JPH02257885A

JPH02257885A - グリセロールから１，３‐プロパンジオールを微生物学的に生成する方法

Info

Publication number: JPH02257885A
Application number: JP1321246A
Authority: JP
Inventors: G Gottschalk; ジー・ゴットシャルク; Beate Averhoff; ビーテ・アベルホフ
Original assignee: Unilever NV
Current assignee: Unilever NV
Priority date: 1988-12-12
Filing date: 1989-12-11
Publication date: 1990-10-18
Also published as: US5164309A; EP0373230A1; ATE85813T1; EP0373230B1; DE3878564D1; JPH0469997B2; DE3878564T2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は水素供与体として補基質（ｃｏｓｕｂｓｔｒａ
ｔｅ）を添加し、生成したプロパンジオールを分離する
、適した細菌株の増殖培地中でグリセ臼−ルがら１゜３
、−プロパンジオールを微生物学的に生成する方法に関
する。

グリセロールから１．３−プロパンジオール又はトリメ
ブレングリコール（ＴＨＧ）を生成する方法は公知であ
る。この方法を行なうどきには本質的に下記の点を考慮
に入れなければならない。グリセ［」−ルを１．３−ブ
［１パンジオールに変換でさる細菌株は例えばクレブシ
ェラ（ＫＩｅｔｌＳｉＯＩｌａ）　［ジャーノール・オ
プ・バクテリオ０ジー（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）　
（１９８２年）第１４９巻第４１３乃至４１９頁参照］
、シトロバクタ−（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）　　［ジ
ャーナル・オプ・バクテリオ０ジー（１９４４年）第３
９巻第４０９乃至４１５頁参照］、クロストリデイウム
（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）　　［アプライド・アンド
・エンバイロメンタル・マイクロバイオ［１ジー（八ｐ
ｐ１．［’ｎｖｉｒｏｎ、Ｈｉｃｒｏｂｉｏ１．　（１
９８７年）第５３巻第６３９乃至６４３頁参照］、イリ
オバクターＩＩ　ｏｂａｃｔｅｒ　　［アーカイブス・
オブ・マイクロバイオロジー（ＡｒＣｈ、Ｈｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ、　）（１９８４年）第１４０巻第１３９乃至１
４６頁参照Ｊ及びラクトバヂ・ルス［システマチック・
アンドウアプライド・マイクロバイオロジー（Ｓｙｓｔ
ｅ−、＾ｐｐ１．　Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌ、）（１９８４
年）第５巻第１６９７ｂ至１７８頁参照］種に見出され
る。さらに必然的又は任意に発酵をおこさせる物質も発
酵生成物としての１．３−プロパンジオールを生成する
ことを無視することはできない。

シト【１バクタ一種の中ではシト０バクター・フリュン
ジイ（Ｃ，ｆｒｅｕｎｄｉｉ　）は１．３プ［１パンジ
オ一ル生成体として特によく知られている。数種の菌株
（例えばＤＳ８３００３９．３００４Ｇ及び３００４７
）は入手可能である。

用いられる細菌株によって、増殖及び１．３−プロパン
ジオールの附随生成のためにグリセ［」−ルを有する無
機培地又は、グリセ臼−ルを有する複合培地を用いるこ
とが可能である。ｐＨ及び温度のような周囲条件も又、
用いるｌｌｌ１菌殊による。グリセ０−ルを１．３−プ
ロパンジオールに変換する酵素は嫌気条件下でのみ生成
されるので常に嫌気増殖条件を与えなければならない。

関与する酵素、グリレロールγヒドラタービは補Ｗｇ素
Ｂ１２を含有するので、細菌に適当なコバルト鉄を確実
に供給しなければならない［アーカイブス・Ａブ・バイ
オケミストリー・アンド・バイオフィジックス（Ａｒｃ
ｈ、　Ｂｉｏｃｈｃｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　）（１９
６２年）第９７巻、第５３８乃至５４３頁参照］。

