CN105441374A - 生产1,4-丁二醇、4-羟基丁醛、4-羟基丁酰-coa、腐胺和相关化合物的微生物及其相关方法 - Google Patents

生产1,4-丁二醇、4-羟基丁醛、4-羟基丁酰-coa、腐胺和相关化合物的微生物及其相关方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供包括1,4-丁二醇(BDO)、4-羟基丁酰-CoA、4-羟基丁醛或者腐胺途径的非天然存在的微生物，该途径包括编码以足以生产BDO的量表达的BDO、4-羟基丁酰-CoA、4-羟基丁醛或者腐胺途径酶的至少一种外源性核酸，该微生物可以被进一步地优化用于表达BDO。本发明还提供利用这类微生物以生产BDO、4-羟基丁酰-CoA、4-羟基丁醛或者腐胺的方法。

Description

生产1,4-丁二醇、4-羟基丁醛、4-羟基丁酰-COA、腐胺和相关化合物的微生物及其相关方法
本申请是申请日为2010年10月13日、申请号为201080056425.4、名称为“生产1,4-丁二醇、4-羟基丁醛、4-羟基丁酰-COA、腐胺和相关化合物的微生物及其相关方法”的发明申请的分案。
本申请要求2009年10月13日提交的申请号为61/251,287的美国临时申请的优先权，所述美国临时申请的全部内容以引用方式并入本文。
发明背景
本发明一般地涉及生物的硅内(insilico)设计和生物工程，更具体地涉及具有1,4-丁二醇、4-羟基丁酰-CoA、4-羟基丁醛或腐胺生物合成能力的生物。
化合物4-羟基丁酸(4-羟基丁酸酯、4-羟基丁酸盐、4-HB)是一种具有作为各种商品和专用化学品的构成材料的工业潜力的4碳羧酸。特别是，4-HB有可能成为通向1,4-丁二醇家族化学品(其包括溶剂、树脂、聚合物前体以及专用化学品)的新入口点。1,4-丁二醇(BDO)是一种聚合物中间体和工业溶剂，全球销量约为30亿lb/年。目前，BDO产自石化前体，主要是乙炔、马来酸酐以及氧化丙烯。
例如，在Reppe合成反应中，乙炔与甲醛的2个分子反应(Kroschwitz和Grant,EncyclopediaofChem.Tech.,JohnWiley以及Sons,Inc.,NewYork(1999))，接着是催化氢化作用以形成1,4-丁二醇。已做过估算，美国生产的90％乙炔消耗用于丁二醇生产。可替换地，丁二醇可以通过衍生自丁烷的马来酸酐的酯化作用以及催化氢化作用形成。在下游环节，丁二醇可以被进一步地转换；例如，通过氧化作用转换为γ-丁内酯，其可以被进一步地转化为吡咯烷酮以及N-甲基-吡咯烷酮，或者通过氢解作用转换为四氢呋喃。这些化合物具有多种用途：用作聚合物中间体、溶剂和添加剂，其合起来的销售量接近20亿lb/年。
需要开发一种通过替代手段生产这些化学品的方法，所述替代手段不仅用再生性能源取代以石油为基础的原料，而且采用更少的能源和资本密集型工艺。能源部已经提出将1,4-二酸，尤其是琥珀酸，作为用于制造丁二醇家族产品的关键的以生物手段生产的中间体(DOEReport,“TopValue-AddedChemicalsfromBiomass”,2004)。然而，琥珀酸的分离和纯化成本较高并且催化还原为丁二醇需要高温和高压。
因此，需要用于有效地生产工业规模的1,4-丁二醇及其化学前体的替代性手段。本发明满足了这种需要并且还具有相关的优势。
发明概述
本发明提供包含1,4-丁二醇(BDO)、4-羟基丁醛(4-HBal)、4-羟基丁酰-CoA(4-HBCoA)和/或腐胺途径的非天然存在的微生物，该途径包含编码以足以生产BDO、4-HBal、4-HBCoA和/或腐胺的量表达的BDO、4-HBal和/或腐胺途径酶的至少一种外源性核酸。该微生物可以被进一步地优化用于表达BDO、4-HBal、4-HBCoA和/或腐胺。此外，本发明提供利用这类微生物生产BDO、4-HBal、4-HBCoA和/或腐胺的方法。
附图说明
图1是显示至4-羟基丁酸(4-hydroxybutyurate)(4-HB)以及至1,4-丁二醇生产的生化途径的示意图。前5个步骤对大肠杆菌来说是内源性，而剩下的步骤可以异源性地表达。催化生物合成反应的酶是：(1)琥珀酰-CoA合成酶；(2)非依赖CoA的琥珀半醛脱氢酶；(3)α-酮戊二酸脱氢酶；(4)谷氨酸：琥珀酸半醛转氨酶；(5)谷氨酸脱羧酶；(6)依赖CoA的琥珀半醛脱氢酶；(7)4-羟基丁酸酯脱氢酶；(8)α-酮戊二酸脱羧酶；(9)4-羟基丁酰CoA：乙酰基-CoA转移酶；(10)丁酸激酶；(11)磷酸丁酰转移酶；(12)醛脱氢酶；(13)醇脱氢酶。
图2是显示大肠杆菌中高丝氨酸生物合成的示意图。
图3显示利用包含表达4-HB途径基因各种组合的质粒的大肠杆菌菌株在葡萄糖基本培养基中生产4-HB。(a)培养肉汤中的4-HB浓度；(b)培养肉汤中的琥珀酸浓度；(c)在600nm波长处测得的培养物光密度。簇状条形表示24小时、48小时以及72小时(若有测量)时间点。沿x轴的编码表示所用的菌株/质粒组合。第一个数符指宿主菌株:1,MG1655lacIQ；2,MG1655ΔgabDlacIQ；3,MG1655ΔgabDΔaldAlacIQ。第二个数符指所用的质粒组合：1,pZE13-0004-0035和pZA33-0036；2,pZE13-0004-0035和pZA33-0010n；3,pZE13-0004-0008和pZA33-0036；4,pZE13-0004-0008和pZA33-0010n；5,对照载体pZE13和pZA33。
图4显示在表达来自结核分枝杆菌的α-酮戊二酸脱羧酶的大肠杆菌菌株中从葡萄糖生产4-HB。菌株1-3包含pZE13-0032和pZA33-0036。菌株4仅表达空载体pZE13和pZA33。宿主菌株如下：1和4，MG1655lacIQ；2,MG1655ΔgabDlacIQ；3,MG1655ΔgabDΔaldAlacIQ。条形指24和48小时时的浓度。
图5显示重组大肠杆菌菌株中从10mM4-HB生产BDO。编号的位置对应采用如下的实验：包含表达来自牙龈卟啉单胞菌的cat2的pZA33-0024的MG1655lacIQ以及在pZE13上表达的如下基因：1,无(对照)；2,0002；3,0003；4,0003n；5,0011；6,0013；7,0023；8,0025；9,0008n；10,0035。基因编码在表6中予以限定。对于每个位置，条形分别指好氧的、微好氧的以及厌氧的条件。微好氧的条件通过密封而非抽空培养管来创造。
图6显示通过在补充有4g/L未标记的葡萄糖(a、c、e以及g)、均匀标记的13C-葡萄糖(b、d、f以及h)的M9基本培养基中培养的MG1655lacIQpZE13-0004-0035-0002pZA33-0034-0036生产的4-HB和BDO的质谱。(a)和(b)，衍生得到的BDO的包含2个碳原子的质量116特征片段；(c)和(d)，衍生得到的BDO的包含1个碳原子的质量177特征片段；(e)和(f)，衍生得到的4-HB的包含2个碳原子的质量117特征片段；(g)和(h)，衍生得到的4-HB的包含4个碳原子的质量233特征片段。
图7是用于生产γ-丁内酯的生物工艺的工艺流程示意图。小图(a)显示采用分批分离的补料分批发酵以及小图(b)显示采用连续分离的补料分批发酵。
图8A和8B显示多条示例性的1,4-丁二醇(BDO)途径。图8A显示多条从琥珀酰-CoA到BDO的途径。图8B显示多条从α-酮戊二酸到BDO的途径。
图9A-9C显示多条示例性的BDO途径。图9A和9B显示多条始于4-氨基丁酸的途径。图9C显示一条从乙酰乙酰基-CoA至4-氨基丁酸的途径。
图10显示多条示例性的从α-酮戊二酸到BDO的途径。
图11显示多条示例性的从谷氨酸到BDO的途径。
图12显示多条示例性的从乙酰乙酰基-CoA到BDO的途径。
图13显示多条示例性的从高丝氨酸到BDO的途径。
图14显示大肠杆菌琥珀酰-CoA合成酶的核苷酸和氨基酸序列。图14A显示大肠杆菌sucCD操纵子的核苷酸序列(SEQIDNO:)。图14B(SEQIDNO:)和14C(SEQIDNO:)显示由该sucCD操纵子编码的琥珀酰-CoA合成酶亚基的氨基酸序列。
图15显示牛型分支杆菌α-酮戊二酸脱羧酶的核苷酸和氨基酸序列。图15A显示牛型分支杆菌sucA基因的核苷酸序列(SEQIDNO:)。图15B显示牛型分支杆菌α-酮戊二酸脱羧酶的氨基酸序列(SEQIDNO:)。
图16显示在大肠杆菌中于厌氧(微好氧的)条件下经由α-酮戊二酸在基本培养基中从葡萄糖生物合成4-羟基丁酸盐(4-hydroxybutyrate)。宿主菌株是ECKh-401。基于质粒pZA33上存在的上游途径基因标记实验如下：1)4hbd-sucA；2)sucCD-sucD-4hbd；3)sucCD-sucD-4hbd-sucA。
图17显示在大肠杆菌中经由琥珀酸和α-酮戊二酸在基本培养基中从葡萄糖生物合成4-羟基丁酸盐。宿主菌株是野生型MG1655。基于质粒pZE13和pZA33上存在的基因标记实验如下：1)空对照载体2)空pZE13、pZA33-4hbd；3)pZE13-sucA、pZA33-4hbd。
图18A显示来自牙龈红棕色单胞菌(Porphymonasgingivalis)的依赖CoA的琥珀酸半醛脱氢酶(sucD)的核苷酸序列(SEQIDNO:)，以及图18B显示编码的氨基酸序列(SEQIDNO:)。
图19A显示来自牙龈红棕色单胞菌的4-羟基丁酸脱氢酶(4hbd)的核苷酸序列(SEQIDNO:)，以及图19B显示编码的氨基酸序列(SEQIDNO:)。
图20A显示来自牙龈红棕色单胞菌的4-羟基丁酸CoA转移酶(cat2)的核苷酸序列(SEQIDNO:)，以及图20B显示编码的氨基酸序列(SEQIDNO:)。
图21A显示来自丙酮丁醇梭菌的磷酸丁酰转移酶(ptb)的核苷酸序列(SEQIDNO:)，以及图21B显示编码的氨基酸序列(SEQIDNO:)。
图22A显示来自丙酮丁醇梭菌的丁酸激酶(buk1)的核苷酸序列(SEQIDNO:)，以及图22B显示编码的氨基酸序列(SEQIDNO:)。
图23显示相对于丙酮丁醇梭菌的原生序列，丙酮丁醇梭菌020(磷酸反丁酰转移酶(phosphtransbutyrylase))的具有改变为更普遍的大肠杆菌密码子的密码子的可选核苷酸序列。图23A-23D(分别是020A-020D的SEQIDNO:)包含的序列中稀有大肠杆菌密码子被更普遍的密码子替换的数量在增加(A<B<C<D)。
图24显示相对于丙酮丁醇梭菌原生序列，丙酮丁醇梭菌021(丁酸激酶)的具有改变为更普遍的大肠杆菌密码子的密码子的可选核苷酸序列。图24A-24D(分别是021A-021B的SEQIDNO:)包含的序列中稀有大肠杆菌密码子被更普遍的密码子替换的数量在增加(A<B<C<D)。
图25显示具有用于在大肠杆菌中表达的优化密码子的丁酸激酶(BK)和磷酸丁酰转移酶(PTB)的改善表达。图25A显示十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)用考马斯蓝染色蛋白质；泳道1，无插入物的对照载体；泳道2，大肠杆菌中丙酮丁醇梭菌原生序列的表达；泳道3，020B-021B密码子优化的PTB-BK的表达；泳道4，020C-021C密码子优化的PTB-BK的表达。BK和PTB的位置被示出。图25B显示与密码子优化的020B-021B(2021B)和020C-021C(2021C)相比，原生丙酮丁醇梭菌序列(2021n)的BK和PTB活性。
图26显示在各种表达产BDO的酶的菌株中BDO和γ-丁酰内酯(GBL)的生产：Cat2(034)；2021n；2021B；2021C。
图27A显示原生拜氏梭菌(Clostridiumbiejerinckii)ald基因(025n)的核苷酸序列(SEQIDNO:)，以及图27B显示编码的氨基酸序列(SEQIDNO:)。
图28A-28D显示拜氏梭菌ald基因(分别是025A-025D的SEQIDNOS:)的可选基因序列，其中稀有密码子被更普遍密码子替换的数量在增加(A<B<C<D)。
图29显示原生拜氏梭菌ald基因和密码子优化的变体的表达；无插入物(无插入物的对照)、025n、025A、025B、025C、025D。
图30显示各种菌株中BDO或者BDO和乙醇的生产。图30显示在包含原生拜氏梭菌ald基因(025n)或者包含具有用于在大肠杆菌中表达的优化密码子的变体(025A-025D)的菌株中的BDO生产。图30B显示相比于密码子优化的变体025B，在表达丙酮丁醇梭菌AdhE2酶(002C)的菌株中乙醇和BDO的生产。第三组显示牙龈卟啉单胞菌sucD(035)的表达。在所有的情况下，还表达了牙龈卟啉单胞菌Cat2(034)。
图31A显示来自热葡糖苷酶地芽孢杆菌的adh1基因的核苷酸序列(SEQIDNO:)，以及图31B显示编码的氨基酸序列(SEQIDNO:)。
图32A显示大肠杆菌中热葡糖苷酶地芽孢杆菌adh1基因的表达。通过SDS-PAGE分析整个细胞裂解液或者上清液以及用考马斯蓝染色无插入物的质粒、具有083(头状地霉N-苄基-3-吡咯烷醇脱氢酶)的质粒和具有084(热葡糖苷酶地芽孢杆菌adh1)插入物的质粒。图32B显示以丁醛(菱形)或者4-羟基丁醛(正方形)作为底物的084的活性。
图33显示在各种菌株中BDO的生产：无插入物的质粒；025B、025B-026n；025B-026A；025B-026B；025B-026C；025B-050；025B-052；025B-053；025B-055；025B-057；025B-058；025B-071；025B-083；025B-084；PTSlacO-025B；PTSlacO-025B-026n。
图34显示载体pRE118-V2的质粒图谱。
图35显示包含aceF和lpdA基因的ECKh-138区域的序列。下划线的是肺炎克雷伯氏杆菌lpdA基因，以及划上阴影线的是Glu354Lys突变体中改变的密码子。
图36显示原生大肠杆菌lpdA和突变体肺炎克雷伯氏杆菌lpdA的蛋白质序列对比。
图37显示在菌株AB3、MG1655ΔldhA和ECKh-138中的4-羟基丁酸盐(左侧条形)和BDO(右侧条形)生产。所有的菌株表达了在中拷贝质粒pZA33上的大肠杆菌sucCD、牙龈卟啉单胞菌sucD、牙龈卟啉单胞菌4hbd，以及在高拷贝质粒pZE13上的牙龈卟啉单胞菌Cat2、丙酮丁醇梭菌AdhE2。
图38显示融合至pflB-p6启动子和核糖体结合位点(RBS)的aceE基因的5’端的核苷酸序列。5’斜体的序列显示aroP基因的起始，其以相反的方向转录自pdh操纵子。3’斜体的序列显示aceE基因的起始。上面的情况下：pflBRBS。下划线部分：FNR结合位点。粗体部分：pflB-p6启动子序列。
图39显示菌株ECKh-456中的aceF-lpdA区域内的核苷酸序列(SEQIDNO:)。
图40显示菌株ECKh-439、ECKh-455和ECKh-456的每个的4-羟基丁酸盐、BDO和丙酮酸的生产(分别是从左到右的条形)。
图41A显示用于删除mdh基因的重组位点的简图。图41B显示两侧是来自质粒pKD3的mdh基因的FRT位点和同源区的抗氯霉素基因(CAT)扩增的PCR产品的序列。
图42显示菌株ECKh-401中删除arcA的区域的序列。
图43显示菌株ECKh-422的包含突变gltA基因的区域的序列。
图44显示野生型gltA基因产品和R163L突变体的柠檬酸合酶活性。在缺乏(菱形)或者存在(正方形)0.4mMNADH的条件下进行检测。
图45显示菌株ECKh-401和ECKh-422(两者均表达质粒上用于完整的BDO途径的基因)中4-羟基丁酸盐(左侧条形)和BDO(右侧条形)的生产。
图46显示来自代谢标记实验的中心代谢通量和关联的95％置信区间。数值是归一化为1mmol/hr葡萄糖摄入率的摩尔通量。结果表明碳通量按照氧化方向的途径穿过柠檬酸合酶以及大部分碳进入BDO途径而非完成TCA循环。
图47显示菌株ECKh-138和ECKh-422(两者均表达质粒上的完整BDO途径)的细胞外产品形成。测得的产品是乙酸(Ace)、丙酮酸(Pyr)、4-羟基丁酸盐(4HB)、1,4-丁二醇(BDO)、乙醇(EtOH)以及其他产品，其包括γ-丁内酯(GBL)、琥珀酸以及乳酸。
图48显示由流感嗜血杆菌磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶(pepck)替换PEP羧化酶(ppc)之后区域的序列。下划线是pepck编码区域。
图49显示包含50mMNaHCO3的基本培养基中培养的进化的pepCK菌株的生长情况。
图50显示表达质粒pZS*13上牙龈卟啉单胞菌Cat2和拜氏梭菌Ald的株ECKh-453内的产品形成。测得的产品是1,4-丁二醇(BDO)、丙酮酸、4-羟基丁酸盐(4HB)、乙酸、γ-丁内酯(GBL)和乙醇。
图51显示两种菌株ECKh-453和ECKh-432的BDO生产。两者均包含表达牙龈卟啉单胞菌Cat2和拜氏梭菌Ald的质粒pZS*13。在微好氧的条件下培养了培养物，用27或者18计量注射针对器皿穿孔，如所示。
图52显示插入包含启动子、sucCD基因、sucD基因、4hbd基因和终止子序列的多顺反子DNA片段的区域内菌株ECKh-426的基因组DNA的核苷酸序列。
图53显示插入包含启动子、sucA基因、克鲁佛氏梭菌4hbd基因和终止子序列的多顺反子序列的区域内菌株ECKh-432的染色体区域的核苷酸序列。
图54显示具有编码整合入染色体的基因的上游BDO途径以及包含含有下游BDO途径基因的质粒的ECKh-432菌株中基本培养基内从葡萄糖合成BDO。
图55显示包含两侧是与rrnC区域同源的区域的利用非磷酸转移酶(非PTS)蔗糖的基因的PCR产品。
图56显示rrnC操纵子中整合位点的示意图。
图57显示葡萄糖上培养的菌株ECKh-432和蔗糖上培养的菌株ECKh-463的48小时生长后的平均产品浓度(归一化为培养物光密度600)。两者均包含表达牙龈卟啉单胞菌Cat2和拜氏梭菌Ald的质粒pZS*13。数据针对每种菌株的6个拷贝培养物。测得的产品是1,4-丁二醇(BDO)、4-羟基丁酸盐(4HB)、γ-丁内酯(GBL)、丙酮酸(PYR)和乙酸(ACE)(分别是左侧到右侧的条形)。
图58显示从琥珀酰-CoA和α-酮戊二酸到1,4-丁二醇的示例性途径。缩写：A)琥珀酰-CoA还原酶(醛形成)，B)α-酮戊二酸脱羧酶，C)4-羟基丁酸脱氢酶，D)4-羟基丁酸还原酶，E)1,4-丁二醇脱氢酶。
图59A显示来自艾瓦诺卡氏菌(GNM_720)的羧酸还原酶的核苷酸序列(SEQIDNO:)，以及图59B显示编码的氨基酸序列(SEQIDNO:)。
图60A显示密码子优化的磷酸泛酰巯基乙胺转移酶的核苷酸序列(SEQIDNO:)，以及图60B显示编码的氨基酸序列。
图61显示质粒pZS*-13S-720721opt的质粒图谱。
图62A和62B显示从琥珀酸、琥珀酰-CoA以及α-酮戊二酸到1,4-丁二醇的途径。缩写：A)琥珀酰-CoA还原酶(醛形成)，B)α-酮戊二酸脱羧酶，C)4-羟基丁酸脱氢酶，D)4-羟基丁酸还原酶，E)1,4-丁二醇脱氢酶，F)琥珀酸还原酶，G)琥珀酰-CoA转移酶，H)琥珀酰-CoA水解酶，I)琥珀酰-CoA合成酶(或者琥珀酰-CoA连接酶)，J)谷氨酸脱氢酶，K)谷氨酸转氨酶，L)谷氨酸脱羧酶，M)4-氨基丁酸脱氢酶，N)4-氨基丁酸转氨酶，O)4-羟基丁酸激酶，P)磷酸转-4-羟基丁酰酶，Q)4-羟基丁酰-CoA还原酶(醛形成)，R)4-羟基丁酰-磷酸还原酶，S)琥珀酰-CoA还原酶(醇形成)，T)4-羟基丁酰-CoA转移酶，U)4-羟基丁酰-CoA水解酶，V)4-羟基丁酰-CoA合成酶(或者4-羟基丁酰-CoA连接酶)，W)4-羟基丁酰-CoA还原酶(醇形成)，X)α-酮戊二酸还原酶，Y)5-羟基-2-氧代戊酸脱氢酶，Z)5-羟基-2-氧代戊酸脱羧酶，AA)5-羟基-2-氧代戊酸脱氢酶(脱羧)。
图63显示从琥珀酸、琥珀酰-CoA以及α-酮戊二酸到腐胺的途径。缩写：A)琥珀酰-CoA还原酶(醛形成)，B)α-酮戊二酸脱羧酶，C)4-氨基丁酸还原酶，D)腐胺脱氢酶，E)腐胺转氨酶，F)琥珀酸还原酶，G)琥珀酰-CoA转移酶，H)琥珀酰-CoA水解酶，I)琥珀酰-CoA合成酶(或者琥珀酰-CoA连接酶)，J)谷氨酸脱氢酶，K)谷氨酸转氨酶，L)谷氨酸脱羧酶，M)4-氨基丁酸脱氢酶，N)4-氨基丁酸转氨酶，O)α-酮戊二酸还原酶，P)5-氨基-2-氧代戊酸脱氢酶，Q)5-氨基-2-氧代戊酸转氨酶，R)5-氨基-2-氧代戊酸脱羧酶，S)鸟氨酸脱氢酶，T)鸟氨酸转氨酶，U)鸟氨酸脱羧酶。
图64A显示来自包皮垢分支杆菌mc(2)155(称为890)的羧酸还原酶的核苷酸序列(SEQIDNO:)，以及图64B显示编码的氨基酸序列(SEQIDNO:)。
图65A显示来自鸟型分枝杆菌亚种类结核K-10(称为891)的羧酸还原酶的核苷酸序列(SEQIDNO:)，以及图65B显示编码的氨基酸序列(SEQIDNO:)。
图66A显示来自海洋分支杆菌M(称为892)的羧酸还原酶的核苷酸序列(SEQIDNO:)，以及图66B显示编码的氨基酸序列(SEQIDNO:)。
发明详述
本发明旨在设计和生产具有4-羟基丁酸(4-HB)、γ-丁内酯、1,4-丁二醇(BDO)、4-羟基丁醛(4-HBal)、4-羟基丁酰-CoA(4-HBCoA)和/或腐胺生物合成生产能力的细胞和生物。本发明具体地涉及通过引入一种或者多种的编码BDO、4-HBal、4-HBCoA和/或腐胺途径酶的核酸设计能够生产BDO、4-HBal、4-HBCoA和/或腐胺的微生物。
在一个实施方式中，本发明利用大肠杆菌新陈代谢的硅内化学计量模型确认用于生物合成生产4-羟基丁酸(4-HB)、1,4-丁二醇(BDO)、4-HBal、4-HBCoA和/或腐胺的新陈代谢设计。本文所述的结果表明新陈代谢途径可以进行设计和重组工程以实现在大肠杆菌和其他细胞或者生物中4-HBal、4-HBCoA或者4-HB和下游产品(如1,4-丁二醇或者腐胺)的生物合成。4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO和/或腐胺的，例如针对硅内设计的，生物合成生产可以通过构建具有设计的新陈代谢基因型的菌株来证实。这些经过新陈代谢工程的细胞或者生物还可以经受适应性进化，以进一步增强4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO和/或腐胺的生物合成，包括在接近理论最大增长量的条件下。
在某些实施方式中，设计菌株的4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO和/或腐胺生物合成特征使得他们具有基因稳定性以及在连续的生物工艺中极为有用。经确认，单独的菌株设计策略将不同的非原生或者异源性反应能力结合进入了大肠杆菌或者其他宿主生物，导致始自非依赖CoA的琥珀半醛脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶和依赖CoA的琥珀半醛脱氢酶，或者始自谷氨酸：琥珀半醛转氨酶的4-HB和1,4-丁二醇生产新陈代谢途径。经确认，硅内新陈代谢设计导致了经由这些新陈代谢途径中的每个在大肠杆菌和酵母菌种两者中4-HB的生物合成。可以通过在pH<7.5的条件下，尤其在酸性条件下(如pH5.5以下，例如pH<7、pH<6.5、pH<6以及尤其pH<5.5或者更低)的自发环化作用于培养中生成1,4-丁二醇中间体γ-丁内酯。
经由平台的计算组件确认的菌株可以通过导致4-HB、1,4-丁二醇或者其他中间体和/或下游产品的生物合成生产的任何预测的新陈代谢改变的基因工程来投入实际生产。在仍然进一步的实施方式中，展示这些化合物的生物合成生产的菌株可以进一步经受适应性进化以进一步增强产品生物合成。适应性进化之后产品生物合成收率的水平也可以通过系统的计算组件来预测。
在其他特定的实施方式中，微生物被构建为表达编码从琥珀酸至4-HB以及至4-HB-CoA的酶步骤的4-HB生物合成途径。相比于存在4-HB生物合成途径缺陷的宿主微生物，在宿主微生物中琥珀酸辅酶A转移酶、依赖CoA的琥珀半醛脱氢酶、NAD-依赖的4-羟基丁酸脱氢酶和4-羟基丁酸辅酶A转移酶的共表达导致了4-HB的大量生产。在进一步特定的实施方式中，生成的产4-HB的微生物通过引入编码α-酮戊二酸脱羧酶和NAD-依赖的4-羟基丁酸脱氢酶的核酸，利用α-酮戊二酸作为底物。
在另一特定的实施方式中，构建的包含1,4-丁二醇(BDO)生物合成途径的微生物当在4-HB的存在下被培养时生物合成了BDO。BDO生物合成途径由一种编码多官能醛/醇脱氢酶的核酸或者多种编码醛脱氢酶和醇脱氢酶的核酸组成。为支持4-HB底物上的生长，这些产BDO的微生物还表达了4-羟基丁酸CoA转移酶或者4-丁酸激酶连同磷酸转羟基丁酰酶。在仍然进一步特定的实施方式中，生成的微生物通过编码官能4-HB生物合成途径和官能BDO生物合成途径的核酸的外源性表达合成BDO。4-HB生物合成途径由琥珀酸辅酶A转移酶、依赖CoA的琥珀半醛脱氢酶、NAD-依赖的4-羟基丁酸脱氢酶和4-羟基丁酸辅酶A转移酶组成。BDO途径由多官能醛/醇脱氢酶组成。本文进一步所述的是用于生产BDO的其他途径(见图8-13)。
在进一步的实施方式中，本文所述的是在4-羟基丁醛、4-羟基丁酰-CoA或者1,4-丁二醇新陈代谢途径起作用的羧酸还原酶的克隆和表达。与酰基-CoA还原酶形成对照，采用羧酸还原酶形成4-羟基丁醛的优势是伴随BDO的生产乙醇和GBL副产品的形成较少。本文还披露了应用羧酸还原酶作为其他众多途径的部分以从三羧酸(TCA)循环代谢产物，例如琥珀酸、琥珀酰-CoA和/或α-酮戊二酸生产1,4-丁二醇和腐胺。
如本文所用，术语“非天然存在的”当关于本发明的微生物使用时，意指该微生物具有至少一种通常不会在相关物种的天然存在的菌株(包括相关物种的野生型菌株)中发现的基因改变(geneticalteration)。基因改变包括，例如，引入编码代谢多肽的可表达的核酸的修饰(modification)、其他核酸新增、核酸缺失和/或微生物遗传物质的其他功能中断。这些修饰包括，例如，相关物种的异源多肽、同源多肽或异源和同源多肽的编码区和功能片段。其他修饰包括，例如，其中该修饰改变基因或操纵子的表达的非编码调控区域。示例性的代谢多肽包括在4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺家族化合物的生物合成途径内的酶或蛋白质。
代谢修饰是指从其天然存在的状态发生改变的生化反应。因此，非天然存在的微生物可以具有对编码代谢多肽的核酸或其功能片段的基因修饰。本文披露了示例性的代谢修饰。
如本文所用，术语“分离”当关于微生物使用时，意指当相关微生物在自然界中被发现时，基本上不含至少一种组分的生物。该术语包括当在其自然环境中被发现时从部分或全部组分脱离的微生物。该术语还包括当其在非天然存在的环境中被发现时从部分或全部组分脱离的微生物。因此，当分离的微生物在自然界中被发现或者当其在非天然存在的环境中培育、储存或生存时，它部分或全部地从其他物质分离。分离的微生物的具体例子包括部分纯的微生物、基本上纯的微生物和在非天然存在的培养基中培养的微生物。
如本文所用，术语“微生物”意在指任何作为包含在古菌域、细菌域或真核域的显微细胞(microscopiccell)存在的生物。因此，该术语意包括原核或真核细胞或具有显微尺寸的生物并包括所有种类的细菌、古菌和真细菌以及真核微生物(如酵母和真菌)。该术语还包括任何种类的可被培养用于生产生物化学品的细胞培养物。
如本文所用，术语“4-羟基丁酸”意在指具有化学式C4H8O3和分子质量104.11g/mol(其钠盐126.09g/mol)的丁酸的4-羟基衍生物。化合物4-羟基丁酸在本领域还作为4-HB、4-羟基丁酸盐、γ-羟基丁酸或者GHB已知。如本文所用，该术语意在包括该化合物的各种任何盐形式以及包括，例如4-羟基丁酸酯和4-羟基丁酸盐。4-HB盐形式的特定实施例包括4-羟基丁酸钠和4-羟基丁酸钾。因此，术语4-羟基丁酸、4-HB、4-羟基丁酸盐、4-羟基丁酸酯、γ-羟基丁酸和GHB以及本领域认可的其他名称在本文中按同义使用。
如本文所用，术语“单体”当关于4-HB使用时意在指非聚合或者非衍生形式的4-HB。聚合4-HB的特定实施例包括聚-4-羟基丁酸以及例如，4-HB和3-HB的共聚物。衍生形式的4-HB的特定实施例是4-HB-CoA。其他聚合4-HB形式和其他衍生形式的4-HB也为本领域所知。
如本文所用，术语“γ-丁内酯”意在指具有化学式C4H6O2和分子质量86.089g/mol的内酯。化合物γ-丁内酯在本领域中也称为GBL、丁内酯、1,4-内酯、4-丁内酯、4-羟基丁酸内酯以及γ-羟基丁酸内酯。如本文所用，该术语意在包括化合物的各种任何盐形式。
如本文所用，术语“1,4-丁二醇”意在指具有化学式C4H10O2和分子质量90.12g/mol、带有两种羟基基团的烷属烃丁烷的乙醇衍生物。化合物1,4-丁二醇在本领域中也被称为BDO以及是本文称为BDO家族化合物的化合物家族的化学中间体或者前体。
如本文所用，术语“4-羟基丁醛”意在指具有化学式C4H8O2和分子质量88.10512g/mol的醛。化合物4-羟基丁醛(4-hydroxybutanal(4-HBal))在本领域中也被称为4-羟基丁醛(4-hydroxybutyraldehyde)。
如本文所用，术语“腐胺”意在指具有化学式C4H12N2和分子质量88.15148g/mol的二胺。化合物腐胺在本领域中也被称为1,4-丁烷二胺、1,4-二氨基丁烷、丁烯二胺、四亚甲基二胺、四甲基二胺以及1,4-丁烯二胺。
如本文所用，术语“四氢呋喃”意在指对应于芳香族化合物呋喃的完全氢化的类似物的杂环有机化合物，具有化学式C4H8O和分子质量72.11g/mol。化合物四氢呋喃在本领域中也被称为THF、四氢呋喃、1,4-环氧丁烷、氧化丁烯、氧化环四亚甲基、氧杂环戊烷、二氧化二乙烯、氧戊环、呋喃烷、氢呋喃、氧化四亚甲基。如本文所用，该术语意在包括化合物的各种任何盐形式。
如本文所用，术语“CoA”或者“辅酶A”意在指有机辅因子或者辅基(酶的非蛋白质部分)，它的存在为许多酶(脱辅基酶蛋白)的活性所需以形成活性酶系统。辅酶A在某些缩合酶中起作用，在乙酰基或者其他酰基基团转移以及在脂肪酸合成和氧化、丙酮酸氧化以及在其他乙酰基化中起作用。
如本文所用，术语“基本上厌氧”当关于培养或培育条件使用时意指氧量少于液体培养基内溶解的氧的饱和量的约10％。该术语还意在包括在小于约1％的氧的气氛中保持的液体或固体培养基的密封室。
本发明的该非天然存在的微生物可以包含稳定的基因改变，这指可以培养超过五代而无改变损失的微生物。一般地，稳定的基因改变包括持续超过10代的修饰，具体地，稳定的修饰将持续超过约25代，以及更具体地，稳定的基因修饰将超过50代，包括永久地。
本领域的技术人员会理解所述基因改变(包括本文示例性的代谢修饰)是关于合适的来源或者宿主生物(如大肠杆菌、酵母或者本文披露的其他生物)及其相应的代谢反应或所需的代谢途径的所需的遗传物质(如为其相应的代谢反应编码酶的基因)的合适的来源生物描述的。然而，如果有各种各样的生物的完整的基因组测序和基因组学领域的高水平技能，本领域的技术人员将能够很容易地将本文提供的启示和指导应用于基本上所有的其他生物。例如，本文示例性的大肠杆菌代谢改变可以通过纳入来自非相关物种的物种的相同或类似的编码核酸很容易地应用到其他物种。一般地，这类基因改变包括例如，物种同系物的基因改变，以及具体地，直系同源、旁系同源或非直系同源基因置换。
直系同源是通过垂直传递(verticaldescent)相关且导致不同的生物内基本上相同或相似的功能的一种或多种基因。例如，小鼠环氧化物水解酶和人环氧化物水解酶因环氧化物水解的生物功能可以被认为是直系同源。例如，当基因共有足够量的序列相似性以表明它们是同源的或者通过进化自共同的祖先相关时，所述基因通过垂直传递相关。如果基因共有足够量的三维结构但不一定共有序列相似性以表明它们进化自共同的祖先达到基本序列相似性无法识别的程度，也认为它们是直系同源。直系同源的基因可以编码具有约25％到100％氨基酸序列一致性的序列相似性的蛋白质。如果编码共有的氨基酸相似性小于25％的蛋白质的基因其三维结构也显示出相似性，则所述基因也可以被认为通过垂直传递产生。酶类的丝氨酸蛋白酶家族的成员(包括组织型纤维蛋白溶酶原激活剂和弹性蛋白酶)被认为通过垂直传递产生自共同的祖先。
直系同源包括通过例如，进化在结构或整体活性方面趋异的基因或其编码基因产物。例如，当一种物种编码显示两种功能的基因产物以及当这类功能在第二个物种内已经分为不同的基因时，这三个基因及其相应的产物被认为是直系同源。对于生化产品的生产(包括生长偶联生产)，本领域的技术人员会理解含待引入或破坏的代谢活性的直系同源的基因将被选择用于所述非天然存在的微生物的构建。显示各自活性的直系同源的例子是当两个或两个以上物种之间或一个单一物种内部不同的活性已经分为不同的基因产物的情况。具体的例子是弹性蛋白酶蛋白质水解和纤维蛋白溶酶原蛋白质水解(两种类型的丝氨酸蛋白酶活性)分离为作为纤维蛋白溶酶原激活剂和弹性蛋白酶的不同分子。第二个例子是支原体5'-3'核酸外切酶和果蝇DNA聚合酶III活性的分离。来自第一物种的DNA聚合酶可以被认为是来自第二物种的核酸外切酶和聚合酶其一或两者的直系同源，反之亦然。
相反，旁系同源是通过例如，复制然后进化趋异相关的同系物并具有相似或共同的，但不完全相同的功能。旁系同源可以源自例如，相同物种或源自不同的物种。例如，微粒体环氧化物水解酶(环氧化物水解酶I)和可溶性环氧化物水解酶(环氧化物水解酶II)可以被认为是旁系同源，因为它们代表两种不同的酶类，协同进化自共同的祖先，催化不同的反应并在相同的物种内具有不同的功能。旁系同源是来自彼此具有显著的序列相似性的相同物种的蛋白质，这表明它们是同源的或通过协同进化自共同的祖先而相关。旁系同源蛋白质家族的群体包括HipA同系物、荧光素酶基因、肽酶以及其他。
非直系同源基因置换是来自一个物种的非直系同源基因，可以替代一种不同的物种内有关基因功能。替代包括例如，能够在起源物种内执行与所述不同的物种内所述有关功能相比基本上相同或相似的功能。虽然一般地，非直系同源基因置换可看作是与编码有关功能的已知基因结构相关，不过结构相关性差但功能相似的基因及其相应的基因产物仍然会如本文所用，落入所述术语的含义之内。功能相似性要求例如，与编码试图被替代的功能的基因相比，在非直系同源基因产物的活性位点或结合区域具有至少一些结构相似性。因此，非直系同源基因包括例如，旁系同源或不相关的基因。
因此，识别和构建本发明的具有4-HB、GBL、4-HBal、4-HBCoA、BDO和/或腐胺生物合成能力的非天然存在的微生物时，本领域的技术人员会将本文提供的启示和指导应用于特定的物种并会理解代谢修饰的识别可以包括直系同源的识别和包含或灭活。如果编码催化相似或基本上相似的代谢反应的酶的旁系同源和/或非直系同源基因置换存在于参照微生物内，本领域的技术人员还可以利用这些进化上相关的基因。
直系同源、旁系同源和非直系同源基因置换可以通过本领域的技术人员熟知的方法确定。例如，对两种多肽的核酸或氨基酸序列的检验将揭示所比较的序列之间的序列一致性和相似性。基于这种相似性，本领域的技术人员可以确定相似性是否足够高以表明蛋白质是通过进化自共同的祖先而相关的。本领域的技术人员熟知的算法(如Align、BLAST、ClustalW以及其他)比较并确定原始序列相似性或一致性，以及还确定序列内空隙的存在或大小，其可以被赋予权数或得分。这类算法在本领域也已知并同样适用于确定核苷酸序列的相似性或一致性。足够的相似性以确定相关性的参数的计算基于熟知的用于计算统计相似性的方法或在随机多肽中发现相似匹配的几率以及确定的所述匹配的程度。如果需要，两个或两个以上序列的计算机对比还可以由本领域的技术人员进行可视优化。相关的基因产物或蛋白质应该具有高度的相似性，例如，25％到100％的序列一致性。不相关的蛋白质可以具有一致性，所述一致性基本上与预计将发生的几率相同，如果扫描一个具有相当规模的数据库(约5％)。5％到24％之间的序列可代表或不代表足以得出所比较的序列具有相关性的结论的同源性。在给定数据集的大小的情况下，可以进行额外的确定这种匹配的程度的统计分析，以确定这些序列的相关性。
用于使用例如，所述BLAST算法确定两个或两个以上序列的相关性的示例性参数可以如下文描述。简言之，氨基酸序列比对可以使用BLASTP版本2.0.8(1999年1月5日)以及以下参数执行：矩阵：0BLOSUM62；空位开放：11；空位延伸:1；x_dropoff：50；期望值：10.0；序列长度：3；过滤器：开。核酸序列比对可以使用BLASTN版本2.0.6(1998年9月16日)以及以下参数执行：匹配：1；错配：-2；空位开放：5；空位延伸:2；x_dropoff：50；期望值：10.0；序列长度：11；过滤器：关。本领域的技术人员会知道对以上参数作何修改会例如，增加或减少比较的严格性，以及确定两个或两个以上序列的相关性。
本文披露了非天然存在的微生物催化剂或者微生物，该微生物催化剂或者微生物包括具有4-羟基丁酸(4-HB)生物合成途径的微生物，所述途径包括编码4-羟基丁酸酯脱氢酶、非依赖CoA的琥珀半醛脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶、依赖CoA的琥珀半醛脱氢酶、谷氨酸：琥珀半醛转氨酶、α-酮戊二酸脱羧酶或者谷氨酸脱羧酶的至少一种外源性核酸，其中该外源性核酸以足够的量表达，以生产单体4-羟基丁酸(4-HB)。4-羟基丁酸酯脱氢酶也被称为4-羟基丁酸脱氢酶或者4-HB脱氢酶。琥珀酰-CoA合成酶也被称为琥珀酰-CoA合酶或者琥珀酰-CoA连接酶。
本文还披露一种非天然存在的微生物催化剂或者微生物，该微生物催化剂或者微生物包括具有4-羟基丁酸(4-HB)生物合成途径的微生物，该途径具有编码4-羟基丁酸酯脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶、依赖CoA的琥珀半醛脱氢酶或者α-酮戊二酸脱羧酶的至少一种外源性核酸,其中该外源性核酸以足够的量表达以生产单体4-羟基丁酸(4-HB)。
该非天然存在的微生物催化剂或者微生物可以包括将新陈代谢反应的组合用于生物合成生产本发明的化合物的微生物。生物合成的化合物可以在细胞内产生和/或分泌到培养基内。由该非天然存在的微生物产生的示例性化合物包括例如，4-羟基丁酸、1,4-丁二醇和γ-丁内酯。
在一个实施方式中，非天然存在的微生物被设计以生产4-HB。这种化合物是一个通向1,4-丁二醇家族的化合物的有用的入口点。从琥珀酸、通过琥珀酰-CoA从琥珀酸或者从α-酮戊二酸形成4-HB的生物化学反应显示于图1的步骤1-8中。
应理解，只要实现从起始组分至BDO、4-HBal、4-HBCoA和/或腐胺产品的转化就可以使用BDO、4-HBal、4-HBCoA和/或腐胺途径的适当酶的任何组合。因此，应理解，本文披露的任何新陈代谢途径可被利用以及本领域的技术人员根据本文的披露能很好地理解如何选择适当的酶以实现所需的途径。
在另一实施方式中，本文披露了一种非天然存在的微生物，该微生物包括具有如下途径的微生物：包括编码以足够的量表达以产生BDO的BDO途径酶的至少一种外源性核酸的1,4-丁二醇(BDO)途径，该BDO途径包括4-氨基丁酸CoA转移酶、4-氨基丁酰-CoA水解酶、4-氨基丁酸-CoA连接酶、4-氨基丁酰-CoA氧化还原酶(脱氨基)、4-氨基丁酰-CoA转氨酶或者4-羟基丁酰-CoA脱氢酶(见实施例VII表17)。该BDO途径进一步可以包括4-羟基丁酰-CoA还原酶(醇形成)、4-羟基丁酰-CoA还原酶或者1,4-丁二醇脱氢酶。
本领域的技术人员应理解，可以利用如本文所披露的途径的各种组合。例如，在非天然存在的微生物中，核酸可以编码4-氨基丁酸CoA转移酶、4-氨基丁酰-CoA水解酶或者4-氨基丁酸-CoA连接酶；4-氨基丁酰-CoA氧化还原酶(脱氨基)或者4-氨基丁酰-CoA转氨酶；以及4-羟基丁酰-CoA脱氢酶。其他示例性的组合在下文具体描述以及进一步可以见于图8-13。例如，该BDO途径可以进一步包括4-羟基丁酰-CoA还原酶(醇形成)、4-羟基丁酰-CoA还原酶或者1,4-丁二醇脱氢酶。
本文另外披露了一种非天然存在的微生物，该微生物包括具有如下途径的微生物：包括编码以足够的量表达以产生BDO的BDO途径酶的至少一种外源性核酸的BDO途径，该BDO途径包括4-氨基丁酸CoA转移酶、4-氨基丁酰-CoA水解酶、4-氨基丁酸-CoA连接酶、4-氨基丁酰-CoA还原酶(醇形成)、4-氨基丁酰-CoA还原酶、4-氨基-1-丁醇脱氢酶、4-氨基-1-丁醇氧化还原酶(脱氨基)或者4-氨基-1-丁醇转氨酶(见实施例VII和表18)以及可以进一步包括1,4-丁二醇脱氢酶。例如，该外源性核酸可以编码4-氨基丁酸CoA转移酶、4-氨基丁酰-CoA水解酶或者4-氨基丁酸-CoA连接酶；4-氨基丁酰-CoA还原酶(醇形成)；以及4-氨基-1-丁醇氧化还原酶(脱氨基)或者4-氨基-1-丁醇转氨酶。此外，该核酸可以编码4-氨基丁酸CoA转移酶、4-氨基丁酰-CoA水解酶或者4-氨基丁酸-CoA连接酶；4-氨基丁酰-CoA还原酶；4-氨基-1-丁醇脱氢酶；以及4-氨基-1-丁醇氧化还原酶(脱氨基)或者4-氨基-1-丁醇转氨酶。
本文还披露了一种非天然存在的微生物，该微生物包括具有如下途径的微生物：包括编码以足够的量表达以产生BDO的BDO途径酶的至少一种外源性核酸的BDO途径，该BDO途径包括4-氨基丁酸激酶、4-氨基丁醛脱氢酶(磷酸化)、4-氨基-1-丁醇脱氢酶、4-氨基-1-丁醇氧化还原酶(脱氨基)、4-氨基-1-丁醇转氨酶、[(4-氨基丁酰基)氧基]磷酸氧化还原酶(脱氨基)、[(4-氨基丁酰基)氧基]磷酸转氨酶、4-羟基丁酰-磷酸脱氢酶或者4-羟基丁醛脱氢酶(磷酸化)(见实施例VII和表19)。例如，该外源性核酸可以编码4-氨基丁酸激酶；4-氨基丁醛脱氢酶(磷酸化)；4-氨基-1-丁醇脱氢酶；和4-氨基-1-丁醇氧化还原酶(脱氨基)或者4-氨基-1-丁醇转氨酶。替代性地，该外源性核酸可以编码4-氨基丁酸激酶；[(4-氨基丁酰基)氧基]磷酸氧化还原酶(脱氨基)或者[(4-氨基丁酰基)氧基]磷酸转氨酶；4-羟基丁酰-磷酸脱氢酶；和4-羟基丁醛脱氢酶(磷酸化)。
本文另外披露了一种非天然存在的微生物，该微生物包括具有如下途径的微生物：包括编码以足够的量表达以产生BDO的BDO途径酶的至少一种外源性核酸的BDO途径，该BDO途径包括α-酮戊二酸5-激酶、2,5-二氧代戊酸半醛脱氢酶(磷酸化)、2,5-二氧代戊酸还原酶、α-酮戊二酸CoA转移酶、α-酮戊二酰基-CoA水解酶、α-酮戊二酰基-CoA连接酶、α-酮戊二酰基-CoA还原酶、5-羟基-2-氧代戊酸脱氢酶、α-酮戊二酰基-CoA还原酶(醇形成)、5-羟基-2-氧代戊酸脱羧酶或者5-羟基-2-氧代戊酸脱氢酶(脱羧)(见实施例VIII和表20)。该BDO途径可以进一步包括4-羟基丁酰-CoA还原酶(醇形成)、4-羟基丁酰-CoA还原酶或者1,4-丁二醇脱氢酶。例如，该外源性核酸可以编码α-酮戊二酸5-激酶；2,5-二氧代戊酸半醛脱氢酶(磷酸化)；2,5-二氧代戊酸还原酶；以及5-羟基-2-氧代戊酸脱羧酶。替代性地，该外源性核酸可以编码α-酮戊二酸5-激酶；2,5-二氧代戊酸半醛脱氢酶(磷酸化)；2,5-二氧代戊酸还原酶；以及5-羟基-2-氧代戊酸脱氢酶(脱羧)。替代性地，该外源性核酸可以编码α-酮戊二酸CoA转移酶、α-酮戊二酰基-CoA水解酶或者α-酮戊二酰基-CoA连接酶；α-酮戊二酰基-CoA还原酶、5-羟基-2-氧代戊酸脱氢酶；以及5-羟基-2-氧代戊酸脱羧酶。在另一实施方式中，该外源性核酸可以编码α-酮戊二酸CoA转移酶、α-酮戊二酰基-CoA水解酶或者α-酮戊二酰基-CoA连接酶；α-酮戊二酰基-CoA还原酶、5-羟基-2-氧代戊酸脱氢酶和5-羟基-2-氧代戊酸脱氢酶(脱羧)。替代性地，该外源性核酸可以编码α-酮戊二酸CoA转移酶、α-酮戊二酰基-CoA水解酶或者α-酮戊二酰基-CoA连接酶；α-酮戊二酰基-CoA还原酶(醇形成)；以及5-羟基-2-氧代戊酸脱羧酶。在仍然另一实施方式中，该外源性核酸可以编码α-酮戊二酸CoA转移酶、α-酮戊二酰基-CoA水解酶或者α-酮戊二酰基-CoA连接酶；α-酮戊二酰基-CoA还原酶(醇形成)；以及5-羟基-2-氧代戊酸脱氢酶(脱羧)。
本文进一步披露了一种非天然存在的微生物，该微生物包括具有如下途径的微生物：包括编码以足够的量表达以产生BDO的BDO途径酶的至少一种外源性核酸的BDO途径，该BDO途径包括谷氨酸CoA转移酶、谷氨酰基-CoA水解酶、谷氨酰基-CoA连接酶、谷氨酸5-激酶、谷氨酸-5-半醛脱氢酶(磷酸化)、谷氨酰基-CoA还原酶、谷氨酸-5-半醛还原酶、谷氨酰基-CoA还原酶(醇形成)、2-氨基-5-羟基戊酸氧化还原酶(脱氨基)、2-氨基-5-羟基戊酸转氨酶、5-羟基-2-氧代戊酸脱羧酶、5-羟基-2-氧代戊酸脱氢酶(脱羧)(见实施例IX和表21)。例如，该外源性核酸可以编码谷氨酸CoA转移酶、谷氨酰基-CoA水解酶或者谷氨酰基-CoA连接酶；谷氨酰基-CoA还原酶；谷氨酸-5-半醛还原酶；2-氨基-5-羟基戊酸氧化还原酶(脱氨基)或者2-氨基-5-羟基戊酸转氨酶；以及5-羟基-2-氧代戊酸脱羧酶或者5-羟基-2-氧代戊酸脱氢酶(脱羧)。替代性地，该外源性核酸可以编码谷氨酸5-激酶；谷氨酸-5-半醛脱氢酶(磷酸化)；谷氨酸-5-半醛还原酶；2-氨基-5-羟基戊酸氧化还原酶(脱氨基)或者2-氨基-5-羟基戊酸转氨酶；以及5-羟基-2-氧代戊酸脱羧酶或者5-羟基-2-氧代戊酸脱氢酶(脱羧)。在仍然另一实施方式中，该外源性核酸可以编码谷氨酸CoA转移酶、谷氨酰基-CoA水解酶或者谷氨酰基-CoA连接酶；谷氨酰基-CoA还原酶(醇形成)；2-氨基-5-羟基戊酸氧化还原酶(脱氨基)或者2-氨基-5-羟基戊酸转氨酶；以及5-羟基-2-氧代戊酸脱羧酶或者5-羟基-2-氧代戊酸脱氢酶(脱羧)。在仍然另一实施方式中，该外源性核酸可以编码谷氨酸5-激酶；谷氨酸-5-半醛脱氢酶(磷酸化)；2-氨基-5-羟基戊酸氧化还原酶(脱氨基)或者2-氨基-5-羟基戊酸转氨酶；以及5-羟基-2-氧代戊酸脱羧酶或者5-羟基-2-氧代戊酸脱氢酶(脱羧)。
本文还披露了一种非天然存在的微生物，该微生物包括具有如下途径的微生物：包括编码以足够的量表达以产生BDO的BDO途径酶的至少一种外源性核酸的BDO途径，该BDO途径包括3-羟基丁酰-CoA脱氢酶、3-羟基丁酰-CoA脱水酶、乙烯乙酰基-CoAΔ-异构酶或者4-羟基丁酰-CoA脱水酶(见实施例X和表22)。例如，该外源性核酸可以编码3-羟基丁酰-CoA脱氢酶；3-羟基丁酰-CoA脱水酶；乙烯乙酰基-CoAΔ-异构酶；以及4-羟基丁酰-CoA脱水酶。
本文进一步披露了一种非天然存在的微生物，该微生物包括具有如下途径的微生物：包括编码以足够的量表达以产生BDO的BDO途径酶的至少一种外源性核酸的BDO途径，该BDO途径包括高丝氨酸脱氨酶、高丝氨酸CoA转移酶、高丝氨酸-CoA水解酶、高丝氨酸-CoA连接酶、高丝氨酸-CoA脱氨酶、4-羟基丁-2-烯酰基-CoA转移酶、4-羟基丁-2-烯酰基-CoA水解酶、4-羟基丁-2-烯酰基-CoA连接酶、4-羟基丁-2-烯酸还原酶、4-羟基丁酰-CoA转移酶、4-羟基丁酰-CoA水解酶、4-羟基丁酰-CoA连接酶或者4-羟基丁-2-烯酰基-CoA还原酶(见实施例XI和表23)。例如，该外源性核酸可以编码高丝氨酸脱氨酶；4-羟基丁-2-烯酰基-CoA转移酶、4-羟基丁-2-烯酰基-CoA水解酶、4-羟基丁-2-烯酰基-CoA连接酶；4-羟基丁-2-烯酰基-CoA还原酶。替代性地，该外源性核酸可以编码高丝氨酸CoA转移酶、高丝氨酸-CoA水解酶或者高丝氨酸-CoA连接酶；高丝氨酸-CoA脱氨酶；以及4-羟基丁-2-烯酰基-CoA还原酶。在进一步的实施方式中，该外源性核酸可以编码高丝氨酸脱氨酶；4-羟基丁-2-烯酸还原酶；以及4-羟基丁酰-CoA转移酶、4-羟基丁酰-CoA水解酶或者4-羟基丁酰-CoA连接酶。替代性地，该外源性核酸可以编码高丝氨酸CoA转移酶、高丝氨酸-CoA水解酶或者高丝氨酸-CoA连接酶；高丝氨酸-CoA脱氨酶；以及4-羟基丁-2-烯酰基-CoA还原酶。
本文进一步披露了一种非天然存在的微生物，该微生物包括具有如下途径的微生物：包括编码以足够的量表达以产生BDO的BDO途径酶的至少一种外源性核酸的BDO途径，该BDO途径包括琥珀酰-CoA还原酶(醇形成)、4-羟基丁酰-CoA水解酶、4-羟基丁酰-CoA连接酶、4-羟基丁醛脱氢酶(磷酸化)(见表15)。这类BDO途径可以进一步包括琥珀酰-CoA还原酶、4-羟基丁酸脱氢酶、4-羟基丁酰-CoA转移酶、4-羟基丁酸激酶、磷酸转-4-羟基丁酰酶、4-羟基丁酰-CoA还原酶、4-羟基丁酰-CoA还原酶(醇形成)或者1,4-丁二醇脱氢酶。
本文另外披露了一种非天然存在的微生物，该微生物包括具有如下途径的微生物：包括编码以足够的量表达以产生BDO的BDO途径酶的至少一种外源性核酸的BDO途径，该BDO途径包括谷氨酸脱氢酶、4-氨基丁酸氧化还原酶(脱氨基)、4-氨基丁酸转氨酶、谷氨酸脱羧酶、4-羟基丁酰-CoA水解酶、4-羟基丁酰-CoA连接酶、4-羟基丁醛脱氢酶(磷酸化)(见表16)。这类BDO途径可以进一步包括α-酮戊二酸脱羧酶、4-羟基丁酸脱氢酶、4-羟基丁酰-CoA转移酶、4-羟基丁酸激酶、磷酸转-4-羟基丁酰酶、4-羟基丁酰-CoA还原酶、4-羟基丁酰-CoA还原酶(醇形成)或者1,4-丁二醇脱氢酶。
上文所述的途径仅仅是示例性的。本领域的技术人员可以根据需要容易地从本文披露的那些途径中选择适当的途径以获得合适的BDO途径或者其他代谢途径。
本发明提供允许通过增加所需的产品(如BDO)或者减少不需要的副产品来改善该产品的生产的基因修饰生物。如本文所披露，本发明提供一种非天然存在的微生物，该微生物包括具有如下途径的微生物：包括编码以足够的量表达以产生BDO的BDO途径酶的至少一种外源性核酸的1,4-丁二醇(BDO)途径。在一个实施方式中，该微生物通过基因修饰以表达外源性琥珀酰-CoA合成酶(见实施例XII)。例如，该琥珀酰-CoA合成酶可以由大肠杆菌sucCD基因编码。
在另一实施方式中，该微生物通过基因修饰以表达外源性α-酮戊二酸脱羧酶(见实施例XIII)。例如，该α-酮戊二酸脱羧酶可以由牛结核分支杆菌sucA基因编码。在仍然另一实施方式中，该微生物通过基因修饰以表达外源性琥珀酸半醛脱氢酶和4-羟基丁酸脱氢酶以及可选地4-羟基丁酰-CoA/乙酰基-CoA转移酶(见实施例XIII)。例如，该琥珀酸半醛脱氢酶(CoA-依赖的)、4-羟基丁酸脱氢酶和4-羟基丁酰-CoA/乙酰基-CoA转移酶可以由牙龈红棕色单胞菌W83基因编码。在其他实施方式中，该微生物通过基因修饰以表达外源性丁酸激酶和磷酸丁酰转移酶(见实施例XIII)。例如，该丁酸激酶和磷酸丁酰转移酶可以由丙酮丁醇梭菌buk1和ptb基因编码。
