JPH05137585A

JPH05137585A - エリスリトール連続培養法

Info

Publication number: JPH05137585A
Application number: JP30640291A
Authority: JP
Inventors: Toshihiro Maeda; 敏弘前田; Makoto Shida; 誠志田; Shuichi Abe; 修一安部
Original assignee: Mitsubishi Kasei Corp
Current assignee: Mitsubishi Kasei Corp
Priority date: 1991-11-21
Filing date: 1991-11-21
Publication date: 1993-06-01

Abstract

(57)【要約】【構成】エリスリトール生産菌を用い、菌体の窒素含
有率を２．５〜４．５％に維持しながら連続培養を行う
ことを特徴とするエリスリトール連続培養法。【効果】本発明によれば、菌体の窒素含有率を特定範
囲内に制御することにより、エリスリトール収率を向上
させることができる。供給基質液の炭酸源と窒素源の濃
度比により菌体の窒素含有率は容易に制御でき、培養中
の運転コントロールが容易なので、工業的に利用しやす
く産業に寄与するところ大である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はエリスリトール連続培養
法に関し、特に回分培養法に比べて高い生産速度を有し
高収率でエリスリトールの大量生産が可能な条件で連続
培養を行う方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】エリスリトールの製造方法としては、回
分培養法によるもの、例えば、オーレオバシディウム菌
によるもの（特公平３−４３０９１）、キャンジダ菌に
よるもの（特公昭４７−４１５４９）、モニリエラ菌に
よるもの（特公昭６０−１１０２９８）等が知られてい
る。エリスリトールを短時間で効率よく生産するために
は、エリスリトール生産菌の菌体濃度（以下「菌体濃
度」とは、培地１リットル当たりに含まれる、培地中の
菌体の乾燥固形分の重量（ｇ）を意味する。）として、
５０ｇ／ｌ程度を必要とする。しかし、回分培養法では
エリスリトールを生産する菌体を、その都度、種菌量と
して菌体濃度１〜２ｇ／ｌから分裂増殖させて作り出さ
なければならず、原料である基質のかなりの部分が、エ
リスリトール生産用でなく、菌体生産用に消費されてし
まうので、エリスリトール収率には上限があり４０〜４
８％程度に過ぎない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】ほぼ増殖し終えた菌に
基質を連続的に供給して、エリスリトールを優先的に生
産させるように制御し収率を上げる方法として連続培養
法がある。しかし、連続培養法でも菌体の新生更新は必
要であるので、最小限の増殖はさせなければならず、基
質の供給が必要である。

【０００４】菌体の増殖による基質の消費を必要最小限
に押さえつつ、エリスリトールを高収率で生産させるた
めに、培養を制御する指標としていまだ最適なものはな
かった。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記実情に
鑑み、連続培養時にエリスリトールを高収率で生産させ
るための制御因子について種々検討した結果、注目すべ
き指標として菌体の増殖に対しては、単位菌体濃度当た
りの増殖速度である菌の比増殖速度（μ）を、エリスリ
トールの生産性に対しては、単位菌体濃度当たりのエリ
スリトール生産速度であるエリスリトール比生産速度
（ε）を指標として着目すればよいことを見い出した。
そして更に、菌体の窒素含有率がこの両指標に密接に相
関する重要な因子であり、エリスリトールを高収率で生
産させるための制御因子となることを見い出して本発明
に到達した。

【０００６】即ち、本発明の要旨は、エリスリトール生
産菌を用い、菌体の窒素含有率を特定範囲内に維持しな
がら連続培養を行うことを特徴とするエリスリトール連
続培養法に存する。以下に、本発明のエリスリトール連
続培養法及びその制御因子の相関関係について詳細に説
明する。