前記の細菌株を用いると、１．３−プロパンジオールを
回分式で又は連続的に生成できる。種によってグリセロ
ールの回分式嫌気発酵での１．３−プロパンジオールの
収率は異なる。ラクトバブールス・ブフネリ（Ｌａｃｔ
ｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｕｃｈｎｅｒｔ）では７８％、
りＯストリジウム・ブブリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕ
ｍｂｕｔｙｌｉｃｕｌ）では６１％、イリオバクター・
ポリトロパス（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ　ｐｏ＋ｙｔｒｏ
ａｕｓ）では４０％、シト０バクターでは５０％である。ラクトバブルス種に関しては、グリ
セロールのみでなく、グリセロールとグルコースの２：
１混合物が発酵されることに注意ずべきである。細菌種
によって、グリセロールの発酵中に種として酢酸塩、酪
酸塩、乳酸塩、ギ酸塩、コハク酸塙、エタノール、ブタ
ノール及びヒト［１キシプロピオン酸塩（イリオバクタ
ー・ポリトロバスの場合）の異なるｎ１生物のスペクト
ルが現われる。

前記の発酵は回分式法で行なう培養に関するが、１９８
７年に、１．３−プロパンジオールが生成する、グリセ
［１−ルの連続的発酵に関する結果が初めて発表された
［アプライド・アンド・エンバイロメンタル・マイクロ
バイオロジー（１９８７年）第５３巻第６３９乃至６４
３頁参照］。発酵は、必然的に発酵をおこさせる物質と
してクロストリジウム・ブグリカムＢ５９３を用いて行
なった。３．８％のグリセロールを化学的に特定した培
地に添加し、その９７％が細菌と反応した。培地に０．
２％酵母エキスを添加することも必要だった。気相にお
いて酵素がなく二酸化炭素があり、反応器中での細菌の
滞留時間は１０時間であり温度は３５℃であった。連続
的発酵はＨＰＬＣ及びＧＣで分析して下記の生成物スペ
クトルを与えた：１．３−プ［ｌパンジオール　６１％、酢Ｍ塩　１．６
％、　　酪酸塩　１．６％、乳酸塩　０．９％、　　ブ
タノール　０．６％、エタノール　０．６％上記記載から細菌を用いて副生物なしに１．３−プロパ
ンジオールを合成づることは不可能のように考えられる
。なぜなら、グリｔ７Ｌｌ−ルの１．３−ブ「１パンジ
オールへの還元が生成する水素を除去するのに用いられ
る一方、グリセ１］−ルの一部は、エネルギーを得るた
めに酸化されなくてはならないからである。ｐＨ値が６
．５から４．９に低下すると細菌の増殖と１．３−７１
コパンジオールの生成は減少する。１．３−プロパンジ
オールの合成中の中間体は３−ヒドロキシプロピオンア
ルデヒドであり、その生成は又、ある発酵試験の目的で
もあつ／、−、［アプライド・アンド・エンバイロメン
タル・マイクロバイオロジー（１９８３年）第４６巻第
１号、第６２乃’ｉ！６７頁参照。１クレブシエラ・二
ｌ−七二アエ（に１ｅｂｓｉｅｌｌａ　　ｐｎｅｕｎ＋
ｏｎｉａｅ）を用いるグリセ［１−ルの嫌気発酵の場合
、発酵反応の速さはセミカルバジド塩酸塩の添加により
変わる。３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの生成は
次の１．３−プロパンジオールへの還元より非常に速く
起こり、結果として３−ヒドロキシプロピオンアルデヒ
ドの蓄積をもたらした。３０９／Ｊのグリセロール溶液
の場合１３．１９／Ｊの３−ヒト［１キシプ［１ビＡン
アルデヒドの収ルを得た。本発明の課題はグリセロール
から１．３−プロパンジオールを高収率でしかし実質的
に環境的に有害な副生物を除去しながら得る単純で経済
的で迅速にそして連続的に１成するように上記の方法を
改良することである。