在仍然另一实施方式中，该微生物通过基因修饰以表达外源性4-羟基丁酰-CoA还原酶(见实施例XIII)。例如，该4-羟基丁酰-CoA还原酶可以由拜氏梭菌ald基因编码。另外，在本发明的实施方式中，该微生物通过基因修饰以表达外源性4-羟基丁醛还原酶(见实施例XIII)。例如，该4-羟基丁醛还原酶可以由热葡糖苷酶地芽孢杆菌adh1基因编码。在另一实施方式中，该微生物通过基因修饰以表达外源性丙酮酸脱氢酶亚基(见实施例XIV)。例如，该外源性丙酮酸脱氢酶可以是NADH不敏感的。该丙酮酸脱氢酶亚基可以由肺炎克雷伯氏杆菌lpdA基因编码。在具体的实施方式中，该微生物的丙酮酸脱氢酶亚基基因可以在丙酮酸甲酸裂解酶启动子的控制下。
在仍然另一实施方式中，该微生物通过基因修饰以中断编码好氧的呼吸控制调节系统(见实施例XV)的基因。例如，该中断可以是arcA基因的中断。这类生物可以进一步包括中断编码苹果酸脱氢酶的基因。在进一步的实施方式中，该微生物通过基因修饰以表达外源性NADH不敏感的柠檬酸合酶(见实施例XV)。例如，该NADH不敏感的柠檬酸合酶可以由gltA，如gltA的R163L突变体编码。在仍然另一实施方式中，该微生物通过基因修饰以表达外源磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶(见实施例XVI)。例如，该磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶可以由流感嗜血杆菌的磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶基因编码。
应理解，如本文所披露的大量基因修饰的任何一种可以单独地或者与本文披露的一种或者多种的基因修饰进行各种组合使用，以增加产BDO的微生物中的BDO生产。在具体的实施方式中，该微生物可以通过基因修饰以纳入任何乃至所有的导致BDO产量增加的基因修饰。在具体的实施方式中，该包含BDO途径的微生物可以通过基因修饰以表达外源性琥珀酰-CoA合成酶；表达外源性α-酮戊二酸脱羧酶；表达外源性琥珀酸半醛脱氢酶和4-羟基丁酸脱氢酶以及可选地4-羟基丁酰-CoA/乙酰基-CoA转移酶；表达外源性丁酸激酶和磷酸丁酰转移酶；表达外源性4-羟基丁酰-CoA还原酶；以及表达外源性4-羟基丁醛还原酶；表达外源性丙酮酸脱氢酶；中断编码好氧的呼吸控制调节系统的基因；表达外源性NADH不敏感的柠檬酸合酶；以及表达外源磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶。这类用于改善产量的菌株在在实施例XII-XIX中有所描述。因此，应理解，除了上文所述的修饰，这类菌株可以另外包括本文披露的其他修饰。这类修饰包括但不仅限于内源性乳酸脱氢酶(ldhA)、醇脱氢酶(adhE)和/或丙酮酸甲酸裂解酶(pflB)的删除(见实施例XII-XIX和表28)。
另外提供了一种微生物，其中一种或者多种编码外源性表达的酶的基因被整合入宿主生物的fimD位点(见实施例XVII)。例如，一种或者多种编码BDO途径酶的基因可以被整合入该fimD位点，以提高BDO的产量。进一步提供了一种表达提高BDO产量的非磷酸转移酶蔗糖摄取系统的微生物。
虽然以包含特定BDO途径酶的微生物作为本文披露的基因修饰的微生物的示例，但是可以应理解，这类修饰可以被纳入任何具有在基因修饰的存在下适于提高产量的BDO、4-HBal、4-HBCoA和/或腐胺途径的微生物。本发明的该微生物因此可以具有本文披露的BDO、4-HBal、4-HBCoA和/或腐胺途径的任何一种。例如，该BDO途径可以包括4-羟基丁酸酯脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶、依赖CoA的琥珀半醛脱氢酶、4-羟基丁酸:CoA转移酶、4-丁酸激酶、磷酸丁酰转移酶、α-酮戊二酸脱羧酶、醛脱氢酶、醇脱氢酶或者醛/醇脱氢酶(见图1)。替代性地，该BDO途径可以包括4-氨基丁酸CoA转移酶、4-氨基丁酰-CoA水解酶、4-氨基丁酸-CoA连接酶、4-氨基丁酰-CoA氧化还原酶(脱氨基)、4-氨基丁酰-CoA转氨酶或者4-羟基丁酰-CoA脱氢酶(见表17)。这类BDO途径可以进一步包括4-羟基丁酰-CoA还原酶(醇形成)、4-羟基丁酰-CoA还原酶或者1,4-丁二醇脱氢酶。
另外，该BDO途径可以包括4-氨基丁酸CoA转移酶、4-氨基丁酰-CoA水解酶、4-氨基丁酸-CoA连接酶、4-氨基丁酰-CoA还原酶(醇形成)、4-氨基丁酰-CoA还原酶、4-氨基-1-丁醇脱氢酶、4-氨基-1-丁醇氧化还原酶(脱氨基)或者4-氨基-1-丁醇转氨酶(见表18)。此外，该BDO途径可以包括4-氨基丁酸激酶、4-氨基丁醛脱氢酶(磷酸化)、4-氨基-1-丁醇脱氢酶、4-氨基-1-丁醇氧化还原酶(脱氨基)、4-氨基-1-丁醇转氨酶、[(4-氨基丁酰基)氧基]磷酸氧化还原酶(脱氨基)、[(4-氨基丁酰基)氧基]磷酸转氨酶、4-羟基丁酰-磷酸脱氢酶或者4-羟基丁醛脱氢酶(磷酸化)(见表19)。这类途径可以进一步包括1,4-丁二醇脱氢酶。
该BDO途径可以还包括α-酮戊二酸5-激酶、2,5-二氧代戊酸半醛脱氢酶(磷酸化)、2,5-二氧代戊酸还原酶、α-酮戊二酸CoA转移酶、α-酮戊二酰基-CoA水解酶、α-酮戊二酰基-CoA连接酶、α-酮戊二酰基-CoA还原酶、5-羟基-2-氧代戊酸脱氢酶、α-酮戊二酰基-CoA还原酶(醇形成)、5-羟基-2-氧代戊酸脱羧酶或者5-羟基-2-氧代戊酸脱氢酶(脱羧)(见表20)。这类BDO途径可以进一步包括4-羟基丁酰-CoA还原酶(醇形成)、4-羟基丁酰-CoA还原酶或者1,4-丁二醇脱氢酶。另外，该BDO途径可以包括谷氨酸CoA转移酶、谷氨酰基-CoA水解酶、谷氨酰基-CoA连接酶、谷氨酸5-激酶、谷氨酸-5-半醛脱氢酶(磷酸化)、谷氨酰基-CoA还原酶、谷氨酸-5-半醛还原酶、谷氨酰基-CoA还原酶(醇形成)、2-氨基-5-羟基戊酸氧化还原酶(脱氨基)、2-氨基-5-羟基戊酸转氨酶、5-羟基-2-氧代戊酸脱羧酶、5-羟基-2-氧代戊酸脱氢酶(脱羧)(见表21)。这类BDO途径可以进一步包括4-羟基丁酰-CoA还原酶(醇形成)、4-羟基丁酰-CoA还原酶或者1,4-丁二醇脱氢酶。
另外，该BDO途径可以包括3-羟基丁酰-CoA脱氢酶、3-羟基丁酰-CoA脱水酶、乙烯乙酰基-CoAΔ-异构酶或者4-羟基丁酰-CoA脱水酶(见表22)。此外，该BDO途径可以包括高丝氨酸脱氨酶、高丝氨酸CoA转移酶、高丝氨酸-CoA水解酶、高丝氨酸-CoA连接酶、高丝氨酸-CoA脱氨酶、4-羟基丁-2-烯酰基-CoA转移酶、4-羟基丁-2-烯酰基-CoA水解酶、4-羟基丁-2-烯酰基-CoA连接酶、4-羟基丁-2-烯酸还原酶、4-羟基丁酰-CoA转移酶、4-羟基丁酰-CoA水解酶、4-羟基丁酰-CoA连接酶或者4-羟基丁-2-烯酰基-CoA还原酶(见表23)。这类BDO途径可以进一步包括4-羟基丁酰-CoA还原酶(醇形成)、4-羟基丁酰-CoA还原酶或者1,4-丁二醇脱氢酶。
该BDO途径可以另外包括琥珀酰-CoA还原酶(醇形成)、4-羟基丁酰-CoA水解酶、4-羟基丁酰-CoA连接酶或者4-羟基丁醛脱氢酶(磷酸化)(见表15)。这类途径可以进一步包括琥珀酰-CoA还原酶、4-羟基丁酸脱氢酶、4-羟基丁酰-CoA转移酶、4-羟基丁酸激酶、磷酸转-4-羟基丁酰酶、4-羟基丁酰-CoA还原酶、4-羟基丁酰-CoA还原酶(醇形成)或者1,4-丁二醇脱氢酶。此外，该BDO途径可以包括谷氨酸脱氢酶、4-氨基丁酸氧化还原酶(脱氨基)、4-氨基丁酸转氨酶、谷氨酸脱羧酶、4-羟基丁酰-CoA水解酶、4-羟基丁酰-CoA连接酶或者4-羟基丁醛脱氢酶(磷酸化)(见表16)。这类BDO途径可以进一步包括α-酮戊二酸脱羧酶、4-羟基丁酸脱氢酶、4-羟基丁酰-CoA转移酶、4-羟基丁酸激酶、磷酸转-4-羟基丁酰酶、4-羟基丁酰-CoA还原酶、4-羟基丁酰-CoA还原酶(醇形成)或者1,4-丁二醇脱氢酶。
本发明另外提供了一种非天然存在的微生物，该微生物包括如下途径：包括编码以足够的量表达以产生4-羟基丁醛的4-羟基丁醛途径酶的至少一种外源性核酸的4-羟基丁醛途径，该4-羟基丁醛途径包括琥珀酰-CoA还原酶(醛形成)；4-羟基丁酸脱氢酶；以及4-羟基丁酸还原酶(见图58，步骤A-C-D)。本发明还提供一种非天然存在的微生物，该微生物包括如下途径：包括编码以足够的量表达以产生4-羟基丁醛的4-羟基丁醛途径酶的至少一种外源性核酸的4-羟基丁醛途径，该4-羟基丁醛途径包括α-酮戊二酸脱羧酶；4-羟基丁酸脱氢酶；以及4-羟基丁酸还原酶(图58，步骤B-C-D)。
本发明进一步提供一种非天然存在的微生物，该微生物包括如下途径：包括编码以足够的量表达以产生4-羟基丁醛的4-羟基丁醛途径酶的至少一种外源性核酸的4-羟基丁醛途径，该4-羟基丁醛途径包括琥珀酸还原酶；4-羟基丁酸脱氢酶，以及4-羟基丁酸还原酶(见图62，步骤F-C-D)。在仍然另一实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物，该微生物包括如下途径：包括编码以足够的量表达以产生4-羟基丁醛的4-羟基丁醛途径酶的至少一种外源性核酸的4-羟基丁醛途径，该4-羟基丁醛途径包括α-酮戊二酸脱羧酶；或者谷氨酸脱氢酶或谷氨酸转氨酶和谷氨酸脱羧酶和4-氨基丁酸脱氢酶或4-氨基丁酸转氨酶；4-羟基丁酸脱氢酶；以及4-羟基丁酸还原酶(见图62，步骤B或者((J或者K)-L-(M或者N))-C-D)。
本发明还提供一种非天然存在的微生物，该微生物包括如下途径：包括编码以足够的量表达以产生4-羟基丁醛的4-羟基丁醛途径酶的至少一种外源性核酸的4-羟基丁醛途径，该4-羟基丁醛途径包括α-酮戊二酸还原酶；5-羟基-2-氧代戊酸脱氢酶；以及5-羟基-2-氧代戊酸脱羧酶(见图62，步骤X-Y-Z)。在仍然另一实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物，该微生物包括如下途径：包括编码以足够的量表达以产生4-羟基丁酰-CoA的4-羟基丁酰-CoA途径酶的至少一种外源性核酸的4-羟基丁酰-CoA途径，该4-羟基丁酰-CoA途径包括α-酮戊二酸还原酶；5-羟基-2-氧代戊酸脱氢酶；以及5-羟基-2-氧代戊酸脱氢酶(脱羧)(见图62，步骤X-Y-AA)。
本发明另外提供一种非天然存在的微生物，该微生物包括如下途径：包括编码以足够的量表达以产生腐胺的腐胺途径酶的至少一种外源性核酸的腐胺途径，该腐胺途径包括琥珀酸还原酶；4-氨基丁酸脱氢酶或者4-氨基丁酸转氨酶；4-氨基丁酸还原酶；以及腐胺脱氢酶或者腐胺转氨酶(见图63，步骤F-M/N-C-D/E)。在仍然另一实施方式中，本发明提供一种非天然存在的微生物，该微生物包括如下途径：包括编码以足够的量表达以产生腐胺的腐胺途径酶的至少一种外源性核酸的腐胺途径，该腐胺途径包括α-酮戊二酸脱羧酶；4-氨基丁酸脱氢酶或者4-氨基丁酸转氨酶；4-氨基丁酸还原酶；以及腐胺脱氢酶或者腐胺转氨酶(见图63，步骤B-M/N-C-D/E)。本发明另外提供一种非天然存在的微生物，该微生物包括如下途径：包括编码以足够的量表达以产生腐胺的腐胺途径酶的至少一种外源性核酸的腐胺途径，该腐胺途径包括谷氨酸脱氢酶或者谷氨酸转氨酶；谷氨酸脱羧酶；4-氨基丁酸还原酶；以及腐胺脱氢酶或者腐胺转氨酶(见图63，步骤J/K-L-C-D/E)。
本发明在另一实施方式中提供一种非天然存在的微生物，该微生物包括如下途径：包括编码以足够的量表达以产生腐胺的腐胺途径酶的至少一种外源性核酸的腐胺途径，该腐胺途径包括α-酮戊二酸还原酶；5-氨基-2-氧代戊酸脱氢酶或者5-氨基-2-氧代戊酸转氨酶；5-氨基-2-氧代戊酸脱羧酶；以及腐胺脱氢酶或者腐胺转氨酶(见图63，步骤O-P/Q-R-D/E)。还提供一种非天然存在的微生物，该微生物包括如下途径：包括编码以足够的量表达以产生腐胺的腐胺途径酶的至少一种外源性核酸的腐胺途径，该腐胺途径包括α-酮戊二酸还原酶；5-氨基-2-氧代戊酸脱氢酶或者5-氨基-2-氧代戊酸转氨酶；鸟氨酸脱氢酶或者鸟氨酸转氨酶；以及鸟氨酸脱羧酶(见图63，步骤O-P/Q-S/T-U)。
在其他的实施方式中，本发明提供一种具有4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺途径的非天然存在的微生物，其中该非天然存在的微生物包括编码转化本文披露的任何途径的底物的酶或者蛋白质的至少一种外源性核酸(见例如，实施例和图1、8-13、58、62和63)。在示例性的用于生产BDO的实施方式中，该微生物可以进行选自如下的底物到产品的转化：琥珀酸到琥珀酰-CoA；琥珀酰-CoA到琥珀半醛；琥珀半醛到4-羟基丁酸盐；4-羟基丁酸盐到4-羟基丁酰-磷酸；4-羟基丁酰-磷酸到4-羟基丁酰-CoA；4-羟基丁酰-CoA到4-羟基丁醛；以及4-羟基丁醛到1,4-丁二醇。在用于生产4-HBal的途径中，微生物可以转化例如，琥珀酸到琥珀半醛；琥珀半醛到4-羟基丁酸盐；以及4-羟基丁酸盐到4-羟基丁醛。这类生物可以另外包括转化4-羟基丁醛到1,4-丁二醇的活性以生产BDO。仍然另一用于生产4-HBal的途径可以是例如，α-酮戊二酸到琥珀半醛；琥珀半醛到4-羟基丁酸盐；以及4-羟基丁酸盐到4-羟基丁醛。用于生产4-HBal的可选途径可以是例如，α-酮戊二酸到2,5-二氧代戊酸；2,5-二氧代戊酸到5-羟基-2-氧代戊酸；以及5-羟基-2-氧代戊酸到4-羟基丁醛。示例性的4-羟基丁酰-CoA途径可以是例如，α-酮戊二酸到2,5-二氧代戊酸；2,5-二氧代戊酸到5-羟基-2-氧代戊酸；以及5-羟基-2-氧代戊酸到4-羟基丁酰-CoA。示例性的腐胺途径可以是例如，琥珀酸到琥珀酰-CoA；琥珀酰-CoA到琥珀半醛；琥珀半醛到4-氨基丁酸；4-氨基丁酸到4-氨基丁醛；以及4-氨基丁醛到腐胺。可选的腐胺途径可以是例如，琥珀酸到琥珀半醛；琥珀半醛到4-氨基丁酸；4-氨基丁酸到4-氨基丁醛；以及4-氨基丁醛到腐胺。本领域的技术人员会理解这些仅仅是示例性以及基于本文的启示，本领域的技术人员可以容易地确定本文披露的任何适于生产所需产品以及具有转化所需的适当活性的底物-产品对。因此，本发明提供一种包含编码酶或者蛋白质的至少一种外源性核酸的非天然存在的微生物，其中该酶或者蛋白质转化途径的底物以及产品(见图1、8-13、58、62和63)。
虽然本文中一般地描述了一种包含4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺途径的微生物，但是可以理解的是，本发明另外提供了一种非天然存在的微生物，该微生物包括编码以足够的量表达以生产4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺通路的中间体的4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺途径酶或者蛋白质的至少一种外源性核酸。例如，如本文所披露，4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO和腐胺途径的示例见图1、8-13、58、62和63。因此，除了包含例如，生产BDO的BDO途径的微生物，本发明另外提供一种包括编码BDO途径酶的至少一种外源性核酸的非天然存在的微生物，其中该微生物将BDO途径中间体作为产品而非途径的中间体来生产。例如，在一个如图62所示的示例性的实施方式中，本发明提供一种将琥珀酰-CoA、琥珀半醛、4-羟基丁酸盐、4-羟基丁酰-磷酸、4-羟基丁酰-CoA或者4-羟基丁醛作为产品而非中间体来生产的微生物。另一示例性的实施方式包括例如，将α-酮戊二酸、2,5-二氧代戊酸、5-羟基-2-氧代戊酸或者4-羟基丁醛作为产品而非中间体来生产的微生物。腐胺途径中的示例性实施方式包括例如，将谷氨酸、4-氨基丁酸或者4-氨基丁醛作为产品而非中间体来生产的微生物。腐胺途径中的可选实施方式可以是例如，将2,5-二氧代戊酸、5-氨基-2-氧代戊酸或者鸟氨酸作为产品而非中间体来生产的微生物。
应理解，本文披露的任何途径，如实施例中所述的以及附图中示范的途径(包括图1、8-13、58、62和63的途径)，可用以生成一种根据需要生产任何途径中间体或者产品的非天然存在的微生物。如本文所披露，这类生产中间体的微生物可以与另一种表达下游途径酶的微生物组合使用，以生产所需的产品。然而，应理解，生产4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺途径中间体的非天然存在的微生物可用以将该中间体作为所需的产品来生产。
本文一般地参照代谢反应、反应物或其产物，或者具体地参照一种或多种编码酶(所述酶与所参照的代谢反应、反应物或产物有关或者催化所参照的代谢反应、反应物或产物)的核酸或基因对本发明进行描述。除非本文另有明确规定，本领域的技术人员会理解对反应的参照也构成了对所述反应的反应物以及产物的参照。同样，除非本文另有明确规定，对反应物或产物的参照也是对反应的参照，以及对任何这些代谢组分的参照也是参照一种或者多种的编码催化所参照的反应、反应物或产物的酶的基因。同样地，考虑到熟知的代谢生物化学、酶学和基因组学领域，本文对基因或编码核酸的参照也构成对相应的被编码的酶和其催化的反应以及反应的反应物和产物的参照。
利用本发明所述的微生物经由生物合成模式生产4-HB是尤其有用的，因为这可以生产出单体4-HB。本发明所述的非天然存在的微生物及其生物合成4-HB和BDO家族化合物也是尤其有用的，因为该4-HB产品(1)可以是分泌的；(2)可以没有任何衍生作用(如辅酶A)；(3)避免生物合成期间的热力学转化；(4)允许BDO的直接生物合成，以及(5)使得酸性pH培养基中4-HB到γ-丁内酯(GBL)的自发化学转化成为可能。后面的这种特征对于例如，BDO家族化合物(如1,4-丁二醇和/或四氢呋喃(THF))的高效的化学合成或者生物合成也是尤其有用的。
微生物普遍缺乏合成4-HB的能力，因此本文披露的任何所述化合物都在1,4-丁二醇家族化合物的范围内或者为本领域的那些人员所知落在1,4-丁二醇家族化合物的范围内。此外，并非已知的是，具有所有的所述必要的新陈代谢酶催能力的生物从本文所述的酶和示范的生化途径生产4-HB。相反，也许除了下文进一步描述的少许厌氧微生物之外，具有酶催能力的微生物利用4-HB作为底物以生产例如，琥珀酸。相比之下，本发明所述的非天然存在的微生物可以将4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO和/或腐胺作为产品来生成。如上文所述，以其单体形成生物合成4-HB不仅在BDO家族化合物的化学合成中尤其有用，它还使得BDO家族化合物的进一步生物合成成为可能并且完全避免了化学合成程序。
通过确保宿主微生物包含用于本发明的至少一种4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO和/或腐胺生物合成途径的完整的生化合成的官能，来生产可以生产4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO和/或腐胺的本发明所述的非天然存在的微生物。确保至少一种必要的4-HB、4-HBal、4-HBCoA或者BDO生物合成途径赋予该宿主微生物4-HB生物合成能力。
为了在图1进行说明，本文示范并示出了数条4-HB生物合成途径。其他4-HB和BDO途径的描述见图8-13。一种4-HB生物合成途径包括从琥珀酸到4-HB的生物合成(琥珀酸途径)。参与这种4-HB途径的酶包括非依赖CoA的琥珀半醛脱氢酶和4-羟基丁酸酯脱氢酶。在这种途径中，非依赖CoA的琥珀半醛脱氢酶按图1中所示的箭头催化逆反应。另一种4-HB生物合成途径包括通过琥珀酰-CoA始自琥珀酸的生物合成(琥珀酰-CoA途径)。参与这种4-HB途径的酶包括琥珀酰-CoA合成酶、依赖CoA的琥珀半醛脱氢酶和4-羟基丁酸酯脱氢酶。三种其他的4-HB生物合成途径包括从α-酮戊二酸到4-HB的生物合成(α-酮戊二酸途径)。因此，第三种4-HB生物合成途径是通过谷氨酸：琥珀半醛转氨酶、谷氨酸脱羧酶和4-羟基丁酸酯脱氢酶的琥珀半醛的生物合成。第四种4-HB生物合成途径也包括从α-酮戊二酸到4-HB的生物合成，但是利用α-酮戊二酸脱羧酶催化琥珀半醛的合成。4-羟基丁酸酯脱氢酶催化琥珀半醛到4-HB的转化。第五种4-HB生物合成途径包括通过琥珀酰-CoA始自α-酮戊二酸的生物合成以及利用α-酮戊二酸脱氢酶生产琥珀酰-CoA，该琥珀酰-CoA通过漏斗进入上文所述的琥珀酰-CoA途径。这些4-HB生物合成途径、它们的底物、反应物和产物的每种于下文在实施例中进一步描述。如本文所述，可以通过包含适于生产BDO的酶以生物合成方式将4-HB进一步转化为BDO(见实施例)。因此，应理解，4-HB途径可以与用于将4-HB转化为BDO以生成BDO途径的酶一起使用。
本发明所述的非天然存在的微生物可以通过引入可表达的核酸来生产，该核酸编码一种或者多种的参与一种或者多种的4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺生物合成途径的酶。根据选定用于生物合成的宿主微生物，可以表达用于部分或者全部的具体4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺生物合成途径的核酸。例如，如果在所需的生物合成途径(例如，该琥珀酸到4-HB途径)中，选定的宿主存在一种或者多种的酶的缺陷，则将用于缺陷的一种或者多种的酶(例如，在这个例子中是非依赖CoA的琥珀半醛脱氢酶和4-羟基丁酸酯脱氢酶两种)的可表达的核酸引入该宿主用于后续的外源性表达。替代性地，如果该选定的宿主显示出一些途径酶的内源性表达，但是在其他方面存在缺陷，则需要用于缺陷的一种或者多种的酶的编码核酸，以实现4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺的生物合成。例如，如果该选定的宿主显示出内源性的非依赖CoA的琥珀半醛脱氢酶，但是存在4-羟基丁酸酯脱氢酶的缺陷，则需要用于这种酶的编码核酸，以实现4-HB的生物合成。因此，可以通过引入外源酶或者蛋白质活性以获得所需的生物合成途径来生产本发明的非天然存在的微生物或者可以通过引入一种或者多种的与一种或者多种内源性的酶或者蛋白质一起生产所需的产品(如4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO和/或腐胺)的外源酶或者蛋白质活性以获得所需的生物合成途径。
照同样的办法，其中选择通过琥珀酸到琥珀酰-CoA的途径(琥珀酰-CoA途径)进行4-HB生物合成，针对存在酶(琥珀酰-CoA合成酶、依赖CoA的琥珀半醛脱氢酶和/或4-羟基丁酸酯脱氢酶)缺陷的宿主，将编码核酸在该受体宿主内进行外源性表达。选择通过α-酮戊二酸到琥珀半醛途径(α-酮戊二酸途径)的4-HB生物合成可以将外源性表达用于存在一种或者多种如下酶的缺陷的宿主：谷氨酸：琥珀半醛转氨酶、谷氨酸脱羧酶和/或4-羟基丁酸酯脱氢酶；或者α-酮戊二酸脱羧酶和4-羟基丁酸酯脱氢酶。本领域的技术人员根据本文的披露可以容易地确定用于生产4-HB或者BDO的途径酶。
依据选定的宿主微生物的4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺的生物合成途径构成，本发明所述的非天然存在的微生物将包括至少一种外源性表达的4-HB、4-HB、4-HBCoA、BDO或者腐胺途径的编码核酸乃至用于一种或者多种4-HB或者BDO生物合成途径的所有的编码核酸。例如，通过外源性表达相应的编码核酸在存在途径酶或者蛋白质缺陷的宿主内建立4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺生物合成。在存在4-HB、4-HB、4-HBCoA、BDO或者腐胺途径的所有的酶或者蛋白质缺陷的宿主内，可以包含该途径中所有的酶或者蛋白质的外源性表达，虽然应理解，即使该宿主包含至少一种途径酶或者蛋白质，也可以表达该途径的所有的酶或者蛋白质。如果需要，可以包含用于生产4-HB、4-HB、4-HBCoA、BDO或者腐胺的途径中的所有的酶或者蛋白质的外源性表达。例如，可以通过4-羟基丁酸酯脱氢酶编码核酸的外源性表达在存在4-羟基丁酸酯脱氢酶缺陷的宿主内通过所有的五种途径建立4-HB的生物合成。相比之下，可以通过所有的如下八种酶的外源性的表达在存在所有的八种酶的缺陷的宿主内通过所有的五种途径建立4-HB的生物合成：非依赖CoA的琥珀半醛脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶、依赖CoA的琥珀半醛脱氢酶、谷氨酸：琥珀半醛转氨酶、谷氨酸脱羧酶、α-酮戊二酸脱羧酶、α-酮戊二酸脱氢酶和4-羟基丁酸酯脱氢酶。
考虑到本文提供的启示和指导，本领域的技术人员会理解以可表达的形式引入的编码核酸的数量将，至少，等于所选定的宿主微生物的4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺途径缺陷量。因此，本发明的非天然存在的微生物可以具有一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种乃至所有的编码本文披露的构成一种或者多种4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺生物合成途径的酶的核酸。在一些实施方式中，该非天然存在的微生物还可以包括其他促进或者优化4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺的生物合成或者赋予该宿主微生物其他有用的功能的基因修饰。一种这类的其他功能性可以包括例如，对一种或者多种4-HB途径前体(如琥珀酸、琥珀酰-CoA、α-酮戊二酸、4-氨基丁酸、谷氨酸、乙酰乙酰基-CoA和/或高丝氨酸)的合成的增强。
一般地,宿主微生物应该这样选择以便其生产4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺途径的前体，作为自然生产的分子或作为工程产物，其提供所需前体的从新生产或由该宿主微生物自然生产的前体的增加生产。例如，琥珀酰-CoA、α-酮戊二酸、4-氨基丁酸、谷氨酸、乙酰乙酰基-CoA，以及高丝氨酸自然产生于宿主生物，如大肠杆菌。宿主生物可以设计以增加前体的生产，正如本文所披露。此外，已被设计以生产所需前体的微生物可用作宿主生物并进一步被设计，以表达4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺途径的酶或蛋白质。
在一些实施方式中，本发明的非天然存在的微生物生成自包含合成4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺的酶催能力的宿主。在该特定的实施方式中，其可用以增加4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺途径产物的合成或累积以，例如促使发生4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺途径反应，以便生产4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺。合成或累积的增加可以通过，例如编码本文披露的一种或多种4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺途径酶的核酸的过表达来完成。该一种或多种4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺途径酶的过表达的发生可以，例如通过一种或多种内源性基因的外源性表达或通过一种或多种异源性基因的外源性表达。因此，通过一种、两种、三种、四种、五种、六种等等乃至所有的编码4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺生物合成途径酶的核酸的过表达，天然存在的生物可以很容易地生成为本发明的产4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺的微生物。此外，非天然存在的生物可以通过造成4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺生物合成途径中酶活性的增加的内源性基因的诱变来生成。
在特别有用的实施方式中，采用编码核酸的外源性表达。外源性表达赋予对宿主定制表达和/或调节元件的能力以及获得使用人控制的所需的表达水平的应用。然而，其他实施方式中还可以利用内源性表达，例如当连接至诱导型启动子或其他调节元件时，通过去除负调节效应子或基因启动子的诱导利用内源性表达。因此，具有天然存在的诱导型启动子的内源性基因可以通过提供适当的诱导剂上调；或者内源性基因的调节区域可设计以纳入诱导调节元件，从而允许在需要的时候调节内源性基因的上调表达。同样，可以包括诱导型启动子，作为针对引入非天然存在的微生物的外源性基因的调节元件(见实施例)。
如本文所用，“外源”意指有关分子或有关活性被引入宿主微生物。分子可以例如，通过将编码核酸引入宿主遗传物质，如通过整合入宿主染色体或作为非染色体遗传物质(如质粒)被引入。因此，当关于编码核酸的表达使用时，该术语指将编码核酸以可表达的形式引入微生物。当关于生物合成活性使用时，该术语指被引入宿主有关生物的活性。来源可以是例如，表达引入宿主微生物后有关活性的同源或异源编码核酸。因此，术语“内源”指在宿主内存在的有关分子或活性。同样，当关于编码核酸的表达使用时，该术语指包含在微生物体内编码核酸的表达。术语“异源”指来自与有关物种不同来源的分子或活性而“同源”指来自宿主微生物的分子或活性。因此，本发明的编码核酸的外源性表达可以利用异源编码核酸和同源编码核酸的其一或两者。
应理解，当微生物内包含一种以上的外源性核酸时，所述一种以上的外源性核酸指相关的编码核酸或者生物合成活性，如上文所讨论。进一步应理解，如本文所披露，这类一种以上的外源性核酸可以被引入在单独的核酸分子上、在多顺反子核酸分子上或者在其组合上的宿主微生物，并且仍然被看作是一种以上的外源性核酸。例如，如本文所披露，微生物可被设计以表达两种或者两种以上的编码所需的途径酶或者蛋白质的外源性核酸。在两种编码所需活性的外源性核酸被引入宿主微生物的情况下，应理解，该两种外源性核酸可以作为单一核酸被引入例如，在单一质粒上、在单独的质粒上的，可以被整合入位于单个位点或者多个位点的宿主染色体，以及仍然被看作是两种外源性核酸。同样，应理解，两种以上的外源性核酸可以任何所需的组合形式被引入例如，在单一质粒上、在单独的质粒上的宿主生物，可以被整合入位于单一位点或者多个位点的宿主染色体，以及仍然被看作是两种或者两种以上的外源性核酸，例如三种外源性核酸。因此，相关的外源性核酸或者生物合成活性的数量指编码核酸的数量或者生物合成活性的数量，而非被引入宿主生物的单独的核酸的数量。
用于4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺途径酶的编码核酸的来源可以包括，例如其中被编码的基因产物能够催化参照反应的任何物种。这类物种既包括原核生物又包括真核生物，包括但不仅限于细菌(包括古生细菌和真细菌)以及真核生物(包括酵母)、植物、昆虫、动物以及哺乳动物(包括人)。针对这种来源的示例性物种包括，例如大肠杆菌、酿酒酵母、克鲁弗氏酵母、克鲁佛氏梭菌、丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、糖乙酸多丁醇梭菌、产气荚膜梭菌、艰难梭菌、肉毒杆菌、酪丁酸梭菌、破伤风形梭菌、破伤风梭菌、丙酸梭菌、氨基丁酸梭菌、近端梭菌、斯蒂克兰德氏梭菌、富养罗尔斯通氏菌、牛结核分支杆菌、结核分枝杆菌、牙龈红棕色单胞菌、拟南芥、嗜热栖热菌、假单胞菌属(包括绿脓假单胞菌、恶臭假单胞菌、施氏假单胞菌、荧光假单胞菌)、智人、穴兔、类球红细菌、布氏热厌氧杆菌、勤奋生金球菌、肠膜明串珠菌、橙色绿屈挠菌、Roseiflexuscastenholzii、赤细菌、加州希蒙得木、不动杆菌属(包括乙酸钙不动杆菌和贝氏不动杆菌)、牙龈红棕色单胞菌、硫化叶菌tokodaii、硫磺矿硫化叶菌、嗜酸热硫化叶菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌、巨大芽孢杆菌、短芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、褐鼠、肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、薄肌眼虫、齿垢密螺旋体、热醋穆尔氏菌、海栖热袍菌、盐沼沙雷氏菌、嗜热脂肪土芽孢杆菌、嗜热泉生古细菌(Aeropyrumpernix)、野猪、秀丽隐杆线虫、谷氨酸棒杆菌、发酵氨基酸球菌、乳酸乳球菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌、产气肠杆菌、念珠菌、土曲霉、乳酸戊糖片球菌、运动发酵单胞菌、巴氏醋杆菌、乳酸克鲁维酵母、巴克氏真杆菌、多毛拟杆菌、Anaerotruncuscolihominis、厌氧性嗜盐嗜碱耐热菌(Natranaerobiusthermophilusm)、空肠弯曲杆菌、流感嗜血杆菌、粘质沙雷氏菌、无丙二酸柠檬酸杆菌、黄色粘球菌、具核梭杆菌、产黄青霉、海洋γ蛋白质菌、产丁酸菌、艾瓦诺卡氏菌、皮疽诺卡氏菌、灰色链霉菌、人体酵母菌探针、热葡糖苷酶地芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌、幽门螺杆菌、烟草、水稻、地中海富盐菌、根癌农杆菌、反硝化无色杆菌、具核梭杆菌、带小棒链霉菌、鲍氏不动杆菌、小家鼠、克鲁佛氏酵母菌、阴道滴虫、布氏锥虫、施氏假单胞菌、大豆慢生根瘤菌、百脉根中慢生根瘤菌、牛、粘毛烟草、创伤弧菌、反刍动物月形单胞菌、副溶血性弧菌、闪烁古生球菌、死海盐盒菌、耐超高温热棒菌、包皮垢分支杆菌MC2155、鸟型分枝杆菌亚种类结核K-10、海洋分支杆菌M、微代谢冢村氏菌DSM20162、蓝菌属PCC7001、盘基网柄菌AX4，以及本文披露的其他物种(见实施例)。例如，本文参照大肠杆菌和酵母宿主对具有4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺生物合成生产的微生物进行了例证。然而，今天超过550个物种的完整的基因组序列是可得的(这些物种中超过一半的基因组序列在公用数据库，如NCBI中可以得到)，包括395微生物基因组和各种酵母、真菌、植物以及哺乳动物基因组，在这种情况下，编码针对近缘或远缘物种中一种或多种基因的必要的4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺生物合成活性的基因的识别(包括，例如已知基因的同系、直系同源、旁系同源和非直系同源基因置换)以及生物之间基因改变的互换在本领域是常规且熟知的。因此，实现本文所述的关于特定生物(如大肠杆菌或酵母)的4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺以及其他化合物的生物合成的代谢改变可以以同样的方式很容易地应用到其他微生物，包括原核和真核生物。考虑到本文提供的启示和指导，本领域的技术人员会得知在一种生物中示范的代谢改变可以同样地应用于其他生物。
在某些情况下，例如当替代性的4-HB、4-HBal、BDO或者腐胺生物合成途径存在于不相关的物种中时，可以通过，例如来自催化相似的、但非完全相同的代谢反应以取代参照反应的不相关物种的一种旁系同源物或多种旁系同源物的外源性表达，赋予该宿主物种4-HB、4-HBal、BDO或者腐胺的生物合成。由于不同的生物之间存在代谢网络间的某些差异，本领域的技术人员会理解不同生物之间的实际的基因用法可以存在差异。然而，考虑到本文提供的启示和指导，本领域的技术人员还会理解本发明的启示和方法可以通过利用对本文那些示例性的微生物所作的同源代谢改变应用于所有的微生物，以在有关的物种中构建会合成4-HB(如单体4-HB、4-HBal、BDO或者腐胺)的微生物。
宿主微生物可以选自以及所述非天然存在的微生物可以生成于，例如细菌、酵母、真菌或各种其他适用于发酵过程的微生物的任意一种。示例性的细菌包括选自如下的物种：大肠杆菌、产酸克雷伯氏菌、产琥珀酸厌氧螺菌、琥珀酸放线杆菌、产琥珀酸曼氏杆菌、菜豆根瘤菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、氧化葡糖杆菌、运动发酵单胞菌、乳酸乳球菌、植物乳杆菌、天蓝色链霉菌、丙酮丁醇梭菌、萤光假单胞菌以及恶臭假单胞菌。示例性的酵母或真菌包括选自如下的物种：酿酒酵母、人体酵母菌探针、乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、土曲霉、黑曲霉、毕赤酵母、无根根霉菌、稻根霉菌(Rhizobusoryzae)等等。黑曲霉和毕赤酵母。大肠杆菌是一种特别有用的宿主生物，因为其是一种适于基因工程的具有良好表征的微生物。其他特别有用的宿主生物包括酵母，如酿酒酵母。应理解，任何适合的宿主微生物可用以引入代谢和/或基因修饰，以生产所需的产品。
可以例如，通过本领域熟知的重组和检测方法操作用于构建和测试生产非天然存在的产4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺的宿主的表达水平的方法。这类方法的描述可以见于，例如Sambrook等人,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第3版，ColdSpringHarborLaboratory,NewYork(2001)；Ausubel等人,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileyandSons,Baltimore,MD(1999)。4-HB和GBL可以通过，例如，利用Spherisorb5ODS1柱和流动相的70％10mM磷酸缓冲液(pH＝7)以及30％甲醇的HPLC进行分离，以及利用UV检测器于215nm处进行检测(Hennessy等人2004,J.ForensicSci.46(6):1-9)。BDO通过气相色谱分析或通过HPLC以及利用AminexHPX-87H柱和流动相的0.5mM硫酸的折光率检测器来检测(Gonzalez-Pajuelo等人、Met.Eng.7:329-336(2005))。
可以利用本领域熟知的技术(包括但不限于接合、电穿孔术、化学转化法、转导、转染和超声转化)将用于生产4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺的途径中涉及的外源性核酸序列稳定或瞬时地引入宿主细胞。对于大肠杆菌或其他原核细胞中的外源性表达，真核细胞核酸的基因或cDNA中的一些核酸序列可以编码导向信号(targetingsignal)，如N-末端线粒体导向信号或其他导向信号，如果需要，其可以在转换进入原核宿主细胞之前被去除。例如，线粒体前导序列的去除导致了大肠杆菌中表达的上调(Hoffmeister等人,J.Biol.Chem.280:4329-4338(2005))。对于酵母或其他真核细胞中的外源性表达，可以在胞质溶胶中表达基因，而不添加前导序列；或者可以通过添加适于宿主细胞的合适的导向序列(如线粒体导向或分泌信号)将基因导向线粒体或其他细胞器。因此，应理解，对核酸序列的适当的以去除或包含导向序列的修改可被纳入外源性核酸序列中，以提供所需的特性。此外，以本领域熟知的技术可以使基因经受密码子优化，以实现蛋白质的优化表达。
表达载体可以被构建以包括如本文所示范的可操作地连接于宿主生物中功能性的表达调控序列的一种或多种4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺生物合成途径和/或一种或者多种生物合成编码核酸。适用于本发明的宿主微生物的表达载体包括，例如质粒、噬菌体载体、病毒载体、附加体和人工染色体(包括可操作地用以稳定地整合到宿主染色体的载体和选择序列或标记)。此外，该表达载体可以包括一种或多种选择标记基因和适当的表达调控序列。还可以包括，例如提供抗生素或毒素抗性、补充营养缺陷或者提供培养基中没有的关键营养物的选择标记基因。表达调控序列可以包括组成型和诱导型启动子、转录增强子、转录终止子以及本领域熟知的诸如此类的表达调控序列。当两个或两个以上外源性编码核酸被共同表达时，两个核酸都可以被插入，例如单一表达载体或独立表达载体。对于单一载体表达，编码核酸可被可操作地连接到一个共同的表达调控序列或连接到不同的表达调控序列，如一个诱导型启动子和一个组成型启动子。可以利用本领域熟知的方法确定代谢或合成途径中涉及的外源性核酸序列的转化。这类方法包括，例如核酸分析法，如Northern印迹法或mRNA聚合酶链反应(PCR)扩增；或基因产物表达免疫印迹法；或其他合适的测试引入核酸序列或其相应的基因产物的表达的分析方法。本领域的技术人员应理解，以足以生产所需产品的量来表达外源性核酸以及进一步应理解，可以利用本领域熟知的和本文披露的方法优化表达水平以获得足够的表达。
利用本领域熟知的方法如本文所示范构建本发明所述的非天然存在的微生物，以以足够的量外源性表达编码4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺途径酶的至少一种核酸，以生产4-HB，如单体4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺。应理解，在足以生产4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺的条件下培养本发明的所述微生物。下文实施例中进一步描述了每种途径中的4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺酶的示例性表达水平。遵循本文提供的启示和指导，本发明所述的非天然存在的微生物可以实现4-HB(如单体4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺)的生物合成，产生在约0.1-200mM或以上(例如0.1-25mM或以上)之间的细胞内浓度。一般地，4-HB(如单体4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺)的细胞内浓度在约3-150mM或以上之间，特别地在约5-125mM或以上之间以及更特别地在约8-100mM之间，例如，约3-20mM，尤其在约5-15mM之间以及更特别地在约8-12mM之间，包括约10mM、20mM、50mM、80mM或以上。也可以从本发明的所述非天然存在的微生物获得这些示例性范围的每个之间和以上的细胞内浓度。在具体的实施方式中，本发明的所述微生物，尤其是菌株(如本文披露的那些菌株)(见实施例XII-XIX和表28)，可以通过提高4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺的生产和/或减少不需要的副产物而提供所需产品(如4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺)的改善生产。这类生产水平包括但不仅限于本文披露的那些生产水平以及包括每升从约1g到约25g，例如每升约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24甚或更多量的产物。
除本文披露的培养和发酵条件之外，用于实现BDO、4-HB、4-HBCoA、4-HBal和/或腐胺的生物合成的培育条件可以包括将渗透保护剂添加到培养条件中。在某些实施方式中，可以在渗透保护剂的存在下如本文所述维持、培养或者发酵本发明所述的非天然存在的微生物。简言之，渗透保护剂指作为渗透物起作用以及帮助如本文所述的微生物经受得住渗透应力的化合物。渗透保护剂包括但不仅限于甜菜碱、氨基酸以及海藻糖。这类渗透保护剂的非限制性的实施例是甘油酸甜菜碱、果仁糖甜菜碱、二甲基噻亭、二甲基锍基丙酸(dimethylsulfoniopropionate)、3-二甲基锍基-2-甲基丙酸、哌可酸、二甲基锍基乙酸、胆碱、L-肉毒碱和四氢嘧啶。在一个方面，该渗透保护剂是甘油酸甜菜碱。本领域的任一普通技术人员应理解，适于保护本文所述的微生物不受渗透应力影响的渗透保护剂的量和类型将取决于所用的微生物。在培养条件下的渗透保护剂的量可以是例如，不多于约0.1mM、不多于约0.5mM、不多于约1.0mM、不多于约1.5mM、不多于约2.0mM、不多于约2.5mM、不多于约3.0mM、不多于约5.0mM、不多于约7.0mM、不多于约10mM、不多于约50mM、不多于约100mM或者不多于约500mM。
在一些实施方式中，培养条件包括厌氧或基本上厌氧培育或维持条件。示例性的厌氧条件已有先前描述并为本领域所熟知。用于发酵过程的示例性的厌氧条件的描述见于本文以及，例如2007年8月10日提交的美国专利申请号US2009/0047719。任何这些条件可以与所述非天然存在的微生物以及本领域熟知的其他厌氧条件一起使用。在这种厌氧或基本上厌氧的条件下，该4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺生产者可以合成细胞内浓度为5-10mM或以上以及本文示例性的所有其他浓度的4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺。应理解，虽然上文的描述指细胞内浓度,生产4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺的微生物可以在细胞内生产4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺和/或分泌产物到培养基内。
培养条件可以包括，例如液体培养程序以及发酵和其他大规模培养程序。如本文所描述，在厌氧或基本上厌氧的培养条件下可以获得本发明生物合成产物的特别有用的收率。
如本文所描述，一种用于实现4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺生物合成的示例性培育条件包括厌氧培养或发酵条件。在某些实施方式中，本发明的所述非天然存在的微生物可以在厌氧或基本上厌氧的条件下维持、培养或发酵。简言之，厌氧条件指缺乏氧的环境。基本上厌氧的条件包括，例如培养菌分批发酵或连续发酵以便培养基中溶解的氧浓度保持在0和10％的饱和度之间。基本上厌氧的条件还包括在保持在小于1％的氧气氛中的密封室内部的液体培养基中或固体琼脂上培育或静置细胞。可以通过，例如用N2/CO2混合物或一种或多种其他合适的非氧气体喷射培养菌来保持氧的百分比。
本发明还提供一种非天然存在的微生物催化剂，该微生物催化剂包括具有4-羟基丁酸(4-HB)和1,4-丁二醇(BDO)生物合成途径的微生物，所述途径包括编码如下酶的至少一种外源性核酸：4-羟基丁酸酯脱氢酶、非依赖CoA的琥珀半醛脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶、依赖CoA的琥珀半醛脱氢酶、4-羟基丁酸：CoA转移酶、谷氨酸：琥珀半醛转氨酶、谷氨酸脱羧酶、非依赖CoA的醛脱氢酶、依赖CoA的醛脱氢酶或醇脱氢酶，其中该外源性核酸以足以生产1,4-丁二醇(BDO)的量表达。4-羟基丁酸：CoA转移酶也统称为4-羟基丁酰CoA：乙酰基-CoA转移酶。本文还披露了其他4-HB或者BDO途径酶(见实施例和图8-13)。
本发明进一步提供非天然存在的微生物催化剂，该微生物催化剂包括具有4-羟基丁酸(4-HB)和1,4-丁二醇(BDO)生物合成途径的微生物，该途径包括编码如下酶的至少一种外源性核酸：4-羟基丁酸酯脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶、依赖CoA的琥珀半醛脱氢酶、4-羟基丁酸：CoA转移酶、4-丁酸激酶、磷酸丁酰转移酶、α-酮戊二酸脱羧酶、醛脱氢酶、醇脱氢酶或者醛/醇脱氢酶，其中该外源性核酸以足以生产1,4-丁二醇(BDO)的量表达。
还可以生成生物合成BDO的非天然存在的微生物。与本发明的生产4-HB的微生物一样，该生产BDO的微生物也可以在细胞内生产BDO或者分泌BDO到培养基内。遵循前文提供的针对合成4-HB的微生物构建的启示和指导，其他的BDO途径可以被纳入该生产4-HB的微生物，以生成也合成BDO和其他BDO家族化合物的生物。已知BDO及其下游产物的化学合成。本发明的能够生物合成BDO的非天然存在的微生物避免了这些利用4-HB作为入口点的化学合成，如图1所示。如下文进一步所述，4-HB生产者还可用以化学转化4-HB到例如，GBL然后到BDO或者THF。替代性地，4-HB生产者可以进行进一步的修饰，以包括用于转化4-HB和/或GBL到BDO的生物合成能力。
引入4-HB生产者的其他的BDO途径包括，例如宿主缺陷背景内的外源性表达或者图1中示范性的如步骤9-13的一种或者多种酶的过表达。一种这类途径包括例如，执行图1中显示为步骤9、12和13的反应所需的酶活性，其中醛和醇脱氢酶可以是单独的酶或者具有醛和醇脱氢酶活性的多官能酶。另一种这类途径包括例如，执行图1显示为步骤10、11、12和13的反应所需的酶活性，其中醛和醇脱氢酶也可以是单独的酶或者具有醛和醇脱氢酶活性的多官能酶。相应地，该引入4-HB生产者的其他的BDO途径包括，例如宿主缺陷背景内的外源性表达或者一种或者多种如下酶的过表达：4-羟基丁酸：CoA转移酶、丁酸激酶、磷酸丁酰转移酶、非依赖CoA的醛脱氢酶、依赖CoA的醛脱氢酶或者醇脱氢酶。缺少能够修饰4-HB的内源性的酰基-CoA合成酶的情况下，该非天然存在的BDO生产微生物可以进一步包括对4-HB具有选择性的外源性酰基-CoA合成酶或者多种具有作为净反应的从4-HB到4-HB-CoA的转化的酶的组合。如下文实施例进一步示范的，丁酸激酶和磷酸丁酰转移酶显示BDO途径活性以及用4-HB底物催化图1中所示的转化。因此，这些酶在本文中还可以分别被称为4-羟基丁酸激酶和磷酸转羟基丁酰酶。
可用于这些从4-HB到BDO的体内转化的示例性的乙醇和醛脱氢酶列入下文的表1中。
表1.用于4-HB到BDO的转化的乙醇和醛脱氢酶.