【０００７】連続培養を、培地中の溶存酸素濃度（以下
ＤＯと略記する）を０．５〜３ｐｐｍに維持して行う
と、基質の炭素源（グルコース等）は、エリスリトール
生産用と菌体増殖用とに、ほぼすべてが変換される。し
たがって、エリスリトールの収率を最大にするには、エ
リスリトール生産活性を落とさない範囲で菌体増殖を最
低限に抑え、できるだけ多くの基質炭素源をエリスリト
ール生産用として消費させる必要がある。

【０００８】菌体の増殖に対しては、比増殖速度（μ）
が、エリスリトール生産活性に対しては、エリスリトー
ル比生産速度（ε）が指標となる。すなわち、エリスリ
トール収率を上げるためには、μをできるだけ下げると
同時に、εをできるだけ上げるように制御すればよい。
更に、μとεの制御について種々検討した結果、菌体の
窒素含有率が、この両指標に密接に相関する因子であ
り、エリスリトールの収率の制御因子となることが、次
に述べるように見い出された。

【０００９】ここで、本発明における「菌体の窒素含有
率」とは、菌体の乾燥固形分中に含まれる窒素を重量％
で表したものを示す。菌体の窒素含有率の測定法として
は、培地中の菌体を遠心分離等で集菌し、洗浄した後に
乾燥させたものを用いて、通常の元素分析法などにより
測定することが出来る。窒素は菌体中のタンパク質、酵
素等の主要構成元素であるから、その含有率は前記の２
つの指標（μ、ε）に密接に相関する重要な因子であ
る。

【００１０】菌の比増殖速度μは菌体の窒素含有率が低
いほど低下し、両者には正の相関性がある（図−２、図
−４参照）。エリスリトール比生産速度εについても、
菌体の窒素含有率とは正の相関性があるが、逆に菌体の
窒素含有率がオーレオバシディウム菌で２．５％以下、
キャンジダ菌で３．５％以下になると、エリスリトール
比生産速度εが急に低下する傾向がみられた（図−３、
図−５参照）。これらの２つの指標μ、εと菌体の窒素
含有率との相関関係から、エリスリトール収率が菌体の
窒素含有率と密接に関係していることがわかる。すなわ
ち、エリスリトール収率向上のために菌体増殖をできる
だけ抑えるには、菌体の窒素含有率をなるべく低く制御
すればよい。しかし、菌体の窒素含有率が低くなり過ぎ
ると、菌の比増殖速度μに比べてエリスリトール比生産
速度εの低下が著しく大きくなり、エリスリトール収率
が低下に転じてしまう。菌体の窒素含有率の制御を試み
たところ、オーレオバシディウム菌で約２．５〜３．５
％、キャンジダ菌で３．５〜４．５のときにエリスリト
ール収率が最大になるという結果が得られた。

【００１１】上述のように、菌体の窒素含有率を制御因
子とし２．５〜４．５％に維持することによって、エリ
スリトール収率を最大にし、かつ維持することが可能で
あることが見出された。以下に、菌体の窒素含有率を制
御する方法についてより具体的に述べる。また、以下、
一般的なエリスリトールの培養法による製造例に沿って
説明するが、本発明の培養法を制限するものではない。

【００１２】培養は、通常、液体培地を用いて撹拌によ
る好気的条件下に実施される。培地の主炭素源として
は、グルコース等の醗酵性糖類、グリセリン、炭化水
素、酢酸などが使用される。窒素源としては、通常、尿
素、硫安等の窒素化合物や、コーンスチープリカー、酵
母エキス等の天然由来のものが使用される。無機塩類と
しては、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム、硫
酸亜鉛、硫酸第一鉄、硫酸銅、硫酸マンガン、塩化カリ
ウム等が好ましく用いられる。さらに、菌体の生育に必
要な各種の有機物、無機物、ビタミンなどの栄養素、あ
るいは、通常用いられる消泡剤などが添加される。以上
に挙げた培地はごく一般的な例であり、エリスリトール
生産菌を用いる通常の培養法であれば、培養条件は任意
に定められる。