本発明により、この課題は、ａ）グリセしＩ−ルを供給
し、必要なら、定常発育期（ｓｔａｔｉｏｎａｒｙｇｒ
ｏｗｔｈ　ｐｈａｓｅ）になるまＣ発育期（ｇｒｏｗｔ
ｈ　ｐｈａｓｅ）の水素供与体を実質的に除去して、選
択した細菌株からバイオマスを生成し、ｂ）　１．３−
プロパンジオールを増加生成させるために、ざらにグリ
セロール及びバイオマスに適合した水素供与体を相当づ
°る静置細胞懸濁液に添加することにより解決された。

このように本発明の最もル要な点はまず工程ａ）におい
て定常発育期又は細胞懸濁液が得られるまでバイオマス
が生成されることである。本発明の範囲において有用な
ｌｌｌ１菌株の殆どは前記工程ａ）において水素供へ体
を実質的に除去することが必要である。このことは、シ
トロバクタ−・フリ１ンジイ、クレブシェラ・ニュー王
ニアＪ１り［１ストリジウム・オーｌ−ブチリカム及び
クロストリジウム・ブブリカムに特に適用される。しか
し発育期に水素供与体の存在下増殖する、そしであるい
は水素供与体を必要とさえする、例えば、ラクトバチル
ス・プレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｒＯＶ
ｉｓ）及びラクトバチルス・ブフネリのような数種のＩ
Ｉｌ菌株が存在する。しかし本発明方法に用いられ得る
細菌株の殆どの増殖は水素供与体の存在により妨害され
るのでそのような場合は水素供与体を実質的に除くべき
である。このことは又、グリセロール含有出発物質の質
的評価に関しても注意すべきことである。このように、
グリセロール出発物質がすでにかなりの、グルコースの
ような糖フラクションを含有していたならこのフラクシ
ョンは工程ａ）を妨害する原因となり得る。グリセロー
ル出発物質に関してはこの他には本発明方法における重
要な制限はない。このようにグリセ〔１−ル出発物質は
高圧分解からのグリセロール分解水、石けん分解からの
グリセ［１−ル水又は例えば魚油、二ｌコヤシ油又はパ
ーム核油からの油脂のメタノール分解からのグリセロー
ル水であり得る。

上記の説明は適した細菌株の選択にも該当する。

シトロバクター・フリ：Ｌンジイのようなシトロバタ一
種の代表的細菌が特に右利に用いられる。細菌株ＤＳ８
３００３９．３００４０及び３００４１は特に適してい
る。

工程ａ）において下記の工程を用いるのが望ましいニジ
トロバクター・フリｌンジイ０３８３００４Ｇに関する
記載は相当する注意を除いて他のｌｏ菌にも適用される
。、無機溶液を当業者に公知の方法で：ｌ製する。特別
な特徴として特に高濃度の塩化コバルト（２５０乃至５
５０μ９のＣ０ＣＩｚ　９／Ｊ　）のようなコバルト塩
、及び増殖制限窒素源として特に硫酸アンモニウムのよ
うなアンモニウム塩を含有する。

所望のバイオマス濃度により硫酸アンモニウム濃度は約
０．４乃至１．５ｇ／ｊとなり得る。グリセロール（例
えば約０．３モル／Ｊ）添加及び０３８３００４０株の
前培養の後にインキュベーションを約３７℃で嫌気条件
下で行なう。約１２乃至２０時間（０，３’［ル／Ｊで
）後、増殖培養は１程ｂ）に必要な定常期に入る。

工程ａ）におけるグリセロールの濃度は臨界的ではない
。グリセ１コール濃度は広範囲−例えば０、００１乃至
１モル／Ｊ、この範囲を超えることも可能であるが−で
あり得る。約０．１乃至０．４モル／Ｊが好ましく、特
には約０．３モル／Ｊである。