本文披露了其他示例性的酶和途径(见实施例)。进一步地，应理解，酶可用于执行底物不是天然底物的反应。虽然非天然底物的活性可能比天然底物的较低，应理解，如本文所披露(还是见实施例)，可以利用定向进化或者适应性进化以自然地存在或者修饰的方式采用这类酶。
通过本文披露的任何所述途径的BDO生产在某种程度上基于适用于从前体到BDO的转化的酶的确认。已经确认大量用于数个所述反应步骤的特异性酶。对于那些其中还未确认对反应前体具有特异性的酶的转换，已经确认最适于催化反应步骤的候选酶。如下文所讨论，已经显示酶对各式各样的底物起作用。此外，蛋白质工程领域的进步使得改变酶以有效地作用于底物(即使是非天然底物)是切实可行的。来自不同类别适用于BDO途径的广泛特异性的酶和已用于酶的进化以作用于非天然底物的方法的例子描述于下文。
BDO途径中一个关键类别的酶是进行酮或醛与醇的相互转化的氧化还原酶(1.1.1)。这个类别的众多示例性酶可以对各式各样的底物起作用。显示，由土壤细菌短杆菌KU1309纯化得到的醇脱氢酶(1.1.1.1)(Hirano等人,J.Biosci.Bioeng.100:318-322(2005))对过量脂肪以及高活性芳族醇起作用。表2示出该酶的活性及其对不同的醇的Km。该酶是可逆的并对多种醛具有非常高的活性(如表3所示)。
表2.来自短杆菌KU的醇脱氢酶氧化各种醇的相对活性.
*2-苯基乙醇的活性(对应19.2U/mg)被视作100％。
表3.来自短杆菌KU1309的醇脱氢酶还原各种羰基化合物的相对活性.
来自富养罗尔斯通氏菌的乳酸脱氢酶(1.1.1.27)是另一已被证明对多种2-氧代酸，如2-氧代丁酸、2-氧代戊酸和2-氧代戊二酸(与2-氧代己二酸类似的C5化合物)具有高活性的酶((Steinbuchel和Schlegel,Eur.J.Biochem.130:329-334(1983))。表4中第2列示出来自富养罗尔斯通氏菌(之前的真养产碱杆菌)的ldhA对不同底物的活性(Steinbuchel和Schlegel,同上，1983)。
表4.富养罗尔斯通氏菌ldhA(Steinbuchel和Schlegel，同上，1983)对不同底物(相比对丙酮酸)的体外活性.
已显示，可以将2-氧代酸转化为其酰基-CoA配对物(1.2.1)的氧化还原酶也接受多个底物。例如，支链2-酮-酸脱氢酶复合物(BCKAD)(也称为2-氧代异戊酸脱氢酶(1.2.1.25))参与支链氨基酸降解途径，将缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的2-酮酸衍生物转化为其酰基-CoA衍生物和CO2。在一些生物(包括褐鼠(Paxton等人,Biochem.J.234:295-303(1986))和酿酒酵母(Sinclair等人,Biochem.Mol.Biol.Int.31:911-922(1993))中，该复合物已被显示具有广泛的底物范围，除支链氨基酸前体之外还包括直链氧代酸，如2-氧代丁酸和α-酮戊二酸。
已有报告称，又有另一类别的酶成员即转氨酶(2.6.1)对多个底物起作用。来自激烈热球菌的天冬氨酸转氨酶(aspAT)已被发现、表征于大肠杆菌并有重组蛋白质表征，以证明该酶对天冬氨酸和α-酮戊二酸具有最高活性，但是对丙氨酸、谷氨酸和芳族氨基酸具有较低但显著的活性(Ward等人,Archaea.1:133-141(2002))。在另一情况下，有报告称一种从墨西哥利什曼原虫中发现的并表征于大肠杆菌中的转氨酶(Vernal等人,FEMSMicrobiol.Lett.229:217-222(2003))具有广泛的底物特异性，分别为对酪氨酸(认为对酪氨酸的活性100％)、对苯基丙氨酸(90％)、对色氨酸(85％)、对天冬氨酸(30％)、对亮氨酸(25％)以及对蛋氨酸(25％)(Vernal等人,Mol.Biochem.Parasitol.96:83-92(1998))。已有报告称，虽然这两种酶的序列同源性仅为6％，来自克氏锥虫的酪氨酸转氨酶具有相似的广泛特异性。后一种酶可以接受亮氨酸、蛋氨酸以及酪氨酸、苯基丙氨酸、色氨酸和丙氨酸作为高效氨基供体(Nowicki等人,Biochim.Biophys.Acta1546:268-281(2001))。
CoA转移酶(2.8.3)已经被证实具有作用于一种以上底物的能力。具体地，CoA转移酶从丙酮丁醇梭菌纯化得到，以及有报告称，其对乙酸、丙酸以及丁酸具有最高活性。它还对戊酸、异丁酸以及巴豆酸具有显著的活性(Wiesenborn等人,Appl.Environ.Microbiol.55:323-329(1989))。在另一研究中，大肠杆菌酶酰基-CoA：乙酸-CoA转移酶(也称为乙酸-CoA转移酶(EC2.8.3.8))已经显示将CoA部分从各种支链和直链酰基-CoA底物转移至乙酸，包括异丁酸(Matthies和Schink,App.Environm.Microbiol.58:1435-1439(1992))、戊酸(Vanderwinkel等人,Biochem.Biophys.ResCommun.33:902-908(1968b))和丁酸酯(Vanderwinkel等人,Biochem.Biophys.ResCommun.33:902-908(1968a)。
其他类别的酶附加地支撑酶的广泛底物特异性。一些异构酶(5.3.3)也已经被证实对多种底物起作用。例如，来自施氏假单胞菌的L-鼠李糖异构酶催化各种醛缩酶(aldoalses)和酮糖之间的异构化(Yoshida等人,J.Mol.Biol.365:1505-1516(2007))。这些包括L-鼠李糖和L-鼠李树胶糖、L-甘露糖和L-果糖、L-木糖和L-木酮糖、D-核糖和D-核酮糖以及D-阿洛糖和D-阿洛酮糖之间的异构化。
在仍然另一类别的酶磷酸转移酶(2.7.1)中，来自大肠杆菌的将L-高丝氨酸转化为L-高丝氨酸磷酸的高丝氨酸激酶(2.7.1.39)被发现使众多的高丝氨酸类似物磷酸化。在这些底物中，位于R位置的羧基官能团已被酯或羟甲基基团替换(Huo和Viola,Biochemistry35:16180-16185(1996))。表5证实了该激酶的广泛底物特异性。
表5.高丝氨酸激酶的底物特异性.
底物 kcat ％kcat Km(mM) kcat/Km
L-高丝氨酸 18.3±0.1 100 0.14±0.04 184±17
D-高丝氨酸 8.3±1.1 32 31.8±7.2 0.26±0.03
L-天冬氨酸β-半醛 2.1±0.1 8.2 0.28±0.02 7.5±0.3
L-2-氨基-1,4-丁二醇 2.0±0.5 7.9 11.6±6.5 0.17±0.06
L-2-氨基-5-羟基戊酸 2.5±0.4 9.9 1.1±0.5 2.3±0.3
L-高丝氨酸甲酯 14.7±2.6 80 4.9±2.0 3.0±0.6
L-高丝氨酸乙酯 13.6±0.8 74 1.9±0.5 7.2±1.7
L-高丝氨酸异丙酯 13.6±1.4 74 1.2±0.5 11.3±1.1
L-高丝氨酸n-丙酯 14.0±0.4 76 3.5±0.4 4.0±1.2
L-高丝氨酸异丁酯 16.4±0.8 84 6.9±1.1 2.4±0.331 -->
L-高丝氨酸n-丁酯 29.1±1.2 160 5.8±0.8 5.0±0.5
可用于BDO途径的另一类别的酶是酸硫醇连接酶(6.2.1)。如同其他类别的酶，该类别的某些酶已被确定具有广泛的底物特异性。例如，来自恶臭假单胞菌的酰基CoA连接酶已被证实对多种脂肪族底物(包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸和辛酸)以及对芳香族化合物(如苯基乙酸和苯氧基乙酸)起作用(Fernandez-Valverde等人,Appl.Environ.Microbiol.59:1149-1154(1993))。一种相关的酶，来自三叶草根瘤菌的丙二酰基CoA合成酶(6.3.4.9)可以将多种二酸(即乙基丙二酸、丙基丙二酸、烯丙基丙二酸、异丙基丙二酸、二甲基丙二酸、环丙基丙二酸、环丙基亚甲基丙二酸、环丁基丙二酸以及苄基丙二酸)转化为其相应的一硫代酯(Pohl等人,J.Am.Chem.Soc.123:5822-5823(2001))。同样，脱羧酶(4.1.1)也已被发现具有广泛的底物范围。丙酮酸脱羧酶(PDC)(也被称为酮酸脱羧酶)是一种在乙醇发酵、催化从丙酮酸到乙醛的脱羧化中的关键酶。从酿酒酵母分离得到的酶对脂肪族2-酮酸(包括2-酮丁酸、2-酮戊酸以及2-苯基丙酮酸)具有广泛的底物范围(Li和Jordan,Biochemistry38:10004-10012(1999))。类似地，苯甲酰基甲酸脱羧酶具有广泛的底物范围以及并已然是酶工程研究的目标。已经对来自恶臭假单胞菌的酶进行广泛研究并得到这种酶的晶体结构(Polovnikova等人,Biochemistry42:1820-1830(2003)；Hasson等人,Biochemistry37:9918-9930(1998))。支链α-酮酸脱羧酶(BCKA)已显示对链长从3到6个碳不等的各种化合物起作用(Oku和Kaneda，J.Biol.Chem.263:18386-18396(1998)；Smit等人,Appl.Environ.Microbiol.71:303-311(2005b))。已经将乳酸乳球菌中的酶表征于各种支链和直链底物(包括2-氧代丁酸、2-氧代己酸、2-氧代戊酸、3-甲基-2-氧代丁酸、4-甲基-2-氧代丁酸和异已酸)(Smit等人,Appl.Environ.Microbiol.71:303-311(2005a)。
有趣的是，已知具有一种主导活性的酶也已被报道催化非常不同的功能。例如，来自嗜热脂肪芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的依赖辅因子的磷酸甘油酸变位酶(5.4.2.1)已知也作为磷酸酶起作用(Rigden等人,ProteinSci.10:1835-1846(2001))。来自嗜热脂肪芽孢杆菌的酶已知对多种底物具有活性，包括3-磷酸甘油酸、α-萘基磷酸、p-硝基苯基磷酸、AMP、果糖-6-磷酸、核糖-5-磷酸和CMP。
在这些例子中所述酶自然地具有广泛的底物特异性，与此形成对照的是，很多酶已通过利用定向进化进行修饰，以扩大其对于其非天然底物的特异性。替代地，酶的底物优选性也已通过利用定向进化进行改变。因此，对给定的酶进行设计以发挥高效的作用(对一种天然底物的，例如改善效率或者对一种非天然底物的，例如提高效率)是可行的。例如，已有报告称，来自绿脓假单胞菌的脂肪酶的对映选择性得到了显著的改善(Reetz等人,Agnew.Chem.Int.EdEngl.36:2830-2832(1997))。这种酶以有利于(S)酸的仅2％的对映体过量(ee)水解了对硝基苯基2-甲基癸酸。然而，连续四轮易错诱变和筛选后，产生了以81％ee催化必不可少的反应的变体(Reetz等人,Angew.Chem.Int.EdEngl.36:2830-2832(1997))。
定向进化方法已被用以对酶进行修饰以对大量的非天然底物起作用。绿脓假单胞菌中的脂肪酶的底物特异性通过对活性位点附近的氨基酸残基随机化得到了扩大。这允许该酶接受α-取代的羧酸酯(Reetz等人,Agnew.Chem.Int.EdEngl.44:4192-4196(2005))。在另一成功的尝试中，采用了DNA改组，以产生大肠杆菌转氨酶，所述酶接受了对于野生型酶来说接受性很差的β-支链底物(Yano等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A95:5511-5515(1998))。具体而言，四轮改组结束时，天冬氨酸转氨酶对于缬氨酸和2-氧代缬氨酸的活性增加了五个数量级之多，而对于天然底物天冬氨酸的活性降低了30倍之多。最近，一种算法被用以设计逆醛醇酶(retro-aldolase)，所述酶可用以催化非天然和非生物底物4-羟基-4-(6-甲氧基-2-萘基)-2-丁酮中的碳-碳键断裂(Jiang等人,Science319:1387-1391(2008))。这些算法利用四个不同的催化motif的不同组合来设计新型酶以及用于实验表征的20个选定设计相比未催化的反应具有四倍的改善率(Jiang等人,Science319:1387-1391(2008))。因此，这些工程方法不仅能够扩展酶可以起作用的底物阵列，而且它们允许设计和构建非常高效的酶。例如，有报告称，一种DNA改组方法(临时模板随机嵌合生长或RACHITT)产生一种设计的单加氧酶，所述酶具有改善的复合物底物脱硫率以及改善20倍的非天然底物转化速率(Coco等人.Nat.Biotechnol.19:354-359(2001))。同样，迟缓突变磷酸丙糖异构酶的比活改善了1.3倍乃至19倍(Hermes等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A87:696-700(1990))。通过利用在蛋白质的整体长度之上的随机诱变完成了比活的增加以及该改善可以追溯至六个氨基酸残基中的突变。
蛋白质工程方法在针对所需底物改变酶的底物特异性方面的有效性也已经得以证实。来自嗜热栖热菌的异丙基苹果酸脱氢酶通过改变靠近活性位点的残基得以修饰，以便其现在可以对作为底物的苹果酸和D-乳酸起作用(Fujita等人,Biosci.BiotechnolBiochem.65:2695-2700(2001))。该研究以及其他研究中指出可以修饰一个或几个残基，以改变底物特异性。一个实例是二氢黄酮醇4-还原酶，其单氨基酸在假定的底物结合区域被改变以及其可以优先地还原二氢山奈酚(Johnson等人,PlantJ.25:325-333(2001))。来自大肠杆菌的非常特异性的异柠檬酸脱氢酶的底物特异性通过改变活性位点的一个残基从异柠檬酸改变为异丙基苹果酸(Doyle等人,Biochemistry40:4234-4241(2001))。同样地，NAD+-依赖的1,5-羟基前列腺素脱氢酶的辅因子特异性通过改变N-末端附近的几个残基得以改变为NADP+(Cho等人,Arch.Biochem.Biophys.419:139-146(2003))。序列分析和分子建模分析被用以识别用于修饰的关键残基，其进一步通过定点诱变得到研究。
存在范围涉及不同类别的酶的大量实施例，其中对酶的功能进行改变以使得该酶对一种非天然底物比对其天然底物有利。通过DNA改组和筛选从大肠杆菌中的半乳糖苷酶进化得到岩藻糖苷酶(Zhang等人,ProcNatlAcadSciUS.A94:4504-4509(1997))。同样，利用同源建模和定点诱变将来自大肠杆菌的天冬氨酸转氨酶转化为酪氨酸转氨酶(Onuffer等人.,ProteinSci.4:1750-1757(1995))。来自恶臭假单胞菌的苯甲酰基甲酸脱羧酶的活性位点中两个残基的定点诱变改变了对于天然和非天然底物的亲和性(Km)(Siegert等人,ProteinEngDesSel18:345-357(2005))。来自酿酒酵母的细胞色素C过氧化物酶(CCP)经受定向分子进化，以生成针对传统的过氧化物酶底物愈创木酚具有增加的活性的突变体，从而将CCP的底物特异性从蛋白质细胞色素c改变为小的有机分子。三轮DNA改组和筛选后，分离相比针对天然底物，具有针对愈创木酚增加300倍活性以及对于这种底物增加达1000倍特异性的突变体(Iffland等人,Biochemistry39:10790-10798(2000))。
在某些情况下，已经获得具有不同于两亲本酶的任何一个的底物优选性的酶。例如，通过改组来自两种细菌类产碱假单胞菌和洋葱伯克霍尔德菌的基因改善联苯-加双氧酶-介导的多氯联苯的降解(Kumamaru等人,Nat.Biotechnol16,663-666(1998))。所得的嵌合联苯加氧酶显示了不同于两亲本酶的底物优选性以及提高了对于相关联苯化合物和单环芳烃(如甲苯和苯)的降解活性，所述联苯化合物和单环芳烃对该酶来说最初是不良的底物。
这不仅可能改变酶特异性，而且可能提高对于自然状态的酶对其具有低活性的那些底物的活性。一项研究证明，通过随机诱变可以显著地改善来自恶臭假单胞菌的(尤其对赖氨酸、精氨酸、丙氨酸、丝氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、亮氨酸和组氨酸)具有广泛的底物特异性但是对色氨酸具有低活性的氨基酸消旋酶(Kino等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.73:1299-1305(2007))。同样，牛BCKAD的活性位点被设计以支持替代性的底物乙酰基-CoA(Meng和Chuang,Biochemistry33:12879-12885(1994))。这些方法的一个有趣的方面是即使当已经用随机方法生成这些具有有效活性的突变酶时，可以确定赋予活性改善的确切的突变或结构改变。例如，在前述的研究中，促进改善对于色氨酸的活性的突变可以追溯到两个不同的位置。
定向进化也已被用以表达难以表达的蛋白质。例如，通过使辣根过氧化物酶经受随机诱变和基因重组，可以确认活性是野生型14倍以上的突变体(Lin等人,Biotechnol.Prog.15:467-471(1999))。
定向进化的另一个例子显示广泛的修饰，可以使酶经受该修饰以获得一系列的所需功能。使酶，即来自嗜热脂肪芽胞杆菌的乳酸脱氢酶经受了定点诱变，以及在被指出以确定对于不同的羟基酸的特异性的位点进行了三个氨基酸置换(Clarke等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.148:15-23(1987))。这些突变之后，对草酰乙酸比对丙酮酸的特异性增加到500，与野生型酶对丙酮酸比对草酰乙酸的催化特异性1000形成对照。利用定点诱变进一步将这种酶设计为具有针对支链取代的丙酮酸的活性(Wilks等人,Biochemistry29:8587-8591(1990))。具体而言，该酶对于α-酮异已酸的Kcat改善了55倍。在同一酶中进行三个结构修饰，以将其底物特异性从乳酸改至苹果酸。该酶对于苹果酸具有高活性和特异性(Wilks等人,Science242:1541-1544(1988))。随后对来自嗜热脂肪芽胞杆菌的同一种酶进行设计，使其对带正电荷侧链的α-酮酸(如包含铵基的那些)具有高催化活性(Hogan等人,Biochemistry34:4225-4230(1995))。在酶的102位置引入酸性氨基酸的突变体支持这种侧链铵基的结合。所得的结果证明该突变体显示了对于ω-氨基-α-酮酸底物的kcat/Km值的高达25倍改善。有趣的是，这种酶还进行了结构修饰，以作为苯基乳酸脱氢酶而非作为乳酸脱氢酶起作用(Wilks等人,Biochemistry31:7802-7806(1992))。将限制位点引入针对该酶的基因，这允许基因区域的切除。该区域编码多肽的移动表面环(残基98-110)，其通常密封来自大量溶剂的活性位点，而且是底物特异性的主要决定簇。插入可变的长度和序列环，以便生成具有改变的底物特异性的羟基酸脱氢酶。在构建一个更长的环的情况下，对丙酮酸的活性被降低了一百万倍，但是对苯基丙酮酸的活性在很大程度上并未改变。获得了390,000倍的特异性(Kcat/Km)转变。这种酶对于苯基丙酮酸与对于丙酮酸的1700:1选择性正是苯基乳酸脱氢酶所需要的。上文所述的研究表明，酶工程各种方法可用以获得如本文所披露的用于BDO途径的酶。
如本文所披露，可以利用从大量中心代谢中间体到1,4-丁二醇的生物合成途径，包括乙酰基-CoA、琥珀酰-CoA、α-酮戊二酸、谷氨酸、4-氨基丁酸、以及高丝氨酸。乙酰基-CoA、琥珀酰-CoA和α-酮戊二酸是三羧酸(TCA)循环(以全部形式存在于几乎所有的利用氧进行细胞呼吸的活细胞中以及以截短形式存在于大量厌氧生物中的一系列反应)的常用中间体。谷氨酸是一种经由谷氨酸脱氢酶或者大量转氨反应的任何一种而衍生自α-酮戊二酸的氨基酸(见图8B)。4-氨基丁酸可以通过谷氨酸脱羧化(见图8B)或经由图9C中披露的途径从乙酰乙酰基-CoA形成。乙酰乙酰基-CoA是通过酶，乙酰基-辅酶A乙酰基转移酶或者等同地，乙酰乙酰基-辅酶A硫解酶从两种乙酰基-CoA分子的缩合衍生得到的。高丝氨酸是苏氨酸和蛋氨酸代谢中的中间体，经由天冬氨酸从草酰乙酸形成。草酰乙酸到高丝氨酸的转化需要一种NADH、两种NADPH以及一种ATP。
除了上文示范性的那些途径，其他途径也可用以在非天然存在的微生物中进行BDO的生物合成。在一个实施方式中，可以利用L-高丝氨酸到BDO的途径实现生物合成(见图13)。这种途径具有0.90mol/mol葡萄糖的摩尔收率，这似乎受还原当量可用性的限制。第二种途径从乙酰乙酰基-CoA合成BDO以及能够实现1.091mol/mol葡萄糖的最大理论收率(见图9)。可以通过将两种外源酶引入宿主生物(如大肠杆菌)实施两种途径的任何一种，以及两种途径均可以另外经由琥珀酰-CoA对BDO的生产做个补充。下文对途径酶、热力学、理论收率和整体可行性进行进一步描述。
高丝氨酸途径还可以被设计以生成产BDO的微生物。高丝氨酸是苏氨酸和蛋氨酸代谢中的中间体，经由天冬氨酸从草酰乙酸形成。草酰乙酸到高丝氨酸的转化需要一种NADH、两种NADPH以及一种ATP(图2)。高丝氨酸一旦形成，便将其送入苏氨酸和蛋氨酸两者的生物合成途径。在大部分生物中，高水平的苏氨酸或者蛋氨酸反过来抑制高丝氨酸的生物合成途径(Caspi等人,NucleicAcidsRes.34:D511-D516(1990))。
高丝氨酸到4-羟基丁酸盐(4-HB)的转换可以在如本文所述的两个酶步骤中得以完成。这种途径的第一个步骤是通过假定的解氨酶对高丝氨酸进行脱氨基化。在步骤2中，消耗一种NADH并通过假定的还原酶将产物烯烃，4-羟基丁-2-烯酸还原为4-HB。然后可以把4-HB转化为BDO。
本文披露了可用于催化上述转换的酶。例如，所述途径的步骤1中的解氨酶非常类似于化学品天冬氨酸解氨酶(天冬氨酸酶)。天冬氨酸酶是一种广泛分布在微生物中的酶，以及已进行广泛表征(Viola,R.E.,Mol.Biol.74:295-341(2008))。大肠杆菌天冬氨酸酶的晶体结构已得到解析(Shi等人,Bio化学品36:9136-9144(1997))，因此有可能在该酶的活性位点中直接进行可能将其底物特异性改变为包括高丝氨酸的突变的设计。步骤2中的氧化还原酶具有的化学品与多种在大肠杆菌TCA循环中包括延胡索酸还原酶的良好表征的酶类似。由于这种反应的热力学非常有利，具有广泛的底物特异性的内源性还原酶将很可能具有还原4-羟基丁-2-烯酸的能力。厌氧条件下这种途径的收率是0.9molBDO/mol葡萄糖。
发现琥珀酰-CoA途径由于其具有更高的能源利用率这一事实而具有较高的收率。经由高丝氨酸途径从一种草酰乙酸分子到BDO的转化将需要消耗2ATP当量。假设PEP羧基激酶是可逆的，葡萄糖到两种草酰乙酸分子的转化可以生成最大量的3ATP分子，因此经由高丝氨酸的从葡萄糖到BDO的整体转化具有负能源收率。如预料的一样，如果假设能源可以经由呼吸生成，高丝氨酸途径的最大收率增至1.05mol/mol葡萄糖，这是琥珀酰-CoA途径收率的96％。琥珀酰-CoA途径可以引导一些碳通量通过丙酮酸脱氢酶以及TCA循环的氧化支路以生成还原当量和琥珀酰-CoA，而未消耗能源。因此，它没有遭受与高丝氨酸途径相同的能源难题，因为并非所有的通量被引导通过草酰乙酸到琥珀酰-CoA到BDO。总的来说，高丝氨酸途径证实是通向BDO的高收率路径。
乙酰乙酸途径也可以被设计以生成产BDO的微生物。乙酰乙酸可以通过脂肪酸代谢中涉及的酶从乙酰基-CoA形成，包括乙酰基-CoA乙酰基转移酶和乙酰乙酰基-CoA转移酶。通过乙酰乙酸的生物合成路径对于可以代谢单碳化合物(如一氧化碳、二氧化碳或者甲醇)以形成乙酰基-CoA的微生物也尤其有用。
从乙酰乙酰基-CoA到4-氨基丁酸的三步路径(见图9C)可用以通过乙酰乙酰基-CoA合成BDO。4-氨基丁酸可以被转化为琥珀半醛，如图8B所示。琥珀半醛(其通过一个还原步骤从琥珀酰-CoA得到或者通过一个脱羧步骤从α-酮戊二酸得到)可以遵循三个还原步骤被转化为BDO(图1)。简言之，这种途径的步骤1涉及通过，例如，由atoA和atoD基因编码的大肠杆菌乙酰乙酰基-CoA转移酶从乙酰乙酰基-CoA到乙酰乙酸的转化(Hanai等人,Appl.Environ.Microbiol.73:7814–7818(2007))。乙酰乙酰基-CoA生物途径的步骤2需要通过ω-氨基转移酶从乙酰乙酸到3-氨基丁酸的转化。来自反硝化产碱菌的ω-氨基酸：丙酮酸氨基转移酶(ω-APT)在大肠杆菌中过表达以及显示对3-氨基丁酸具有高体外活性(Yun等人,Appl.Environ.Microbiol.70:2529-2534(2004))。
在步骤2中，假定的氨基变位酶将氨基从碳骨架的位置3移动至位置4。对3-氨基丁酸具有这种功能的氨基变位酶还未被表征，但是来自斯蒂克兰德氏梭菌的酶具有非常类似的机理。赖氨酸生物合成中涉及一种酶D-赖氨酸-5,6-氨基变位酶。
从乙酰乙酰基-CoA到BDO的合成路径经过4-氨基丁酸，一种在大肠杆菌中通常通过谷氨酸脱羧形成的代谢产物。4-氨基丁酸一旦形成便可以通过4-氨基丁酸转氨酶(2.6.1.19)(一种已有生化表征的酶)被转化为琥珀半醛。
选择这种途径中的候选酶的一个考虑是步骤2和3中涉及的酶的立体选择性。反硝化产碱菌中的ω-ABT对3-氨基丁酸的L-立体异构体具有特异性，而D-赖氨酸-5,6-氨基变位酶很可能需要D-立体异构体。如果起初未发现或者设计具有互补的立体选择性的酶，可以将第三种酶加入可以将L-3-氨基丁酸转化为D-3-氨基丁酸、具有消旋酶活性的途径中。虽然氨基酸消旋酶分布广泛，这些酶是否可以作用于ω-氨基酸是未知的。
厌氧条件下这种途径的最大理论摩尔收率是1.091mol/mol葡萄糖。为了生成从乙酰乙酰基-CoA到BDO的通量，有必要假设乙酰基-CoA：乙酰乙酰基-CoA转移酶是可逆的。这种酶在大肠杆菌中的作用是通过首先将短链脂肪酸第一转化为硫酯而对其进行代谢。
虽然还未在大肠杆菌中用实验验证乙酰基-CoA：乙酰乙酰基-CoA转移酶按消耗乙酸的方向起作用，在其他生物中对类似酶的研究支持这种反应是可逆的假设。在肠道微生物Roseburia菌属和F.prasnitzii中的酶丁酰-CoA：乙酸：CoA转移酶按利用乙酸的方向起作用以生产丁酸盐(Duncan等人,Appl.Environ.Microbiol68:5186-5190(2002))。另一种非常类似的酶，在布氏锥虫中的乙酰基：琥珀酸CoA-转移酶也按利用乙酸的方向起作用。这种反应具有接近平衡值的ΔrxnG，如此高浓度的乙酸很可能能够促使反应按所需的方向进行。在最大理论的BDO生产率为1.09mol/mol葡萄糖的情况下，模拟预测大肠杆菌可以生成1.098molATP/mol葡萄糖，而无发酵副产物。这种ATP收率对细胞培养、维持以及生产应该是足够的。该乙酰乙酰基-CoA生物途径是从乙酰基-CoA到BDO的高收率路径。
因此，除了前文示范的用于在选定的宿主中进行4-HB生物合成的任何各种修饰之外，所述产BDO的微生物还可以包括前文4-HB途径代谢修饰的任何组合和排列以及非依赖CoA的醛脱氢酶、依赖CoA的醛脱氢酶或者醇脱氢酶或者本文披露的其他酶的任何表达组合，以生成GBL和/或BDO的生物合成途径。因此，本发明的BDO生产者可以具有，例如，对应本文披露的任何所述4-HB途径和/或任何所述BDO途径酶的一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种甚或所有的酶的外源性表达。
利用本领域熟知的方法进行基因修饰的微生物的设计和构建，以实现足以生产BDO的量的表达。具体地，本发明所述的非天然存在的微生物可以实现BDO的生物合成，产生如上文所讨论的，在约0.1-200mM或者以上(如约0.1-25mM或者以上)之间的细胞内浓度。例如，BDO的细胞内浓度在约3-20mM之间，尤其在约5-15mM之间以及更尤其在约8-12mM之间，包括约10mM或者以上。也可以从本发明的所述非天然存在的微生物获得这些示例性范围的每个之间和以上的细胞内浓度。与4-HB生产者一样，BDO生产者也可以在厌氧条件下维持、培养或者发酵。
本发明进一步提供一种用于生产4-HB的方法。该方法包括在基本上厌氧条件下，培养一种具有4-羟基丁酸(4-HB)生物合成途径的非天然存在的微生物达足够长的时间到生产单体4-羟基丁酸(4-HB)，该途径包括编码如下酶的至少一种外源性核酸：4-羟基丁酸酯脱氢酶、非依赖CoA的琥珀半醛脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶、依赖CoA的琥珀半醛脱氢酶、谷氨酸：琥珀半醛转氨酶、α-酮戊二酸脱羧酶或者谷氨酸脱羧酶。该方法可以另外包括例如，4-HB到GBL以及到BDO或者THF的化学转化。
另外提供了一种用于生产4-HB的方法。该方法包括在基本上厌氧条件下培养一种具有4-羟基丁酸(4-HB)生物合成途径的非天然存在的微生物达足够长的时间以生产单体4-羟基丁酸(4-HB)，该途径包括编码如下酶的至少一种外源性核酸：4-羟基丁酸酯脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶、依赖CoA的琥珀半醛脱氢酶或者α-酮戊二酸脱羧酶。可以分泌4-HB产物到培养基。
进一步提供了一种用于生产BDO的方法。该方法包括培养一种非天然存在的微生物催化剂或者微生物达足够长的时间以生产1,4-丁二醇(BDO)，该微生物催化剂或者微生物包括具有4-羟基丁酸(4-HB)和1,4-丁二醇(BDO)生物合成途径的微生物，该途径包括编码如下酶的至少一种外源性核酸：4-羟基丁酸酯脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶、依赖CoA的琥珀半醛脱氢酶、4-羟基丁酸：CoA转移酶、4-羟基丁酸激酶、磷酸转羟基丁酰酶、α-酮戊二酸脱羧酶、醛脱氢酶、醇脱氢酶或者醛/醇脱氢酶。可以分泌BDO产物到培养基。
另外提供用于通过培养一种具有本发明的BDO途径的非天然存在的微生物来生产BDO的方法。该BDO途径可以包括编码以足以生产BDO的量、在一定条件下以及足以生产BDO这么长的时间表达的BDO通路酶的至少一种外源性核酸，该BDO途径包括4-氨基丁酸CoA转移酶、4-氨基丁酰-CoA水解酶、4-氨基丁酸-CoA连接酶、4-氨基丁酰-CoA氧化还原酶(脱氨基)、4-氨基丁酰-CoA转氨酶或者4-羟基丁酰-CoA脱氢酶(见实施例VII和表17)。
替代性地，该BDO途径可以包括编码以足以生产BDO的量、在一定条件下以及足以生产BDO这么长的时间表达的BDO通路酶的至少一种外源性核酸，该BDO途径包括4-氨基丁酸CoA转移酶、4-氨基丁酰-CoA水解酶、4-氨基丁酸-CoA连接酶、4-氨基丁酰-CoA还原酶(醇形成)、4-氨基丁酰-CoA还原酶、4-氨基-1-丁醇脱氢酶、4-氨基-1-丁醇氧化还原酶(脱氨基)或者4-氨基-1-丁醇转氨酶(见实施例VII和表18)。
此外，本发明提供一种用于生产BDO的方法，该方法包括在一定条件下培养一种具有BDO途径的非天然存在的微生物达足够长的时间以生产BDO，该途径包括编码以足以生产BDO的量表达的BDO途径酶的至少一种外源性核酸，该BDO途径包括4-氨基丁酸激酶、4-氨基丁醛脱氢酶(磷酸化)、4-氨基-1-丁醇脱氢酶、4-氨基-1-丁醇氧化还原酶(脱氨基)、4-氨基-1-丁醇转氨酶、[(4-氨基丁酰基)氧基]磷酸氧化还原酶(脱氨基)、[(4-氨基丁酰基)氧基]磷酸转氨酶、4-羟基丁酰-磷酸脱氢酶或者4-羟基丁醛脱氢酶(磷酸化)(见实施例VII和表19)。
本发明进一步提供一种用于生产BDO的方法，该方法包括在一定条件下培养一种具有BDO途径的非天然存在的微生物达足够长的时间以生产BDO，该途径包括编码以足以生产BDO的量表达的BDO途径酶的至少一种外源性核酸，该BDO途径包括α-酮戊二酸5-激酶、2,5-二氧代戊酸半醛脱氢酶(磷酸化)、2,5-二氧代戊酸还原酶、α-酮戊二酸CoA转移酶、α-酮戊二酰基-CoA水解酶、α-酮戊二酰基-CoA连接酶、α-酮戊二酰基-CoA还原酶、5-羟基-2-氧代戊酸脱氢酶、α-酮戊二酰基-CoA还原酶(醇形成)、5-羟基-2-氧代戊酸脱羧酶或者5-羟基-2-氧代戊酸脱氢酶(脱羧)(见实施例VIII和表20)。
本发明另外提供一种用于生产BDO的方法，该方法包括在一定条件下培养一种具有BDO途径的非天然存在的微生物达足够长的时间以生产BDO，该途径包括编码以足以生产BDO的量表达的BDO途径酶的至少一种外源性核酸，该BDO途径包括谷氨酸CoA转移酶、谷氨酰基-CoA水解酶、谷氨酰基-CoA连接酶、谷氨酸5-激酶、谷氨酸-5-半醛脱氢酶(磷酸化)、谷氨酰基-CoA还原酶、谷氨酸-5-半醛还原酶、谷氨酰基-CoA还原酶(醇形成)、2-氨基-5-羟基戊酸氧化还原酶(脱氨基)、2-氨基-5-羟基戊酸转氨酶、5-羟基-2-氧代戊酸脱羧酶、5-羟基-2-氧代戊酸脱氢酶(脱羧)(见实施例IX和表21)。
本发明另外包括一种用于生产BDO的方法，该方法包括在一定条件下培养一种具有BDO途径的非天然存在的微生物达足够长的时间以生产BDO，该途径包括编码以足以生产BDO的量表达的BDO途径酶的至少一种外源性核酸，该BDO途径包括3-羟基丁酰-CoA脱氢酶、3-羟基丁酰-CoA脱水酶、乙烯乙酰基-CoAΔ-异构酶或者4-羟基丁酰-CoA脱水酶(见实施例X和表22)。
还提供了一种用于生产BDO的方法，该方法包括在一定条件下培养一种具有BDO途径的非天然存在的微生物达足够长的时间以生产BDO，该途径包括编码以足以生产BDO的量表达的BDO途径酶的至少一种外源性核酸，该BDO途径包括高丝氨酸脱氨酶、高丝氨酸CoA转移酶、高丝氨酸-CoA水解酶、高丝氨酸-CoA连接酶、高丝氨酸-CoA脱氨酶、4-羟基丁-2-烯酰基-CoA转移酶、4-羟基丁-2-烯酰基-CoA水解酶、4-羟基丁-2-烯酰基-CoA连接酶、4-羟基丁-2-烯酸还原酶、4-羟基丁酰-CoA转移酶、4-羟基丁酰-CoA水解酶、4-羟基丁酰-CoA连接酶或者4-羟基丁-2-烯酰基-CoA还原酶(见实施例XI和表23)。
本发明另外提供一种用于生产BDO的方法，该方法包括在一定条件下培养一种具有BDO途径的非天然存在的微生物达足够长的时间以生产BDO，该途径包括编码以足以生产BDO的量表达的BDO途径酶的至少一种外源性核酸，该BDO途径包括琥珀酰-CoA还原酶(醇形成)、4-羟基丁酰-CoA水解酶、4-羟基丁酰-CoA连接酶、4-羟基丁醛脱氢酶(磷酸化)。这类BDO途径可以进一步包括琥珀酰-CoA还原酶、4-羟基丁酸脱氢酶、4-羟基丁酰-CoA转移酶、4-羟基丁酸激酶、磷酸转-4-羟基丁酰酶、4-羟基丁酰-CoA还原酶、4-羟基丁酰-CoA还原酶(醇形成)或者1,4-丁二醇脱氢酶。
还提供了一种用于生产BDO的方法，该方法包括在一定条件下培养一种具有BDO途径的非天然存在的微生物达足够长的时间以生产BDO，该途径包括编码以足以生产BDO的量表达的BDO途径酶的至少一种外源性核酸，该BDO途径包括谷氨酸脱氢酶、4-氨基丁酸氧化还原酶(脱氨基)、4-氨基丁酸转氨酶、谷氨酸脱羧酶、4-羟基丁酰-CoA水解酶、4-羟基丁酰-CoA连接酶、4-羟基丁醛脱氢酶(磷酸化)。
本发明另外提供利用本文披露的基因修饰的生物生产所需产品的方法，所述基因修饰的生物允许通过增加产品或者减少不需要的副产物来改善所需产品(如BDO)的生产。因此，本发明提供一种用于生产1,4-丁二醇(BDO)的方法，该方法包括在一定条件下培养本文披露的所述非天然存在的微生物达足够长的时间以生产BDO。在一个实施方式中，本发明提供一种利用一种非天然存在的微生物生产BDO的方法，该微生物包括具有1,4-丁二醇(BDO)途径的微生物，该途径包括编码以足以生产BDO的量表达的BDO途径酶的至少一种外源性核酸。在一个实施方式中，该微生物通过基因修饰以表达外源琥珀酰-CoA合成酶(见实施例XII)。例如，该琥珀酰-CoA合成酶可以由大肠杆菌sucCD基因编码。
在另一实施方式中，该微生物通过基因修饰以表达外源性α-酮戊二酸脱羧酶(见实施例XIII)。例如，该α-酮戊二酸脱羧酶可以由牛结核分支杆菌sucA基因编码。在仍然另一实施方式中，该微生物通过基因修饰以表达外源性琥珀酸半醛脱氢酶和4-羟基丁酸脱氢酶以及可选地4-羟基丁酰-CoA/乙酰基-CoA转移酶(见实施例XIII)。例如，该琥珀酸半醛脱氢酶(CoA-依赖的)、4-羟基丁酸脱氢酶和4-羟基丁酰-CoA/乙酰基-CoA转移酶可以由牙龈红棕色单胞菌W83基因编码。在其他的实施方式中，该微生物通过基因修饰以表达外源性丁酸激酶和磷酸丁酰转移酶(见实施例XIII)。例如，该丁酸激酶和磷酸丁酰转移酶可以由丙酮丁醇梭菌buk1和ptb基因编码。
在仍然另一实施方式中，该微生物通过基因修饰以表达外源性4-羟基丁酰-CoA还原酶(见实施例XIII)。例如，该4-羟基丁酰-CoA还原酶可以由拜氏梭菌ald基因编码。另外，在本发明的实施方式中，该微生物通过基因修饰以表达外源性4-羟基丁醛还原酶(见实施例XIII)。例如，该4-羟基丁醛还原酶可以由热葡糖苷酶地芽孢杆菌adh1基因编码。在另一实施方式中，该微生物通过基因修饰以表达外源性丙酮酸脱氢酶亚基(见实施例XIV)。例如，该外源性丙酮酸脱氢酶可以是NADH不敏感的。该丙酮酸脱氢酶亚基可以由肺炎克雷伯氏杆菌lpdA基因编码。在具体的实施方式中，该微生物的丙酮酸脱氢酶亚基基因可以在丙酮酸甲酸裂解酶启动子的控制下。
在仍然另一实施方式中，该微生物通过基因修饰以中断好氧的呼吸控制调节系统的编码基因(见实施例XV)。例如，该中断可以是对arc基因的中断。这类生物可以进一步包括编码苹果酸脱氢酶的基因的中断。在进一步的实施方式中，该微生物通过基因修饰以表达外源性NADH不敏感的柠檬酸合酶(见实施例XV)。例如，该NADH不敏感的柠檬酸合酶可以由gltA(如gltA的R163L突变体)编码。在仍然另一实施方式中，该微生物通过基因修饰以表达外源性磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶(见实施例XVI)。例如，该磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶可以由流感嗜血杆菌磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶基因编码。应理解，同样可以通过适当的修饰利用本文示范性的用于改善BDO生产的菌株，以生产其他所需的产品，例如本文披露的4-羟基丁酸盐或者其他所需的产品。
本发明另外提供一种用于通过培养一种非天然存在的微生物来生产4-羟基丁醛的方法，该微生物包括4-羟基丁醛途径，该途径包括编码以足以生产4-羟基丁醛的量表达的4-羟基丁醛途径酶的至少一种外源性核酸，该4-羟基丁醛途径包括琥珀酰-CoA还原酶(醛形成)；4-羟基丁酸脱氢酶；以及4-羟基丁酸还原酶(见图58，步骤A-C-D)。本发明还提供一种用于通过培养一种非天然存在的微生物来生产4-羟基丁醛的方法，该微生物包括4-羟基丁醛途径，该途径包括编码以足以生产4-羟基丁醛的量表达的4-羟基丁醛途径酶的至少一种外源性核酸，该4-羟基丁醛途径包括α-酮戊二酸脱羧酶；4-羟基丁酸脱氢酶；以及4-羟基丁酸还原酶(图58，步骤B-C-D)。
本发明进一步提供一种用于通过培养一种非天然存在的微生物来生产4-羟基丁醛的方法，该微生物包括4-羟基丁醛途径，该途径包括编码以足以生产4-羟基丁醛的量表达的4-羟基丁醛途径酶的至少一种外源性核酸，该4-羟基丁醛途径包括琥珀酸还原酶；4-羟基丁酸脱氢酶以及4-羟基丁酸还原酶(见图62，步骤F-C-D)。在仍然另一实施方式中，本发明提供一种用于通过培养一种非天然存在的微生物来生产4-羟基丁醛的方法，该微生物包括4-羟基丁醛途径，该途径包括编码以足以生产4-羟基丁醛的量表达的4-羟基丁醛途径酶的至少一种外源性核酸，该4-羟基丁醛途径包括α-酮戊二酸脱羧酶或者谷氨酸脱氢酶或谷氨酸转氨酶和谷氨酸脱羧酶以及4-氨基丁酸脱氢酶或4-氨基丁酸转氨酶；4-羟基丁酸脱氢酶；以及4-羟基丁酸还原酶(见图62，步骤B或者((J或者K)-L-(M或者N))-C-D)。
本发明还提供一种用于通过培养一种非天然存在的微生物来生产4-羟基丁醛的方法，该微生物包括4-羟基丁醛途径，该途径包括编码以足以生产4-羟基丁醛的量表达的4-羟基丁醛途径酶的至少一种外源性核酸，该4-羟基丁醛途径包括α-酮戊二酸还原酶；5-羟基-2-氧代戊酸脱氢酶；以及5-羟基-2-氧代戊酸脱羧酶(见图62，步骤X-Y-Z)。本发明进一步提供一种用于通过培养一种非天然存在的微生物来生产4-羟基丁酰-CoA的方法，该微生物包括4-羟基丁酰-CoA途径，该途径包括编码以足以生产4-羟基丁酰-CoA的量表达的4-羟基丁酰-CoA途径酶的至少一种外源性核酸，该4-羟基丁酰-CoA途径包括α-酮戊二酸还原酶；5-羟基-2-氧代戊酸脱氢酶；以及5-羟基-2-氧代戊酸脱氢酶(脱羧)(见图62，步骤X-Y-AA)。
