子液，按照5%接种量接种到含有400mLLB培养基的1L三角瓶中，37℃ 200rpm，培养24h，后按照5%接种量接种到含有3L发酵培养基的5L发酵罐中，通风量为1.5L/min，通过调节搅拌转速，控制溶氧在5~15之间，发酵5d得到发酵液，按照1:4的添加量向发酵液中添加乙醇，所得产品经3次复溶醇沉后，获得聚谷氨酸粗品。

实施例4

实施例1中的地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis A-A2-10菌株菌剂产品的制备方法如下：

发酵培养基为硫酸铵浓度14%的谷氨酸高浓度废水。采用氨水调节培养基初始pH 6.5，灭菌条件为115℃下灭菌20 min。

用接种环从LB平板中挑取A-A2-10菌株单菌落，接种到含有LB液体培养基的试管中，37℃恒温摇床培养18h获得种子液，按照5%接种量接种到含有400mLLB培养基的1L三角瓶中，37℃ 200rpm，培养24h，后按照5%接种量接种到含有3LLB培养基的5L发酵罐中，通风量为1.5L/min，通过调节搅拌转速，控制溶氧在5~15之间，发酵4d后，镜检观察菌株大部分已成芽孢，将发酵液喷干后，制备获得地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis A-A2-10菌株菌剂产品。

实施例5

将实施例1中所获得的耐盐菌Bacillus licheniformis A-A2-10应用于高盐谷氨酸废水处理中，具体的步骤如下：

步骤1、调节高盐谷氨酸废水的含盐17%，加水稀释至23%，pH调至6.0，灭菌温度为115℃，时间为15min；

步骤2、将耐盐菌株按照0.8%接种量接种至废水中，培养温度为32℃，通风培养55小时，废水残糖将至0.17%；

步骤3、向步骤2所述溶液中加入0.08%的五水硫酸铜，沉降聚谷氨酸；

步骤4、步骤3所得沉淀经固液分离后，80℃低温烘干，得聚谷氨酸铜盐；

步骤5、步骤3所得固液分离清液采用强制循环蒸发，再经流化床100℃干燥，得粗品硫酸铵。

实施例6

步骤1、调节高盐谷氨酸废水的含盐量20%，pH调至7.0，灭菌温度为115℃，时间为15min；

步骤2、将地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformisA-A2-10按照0.5～1.0%接种量接种至废水中，培养温度为37℃，时间为81小时，废水残糖达到0.14%；

步骤3、向步骤2所述溶液中加入0.06%氯化钙沉降聚谷氨酸；

步骤4、步骤3所得沉淀经固液分离后， 70℃低温烘干，得聚谷氨酸钙盐；

步骤5、步骤3所得固液分离清液采用多效蒸发浓缩，再经流化床120℃干燥可得粗品硫酸铵。

对比例1

以本行业常用谷氨酸废水处理工艺（多效蒸发法浓缩废水结晶回收硫酸铵）作为对比例1。

实施例7

现有行业常用谷氨酸废水处理工艺（多效蒸发法浓缩废水结晶回收硫酸铵）与本发明实施例3~6各数据对比如下：

表1 实施例3～6与对比例1的硫酸铵收率等比较

从以上表1中的数据可以看出，对比例1中的方案下，硫酸铵的收率仅为50~60%，而本发明的实施例3~6中硫酸铵的回收率达到了91%以上；

对比例1中，并没有其它高附加值的副产品产生，而本发明中产生了4%以上的农用聚谷氨酸；

通过本发明的方法，获得的产品中硫酸铵含量高，适于作为颗粒肥的原料或者是适于制作颗粒肥。

对比例1中，处理后的废水量还占有20~25%，而本发明中能做到废水的零排放，这说明本发明的方法更加环保；

对比例1中处理每吨废水需要成本150元左右，而本发明中每吨废水可产生500~600元的效益，从经济的角度来比较，本发明的方法极具经济效益。

实施例5中废水残糖降至0.17%；实施例6中废水残糖仅为0.14%；从废水中残糖来看，本发明中的废水经过处理后残糖显著含量低，不会导致无法高度浓缩的问题，这也是为何本发明中结晶回收硫酸铵得率高的原因，通过本发明的方法彻底的解决了废液产出量大的问题。

且相对于背景技术中对比例1的方法，其步骤4）水解：“将料液A烘干，粉碎机粉碎成粉末状，然后置于反应釜中, 加入6-8mol/L的盐酸，以没过原料为准”，一般来说烘干的温度较高，普遍采用500℃以上的温度来直接烘干，这将导致有机物炭化非常严重，所以产品中基本上只剩无机盐硫酸铵；而谷氨酸废水里面含有很多包括谷氨酸在内的氨基酸，500℃导致各种氨基酸破坏严重。本发明中实现了在低温下对硫酸铵进行结晶回收，将谷氨酸变成了市场价格更高的聚谷氨酸。（谷氨酸市售价格一般为3000-4000/吨，而聚谷氨酸的纯品约为20万/吨），显然的本发明的经济效益更高。