■程ａ）を嫌気的又は好気的のいずれで行なうかは臨界
的でない。グリセロールの１．３−プロパンジオールへ
の望ましい変換が最適の形態で行なわれるように嫌気的
に行なうのが好ましい。工程ａ）により所望のバイオマ
ス過を生成させたとき、増殖を終らせるために処置を講
じる。これは、好ましくは、増殖の終りをリン酸塩又は
窒素源を一定量添加することにより調節することで行な
う。硫酸アンモニウムのようなアンモニウム塩は特に有
効であることが認められた。

本発明方法は、複合培地中及び無機培地中の両方で行な
われる。無機培地の方が安く、扱い易く、本発明方法の
終りに廃棄し易いので好ましい。無機培地は無機塩及び
付加的にグリセロール、場合によっては還元剤としてシ
スティンを含有するのみの培地を意味する。複合培地は
酵母エキスを好ましくは約１％量含有することにより区
別される。

工程ａ）で得られたバイオマスは直接、工程ｂ）に供給
され得る。遠心分離によりバイオマスを濃縮するか又は
バイオマスを固定することは有利である。固定は例えば
アルギン酸カルシウム、カラギーナン又はポリウレタン
のような種々の方法で行なわれる。固定は、容易に入手
可能な市販のアルギン酸カルシウム［ブロタナル（Ｐｒ
ｏｔａｎａｌ）　−ＬＦ　−２０／６０１で行なうのが
好ましい。バイオマスの固定形、を、例えば、処理され
るグリセロール溶液を連続的に供給するカラムに充填し
得る。これにより３！Ｊ！続的方法の実施が特に有利に
なり、バイオマスは何週間も使用でき、グリセロールか
ら１．３−プロパンジオールを得るのに有効性を減じな
い。４２日より長い間、バイオマスが活君で効力が失わ
れないということが試験により確認すれた。

工程ｂ）では、微生物を発育させるのにグリセ［１−ル
は必須ではなく、その代わりにグリセロール／水素供与
体の組み合わせを用いるべきである。

水素供与体の選択に関して＠要な制限はない。当業者は
、彼の知識及び選択した細菌株に基づいて水素供与体を
選択する。一般に水素供与体は、単糖類及び二糖類、特
にフルクトース及びグルコースにより構成され得る。グ
ルコースは、細菌株としてのシトロバクタ−・フリュン
ジイと組み合わせることにおいて特に有利であることが
わかった。

工程ｂ）において時期早尚の阻害を受けないために、ｐ
Ｈ値の調節が必要である。ｐＨ値は約５．５乃至８．５
の範囲であるべきである。約６．５乃至７．５、特に約
７が好ましい。このｐＨ値は、グリセロールから１．３
−プロパンジオールの生成に最適な生物学的変換条件を
もたらす。

水素供与体及びグリセロールの量的適合は本発明方法を
さらに最適にする。この厳密な数値は水素供給体の性質
及び選択した細菌株の＋Ａｖ１による。

−量的なガイドラインは与えられない。細菌株シ形態の
水素供給体を好ましく用いる場合は、グルコース及びグ
リセロールの好ましい・てル比は約１ニア乃至１：８で
ある。グルコース及びグリセ０−ルのモル比は一般に約
１＝１乃至１：２５、特に１：５乃至１：１０であるの
が実際的に有利である。

工程ｂ）も又、好ましくは無機培地で行なわれる。

本発明方法を最適に行なうために、工程ｂ）の培地中の
グリセロール濃度が一定の役割を果たす。過剰のグリセ
【１−ル濃度は関与する酵素系を阻害する。不適当なグ
リセロール濃度は望ましくない高価な処理コストをもた
らす。約０．２乃至１．５モルのグリセロール溶液、特
に約１：Ｅルのグリセ１」−ル溶液が工程ｂ）で扱われ
る培地に最適である。