本发明另外提供一种用于通过培养一种非天然存在的微生物来生产腐胺的方法，该微生物包括腐胺途径，该途径包括编码以足以生产腐胺的量表达的腐胺途径酶的至少一种外源性核酸，该腐胺途径包括琥珀酸还原酶；4-氨基丁酸脱氢酶或者4-氨基丁酸转氨酶；4-氨基丁酸还原酶；以及腐胺脱氢酶或者腐胺转氨酶(见图63，步骤F-M/N-C-D/E)。在仍然另一实施方式中，本发明提供一种用于通过培养一种非天然存在的微生物来生产腐胺的方法，该微生物包括腐胺途径，该途径包括编码以足以生产腐胺的量表达的腐胺途径酶的至少一种外源性核酸，该腐胺途径包括α-酮戊二酸脱羧酶；4-氨基丁酸脱氢酶或者4-氨基丁酸转氨酶；4-氨基丁酸还原酶；以及腐胺脱氢酶或者腐胺转氨酶(见图63，步骤B-M/N-C-D/E)。本发明另外提供一种用于通过培养一种非天然存在的微生物来生产腐胺的方法，该微生物包括腐胺途径，该途径包括编码以足以生产腐胺的量表达的腐胺途径酶的至少一种外源性核酸，该腐胺途径包括谷氨酸脱氢酶或者谷氨酸转氨酶；谷氨酸脱羧酶；4-氨基丁酸还原酶；以及腐胺脱氢酶或者腐胺转氨酶(见图63，步骤J/K-L-C-D/E)。
在另一实施方式中，本发明提供一种用于通过培养一种非天然存在的微生物来生产腐胺的方法，该微生物包括腐胺途径，该途径包括编码以足以生产腐胺的量表达的腐胺途径酶的至少一种外源性核酸，该腐胺途径包括α-酮戊二酸还原酶；5-氨基-2-氧代戊酸脱氢酶或者5-氨基-2-氧代戊酸转氨酶；5-氨基-2-氧代戊酸脱羧酶；以及腐胺脱氢酶或者腐胺转氨酶(见图63，步骤O-P/Q-R-D/E)。还提供了一种用于通过培养一种非天然存在的微生物来生产腐胺的方法，该微生物包括腐胺途径，该途径包括编码以足以生产腐胺的量表达的腐胺途径酶的至少一种外源性核酸，该腐胺途径包括α-酮戊二酸还原酶；5-氨基-2-氧代戊酸脱氢酶或者5-氨基-2-氧代戊酸转氨酶；鸟氨酸脱氢酶或者鸟氨酸转氨酶；以及鸟氨酸脱羧酶(见图63，步骤O-P/Q-S/T-U)。应理解，包括本文披露的任何所述途径的微生物可用以到生产所需的产品或者中间体，包括4-HB、4-HBal、BDO或者腐胺。
应理解，在本发明的方法中，任何所述一种或者多种外源性核酸可被引入微生物以生产本发明的一种非天然存在的微生物。该核酸可被引入以便赋予该微生物，例如4-HB、BDO、THF或者GBL生物合成途径。替代性地，可以引入编码核酸，以生产具有生物合成能力的中间体微生物，以催化所需的反应的一些，从而赋予4-HB、BDO、THF或者GBL生物合成能力。例如，具有4-HB生物合成途径的非天然存在的微生物可以包括至少两种编码所需的酶(如组合：4-羟基丁酸酯脱氢酶和α-酮戊二酸脱羧酶；4-羟基丁酸酯脱氢酶和非依赖CoA的琥珀半醛脱氢酶；4-羟基丁酸酯脱氢酶和依赖CoA的琥珀半醛脱氢酶；依赖CoA的琥珀半醛脱氢酶和琥珀酰-CoA合成酶；琥珀酰-CoA合成酶和谷氨酸脱羧酶等等)的外源性核酸。因此，应应理解，生物合成途径的两种或两种以上酶的任意组合可以包含在本发明的非天然存在的微生物中。同样，应应理解，按照要求，生物合成途径的三种或三种以上酶的任意组合可以包含在本发明的非天然存在的微生物中，例如，4-羟基丁酸酯脱氢酶、α-酮戊二酸脱羧酶和依赖CoA的琥珀半醛脱氢酶；非依赖CoA的琥珀半醛脱氢酶和琥珀酰-CoA合成酶；4-羟基丁酸酯脱氢酶、依赖CoA的琥珀半醛脱氢酶和谷氨酸：琥珀半醛转氨酶等等，只要所需的生物合成途径的酶的组合导致相应的所需产品的产生。
同样，例如，关于任何一种或者多种被引入以赋予BDO生产的外源性核酸，具有BDO生物合成途径的非天然存在的微生物可以包括至少两种编码所需的酶的外源性核酸如组合：4-羟基丁酸酯脱氢酶和α-酮戊二酸脱羧酶；4-羟基丁酸酯脱氢酶和4-羟基丁酰CoA：乙酰基-CoA转移酶；4-羟基丁酸酯脱氢酶和丁酸激酶；4-羟基丁酸酯脱氢酶和磷酸丁酰转移酶；4-羟基丁酰CoA：乙酰基-CoA转移酶和醛脱氢酶；4-羟基丁酰CoA：乙酰基-CoA转移酶和醇脱氢酶；4-羟基丁酰CoA：乙酰基-CoA转移酶和醛/醇脱氢酶，4-氨基丁酸-CoA转移酶和4-氨基丁酰-CoA转氨酶；4-氨基丁酸激酶和4-氨基-1-丁醇氧化还原酶(脱氨基)等等。因此，应理解，生物合成途径的两种或两种以上酶的任意组合可以包含在本发明的非天然存在的微生物中。同样，应理解，生物合成途径的三种或三种以上酶的任意组合可以包含在本发明的非天然存在的微生物中，例如，4-羟基丁酸酯脱氢酶、α-酮戊二酸脱羧酶和4-羟基丁酰CoA：乙酰基-CoA转移酶；4-羟基丁酸酯脱氢酶、丁酸激酶和磷酸丁酰转移酶；4-羟基丁酸酯脱氢酶、4-羟基丁酰CoA：乙酰基-CoA转移酶和醛脱氢酶；4-羟基丁酰CoA：乙酰基-CoA转移酶、醛脱氢酶和醇脱氢酶；丁酸激酶、磷酸丁酰转移酶和醛/醇脱氢酶；4-氨基丁酰-CoA水解酶、4-氨基丁酰-CoA还原酶和4-氨基-1-丁醇转氨酶；3-羟基丁酰-CoA脱氢酶、3-羟基丁酰-CoA脱水酶和4-羟基丁酰-CoA脱水酶等等。同样，按照要求，生物合成途径的四种、五种或更多种的酶的任意组合可以包含在本发明的非天然存在的微生物中，只要所需的生物合成途径的酶的组合导致相应的所需产品的产生。
本文所述的任何所述非天然存在的微生物可以培养以生产和/或分泌本发明的生物合成产物。例如，4-HB生产者可以培养用于4-HB的生物合成生产。可以如下文所述，分离或者处理4-HB，以生成GBL、THF和/或BDO。同样，BDO生产者可以培养用于BDO的生物合成生产。可以如下文所述，分离或者进一步处理BDO，以化学合成BDO家族化合物。
生长培养基可以包括，例如任何可以向非天然存在的微生物提供碳源的碳水化合物源。这类源包括，例如糖类(如葡萄糖、蔗糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖和淀粉)。其他碳水化合物源包括，例如可再生的原料和生物质。可在本发明所述的方法中用作原料的示例性类型的生物质包括纤维素生物质、半纤维素生物质和木素原料或原料的木素部分。这类生物质原料包含，例如用作碳源的碳水化合物底物(如葡萄糖、蔗糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖和淀粉)。考虑到本文提供的启示和指导，本领域的技术人员会理解除上文那些示例性的原料和生物质，可再生的原料和生物质也可用以培养用于生产4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺和本发明的其他化合物的本发明的所述微生物。
因此，考虑到本文提供的启示和指导，本领域的技术人员会理解可以生产非天然存在的微生物，所述微生物当培育在碳源(如碳水化合物)上时分泌本发明的生物合成的化合物。这类化合物包括，例如4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺以及在4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺途径和/或4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺联合途径中的任何中间体代谢产物。所有需要的是在图1所示的一种或多种酶活性中进行设计，以实现所需化合物或中间体(包括，例如部分或全部所述4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺生物合成途径的包涵物)的生物合成。因此，本发明提供一种非天然存在的微生物，所述微生物当培育在碳水化合物上时分泌4-HB以及当培育在碳水化合物上时分泌BDO和/或当培育在碳水化合物上时分泌图1、8-13、58、62或者63所示的任何中间体代谢产物。本发明的所述产BDO的微生物可以启动始自，例如琥珀酸、琥珀酰-CoA、α-酮戊二酸、琥珀半醛、4-HB、4-羟基丁酰磷酸、4-羟基丁酰-CoA(4-HB-CoA)和/或4-羟基丁醛的合成。
在一些实施方式中，培养条件包括厌氧或基本上厌氧的培育或维持条件。示例性的厌氧条件已有先前描述并为本领域所熟知。用于发酵过程的示例性厌氧条件的描述见下文实施例。任何这些条件可以与所述非天然存在的微生物以及本领域熟知的其他厌氧条件一起使用。在这种厌氧条件下，该4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺生产者可以合成细胞内浓度为5-10mM或以上以及前文示例性的所有其他浓度的4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺。
对于本发明的产4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺的非天然存在的微生物，还可以生成大量的下游化合物。关于本发明的产4-HB的微生物，单体4-HB和GBL在培养基中处于平衡。可以通过，例如在酸性pH的培养基中培养微生物来是高效地完成从4-HB到GBL的转化。小于或者等于7.5的pH值，尤其是小于或者等于pH5.5自发地将4-HB转化为GBL。
可以利用本领域熟知的各种方法从培养物中的4-HB和其他组分分离所得的GBL。这类分离方法包括，例如实施例中示范的萃取程序以及包括如下的方法：连续液液萃取法、全蒸发法、膜滤法、膜分离法、反渗透法、电渗析法、蒸馏法、结晶法、离心法、萃取过滤法、离子交换色谱法、体积排阻色谱法、吸附色谱法以及超滤法。所有上述方法为本领域所熟知。分离的GBL可以通过，例如蒸馏法进一步纯化。
可以产自本发明所述的产4-HB的非天然存在的微生物的另一下游化合物包括例如，BDO。这种化合物可以通过，例如GBL的化学氢化作用合成。化学氢化反应为本领域所熟知。一个示例性的程序包括利用一种多相或者均相氢化催化剂连同氢；或者化学计量或者催化地使用的基于氢化物的还原剂来化学还原衍生自培养物的4-HB和/或GBL或者这两种组分的混合物，以生产1,4-丁二醇。
本领域熟知的其他程序同样地适用于上文的化学反应以及包括，例如WO号82/03854(Bradley,等人)，其描述了汽相中在氧化铜和氧化锌催化剂上γ-丁内酯的氢解作用。英国专利号1,230,276，其描述了利用氧化铜-氧化铬催化剂的γ-丁内酯氢化作用。该氢化作用在液相中进行。还示范了具有反应器高总压的间歇反应。反应器中的反应物和产物分压远大于各自的露点。英国专利号1,314,126，其描述了液相中在氧化镍-钴-钍催化剂上γ-丁内酯的氢化作用。示范了具有高总压间歇反应以及组分分压远大于各自的组分露点。英国专利号1,344,557，其描述了液相中在氧化铜-氧化铬催化剂上γ-丁内酯的氢化作用。指出，汽相或者包含汽相的混合相在某些情况下适用。示范了利用反应器高总压的管式连续流动反应器。英国专利号1,512,751，其描述了液相中在氧化铜-氧化铬催化剂上γ-丁内酯到1,4-丁二醇的氢化作用。示范了具有反应器高总压的间歇反应以及，可确定的是，反应物和产物分压远大于各自的露点。美国专利号4,301,077，其描述了Ru-Ni-Co-Zn催化剂上γ-丁内酯到1,4-丁二醇的氢化作用。该反应可以在液相或者气相或在液气混合相中进行。示范了反应器高总压下的连续流动液相反应以及相对低的反应器生产率。美国专利号4,048,196，其描述了通过氧化铜-氧化锌催化剂上γ-丁内酯的液相氢化作用来生产1,4-丁二醇。进一步示范了在反应器高总压以及高反应物和产物分压下运行的管式连续流动反应器。以及美国专利号4,652,685，其描述内酯到乙二醇的氢化作用。
可以产自本发明所述的产4-HB的非天然存在的微生物的进一步的下游化合物包括例如，THF。这种化合物可以通过，例如GBL的化学氢化作用合成。本领域熟知的适用于GBL到THF的转化的一个示例性的程序包括利用一种多相或者均相氢化催化剂连同氢；或者化学计量或者催化地使用的基于氢化物的还原剂来化学还原衍生自培养物的4-HB和/或GBL或者这两种组分的混合物，以生产四氢呋喃。本领域熟知的其他程序同样地适用于上文的化学反应以及包括，例如美国专利号6,686,310，其描述了高表面面积溶胶-凝胶路径制备的氢化催化剂。还描述了马来酸到四氢呋喃(THF)和1,4-丁二醇(BDO)的还原过程以及γ丁内酯到四氢呋喃和1,4-丁二醇的还原过程。
培养条件可以包括，例如液体培养程序以及发酵和其他大规模培养程序。如下文实施例中所描述，在厌氧或基本上厌氧的培养条件下可以获得本发明生物合成产物的特别有用的收率。
可以利用熟知的方法进行适用于4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺生产测试的纯化和/或测定。可以为每个设计的待测菌株培育合适的复制品，如一式三份的培养物。例如，可以监测所设计的生产宿主中产物和副产物的形成。可以通过各种方法，例如HPLC(高效液相色谱)、GC-MS(气相色谱-质谱法)和LC-MS(液相色谱-质谱法)或者其他利用本领域熟知的例行程序的合适的分析方法来分析最终产品和中间体以及其他有机化合物。也可以利用培养上清液对产物在发酵肉汤中的释放进行测试。可以利用，例如针对葡萄糖和醇的折光率检测器以及针对有机酸的紫外检测器(Lin等人,Biotechnol.Bioeng.90:775-779(2005))通过HPLC或本领域熟知的其他合适的测定和检测方法对副产物和残余葡萄糖进行定量。也可以利用本领域熟知的方法对来自外源性DNA序列的个别酶或蛋白质活性进行测定。
可以利用本领域熟知的各种方法从培养物中的其他组分分离4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺产品。这类分离方法包括，例如萃取程序以及包括如下的方法：连续液液萃取法、全蒸发法、膜滤法、膜分离法、反渗透法、电渗析法、蒸馏法、结晶法、离心法、萃取过滤法、离子交换色谱法、体积排阻色谱法、吸附色谱法以及超滤法。所有上述方法为本领域所熟知。
本发明进一步提供一种生产4-HB的方法。该方法包括在基本上厌氧的条件下发酵一种具有4-羟基丁酸(4-HB)生物合成途径的非天然存在的微生物达足够长的时间以生产单体4-羟基丁酸(4-HB)，该途径包括编码如下酶的至少一种外源性核酸：4-羟基丁酸酯脱氢酶、非依赖CoA的琥珀半醛脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶、依赖CoA的琥珀半醛脱氢酶、谷氨酸：琥珀半醛转氨酶、α-酮戊二酸脱羧酶或者谷氨酸脱羧酶，该工艺包括补料分批发酵和分批分离；补料分批发酵和连续分离；或者连续发酵和连续分离。
上文所述的培养和化学氢化作用也可以按比例扩大并连续增长，以用于生产4-HB、4-HBal、4-HBCoA、GBL、BDO和/或THF或者腐胺。示例性的培养程序包括，例如补料分批发酵和分批分离；补料分批发酵和连续分离；或者连续发酵和连续分离。所有这些过程都为本领域所熟知。采用4-HB生产者允许通过采用上述氢化程序同时利用连续培养方法(如发酵)，同时实现4-HB生物合成和化学转化为GBL、BDO和/或THF。其他氢化程序也为本领域所熟知以及可以同样地应用于本发明的所述方法中。
发酵程序对于工业规模的4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺的生物合成生产是特别有用的。一般地以及与非连续培养程序一样，4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺的连续和/或接近连续的生产将包括在足够的营养物和培养基中培养本发明的生产4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺的非天然存在的生物，以维持和/或接近维持指数期的生长。这种条件下的连续培养可以包括，例如1天、2、3、4、5、6或7天或更多。此外，连续培养可以包括1周、2、3、4或5或更多周乃至数月。替代性地，如果适于具体的应用，本发明的生物可以培养数小时。应理解，连续和/或接近连续培养的条件还可以包括这些示例性周期之间的所有的时间间隔。应进一步理解，本发明的所述微生物的培养时间是足以生产足够量的用于所需目的的产品的时间段。
发酵程序为本领域所熟知。简言之，可以，例如补料分批发酵和分批分离；补料分批发酵和连续分离；或连续发酵和连续分离的方式利用用于本发明的4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺或者其他4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺衍生产物(包括中间体)的生物合成生产的发酵。本领域所熟知的分批和连续发酵程序的例子进一步在下文的实施例中进行示范。
除了上文将本发明的所述4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺生产者分别用于4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺(包括单体4-HB)的大量连续的生产的发酵程序，所述4-HB生产者还可以，例如同时经受化学合成程序，以将产物转化为其他化合物或如前所述用于将单体4-HB化学转化为，例如GBL、BDO和/或THF的产物。所述BDO生产者同样可以，例如同时经受如前所述用于将BDO化学转化为，例如THF、GBL、吡咯烷酮和/或其他BDO家族化合物的化学合成程序。此外，如本文所披露，4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺生产者的产物可以从发酵培养物中分离以及后续经受化学转化，以将产物转化为其他化合物(如有需要)。
简言之，发酵肉汤中GBL的氢化作用可以如Frost等人,BiotechnologyProgress18:201-211(2002)所述执行。发酵期间用于氢化作用的另一程序包括，例如美国专利号5,478,952中所述的方法。这种方法在下文的实施例中进一步示范。
因此，本发明另外提供一种生产γ-丁内酯(GBL)、四氢呋喃(THF)或者1,4-丁二醇(BDO)的方法。该方法包括在基本上厌氧的条件下发酵一种具有4-羟基丁酸(4-HB)和/或1,4-丁二醇(BDO)生物合成途径的非天然存在的微生物达足够长的时间以生产1,4-丁二醇(BDO)、GBL或者THF，该途径包括编码如下酶的至少一种外源性核酸：4-羟基丁酸酯脱氢酶、非依赖CoA的琥珀半醛脱氢酶、琥珀酰-CoA合成酶、依赖CoA的琥珀半醛脱氢酶、4-羟基丁酸：CoA转移酶、谷氨酸：琥珀半醛转氨酶、α-酮戊二酸脱羧酶、谷氨酸脱羧酶、4-羟基丁酸酯激酶、磷酸丁酰转移酶、非依赖CoA的1,4-丁二醇半醛脱氢酶、依赖CoA的1,4-丁二醇半醛脱氢酶、非依赖CoA的1,4-丁二醇醇脱氢酶或者依赖CoA的1,4-丁二醇醇脱氢酶；该发酵包括补料分批发酵和分批分离；补料分批发酵和连续分离；或者连续发酵和连续分离。
除如本文描述的本发明的4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺和其他产物的生物合成之外，本发明所述的非天然存在的微生物和方法也可以通过彼此间以及与本领域熟知的其他微生物和方法进行各种组合来应用，以通过其他路径实现产品生物合成。例如，除了使用4-HB生产者和化学步骤或者除了直接使用BDO生产者，一种生产BDO的替代性方法是通过加入另一种能够将4-HB或者本文示范性的4-HB产物转化为BDO的微生物。
一种这样的程序包括，例如发酵本发明的产4-HB的微生物以生产4-HB，如上下文所述。该4-HB然后可以被用作将4-HB转化为，例如BDO、GBL和/或THF的第二微生物的底物。该4-HB可以被直接加入该第二生物的另一培养物或该4-HB生产者的原始培养物可以通过，例如细胞分离耗尽这些微生物，然后可以利用将第二生物随后加入发酵肉汤，以生产最终产品而无中间体纯化的步骤。一种能够以生化方式利用4-HB作为底物以转化为，例如BDO的示例性的第二生物是丙酮丁醇梭菌(见，例如，Jewell等人,CurrentMicrobiology,13:215-19(1986))。
因此，这类程序包括例如，生产4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺途径中间体的微生物的发酵。该4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺途径中间体然后可以用作将4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺途径中间体转化为4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺的第二微生物的底物。该4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺途径中间体可以被直接加入该第二生物的另一培养物或该4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺途径中间体生产者的原始培养物可以通过，例如细胞分离耗尽这些微生物，然后可以利用将第二生物随后加入发酵肉汤，以生产最终产品而无中间体纯化的步骤。
在其他实施方式中，本发明的所述非天然存在的微生物和方法可以在各种各样的子途径中进行组合，以获得，例如所述的4-HB和/或BDO的生物合成。在这些实施方式中，可以将用于本发明的所需产品的生物合成途径分离到不同的微生物中，以及可以共同培养该不同的微生物，以生产最终产品。在这种生物合成方案中，一种微生物的产物是用于第二微生物的底物，直至合成最终产品。例如，如前所述，可以通过构建如下微生物完成BDO的生物合成：该微生物包含用于将一个途径中间体转化为另一途径中间体或将产物，例如底物(如内源性的琥珀酸)通过4-HB转化为最终产品BDO的生物合成途径。替代性地，也可以通过利用相同器皿内的两种生物的共同培养或共同发酵从微生物生物合成生产BDO。第一种微生物是具有从琥珀酸生产4-HB的基因的4-HB生产者，以及第二种微生物是具有将4-HB转化为BDO的基因的BDO生产者。例如，可以通过构建包含用于将一个途径中间体转化为另一途径中间体或产物的生物合成途径的微生物来完成4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺的生物合成。替代性地，也可以通过利用相同器皿内的两种生物的共同培养或共同发酵从微生物生物合成生产4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺，其中该第一种微生物生产4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺中间体以及该第二种微生物将该中间体转化为4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺。
考虑到本文提供的启示和指导，本领域的技术人员会理解存在针对本发明的所述非天然存在的微生物和方法，连同其他微生物、具有子途径的其他非天然存在的微生物的共同培养物以及本领域熟知的生产本发明的4-HB、BDO、GBL和THF产品的其他化学和/或生化程序的组合的各种各样的组合和排列。
应理解，在本发明的方法中，任何所述一种或者多种外源性核酸可被引入微生物以生产本发明的一种非天然存在的微生物。该核酸可被引入以便赋予该微生物，例如4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺生物合成途径。替代性地，可以引入编码核酸，以生产具有生物合成能力的中间体微生物，以催化所需的反应的一些，从而赋予4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺生物合成能力。例如，具有4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺生物合成途径的非天然存在的微生物可以包括至少两种编码所需的酶或者蛋白质(如本文所披露的酶的组合)等等的外源性核酸(见实施例以及图1、8-13、58、62和63)。因此，应理解，生物合成途径的两种或两种以上酶的任意组合可以包含在本发明的非天然存在的微生物中。同样，应理解，如本文所要求和披露的，生物合成途径的三种或三种以上酶或者蛋白质的任意组合可以包含在本发明的非天然存在的微生物中，例如，]等等，只要所需的生物合成途径的酶或者蛋白质的组合导致相应的所需产品的产生。同样，根据要求，如本文所披露的生物合成途径的四种或四种以上酶或者蛋白质的任意组合可以包含在本发明的非天然存在的微生物中，只要所需的生物合成途径的酶或者蛋白质的组合导致相应的所需产品的产生。
为生成更好的生产者，可以利用代谢建模优化培育条件。建模还可被用以设计另外优化途径应用的基因敲除(参见，例如美国专利公布US2002/0012939、US2003/0224363、US2004/0029149、US2004/0072723、US2003/0059792、US2002/0168654和US2004/0009466；以及美国专利号7,127,379)。建模分析允许对偏移代谢对细胞生长的影响进行可靠的预测，以便更高效地生产4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺。
一种用于识别和设计支持所需产品的生物合成的代谢改变的计算方法是OptKnock计算框架(Burgard等人,Biotechnol.Bioeng.84:647-657(2003))。OptKnock是一种代谢建模和模拟程序，该程序提出基因删除或者中断策略，其产生从基因方面来说稳定的微生物，该微生物超过定额地生产靶产品。具体而言，该框架检查微生物的完整的代谢和/或生化网络，以便提出迫使所需的生化品变为细胞生长的专性副产品的基因操作。通过战略性放置的基因缺失或其他功能基因中断把生化生产与细胞生长耦合起来，在生物反应器中长时间之后，施加至设计菌株的生长选择压力由于结合强制性生长的生化生产引起效能改善。最后，当基因缺失被构建时，由于OptKnock选择的基因将从基因组完全去除，设计菌株回复到其野生型状态的可能性可以忽略不计。因此，该计算方法可用以识别导致所需产品生物合成的替代性途径或与所述非天然存在的微生物结合用于所需产品生物合成的进一步优化。
简言之，术语OptKnock在本文用以指用于建模细胞代谢的计算方法和系统。OptKnock方案涉及将具体的约束因素引入通量平衡分析(FBA)模型的模型和方法的框架。这些约束因素包括，例如定性动力信息、定性调节信息和/或DNA微阵列实验数据。OptKnock还通过，例如收紧通过通量平衡模型导出的通量边界以及随后在基因添加或删除的存在下探测代谢网络的效能极限来计算各种代谢问题的解。OptKnock计算框架允许使代谢网络的效能极限的有效质询可行的模型表述的构建以及提供用于解决引起的混合整数线性规划问题的方法。本文称为OptKnock的代谢建模和模拟方法的描述见于，例如2002年1月10日提交的美国公布2002/0168654、2002年1月10日提交的国际专利号PCT/US02/00660以及2007年8月10日提交的美国公布2009/0047719。
另一种用于识别和设计支持产品的生物合成生产的代谢改变的计算方法是一种代谢建模和模拟系统，称为该计算方法和系统的描述见于，例如2002年6月14日提交的美国公布2003/0233218以及见于2003年6月13日提交的PCT/US03/18838。是一种计算系统，该系统可用以产生硅内网络模型并用以通过生物系统的化学反应模拟质量、能量或电荷的通量，以限定包含该系统中化学反应的任何以及所有可能的函数的解空间，从而确定该生物系统一系列的允许活性。这种方法称为基于约束因素的建模，因为该解空间由约束因素限定，如所包含的反应的已知的化学计量以及通过反应与最大通量关联的反应热动力和能力约束因素。可以询问这些约束因素限定的空间，以确定该生物系统或其生化部件的显型能力和行为。
这些计算方法与生物现实一致，因为生物系统具有灵活性并可以许多不同的方式达到相同的结果。生物系统已经通过由所有生物系统必须面对的基本的约束因素限制的进化机制加以设计。因此，基于约束因素的建模策略包括这些一般现实。进一步地，通过约束因素收紧向网络模型连续施加进一步的限制的能力导致解空间的尺寸变小，从而提升生理效能或显型可预测的精确性。
考虑到本文提供的启示和指导，本领域的技术人员将能够应用各种用于代谢模型和模拟的计算框架，以在宿主微生物中设计和实施所需化合物的生物合成。这种代谢建模和模拟方法包括，例如上文示范为和OptKnock的计算系统。为了说明本发明，本文描述一些关于用于建模和模拟的OptKnock计算框架的方法。本领域的技术人员会了解如何利用OptKnock将代谢改变的识别、设计和实施应用于为本领域所熟知的任何这类其他代谢模型和模拟计算框架和方法。
上文描述的方法将提供待中断的一组代谢反应。该组或代谢修饰内每个反应的消除可以在生物的培育期期间产生作为专性产品的所需产品。由于反应已知，双层OptKnock问题的解也将提供编码一种或多种催化该组反应内每个反应的酶的有关基因。一组反应及其相应的编码参与每个反应的酶的基因的识别通常是自动化过程，通过将反应与具有酶和编码基因之间的关系的反应数据库相关联得以完成。
一旦确定，通过至少一个编码该组反应内每个代谢反应的基因的功能中断在靶细胞或生物内实施该组反应，该组反应待中断以便实现所需产品的生产。一种实现该反应组的功能中断的特别有用的手段是通过删除每个编码基因。然而，在某些情况下，通过其他的遗传畸变(包括，例如调节区域如启动子或针对调节因子的顺式结合位点的突变、删除或者通过大量位置的任意处编码序列的截断)中断该反应可能是有利的。这些导致基因组不完全删除的后者畸变可能是有用的，例如，当需要产物耦合的快速评估或当不太可能发生遗传回复变异时。
为识别上文描述的导致进一步的中断反应组或可以导致生物合成(包括所需产品的生长耦合的生物合成)的代谢修饰的双层OptKnock问题的其他的富有成效的解，可以实施一种优化方法，称为整数切割。该方法通过在每次迭代时纳入被称为整数切割的另一约束因素迭代地解决上文示例性的OptKnock问题而进行下去。整数切割约束因素有效地阻止解程序选择在任何先前的强制耦合产品生物合成至生长的迭代中确定的恰好相同的反应组。例如，如果先前确定的耦合生长的代谢修饰指定反应1、2和3进行中断，则接下来的约束因素阻止相同的反应被同时考虑在后续解中。该整数切割方法为本领域所熟知以及可以发现其被描述于，例如Burgard等人,Biotechnol.Prog.17:791-797(2001)。与本文关于其结合用于代谢模型和模拟的OptKnock计算框架的用途所述的所有方法一样，减少迭代计算分析中的冗余的整数切割方法还可以与本领域所熟知的其他计算框架(包括，例如一起应用。
本文示例性的方法允许生物合成地生产所需产品的细胞和生物的构建，包括靶生化产品的生产与被设计包括所识别的基因改变的细胞或生物生长的强制耦合。因此，本文所述的计算方法允许通过选自OptKnock或的硅内方法识别的代谢修饰的识别和实施。代谢修饰组可包括，例如一种或多种生物合成途径酶的添加和/或一种或多种代谢反应的功能中断(包括，例如通过基因删除中断)。
如上文所讨论，该OptKnock方法的开发前提是当遭受长期的生长选择时突变微生物网络可以朝向其计算地预测最大生长显型进化。换言之，该方法利用生物在选择压力下的自优化能力。该OptKnock框架允许有基于网络化学计量强迫形成生化生产和细胞生长之间的耦合的基因删除组合的穷尽枚举(exhaustiveenumeration)。最佳基因/反应敲除的确认需要双层优化问题的解，所述解选择活性反应组以便所得网络的最佳生长解超过定额地生产相关生化品(Burgard等人,Biotechnol.Bioeng.84:647-657(2003))。
大肠杆菌代谢的硅内化学计量模型可用以识别代谢途径必需的基因，如先前示范以及描述，见于，例如美国专利公布US2002/0012939、US2003/0224363、US2004/0029149、US2004/0072723、US2003/0059792、US2002/0168654和US2004/0009466以及见于美国专利号7,127,379。如本文所披露，OptKnock数学框架可用以精确地定位基因删除，导致所需产品的耦合生长的生产。进一步地，双层OptKnock问题的解仅提供一组删除。要枚举所有有意义的解，即导致耦合生长的生产的形成的所有敲除组，可以实施优化技术，称为整数切割。这必伴有通过在每次迭代时纳入被称为整数切割的另一约束因素迭代地解决该OptKnock问题，如上文所讨论。
上文示范的以及下文实施例中进一步说明的方法允许进行生物合成生产的细胞和生物的构建，包括靶生化产品与被设计包括所识别的基因改变的细胞或生物生长的强制耦合生产。在这点上，已经识别导致4-HB和1,4-丁二醇生物合成的代谢改变。相比于未修饰的微生物，构建有所识别的代谢改变的微生物菌株生产更高水平的4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺。这些菌株可以有利地用于例如连续发酵过程以进行4-HB、BDO、THF、GBL、4-HBal、4-HBCoA或者腐胺的工业生产，而不经受负选择压力。
因此，本文所述的计算方法允许通过选自OptKnock或的硅内方法识别的代谢修饰的识别和实施。代谢修饰组可包括，例如一种或多种生物合成途径酶的添加和/或一种或多种代谢反应的功能中断(包括，例如通过基因删除中断)。
应应理解，本质上不影响本发明各种实施方式的效能的修改也包含在本文提供的本发明的定义中。因此，下文的实施例旨在说明而非限制本发明。
本文所述的任何非天然存在的微生物可以培养以生产和/或分泌本发明的生物合成产物。例如，该4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺生产者可以培养用于4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺的生物合成生产。
为了生产4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺，在具有碳源和其他必需营养物的培养基中培养重组菌株。在发酵罐中保持厌氧条件以降低整个过程的消耗是非常可取的。这种条件的获取可以通过，例如首先用氮喷射该培养基，然后用垫片和钳口盖密封烧瓶。对于培育不遵循厌氧的菌株，可以通过在该垫片上打一小孔进行有限通气来采用微氧条件。示例性的厌氧条件已有先前描述并为本领域所熟知。示例性的有氧和厌氧条件的描述见于，例如2007年8月10日提交的美国公布号2009/0047719。如本文所披露，可以分批、补料分批或连续的方式进行发酵。
如果需要，可以将培养基的pH值保持为所需的pH值，特别是按需要通过添加碱(如NaOH或其他碱)或酸保持为中性pH值(如约7的pH值)，以将培养基保持在所需的pH值。可以通过利用分光光度计(600nm)测量光密度确定生长速率，以及可以通过监测随着时间的推移碳源的消耗确定葡萄糖摄取速率。
除了如上文的那些示例性的可再生的原料，本发明所述的产4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺的微生物也可以修改为将合成气作为其碳源进行培育。在这个特定的实施方式中，在生产所述产4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺的生物中表达一种或多种蛋白质或酶，以提供用于利用合成气或其他气态碳源的代谢途径。
合成气体(也称为合成气或者发生炉煤气)是煤炭和碳质材料(如包括农作物和农业剩余物的生物质材料)气化的主要产物。合成气是一种主要含H2和CO的混合物以及可以通过气化任何有机原料(包括但不仅限于煤炭、煤油、天然气、生物质以及有机废物)获得。一般地，在高燃料/氧气比的条件下进行气化。虽然大部分含H2和CO，合成气还可以包括少量的CO2和其他气体。因此，合成气体提供了有成本效益的气体碳源，如CO以及另外地，CO2。
Wood-Ljungdahl途径催化从CO和H2到乙酰基-CoA和其他产物(如乙酸)的转化。能够利用CO和合成气的生物一般地也具有通过该Wood-Ljungdahl途径包含的相同的基本酶和转换组利用CO2和CO2/H2混合物的能力。通过微生物依赖H2的从CO2到乙酸的转化得到公认很长时间之后，显示，CO也可以被相同的生物采用以及涉及的途径也相同。已有显示，许多产乙酸菌在CO2的存在下生长，以及只要存在氢以提供必需的还原当量，便生产化合物，如乙酸(见例如，Drake,Acetogenesis,pp.3-60ChapmanandHall,NewYork,(1994))。这可以概括为如下的反应式：
2CO2+4H2+nADP+nPi→CH3COOH+2H2O+nATP。
因此，具有该Wood-Ljungdahl途径的非天然存在的微生物也可以利用CO2和H2混合物来生产乙酰基-CoA和其他所需的产品。
该Wood-Ljungdahl途径为本领域熟知以及由12个反应组成，所述反应可以分为两个支路：(1)甲基支路和(2)羰基支路。该甲基支路将合成气转化为甲基-四氢叶酸(甲基-THF)而该羰基支路将甲基-THF转化为乙酰基-CoA。依次通过如下酶或者蛋白质催化该甲基支路中的反应：铁氧还蛋白氧化还原酶、甲酸脱氢酶、甲酰基四氢叶酸合成酶、次甲基四氢叶酸环化脱水酶、亚甲基四氢叶酸脱氢酶和亚甲基四氢叶酸还原酶。依次通过如下酶或者蛋白质催化在该羰基支路中的反应：甲基四氢叶酸：类咕啉蛋白质甲基转移酶(例如AcsE)、钴铁硫蛋白质、镍-蛋白质装配蛋白质(例如AcsF)、铁氧还蛋白、乙酰基-CoA合酶、一氧化碳脱氢酶和镍-蛋白质装配蛋白质(例如CooC)。遵循本文提供的关于引入足够数量的编码核酸以生成4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺途径的启示和指导，本领域的技术人员会理解，关于至少引入编码宿主生物中缺少的Wood-Ljungdahl酶或者蛋白质的核酸，也可以进行相同的工程设计。因此，将一种或者多种编码核酸引入本发明的微生物使得修饰的生物包含完整的Wood-Ljungdahl途径，这将获得合成气利用能力。
另外，该还原(逆)三羧酸循环用于和/或氢化酶活性也可以用于CO、CO2和/或H2到乙酰基-CoA和其他产物(如乙酸)的转化。能够经由还原TCA途径来固定碳的生物可以利用一种或者多种如下酶：ATP柠檬酸-裂解酶、柠檬酸裂解酶、乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶、α-酮戊二酸：铁氧还蛋白氧化还原酶、琥珀酰-CoA合成酶、琥珀酰-CoA转移酶、延胡索酸还原酶、延胡索酸酶、苹果酸脱氢酶、NAD(P)H：铁氧还蛋白氧化还原酶、一氧化碳脱氢酶，以及氢化酶。具体地，将通过一氧化碳脱氢酶和氢化酶从CO和/或H2萃取得到的还原当量用于经由还原TCA循环将CO2固定入乙酰基-CoA或者乙酸。乙酸可以通过酶(如乙酰基-CoA转移酶、乙酸激酶/磷酸转乙酰酶以及乙酰基-CoA合成酶)转化为乙酰基-CoA。乙酰基-CoA可以通过丙酮酸：铁氧还蛋白氧化还原酶和糖异生酶转化为4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺前体、甘油醛-3-磷酸、磷酸烯醇丙酮酸以及丙酮酸。遵循本文提供的关于引入足够数量的编码核酸以生成4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺途径的启示和指导，本领域的技术人员会理解，关于至少引入编码宿主生物中缺少的还原TCA途径酶或者蛋白质的核酸，也可以进行相同的工程设计。因此，将一种或者多种编码核酸引入本发明的微生物使得修饰的生物包含完整的还原TCA途径，这将获得合成气利用能力。
因此，考虑到本文提供的启示和指导，本领域的技术人员会理解，可以生产一种非天然存在的微生物，该微生物当在碳源(如碳水化合物)上培养时分泌本发明的生物合成的化合物。这类化合物包括，例如，4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺以及在4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺途径中的任何中间体代谢产物。所有需要的是在一种或多种所需的酶或蛋白质活性中进行设计，以实现所需化合物或中间体(包括，例如部分或全部所述4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺生物合成途径的包涵物)的生物合成。因此，本发明提供一种非天然存在的微生物，所述微生物当培育在碳水化合物或其他碳源上时生产和/或分泌4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺以及当培育在碳水化合物或其他碳源上时分泌4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺途径中所示的任何中间体代谢产物。本发明的所述产4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺的微生物可以启动始自4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺途径中的中间体的合成，如本文所披露。
为生成更好的生产者，可以利用代谢建模优化培育条件。建模还可被用以设计另外优化途径应用的基因敲除(参见，例如美国专利公布US2002/0012939、US2003/0224363、US2004/0029149、US2004/0072723、US2003/0059792、US2002/0168654和US2004/0009466；以及美国专利号7,127,379)。建模分析允许对偏移代谢对细胞生长的影响进行可靠的预测，以便更高效地生产4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺。