【００１３】まず、通常の回分培養を行って菌体を十分
に増殖させる。例えば培地３リットル（培養槽５リット
ル容）に種培養液３％を加え、温度３５℃、通気量１ｖ
ｖｍ、回転数５００ｒｐｍ、ｐＨ４．２の条件で４日間
培養を行えばよい。回分培養の終わりが近づき、菌体が
十分に増殖した時点で（菌体濃度５０ｇ／ｌ、エリスリ
トール濃度１５０ｇ／ｌ程度が好ましい）連続培養を開
始するのが好ましい。

【００１４】連続培養では、後記図−１に示すように、
炭素源（グルコース等）、窒素源（尿素等）を主成分と
する基質液を全供給液として供給し、同時に培地を同量
抜き出し、余剰の菌体増殖分以外の培地中から菌体のみ
を分離濃縮して培養槽内に濃縮菌体として戻すのが好ま
しい。この際回転数を８００ｒｐｍ程度に引き上げてＤ
Ｏを０．５〜３ｐｐｍの範囲に維持するのが更に好まし
く、それ以外の温度、通気量、ｐＨ等の条件は回分培養
時と同じでよい。定常状態で、エリスリトールは２５０
ｇ／ｌ程度生産される。

【００１５】連続培養抜き出し液からのエリスリトール
の分離精製法としては、例えば、濾過、遠心分離、イオ
ン交換又は吸着クロマトグラフィー、溶媒抽出、蒸留、
晶析などの操作を必要に応じて適宜組み合せて用いれば
よい。一例として、特公平１−３２０９８７号公報記載
の方法が挙げられる。本発明の重要な要件である菌体の
窒素含有率は、前述のとおり元素分析等による測定が可
能であるので、菌体の窒素含有率を指標として、菌体が
増殖する分に必要なだけの窒素源の量を定め、これを連
続倍養槽中に供給することにより維持することが出来
る。

【００１６】炭素源は、倍養液中のＤＯを０．５〜３ｐ
ｐｍに維持した場合、ほとんど全量が菌体とエリスリト
ールに変換される。ＤＯが低すぎる場合は、嫌気性条件
となってエタノールを多量に副生しエリスリトール収率
の低下が認められる。一方、ＤＯが高すぎると呼吸活動
が活発となって炭酸ガスが増加し、やはりエリスリトー
ル収率の低下を引き起こす。それ故に、ＤＯは０．５〜
３ｐｐｍの範囲が望ましく、例えばこの条件下でグルコ
ースを炭素源とした場合、菌体１ｇの増殖についてグル
コース２．０８ｇが消費され、エリスリトール１モル
（１２２ｇ）の生産についてグルコース１モル（１８０
ｇ）が消費される。また、同条件下では窒素源中のＮ
も、ほとんど全量が菌体に取り込まれる。例えば窒素及
び酵母エキスを窒素源とした場合、尿素１モル（６０
ｇ）中のＮは２８ｇ、酵母エキス１ｇ中のＮは０．１ｇ
で、これがほぼ全量菌体に取り込まれることとなる。

【００１７】図−２、図−４で示される菌の比増殖速度
μと菌体の窒素含有率との相関関係と図−３、図−５で
示されるエリスリトール比生産速度μと菌体の窒素含有
率との相関関係により、菌体の窒素含有率を特定範囲内
の値に定めれば、その菌体の窒素含有率に対応するμと
εをそれぞれ定めることができる。そのようにして定め
たμとεを指標として、供給する炭素源と窒素源の必要
量を求め、エリスリトールの収率を制御する。すなわ
ち、炭素源の必要量は、エリスリトールに転換される分菌体が新たに分裂増殖するのに必要な分培養糟からの抜き出し液中に含まれる分上記の和が供給する炭素源の必要量である。ま
た、窒素源の必要量は、菌体が新たに分裂増殖するのに必要な分培養糟からの抜き出し液中に含まれる分上記の和が供給する窒素源の必要量である。