本発明はさらに、その本質を変えずにそれ自体公知の変
形を行なうことができる。以下に例示する。

工程ａ）：　　各成分のＳ度に関しての無機培地の変形
：グリセロールの濃度、それにより供給源による不純物
が性質及び濃度に関して広く異なり得る；撹拌による培
地の混合、吸入排出又は発泡の通しでの性質；還元剤及
び不活性ガスによる嫌気条件の具備。

工程ｂ）：　　バイオマスの濃度；操作ｐＨ及び温度；
再供給するグリセ１゛１−ルの性質；水素供給体の性質
及び濃度。

本発明方法は、従来の公知の方法と比較して多くの利点
を有する。２工程方法、すなわち、定常期への移行を有
する、第１の工程中の発育期及び次の生物学的変換則の
実施の結果、１，３−プロパンジオールの収率が９０％
より多く増加し得る。第１の工程で生成するバイオマス
を固定化し、カラムに導入すると、このことが長期の連
続的実施、例えば４０日より長い実施を可能にする。グ
リセロールは特に１．３−プロパンジオールに変換され
、副生物は問題にならない少量生成する。ある場合には
副生物は酢酸塩及び乳酸塩であり、それらは容易に除去
でき、環境に１害なものではない。■程ａ）において安
い栄養培地を用いることも可能である。

両工程で用いる培地において比較的高濃度のグリセ０−
ルが選ばれ得る。出発物質のグリセロールの特別な純度
を守る必要はない。事実、微生物を妨害する副生物を含
有しなければ工業グリセロールを用いてもよい（工業グ
リセ［１−ルは、粗グリセロール）。工業グリセロール
が工程ａ）には適さない場合があるが、その場合、より
純粋なグリセロール出発物質を用いなければならないが
、第２の工程では純度のより低いグリセロールが使用で
きる。定常期の形成及び第２の工程に必要なバイオマス
の生成には、第２の工程の場合より比較的少ないグリセ
ロールしか必要でないので、このことは重要な利点であ
る。このことは本方法のより順応性のある実施を可能に
する。

本発明を実施例により、より詳細に説明する１鳳１工程順序ａ）の進行を第１図に示す。シトロバクタ−・
フリュンジイをアンモニウムを制限して下記の無機培地
中で増殖させる：にＨ２ＰＯ４，６９／Ｊ：　　に２Ｈｐｏ４　・３■、
０．１４ｇ／Ｊ　：　（ＨＩ３　）　２ｓＯ４，０，４
９／Ｊ　：　　ＨＱＳＯ□・７１１＊Ｏ１０，２ｇ／ｊ
　：ＣａＣｌ２．０．１ｇ／ｊ　；システィン・１１Ｃ
１，０，１ｇ／ｊ微量元素溶液［１４溶液は５ｇＥＤＴ
Ａ　にナトリウム塩）　］　　０，３０１１３　ＢＯ４
・４Ｈ１０，０，０３ＱＨｎＣ１ｚ　Φ４ｔｌ＊Ｏ１０
，０２（ｌｃＯｃｆｚ　＠　ａｌｌ！ｏ、　２ｇＦｅ３
Ｏ４・７ｔｌｓＯ１ｏ、１ｇ　１ｎｓＯ＜　番７Ｈ２０
，０，０３ＱＮａＨＯＯｔφ２１１ｔＯ、０，０２ＯＮ
ｉＣｊ　２　・６ｔｌｔＯ及び０．０１ｇＣＵＣｊ２２
■２０を含有する。）　［アーカイプス・オプ・マイク
ロバイオ［１ジー（１９６６年）第５５巻第２４５乃至
２５６頁参照］、１７　／　Ｊ　；　ＣｏＣｆ　２．５
５０μ９／Ｊ１グリセ【コール８８０ミリモル／Ｊ０接
種（２０ａｄ！前培養／１．２主培？！Ｒ）後、３７℃
でインキコベーションを行ない、１１１１値を７．５に
一定に保った。２０時間後、培養は定常期に移行し、そ
こでグリセロールはさらに反応がおこり、１．３−プロ
パンジオールになる。