一种用于识别和设计支持所需产品的生物合成的代谢改变的计算方法是OptKnock计算框架(Burgard等人,Biotechnol.Bioeng.84:647-657(2003))。OptKnock是一种代谢建模和模拟程序，该程序提出基因删除策略，其产生从基因方面来说稳定的微生物，该微生物超过定额地生产靶产品。具体而言，该框架检查微生物的完整的代谢和/或生化网络，以便提出迫使所需的生化品变为细胞生长的专性副产品的基因操作。通过战略性放置的基因缺失或其他功能基因中断把生化生产与细胞生长耦合起来，在生物反应器中长时间之后，施加至设计菌株的生长选择压力由于结合强制性生长的生化生产引起效能改善。最后，当基因缺失被构建时，由于OptKnock选择的基因将从基因组完全去除，设计菌株回复到其野生型状态的可能性可以忽略不计。因此，该计算方法可用以识别导致所需产品生物合成的替代性途径或与所述非天然存在的微生物结合用于所需产品生物合成的进一步优化。
简言之，术语OptKnock在本文用以指用于建模细胞代谢的计算方法和系统。OptKnock方案涉及将具体的约束因素引入通量平衡分析(FBA)模型的模型和方法的框架。这些约束因素包括，例如定性动力信息、定性调节信息和/或DNA微阵列实验数据。OptKnock还通过，例如收紧通过通量平衡模型导出的通量边界以及随后在基因添加或删除的存在下探测代谢网络的效能极限来计算各种代谢问题的解。OptKnock计算框架允许使代谢网络的效能极限的有效质询可行的模型表述的构建以及提供用于解决引起的混合整数线性规划问题的方法。本文称为OptKnock的代谢建模和模拟方法的描述见于，例如2002年1月10日提交的美国公布2002/0168654、2002年1月10日提交的国际专利号PCT/US02/00660以及2007年8月10日提交的美国公布2009/0047719。
另一种用于识别和设计支持产品的生物合成生产的代谢改变的计算方法是一种代谢建模和模拟系统，称为该计算方法和系统的描述见于，例如2002年6月14日提交的美国公布2003/0233218以及见于2003年6月13日提交的PCT/US03/18838。是一种计算系统，该系统可用以产生硅内网络模型并用以通过生物系统的化学反应模拟质量、能量或电荷的通量，以限定包含该系统中化学反应的任何以及所有可能的函数的解空间，从而确定该生物系统一系列的允许活性。这种方法称为基于约束因素的建模，因为该解空间由约束因素限定，如所包含的反应的已知的化学计量以及通过反应与最大通量关联的反应热动力和能力约束因素。可以询问这些约束因素限定的空间，以确定该生物系统或其生化部件的显型能力和行为。
这些计算方法与生物现实一致，因为生物系统具有灵活性并可以许多不同的方式达到相同的结果。生物系统已经通过由所有生物系统必须面对的基本的约束因素限制的进化机制加以设计。因此，基于约束因素的建模策略包括这些一般现实。进一步地，通过约束因素收紧向网络模型连续施加进一步的限制的能力导致解空间的尺寸变小，从而提升生理效能或显型可预测的精确性。
考虑到本文提供的启示和指导，本领域的技术人员将能够应用各种用于代谢模型和模拟的计算框架，以在宿主微生物中设计和实施所需化合物的生物合成。这种代谢建模和模拟方法包括，例如上文示范为和OptKnock的计算系统。为了说明本发明，本文描述一些关于用于建模和模拟的OptKnock计算框架的方法。本领域的技术人员会了解如何利用OptKnock将代谢改变的识别、设计和实施应用于为本领域所熟知的任何这类其他代谢模型和模拟计算框架和方法。
上文描述的方法将提供待中断的一组代谢反应。该组或代谢修饰内每个反应的消除可以在生物的培育期期间产生作为专性产品的所需产品。由于反应已知，双层OptKnock问题的解也将提供编码一种或多种催化该组反应内每个反应的酶的有关基因。一组反应及其相应的编码参与每个反应的酶的基因的识别通常是自动化过程，通过将反应与具有酶和编码基因之间的关系的反应数据库相关联得以完成。
一旦确定，通过至少一个编码该组反应内每个代谢反应的基因的功能中断在靶细胞或生物内实施该组反应，该组反应待中断以便实现所需产品的生产。一种实现该反应组的功能中断的特别有用的手段是通过删除每个编码基因。然而，在某些情况下，通过其他的遗传畸变(包括，例如调节区域如启动子或针对调节因子的顺式结合位点的突变、删除或者通过大量位置的任意处编码序列的截断)中断该反应可能是有利的。这些导致基因组不完全删除的后者畸变可能是有用的，例如，当需要产物耦合的快速评估或当不太可能发生遗传回复变异时。
为识别上文描述的导致进一步的中断反应组或可以导致生物合成(包括所需产品的生长耦合的生物合成)的代谢修饰的双层OptKnock问题的其他的富有成效的解，可以实施一种优化方法，称为整数切割。该方法通过在每次迭代时纳入被称为整数切割的另一约束因素迭代地解决上文示例性的OptKnock问题而进行下去。整数切割约束因素有效地阻止解程序选择在任何先前的强制耦合产品生物合成至生长的迭代中确定的恰好相同的反应组。例如，如果先前确定的耦合生长的代谢修饰指定反应1、2和3进行中断，则接下来的约束因素阻止相同的反应被同时考虑在后续解中。该整数切割方法为本领域所熟知以及可以发现其被描述于，例如Burgard等人,Biotechnol.Prog.17:791-797(2001)。与本文关于其结合用于代谢模型和模拟的OptKnock计算框架的用途所述的所有方法一样，减少迭代计算分析中的冗余的整数切割方法还可以与本领域所熟知的其他计算框架(包括，例如一起应用。
本文示例性的方法允许生物合成地生产所需产品的细胞和生物的构建，包括靶生化产品的生产与被设计包括所识别的基因改变的细胞或生物生长的强制耦合。因此，本文所述的计算方法允许通过选自OptKnock或的硅内方法识别的代谢修饰的识别和实施。代谢修饰组可包括，例如一种或多种生物合成途径酶的添加和/或一种或多种代谢反应的功能中断(包括，例如通过基因删除中断)。
如上文所讨论，该OptKnock方法的开发前提是当遭受长期的生长选择时突变微生物网络可以朝向其计算地预测最大生长显型进化。换言之，该方法利用生物在选择压力下的自优化能力。该OptKnock框架允许有基于网络化学计量强迫形成生化生产和细胞生长之间的耦合的基因删除组合的穷尽枚举(exhaustiveenumeration)。最佳基因/反应敲除的确认需要双层优化问题的解，所述解选择活性反应组以便所得网络的最佳生长解超过定额地生产相关生化品(Burgard等人,Biotechnol.Bioeng.84:647-657(2003))。
大肠杆菌代谢的硅内化学计量模型可用以识别代谢途径必需的基因，如先前示范以及描述，见于，例如美国专利公布US2002/0012939、US2003/0224363、US2004/0029149、US2004/0072723、US2003/0059792、US2002/0168654和US2004/0009466以及见于美国专利号7,127,379。如本文所披露，OptKnock数学框架可用以精确地定位基因删除，导致所需产品的耦合生长的生产。进一步地，双层OptKnock问题的解仅提供一组删除。要枚举所有有意义的解，即导致耦合生长的生产的形成的所有敲除组，可以实施优化技术，称为整数切割。这必伴有通过在每次迭代时纳入被称为整数切割的另一约束因素迭代地解决该OptKnock问题，如上文所讨论。
如本文所披露，可将编码4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺途径的所需活性的核酸引入宿主生物。在某些情况下，修饰4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺途径酶或者蛋白质以提高4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺的生产，这会是可取的。例如，可将增加蛋白质或者酶的活性的已知突变引入编码核酸分子。另外，可以采用优化方法来提高酶或者蛋白质的活性和/或降低抑制活性，例如，降低负调节因子的活性。
一种这类的优化方法是定向进化。定向进化是一种涉及引入靶向特异性基因的突变以改善和/或改变酶的特性的强有力的方法。可以通过开发和实施允许许多酶变体(如>104)的自动筛选的敏感性高通量筛选测定确定改善和/或改变的酶。通常进行迭代轮的诱变和筛选，以使酶具有优化的特性。可有助于识别进行诱变的基因区域的计算算法也已经被开发并可以显著地减少需要生成和筛选的酶变体的数目。已经开发了大量的定向进化技术(参阅Hibbert等人,Biomol.Eng22:11-19(2005)；Huisman和Lalonde,InBiocatalysisinthepharmaceuticalandbiotechnologyindustriespgs.717-742(2007),Patel(ed.),CRCPress；Otten和Quax.Biomol.Eng22:1-9(2005).；以及Sen等人,ApplBiochem.Biotechnol143:212-223(2007))以有效地创建多样化变体库并且这些方法已被成功地应用于许多酶类别范围内各种特性的改善。通过定向进化技术改善和/或改变的酶特性包括，例如选择性/特异性-针对非自然底物的转化；温度稳定性-针对鲁棒高温处理；pH值稳定性-针对较低或较高pH值条件下的生物工艺；底物或产物容忍性(tolerence)–以便可以实现高产物滴度；结合性(Km)-扩大底物结合以包括非自然底物；抑制性(Ki)–以通过产物、底物或关键的中间体去除抑制；活性(kcat)-提高酶催反应速率，以获得所需通量；表达水平-增加蛋白质收率和整个途径通量；氧稳定性-针对在有氧条件下空气敏感性酶的操作；以及厌氧活性-针对缺氧条件下需氧酶的操作。
已经开发了大量示例性的方法用于基因的诱变和多样化以靶向特异性酶的所需特性。这类方法为本领域的技术人员所熟知。任何这些方法可用以到改变和/或优化4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BDO或者腐胺途径酶或者蛋白质的活性。这类方法包括但不仅限于EpPCR，其通过降低PCR反应中DNA聚合酶的保真度引入随机点突变(Pritchard等人,JTheor.Biol.234:497-509(2005))；易错滚环扩增(epRCA)，其与epPCR类似，除了整个环状质粒被用作模板以及在最后2个核苷酸上具有核酸外切酶抗性硫代膦酸酯键的随机6-引物被用以扩增该质粒，接着转化至细胞，在那里该质粒以串联反复被再环化(Fujii等人,NucleicAcidsRes.32:e145(2004)；以及Fujii等人,Nat.Protoc.1:2493-2497(2006))；DNA或家族改组，其通常涉及以核酸酶(如脱氧核糖核酸酶I或核酸内切酶V)消化2种或2种以上的变体基因，以生成随机片段池，所述随机片段在DNA聚合酶的存在下通过退火和扩展循环进行重装，以创建嵌合基因库(Stemmer,ProcNatlAcadSciUSA91:10747-10751(1994)；以及Stemmer,Nature370:389-391(1994))；交错延伸(StEP)，其必伴有模板引物，接着是以变性和持续非常短(短似5秒)的退火/延伸进行的2步PCR的重复循环(Zhao等人,Nat.Biotechnol.16:258-261(1998))；随机引物重组(RPR)，其中随机序列引物被用以生成许多与不同的模板段互补的短DNA片段(Shao等人,NucleicAcidsRes26:681-683(1998))。
其他的方法包括异源双链重组，其中线性质粒DNA被用以形成通过错配修复得以修复的异源双链(Volkov等人，NucleicAcidsRes.27:e18(1999)；以及Volkov等人,MethodsEnzymol.328:456-463(2000))；临时模板随机嵌合生长(RACHITT)，其采用单链DNA的脱氧核糖核酸酶I断裂和大小分级(Coco等人,Nat.Biotechnol.19:354-359(2001))；截短状模板重组延伸(RETT)，其必伴有在单向单链DNA片段作为模板池的存在下自引物单向生长的链的模板切换(Lee等人,J.Molec.Catalysis26:119-129(2003))；简并寡核苷酸基因改组(DOGS)，其中简并引物被用以控制分子之间的重组；(Bergquist和Gibbs、MethodsMol.Biol352:191-204(2007)；Bergquist等人,Biomol.Eng22:63-72(2005)；Gibbs等人,Gene271:13-20(2001))；渐进式切割产生杂合酶(ITCHY)，其创建带有相关基因或基因片段的1碱基对删除的组合库(Ostermeier等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:3562-3567(1999)；以及Ostermeier等人,Nat.Biotechnol.17:1205-1209(1999))；硫代渐进式切割产生杂合酶(THIO-ITCHY)，其除了硫代磷酸dNTP被用以产生切割物，几乎与ITCHY相同(Lutz等人,NucleicAcidsRes.29:E16(2001))；SCRATCHY，其是两种用于重组基因的方法DNA改组和ITCHY的组合(Lutz等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:11248-11253(2001))；随机漂变诱变(RNDM)，其中通过epPCR进行突变，接着对保留有用活性的那些进行筛选/选择(Bergquist等人,Biomol.Eng.22:63-72(2005))；序列饱和诱变(SeSaM)，其是一种随机诱变方法，该方法利用硫代磷酸核苷酸的随机掺入和断裂生成随机长度片段池；该池被用作模板，以在“通用”碱(如肌苷)的存在下延伸；以及包含肌苷的补体的复制提供随机碱掺入并因此提供诱变(Wong等人,Biotechnol.J.3:74-82(2008)；Wong等人,NucleicAcidsRes.32:e26(2004)；以及Wong等人,Anal.Biochem.341:187-189(2005))；合成改组，其利用被设计以编码“靶中所有的遗传多样性”的重叠的寡核苷酸并允许改组的后代有非常高的多样性(Ness等人,Nat.Biotechnol.20:1251-1255(2002))；核苷酸交换和切除技术(NexT)，其利用dUTP掺入组合，继之以用尿嘧啶DNA糖基化酶然后哌啶进行处理，以执行端点DNA断裂(Muller等人,NucleicAcidsRes.33:e117(2005))。
进一步的方法包括不依赖序列同源性的蛋白质重组(SHIPREC)，其中接头被用以促进2个远缘/不相关的基因之间的融合；在这两个之间产生一系列嵌合体，产生单交叉融合文库(Sieber等人,Nat.Biotechnol.19:456-460(2001))；基因位点饱和诱变TM(GSSMTM)，其中起始材料包括在所需的突变位点具有插入和2个引物简并的超螺旋双链DNA(dsDNA)质粒(Kretz等人,MethodsEnzymol.388:3-11(2004))；组合式盒式诱变(CCM)，其涉及短寡核苷酸盒以大量可能的氨基酸序列改变取代有限区域的用途(Reidhaar-Olson等人MethodsEnzymol.208:564-586(1991)；以及Reidhaar-Olson等人Science241:53-57(1988))；组合式多重盒式诱变(CMCM)，其在本质上与CCM相似，以及以高突变速率使用epPCR，以确认热点和热区域，然后通过CMCM延伸，以覆盖蛋白质序列空间的限定区域(Reetz等人,Angew.Chem.Int.EdEngl.40:3589-3591(2001))；致突变菌株技术，其中附条件的ts致突变质粒利用编码DNA聚合酶III的突变体亚基的mutD5基因，以允许选择期间随机和自然突变频率增加20-到4000-X以及当无需选择时，允许阻碍有害突变的累积(Selifonova等人,Appl.Environ.Microbiol.67:3645-3649(2001))；Low等人,J.Mol.Biol.260:359-3680(1996))。
其他示例性的方法包括精确诱变(LTM)，其是一种评估和优化选择氨基酸的组合突变的多维诱变方法(Rajpal等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA102:8466-8471(2005))；基因重装，其是一种DNA改组方法，该方法可以一次应用于多个基因或应用于创建单基因的大型嵌合体(多重突变)文库(VereniumCorporation提供的可调基因重装TM(TGRTM)技术)；硅内蛋白质设计自动化(PDA)，其是一种优化算法，所述算法固定具有特定折叠子的结构上限定的蛋白质骨架，以及为可以稳固该折叠子和整个蛋白质能量的氨基酸替代寻找序列空间，以及一般地，对具有已知三维结构的蛋白质最有效(Hayes等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA99:15926-15931(2002))；以及迭代饱和诱变(ISM)，其涉及利用结构/功能的知识选择用于酶改善的适当的位点，利用诱变方法，如StratageneQuikChange(加利福尼亚圣地亚哥Stratgene)在选定的位点进行饱和诱变，筛选/选择所需的特性，以及利用改善的克隆，在另一位点重新开始并持续重复直至获得所需的活性(Reetz等人,Nat.Protoc.2:891-903(2007)；以及Reetz等人,Angew.Chem.Int.EdEngl.45:7745-7751(2006))。
前述的用于诱变的任何方法可以单独或以任何组合使用。此外，所述定向进化方法的任何一种或组合可以结合适应性进化技术使用，如本文所述。
应应理解，本质上不影响本发明各种实施方式的效能的修改也包含在本文提供的本发明的定义中。因此，下文的实施例旨在说明而非限制本发明。
实施例I
4-羟基丁酸的生物合成
该实施例描述用于4-HB生产的示例性生化途径。
先前报告的微生物中4-HB的合成已经将重点集中在将这种化合物作为可生物降解的塑料聚羟基脂肪酸酯(PHA)生产中的中间体(美国专利号6,117,658)。使用4-HB/3-HB共聚物优于使用聚-3-羟基丁酸盐聚合物(PHB)，因为其可以生产脆性较小的塑料(Saito和Doi,Intl.J.Biol.Macromol.16:99-104(1994))。本文所述的单体4-HB的生产是一种从根本上不同的工艺，有如下几种原因：(1)该产品是分泌的，与细胞内生产并且保留在细胞内的PHA形成对照；(2)对于生产羟基丁酸酯聚合物的生物，与其说其不生产游离的4-HB，而宁可说是通过聚羟基脂肪酸酯合酶利用辅酶A衍生物；(3)在聚合物的情况下，粒状产物的形成改变了热力学；以及(4)细胞外pH值不是影响聚合物生产的问题，尽管它会影响4-HB是以游离酸还是以共轭碱的状态存在，还会影响4-HB和GBL之间的平衡。
可以通过两个酶还原步骤、以琥珀半醛作为中间体从琥珀酸(TCA循环的中心代谢产物)生产4-HB(图1)。这些酶的第一种是对许多生物(包括大肠杆菌)来说是原生的琥珀半醛脱氢酶，其中NADH-依赖的酶和NADPH-依赖的酶均已被发现(Donnelly和Cooper，Eur.J.Biochem.113:555-561(1981)；Donnelly和Cooper,J.Bacteriol.145:1425-1427(1981)；Marek和Henson、J.Bacteriol.170:991-994(1988))。还有证据支持酿酒酵母中琥珀半醛脱氢酶的活性(Ramos等人,Eur.J.Biochem.149:401-404(1985))，以及已通过序列同源性对假定的基因进行了确认。然而，大部分报告表明这种酶按琥珀酸合成的方向前进，如图1所示(Donnelly和Cooper,同上；Lutke-Eversloh和Steinbuchel,FEMSMicrobiol.Lett.181:63-71(1999))，参与4-HB和γ-氨基丁酸的降解途径。琥珀半醛也经由两种酶谷氨酸：琥珀半醛转氨酶和谷氨酸脱羧酶的作用通过TCA循环中间体α-酮戊二酸由某些微生物如大肠杆菌原生生产。专性厌氧微生物克鲁佛氏梭菌降解琥珀酸所用的可选途径促使琥珀酸转化为琥珀酰-CoA，然后利用已知按这个方向起作用的可选琥珀半醛脱氢酶将琥珀酰-CoA转化为琥珀半醛(Sohling和Gottschalk、Eur.J.Biochem.212:121-127(1993))。然而，这种路径将琥珀酸转化为琥珀酰-CoA需要ATP能源消耗。
该途径的第二种酶4-羟基丁酸酯脱氢酶对于大肠杆菌或者酵母来说是非原生的，但其在各种细菌(如克鲁佛氏梭菌和富养罗尔斯通氏菌)中得以发现(Lutke-Eversloh和Steinbuchel,同上；Sohling和Gottschalk,J.Bacteriol.178:871-880(1996)；Valentin等人,Eur.J.Biochem.227:43-60(1995)；Wolff和Kenealy,ProteinExpr.Purif.6:206-212(1995))。已知这些酶是NADH-依赖的，虽然也存在NADPH-依赖的形成。从α-酮戊二酸到4-HB的其他途径在大肠杆菌中得到证实，导致了聚(4-羟基丁酸)的累积(Song等人,WeiShengWuXue.Bao.45:382-386(2005))。重组菌株需要三种异源性基因PHA合酶(富养罗尔斯通氏菌)、4-羟基丁酸脱氢酶(富养罗尔斯通氏菌)和4-羟基丁酸：CoA转移酶(克鲁佛氏梭菌)以及两种原生大肠杆菌基因谷氨酸：琥珀半醛转氨酶和谷氨酸脱羧酶的过表达。图1中的步骤4和5可以通过α-酮戊二酸脱羧酶(如在薄肌眼虫中确认的α-酮戊二酸脱羧酶)以二择一的方式执行(Shigeoka等人,Biochem.J.282(Pt2):319-323(1992)；Shigeoka和Nakano,Arch.Biochem.Biophys.288:22-28(1991)；Shigeoka和Nakano,BiochemJ.292(Pt2):463-467(1993))。然而，先前并未应用这种酶来影响任何生物中4-HB或者相关聚合物的生产。
利用每种生物的硅内代谢模型在两种微生物大肠杆菌和酿酒酵母中研究了4-羟基丁酸盐的微生物生产能力。通向4-HB的潜在途径经由琥珀酸、琥珀酰-CoA或者α-酮戊二酸中间体前进，如图1所示。
从琥珀酸到4-HB的生产途径中的第一步骤涉及经由NADH-依赖的琥珀半醛脱氢酶或者NADPH-依赖的琥珀半醛脱氢酶从琥珀酸到琥珀半醛的转化。在大肠杆菌中，gabD是一种NADP-依赖的琥珀半醛脱氢酶以及是4-氨基丁酸摄取和降解中涉及的基因簇的部分(Niegemann等人,.Arch.Microbiol.160:454-460(1993)；Schneider等人,J.Bacteriol.184:6976-6986(2002))。认为，sad编码针对NAD-依赖的琥珀半醛脱氢酶活性的酶(Marek和Henson,同上)。酿酒酵母仅包含NADPH-依赖的琥珀半醛脱氢酶，假定其分配给局部化至细胞溶质的UGA2(Huh等人,Nature425:686-691(2003))。假设在大肠杆菌和酿酒酵母中从琥珀酸到4-HB的途径的最大收率计算仅需要做这种假设：已经将非原生的4-HB脱氢酶加入它们的代谢网络。
从琥珀酰-CoA到4-羟基丁酸盐的途径被描述为用于制造聚羟基脂肪酸酯(包括4-羟基丁酸盐单体单元)的工艺的一部分，见美国专利号6,117,658。克鲁佛氏梭菌是一种已知具有CoA-依赖的琥珀半醛脱氢酶活性的实施例生物(Sohling和Gottschalk,同上；Sohling和Gottschalk,同上)。在该研究中，假设在大肠杆菌或者酿酒酵母连同非原生或者异源性4-HB脱氢酶中表达来自克鲁佛氏梭菌或者另一生物的这种酶，以完成从琥珀酰-CoA到4-HB的途径。从α-酮戊二酸到4-HB的途径在大肠杆菌中得到证实，导致了聚(4-羟基丁酸)累积形成30％干细胞重量(Song等人,同上)。由于大肠杆菌和酿酒酵母原生或者内源地具有谷氨酸：琥珀半醛转氨酶和谷氨酸脱羧酶(Coleman等人,J.Biol.Chem.276:244-250(2001))，仅通过假设存在非原生4-HB脱氢酶便可以在这两种生物中完成从AKG到4-HB的途径。
实施例II
从琥珀酸和α-酮戊二酸到1,4-丁二醇的生物合成
该实施例描述从微生物构建和生物合成生产4-HB和BDO。本文披露了4-HB和BDO途径。
存在几种可以用于上文所述途径的可选酶。可以用以与步骤9相似的方式起作用的CoA转移酶(如克鲁佛氏梭菌cat1基因编码的CoA转移酶)替换用于从琥珀酸到琥珀酰-CoA的转化(图1中步骤1)的原生或者内源性的酶(Sohling和Gottschalk,Eur.JBiochem.212:121-127(1993))。然而，通过这种酶生产乙酸或许不是最佳的，因为它有可能是被分泌而不是被转化回乙酰基-CoA。从这方面讲，取消步骤9中乙酸的形成也是会有益处的。作为这种CoA转移酶的一种选择，可以采用这样的机理：其中4-HB首先通过ATP进行磷酸化，然后转化为CoA衍生物，类似于大肠杆菌中用于从乙酸到乙酰基-CoA的转化的乙酸激酶/磷酸转乙酰酶途径。这种路径的净消耗是一种ATP，这与从乙酸再生乙酰基-CoA所需的相同。已知，酶磷酸丁酰转移酶(ptb)和丁酸激酶(BK)在非羟基化的分子上执行这些步骤，以在丙酮丁醇梭菌中生产丁酸盐(Cary等人,ApplEnvironMicrobiol56:1576-1583(1990)；Valentine,R.C.和R.S.Wolfe,JBiolChem.235:1948-1952(1960))。这些酶是可逆的，允许合成按4-HB的方向前进。
除了或者代替通过琥珀酸，BDO还可以经由α-酮戊二酸生产。如前文所述以及下文进一步示范，完成产品生物合成的一个途径是利用内源性酶经由α-酮戊二酸生产琥珀半醛(图1，步骤4-5)。一种替换方式是利用可以经一个步骤执行这种转化的α-酮戊二酸脱羧酶(图1，步骤8；Tian等人,ProcNatlAcadSciUS.A102:10670-10675(2005))。
为构建产BDO的微生物的不同菌株，集合了一列可适用的基因用于确证。简言之，利用可用的文献资源、NCBI遗传数据库以及同源性搜索确认了4-HB和/或BDO生物合成途径内的一种或者多种基因，用于图1所示的完整的BDO生产途径的每个步骤。在该研究中克隆并评估的基因连同适当的参考文献和对多肽序列的URL引用列在下文的表6中。如下文进一步所讨论，合成一些基因用于密码子优化而经由PCR从原生或者野生型生物的基因组DNA克隆其他基因。用于某些基因，两种方法均采用，以及在这种情况下，当原生基因被用于实验时，通过基因确认编码的后缀“n”指出该原生基因。注意只有DNA序列是不同的；蛋白质是相同的。
表6.产BDO的宿主微生物内表达的基因
1Sohling和Gottschalk,Eur.J.Biochem.212:121-127(1993)；Sohling和Gottschalk,J.Bacteriol.178:871-880(1996)
2Nolling等人,J.,J.Bacteriol.183:4823-4838(2001)
3Pohlmann等人,Nat.Biotechnol.24:1257-1262(2006)
4Kosaka等人,Biosci.Biotechnol.Biochem.71:58-68(2007)
5Brosch等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.104:5596-5601(2007)
6Henne等人,Appl.Environ.Microbiol.65:3901-3907(1999)
用于BDO途径的表达载体构建.从Dr.RolfLutzofExpressys(www.expressys.de/)获得了载体骨架和一些菌株。该载体和菌株基于Dr.RolfLutz和Prof.HermannBujard开发的pZ表达系统(Lutz,R.和H.Bujard,NucleicAcidsRes25:1203-1210(1997))。获得的载体是pZE13luc、pZA33luc、pZS*13luc和pZE22luc以及包含萤光素酶基因作为填充片段。为用两侧是适当的限制酶位点的lacZ-α片段替换该萤光素酶填充片段，首先通过利用EcoRI和XbaI的消化从每个载体去除该萤光素酶填充片段。用如下的引物从pUC19PCR扩增该lacZ-α片段：
lacZα-RI
5’GACGAATTCGCTAGCAAGAGGAGAAGTCGACATGTCCAATTCACTGGCCGTCGTTTTAC3’
lacZα3'BB
5’-GACCCTAGGAAGCTTTCTAGAGTCGACCTATGCGGCATCAGAGCAGA-3’。
这生成了具有EcoRI位点、NheI位点、核糖体结合位点、SalI位点和起始密码子的5’端的片段。在该片段的3’端包含终止密码子、XbaI、HindIII以及AvrII位点。用EcoRI和AvrII消化PCR产物并连接入用EcoRI和XbaI消化的基本载体(XbaI和AvrII具有配伍末端以及生成非位点)。因为NheI和XbaI限制酶位点生成可以连接在一起的配伍末端(但是生成不通过这两种酶的任意一种消化的NheI/XbaI非位点)，所以克隆入所述载体的基因可以一起形成生物砖块(Biobrick)(http://openwetware.org/wiki/Synthetic_Biology:BioBricks)。简言之，这种方法允许将数量不限的基因连接入利用这2个相同的限制位点的载体(只要该位点不出现在该基因的内部)，因为每次添加后会将基因之间的位点破坏。
所有的载体都具有pZ名称，后面是指示复制来源、抗生素抗性标记和启动子/调节单元的字母和数字。复制来源是第二个字母以及对于基于ColE1、p15A和pSC101的来源分别用E、A和S指示。第一个数字代表抗生素抗性标记(1针对氨苄青霉素、2针对卡那霉素、3针对氯霉素、4针对奇霉素以及5针对四环素)。最后的数字限定调节相关基因的启动子(1针对PLtetO-1、2针对PLlacO-1、3针对PA1lacO-1以及4针对Plac/ara-1)。后面紧跟着MCS和相关基因。对于本文所讨论的发明，我们采用两种基本载体pZA33和pZE13，对其进行修饰以进行如上文所讨论的生物砖块插入物。一旦相关基因被克隆入这些载体，便利用表6提供的四位数字基因编码指明生成的质粒；如pZA33-XXXX-YYYY-…
宿主菌株构建.本文所述的所有研究中的亲株是大肠杆菌K-12菌株MG1655。由第三方根据服务合同利用redET方法构建了adhE、gabD以及aldA中的无痕敲除(Markerlessdeletion)菌株(Datsenko,K.A.和B.L.Wanner,ProcNatlAcadSciUS.A97:6640-6645(2000))。经由噬菌体P1介导的转导构建了后续的菌株(Miller,J.ExperimentsinMolecularGenetics,ColdSpringHarborLaboratories,NewYork(1973))。从Expressys获得了菌株C600Z1(laciq,PN25-tetR,SpR,lacY1,leuB6,mcrB+,supE44,thi-1,thr-1,tonA21)并将其作为lacIq等位基因的源，用于P1转导。在奇霉素抗性基因连接至该lacIq的C600Z1大肠杆菌菌株上培养了噬菌体P1vir。使用在C600Z1上培养的P1裂解液传染对奇霉素抗性具有选择性的MG1655。然后通过测定转导子抑制连接至PA1lacO-1启动子的基因表达的能力筛选用于连接lacIq的奇霉素抗性菌落。所得的菌株为指定的MG1655lacIq。利于类似的程序将lacIQ引入该敲除菌株。
从琥珀酸到4-HB的生产.为从琥珀酸构建4-HB生产者，将编码从琥珀酸到4-HB和4-HB-CoA的步骤(图1中1、6、7和9)的基因聚集到该pZA33和pZE13载体，如下文所述。对基因的各种组合以及作为对照的承载有不完整途径的构造进行评估(表7和8)。然后将质粒转换为包含lacIQ的宿主菌株，这允许通过添加异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)进行诱导型表达。对野生型和具有编码原生琥珀半醛脱氢酶的基因缺失的宿主均进行了测试(图1步骤2)。
首先利用菌株MG1655lacIQ作为用于包含途径基因的质粒构造的宿主以体外测定方式对异源性酶的活性进行测试。在好氧条件下于包含适用于每种构造的抗生素的LB培养基(Difco)中培养细胞，以及当光密度(OD600)达到大约0.5时通过添加1mM的IPTG诱导细胞。6小时后收获细胞，以及如下文所讨论进行酶测定。
体外酶测定.为获得用于活性测定的粗提取物，通过以4,500rpm离心(Beckman-Coulter,AllegeraX-15R)10min收获细胞。在具有benzonase核酸酶和溶菌酶的0.3mLBugBuster(Novagen)试剂中再悬浮细胞团，以及室温下轻轻摇晃使溶解进行15min。在4℃下通过以14,000rpm离心(Eppendorfcentrifuge5402)30min获得不含细胞的裂解液。利用Bradford等人,Anal.Biochem.72:248-254(1976)所述的方法确定样本中的细胞蛋白质，以及如下文所述进行特异性酶测定。活性以单元/mg蛋白质的形式报告，其中一单元的活性定义为在室温下1min内转化1μmol底物所需的酶的量。一般地，报告的数值是至少3次重复测定的平均值。
遵循先前所述的程序Sohling和Gottschalk,J.Bacteriol.178:871-880(1996)，通过监测从琥珀酰-CoA和乙酸到乙酰基-CoA的形成测定了琥珀酰-CoA转移酶(Cat1)的活性。在ATP的存在下，通过遵循从琥珀酸和CoA到琥珀酰-CoA的形成测定了琥珀酰-CoA合成酶(SucCD)的活性。该实验遵循Cha和Parks,J.Biol.Chem.239:1961-1967(1964)所述的程序。在琥珀酸半醛和CoA的存在下，通过遵循340nm下NAD到NADH的转化测定了依赖CoA的琥珀酸半醛脱氢酶(sucD)的活性(Sohling和Gottschalk,Eur.J.Biochem.212:121-127(1993))。在琥珀酸半醛的存在下，通过监测340nm下NADH到NAD的氧化测定了4-HB脱氢酶(4-HBd)的酶活性。该实验遵公布的程序Gerhardt等人Arch.Microbiol.174:189-199(2000)。利用修改自Scherf和Buckel,Appl.Environ.Microbiol.57:2699-2702(1991)的程序测定了4-HBCoA转移酶(cat2)的活性。利用HPLC对4-HB-CoA的形成或者从乙酰基-CoA和4-HB或者丁酸盐到丁酰-CoA的形成进行了测定。
利用对一些文献源(Durre等人,FEMSMicrobiol.Rev.17:251-262(1995)；Palosaari和Rogers,J.Bacteriol.170:2971-2976(1988)和Welch等人,Arch.Biochem.Biophys.273:309-318(1989)做过适应性修改的程序按还原方向测定了乙醇(ADH)和醛(ALD)脱氢酶。NADH氧化后，于室温下每四秒读取一次340nM波长处的吸光度，总共达240秒。在100mMMOPS(用KOH调整到pH7.5)、0.4mMNADH和从1到50μl的细胞提取物中进行了还原测定。通过添加如下试剂开始反应：针对ADH，100μl的100mM乙醛或丁醛；或者针对ALD，100μl的1mM乙酰基-CoA或者丁酰-CoA。分光光度计很快变为空白，然后开始动力学读取。所得的每分钟340nM处的吸光度减少斜率连同340nM(6000)处NAD(P)H的摩尔消光系数以及提取物的蛋白质浓度可用以到确定比活。
按从丁酰-CoA到丁酰-磷酸的方向测量PTB的酶活性，如Cary等人J.Bacteriol.170:4613-4618(1988)所述。它提供用于转化的无机磷酸，以及遵循具有试剂5,5’-二硫双-(2-硝基苯甲酸)或者DTNB的游离CoA的增加。DTNB很快与硫醇基团(如游离CoA)反应，释放黄色的2-硝基-5-巯基苯甲酸(TNB)，该酸在412nm处以14,140Mcm-1的摩尔消光系数吸光。分析缓冲液包含pH7.4的150mM磷酸钾、0.1mMDTNB以及0.2mM丁酰-CoA，以及通过添加2到50μL细胞提取物开始反应。按消耗ATP从丁酸盐到丁酰-磷酸形成的方向测量BK的酶活性。该程序类似于先前Rose等人,J.Biol.Chem.211:737-756(1954)所述的乙酸激酶检测。然而，我们已经发现Sigma提供的另一乙酸激酶酶检测方案更有用以及更具敏感性。这种检测将通过乙酸激酶从ATP到ADP的转化连接至通过丙酮酸激酶从ADP和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)到ATP和丙酮酸的连接转化，接着连接至通过乳酸脱氢酶从丙酮酸和NADH到乳酸和NAD+的转化。用丁酸代替乙酸是唯一大的修改，以允许检测遵循BK酶活性。检测混合物包含pH7.6的80mM三乙醇胺缓冲液、200mM丁酸钠、10mMMgCl2、0.1mMNADH、6.6mMATP、1.8mM磷酸烯醇丙酮酸。根据生产者的指示添加丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶以及肌激酶。通过添加2到50μL细胞提取物开始反应，以及基于指示NADH氧化的340nm处吸光度的减少对反应进行监测。
通过HPLC分析CoA衍生物.建立一种基于HPLC的检测以监测涉及辅酶A(CoA)转移的酶反应。所建立的方法允许通过定量测定在体外反应混合物中存在的CoA、乙酰基CoA(AcCoA)、丁酰CoA(BuCoA)和4-羟基丁酸CoA(4-HBCoA)来进行酶活性表征。实现了低至低μM的敏感性以及所有相关CoA衍生物的良好的分离度。
进行了化学品和样本制备如下。简言之，从Sigma-Aldrich获得了CoA、AcCoA、BuCoA以及所有其他的化学品。溶剂甲醇和乙腈是HPLC级别的。标准的校准曲线显示了0.01-1mg/mL浓度范围内的良好线性。酶反应混合物包含100mMTrisHCl缓冲液(pH7)，我们在不同的时间点取等分试样，用甲酸(0.04％终浓度)淬火以及通过HPLC直接分析。
利用配有二元泵、脱气器、恒温自动进样器和柱室的Agilent1100HPLC系统进行HPLC分析，以及将二极管阵列检测器(DAD)用于该分析。采用反相柱Kromasil1005umC184.6x150mm(PeekeScientific)。将25mM磷酸钾(pH7)和甲醇或者乙腈用作水相和有机溶剂，流速为1mL/min。建立了两种方法：具有更快梯度的用于分析分离度良好的CoA、AcCoA和BuCoA的短期方法，以及用于区别洗脱很相近的AcCoA和4-HBCoA的长期方法。短期方法采用了乙腈梯度(0min–5％、6min–30％、6.5min–5％、10min–5％)以及分别针对CoA、AcCoA和BuCoA产生了保留时间2.7、4.1和5.5min。在所述长期方法中，采用了甲醇，线性梯度如下：0min–5％、20min–35％、20.5min–5％、25min–5％。针对CoA、AcCoA、4-HBCoA和BuCoA的保留时间分别是5.8、8.4、9.2和16.0min。进样量是5μL，柱温是30℃，以及在260nm处监测UV吸光度。
结果证实了四种途径步骤的每种的活性(表7)，尽管显然地，活性取决于基因源、基因在载体中的位置以及表达该基因的其他基因的背景。例如，基因0035编码琥珀半醛脱氢酶，该酶比0008编码的酶更具活性，以及0036和0010n是比0009更具活性的4-HB脱氢酶基因。当在相同的操纵子上在其前面有另一基因时，似乎也更具4-HB脱氢酶活性。
表7.来自MG1655lacIQ的包含表达4-HB-CoA途径中基因的质粒的细胞提取物中的体外酶活性。活性以单元/mg蛋白质的形式报告，其中一单元的活性定义为在室温下1min内转化1μmol底物所需的酶的量。
从pZE13(一种具有colE1来源和氨苄青霉素抗性的高拷贝质粒)上
的Plac表达基因。基因确认编码如表6中所提供。
从pZA33(一种具有pACYC来源和氯霉素抗性的中拷贝质粒)上
的Plac表达基因。
(c)提供的细胞蛋白质单位是mg蛋白质/mL提取物。
然后对包含4-HB途径中基因的重组菌株进行从中心代谢中间体活体内生产4-HB的能力的评估。厌氧条件下于LB培养基中培养细胞至OD600大约0.4，然后用1mMIPTG进行诱导。1小时后，添加琥珀酸钠至10mM，以及取样本用于额外24和48小时的分析。如下文所述通过GC-MS分析培养肉汤中的4-HB。结果表明，24小时后，该重组菌株可以生产超过2mM4-HB，与对照菌株中的基本上为0的数据形成对比(表8)。
表8.在含有表达各种组合的4-HB途径基因的质粒的大肠杆菌菌株中从琥珀酸生产4-HB.