【００１８】上記を算出することにより、培
養糟に供給されるべき基質液の流量と、そこに含まれる
べき窒素源の量を求めることができる。また、エリスリ
トール収率は、消費された炭素源の量に対して生産され
たエリスリトールの量の割合（％）で表される。

【００１９】

【実施例】次に本発明を実施例によって更に具体的に説
明するが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実
施に限定されるものではない。

【００２０】実施例１始めに、種培養及び回分培養により、菌体を十分に増殖
させた。グルコース３００ｇ／ｌ、酵母エキス１０ｇ／
ｌ、寒天１５ｇ／ｌからなる斜面培地に、オーレオバシ
ディウムｓｐ．ＳＮーＧ４２菌株の菌体を塗布し、３０
℃で３日間静置培養した。次に、グルコース３００ｇ／
ｌ、酵母エキス１０ｇ／ｌを含む液体培地１００ｍｌを
入れた５００ｍｌ容三角フラスコに上記培養菌体を１白
金耳分植菌し、３０℃で３日間培養を行ない種培養液を
得た。次いで、回分培養を行なったが、その際の培地組
成を下記表−１に示す。

【００２１】

【表１】

【００２２】表−１に示す組成の培地３リットル（培養
糟５リットル容）に種培養液３％を加え、温度３５℃、
通気量１ｖｖｍ、回転数５００ｒｐｍ、ｐＨ４．２の条
件で４日間回分培養を行なったところ、４日後の時点で
菌体濃度６０ｇ／ｌとなった。次に連続培養に移り、回
転数を８００ｒｐｍとしてＤＯを０．５〜３．０ｐｐｍ
の範囲に維持した以外、温度、通気量、ｐＨ等の条件は
回分培養時と同じ条件で行った。菌体濃度が６０ｇ／ｌ
で、基質供給液のグルコース濃度を５００ｇ／ｌ、尿素
濃度を１．５４ｇ／ｌとした他は、表−１に示した培地
中のＫＣｌ等微量成分については回分培養時と等濃度と
し、供給流量を０．０３０ｌ／Ｈｒ、培地ブロスの直接
抜き出し流量は０．０１２ｌ／Ｈｒ、菌体分離後の上清
抜き出し流量は０．０１８ｌ／Ｈｒとして連続培養を行
った。

【００２３】結果として、定常状態において菌体の窒素
含有率は３．０％に維持され、対消費グルコース当たり
のエリスリトール収率は平均６０．０％であった。

【００２４】実施例２種培養から回分培養の終了段階までの方法は実施例１と
同様に行い、以降、連続培養に移った。菌体濃度が６０
ｇ／ｌで、基質供給液のグルコース濃度を５００ｇ／
ｌ、尿素濃度を２．４９ｇ／ｌにした他は、表−１に示
した培地中のＫＣｌ等微量成分については回分培養時と
等濃度とし、供給流量を０．０３８ｌ／Ｈｒ、培地ブロ
スの直接抜き出し流量は０．０２１ｌ／Ｈｒ、菌体分離
後の上清抜き出し流量は０．０１７ｌ／Ｈｒとして連続
培養を行った。結果として、定常状態において、菌体の
窒素含有率は３．６％に維持され、対消費グルコース当
たりのエリスリトール収率は平均５５．８％であった。

【００２５】実施例３種培養から回分培養の終了段階までの方法は実施例１と
同様に行い、以降、連続培養に移った。菌体濃度が６０
ｇ／ｌで、基質供給液のグルコース濃度を５００ｇ／
ｌ、尿素濃度を０．４４ｇ／ｌ、ＫＣｌ等表−１に示し
た培地中の微量成分については回分培養時と等濃度と
し、供給流量を０．０２２ｌ／Ｈｒ、培地ブロスの直接
抜き出し流量は０．００３ｌ／Ｈｒ、菌体分離後の上清
抜き出し流量は０．０１９ｌ／Ｈｒとして連続培養を行
った。結果として、定常状態において、菌体の窒素含有
率は２．６％に維持され、対消費グルコース当たりのエ
リスリトール収率は平均５８．５％であった。