工程ｂ）のシフ［１バクター・フリュンジイの細胞懸濁
液により、水素供給体としてグルコースの存在下、グリ
セロールの１．３−プロパンジオールへの反応を第２１
ｉ２１に示す。この場合、細胞を３ｊｌ！Ｊ乾燥重量／
ｌｄの濃度でｐＨ７，５のリン酸カリウム緩衝液中に懸
濁した。グリセロール２４０ミリモル／Ｊ及びグルコー
ス４２ミリモル／Ｊを添加後、酸素の不存在下（窒素雰
囲気下）、３７℃でインキュベーションを行なった。２
規定の水酸化カリウムでの滴定によりｐｌｌｆｌを７．
５に保った。２１１ミリｔルのグリセロールから　１９
１ミリｔルの１，３−プロパンジオールが生成され、す
なわちモル基準で９１％、重量基準で７５％（最大可能
値８３％）の収率であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は２度の増加濃度のＣｏｈの存在−トでの、アン
モニウムを制限した静置培養におけるグリセロールから
ＴＨＧ生成の経過を示す（０，０４％硫酸アンモニウム
、８８０ミリモルのグリセロール及び５５（ＩＩＩＦの
Ｃｏ’／Ｊを有する無機培地におりる１、２Ｊ培養でｐ
Ｈを７．５に一定に保ち、ＴＨＧの生成及び増殖がおこ
った）。（マ）は生成したＴＨＧであり、（ロ）は生成した酢酸
塩、（ム）は生成したエタノール、（−）は生成した乳
酸塩、（）は生成したピルビン酸であり、（ＩＩ）は吸
光度を（Δ）はグリセロールを示す。第２１２１はにＯＨ滴定によりＥ）Ｉｌｌを一定に保ち
ながら、細ｌＩｉ懸濁液ぐのＴ）ＩＧの生成経過を示す
［４２ミリモルのグリコースの存在下でのグリセ［ｌ−
ルからのＴＨＧの生成の後にｐＨ７，５でにＰｏｔ緩衝
液中の細胞希懸濁液（３１１！ｉＦ／ａｅ）テ行ない、
１）ＩＩ値ハ２規定（７）に０１１での滴定により−・
定に保った１゜（ム）はグリセロール、（・）はＴＨＧ
を示す。第３図は異なった一定のｐＨ値での静置培養によりグリ
セロールからのＴＨＧ生成の比較を示す。［試験は４ｒｄｌｌｌＷ１ｆａ濁液（蛋白’ａｍ度：　
　１．８Ｒ１／ｄｌＦ一定（７）ｐＨ値６．６（Ａ）、
７．０（Ｂ）、７．９（Ｃ）及び８．０（ロ）で行なっ
た。ｐＨ値は０．６規定のＮａ０１１での滴定により一
定に保った。用いた緩衝液は２４８ミリモルのにＰＯ４
（＾乃至Ｃ）及び１００ミリ１ルのトリス／　ＩＩ（Ｊ
（０）であった。］（ム）はグリセロール、（・）は丁
ＨＧ、（−）は酢酸塩、（マ）はエタノールを示す。第４図はグル、コースの不存在下（＾）又は存在下（Ｂ
）における、静置細胞培養でのグリセロールからのＴＨ
Ｇ生成の比較を示す［ＫＰＯａｌｌｌｊ液中の細胞懸濁
液（蛋白質濃度：　　２．４ＩＩ１ｇ／ｄ）によりグリ
セロールからのＴＨＧの生成の経過は一定のｐ）１値７
．５で行なわれ、混合物Ｂは８４ミリモルのグルコース
を含有する］。（ム）はグリセロール、（・）はＴＨＧ
、（ロ）はグルコースを示す。＃＋＋＊−ｎ−ｎ−１ｒｎＭ１．　ＴＭ５１ｒｎＭ１０
スＬ先＆５７８手続補正書平成２年７月１３日１　事件の表示平成１年特許願第３２１２４６号２　発明の名称グリセロールから１．３生成する方法プロパンジオールを微生物学的に３　補正をする者事件との関係　　特許出願人名称ユニリーバ−ｅナームローゼ・ベンノートシャープ