(a)归一化4-HB浓度，M/OD600单元
利用CoA转移酶(cat1)从琥珀酸生产琥珀酰-CoA的替代性选择是利用编码琥珀酰-CoA合成酶的原生大肠杆菌sucCD基因。将这种基因簇连同候选基因克隆到pZE13上用于通向4-HB的后续步骤，以创建pZE13-0038-0035-0036。
从葡萄糖生产4-HB.然上述实验证实从中心代谢中间体(琥珀酸)到4-HB的途径有用，但是工业过程则需要从廉价的碳水化合物原料(如葡萄糖或者蔗糖)生产化学品。因此，下一组实验旨在确定由细胞在葡萄糖上培养期间生产的内源性琥珀酸是否可以为4-HB途径提供燃料。于厌氧条件下在补充有20g/L葡萄糖、100mM3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)以改善缓冲容量、10μg/mL硫胺以及适当的抗生素的M9基本培养基(6.78g/LNa2HPO4、3.0g/LKH2PO4、0.5g/LNaCl、1.0g/LNH4Cl、1mMMgSO4、0.1mMCaCl2)中培养细胞。当OD600达到大约0.2时添加0.25mMIPTG，以及诱导后每24小时取样本用于4-HB分析。在所有的情况下，24小时之后4-HB都达到平衡，在最好的菌株中最大约为1mM(图3a)，而琥珀酸浓度持续升高(图3b)。这表明，提供给该所述途径的琥珀酸很可能是不受限的，以及瓶颈可能在于酶本身的活性或在于NADH的可用性。显然，0035和0036分别是用于依赖CoA的琥珀半醛脱氢酶和4-HB脱氢酶的最好的候选基因。去除编码已知(gabD)或者假定(aldA)的原生琥珀半醛脱氢酶的所述基因的一种或者两种对性能的影响微乎其微。最后，应注意的是，细胞在生产4-HB的菌株中比在对照中生长的OD低得多(图3c)。
用于从葡萄糖生产4-HB的替代性途径是经由a-酮戊二酸。我们研究了来自结核分枝杆菌Tian等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA102:10670-10675(2005)的α-酮戊二酸脱羧酶用于直接从α-酮戊二酸生产琥珀半醛(图1步骤8)的用途。为证实这种基因(0032)在体内有用，我们在相同的宿主中将其表达于pZE13上，而4-HB脱氢酶(基因0036)表达于pZA33上。在使用1mMIPTG进行诱导后24小时内，这种菌株能够生产超过1.0mM4-HB(图4)。由于这种菌株没有表达依赖CoA的琥珀半醛脱氢酶，所以消除了经由琥珀酰-CoA生产琥珀半醛的可能性。还有可能的是，负责生产琥珀半醛的原生基因可在这种途径中起作用(图1步骤4和5)；然而，当宿主不含pZE13-0032质粒时，生产的4-HB的量是微不足道的。
从4-HB生产BDO.从4-HB生产BDO需要脱氢酶催化的两个还原步骤。醇和醛脱氢酶(分别是ADH和ALD)是NAD+/H和/或NADP+/H-依赖的酶，它们可以一起将分子上的羧酸基团还原为醇基团，或者反过来，可以执行从醇到羧酸的氧化。这种生物转换已在野生型丙酮丁醇梭菌(Jewell等人,CurrentMicrobiology、13:215-19(1986))中得以证实，但是无论是负责的酶还是负责的基因都未得到确认。此外，是首先需要激活4-HB-CoA(图1步骤9)还是醛脱氢酶(步骤12)可以直接作用于4-HB尚未可知。我们基于4-HB和途径中间体的非羟基化类似物的已知活性，或者通过类似于这些表征的基因(表6)，从丙酮丁醇梭菌和相关的生物开发了一列候选酶。由于这些候选酶的一些是多功能脱氢酶，它们可能既能够催化酸(或者CoA-衍生物)到醛的又能够催化醛到醇的NAD(P)H-依赖的还原。在开始研究大肠杆菌中这些基因之前，我们首先利用丙酮丁醇梭菌ATCC824验证了上文引用的结果。于30℃在10％CO2、10％H2以及80％N2的厌氧气氛下载补充有10mM4-HB的Schaedler肉汤(密歇根州兰辛市Accumedia)中培养细胞。取周期培养样本离心，以及通过GC-MS对肉汤进行BDO分析，如下文所述。分别于1天、2天以及7天孵育之后检测0.1mM、0.9mM以及1.5mM的BDO浓度。在未添加4-HB进行培养的培养物中未检测到BDO。为了证实所生产的BDO衍生自葡萄糖，我们在在补充有4g/L均匀标记的13C-葡萄糖的M9基本培养基中培育了最好的生产BDO的菌株MG1655lacIQpZE13-0004-0035-0002pZA33-0034-0036。在0.67OD下用1mMIPTG诱导细胞，以及24小时之后取出样本。通过质谱分析法进行培养物上清液的分析。
接下来检测当用于4-HB到BDO转化途径的候选基因表达于大肠杆菌宿主MG1655lacIQ时所述基因的活性。于37℃在0.25mMIPTG的存在下培养包含在pZA33上表达的每种候选基因的重组菌株4个小时以完全诱导酶的表达。诱导4个小时之后，收获细胞并如上文所述，测定ADH和ALD活性。由于4-HB-CoA和4-羟基丁醛不能购得，则利用非羟基化的底物进行测定(表9)。对于丙酮丁醇梭菌adhE2(0002)和大肠杆菌adhE(0011)，4碳和2碳底物之间的活性比先前在文献Atsumi等人,Biochim.Biophys.Acta.1207:1-11(1994)中报告的那些类似。
表9.来自包含表达用于醛和醇脱氢酶的候选基因的pZA33的MG1655lacIQ的细胞提取物中的体外酶活性。以μmol/min/mg细胞蛋白质表达活性。N.D.指未测定。
为进行BDO生产实验，将来自牙龈红棕色单胞菌W83(基因0034)的cat2包含在pZA33上，用于4-HB到4-HB-CoA的转化，而将候选脱氢酶基因表达在pZE13上。宿主菌株是MG1655lacIQ。和候选醇和醛脱氢酶一起，由于底物的类似性，我们还检测了依赖CoA的琥珀半醛脱氢酶(sucD)在该步骤中起作用的能力。在补充有10mM4-HB的LB培养基中培养细胞至OD约为0.5，用1mMIPTG进行诱导，以及24小时之后取出培养肉汤样本并如下文所述进行BDO分析。利用来自丙酮丁醇梭菌的adhE2、来自克鲁佛氏梭菌的sucD或者来自牙龈卟啉单胞菌的sucD进行了最好的BDO生产(图5)。有趣的是，生产的BDO绝对量在好氧的条件下较高；但是，这主要是由于在厌氧培养物中获得的细胞密度较低。当归一化为细胞OD时，厌氧条件下每单位生物质的BDO产量较高(表10)。
表10.来自表达来自丙酮丁醇梭菌的adhE2、来自克鲁佛氏梭菌的sucD或者来自牙龈卟啉单胞菌的sucD的细胞的培养物的绝对和归一化的BDO浓度(数据来自图3中实验2、9和10)以及阴性对照(实验1)。
表达的基因 条件 BDO(μM) OD(600nm) BDO/OD
无 好氧 0 13.4 0
无 微好氧 0.5 6.7 0.09
无 厌氧 2.2 1.26 1.75
0002 好氧 138.3 9.12 15.2
0002 微好氧 48.2 5.52 8.73
0002 厌氧 54.7 1.35 40.565 -->
0008n 好氧 255.8 5.37 47.6
0008n 微好氧 127.9 3.05 41.9
0008n 厌氧 60.8 0.62 98.1
0035 好氧 21.3 14.0 1.52
0035 微好氧 13.1 4.14 3.16
0035 厌氧 21.3 1.06 20.1
如上文所讨论，利用用于转化4-HB到4-HB-CoA的路径可能有利，所述路径不生成作为副产物的乙酸。为此目的，我们做了测试，利用来自丙酮丁醇梭菌的磷酸丁酰转移酶(ptb)和丁酸激酶(BK)经由图1中的步骤10和11执行这种转化。克隆了来自丙酮丁醇梭菌(基因0020和0021)的原生ptb/bk操纵子并将其表达在pZA33中。从包含所得构造的细胞中取得提取物以及如本文所述进行两种酶活性测定。BK的比活大约为65U/mg，而PTB的比活大约为5U/mg。将一单元(U)的活性定义为在室温下1min内1μM底物的转化。最后，对所述构造参与4-HB到BDO的转化进行了检测。用所述的pZA33-0020-0021构造和pZE13-0002转换宿主菌株，以及与利用上文图5所用的好氧程序，将cat2用于BDO生产中这一用途形成对比。BK/PTB菌株生产了1mMBDO，与利用cat2时的2mM形成对比(表11)。有趣的是，结果取决于宿主菌株是否包含原生adhE基因缺失。
表11.来自细胞培养物的绝对和归一化的BDO浓度，所述细胞将来自丙酮丁醇梭菌的adhE2表达在pZE13中以及将来自牙龈卟啉单胞菌(0034)的cat2或者来自丙酮丁醇梭菌的PTB/BK基因表达在pZA33上。宿主菌株是MG1655lacIQ或者MG1655ΔadhElacIQ。
基因 宿主菌株 BDO(M) OD(600nm) BDO/OD
0034 MG1655 lacIQ 0.827 19.9 0.042
0020+0021 MG1655 lacIQ 0.007 9.8 0.0007
0034 MG1655ΔadhE lacIQ 2.084 12.5 0.166
0020+0021 MG1655ΔadhE lacIQ 0.975 18.8 0.052
从葡萄糖生产BDO.途径确证的最后步骤是在大肠杆菌中表达该途径的4-HB和BDO段，以及在葡萄糖基本培养基中证实BDO的生产。构建了新的质粒，以便所有需要的基因适于在两种质粒上。一般地，cat1、adhE和sucD基因表达自pZE13，以及cat2和4-HBd表达自pZA33。在MG1655lacIQ背景中检测了各种组合的基因源和基因序列。于厌氧条件下在补充有20g/L葡萄糖、100mM3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)以改善缓冲容量、10μg/mL硫胺以及适当的抗生素的M9基本培养基(6.78g/LNa2HPO4、3.0g/LKH2PO4、0.5g/LNaCl、1.0g/LNH4Cl、1mMMgSO4、0.1mMCaCl2)中培养细胞。接种大约15个小时后添加0.25mMIPTG，以及诱导后24和48小时取培养物上清液样本进行BDO、4-HB以及琥珀酸分析。看起来，BDO的生产显示出对基因序列的依赖性(表12)。通过在pZA33上首先表达cat2，接着表达4-HBd，以及在pZE13上表达cat1，接着表达牙龈卟啉单胞菌sucD获得最高的BDO产量超过0.5mM。在pZE13上的最后位置上添加丙酮丁醇梭菌adhE2产生了轻微的改善。生产的4-HB和琥珀酸的浓度也较高。
表12.在补充有20g/L葡萄糖的基本培养基中培育的、表达多种组合的BDO途径基因的重组大肠杆菌菌株中BDO、4-HB以及琥珀酸的生产。提供的浓度单位为mM。
通过GCMS分析BDO、4-HB和琥珀酸.利用适应性修改自文献报告((Simonov等人,J.AnalChem.59:965-971(2004))的方法，通过GCMS进行甲硅烷基化和定量分析以对发酵和细胞培养样本中的BDO、4-HB和琥珀酸进行衍生化。所建立的方法证实了低至1μM的良好的敏感性、高达至少25mM的线性以及优异的选择性和可再现性。
样本制备如下：在环境温度下于SpeedVac浓缩器(SavantSVC-100H)中干燥100μL过滤的(0.2μm或者0.45μm针筒过滤器)样本(如发酵肉汤、细胞培养或者标准溶液)达大约1小时，接着在二甲基甲酰胺中添加20μL10mM环己醇溶液作为内部标准。在水浴(Branson3510)中将混合物振荡并且进行声处理达15min，以确保均质。添加100μL甲硅烷基化衍生试剂含有1％三甲基氯硅烷的N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)，以及在70℃下孵育混合物30min。对衍生得到的样本离心处理5min，以及将清液直接注入GCMS。所有的化学品和试剂都来自Sigma-Aldrich，但是BDO例外，其购自J.T.Baker。
在Agilent气相色谱仪6890N上执行GCMS，6890N接口到已被用于所述分析的以电子轰击离子化(EI)模式操作的质量选择检测器(MSD)5973N。使用了DB-5MS毛细管柱(J&WScientific,AgilentTechnologies)，30mx0.25mmi.d.x0.25μm膜厚度。以分流进样模式操作GC，以20:1的分流比引入1μL的样本。进样口温度为250℃。将氦用作运载气体，以及将流速保持在1.0mL/min。优化温度梯度方案，以确保相关分析物的良好分离度和最低基质干扰。炉温起初保持在80℃达1min，然后以2℃/min的速度升至120℃，接着以100℃/min的速度快速升至320℃以及最后保持在320℃达6min。将MS接口传输管保持在280℃。利用“低质”MS调谐设置和30-400m/z质量范围扫描获得数据。全部的分析时间为29min(包括3min溶剂延迟)。对于BSTFA衍生得到的环己醇、BDO、4-HB和琥珀酸，保留时间分别对应5.2、10.5、14.0和18.2min。为进行定量分析，选定了如下具体的质量片段(提取离子色谱图)：m/z157用于内部标准的环己醇、116用于BDO以及147用于4-HB和琥珀酸。利用含于相应的细胞培养或者发酵培养基的分析物溶液构建标准的校准曲线，以尽可能接近地匹配样本基质。利用环境数据分析软件ChemStation(AgilentTechnologies)处理GCMS数据。
结果表明，大部分生产的4-HB和BDO用13C做了标记(图6右侧)。示出来自在未标记的葡萄糖中培育的平行培养物(parallelculture)的质谱，用作比较(图6左侧)。注意，所示的峰值针对包含的碳原子数目不同于代谢产物的衍生分子的片段。衍生试剂也贡献了一些碳和硅原子用于天然存在的标记分发，因此该结果是不严格定量。
利用替代性的途径从4-HB生产BDO.也对各种替代性的途径进行了BDO生产检测。这包括利用原生大肠杆菌sucCD酶转化琥珀酸到琥珀酰-CoA(表13，2-3行)，将α-酮戊二酸脱羧酶用于α-酮戊二酸途径(表13，行4)，以及利用PTB/BK作为生成4HB的CoA-衍生物的替代性手段(表13，行1)。构建了包含质粒的菌株，所述质粒表达表13所示的包含这些变体的基因。结果显示，在所有的情况下皆产生了4-HB和BDO(表13)。
表13.在用于不同的BDO途径变体的重组大肠杆菌菌株基因中BDO、4-HB以及琥珀酸的生产，所述基因在厌氧条件下在补充有20g/L葡萄糖的基本培养基中培育，以及用0.1mMIPTG诱导之后24小时收获。提供的浓度单位是mM。
pZE13上的基因 pZA33上的基因 琥珀酸 4-HB BDO
0002+0004+0035 0020n-0021n-0036 0.336 2.91 0.230
0038+0035 0034-0036 0.814 2.81 0.126
0038+0035 0036-0034 0.741 2.57 0.114
0035+0032 0034-0036 5.01 0.538 0.154
实施例III
4-羟基丁酸、γ-丁内酯和1,4-丁二醇的生物合成
该实施例描述利用发酵和其他生物工艺的4-羟基丁酸、γ-丁内酯和1,4-丁二醇的生物合成生产。
下文描述了用于将4-HB发酵步骤整合为用于生产纯化的GBL、1,4-丁二醇(BDO)和四氢呋喃(THF)的完整过程的方法。由于4-HB和GBL处于平衡状态，发酵肉汤会包含这两种化合物。在低pH值下，这种平衡转向对GBL有利。因此，发酵可以在pH值为7.5或者更小的情况下，一般地在pH值为5.5或者更小的情况下操作。去除生物质之后，产物流进入分离步骤，其中除去GBL以及回收利用富集在4-HB中的残余流。最后，蒸馏GBL以除去任何杂质。所述过程以三种方式之一操作：1)补料分批发酵和分批分离；2)补料分批发酵和连续分离；3)连续发酵和连续分离。图7所示为这些模式的前两种的简图。也如下文所描述的整合发酵程序被用于本发明的生产BDO的细胞，以生物合成BDO和后续的BDO家族产物。
生产4-HB/GBL的发酵方案(分批)：利用包含5g/L磷酸钾、2.5g/L氯化铵、0.5g/L硫酸镁以及30g/L玉米浆的5L肉汤以及初始浓度为20g/L的葡萄糖，在用N2/CO2混合物喷射的10L生物反应器中培育生产生物。随着细胞生长和对葡萄糖的利用，以大约等于葡萄糖消耗量的比率向该生物反应器补入另外70％葡萄糖。将该生物反应器的温度保持在30℃。生长持续大约24小时，直至4-HB达到20-200g/L之间的浓度，具有的细胞密度在5和10g/L之间。pH值不进行控制，以及在此次运行结束时，通常会降至pH3-6。培养期一完成，便使发酵罐内容物穿过细胞分离装置(如离心机)，以除去细胞和细胞碎片，以及将发酵肉汤转移至产物分离单元。通过本领域采用的利用不溶于水的有机溶剂(如甲苯)从稀释水相溶液(如液液提取物)分离有机产物的标准分离程序，分离4-HB和/或GBL以提供4-HB/GBL有机溶液。然后用标准的蒸馏方法处理所得的溶液以除去和回收有机溶剂以及提供GBL(沸点204-205℃)，GBL分离为纯化的液体。
生产4-HB/GBL的发酵方案(完全连续)：首先利用上文所述的设备和培养基组分(除了初始葡萄糖浓度是30-50g/L之外)以分批模式培养生产生物。当葡萄糖耗尽时，以0.5L/hr和1L/hr之间的比率连续提供相同组分的填料培养基，以及以相同的比率收回液体。生物反应器中的4-HB浓度恒定在30-40g/L，以及细胞密度恒定在3-5g/L之间。将温度保持在30℃，以及根据需要利用浓NaOH和HCl将pH保持在4.5。生物反应器连续操作一个月，每日取样本以确保4-HB浓度一致。在提供新填料培养基时，以连续模式不断地去除发酵罐内容物。然后用连续产物分离程序处理包含细胞、培养基以及产物4-HB和/或GBL的逸出流，除去或不除去细胞和细胞碎片，以及通过本领域采用的利用不溶于水的有机溶剂(如甲苯)从稀释水相溶液(如连续液液提取物)分离有机产物的标准连续分离方法，分离4-HB和/或GBL以提供4-HB/GBL有机溶液。接着用标准的连续蒸馏方法处理所得的溶液以除去和回收有机溶剂以及提供GBL(沸点204-205℃)，GBL分离为纯化的液体。
GBL还原方案:一旦如上文所述分离并纯化GBL，然后则用还原方案，如本领域熟知的那些还原方案(引用参考文献)，对其进行处理以生产1,4-丁二醇或者四氢呋喃(THF)或者其混合物。熟知的是，在氢压力下多相或者均相氢化催化剂结合GBL提供产物1,4-丁二醇或者四氢呋喃(THF)或者其混合物。重要的是要注意，如上文所述从发酵肉汤分离得到的4-HB/GBL产物混合物可以在GBL分离和纯化之前直接用这些相同的还原方案处理，以提供产物1,4-丁二醇或者四氢呋喃或者其混合物。然后通过本领域熟知的程序对所得的产物1,4-丁二醇和THF进行分离和纯化。
直接生产BDO或者THF的发酵和氢化方案(分批)：利用包含5g/L磷酸钾、2.5g/L氯化铵、0.5g/L硫酸镁以及30g/L玉米浆的5L肉汤以及初始浓度为20g/L的葡萄糖，在用N2/CO2混合物喷射的10L生物反应器中培育细胞。随着细胞生长和对葡萄糖的利用，以大约等于葡萄糖消耗量的比率向该生物反应器补入另外70％葡萄糖。将该生物反应器的温度保持在30℃。生长持续大约24小时，直至4-HB达到20-200g/L之间的浓度，具有的细胞密度在5和10g/L之间。pH值不进行控制，以及在此次运行结束时，通常会降至pH3-6。培养期一完成，便使发酵罐内容物穿过细胞分离装置(如离心机)，以除去细胞和细胞碎片，以及将发酵肉汤转移至还原装置(如氢化器皿)，其中混合物4-HB/GBL直接还原为1,4-丁二醇或者THF或者其混合物。完成该还原程序之后，将反应器内容物转移至产物分离装置。通过本领域采用的利用不溶于水的有机溶剂(如甲苯)从稀释水相溶液(如液液提取物)分离有机产物的标准分离程序，分离1,4-丁二醇和/或THF以提供1,4-丁二醇和/或THF有机溶液。然后用标准的蒸馏方法处理所得的溶液以除去和回收有机溶剂以及提供1,4-丁二醇和/或THF，1,4-丁二醇和/或THF分离为纯化的液体。
直接生产BDO或者THF的发酵和氢化方案(完全连续)：首先利用上文所述的设备和培养基组分(除了初始葡萄糖浓度是30-50g/L之外)以分批模式培养细胞。当葡萄糖耗尽时，以0.5L/hr和1L/hr之间的比率连续提供相同组分的填料培养基，以及以相同的比率收回液体。生物反应器中的4-HB浓度恒定在30-40g/L，以及细胞密度恒定在3-5g/L之间。将温度保持在30℃，以及根据需要利用浓NaOH和HCl将pH保持在4.5。生物反应器连续操作一个月，每日取样本以确保4-HB浓度一致。在提供新填料培养基时，以连续模式不断地去除发酵罐内容物。然后使包含细胞、培养基以及产物4-HB和/或GBL的逸出流穿过细胞分离装置(如离心机)，以除去细胞和细胞碎片，以及将发酵肉汤转移至连续还原装置(如氢化器皿)，其中混合物4-HB/GBL直接还原为1,4-丁二醇或者THF或者其混合物。完成该还原程序之后，将反应器内容物转移至连续产物分离装置。通过本领域采用的利用不溶于水的有机溶剂(如甲苯)从稀释水相溶液(如液液提取物)分离有机产物的标准连续分离程序，分离1,4-丁二醇和/或THF以提供1,4-丁二醇和/或THF有机溶液。然后用标准的连续蒸馏方法处理所得的溶液以除去和回收有机溶剂以及提供1,4-丁二醇和/或THF，1,4-丁二醇和/或THF分离为纯化的液体。
直接生产BDO的发酵方案(分批)：利用包含5g/L磷酸钾、2.5g/L氯化铵、0.5g/L硫酸镁以及30g/L玉米浆的5L肉汤以及初始浓度为20g/L的葡萄糖，在用N2/CO2混合物喷射的10L生物反应器中培育生产生物。随着细胞生长和对葡萄糖的利用，以大约等于葡萄糖消耗量的比率向该生物反应器补入另外70％葡萄糖。将该生物反应器的温度保持在30℃。生长持续大约24小时，直至BDO达到20-200g/L之间的浓度，具有的细胞密度一般在5和10g/L之间。培养期一完成，便使发酵罐内容物穿过细胞分离装置(如离心机)，以除去细胞和细胞碎片，以及将发酵肉汤转移至产物分离单元。通过本领域采用的利用不溶于水的有机溶剂(如甲苯)从稀释水相溶液(如液液提取物)分离有机产物的标准分离程序，分离BDO以提供BDO有机溶液。然后用标准的蒸馏方法处理所得的溶液以除去和回收有机溶剂以及提供BDO(沸点228-229℃)，BDO分离为纯化的液体。
直接生产BDO的发酵方案(完全连续)：首先利用上文所述的设备和培养基组分(除了初始葡萄糖浓度是30-50g/L之外)以分批模式培养生产生物。当葡萄糖耗尽时，以0.5L/hr和1L/hr之间的比率连续提供相同组分的填料培养基，以及以相同的比率收回液体。生物反应器中的BDO浓度恒定在30-40g/L，以及细胞密度恒定在3-5g/L之间。将温度保持在30℃，以及根据需要利用浓NaOH和HCl将pH保持在4.5。生物反应器连续操作一个月，每日取样本以确保BDO浓度一致。在提供新填料培养基时，以连续模式不断地去除发酵罐内容物。然后用连续产物分离程序处理包含细胞、培养基以及产物BDO的逸出流，除去或不除去细胞和细胞碎片，以及通过本领域采用的利用不溶于水的有机溶剂(如甲苯)从稀释水相溶液(如连续液液提取物)分离有机产物的标准连续分离方法，分离BDO以提供BDO有机溶液。接着用标准的连续蒸馏方法处理所得的溶液以除去和回收有机溶剂以及提供BDO(沸点228-229℃)，BDO分离为纯化的液体。
实施例IV
示例性BDO途径
该实施例描述用于1,4-丁二醇(BDO)合成途径的示例性酶和相应的基因。
图8-13显示了示例性的BDO合成途径。图8-13描述的途径从常见的中心代谢中间体到1,4-丁二醇。图8-13描述的所有的转换落入表14显示的18种一般的转换类型的范围。下文描述了每个类型中的若干生物化学表征的候选基因。具体列出了当克隆和表达在宿主生物中时可用以催化图9-13中适当转换的基因。表15-23提供了用于图9-13中每个关键步骤的前三种示例性基因(见下文)。此处描述了提供的用于图8中描述的途径的示例性基因。
表14.将常见的中心代谢中间体转化为1,4-丁二醇所需的酶类型。每种标签的前三个数字对应酶委员会编号的前三个数字(其指明不依赖于底物特异性的一般转换类型)。
标签 功能
1.1.1.a 氧化还原酶(酮到羟基或醛到醇)
1.1.1.c 氧化还原酶(2步，酰基-CoA到醇)
1.2.1.b 氧化还原酶(酰基-CoA到醛)
1.2.1.c 氧化还原酶(2-氧代酸到酰基-CoA，脱羧)70 -->
1.2.1.d 氧化还原酶(磷酸化/脱磷酸化)
1.3.1.a 作用于CH-CH供体的氧化还原酶
1.4.1.a 作用于氨基酸的氧化还原酶
2.3.1.a 酰基转移酶(转移磷酸基团)
2.6.1.a 氨基转移酶
2.7.2.a 磷酸转移酶，羧基基团受体
2.8.3.a Co酶-A转移酶
3.1.2.a 硫醇酯水解酶(CoA特异性)
4.1.1.a 羧基裂解酶
4.2.1.a 水解酶
4.3.1.a 解氨酶
5.3.3.a 异构酶
5.4.3.a 氨基变位酶
6.2.1.a 酸硫醇连接酶
1.1.1.a-氧化还原酶(醛到醇或酮到羟基)
醛到醇.编码催化醛到醇转化的酶(即醇脱氢酶或者对等地，醛还原酶)的示例性基因包括编码C2-C14的中链醇脱氢酶的alrA(Tani等人.Appl.Environ.Microbiol.66:5231-5235(2000))、来自酿酒酵母的ADH2(Atsumi等人.Nature451:86-89(2008))、来自大肠杆菌偏向长于C(3)的分子的yqhD(Sulzenbacher等人.JournalofMolecularBiology342:489-502(2004))以及来自丙酮丁醇梭菌将丁醛转化为丁醇的bdhI和bdhII(Walter等人.JournalofBacteriology174:7149-7158(1992))。利用如下的GenBank登记号可以找到这些示例性的基因产物的每个的蛋白质序列：
基因 登记号 GI号 生物
alrA BAB12273.1 9967138 不动杆菌菌株M-1
ADH2 NP_014032.1 6323961 酿酒酵母
yqhD NP_417484.1 16130909 大肠杆菌
bdh I NP_349892.1 15896543 丙酮丁醇梭菌
bdh II NP_349891.1 15896542 丙酮丁醇梭菌
显示4-羟基丁酸脱氢酶活性的酶(EC1.1.1.61)也属于这一类别。这类酶已经表征于富养罗尔斯通氏菌(Bravo等人.J.ForensicSci.,49:379-387(2004))、克鲁弗氏梭菌(Wolff等人.ProteinExpr.Purif.,6:206-212(1995))和拟南芥(Breitkreuz等人.J.Biol.Chem.,278:41552-41556(2003))。
基因 登记号 GI号 生物
4hbd YP_726053.1 113867564 富养罗尔斯通氏菌H16
4hbd L21902.1 146348486 克鲁佛氏梭菌DSM 555
4hbd Q94B07 75249805 拟南芥
另一示例性的酶是对3-羟基异丁酸到甲基丙二酸半醛的可逆氧化进行催化的3-羟基异丁酸脱氢酶。这种酶参与缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的降解并且已经发现于细菌、真核生物以及哺乳动物中。由来自嗜热栖热菌HB8的P84067编码的酶已经有结构表征(Lokanath等人.J.Mol.Biol.,352:905-917(2005))。人3-羟基异丁酸脱氢酶的可逆性通过利用同位素标记的底物得到了证明(Manning等人,BiochemJ.，231:481-484(1985))。编码这种酶的其他的基因包括智人(Hawes等人.MethodsEnzymol,324:218-228(2000))和穴兔(Chowdhury等人.Biosci.BiotechnolBiochem.,60:2043-2047(1996)；Hawes等人.MethodsEnzymol.324:218-228(2000))中的3hidh、绿脓假单胞菌中的mmsb以及恶臭假单胞菌(Aberhart等人.JChem.Soc.[Perkin1]6:1404-1406(1979)；Chowdhury等人.Biosci.BiotechnolBiochem.67:438-441(2003)；Chowdhury等人.Biosci.BiotechnolBiochem.60:2043-2047(1996))中的dhat。
基因 登记号 GI号 生物
P84067 P84067 75345323 嗜热栖热菌
mmsb P28811.1 127211 绿脓假单胞菌
dhat Q59477.1 2842618 恶臭假单胞菌
3hidh P31937.2 12643395 智人
3hidh P32185.1 416872 穴兔
若干3-羟基异丁酸脱氢酶也已经显示转化丙二酸半醛到3-羟基丙酸(3-HP)。显示这种活性的三种候选基因是来自绿脓假单胞菌PAO1(62)的mmsB、来自恶臭假单胞菌KT2440(Liao等人,美国公布2005/0221466)的mmsB和来自恶臭假单胞菌E23(Chowdhury等人,Biosci.Biotechnol.Biochem.60:2043-2047(1996))的mmsB。也已经确认粪产碱菌M3A中具有3-羟基丁酸脱氢酶活性的酶(Gokam等人,美国专利号7,393,676；Liao等人,美国公布号2005/0221466)。通过序列相似性可以推断出来自其他生物(包括类球红细菌)的其他候选基因。
基因 登记号 GI号 生物
mmsB AAA25892.1 151363 绿脓假单胞菌
mmsB NP_252259.1 15598765 绿脓假单胞菌PAO1
mmsB NP_746775.1 26991350 恶臭假单胞菌KT2440
mmsB JC7926 60729613 恶臭假单胞菌E23
orfB1 AAL26884 16588720 类球红细菌
丙二酸半醛到3-HP的转化还可以通过两种其他的酶完成：NADH-依赖的3-羟基丙酸脱氢酶和NADPH-依赖的丙二酸半醛还原酶。认为，NADH-依赖的3-羟基丙酸脱氢酶参与细菌和植物中从丙酸到β-丙氨酸的生物合成途径(Rathinasabapathi,B.JournalofPlantPathology159:671-674(2002)；Stadtman,E.R.J.Am.Chem.Soc.77:5765-5766(1955))。迄今为止，这种酶仍未与任何生物中的基因有所关联。NADPH-依赖的丙二酸半醛还原酶催化固定CO2的自养细菌中的逆反应。虽然已在勤奋生金球菌中检测到该酶的活性，但是基因的身份尚未可知(Alber等人.J.Bacteriol.188:8551-8559(2006))。
酮到羟基.存在转化酮到羟基官能团的多种示例性醇脱氢酶。来自大肠杆菌的两种这类酶由苹果酸脱氢酶(mdh)和乳酸脱氢酶(ldhA)编码。此外，已显示，来自富养罗尔斯通氏菌的乳酸脱氢酶被证实对链长不等的底物，如乳酸、2-氧代丁酸、2-氧代戊酸和2-氧代戊二酸具有高活性(Steinbuchel和Schlegel,Eur.J.Biochem.130:329-334(1983))。α-酮己二酸到α-羟基己二酸的转化可以通过2-酮己二酸还原酶催化，该酶据报告发现于大鼠和在紫河车中(Suda等人.Arch.Biochem.Biophys.176:610-620(1976)；Suda等人.Biochem.Biophys.Res.Commun.77:586-591(1977))。用于该步骤的其他候选酶是来自人类心脏的线粒体3-羟基丁酸脱氢酶(bdh)，该酶已被克隆并表征(Marks等人.J.Biol.Chem.267:15459-15463(1992))。这种酶是一种作用于3-羟基酸的脱氢酶。另一示例性醇脱氢酶将乙酰转化为异丙醇，如拜氏梭菌(Ismaiel等人.J.Bacteriol.175:5097-5105(1993))和布氏热厌氧杆菌(Lamed等人.Biochem.J.195:183-190(1981)；PeretzandBursteinBiochemistry28:6549-6555(1989))中所示。
基因 登记号 GI号 生物
mdh AAC76268.1 1789632 大肠杆菌
ldhA NP_415898.1 16129341 大肠杆菌
ldh YP_725182.1 113866693 富养罗尔斯通氏菌
bdh AAA58352.1 177198 智人
adh AAA23199.2 60592974 拜氏梭菌NRRL B593
adh P14941.1 113443 布氏热厌氧杆菌HTD4
将乙酰乙酰基-CoA转化为3-羟基丁酰-CoA的示例性3-羟基酰基脱氢酶包括来自丙酮丁醇梭菌(Boynton等人.JournalofBacteriology178:3015-3024(1996))的hbd、来自拜氏梭菌(Colby等人.ApplEnviron.Microbiol58:3297-3302(1992))的hbd以及来自勤奋生金球菌(Berg等人.Archaea.Science318:1782-1786(2007))的许多类似酶。
基因 登记号 GI号 生物
hbd NP_349314.1 15895965 丙酮丁醇梭菌
hbd AAM14586.1 20162442 拜氏梭菌
Msed_1423 YP_001191505 146304189 勤奋生金球菌
Msed_0399 YP_001190500 146303184 勤奋生金球菌
Msed_0389 YP_001190490 146303174 勤奋生金球菌
Msed_1993 YP_001192057 146304741 勤奋生金球菌
1.1.1.c-氧化还原酶(2步，酰基-CoA到醇)
转化酰基-CoA到醇的示例性2步氧化还原酶包括那些转换底物的酶，如转换乙酰基-CoA到乙醇(例如，来自大肠杆菌的adhE(Kessler等人FEBS.Lett.281:59-63(1991))以及转换丁酰-CoA到丁醇(例如，来自丙酮丁醇梭菌的adhE2(Fontaine等人.J.Bacteriol.184:821-830(2002))。除了还原乙酰基-CoA到乙醇之外，由肠膜明串珠菌中的adhE编码的酶也已显示将支链化合物异丁醛氧化为异丁酰-CoA(Kazahaya等人.J.Gen.Appl.Microbiol.18:43-55(1972)；Koo等人.BiotechnolLett.27:505-510(2005))。
基因 登记号 GI号 生物
adhE NP_415757.1 16129202 大肠杆菌
adhE2 AAK09379.1 12958626 丙酮丁醇梭菌
adhE AAV66076.1 55818563 肠膜明串珠菌
另一示例性的酶可以将丙二酰基-CoA转化为3-HP。具有这种活性的NADPH-依赖的酶已经表征在橙色绿屈挠菌中，其中它参与3-羟基丙酸循环(Hugler等人,J.Bacteriol.184:2404-2410(2002)；Strauss和Fuchs,Eur.J.Biochem.215:633-643(1993))。这种酶(具有300kDa的量)具有高底物特异性并显示与其他已知的氧化还原酶几乎没有序列相似性(Hugler等人,J.Bacteriol.184:2404-2410(2002))。在其他生物中没有显示为催化这一特异性反应的酶；然而存在其他生物可以具有相似途径的生物信息证据(Klatt等人,Environ.Microbiol.,9:2067-2078(2007))。可以通过序列相似性推断在其他生物(包括Roseiflexuscastenholzii、赤细菌NAP1和海洋γ-蛋白质菌HTCC2080)中的候选酶。
基因 登记号 GI号 生物
mcr AAS20429.1 42561982 橙色绿屈挠菌
Rcas_2929 YP_001433009.1 156742880 Roseiflexus castenholzii
NAP1_02720 ZP_01039179.1 85708113 赤细菌NAP1
MGP2080_00535 ZP_01626393.1 119504313 海洋γ蛋白质菌HTCC2080
较长链的酰基-CoA分子可以通过酶被还原，如编码醇-形成脂肪酰基-CoA还原酶的荷荷巴(加州希蒙得木)FAR。其在大肠杆菌中的过表达导致FAR活性和脂肪醇的累积(Metz等人,PlantPhysiology,122:635-644(2000))。
基因 登记号 GI号 生物
FAR AAD38039.1 5020215 加州希蒙得木
1.2.1.b-氧化还原酶(酰基-CoA到醛)
若干酰基-CoA脱氢酶能够将酰基-CoA还原为其相应的醛。编码这类酶的示例性基因包括编码脂肪酰基-CoA还原酶的乙酸钙不动杆菌acr1(Reiser等人,J.ofBacteriology,179:2969-2975(1997))、编码脂肪酰基-CoA还原酶的嗜精不动杆菌M-1(Ishige等人,Appl.Environ.Microbiol.,68:1192-1195(2002))和克鲁弗氏梭菌中编码CoA-和NADP-依赖的琥珀酸半醛脱氢酶的sucD基因(Sohling和GottschalkJBacteriol178:871-80(1996)；Sohling和GottschalkJBacteriol.178:871-880(1996))。牙龈卟啉单胞菌的sucD是另一种琥珀酸半醛脱氢酶(Takahashi等人J.Bacteriol.182:4704-4710(2000))。假单胞菌中由bphG编码的酶酰化型乙醛脱氢酶仍然是另一种被证明对乙醛、丙醛、丁醛、异丁醛和甲醛氧化和酰化的酶(Powlowski等人.JBacteriol.175:377-385(1993))。
基因 登记号 GI号 生物74 -->
acr1 YP_047869.1 50086359 乙酸钙不动杆菌
acr1 AAC45217 1684886 贝氏不动杆菌
acr1 BAB85476.1 18857901 不动杆菌菌株M-1
sucD P38947.1 730847 克鲁佛氏梭菌
sucD NP_904963.1 34540484 牙龈红棕色单胞菌
bphG BAA03892.1 425213 假单胞菌
其他的将酰基-CoA转化为其相应的醛的酶型是将丙二酰基-CoA转化为丙二酸半醛的丙二酰基-CoA还原酶。丙二酰基-CoA还原酶是在嗜热酸古生细菌中通过3-羟基丙酸循环的自养碳固定中的关键酶(Berg等人Science318:1782-1786(2007)；Thauer,R.K.Science318:1732-1733(2007))。所述酶利用NADPH作为辅因子并已经表征在生金球菌和硫化叶菌菌种中(Alber等人J.Bacteriol.188:8551-8559(2006)；Berg等人Science318:1782-1786(2007))。来自硫化叶菌tokodaii的编码丙二酰基-CoA还原酶的基因被克隆并异源表达在大肠杆菌中(Alber等人J.Bacteriol.188:8551-8559(2006))。虽然这些酶的醛脱氢酶功能性与来自橙色绿屈挠菌的双功能脱氢酶相似，但是几乎没有序列相似性。两种丙二酰基-CoA还原酶具有相对于天冬氨酸半醛脱氢酶(一种催化天冬氨酰基-4-磷酸到天冬氨酸半醛的还原和同时发生的脱磷酸作用)的高度序列相似性。其他的基因可以通过蛋白质序列同源性发现于其他的生物，包括硫磺矿硫化叶菌和嗜酸热硫化叶菌。
基因 登记号 GI号 生物
Msed_0709 YP_001190808.1 146303492 勤奋生金球菌
mcr NP_378167.1 15922498 硫化叶菌tokodaii
asd-2 NP_343563.1 15898958 硫磺矿硫化叶菌
Saci_2370 YP_256941.1 70608071 嗜酸热硫化叶菌
1.2.1.c-氧化还原酶(2-氧代酸到酰基-CoA，脱羧)
这种家族中的酶包括1)支链2-酮酸脱氢酶、2)α-酮戊二酸脱氢酶以及3)丙酮酸脱氢酶多酶复合物(PDHC)。这些酶是催化导致2-酮酸酰基化氧化脱羧的一系列部分反应的多酶复合物。2-酮酸脱氢酶复合物的每种都在中间代谢中占据关键位置，以及酶活性通常经过紧密调节(Fries等人Biochemistry42:6996-7002(2003))。所述酶具有由如下三种催化组分的多个拷贝组成的复合但是常见的结构：α-酮酸脱羧酶(E1)、二氢硫辛酰胺酰基转移酶(E2)和二氢硫辛酰胺脱氢酶(E3)。生物中所有的2-酮酸脱氢酶复合物均有E3组分，而该E1和E2组分则由不同的基因编码。酶组分在复合物中以大量的拷贝形式存在以及利用多个辅因子经由底物通道(substratechanneling)催化反应的定向序列。这些脱氢酶复合物的整体尺寸非常大，具有的分子量在4百万和1千万Da之间(即大于核糖体)。
在厌氧条件下，大肠杆菌中2-酮酸脱氢酶家族中的酶活性通常较低或者受限。NADH(或者NADPH)产量的提高会导致氧化还原剂失衡，以及NADH本身起酶功能抑制剂的作用。工程方面的努力已经使得大肠杆菌丙酮酸脱氢酶复合物的厌氧活性提高(Kim等人.Appl.Environ.Microbiol.73:1766-1771(2007)；Kim等人.J.Bacteriol.190:3851-3858)2008)；Zhou等人Biotechnol.Lett.30:335-342(2008))。例如，通过在E3组分中设计H322Y突变可以克服NADH的抑制作用(Kim等人J.Bacteriol.190:3851-3858(2008))。个体组分的结构研究以及它们在复合物中的工作机理使人洞察这种家族中酶的催化机理和架构(Aevarsson等人.Nat.Struct.Biol.6:785-792(1999)；Zhou等人.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:14802-14807(2001))。脱氢酶复合物的底物特异性因生物不同而不同，但是一般地，支链酮酸脱氢酶具有最广泛的底物范围。
α-酮戊二酸脱氢酶(AKGD)将α-酮戊二酸转化为琥珀酰-CoA以及是控制通过TCA循环的代谢通量的基本位点(Hansford,R.G.Curr.top.Bioenerg.10:217-278(1980))。由大肠杆菌中的基因sucA、sucB和lpd编码，AKGD基因表达在厌氧条件下以及在葡萄糖上培养期间下调(Park等人.Mol.Microbiol.15:473-482(1995))。虽然AKGD的底物范围较窄，但是对E2组分催化核心的结构研究精准地定位了导致底物特异性的具体残基(Knapp等人.J.Mol.Biol.280:655-668(1998))。由odhAB(E1和E2)和pdhD(E3，共有域)编码的枯草芽孢杆菌AKGD以转录水平进行调节以及依赖于生物的碳源和生长期(Resnekov等人.Mol.Gen.Genet.234:285-296(1992))。在酵母中，通过葡萄糖以转录水平调节编码E3组分的LPD1基因(Roy和DawesJ.Gen.Microbiol.133:925-933(1987))。由KGD1编码的E1组分也通过葡萄糖进行调节以及通过产物HAP2和HAP3激活(Repetto和TzagoloffMol.CellBiol.9:2695-2705(1989))。受产物NADH和琥珀酰-CoA抑制的AKGD酶复合物在哺乳动物系统中得到了很好的研究，因为其功能缺欠已与多种神经疾病相关联(Tretter和dam-ViziPhilos.Trans.R.Soc.LondBBiol.Sci.360:2335-2345(2005))。
基因 登记号 GI号 生物
sucA NP_415254.1 16128701 大肠杆菌菌株K12亚株MG1655
sucB NP_415255.1 16128702 大肠杆菌菌株K12亚株MG1655
lpd NP_414658.1 16128109 大肠杆菌菌株K12亚株MG1655
odhA P23129.2 51704265 枯草芽孢杆菌
odhB P16263.1 129041 枯草芽孢杆菌
pdhD P21880.1 118672 枯草芽孢杆菌
KGD1 NP_012141.1 6322066 酿酒酵母
KGD2 NP_010432.1 6320352 酿酒酵母
LPD1 NP_116635.1 14318501 酿酒酵母
支链2-酮酸脱氢酶复合物(BCKAD)(也称为2-氧代异戊酸脱氢酶)参与支链氨基酸降解途径，将缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的2-酮酸衍生物转化为它们的酰基-CoA衍生物和CO2。已在许多生物中对该复合物进行研究，所述生物包括枯草芽孢杆菌(Wang等人.Eur.J.Biochem.213:1091-1099(1993))、褐鼠(Namba等人.J.Biol.Chem.244:4437-4447(1969))和恶臭假单胞菌(SokatchJ.Bacteriol.148:647-652(1981))。在枯草芽孢杆菌中，该酶由基因pdhD(E3组分)、bfmBB(E2组分)、bfmBAA和bfmBAB(E1组分)编码(Wang等人.Eur.J.Biochem.213:1091-1099(1993))。在哺乳动物中，通过特异性磷酸酶和蛋白质激酶磷酸化对该复合物进行调节。已在大鼠干细胞中对该复合物进行了研究(Chicco等人.J.Biol.Chem.269:19427-19434(1994))以及该复合物由基因Bckdha(E1α)、Bckdhb(E1β)、Dbt(E2)和Dld(E3)编码。恶臭假单胞菌BCKAD复合物的E1和E3组分已经被结晶化(Aevarsson等人.Nat.Struct.Biol.6:785-792(1999)；MatteviScience255:1544-1550(1992))以及已对该酶复合物进行研究(Sokatch等人.J.Bacteriol.148:647-652(1981))。通过bkdR的基因产物激活恶臭假单胞菌BCKAD基因的转录(Hester等人.Eur.J.Biochem.233:828-836(1995))。在一些生物(包括褐鼠(Paxton等人.Biochem.J.234:295-303(1986))和酿酒酵母(Sinclair等人.Biochem.Mol.Biol.Int.31:911-922(1993))中，这种复合物已显示出具有广泛的底物范围，所述范围除了支链氨基酸前体之外还包括直链氧代酸(如2-氧代丁酸和α-酮戊二酸)。对牛BCKAD的活性位点进行设计，以支持替代性的底物乙酰基-CoA(Meng和Chuang,Biochemistry33:12879-12885(1994))。
基因 登记号 GI号 生物
bfmBB NP_390283.1 16079459 枯草芽孢杆菌
bfmBAA NP_390285.1 16079461 枯草芽孢杆菌
bfmBAB NP_390284.1 16079460 枯草芽孢杆菌
pdhD P21880.1 118672 枯草芽孢杆菌
lpdV P09063.1 118677 恶臭假单胞菌
bkdB P09062.1 129044 恶臭假单胞菌
bkdA1 NP_746515.1 26991090 恶臭假单胞菌
bkdA2 NP_746516.1 26991091 恶臭假单胞菌
Bckdha NP_036914.1 77736548 褐鼠
Bckdhb NP_062140.1 158749538 褐鼠
Dbt NP_445764.1 158749632 褐鼠
Dld NP_955417.1 40786469 褐鼠
已经对催化从丙酮酸到乙酰基-CoA的转化的丙酮酸脱氢酶复合物进行了广泛研究。在大肠杆菌酶中，E1组分中的特定残基对底物特异性负责(Bisswanger,H.JBiolChem.256:815-822(1981)；Bremer,J.Eur.JBiochem.8:535-540(1969)；Gong等人.JBiolChem.275:13645-13653(2000))。如前文所述，酶工程方面的努力已经改善了厌氧条件下的大肠杆菌PDH酶活性(Kim等人.Appl.Environ.Microbiol.73:1766-1771(2007)；KimJ.Bacteriol.190:3851-3858(2008)；Zhou等人.Biotechnol.Lett.30:335-342(2008))。与大肠杆菌PDH相反，枯草芽孢杆菌复合物具有活性以及需要在厌氧条件下培育(NakanoJ.Bacteriol.179:6749-6755(1997))。在甘油上培育期间被表征的肺炎克雷伯菌PDH在厌氧条件下也具有活性(Menzel等人.J.Biotechnol.56:135-142(1997))。来自牛肾脏的所述酶复合物的晶体结构(Zhou等人.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:14802-14807(2001))以及来自维涅兰德固氮菌的E2催化区是可得的(Mattevi等人.Science255:1544-1550(1992))。一些哺乳动物PDH酶复合物可以反作用于替代性的底物，如2-氧代丁酸，尽管褐鼠PDH和BCKAD的比较动力学表明，BCKAD对作为底物的2-氧代丁酸具有更高的活性(Paxton等人.Biochem.J.234:295-303(1986))。
基因 登记号 GI号 生物
aceE NP_414656.1 16128107 大肠杆菌菌株K12亚株MG165577 -->
aceF NP_414657.1 16128108 大肠杆菌菌株K12亚株MG1655
lpd NP_414658.1 16128109 大肠杆菌菌株K12亚株MG1655
pdhA P21881.1 3123238 枯草芽孢杆菌
pdhB P21882.1 129068 枯草芽孢杆菌
pdhC P21883.2 129054 枯草芽孢杆菌
pdhD P21880.1 118672 枯草芽孢杆菌
aceE YP_001333808.1 152968699 肺炎克雷伯氏杆菌MGH78578
aceF YP_001333809.1 152968700 肺炎克雷伯氏杆菌MGH78578
lpdA YP_001333810.1 152968701 肺炎克雷伯氏杆菌MGH78578
Pdha1 NP_001004072.2 124430510 褐鼠
Pdha2 NP_446446.1 16758900 褐鼠
Dlat NP_112287.1 78365255 褐鼠
Dld NP_955417.1 40786469 褐鼠
作为上文所述的大型多酶2-酮酸脱氢酶复合物的替代性选择，一些厌氧生物利用2-酮酸氧化还原酶家族(OFOR)中的酶催化2-酮酸的酰基化氧化脱羧。与脱氢酶复合物不同，这些酶包含铁硫簇，利用不同的辅因子以及利用铁氧还蛋白或者黄素氧还蛋白代替NAD(P)H作为电子受体。虽然这种家族中的大部分酶对作为底物(POR)的丙酮酸具有特异性，一些2-酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶已经显示接受一大批2-酮酸作为底物，包括α-酮戊二酸和2-氧代丁酸(Fukuda和WakagiBiochim.Biophys.Acta1597:74-80(2002)；Zhang等人.J.Biochem.120:587-599(1996))。一种这类酶是来自嗜酸热古菌硫化叶菌tokodaii7的OFOR，其包含基因ST2300编码的α和β亚基(Fukuda和WakagiBiochim.Biophys.Acta1597:74-80(2002)；Zhang等人.J.Biochem.120:587-599(1996))。已开发了基于质粒的表达系统用于高效表达大肠杆菌中的这种蛋白质(Fukuda等人.Eur.J.Biochem.268:5639-5646(2001))以及确定了涉及底物特异性的残基(Fukuda和WakagiBiochim.Biophys.Acta1597:74-80(2002))。最近来自嗜热泉生古细菌菌株K1的两种OFOR也已被克隆入大肠杆菌、表征以及发现与一大批2-氧代酸反应(Nishizawa等人.FEBSLett.579:2319-2322(2005))。这些候选OFOR的基因序列是可得的，尽管它们迄今为止尚未指定GenBank标识符。具有类似的酶存在于所有的古菌、一些厌氧细菌和线粒体真核生物中的生物信息证据(Fukuda和WakagiBiochim.Biophys.Acta1597:74-80(2005))。从能源观点来看，这种类别的酶也是有趣的，因为还原的铁氧还蛋白可以用来通过铁氧还蛋白-NAD还原酶生成NADH(Petitdemange等人.Biochim.Biophys.Acta421:334-337(1976))。此外，由于大部分所述酶设计以在厌氧条件下起作用，厌氧环境中的活性相对于2-酮酸脱氢酶复合物家族中的酶可能需要较少的酶工程。