【００２６】実施例４始めに、種培養および回分培養により、菌体を十分に増
殖させた。グルコース３００ｇ／ｌ、酵母エキス１０ｇ
／ｌ、寒天１５ｇ／ｌからなる斜面培地に、キャンジダ
・リポリティカ２−２１菌株の菌体を塗布し、２７℃で
３日間静置培養した。次に、グルコース３００ｇ／ｌ、
酵母エキス１０ｇ／ｌを含む液体培地１００ｍｌを入れ
た５００ｍｌ容三角フラスコに上記培養菌体を１白金耳
分植菌し、２７℃で３日間培養を行い種培養液を得た。
次いで、回分培養を行ったが、その際の培地組成は、グ
ルコース４００ｇ／ｌ、酵母エキス２０ｇ／ｌ、塩酸チ
アミン１．５ｇ／ｌとした。

【００２７】上記組成の培地３リットル（培養槽５リッ
トル容）に種培養液２％を加え、温度２７℃、通気量１
ｖｖｍ、回転数５００ｒｐｍ、ｐＨ４．５の条件で４日
間培養を行った。４日後の時点で、菌体濃度は６０ｇ／
ｌとなった。次に、連続培養に移り、回転数を８００ｒ
ｐｐｍとしてＤＯを０．５〜３ｐｐｍの範囲に維持した
以外、気温、通気量、ｐＨ等の条件は、回分培養時と同
じ条件で行った。

【００２８】菌体濃度が６０ｇ／ｌで、基質供給液のグ
ルコース濃度を５００ｇ／ｌ、酵母エキス濃度を１４．
５ｇ／ｌ、塩酸チアミンについては、回分培養時と等濃
度とし、供給流量を０．０２６ｌ／Ｈｒ、培地ブロスの
直接抜き出し流量は０．０１５ｌ／Ｈｒ、菌体分離後の
上清抜き出し流量は０．０１１ｌ／Ｈｒとして連続培養
を行った。結果として、定常状態において、菌体の窒素
含有率は４．１％に維持され、対消費グルコース当たり
のエリスリトール収率は平均６１．１％であった。

【００２９】実施例５種培養から回分培養の終了段階までの方法は実施例４と
同様に行い、以降、連続培養に移った。菌体濃度が６０
ｇ／ｌで、基質供給液のグルコース濃度を５００ｇ／
ｌ、酵母エキス濃度を１９．９ｇ／ｌ、塩酸チアミンに
ついては、回分培養時と等濃度とし、供給流量を０．０
３９ｌ／Ｈｒ、培地ブロスの直接抜き出し流量は０．０
２７ｌ／Ｈｒ、菌体分離後の上清抜き出し流量は０．０
１２ｌ／Ｈｒとして連続培養を行った。結果として、定
常状態において、菌体の窒素含有率は４．６％に維持さ
れ、対消費グルコース当たりのエリスリトール収率は平
均４４．８％であった。

【００３０】実施例６種培養から回分培養の終了段階までの方法は実施例４と
同様に行い、以降、連続培養に移った。菌体濃度が６０
ｇ／ｌで、基質供給液のグルコース濃度を５００ｇ／
ｌ、酵母エキス濃度を１１．２ｇ／ｌ、塩酸チアミンに
ついては、回分培養時と等濃度とし、供給流量を０．０
１１ｌ／Ｈｒ、培地ブロスの直接抜き出し流量は０．０
０６ｌ／Ｈｒ、菌体分離後の上清抜き出し流量は０．０
０５ｌ／Ｈｒとして連続培養を行った。結果として、定
常状態において、菌体の窒素含有率は３．６％に維持さ
れ、対消費グルコース当たりのエリスリトール収率は平
均５７．０％であった。