４代理人住　所　　東京都千代田区永田町１丁目１１番２８号相
互永田町ビルディング８階１　特許請求の範囲を以下の通り訂正する。「（Ｉ）水素供与体の形の補益質（ｃｏｓｕｂＮｒ［ｅ
）の添加及び生成したプロパンジオールの分離を伴う、
適した細菌株の増殖培地中でグリセロールから１．３−
プロパンジオールを微生物学的に生成する方法において
、１）バイオマスを、選択した細°菌株°の発育期（ｇｒ
ｏｗｔｈ　ｐｈａｓｅ）から生成し、グリセロールを供
給し、もし必要なら、定常発育期（ｓｌｉｔｉｏｎｘｒ
７　ｇｒｏｗｔｈ　ｐｂｇｓｅ）になるまで水素供与体
を実質的に除去しｂ）　さらに、グリセロール及び、バイオマスに適合す
る水素供与体を、生成した静置細胞懸濁液に添加し、１
．３−プロパンジオールの増加生成を伴うことを特徴とする方法。（２）糖を工程ｂ）における水素供与体として添加する
ことを特徴とする請求項（１）に記載の方法。（３）シクロバクタ一種　（ＣＮｔｏｂａｃｊｅｒ　ｓ
ｐｅｃｉｅｓ）からの細菌株を用いることを特徴とする
請求項（１）又は請求項（２）に記載の方法。（４）シクロバクタ一種の細菌としてシクロバクター・
フリュンジイ（Ｃ目＋ｏｂａｃｊｅｒ　（ｔｅｉｎｄｉ
ｉ）を用いることを特徴とする請求項（３）に記載の方
法。（５）工程ａ）において、嫌気的作業が行われることを
特徴とする請求項（１）乃至皿のいずれか１請求項に記
載の方法。（６）工程ｂ）において、嫌気的作業が行なわれること
を特徴とする請求項具し乃至皿のいずれか１請求項に記
載の方法。（７）工程ｌ）及びｂ）において約６．５乃至８．５の
ｐ）Ｉ値を維持することを特徴とする請求項（１）乃至
（６）のいずれか１請求項に記載の方法。（８）無機培地中で行なうことを特徴とする請求項（１
）乃至（７）のいずれか１請求項に記載の方法。（９）所定量のリン酸塩及び窒素源の添加により増殖の
終りを調節する、請求項（１）乃至（８）のいずれか１
請求項に記載の方法。（１０）窒素源としてアンモニウム塩を、又はリン酸塩
源としてリン酸二水素カリウムを用いることを特徴とす
る請求項（９）に記載の方法。（１１）工程ｂ）においてグリセロールが最初に約０．
２乃至１．５モル濃度存在することを特徴とする請求項
（１）乃至（１０）のいずれか１請求項に記載の方法。（１２）工程りにおいてグリセロールが最初に約０．１
乃至０．４モル濃度存在することを特徴とする請求項（
１）乃至（１１）のいずれか１請求項に記載の方法。（ｉ３）工程ｌ）において得られるバイオマスは固定さ
れており、工程ｂ）の培地を前記バイオマス上に供給す
ることを特徴とする請求項（１）乃至（１２）のいずれ
か１請求項に記載の方法。（１４）固定化をアルギン酸カルシウムを用いて行なう
ことを特徴とする請求項（１３）に記載の方法。」２　明細書、第４頁第１０行乃至１１行「グリセロール
」を「グリセロール」に訂正する。３　同、第７頁第２行「種として」を「主として」に訂
正する。４　同、同頁第１７行「酵素」を「酸素」に訂正する。５　同、第８頁第３行「酢酸塩　１．６％」を「酢酸塩
　６．６％」に訂正する。６　同、第１１頁第１１行乃至１２行「シクロバタ一種
」を「シクロバクタ一種」に訂正する。７　同、第１８頁第９行乃至ＩＯ行ｒ０．１ｇ／・ｌ微
量元素溶液［ＩＩｌ溶液は５ｇＥＤＴＡにナトリウム塩