基因 登记号 GI号 生物
ST2300 NP_378302.1 15922633 硫化叶菌tokodaii 7
1.2.1.d-氧化还原酶(磷酸化/脱磷酸化)
这种类别的示例性酶包括将甘油醛-3-磷酸转化为D-甘油酸1,3-二磷酸的甘油醛3-磷酸脱氢酶(例如，大肠杆菌gapA(Branlant和BranlantEur.J.Biochem.150:61-66(1985))、将L-天冬氨酸-4-半醛转化为L-4-天冬氨酰基-磷酸的天冬氨酸-半醛脱氢酶(例如，大肠杆菌asd(Biellmann等人.Eur.J.Biochem.104:53-58(1980))、将N-乙酰基-L-谷氨酸-5-半醛转化为N-乙酰基-L-谷氨酰基-5-磷酸的N-乙酰基-γ-谷氨酰基-磷酸还原酶(例如，大肠杆菌argC(Parsot等人.Gene68:275-283(1988))以及将L-谷氨酸-5-半醛转化为L-谷氨酰基-5-磷酸的谷氨酸-5-半醛脱氢酶(例如，大肠杆菌proA(Smith等人.J.Bacteriol.157:545-551(1984))。
基因 登记号 GI号 生物
gapA P0A9B2.2 71159358 大肠杆菌
asd NP_417891.1 16131307 大肠杆菌
argC NP_418393.1 16131796 大肠杆菌
proA NP_414778.1 16128229 大肠杆菌
1.3.1.a–作用于CH-CH供体的氧化还原酶
一种示例性的烯酰基-CoA还原酶是来自丙酮丁醇梭菌的bcd基因产物(Atsumi等人.MetabEng(2007)；Boynton等人.JournalofBacteriology178:3015-3024(1996))，其自然地催化巴豆酰基-CoA到丁酰-CoA的还原通过表达bcd结合表达编码电子转移黄素蛋白的丙酮丁醇梭菌etfAB基因可以增强这种酶的活性。用于烯酰基-CoA还原酶步骤的其他候选酶是来自薄肌眼虫的线粒体烯酰基-CoA还原酶(Hoffmeister等人.JournalofBiologicalChemistry280:4329-4338(2005))。去除序列的线粒体靶向前导序列之后衍生自这种序列的构架被克隆在大肠杆菌中，产生活性酶(Hoffmeister等人,同上，(2005))。这种方法是本领域的技术人员熟知的表达原核生物中的真核基因(尤其那些具有可以将基因产物靶向特定细胞内区室的前导序列的基因)的方法。来自原核生物齿垢密螺旋体的这种基因的紧密同系物TDE0597表示已被克隆并表达在大肠杆菌中的第三中烯酰基-CoA还原酶(Tucci和MartinFEBSLetters581:1561-1566(2007))。
基因 登记号 GI号 生物
bcd NP_349317.1 15895968 丙酮丁醇梭菌
etfA NP_349315.1 15895966 丙酮丁醇梭菌
etfB NP_349316.1 15895967 丙酮丁醇梭菌
TER Q5EU90.1 62287512 薄肌眼虫
TDE0597 NP_971211.1 42526113 齿垢密螺旋体
已知示例性2-烯酸还原酶(EC1.3.1.31)酶类催化各种各样的α,β-不饱和羧酸和醛的NADH-依赖的还原反应(Rohdich等人.J.Biol.Chem.276:5779-5787(2001))。2-烯酸还原酶由多种梭菌(Giesel和SimonArchMicrobiol.135(1):p.51-57(2001)，包括酪丁酸梭菌以及热醋酸梭菌(现称热醋穆尔氏菌)(Rohdich等人，同上，(2001))中的enr编码。在最近公布的克鲁佛氏梭菌基因组序列中，已经报告了9种用于烯酸还原酶的编码序列，其中之一已被表征(Seedorf等人.ProcNatlAcadSciU.S.A.105(6):2128-33(2008))。来自酪丁酸梭菌和热醋酸梭菌两者的enr基因已经被克隆并测序以及显示彼此间59％的一致性。还发现前者基因具有相对于克鲁佛氏梭菌中的表征基因的大约75％的相似性(Giesel和SimonArchMicrobiol135(1):51-57(1983))。已有基于这些序列结果的报告显示，enr与大肠杆菌(fadH)中的二烯酰基CoA还原酶非常类似(163Rohdich等人,同上(2001))。也已将热醋酸梭菌enr基因以酶活性形式表达在大肠杆菌中(163Rohdich等人,同上(2001))。
基因 登记号 GI号 生物
fadH NP_417552.1 16130976 大肠杆菌
enr ACA54153.1 169405742 肉毒杆菌A3菌株
enr CAA71086.1 2765041 酪丁酸梭菌
enr CAA76083.1 3402834 克鲁佛氏梭菌
enr YP_430895.1 83590886 热醋穆尔氏菌
1.4.1.a–作用于氨基酸的氧化还原酶
作用于氨基酸的大部分氧化还原酶催化将NAD+或者NADP+作为受体的α-氨基酸的氧化脱氨基化。作用于氨基酸的示例性的氧化还原酶包括由gdhA编码的谷氨酸脱氢酶(脱氨基)、由ldh编码的亮氨酸脱氢酶(脱氨基)以及由nadX编码的天冬氨酸脱氢酶(脱氨基)。来自大肠杆菌的gdhA基因产物(Korber等人.J.Mol.Biol.234:1270-1273(1993)；McPherson和WoottonNucleic.AcidsRes.11:5257-5266(1983))、来自海栖热袍菌的gdh(Kort等人.Extremophiles1:52-60(1997)；Lebbink,等人.J.Mol.Biol.280:287-296(1998))；Lebbink等人.J.Mol.Biol.289:357-369(1999))以及来自盐沼沙雷氏菌的gdhA1(Ingoldsby等人.Gene349:237-244(2005))催化谷氨酸到2-氧代戊二酸和氨的可逆的相互转化，同时分别支持NADP(H)、NAD(H)或者两者。蜡样芽胞杆菌的ldh基因编码具有宽底物范围(包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸以及2-氨基丁酸)的LeuDH蛋白质(Ansorge和KulaBiotechnolBioeng.68:557-562(2000)；Stoyan等人.J.Biotechnol54:77-80(1997))。NAD生物合成涉及来自海栖热袍菌用于编码天冬氨酸脱氢酶的nadX基因(Yang等人.J.Biol.Chem.278:8804-8808(2003))。
基因 登记号 GI号 生物
gdhA P00370 118547 大肠杆菌
gdh P96110.4 6226595 海栖热袍菌
gdhA1 NP_279651.1 15789827 盐沼沙雷氏菌
ldh P0A393 61222614 蜡样芽胞杆菌
nadX NP_229443.1 15644391 海栖热袍菌
由lysDH基因编码的赖氨酸6-脱氢酶(脱氨基)催化L-赖氨酸的ε-氨基基团的氧化脱氨基化以形成2-氨基己二酸-6-半醛，其转而非酶环化以形成Δ1-哌啶-6-羧酸(Misono和NagasakiJ.Bacteriol.150:398-401(1982))。来自嗜热脂肪土芽孢杆菌的lysDH基因编码嗜热NAD-依赖的赖氨酸6-脱氢酶(Heydari等人.ApplEnviron.Microbiol70:937-942(2004))。此外，通过来自基因组计划的同系物对来自嗜热泉生古细菌K1的lysDH基因进行了确认。
基因 登记号 GI号 生物80 -->
lysDH AB052732 13429872 嗜热脂肪土芽孢杆菌
lysDH NP_147035.1 14602185 嗜热泉生古细菌K1
ldh P0A393 61222614 蜡样芽胞杆菌
2.3.1.a-酰基转移酶(转移磷酸基团)
示例性转移磷酸的酰基转移酶包括由pta编码的磷酸转乙酰酶以及由ptb编码的磷酸丁酰转移酶。来自大肠杆菌的pta基因编码可以将乙酰基-CoA转化为乙酰基-磷酸以及进行相反转化的酶(Suzuki,T.Biochim.Biophys.Acta191:559-569(1969))。在该过程中，这种酶还可以利用丙酰基-CoA取代乙酰基-CoA形成丙酸(Hesslinger等人.Mol.Microbiol27:477-492(1998))。类似地，来自丙酮丁醇梭菌的ptb基因编码可以将丁酰-CoA转化为丁酰-磷酸的酶(Walter等人.Gene134(1):p.107-11(1993))；Huang等人.JMolMicrobiolBiotechnol2(1):p.33-38(2000)。其他ptb基因可以发现于产丁酸细菌L2-50(Louis等人.J.Bacteriol.186:2099-2106(2004))和巨大芽孢杆菌(Vazquez等人.Curr.Microbiol42:345-349(2001))。
2.6.1.a-氨基转移酶
天冬氨酸氨基转移酶将来自天冬氨酸的氨基基团转移至α-酮戊二酸，形成谷氨酸和草酰乙酸。这种转化通过，例如，来自大肠杆菌的aspC(Yagi等人.FEBSLett.100:81-84(1979)；Yagi等人.MethodsEnzymol.113:83-89(1985))、来自酿酒酵母的AAT2(Yagi等人.JBiochem.92:35-43(1982))和来自拟南芥的ASP5(48,108,22548.dela等人.PlantJ46:414-425(2006)；Kwok和HansonJExp.Bot.55:595-604(2004)；Wilkie和WarrenProteinExpr.Purif.12:381-389(1998))的基因产物催化。缬氨酸氨基转移酶催化缬氨酸和丙酮酸到2-酮异戊酸和丙氨酸的转化。大肠杆菌基因avtA编码一种这类酶(Whalen和BergJ.Bacteriol.150:739-746(1982))。这种基因产物还催化α-酮丁酸的氨基化以生成α-氨基丁酸，虽然这种反应中的胺供体还未得到确认(Whalen和BergJ.Bacteriol.158:571-574(1984))。大肠杆菌serC的基因产物催化两种反应，磷酸丝氨酸氨基转移酶和磷酸羟基苏氨酸氨基转移酶(Lam和WinklerJ.Bacteriol.172:6518-6528(1990))，以及未能检测到非磷酸化底物上的活性(Drewke等人.FEBS.Lett.390:179-182(1996))。
基因 登记号 GI号 生物
aspC NP_415448.1 16128895 大肠杆菌
AAT2 P23542.3 1703040 酿酒酵母
ASP5 P46248.2 20532373 拟南芥
avtA YP_026231.1 49176374 大肠杆菌
serC NP_415427.1 16128874 大肠杆菌
Cargill已经开发了一种β-丙氨酸/α-酮戊二酸氨基转移酶，用于经由丙二酰基-半醛从β-丙氨酸生产3-HP(PCT/US2007/076252(Jessen等人))。克鲁弗氏酵母中的SkPYD4基因产物也显示优选地利用β-丙氨酸作为氨基基团供体(Andersen等人.FEBS.J.274:1804-1817(2007))。SkUGA1编码酿酒酵母GABA氨基转移酶的同系物UGA1(Ramos等人.Eur.J.Biochem.149:401-404(1985))，而SkPYD4编码β-丙氨酸和GABA转氨基反应涉及的酶(Andersen等人.FEBS.J.274:1804-1817(2007))。3-氨基-2-甲基丙酸转氨酶催化从甲基丙二酸半醛到3-氨基-2-甲基丙酸的转换。该酶已被表征在褐鼠和野猪中以及由Abat编码(Kakimo到等人.Biochim.Biophys.Acta156:374-380(1968)；Tamaki等人.MethodsEnzymol.324:376-389(2000))。在其他生物中具有与3-氨基-2-甲基丙酸转氨酶高序列同源性的候选酶包括秀丽隐杆线虫中的Gta-1和枯草芽孢杆菌中的gabT。另外，大肠杆菌中由基因gabT编码的原生GABA氨基转移酶之一已显示具有广泛的底物特异性(Liu等人Biochemistry43:10896-10905(2004)；Schulz等人.ApplEnvironMicrobiol56:1-6(1990))。puuE基因产物催化大肠杆菌中另一种4-氨基丁酸转氨酶(Kurihara等人.J.Biol.Chem.280:4602-4608(2005))。
基因 登记号 GI号 生物
SkyPYD4 ABF58893.1 98626772 克鲁弗氏酵母
SkUGA1 ABF58894.1 98626792 克鲁弗氏酵母
UGA1 NP_011533.1 6321456 酿酒酵母
Abat P50554.3 122065191 褐鼠
Abat P80147.2 120968 野猪
Gta-1 Q21217.1 6016091 秀丽隐杆线虫
gabT P94427.1 6016090 枯草芽孢杆菌
gabT P22256.1 120779 大肠杆菌K12
puuE NP_415818.1 16129263 大肠杆菌K12
未结合以及结合至抑制剂的大肠杆菌4-氨基丁酸转氨酶的X射线晶体结构已有报告(Liu等人.Biochemistry43:10896-10905(2004))。底物结合和底物特异性已有研究和启示。通过位点定向的诱变和X射线晶体学研究了活性位点残基的作用(Liu等人.Biochemistry44:2982-2992(2005))。基于结构信息，试图设计具有新颖酶活性的大肠杆菌4-氨基丁酸转氨酶。这些研究为转氨酶活性进化用于BDO途径提供了基础。
2.7.2.a-磷酸转移酶，羧基基团受体
示例性激酶包括由ackA编码的大肠杆菌乙酸激酶(Skarstedt和SilversteinJ.Biol.Chem.251:6775-6783(1976))、由buk1和buk2编码的丙酮丁醇梭菌丁酸激酶(Walter等人.Gene134(1):107-111(1993)(Huang等人.JMolMicrobiolBiotechnol2(1):33-38(2000)]以及由proB编码的大肠杆菌γ-谷氨酰基激酶(Smith等人.J.Bacteriol.157:545-551(1984))。这些酶分别使乙酸、丁酸以及谷氨酸磷酸化。来自大肠杆菌的ackA基因产物还使丙酸磷酸化(Hesslinger等人.Mol.Microbiol27:477-492(1998))。
基因 登记号 GI号 生物82 -->
ackA NP_416799.1 16130231 大肠杆菌
buk1 NP_349675 15896326 丙酮丁醇梭菌
buk2 Q97II1 20137415 丙酮丁醇梭菌
proB NP_414777.1 16128228 大肠杆菌
2.8.3.a-辅酶-A转移酶
在CoA-转移酶家族中，大肠杆菌酶酰基-CoA：乙酸-CoA转移酶(也称为乙酸-CoA转移酶(EC2.8.3.8))已显示将来自各种支链和直链酰基-CoA底物的CoA部分转移到乙酸，所述底物包括异丁酸(Matthies和SchinkApplEnvironMicrobiol58:1435-1439(1992))、戊酸(Vanderwinkel等人.Biochem.Biophys.ResCommun.33:902-908(1968))和丁酸酯(Vanderwinkel,同上(1968))。这种酶由大肠杆菌属K12中的atoA(α亚基)和atoD(β亚基)(Korolev等人ActaCrystallogr.DBiolCrystallogr.58:2116-2121(2002)；Vanderwinkel,同上(1968))以及谷氨酸棒杆菌ATCC13032中的actA和cg0592(Duncan等人.ApplEnvironMicrobiol68:5186-5190(2002))编码。通过序列同源性发现的其他基因包括大肠杆菌UT189中的atoD和atoA。
基因 登记号 GI号 生物
atoA P76459.1 2492994 大肠杆菌K12
atoD P76458.1 2492990 大肠杆菌K12
actA YP_226809.1 62391407 谷氨酸棒杆菌ATCC 13032
cg0592 YP_224801.1 62389399 谷氨酸棒杆菌ATCC 13032
atoA ABE07971.1 91073090 大肠杆菌UT189
atoD ABE07970.1 91073089 大肠杆菌UT189
类似的转换通过克鲁佛氏梭菌的已经显示分别具有琥珀酰-CoA、4-羟基丁酰-CoA以及丁酰-CoA乙酰基转移酶活性的cat1、cat2和cat3基因产物催化(Seedorf等人.ProcNatlAcadSciU.S.A.105(6):2128-2133(2008)；Sohling和GottschalkJBacteriol178(3):871-880(1996)]。
基因 登记号 GI号 生物
cat1 P38946.1 729048 克鲁佛氏梭菌
cat2 P38942.2 1705614 克鲁佛氏梭菌
cat3 EDK35586.1 146349050 克鲁佛氏梭菌
来自厌氧细菌发酵氨基酸球菌的戊烯二酸-CoA-转移酶(EC2.8.3.12)与二酸戊烯二酰基-CoA和3-丁烯酰基-CoA反应(Mack和BuckelFEBSLett.405:209-212(1997))。编码这种酶的基因是gctA和gctB。这种酶对其他CoA衍生物(包括戊二酰基-CoA、2-羟基戊二酰基-CoA、己二酰-CoA和烯丙酰-CoA)具有降低的但是可检测出的活性(Buckel等人.Eur.J.Biochem.118:315-321(1981))。该酶已被克隆和表达在大肠杆菌中(Mac等人.Eur.J.Biochem.226:41-51(1994))。
基因 登记号 GI号 生物83 -->
gctA CAA57199.1 559392 发酵氨基酸球菌
gctB CAA57200.1 559393 发酵氨基酸球菌
3.1.2.a-硫醇酯水解酶(CoA特异性)
在CoA水解酶家族中，酶3-羟基异丁酰-CoA水解酶对3-HIBCoA具有特异性以及已被描述在缬氨酸降解期间高效地催化所需的转换(Shimomura等人.JBiolChem269:14248-14253(1994))。编码这种酶的基因包括褐鼠(Shimomura等人,同上(1994)；Shimomura等人.MethodsEnzymol.324:229-240(2000))和智人(Shimomura等人，同上，2000)的hibch。通过序列同源性的候选基因包括酿酒酵母的hibch和蜡样芽胞杆菌的BC_2292。
基因 登记号 GI号 生物
hibch Q5XIE6.2 146324906 褐鼠
hibch Q6NVY1.2 146324905 智人
hibch P28817.2 2506374 酿酒酵母
BC_2292 Q81DR3 81434808 蜡样芽胞杆菌
己二酰-CoA到己二酸的转化可以通过酰基-CoA水解酶或者对等地硫酯酶来进行。头号大肠杆菌候选基因是tesB(Naggert等人.JBiolChem.266(17):11044-11050(1991)]，其显示出与对己二酰-CoA具有活性的二羧酸乙酰基转移酶人类acot8较高的相似性(Westin等人.JBiolChem280(46):38125-38132(2005))。这种活性也已经表征在鼠肝中(Deana,BiochemInt.26(4):p.767-773(1992))。
基因 登记号 GI号 生物
tesB NP_414986 16128437 大肠杆菌
acot8 CAA15502 3191970 智人
acot8 NP_570112 51036669 褐鼠
其他潜在的大肠杆菌硫醇酯水解酶包括tesA(Bonner和Bloch,JBiolChem.247(10):3123-3133(1972))、ybgC(Kuznetsova等人,FEMSMicrobiolRev.29(2):263-279(2005)；Zhuang等人,FEBSLett.516(1-3):161-163(2002))、paaI(S上g等人,JBiolChem.281(16):11028-11038(2006))，以及ybdB(Leduc等人,JBacteriol.189(19):7112-7126(2007))的基因产物。
基因 登记号 GI号 生物
tesA NP_415027 16128478 大肠杆菌
ybgC NP_415264 16128711 大肠杆菌
paaI NP_415914 16129357 大肠杆菌
ybdB NP_415129 16128580 大肠杆菌
多种真核乙酰基-CoA水解酶(EC3.1.2.1)具有广泛的底物特异性。来自褐鼠脑的酶(Robins上等人.Biochem.Biophys.Res.Commun.71:959-965(1976))可以与丁酰-CoA、己酰-CoA和丙二酰基-CoA反应。
基因 登记号 GI号 生物
acot12 NP_570103.1 18543355 褐鼠
4.1.1.a-羧基裂解酶
示例性的羧基裂解酶是乙酰乳酸脱羧酶，其参与柠檬酸分解代谢和支链氨基酸生物合成，将2-乙酰乳酸转化为乙偶姻。在乳酸乳球菌中，该酶是由基因aldB编码的6种亚基组成，以及通过缬氨酸、氨酸和异亮氨酸来激活(Goupil等人.Appl.Environ.Microbiol.62:2636-2640(1996)；Goupil-Feuillerat等人.J.Bacteriol.182:5399-5408(2000))。这种酶已在大肠杆菌中过表达和表征(Phalip等人.FEBSLett.351:95-99(1994))。在其他生物中，该酶是一种由嗜热链球菌中的aldC(Monnet等人.Lett.Appl.Microbiol.36:399-405(2003))、短芽孢杆菌的aldB(Diderichsen等人.J.Bacteriol.172:4315-4321(1990)；Najmudin等人.ActaCrystallogr.D.Biol.Crystallogr.59:1073-1075(2003))以及来自产气肠杆菌的budA(Diderichsen等人.J.Bacteriol.172:4315-4321(1990))编码的二聚物。来自短芽孢杆菌的所述酶被克隆和过表达于枯草芽孢杆菌以及有了晶体学表征(Najmudin等人.ActaCrystallogr.D.Biol.Crystallogr.59:1073-1075(2003))。另外，来自乳明串珠菌的所述酶已被纯化和表征，但基因尚未分离(O'Sullivan等人.FEMSMicrobiol.Lett.194:245-249(2001))。
基因 登记号 GI号 生物
aldB NP_267384.1 15673210 乳酸乳球菌
aldC Q8L208 75401480 嗜热链球菌
aldB P23616.1 113592 短芽孢杆菌
budA P05361.1 113593 产气肠杆菌
乌头酸脱羧酶催化念珠菌菌株以及丝状真菌土曲霉中衣康酸生物合成的最后步骤(Bonnarme等人,J.Bacteriol.,177:3573-3578(1995)；Willke和VorlopApplMicrobiolBiotechnol56:289-295(2001))。虽然衣康酸是一种有关生物技术的化合物，乌头酸脱羧酶基因或者蛋白质序列迄今为止尚无报告。
已从很多生物中分离4-草酰巴豆酸脱羧酶并已对其进行表征。编码这种酶的基因包括假单胞菌(菌株600)中的dmpH和dmpE(Shingler等人,J.Bacteriol.,174:711-724(1992))、来自恶臭假单胞菌的xylII和xylIII(Kato和AsanoArch.Microbiol168:457-463(1997)；Lian和WhitmanJ.Am.Chem.Soc.116:10403-10411(1994)；Stanley等人.Biochemistry39:3514(2000))和来自富养罗尔斯通氏菌JMP134的Reut_B5691和Reut_B5692(Hughes等人,J.Bacteriol.,158:79-83(1984))。来自假单胞菌(菌株600)编码该酶的基因已被克隆并在大肠杆菌中表征(Shingler等人.JBacteriol.174:711-724(1992))。
基因 登记号 GI号 生物
dmpH CAA43228.1 45685 假单胞菌.CF600
dmpE CAA43225.1 45682 假单胞菌.CF60085 -->
xylII YP_709328.1 111116444 恶臭假单胞菌
xylIII YP_709353.1 111116469 恶臭假单胞菌
Reut_B5691 YP_299880.1 73539513 富养罗尔斯通氏菌JMP134
Reut_B5692 YP_299881.1 73539514 富养罗尔斯通氏菌JMP134
已表征其他类别的催化肉桂酸(苯基丙烯酸)和被取代的肉桂酸衍生物到相应的苯乙烯衍生物的转化的脱羧酶。这些酶在各种生物中是常见的以及编码这些酶的已被克隆并表征于大肠杆菌中的特异性基因如下：来自酿酒酵母的pad1(Clausen等人,Gene,142:107-112(1994))、来自植物乳杆菌的pdc(Barthelmebs等人,Appl.Environ.Microbiol.,67:1063-1069(2001)；Qi等人.MetabEng9:268-276(2007)；Rodriguez等人.J.Agric.FoodChem.56:3068-3072(2008))、来自产酸克雷伯氏菌(Hashidoko等人.Biosci.Biotech.Biochem.58:217-218(1994)；Uchiyama等人.Biosci.Biotechnol.Biochem.72:116-123(2008))、乳酸戊糖片球菌(Barthelmebs等人.ApplEnvironMicrobiol67:1063-1069(2001))的pofK(pad)和来自枯草芽孢杆菌和短小芽胞杆菌的padC(Lingen等人.ProteinEng15:585-593(2002))。来自萤光假单胞菌的阿魏酸脱羧酶也已被纯化并表征(Huang等人,J.Bacteriol.,176:5912-5918(1994))。重要的是，这个类别的酶已显示具有稳定性以及不需要外源性或内结合的辅因子，因此使得这些酶理想地合适生物转化(Sariaslani,Annu.Rev.Microbiol.61:51-69(2007))。
其他脱羧酶可以从α-酮戊二酸形成琥珀半醛。这些包括来自薄肌眼虫的α-酮戊二酸脱羧酶(Shigeoka等人.Biochem.J.282(Pt2):319-323(1992)；Shigeoka和NakanoArch.Biochem.Biophys.288:22-28(1991)；Shigeoka和NakanoBiochem.J.292(Pt2):463-467(1993))(其相应的基因序列仍有待确定)以及来自结核分枝杆菌(Tian等人.ProcNatlAcadSciU.S.A.102:10670-10675(2005))的α-酮戊二酸脱羧酶。此外，谷氨酸脱羧酶可以将谷氨酸转化为4-氨基丁酸，如大肠杆菌gadA和gadB基因(DeBiase等人.Protein.Expr.Purif.8:430-438(1993))。
基因 登记号 GI号 生物
kgd O50463.4 160395583 结核分枝杆菌
gadA NP_417974 16131389 大肠杆菌86 -->
gadB NP_416010 16129452 大肠杆菌
酮酸脱羧酶
丙酮酸脱羧酶(PDC,EC4.1.1.1)(又称为酮酸脱羧酶)是在生醇发酵中对丙酮酸到乙醛的脱羧基化进行催化的关键酶。这种酶具有针对脂肪族2-酮酸(包括2-酮丁酸、2-酮戊酸、3-羟基丙酮酸和2-苯基丙酮酸)的广泛的底物范围(Berg等人.Science318:1782-1786(2007))。来自运动发酵单胞菌的由pdc编码的PDC已然是定向工程研究的主题，以改变针对不同的底物的亲和性(Siegert等人.,ProteinEng.Des.Sel.,18:345-357(2005))。还已对来自酿酒酵母的PDC进行了广泛研究、设计以改变活性以及功能表达于大肠杆菌中(Killenberg-Jabs等人.Eur.J.Biochem.268:1698-1704(2001)；Li和JordanBiochemistry38:10004-10012(1999)；terSchure等人.Appl.Environ.Microbiol.64:1303-1307(1998))。这种酶的晶体结构是可得的(Killenberg-JabsEur.J.Biochem.268:1698-1704(2001))。其他很好地表征的PDC候选酶包括来自巴氏醋杆菌(Chandra等人,Arch.Microbiol.176:443-451(2001))和乳酸克鲁维酵母(Krieger等人,Eur.J.Biochem.,269:3256-3263(2002))的酶。
基因 登记号 GI号 生物
pdc P06672.1 118391 运动发酵单胞菌
pdc1 P06169 30923172 酿酒酵母
pdc Q8L388 75401616 巴氏醋杆菌
pdc1 Q12629 52788279 乳酸克鲁维酵母
与PDC类似，苯甲酰基甲酸脱羧酶(EC4.1.1.7)具有广泛的底物范围并已然是酶工程研究的目标。已经对来自恶臭假单胞菌的酶进行广泛研究并得到这种酶的晶体结构(Hasson等人.Biochemistry37:9918-9930(1998)；Polovnikova等人.Biochemistry42:1820-1830(2003))。该恶臭假单胞菌酶的活性位点中两种残基的定点诱变改变了天然和非天然存在的底物的亲和性(Km)(SiegertProteinEngDesSel18:345-357(2005))。已经通过定向工程对这种酶的特性进行进一步修改(Lingen等人.ProteinEng15:585-593(2002))；LingenChembiochem4:721-726(2003))。也已经对来自绿脓假单胞菌由mdlC编码的酶进行试验性的表征(Barrowman等人,FEMSMicrobiologyLetters,34:57-60(1986))。可以通过序列同源性推断或利用恶臭假单胞菌中培养的生长选择系统确定来自施氏假单胞菌、萤光假单胞菌和其他生物的其他基因(Henning等人,Appl.Environ.Microbiol.,72:7510-7517(2006))。
基因 登记号 GI号 生物
mdlC P20906.2 3915757 恶臭假单胞菌
mdlC Q9HUR2.1 81539678 绿脓假单胞菌
dpgB ABN80423.1 126202187 施氏假单胞菌
ilvB-1 YP_260581.1 70730840 荧光假单胞菌
4.2.1.a-水解酶
巴克氏真杆菌的2-(羟甲基)戊二酸脱水酶是示例性的水解酶。已就烟酸分解代谢对这种酶进行了研究以及这种酶由hmd编码(Alhapel等人.ProcNatlAcadSciUSA103:12341-12346(2006))。有高序列同源性的相似的酶发现于多毛拟杆菌、Anaerotruncuscolihominis以及厌氧性嗜盐嗜碱耐热菌。
基因 登记号 GI号 生物
hmd ABC88407.1 86278275 巴克氏真杆菌
BACCAP_02294 ZP_02036683.1 154498305 多毛拟杆菌ATCC 29799
ANACOL_02527 ZP_02443222.1 167771169 Anaerotruncus colihominis DSM 17241
NtherDRAFT_2368 ZP_02852366.1 169192667 厌氧性嗜盐嗜碱耐热菌JW/NM-WN-LF
第二示例性水解酶是延胡索酸水解酶，一种催化苹果酸到延胡索酸的脱水作用的酶。可以得到这种酶的大量结构信息以及研究人员已经成功地对酶进行设计以改变活性、抑制和定位(Weaver,T.ActaCrystallogr.DBiolCrystallogr.61:1395-1401(2005))。其他的延胡索酸水解酶包括那些由来自大肠杆菌(Estevez等人.ProteinSci.11:1552-1557(2002)；Hong和LeeBiotechnol.BioprocessEng.9:252-255(2004)；Rose和WeaverProcNatlAcadSciUS.A101:3393-3397(2004))、空肠弯曲杆菌(Smith等人.Int.JBiochem.CellBiol31:961-975(1999))和嗜热栖热菌(Mizobata等人.Arch.Biochem.Biophys.355:49-55(1998))的fumC，以及来自褐鼠的fumH(Kobayashi等人.JBiochem.89:1923-1931(1981))编码的延胡索酸水解酶。具有高序列同源性的类似酶包括来自拟南芥的fum1和来自谷氨酸棒杆菌的fumC。
基因 登记号 GI号 生物
fumC P05042.1 120601 大肠杆菌K12
fumC O69294.1 9789756 空肠弯曲杆菌
fumC P84127 75427690 嗜热栖热菌
fumH P14408.1 120605 褐鼠
fum1 P93033.2 39931311 拟南芥
fumC Q8NRN8.1 39931596 谷氨酸棒杆菌
柠苹酸水解酶(也称为2-甲基苹果酸脱水酶)将2-甲基苹果酸转化为中康酸酯。在谷氨酸降解VI途径下，在破伤风形梭菌、摩氏摩根菌、无丙二酸柠檬酸杆菌检测到了2-甲基苹果酸脱水酶活性(Kato和AsanoArch.Microbiol168:457-463(1997))；然而，编码这种酶的基因迄今为止还未测序。
来自丙酮丁醇梭菌的crt基因产物催化3-羟基丁酰-CoA到巴豆酰基-CoA的脱水作用(Atsumi等人.MetabEng.；29(2007))；Boynton等人.JournalofBacteriology178:3015-3024(1996))。认为，恶臭假单胞菌的烯酰基-CoA水解酶phaA和phaB在苯基乙酸分解代谢期间执行双键的羟基化；(Olivera等人.ProcNatlAcadSciUSA95(11):6419-6424(1998))。来自荧光假单胞菌的paaA和paaB催化类似转换(14Olivera等人，同上，1998)。最后，许多大肠杆菌基因已经显示具有烯酰基-CoA水解酶功能，包括maoc(Park和LeeJBacteriol185(18):5391-5397(2003))、paaF(Park和LeeBiotechnolBioeng.86(6):681-686(2004a))；Park和LeeApplBiochemBiotechnol.113-116:335-346(2004b))；Ismail等人.EurJBiochem270(14):p.3047-3054(2003)以及paaG(Park和Lee，同上，2004；Park和Lee同上,2004b；Ismail等人，同上，2003)。
基因 登记号 GI号 生物
maoC NP_415905.1 16129348 大肠杆菌
paaF NP_415911.1 16129354 大肠杆菌
paaG NP_415912.1 16129355 大肠杆菌
crt NP_349318.1 15895969 丙酮丁醇梭菌
paaA NP_745427.1 26990002 恶臭假单胞菌
paaB NP_745426.1 26990001 恶臭假单胞菌
phaA ABF82233.1 106636093 荧光假单胞菌
phaB ABF82234.1 106636094 荧光假单胞菌
大肠杆菌基因fadA和fadB编码显示酮酰基-CoA硫解酶、3-羟基酰基-CoA脱氢酶以及烯酰基-CoA水解酶活性的多酶复合物(Yang等人.Biochemistry30(27):p.6788-6795(1991)；Yang等人.JBiolChem265(18):p.10424-10429(1990)；Yang等人.JBiolChem266(24):p.16255(1991)；Nakahigashi和InokuchiNucleicAcidsRes18(16):p.4937(1990))。fadI和fadJ基因编码相似的功能以及仅在厌氧条件下被自然表达(Campbell等人.MolMicrobiol47(3):p.793-805(2003))。先前已经描述了一种用于在大肠杆菌中生产聚[(R)-3-羟基丁酸盐]的方法，该方法涉及激活fadB(通过敲除负调节子fadR)和共表达非原生酮硫解酶(来自富养罗尔斯通氏菌的phaA)(Sato等人.JBiosciBioeng103(1):38-44(2007))。这项工作明显证实β-氧化酶，尤其是编码3-羟基酰基-CoA脱氢酶和烯酰基-CoA水解酶两者活性的fadB基因产物，可以作为途径的一部分以从乙酰基-CoA前体生产较长链的分子。
基因 登记号 GI号 生物
fadA YP_026272.1 49176430 大肠杆菌
fadB NP_418288.1 16131692 大肠杆菌
fadI NP_416844.1 16130275 大肠杆菌
fadJ NP_416843.1 16130274 大肠杆菌
fadR NP_415705.1 16129150 大肠杆菌
4.3.1.a-解氨酶
催化天冬氨酸到延胡索酸的脱氨基化的天冬氨酸酶(EC4.3.1.1)是一种广泛分布在微生物中的酶，以及已进行广泛表征(Viola,R.E.Adv.Enzymol.RelatAreasMol.Biol74:295-341(2000))。由aspA编码的大肠杆菌天冬氨酸酶的晶体结构已得到解析(Shi等人.Biochemistry36:9136-9144(1997))。该大肠杆菌酶也已经显示与替代性的底物天冬氨酸苯基甲基酯、天冬酰胺、苄基-天冬氨酸和苹果酸反应(Ma等人.AnnN.Y.AcadSci672:60-65(1992))。在一项单独的研究中，已经对这种酶采用定向进化以改变底物特异性(Asano等人.Biomol.Eng22:95-101(2005))。具有天冬氨酸酶功能的酶也已被表征在流感嗜血杆菌(Sjostrom等人.Biochim.Biophys.Acta1324:182-190(1997))、荧光假单胞菌(Takagi等人.J.Biochem.96:545-552(1984))、枯草芽孢杆菌(Sjostrom等人.Biochim.Biophys.Acta1324:182-190(1997))和粘质沙雷氏菌(Takagi和KisumiJBacteriol.161:1-6(1985))中。
基因 登记号 GI号 生物
aspA NP_418562 90111690 大肠杆菌K12亚种MG1655
aspA P44324.1 1168534 流感嗜血杆菌
aspA P07346.1 114273 荧光假单胞菌
ansB P26899.1 114271 枯草芽孢杆菌
aspA P33109.1 416661 粘质沙雷氏菌
3-甲基天冬氨酸酶(EC4.3.1.2)(也称为β-甲基天冬氨酸酶或者3-甲基天冬氨酸解氨酶)催化苏-3-甲基天冬氨酸到中康酸酯的脱氨反应。来自破伤风形梭菌的3-甲基天冬氨酸酶已被克隆、在大肠杆菌进行功能表达以及结晶化(Asuncion等人.ActaCrystallogr.DBiolCrystallogr.57:731-733(2001)；Asuncion等人.JBiolChem.277:8306-8311(2002)；Botting等人.Biochemistry27:2953-2955(1988)；Goda等人.Biochemistry31:10747-10756(1992))。在无丙二酸柠檬酸杆菌中，这种酶由BAA28709编码的(Kato和AsanoArch.Microbiol168:457-463(1997))。3-甲基天冬氨酸酶也已由大肠杆菌YG1002结晶得到(Asano和KatoFEMSMicrobiolLett.118:255-258(1994))，虽然该蛋白质序列并未列入公用数据库(如GenBank)。可以利用序列同源性以确认其他候选基因，包括破伤风梭菌中的CTC_02563和大肠杆菌O157:H7中的ECs0761。
基因 登记号 GI号 生物
MAL AAB24070.1 259429 破伤风形梭菌
BAA28709 BAA28709.1 3184397 无丙二酸柠檬酸杆菌
CTC_02563 NP_783085.1 28212141 破伤风梭菌
ECs0761 BAB34184.1 13360220 大肠杆菌O157:H7菌株Sakai
形成烯酰基-CoA产物的候选解氨酶包括β-丙氨酰-CoA解氨酶(EC4.3.1.6)(其使β-丙氨酰-CoA脱氨基化)以及3-氨基丁酰-CoA解氨酶(EC4.3.1.14)。两种β-丙氨酰-CoA解氨酶已经确认并表征在丙酸梭菌中(Herrmann等人.FEBSJ.272:813-821(2005))。迄今为止尚未对其他β-丙氨酰-CoA解氨酶进行研究，但是候选基因可以通过序列相似性来确认。一种这类的候选酶是黄色粘球菌中的MXAN_4385。
基因 登记号 GI号 生物
ac12 CAG29275.1 47496504 丙酸梭菌
acl1 CAG29274.1 47496502 丙酸梭菌
MXAN_4385 YP_632558.1 108756898 黄色粘球菌
5.3.3.a-异构酶
来自氨基丁酸梭菌和克鲁佛氏梭菌的4-羟基丁酰-CoA脱水酶催化4-羟基丁酰-CoA到巴豆酰基-CoA的可逆转化并具有乙烯乙酰基-CoAΔ-异构酶固有活性(Scherf和BuckelEur.JBiochem.215:421-429(1993)；Scherf等人.Arch.Microbiol161:239-245(1994))。两种原生酶均被纯化和表征，包括N-末端氨基酸序列(Scherf和Buckel，同上，1993；Scherf等人，同上，1994)。来自氨基丁酸梭菌和克鲁佛氏梭菌的abfD基因与这些N-末端氨基酸序列完全匹配，从而编码4-羟基丁酰-CoA脱水酶/乙烯乙酰基-CoAΔ-异构酶。此外，通过来自基因组计划的同系物对来自牙龈红棕色单胞菌ATCC33277的abfD基因进行了确认。
基因 登记号 GI号 生物
abfD YP_001396399.1 153955634 克鲁佛氏梭菌DSM 555
abfD P55792 84028213 氨基丁酸梭菌
abfD YP_001928843 188994591 牙龈红棕色单胞菌ATCC 33277
5.4.3.a-氨基变位酶
赖氨酸2,3-氨基变位酶(EC5.4.3.2)是一种示例性的通过将胺基从2位移动到3位来将赖氨酸转化为(3S)-3,6-二氨基己酸的氨基变位酶。该酶发现于将赖氨酸发酵成为乙酸和丁酸的细菌，包括作为具核梭杆菌(kamA)(Barker等人.J.Bacteriol.152:201-207(1982))和近端梭菌(kamA)(Chirpich等人.J.Biol.Chem.245:1778-1789(1970))。来自近端梭菌的所述酶已被结晶化(Lepore等人.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A102:13819-13824(2005))。编码这种功能的酶还由枯草芽孢杆菌中的yodO编码(Chen等人.Biochem.J.348Pt3:539-549(2000))。该酶利用吡哆醛5’-磷酸作为辅因子，需要通过S-腺苷基甲硫氨酸激活，以及具有立体选择性，仅与L-赖氨酸反应。该酶尚未显示与替代性的底物反应。
基因 登记号 GI号 生物
yodO O34676.1 4033499 枯草芽孢杆菌
kamA Q9XBQ8.1 75423266 近端梭菌
kamA Q8RHX4 81485301 具核梭杆菌亚种具核
第二种氨基变位酶β-赖氨酸5,6-氨基变位酶(EC5.4.3.3)催化赖氨酸到乙酸和丁酸的发酵反应的下一步，其通过将末端的胺基从6位移动到5位来将(3S)-3,6-二氨基己酸转换为(3S,5S)-3,5-二氨基己酸。这种酶还催化赖氨酸到2,5-二氨基己酸的转化以及也被称为赖氨酸-5,6-氨基变位酶(EC5.4.3.4)。该酶已在斯蒂克兰德氏梭菌(kamD，kamE)中被结晶化(Berkovitch等人.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A101:15870-15875(2004))。也已对来自牙龈红棕色单胞菌的所述酶进行表征(Tang等人.Biochemistry41:8767-8776(2002))。
基因 登记号 GI号 生物
kamD AAC79717.1 3928904 斯蒂克兰德氏梭菌
kamE AAC79718.1 3928905 斯蒂克兰德氏梭菌
kamD NC_002950.2 34539880,34540809 牙龈红棕色单胞菌W83
kamE NC_002950.2 34539880,34540810 牙龈红棕色单胞菌W83
鸟氨酸4,5-氨基变位酶(EC5.4.3.5)也通过将末端的胺移动到临近的碳上来讲D-鸟氨酸转化为2,4-二氨基戊酸。来自斯蒂克兰德氏梭菌的所述酶由两种基因oraE和oraS编码，以及已被克隆、测序和表达在大肠杆菌中(Chen等人.J.Biol.Chem.276:44744-44750(2001))。这种酶迄今为止未表征在其他生物中。
基因 登记号 GI号 生物
oraE AAK72502 17223685 斯蒂克兰德氏梭菌
oraS AAK72501 17223684 斯蒂克兰德氏梭菌
酪氨酸2,3-氨基变位酶(EC5.4.3.6)参与酪氨酸生物合成，通过将胺从2位移动到3位可逆地转化酪氨酸到3-氨基-3-(4-羟基苯基)丙酸酯。在球孢链霉菌中，该酶还已经显示与酪氨酸衍生物反应(Christenson等人.Biochemistry42:12708-12718(2003))。没有得到序列信息。
亮氨酸2,3-氨基变位酶(EC5.4.3.7)在亮氨酸降解和生物合成期间将L-亮氨酸转化为β-亮氨酸。针对亮氨酸2,3-氨基变位酶的一项检测在许多生物中检测到了活性(Poston,J.M.MethodsEnzymol.166:130-135(1988))，但是编码该酶的基因迄今为止还未确认。
Cargill已经开发了一种新颖的2,3-氨基变位酶来将L-丙氨酸转化为β-丙氨酸，从而创建了具有4个生化步骤的从丙酮酸到3-HP的途径(Liao等人,美国公布号2005-0221466)。
6.2.1.a-酸硫醇连接酶
示例性的酸硫醇连接酶是大肠杆菌sucCD的基因产物，所述基因产物一起催化从琥珀酸到琥珀酰-CoA的形成以及伴随消耗一种ATP(一种在体内可逆的反应)(Buck等人.Biochemistry24(22):p.6245-6252(1985))。其他示例性的CoA-连接酶包括序列尚未表征的大鼠二羧酸-CoA连接酶(Vamecq等人.BiochemJ.230(3):p.683-693(1985))、来自产黄青霉的两种表征的苯基乙酸-CoA连接酶的任一种(Lamas-Maceiras等人.BiochemJ395(1):147-155(2006)；Wang等人.BiochemBiophysResCommun,360(2):453-458(2007))、来自恶臭假单胞菌的苯基乙酸-CoA连接酶(Martinez-Blanco等人.JBiolChem.265(12):7084-7090(1990))以及来自枯草芽孢杆菌的6-羧基己酸-CoA连接酶(Bower等人.JBacteriol178(14):4122-4130(1996))。
基因 登记号 GI号 生物
sucC NP_415256.1 16128703 大肠杆菌
sucD AAC73823.1 1786949 大肠杆菌
phl CAJ15517.1 77019264 产黄青霉
phlB ABS19624.1 152002983 产黄青霉
paaF AAC24333.2 22711873 恶臭假单胞菌
bioW NP_390902.2 50812281 枯草芽孢杆菌
实施例V
从琥珀酰-CoA到BDO的示例性途径
该实施例描述从琥珀酰-CoA到BDO的示例性途径。
从琥珀酰-CoA到BDO的途径在本文有描述以及已经有了先前描述(见2008年3月14日提交的美国申请序列号12/049,256以及2008年3月14日提交的PCT申请序列号US08/57168，每个以引用方式并入本文)。其他途径如图8A所示。这类示例性的BDO途径的酶连同编码这些酶的示例性基因列入表15。
简言之，琥珀酰-CoA可以通过琥珀酰-CoA还原酶(或琥珀酸半醛脱氢酶)(EC1.2.1.b)转化为琥珀半醛。琥珀酸半醛可以如先前所述通过4-羟基丁酸脱氢酶(EC1.1.1.a)转化为4-羟基丁酸盐。替代性地，琥珀酰-CoA可以通过琥珀酰-CoA还原酶(醇形成)(EC1.1.1.c)转化为4-羟基丁酸盐。4-羟基丁酸盐可以如先前所述通过4-羟基丁酰-CoA转移酶(EC2.8.3.a)，或者通过4-羟基丁酰-CoA水解酶(EC3.1.2.a)或者4-羟基丁酰-CoA连接酶(或者4-羟基丁酰-CoA合成酶)(EC6.2.1.a)转化为4-羟基丁酰-CoA。替代性地，4-羟基丁酸盐可以如先前所述通过4-羟基丁酸激酶(EC2.7.2.a)转化为4-羟基丁酰-磷酸。4-羟基丁酰-磷酸可以如先前所述通过磷酸转-4-羟基丁酰酶(EC2.3.1.a)转化为4-羟基丁酰-CoA。替代性地，4-羟基丁酰-磷酸可以通过4-羟基丁醛脱氢酶(磷酸化)(EC1.2.1.d)转化为4-羟基丁醛。4-羟基丁酰-CoA可以通过4-羟基丁酰-CoA还原酶(或4-羟基丁醛脱氢酶)(EC1.2.1.b)转化为4-羟基丁醛。替代性地，4-羟基丁酰-CoA可以通过4-羟基丁酰-CoA还原酶(醇形成)(EC1.1.1.c)转化为1,4-丁二醇。4-羟基丁醛可以如先前所述通过1,4-丁二醇脱氢酶(EC1.1.1.a)转化为1,4-丁二醇。
表15.琥珀酰-CoA到BDO的途径.
实施例VI
从α-酮戊二酸到BDO的其他示例性途径
该实施例描述从α-酮戊二酸到BDO的示例性途径。
从琥珀酰-CoA到BDO的途径在本文有描述以及已经有了先前描述(见2008年3月14日提交的美国申请序列号12/049,256以及2008年3月14日提交的PCT申请序列号US08/57168，每个以引用方式并入本文)。其他途径如图8B所示。这类示例性的BDO途径的酶连同编码这些酶的示例性基因列入表16。
简言之，α-酮戊二酸可以如先前所述通过α-酮戊二酸脱羧酶(EC4.1.1.a)转化为琥珀半醛。替代性地，α-酮戊二酸可以通过谷氨酸脱氢酶(EC1.4.1.a)转化为谷氨酸。4-氨基丁酸可以通过4-氨基丁酸氧化还原酶(脱氨基)(EC1.4.1.a)或者4-氨基丁酸转氨酶(EC2.6.1.a)转化为琥珀半醛。谷氨酸可以通过谷氨酸脱羧酶(EC4.1.1.a)转化为4-氨基丁酸。琥珀酸半醛可以如先前所述通过4-羟基丁酸脱氢酶(EC1.1.1.a)转化为4-羟基丁酸盐。4-羟基丁酸盐可以如先前所述通过4-羟基丁酰-CoA转移酶(EC2.8.3.a)，或者通过4-羟基丁酰-CoA水解酶(EC3.1.2.a)或者4-羟基丁酰-CoA连接酶(或者4-羟基丁酰-CoA合成酶)(EC6.2.1.a)转化为4-羟基丁酰-CoA。4-羟基丁酸盐可以通过4-羟基丁酸激酶(EC2.7.2.a)转化为4-羟基丁酰-磷酸。4-羟基丁酰-磷酸可以如先前所述通过磷酸转-4-羟基丁酰酶(EC2.3.1.a)转化为4-羟基丁酰-CoA。替代性地，4-羟基丁酰-磷酸可以通过4-羟基丁醛脱氢酶(磷酸化)(EC1.2.1.d)转化为4-羟基丁醛。4-羟基丁酰-CoA可以如先前所述通过4-羟基丁酰-CoA还原酶(或者4-羟基丁醛脱氢酶)(EC1.2.1.b)转化为4-羟基丁醛。4-羟基丁酰-CoA可以通过4-羟基丁酰-CoA还原酶(醇形成)(EC1.1.1.c)转化为1,4-丁二醇。4-羟基丁醛可以如先前所述通过1,4-丁二醇脱氢酶(EC1.1.1.a)转化为1,4-丁二醇。
表16.从α-酮戊二酸到BDO的途径.