实施例8

取山东某味精厂离子交换提取谷氨酸后排出的谷氨酸母液，其含盐量约为25.4%左右；以该母液为待处理废水，备用；

实施例9

取山东某市另一家味精生产厂家的原废母液排放口1中的样品，以该母液为待处理废水，备用；

实施例10

从实施例6中的厂家取味精生产提菌后的废水，为待处理废水，备用；

实施例11

从实施例9中的厂家取味精生产处理后废水，为待处理废水；

实施例12

从实施例9中的厂家取味精生产的总排放口废水，为待处理废水；

将实施例8～12中的废水分别取样，采用实施例3中的方法进行处理，结果如下：

表2 实施例8～12中硫酸铵收率等比较

从以上表格中可以看出，本发明通过对于味精生产厂家的废水进行处理，也获得了优异的处理效果，即，硫酸铵回收率高，达到了91%以上，处理后的废水量为0，产生了4%以上的农用聚谷氨酸；每吨废水产生的经济效益约为500～600元/吨。

本发明人还进行了如下的实验，本发明人购买了不同厂家所生产的芽孢杆菌，应用于上述实施例13～16中废水的处理中，处理方法同实施例3，不同厂家的地衣芽孢杆菌分别记作实施例13～16结果如下：

表3 实施例13～16硫酸铵收率等比较

从以上表格中可以看出，实施例13～16中硫酸铵收率较实施例3要低。

处理后的废水量也要高于实施例3；其它高值副产品也要低于实施例3，吨废水产生效益也要低于实施例3。可见实施例13～16中市售的普通的芽孢杆菌在处理味精生产废水中的效果远远不如实施例3。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.耐盐地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis A-A2-10的培养方法，其特征在于，所述的耐盐地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis A-A2-10菌株已于2020年3月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO.M 2020051；

所述方法的步骤是：将地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis A-A2-10接种于种子培养基中，在37～42℃下培养12～18h；然后按照4～6％的接种量接入发酵培养基中，在37～42℃下培养96～120h，获得含有γ-聚谷氨酸的发酵液。

2.如权利要求1所述的耐盐地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis A-A2-10的培养方法，其特征在于，所述耐盐地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis的种子培养基由以下重量百分比的原料组成：酵母粉0.35～0.65%，蛋白胨0.8～1.2%，氯化钠0.35～0.65%。

3.如权利要求1所述的耐盐地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis A-A2-10的培养方法，其特征在于，所述耐盐地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis的发酵培养基由以下重量百分比的原料组成：含有质量浓度为12～20%硫酸铵的谷氨酸废液，余量为无菌水，采用1MNaOH调节pH值为7.0～7.5。

4.如权利要求1所述的耐盐地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis A-A2-10的培养方法，其特征在于，所述耐盐地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis是通过以下的重量百分比的原料的分离培养基分离培养所获得的：含有质量12～15%硫酸铵的谷氨酸高浓废液，琼脂1.8～2.2%，采用1MNaOH调节pH值为7.0～7.5。

5.如权利要求1所述的耐盐地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis A-A2-10的培养方法，其特征在于，所述耐盐地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis是通过如下的分离方法所获得的：

取海水、盐碱地环境中的样品，置于盛有种子培养基的容器中，振荡培养后，取稀释后的增殖液，用涂布法将样品接种于筛选培养基上进行培养，培养结束后挑选有单菌落转接至斜面保藏培养基，经鉴定选育获得聚谷氨酸产生菌，保存得到目的菌株。

6.如权利要求1所述的耐盐地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis A-A2-10的培养方法，其特征在于，所述耐盐地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis的制作为菌剂的方法如下：

（1）将低温保存的Bacillus licheniformis A-A2-10菌株在LB固体培养基上活化，挑取单菌落在LB斜面培养基上37℃培养24小时，获得活化的菌种；

7.如权利要求1所述的耐盐地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis A-A2-10的培养方法，其特征在于，所述耐盐地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis A-A2-10在牛肉膏蛋白胨培养基中，于37℃下培养24h后，培养基中呈现白色不透明的单菌落，表面湿润有光泽，边缘为圆锯齿，直径4-5mm；革兰氏染色阳性G+,细胞为杆状，芽孢染色后呈椭圆形；接触酶阳性，V.P.反应阳性，硝酸盐还原阳性，D-葡萄糖发酵阳性，D-木糖发酵阳性，阿拉伯糖发酵阳性，甘露醇发酵阳性，淀粉水解阳性。

8.通过权利要求1所述的方法培养的耐盐地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformisA-A2-10在高盐环境下利用谷氨酸废水中残留的谷氨酸合成聚谷氨酸并同时降解废水中残糖的应用。

9.通过权利要求1所述的方法培养的耐盐地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis A-A2-10在高盐环境下利用谷氨酸废水生产肥料的应用。

10.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的谷氨酸生产废水谷氨酸发酵及后续味精生产离交、中和各环节汇合而成的浓缩水；

优选的，所述的谷氨酸生产废水为谷氨酸发酵及后续味精生产离交、中和各环节汇合而成的未浓缩废水；

优选的，所述的谷氨酸生产废水中的硫酸铵含量在5～40%之间。