【００３１】比較例１オーレオバシディウムｓｐ．ＳＮ−Ｇ４２菌株を用い、
種培養から回分培養の終了段階までの方法は実施例１と
同様に行い、以降、連続培養に移った。菌体濃度が６０
ｇ／ｌで、基質供給液のグルコース濃度を５００ｇ／
ｌ、尿素濃度を０．５２ｇ／ｌとした他は、表−１に示
した培地中のＫＣｌ等微量成分については回分培養時と
等濃度とし、供給流量を０．０１７ｌ／Ｈｒ、培地ブロ
スの直接抜き出し流量は０．００３ｌ／Ｈｒ、菌体分離
後の上清抜き出し流量は０．０１４ｌ／Ｈｒとして連続
培養を行った。結果として、定常状態において、菌体の
窒素含有率は２．３％になり、本発明の菌体の窒素含有
率の制御範囲を外れ、対消費グルコース当たりのエリス
リトール収率も平均３０．１％まで低下した。

【００３２】比較例２オーレオバシディウムｓｐ．ＳＮ−Ｇ４２菌株を用い、
種培養から回分培養の終了段階までの方法は実施例１と
同様に行い、以降、連続培養に移った。菌体濃度が６０
ｇ／ｌで、基質供給液のグルコース濃度を５００ｇ／
ｌ、尿素濃度を４．８２ｇ／ｌとした他は、表−１に示
した培地中のＫＣｌ等微量成分については回分培養時と
等濃度とし、供給流量を０．０６０ｌ／Ｈｒ、培地ブロ
スの直接抜き出し流量は０．０４５ｌ／Ｈｒ、菌体分離
後の上清抜き出し流量は０．０１５ｌ／Ｈｒとして連続
培養を行った。結果として、定常状態において、菌体の
窒素含有率は５．０％になり、本発明の菌体の窒素含有
率の制御範囲を外れ、対消費グルコース当たりのエリス
リトール収率も平均２９．１％まで低下した。

【００３３】

【発明の効果】エリスリトール生産菌を用い、菌体の窒
素含有率を特定範囲内に制御することにより、菌の比増
殖速度μおよびエリスリトール比生産速度εを定め、エ
リスリトール収率を向上させることができる。また、連
続培養においては、供給基質液の炭素源と窒素源の濃度
比により、菌体の窒素含有率を容易に制御できるので、
培養中の運転コントロールが容易となり、工業的に利用
しやすく産業に寄与するところ大である。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明で用いられる好ましい連続培養の一例を
示すフロー図である。

【図２】オーレオバシディウムｓｐ．ＳＮ−Ｇ４２菌株
における菌の比増殖速度μ、エリスリトール収率及び菌
体の窒素含有率の相関関係を示す。

【図３】オーレオバシディウムｓｐ．ＳＮ−Ｇ４２菌株
におけるエリスリトール比生産速度εと菌体の窒素含有
率との相関関係を示す。

【図４】キャンジダ・リポリティカ２−２１菌株におけ
る菌の比増殖速度μ、エリスリトール収率及び菌体の窒
素含有率との相関関係を示す。

【図５】キャンジダ・リポリティカ２−２１菌株におけ
るエリスリトール比生産速度εと菌体の窒素含有率との
相関関係を示す。

【符号の説明】

１培養槽２培養液３分離機

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】エリスリトール生産菌を用い、菌体の
窒素含有率を２．５〜４．５％に維持しながら連続培養
を行うことを特徴とするエリスリトール連続培養法。
【請求項２】培地中の溶存酸素濃度を０．５〜３ｐ
ｐｍに維持しながら請求項１記載の連続培養を行うこと
を特徴とするエリスリトール連続培養法。