）をｒｏ、１　ｇｅｌ　；微量元素溶液［１１溶液は５
ｇＥＤＴ＾にナトリウム塩）］、」に訂正する。８　同、第２０頁第５行「ピルビン酸」を「ピルビン酸
塩」に訂正する。９　同、同頁第１０行「グリコース」を「グルコースに
訂正する。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）水素供与体の形の補基質（ｃｏｓｕｂｓｔｒａｔ
ｅ）の添加及び生成したプロパンジオールの分離を伴う
、適した細菌株の増殖培地中でグリセロールから１，３
−プロパンジオールを微生物学的に生成する方法におい
て、ａ）バイオマスを、選択した細菌株の発育期（ｇｒｏｗ
ｔｈｐｈａｓｅ）から生成し、グリセロールを供給し、
もし必要なら、定常発育期（ｓｔａｔｉｏｎａ−ｒｙｇ
ｒｏｗｔｈｐｈａｓｅ）になるまで水素供与体を実質的
に除去しｂ）さらに、グリセロール及び、バイオマスに適合する
水素供与体を、生成した静置細胞懸濁液に添加し、１，
３−プロパンジオールの増加生成を伴うことを特徴とする方法。
（２）糖を工程ｂ）における水素供与体として添加する
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
（３）シトロバクター種（￥Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ￥
ｓｐｅｃｉｅｓ）からの細菌株を用いることを特徴とす
る、請求項１又は請求項２に記載の方法。
（４）シトロバクター種の細菌としてシトロバクー・フ
リュンジイ（￥Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒｆｒｅｕｎｄｉ
ｉ￥）を用いることを特徴とする請求項３に記載の方法
。
（５）工程ａ）において、嫌気的作業が行なわれること
を特徴とする、請求項１乃至４のいずれか１請求項に記
載の方法。
（６）工程ｂ）において、嫌気的作業が行なわれること
を特徴とする、請求項１乃至５のいずれか１請求項に記
載の方法。
（７）工程ａ）及びｂ）において約６．５乃至８．５の
ｐＨ値を維持することを特徴とする、請求項１乃至６の
いずれか１請求項に記載の方法。
（８）無機培地中で行なうことを特徴とする、請求項１
乃至７のいずれか１請求項に記載の方法。
（９）所定量のリン酸塩及び窒素源の添加により増殖の
終りを調節する、請求項１乃至８のいずれか１請求項に
記載の方法。
（１０）窒素源としてアンモニウム塩を、又はリン酸塩
源としてリン酸二水素カリウムを用いることを特徴とす
る請求項９に記載の方法。
（１１）工程ｂ）においてグリセロールが最初に約０．
２乃至１．５モル濃度存在することを特徴とする、請求
項１乃至１０のいずれか１請求項に記載の方法。
（１２）工程ａ）においてグリセロールが最初に約０．
１乃至０．４モル濃度存在することを特徴とする、請求
項１乃至１１のいずれか１請求項に記載の方法。
（１３）工程ａ）において得られるバイオマスは固定さ
れており、工程ｂ）の培地を前記バイオマス上に供給す
ることを特徴とする、請求項１乃至１２のいずれか１請
求項に記載の方法。
（１４）固定化をアルギン酸カルシウムを用いて行なう
ことを特徴とする請求項１３に記載の方法。