实施例VII
从4-氨基丁酸到BDO的途径
该实施例描述从4-氨基丁酸到BDO的示例性途径。
图9A描述其中4-氨基丁酸转化为BDO的示例性BDO途径。这类示例性BDO途径的酶连同编码这些酶的示例性基因列入表17。
简言之，4-氨基丁酸可以通过4-氨基丁酸CoA转移酶(EC2.8.3.a)、4-氨基丁酰-CoA水解酶(EC3.1.2.a)或者4-氨基丁酸-CoA连接酶(或者4-氨基丁酰-CoA合成酶)(EC6.2.1.a)转化为4-氨基丁酰-CoA。4-氨基丁酰-CoA可以通过4-氨基丁酰-CoA氧化还原酶(脱氨基)(EC1.4.1.a)或者4-氨基丁酰-CoA转氨酶(EC2.6.1.a)转化为4-氧代丁酰-CoA。4-氧代丁酰-CoA可以通过4-羟基丁酰-CoA脱氢酶(EC1.1.1.a)转化为4-羟基丁酰-CoA。4-羟基丁酰-CoA可以通过4-羟基丁酰-CoA还原酶(醇形成)(EC1.1.1.c)转化为1,4-丁二醇。替代性地，4-羟基丁酰-CoA可以通过4-羟基丁酰-CoA还原酶(或4-羟基丁醛脱氢酶)(EC1.2.1.b)转化为4-羟基丁醛。4-羟基丁醛可以通过1,4-丁二醇脱氢酶(EC1.1.1.a)转化为1,4-丁二醇。
表17.从4-氨基丁酸到BDO的途径.
表17续
表17续
图9A显示用于将4-氨基丁酸转化为BDO的另一示例性BDO途径的酶。这类示例性BDO途径的酶连同编码这些酶的示例性基因列入表18。
简言之，4-氨基丁酸可以通过4-氨基丁酸CoA转移酶(EC2.8.3.a)、4-氨基丁酰-CoA水解酶(EC3.1.2.a)或者4-氨基丁酸-CoA连接酶(或者4-氨基丁酰-CoA合成酶)(EC6.2.1.a)转化为4-氨基丁酰-CoA。4-氨基丁酰-CoA可以通过4-氨基丁酰-CoA还原酶(醇形成)(EC1.1.1.c)转化为4-氨基-1-丁醇。替代性地，4-氨基丁酰-CoA可以通过4-氨基丁酰-CoA还原酶(或4-氨基丁醛脱氢酶)(EC1.2.1.b)转化为4-氨基丁醛，以及4-氨基丁醛通过4-氨基-1-丁醇脱氢酶(EC1.1.1.a)转化为4-氨基-1-丁醇。4-氨基-1-丁醇可以通过4-氨基-1-丁醇氧化还原酶(脱氨基)(EC1.4.1.a)或者4-氨基-1-丁醇转氨酶(EC2.6.1.a)转化为4-羟基丁醛。4-羟基丁醛可以通过1,4-丁二醇脱氢酶(EC1.1.1.a)转化为1,4-丁二醇。
表18.从4-氨基丁酸到BDO的途径.
表18续
表18续
图9B描述其中4-氨基丁酸转化为BDO的示例性BDO途径。这类示例性BDO途径的酶连同编码这些酶的示例性基因列入表19。
简言之，4-氨基丁酸可以通过4-氨基丁酸激酶(EC2.7.2.a)转化为[(4-氨基丁酰基)氧基]磷酸。[(4-氨基丁酰基)氧基]磷酸可以通过4-氨基丁醛脱氢酶(磷酸化)(EC1.2.1.d)转化为4-氨基丁醛。4-氨基丁醛可以通过4-氨基-1-丁醇脱氢酶(EC1.1.1.a)转化为4-氨基-1-丁醇。4-氨基-1-丁醇可以通过4-氨基-1-丁醇氧化还原酶(脱氨基)(EC1.4.1.a)或者4-氨基-1-丁醇转氨酶(EC2.6.1.a)转化为4-羟基丁醛。替代性地，[(4-氨基丁酰基)氧基]磷酸可以通过[(4-氨基丁酰基)氧基]磷酸氧化还原酶(脱氨基)(EC1.4.1.a)
或者[(4-氨基丁酰基)氧基]磷酸转氨酶(EC2.6.1.a)转化为[(4-氧代丁酰基)氧基]磷酸。[(4-氧代丁酰基)氧基]磷酸可以通过4-羟基丁酰-磷酸脱氢酶(EC1.1.1.a)转化为4-羟基丁酰-磷酸。4-羟基丁酰-磷酸可以通过4-羟基丁醛脱氢酶(磷酸化)(EC1.2.1.d)转化为4-羟基丁醛。4-羟基丁醛可以通过1,4-丁二醇脱氢酶(EC1.1.1.a)转化为1,4-丁二醇。
表19.从4-氨基丁酸到BDO的途径.
表19续
表19续
表19续
9B 1.1.1.a 4-羟基丁醛 1,4-丁二醇 1,4-丁二醇脱氢酶 ADH2 NP_014032.1 酿酒酵母 一般
yqhD NP_417484.1 大肠杆菌 >C3
4hbd L21902.1 克鲁佛氏梭菌DSM 555 琥珀酸半醛
图9C显示通过乙酰乙酸的示例性途径。
实施例VIII
从α-酮戊二酸到BDO的示例性途径
该实施例描述从α-酮戊二酸到BDO的示例性途径。
图10描述其中α-酮戊二酸转化为BDO的示例性BDO途径。这类示例性BDO途径的酶连同编码这些酶的示例性基因列入表20。
简言之，α-酮戊二酸可以通过α-酮戊二酸5-激酶(EC2.7.2.a)转化为α-酮戊二酰基-磷酸。α-酮戊二酰基-磷酸可以通过2,5-二氧代戊酸半醛脱氢酶(磷酸化)(EC1.2.1.d)转化为2,5-二氧代戊酸。2,5-二氧代戊酸可以通过2,5-二氧代戊酸还原酶(EC1.1.1.a)转化为5-羟基-2-氧代戊酸。替代性地，α-酮戊二酸可以通过α-酮戊二酸CoA转移酶(EC2.8.3.a)、α-酮戊二酰基-CoA水解酶(EC3.1.2.a)或者α-酮戊二酰基-CoA连接酶(或者α-酮戊二酰基-CoA合成酶)(EC6.2.1.a)转化为α-酮戊二酰基-CoA。α-酮戊二酰基-CoA可以通过α-酮戊二酰基-CoA还原酶(或2,5-二氧代戊酸脱氢酶)(EC1.2.1.b)转化为2,5-二氧代戊酸。2,5-二氧代戊酸可以通过5-羟基-2-氧代戊酸脱氢酶转化为5-羟基-2-氧代戊酸。替代性地，α-酮戊二酰基-CoA可以通过α-酮戊二酰基-CoA还原酶(醇形成)(EC1.1.1.c)转化为5-羟基-2-氧代戊酸。5-羟基-2-氧代戊酸可以通过5-羟基-2-氧代戊酸脱羧酶(EC4.1.1.a)转化为4-羟基丁醛。4-羟基丁醛可以通过1,4-丁二醇脱氢酶(EC1.1.1.a)转化为1,4-丁二醇。5-羟基-2-氧代戊酸可以通过5-羟基-2-氧代戊酸脱氢酶(脱羧)(EC1.2.1.c)转化为4-羟基丁酰-CoA。
表20.从α-酮戊二酸到BDO的途径.
表20续
表20续
实施例IX
从谷氨酸到BDO的示例性途径
该实施例描述从谷氨酸到BDO的示例性途径。
图11描述其中谷氨酸转化为BDO的示例性BDO途径。这类示例性BDO途径的酶连同编码这些酶的示例性基因列入表21。
简言之，谷氨酸可以通过谷氨酸CoA转移酶(EC2.8.3.a)、谷氨酰基-CoA水解酶(EC3.1.2.a)或者谷氨酰基-CoA连接酶(或者谷氨酰基-CoA合成酶)(EC6.2.1.a)转化为谷氨酰基-CoA。替代性地，谷氨酸可以通过谷氨酸5-激酶(EC2.7.2.a)转化为谷氨酸-5-磷酸。谷氨酸-5-磷酸可以通过谷氨酸-5-半醛脱氢酶(磷酸化)(EC1.2.1.d)转化为谷氨酸-5-半醛。谷氨酰基-CoA可以通过谷氨酰基-CoA还原酶(或谷氨酸-5-半醛脱氢酶)(EC1.2.1.b)转化为谷氨酸-5-半醛。谷氨酸-5-半醛可以通过谷氨酸-5-半醛还原酶(EC1.1.1.a)转化为2-氨基-5-羟基戊酸。替代性地，谷氨酰基-CoA可以通过谷氨酰基-CoA还原酶(醇形成)(EC1.1.1.c)转化为2-氨基-5-羟基戊酸。2-氨基-5-羟基戊酸可以通过2-氨基-5-羟基戊酸氧化还原酶(脱氨基)(EC1.4.1.a)或者2-氨基-5-羟基戊酸转氨酶(EC2.6.1.a)转化为5-羟基-2-氧代戊酸。5-羟基-2-氧代戊酸可以通过5-羟基-2-氧代戊酸脱羧酶(EC4.1.1.a)转化为4-羟基丁醛。4-羟基丁醛可以通过1,4-丁二醇脱氢酶(EC1.1.1.a)转化为1,4-丁二醇。替代性地，5-羟基-2-氧代戊酸可以通过5-羟基-2-氧代戊酸脱氢酶(脱羧)(EC1.2.1.c)转化为4-羟基丁酰-CoA。
表21.从谷氨酸到BDO的途径.
表21续
表21续
表21续
实施例X
从乙酰乙酰基-CoA到BDO的示例
该实施例描述从乙酰乙酰基-CoA到BDO的示例性途径。
图12描述其中乙酰乙酰基-CoA转化为BDO的示例性BDO途径。这类示例性BDO途径的酶连同编码这些酶的示例性基因列入表22。
简言之，乙酰乙酰基-CoA可以通过3-羟基丁酰-CoA脱氢酶(EC1.1.1.a)转化为3-羟基丁酰-CoA。3-羟基丁酰-CoA可以通过3-羟基丁酰-CoA脱水酶(EC4.2.1.a)转化为巴豆酰基-CoA。巴豆酰基-CoA可以通过乙烯乙酰基-CoAΔ-异构酶(EC5.3.3.3)转化为乙烯乙酰基-CoA。乙烯乙酰基-CoA可以通过4-羟基丁酰-CoA脱水酶(EC4.2.1.a)转化为4-羟基丁酰-CoA。4-羟基丁酰-CoA可以通过4-羟基丁酰-CoA还原酶(醇形成)(EC1.1.1.c)转化为1,4-丁二醇。替代性地，4-羟基丁酰-CoA可以通过4-羟基丁酰-CoA还原酶(或4-羟基丁醛脱氢酶)(EC1.2.1.b)转化为4-羟基丁醛。4-羟基丁醛可以通过1,4-丁二醇脱氢酶(EC1.1.1.a)转化为1,4-丁二醇。
表22.从乙酰乙酰基-CoA到BDO的途径.
表22续
实施例XI
从高丝氨酸到BDO的示例性途径
该实施例描述从高丝氨酸到BDO的示例性途径。
图13描述其中高丝氨酸转化为BDO的示例性BDO途径。这类示例性BDO途径的酶连同编码这些酶的示例性基因列入表23,。
简言之，高丝氨酸可以通过高丝氨酸脱氨酶(EC4.3.1.a)转化为4-羟基丁-2-烯酸。替代性地，高丝氨酸可以通过高丝氨酸CoA转移酶(EC2.8.3.a)、高丝氨酸-CoA水解酶(EC3.1.2.a)或者高丝氨酸-CoA连接酶(或者高丝氨酸-CoA合成酶)(EC6.2.1.a)转化为高丝氨酸-CoA。高丝氨酸-CoA可以通过高丝氨酸-CoA脱氨酶(EC4.3.1.a)转化为4-羟基丁-2-烯酰基-CoA。4-羟基丁-2-烯酸可以通过4-羟基丁-2-烯酰基-CoA转移酶(EC2.8.3.a)、4-羟基丁-2-烯酰基-CoA水解酶(EC3.1.2.a)或者4-羟基丁-2-烯酰基-CoA连接酶(或者4-羟基丁-2-烯酰基-CoA合成酶)(EC6.2.1.a)转化为4-羟基丁-2-烯酰基-CoA。替代性地，4-羟基丁-2-烯酸可以通过4-羟基丁-2-烯酸还原酶(EC1.3.1.a)转化为4-羟基丁酸盐。4-羟基丁酸盐可以通过4-羟基丁酰-CoA转移酶(EC2.8.3.a)、4-羟基丁酰-CoA水解酶(EC3.1.2.a)或者4-羟基丁酰-CoA连接酶(或者4-羟基丁酰-CoA合成酶)(EC6.2.1.a)转化为4-羟基丁酰-CoA。4-羟基丁-2-烯酰基-CoA可以通过4-羟基丁-2-烯酰基-CoA还原酶(EC1.3.1.a)转化为4-羟基丁酰-CoA。4-羟基丁酰-CoA可以通过4-羟基丁酰-CoA还原酶(醇形成)(EC1.1.1.c)转化为1,4-丁二醇。替代性地，4-羟基丁酰-CoA可以通过4-羟基丁酰-CoA还原酶(或4-羟基丁醛脱氢酶)(EC1.2.1.b)转化为4-羟基丁醛。4-羟基丁醛可以通过1,4-丁二醇脱氢酶(EC1.1.1.a)转化为1,4-丁二醇。
表23.从高丝氨酸到BDO的途径.
表23续
表23续
表23续
表23续
实施例XII
表达琥珀酰-CoA合成酶的产BDO菌株
该实施例描述在表达琥珀酰-CoA合成酶的产BDO菌株中提高BDO的产量。
如上文所讨论，琥珀酸可以作为前体通过转化为琥珀酰-CoA用于生产BDO(还见WO2008/115840、WO2009/023493、美国公布2009/0047719、美国公布2009/0075351)。因此，宿主菌株通过基因修饰以过表达编码琥珀酰-CoA合成酶的大肠杆菌sucCD基因。大肠杆菌sucCD操纵子的核苷酸序列如图14A所示，以及编码的琥珀酰-CoA合成酶亚基的氨基酸序列如图14B和14C所示。简言之，通过PCR从大肠杆菌染色体DNA克隆大肠杆菌sucCD基因以及利用标准的分子生物程序将所述基因引入PA1lacO-1启动子后面的多拷贝质粒pZS*13、pZA13以及pZE33(Lutz和Bujard,NucleicAcidsRes.25:1203-1210(1997))。
过表达编码琥珀酰-CoA合成酶的大肠杆菌sucCD基因。结果显示，与cat1(其是一种琥珀酰-CoA/乙酰基-CoA转移酶)的原生水平表达或者表达相比，引入该菌株sucCD以表达琥珀酰-CoA合成酶改善了各种菌株中BDO的生产。因此，通过过表达编码琥珀酰-CoA合成酶的原生大肠杆菌sucCD基因改善了BDO的生产。
实施例XIII
编码BDO途径酶的异源性基因的表达
该实施例描述各种非原生途径酶的表达以提供改善BDO的产量。
α-酮戊二酸脱羧酶.在宿主菌株中表达编码α-酮戊二酸脱羧酶的牛结核分支杆菌sucA基因。牛结核分支杆菌sucA的过表达改善了BDO的产量(还见WO2008/115840、WO2009/023493、美国公布2009/0047719、美国公布2009/0075351)。牛结核分支杆菌sucA的核苷酸和氨基酸序列和编码的α-酮戊二酸脱羧酶如图15所示。
为构建表达菌株的牛结核分支杆菌sucA，利用下文所示的引物从牛结核分支杆菌BCG的基因组DNA(ATCC19015；弗吉尼亚州马纳萨斯的AmericanTypeCultureCollection)扩增编码该α-酮戊二酸脱羧酶的sucA基因片段。通过4个扩增DNA片段的连接反应组装全长基因，以及将所述基因克隆入PA1lacO-1启动子后面的表达载体pZS*13和pZE23(Lutz和Bujard,NucleicAcidsRes.25:1203-1210(1997))。通过DNA测序验证了该组装基因的核苷酸序列。
用于片段1的引物:
5’-ATGTACCGCAAGTTCCGC-3’(SEQIDNO:)
5’-CAATTTGCCGATGCCCAG-3’(SEQIDNO:)
用于片段2的引物:
5’-GCTGACCACTGAAGACTTTG-3’(SEQIDNO:)
5’-GATCAGGGCTTCGGTGTAG-3’(SEQIDNO:)
用于片段3的引物:
5’-TTGGTGCGGGCCAAGCAGGATCTGCTC-3’(SEQIDNO:)
5’-TCAGCCGAACGCCTCGTCGAGGATCTCCTG-3’(SEQIDNO:)
用于片段4的引物:
5’-TGGCCAACATAAGTTCACCATTCGGGCAAAAC-3’(SEQIDNO:)
5’-TCTCTTCAACCAGCCATTCGTTTTGCCCG-3’(SEQIDNO:)
利用体外和体内测定证实了α-酮戊二酸脱羧酶的功能表达。通过遵循先前报告的方法测量了SucA酶活性(Tian等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA102:10670-10675(2005))。反应混合物包含50mM钾磷酸缓冲液、pH7.00.2mM硫胺素焦磷酸、1mMMgCl2、0.8mM氰铁酸盐、1mMα-酮戊二酸和细胞粗裂解液。通过在430nm处还原氰铁酸盐监测酶活性。利用大肠杆菌全细胞培养验证SucA酶的体内功能。用编码SucA酶的质粒转换单菌落大肠杆菌MG1655lacIq以及将4-羟基丁酸脱氢酶(4hbd)接种到包含适当抗生素的5mLLB培养基中。37℃的好氧条件下培养细胞过夜。将200uL这种过夜培养物引入补充有20g/L葡萄糖、100mM3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)以改善缓冲容量、10g/mL硫胺和适当抗生素的8mLM9基本培养基(6.78g/LNa2HPO4、3.0g/LKH2PO4、0.5g/LNaCl、1.0g/LNH4Cl、1mMMgSO4、0.1mMCaCl2)。通过在接种后起初用氮冲洗加盖厌氧瓶5min，然后用23G针刺穿垫片建立微好氧的条件。在培育期间将该针保持在该瓶中，以允许少量的空气进入该瓶中。当培养物达到对数生长中期时，用0.2mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导蛋白质表达。作为对照，仅用编码4-羟基丁酸脱氢酶的质粒转换大肠杆菌MG1655lacIq菌株以及在相同的条件下仅培养空载体(见表23)。利用LCMS方法监测培养基中4-羟基丁酸盐(4HB)的累积。只有表达分支杆菌属α-酮戊二酸脱羧酶的大肠杆菌菌株产生显著量的4HB(见图16)。
表24.包含各种质粒对照和编码sucA和4-羟基丁酸脱氢酶的三种菌株.
一项单独的实验证实，α-酮戊二酸脱羧酶途径独立于还原TCA循环起作用。将大肠杆菌菌株ECKh-401(ΔadhEΔldhAΔpflBΔlpdA::肺炎克雷伯菌lpdA322ΔmdhΔarcA)用作宿主菌株(见表25)。这三种构架全部包含编码4HB脱氢酶(4Hbd)的基因。构架1还包含编码α-酮戊二酸脱羧酶(sucA)的基因。构架2包含编码经由还原TCA循环合成4HB所需的琥珀酰-CoA合成酶(sucCD)和依赖CoA的琥珀酸半醛脱氢酶(sucD)的基因。构架3包含来自1和2的所有基因。如上文所述，在相同的条件下培养这三种大肠杆菌菌株，除了在微好氧条件下培养第二种培养物。通过表达SucA酶，构架3比依赖还原TCA循环进行4HB合成的构架2生产更多的4HB(见图17)。
通量分析实验为α-酮戊二酸脱羧酶对4HB和BDO生产的促成作用提供了进一步支持。在包含1-13C-葡萄糖(60％)和U-13C-葡萄糖(40％)的混合物的M9基本培养基中培育在染色体上包含sucCD-sucD和sucA两者的ECKh-432培养物。收获了生物质、将蛋白质分离和水解为氨基酸，以及如先前所述，通过气相色谱分析-质谱分析法(GCMS)分析了氨基酸的标记分发(Fischer和Sauer,Eur.J.Biochem.270:880-891(2003))。此外，如WO2008115840A2所述，通过GCMS分析了分泌的4HB和BDO的标记分发。利用这种数据，通过建立的方法计算细胞内通量分布(Suthers等人,Metab.Eng.9:387-405(2007))。结果表明，56％和84％之间的α-酮戊二酸被引导通过α-酮戊二酸脱羧酶进入BDO途径。剩余部分通过α-酮戊二酸脱氢酶氧化，其然后经由琥珀酰-CoA路径进入BDO。
这些结果证实了包含在质粒上表达的来自牛结核分支杆菌BCG的sucA基因的产4-羟基丁酸盐的菌株。当编码这种基因的质粒不存在时，4-羟基丁酸盐的产量在没有表达sucD(CoA-依赖的琥珀酸半醛脱氢酶)时是可以忽略的。牛结核分支杆菌基因是结核分枝杆菌基因的紧密同系物，所述结核分枝杆菌基因的酶产物已有先前表征(Tian等人，同上，2005)。
琥珀酸半醛脱氢酶(CoA-依赖的)、4-羟基丁酸脱氢酶和4-羟基丁酰-CoA/乙酰基- CoA转移酶.来自牙龈红棕色单胞菌W83的基因可以是用于生产1,4-丁二醇的途径的有效组分(还见WO2008/115840、WO2009/023493、美国公布2009/0047719、美国公布2009/0075351)。来自牙龈红棕色单胞菌的依赖CoA的琥珀酸半醛脱氢酶(sucD)的核苷酸序列如图18A所示，以及编码的氨基酸序列如图18B所示。来自牙龈红棕色单胞菌的4-羟基丁酸脱氢酶(4hbd)的核苷酸序列如图19A所示，以及编码的氨基酸序列如图19B所示。来自牙龈红棕色单胞菌的4-羟基丁酸CoA转移酶(cat2)的核苷酸序列如图20A所示，以及编码的氨基酸序列如图20B所示。
简言之，通过PCR自牙龈卟啉单胞菌染色体DNA克隆来自牙龈红棕色单胞菌W83编码琥珀酸半醛脱氢酶(CoA-依赖的)和4-羟基丁酸脱氢酶，以及在一些情况下，另外编码4-羟基丁酰-CoA/乙酰基-CoA的基因,以及利用标准的分子生物程序将所述基因引入PA1lacO-1启动子后的多拷贝质粒pZS*13、pZA13和pZE33(Lutz和Bujard,NucleicAcidsRes.25:1203-1210(1997))。然后将这些质粒引入宿主菌株。
如上文所述，将牙龈红棕色单胞菌W83基因引入生产菌株。一些菌株仅包括琥珀酸半醛脱氢酶(CoA-依赖的)和4-羟基丁酸脱氢酶，而无4-羟基丁酰-CoA/乙酰基-CoA转移酶。
丁酸激酶和磷酸丁酰转移酶.丁酸激酶(BK)和磷酸丁酰转移酶(PTB)酶类可用以生产4-羟基丁酰-CoA(还见WO2008/115840、WO2009/023493、美国公布2009/0047719、美国公布2009/0075351)。具体地，丙酮丁醇梭菌基因buk1和ptb可用作功能性BDO途径的一部分。
初始实验涉及原生丙酮丁醇梭菌PTB(020)和大肠杆菌中BK(021)基因的克隆和表达。需要时，将每种基因的起始密码子和终止密码子分别修饰为“ATG”和“TAA”，以在大肠杆菌中更优化地表达。丙酮丁醇梭菌基因序列(020N和021N)及其相应的翻译肽序列(translatedpeptidesequence)如图21和22所示。
PTB和BK基因作为操纵子存在于丙酮丁醇梭菌中，其中首先表达的是PTB(020)基因。通过序列“attaaagttaagtggaggaatgttaac”(SEQIDNO:)连接这两种基因，所述序列包括针对下游BK(021)基因的再引发核醣体结合位点。在这种情况下，将这两种基因融合至表达载体中受lac控制的启动子，以在大肠杆菌中进行表达(Lutz和Bujard,NucleicAcidsRes.25:1203-1210(1997))。
发现，由于在丙酮丁醇梭菌基因中的密码子发生率高而大肠杆菌中只是偶有发生，与其他外源性表达的基因相比，来自这些载体构架的两种蛋白质的表达较低。因此，预测了新的020和021基因，所述基因将稀有密码子改变为在大肠杆菌基因序列中具有更高表达的替代性密码子。这种密码子优化方法遵循先前所述的算法(Sivaraman等人,NucleicAcidsRes.36:e16(2008))。当任一侧具有某些密码子时，这种方法根据它们的出现频率预测密码子替换。确定了用于020(图23)和021(图24)的替代性基因序列，其中基于它们在临近密码子环境中的发生率，稀有密码子被更普遍的密码子替换的数量在增加(A<B<C<D)。未将实际肽序列中相比于原生020和021肽序列的改变引入这些预测序列。
图25A显示了密码子优化导致的BK和PTB蛋白质表达的改善。原生基因序列的表达如泳道2所示，而020B-021B和020C-021C的表达分别如泳道3和4所示。密码子优化的操纵子020B-021B(2021B)和020C-021C(2021C)中更高水平的蛋白质表达还导致活性相比于在对等地表达的大肠杆菌粗提取物中的原生操纵子(2021n)得以提高(图25B)。
在菌株ECKh-432(ΔadhEΔldhAΔpflBΔlpdA::肺炎克雷伯菌lpdA322ΔmdhΔarcAgltAR163LfimD::大肠杆菌sucCD、牙龈卟啉单胞菌sucD、牙龈卟啉单胞菌4hbdfimD::牛结核分支杆菌sucA、克鲁佛氏梭菌4hbd)中的质粒连同丙酮丁醇梭菌醛脱氢酶上表达密码子优化的操纵子，以提供完整的BDO途径。在包含20g/L葡萄糖的M9基本培养基中培养细胞，如上文所述利用23G针维持微好氧的条件。对葡萄糖到最终产物BDO的所得转化率进行测量。还测量了γ-丁内酯(GBL)的累积量，该GBL是一种从PTB-BK酶对的直接产物4Hb-CoA衍生得到的自发重排分子。图26显示原生2021n操纵子的表达导致了BDO水平可以与能够将4HB和游离CoA转化为4HB-CoA的替代性酶功能Cat2(034)相比。034的GBL水平显著高于2021n，这表明前者酶比表达自原生基因的PTB-BK更具活性。然而，当表达密码子优化的变体2021B和2021C时，BDO和GBL的水平均高于034或者2021n，这表明用于PTB和BK的基因的密码子优化显著提高了它们对大肠杆菌中BDO合成的促进作用。
这些结果证实丁酸激酶(BK)和磷酸丁酰转移酶(PTB)酶类可用以将4-羟基丁酸盐转化为4-羟基丁酰-CoA。这根除了对转移酶如4-羟基丁酰-CoA/乙酰基-CoA转移酶(其每生产1摩尔4-羟基丁酰-CoA将生成1摩尔的乙酸)的需求。来自丙酮丁醇梭菌的所述酶存在于许多设计以用于BDO生产的菌株中。
4-羟基丁酰-CoA还原酶.拜氏梭菌ald基因可用作功能BDO途径的一部分(还见WO2008/115840、WO2009/023493、美国公布2009/0047719、美国公布2009/0075351)。拜氏梭菌ald还可用以降低产BDO的菌株中乙醇的产量。另外，发现特定的密码子优化的ald变体(GNM0025B)改善BDO的生产。
原生拜氏梭菌ald基因(025n)和该酶的预测蛋白质序列如图27所示。如所见，对于丙酮丁醇梭菌PTB和BK基因来说，大肠杆菌中原生拜氏梭菌ald基因的表达非常低。因此，预测了用于这种基因的4种密码子优化的变体。图28A-28D显示用于025的替代性基因序列，其中基于它们在临近密码子环境中的发生率(25A,P＝0.05；25B,P＝0.1；25C,P＝0.15；25D,P＝1)，稀有密码子被更普遍的密码子替换的数量在增加(A<B<C<D)。未将实际肽序列中相比于原生025肽序列的改变引入这些预测。密码子优化显著提高了拜氏梭菌ald的表达(见图29)，这导致了在表达完整BDO途径的细胞中葡萄糖到BDO的转化显著较高(图30A)。
在宿主菌株ECKh-432(ΔadhEΔldhAΔpflBΔlpdA::肺炎克雷伯菌lpdA322ΔmdhΔarcAgltAR163LΔackAfimD::大肠杆菌sucCD、牙龈卟啉单胞菌sucD、牙龈卟啉单胞菌4hbdfimD::牛结核分支杆菌sucA、克鲁佛氏梭菌4hbd)中的质粒连同牙龈卟啉单胞菌Cat2中表达原生和密码子优化的基因，从而包含完整的BDO途径。如上文所述，在包含20g/L葡萄糖的M9基本培养基中微好氧培养细胞。将通过拜氏梭菌Ald酶(表达自密码子优化的变体基因025B)的BDO和乙醇的相对生产与丙酮丁醇梭菌AdhE2酶作比较(见图30B)。丙酮丁醇梭菌AdhE2酶(002C)生产的乙醇比BDO多4倍。相比之下，拜氏梭菌Ald(025B)(结合内源性ADH活性)生产相等量的BDO，然而相比于002C，对于这种酶，BDO与乙醇的产量比率则是相反的。这表示，与丙酮丁醇梭菌AdhE2相比，拜氏梭菌Ald对4HB-CoA的特异性超过对乙酰基-coA的特异性，因此前者是用于包含在BDO途径中的优选酶。
将拜氏梭菌ald基因(Toth等人,Appl.Envir上.Microbiol.65:4973-4980(1999))作为用于催化4-羟基丁酰-CoA到4-羟基丁醛的转化的候选基因进行检测。对超过五十种醛脱氢酶进行催化4-羟基丁酰-CoA到4-羟基丁醛的转化的能力的筛选。由于这种酶偏爱4-羟基丁酰-CoA作为底物而非乙酰基-CoA，选定拜氏梭菌ald基因实施入产BDO的菌株。这是很重要的，因为大部分其他的具有醛脱氢酶功能的酶(例如，来自丙酮丁醇梭菌的adhE2(Fontaine等人,JBacteriol.184:821-830(2002))优选地将乙酰基-CoA转化为乙醛，乙醛转而转化为乙醇。利用拜氏梭菌基因降低产BDO的生物中作为副产物产生的乙醇的量。此外，在大肠杆菌中很好地表达密码子优化形式的这种基因(Sivaraman等人,NucleicAcidsRes.36:e16(2008))。
4-羟基丁醛还原酶.利用来自热葡糖苷酶地芽孢杆菌(M10EXG)的adh1的4-羟基丁醛还原酶活性。通过提高4-羟基丁醛还原酶活性使其高于内源性的水平导致了BDO生产的改善。
对多种醇脱氢酶进行催化4-羟基丁醛到BDO的还原反应的能力的筛选。大部分对丁醛具有高活性的醇脱氢酶显示对4-羟基丁醛的活性要低得多。一个明显的例外是来自热葡糖苷酶地芽孢杆菌M10EXG的adh1基因(Jeon等人,J.Biotechnol.135:127-133(2008))(GNM0084)，其显示出对4-羟基丁醛和丁醛的高活性。
来自热葡糖苷酶地芽孢杆菌的adh1基因的原生基因序列和编码的蛋白质序列如图31所示。在大肠杆菌中表达了热葡糖苷酶地芽孢杆菌ald1基因。
Adh1酶(084)很好地表达自大肠杆菌中其原生基因(见图32A)。在ADH酶测定中，当将丁醛或者4HB-醛用作底物时，该大肠杆菌表达的酶显示出非常高的还原活性(见图32B)。所确定的这些底物的Km数值分别是1.2mM和4.0mM。这些活性数值显示，Adh1酶是所有检测的候选酶中对4HB-醛还原最具活性的酶。
对084酶进行当与拜氏梭菌ald偶联时促进BDO生产的能力的检测。将084基因插到拜氏梭菌ald变体025B基因后面，以创建导致两种基因的偶联表达的合成操纵子。类似的构架将025B与其他ADH候选基因连接起来，以及检测了用025B包含每种ADH对BDO生产的影响。所用的宿主菌株是ECKh-459(ΔadhEldhAΔpflBΔlpdA::fnr-pflB6-肺炎克雷伯菌lpdA322ΔmdhΔarcAgltAR163LfimD::大肠杆菌sucCD、牙龈卟啉单胞菌sucD、牙龈卟啉单胞菌4hbdfimD::牛结核分支杆菌sucA、克鲁佛氏梭菌4hbdfimD::丙酮丁醇梭菌buk1、丙酮丁醇梭菌ptb)，其包含染色体上BDO途径的剩余部分。当相比于仅仅有025B(图33左侧箭头)以及结合内源性的ADH功能时，结合025B表达的084ADH显示了最高量的BDO(图33右侧箭头)。它生产的BDO也比当与025B配对时，其他ADH酶(如下所示)生产的多：026A-C，丙酮丁醇梭菌丁醇脱氢酶的密码子优化的变体；050，运动发酵单胞菌醇脱氢酶I；052，弗氏柠檬酸杆菌1,3-丙二醇脱氢酶；053，短乳杆菌1,3-丙二醇脱氢酶；057，脆弱类杆菌乳醛还原酶；058，大肠杆菌1,3-丙二醇脱氢酶；071，枯草芽孢杆菌168α-酮戊二酸半醛脱氢酶。标记有“PT5lacO”的构架是那些其中通过PT5lacO启动子驱动基因的构架。在所有其他的情况下，使用PA1lacO-1启动子。这显示，BDO途径中包含084ADH提高了BDO的产量。
实施例XIV
表达丙酮酸脱氢酶的产BDO的菌株
该实施例描述丙酮酸脱氢酶(PDH)提高BDO产量的用途。利用肺炎克雷伯氏杆菌lpdA基因的异源性表达来提高BDO的产量。
从计算量上来说，丙酮酸到乙酰基-CoA的生成NADH的转化率需要达到1,4-丁二醇的最大理论收率(还见WO2008/115840、WO2009/023493、美国公布2009/0047719、美国公布2009/0075351；WO2008/018930；Kim等人,Appl.Environ.Microbiol.73:1766-1771(2007)；Kim等人,J.Bacteriol.190:3851-3858(2008)；Menzel等人,J.Biotechnol.56:135-142(1997))。如果不能获得磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶(PEPCK)活性，PDH活性的缺乏显示出使BDO的最大厌氧理论收率降低了11％，以及如果可以获得PEPCK活性，PDH活性的缺乏显示出使BDO的最大厌氧理论收率降低了3％。然而更重要的是，OptKnock菌株#439(描述于WO2009/023493和美国公布2009/0047719，其中ADHEr、ASPT、LDH_D、MDH和PFLi被敲除)中PDH活性的缺乏将在PEPCK活性缺乏或者存在时，使BDO的最大厌氧收率分别降低了54％或43％。在外部电子受体的存在下，分别假设PEPCK活性缺乏或者存在，PDH活性的缺乏将使敲除菌株的最大收率降低了10％或3％。
PDH是中心代谢的最复杂的酶之一，其由结合到二氢脂转乙酰酶(E2)核心外的丙酮酸脱羧酶(E1)的24个拷贝以及二氢脂脱氢酶(E3)的的12个分子组成。高NADH/NAD、ATP/ADP以及乙酰基-CoA/CoA比率抑制PDH。在很大程度上由于由lpdA编码的E3的ADH敏感性，在生物如大肠杆菌中在氧受限或厌氧条件下，该酶自然地显示出非常低的活性。为此，克隆并表达来自肺炎克雷伯氏杆菌的对NADH不敏感的形式的lpdA基因，以增加期望ADH/NAD比率高的条件下PDH的活性。
原生lpdA的替换.肺炎克雷伯菌的丙酮酸脱氢酶操纵子与大肠杆菌的等同操纵子在核苷酸水平上具有78％和95％之间的一致性。先前显示，肺炎克雷伯菌具有在甘油的存在下厌氧生长的能力(Menzel等人,J.Biotechnol.56:135-142(1997)；Menzel等人,Biotechnol.Bioeng.60:617-626(1998))。也已经有显示，大肠杆菌操纵子的lpd基因中的两种突变会提高其厌氧生长的能力(Kim等人.Appl.Environ.Microbiol.73:1766-1771(2007)；Kim等人,J.Bacteriol.190:3851-3858(2008))。利用基因组DNA(ATCC700721D)作为模板以及引物KP-lpdA-Bam(5’-acacgcggatccaacgtcccgg-3’)(SEQIDNO:)和KP-lpdA-Nhe(5’-agcggctccgctagccgcttatg-3’)(SEQIDNO:)通过PCR扩增肺炎克雷伯氏杆菌的lpd基因。将所得的片段克隆进入载体pCR-BluntII-TOPO(加利福尼亚州卡尔斯巴的Invitrogen)，产生质粒pCR-KP-lpdA。
利用非复制型质粒和来自枯草芽孢杆菌的sacB基因作为反向选择的手段来进行染色体基因替换(Gay等人,J.Bacteriol.153:1424-1431(1983))。所用的载体是删除oriT和IS序列的pRE118(ATCC87693)，其大小为3.6kb以及携带卡那霉素抗性基因。确认了序列，以及将该载体称为pRE118-V2(见图34)。
利用如下的引物组合通过PCR扩增lpd基因两侧的大肠杆菌片段：EC-aceF-Pst(5’-aagccgttgctgcagctcttgagc-3’)(SEQIDNO:)+EC-aceF-Bam2(5’-atctccggcggtcggatccgtcg-3’)(SEQIDNO:)和EC-yacH-Nhe(5’-aaagcggctagccacgccgc-3’)(SEQIDNO:)+EC-yacH-Kpn(5’-attacacgaggtacccaacg-3’)(SEQIDNO:)。将包含肺炎克雷伯氏杆菌的lpd基因的BamHI-XbaI片段从质粒pCR-KP-lpdA分离，然后连接到分别用PstI+BamHI和NheI-KpnI消化的如上大肠杆菌片段，以及用KpnI和PstI消化的pRE118-V2质粒。利用引物KP-lpdA-HisTyr-F(5’-atgctggcgtacaaaggtgtcc-3’)(SEQIDNO:)和(5’-ggacacctttgtacgccagcat-3’)(SEQIDNO:)的组合或者利用引物KP-lpdA-GluLys-F(5’-atcgcctacactaaaccagaagtgg-3’)(SEQIDNO:)和KP-lpdA-GluLys-R(5’-ccacttctggtttagtgtaggcgat-3’)(SEQIDNO:)的组合使所得的质粒(称为pRE118-M2.1lpdAyac)经受定点诱变(SDM)分别使得His322残基突变成Tyr残基或者使得残基Glu354突变成Lys残基。用聚合酶PfuTurbo(加利福尼亚圣地亚哥Stratgene)执行PCR。验证了完整片段的序列以及仅存在所需的突变。通过转换将所得的质粒引入大肠杆菌ΔadhE::Frt-ΔldhA::Frt的电转感受态细胞。选定染色体中的第一整合事件在包含卡那霉素(25或者50mg/L)的LB琼脂平板上。利用2种引物(一种位于插入区域之外以及一种位于卡那霉素基因中(5’-aggcagttccataggatggc-3’)(SEQIDNO:))通过PCR验证了恰当的插入物。选定具有恰当插入物的克隆物进行溶解。将它们在所需的温度下于纯液体LB中次代培养以及将连续稀释物涂抹至LB-无盐-蔗糖10％平板上。对在包含蔗糖的平板上生长的克隆物进行在LB-低盐琼脂培养基上卡那霉素抗性基因损失的筛选以及通过PCR和包含区域的测序lpd基因替换。插入区域的序列得到了验证，以及如下文所述。选定一种具有突变Glu354Lys的克隆物(称为4-4-P1)。然后用大肠杆菌ΔPflB::Frt的P1裂解液转换这种克隆物，产生菌株ECKh-138(ΔadhEΔldhAvpflBΔlpdA::肺炎克雷伯菌lpdA322)。
包含aceF和lpdA基因的ECKh-138区域的序列如图35所示。下划线的是肺炎克雷伯氏杆菌lpdA基因，以及划上阴影线的是Glu354Lys突变体中改变的密码子。原生大肠杆菌lpdA和突变体肺炎克雷伯氏杆菌lpdA的蛋白质序列对比如图36所示。
为评估将肺炎克雷伯氏杆菌lpdA用于BDO生产菌株的益处，用来自诱导型强启动子的表达完整BDO途径的质粒转化宿主菌株AB3和ECKh-138。具体地，在培养基拷贝质粒pZA33上表达大肠杆菌sucCD、牙龈卟啉单胞菌sucD、牙龈卟啉单胞菌4hbd，以及在高拷贝质粒pZE13上表达牙龈卟啉单胞菌Cat2和丙酮丁醇梭菌AdhE2。文献(Lutz和H.Bujard,NucleicAcidsRes25:1203-1210(1997))中已经对这些质粒进行了描述，以及实施例XIII和WO2008/115840中描述了它们在BDO途径表达中的用途。
在补充有20g/L葡萄糖、100mM3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)以改善缓冲容量、10μg/mL硫胺和适当抗生素的M9基本培养基(6.78g/LNa2HPO4、3.0g/LKH2PO4、0.5g/LNaCl、1.0g/LNH4Cl、1mMMgSO4、0.1mMCaCl2)中在37℃下厌氧培育细胞。通过在接种后起初用氮冲洗加盖厌氧瓶5min，然后用23G针刺穿垫片建立微好氧的条件。在培育期间将该针保持在该瓶中，以允许少量的空气进入该瓶中。当OD600达到大约0.2时，添加0.25mMIPTG以诱导途径基因，以及诱导后每24小时取样本进行分析。如实施例II和WO2008/115840中所述，对培养上清液进行BDO、4HB以及其他副产物的分析。48小时后，ECKh-138中的BDO和4HB产量明显高于AB3或者先前工作所用的宿主MG1655ΔldhA中的BDO和4HB产量(图37)。
PDH启动子替换.据先前显示，通过包含Fnr结合位点、pflB启动子之一及其核糖体结合位点(RBS)的转录融合体进行的从而导致通过厌氧启动子的aceEF-lpd操纵子的表达的pdhR抑制子替换应该厌氧地提高pdh活性(Zhou等人,Biotechnol.Lett.30:335-342(2008))。通过重叠PCR构建包含Fnr结合位点、pflB-p6启动子和RBS结合位点的融合体。扩增两种片段，一种利用引物aceE-上游-RC(5’-tgacatgtaacacctaccttctgtgcctgtgccagtggttgctgtgatatagaag-3’)(SEQIDNO:)和pflBp6-上游-Nde(5’-ataataatacatatgaaccatgcgagttacgggcctataagccaggcg-3’)(SEQIDNO:)以及另一种利用引物aceE-EcoRV-EC(5’-agtttttcgatatctgcatcagacaccggcacattgaaacgg-3’)(SEQIDNO:)和aceE-上游(5’-ctggcacaggcacagaaggtaggtgttacatgtcagaacgtttacacaatgacgtggatc-3’)(SEQIDNO:)。通过重叠PCR组装tw片段，以及用限制酶NdeI和BamHI消化最后的DNA片段。随后，如上文所述，利用pRE118-V2将这种片段引入大肠杆菌操纵子的aceE基因上游。在菌株ECKh-138和ECKh-422中进行该替换。包含aceE基因的5’区域的核苷酸序列得到了验证以及如图37所示。图37显示该aceE基因的5’端的核苷酸序列融合至该pflB-p6启动子和核糖体结合位点(RBS)。5’斜体序列表示aroP基因的起始，其按相反的方向从pdh操纵子转录。3’斜体序列表示aceE基因的起始。上面的情况下：pflBRBS。下划线部分：FNR结合位点。粗体部分：pflB-p6启动子序列。
lpdA启动子替换.利用染色体DNA模板和引物aceF-pflBp6-正向(5’-agacaaatcggttgccgtttgttaagccaggcgagatatgatctatatc-3’)(SEQIDNO:)和lpdA-RBS-B-反向(5’-gagttttgatttcagtactcatcatgtaacacctaccttcttgctgtgatatag-3’)(SEQIDNO:)通过PCR扩增包含fnr结合位点、pflB-p6启动子和pflB基因的RBS的启动子区域。利用引物B-RBS-lpdA正向(5’-ctatatcacagcaagaaggtaggtgttacatgatgagtactgaaatcaaaactc-3’)(SEQIDNO:)和pflBp6-aceF-反向(5’-gatatagatcatatctcgcctggcttaacaaacggcaaccgatttgtct-3’)(SEQIDNO:)通过PCR扩增质粒2-4a。利用BPS克隆试剂盒(加利福尼亚圣地亚哥的BPSBioscience)组装两种所得的片段。对所得的构架进行测序、验证并利用上文所述的pRE118-V2方法将其引入菌株ECKh-439。所得的菌株ECKh-456中包含aceF-lpdA区域的核苷酸序列如图39所示。
对宿主菌株ECKh-439(ΔadhEΔldhAΔpflBΔlpdA::肺炎克雷伯菌lpdA322ΔmdhΔarcAgltAR163LackAfimD::大肠杆菌sucCD、牙龈卟啉单胞菌sucD、牙龈卟啉单胞菌4hbdfimD:：牛结核分支杆菌sucA、克鲁佛氏梭菌4hbd)(其构架如下文所述)以及pdhR和lpdA启动子替换衍生物ECKh-455和ECKh-456进行BDO产量检测。用包含牙龈卟啉单胞菌Cat2和拜氏梭菌Ald的pZS*13转换菌株，以提供完整的BDO途径。如上文所述，在补充有20g/L葡萄糖的M9基本培养基中培养细胞。用0.2mMIPTG诱导之后48小时，BDO、4HB以及丙酮酸的浓度如图40所示。启动子替换菌株比同基因亲株生产的BDO稍多。
这些结果证实，丙酮酸脱氢酶的表达提高了产BDO的菌株中BDO的产量。
实施例XV
表达柠檬酸合酶和乌头酸酶的产BDO的菌株
该实施例描述提高柠檬酸合酶和乌头酸酶的活性以提高BDO的产量。发现，R163L突变为gltA可改善BDO的产量。另外，利用arcA敲除来改善BDO的产量。
据计算，确定通过柠檬酸合酶(CS)和乌头酸酶(ACONT)的通量需要达到1,4-丁二醇的最大理论收率(还见WO2008/115840、WO2009/023493、美国公布2009/0047719、美国公布2009/0075351)。厌氧条件下，CS或者ACONT活性的缺乏会使最大理论收率降低14％。分别假设缺乏或者存在PEPCK活性，在外部电子受体的存在下，该最大收率降低了9％或6％，而无通量通过CS或者ACONT。与丙酮酸脱氢酶(PDH)一样，CS和ACONT的重要性在敲除菌株背景(其中敲除ADHEr、ASPT、LDH_D、MDH和PFLi(设计#439)(见WO2009/023493和美国公布2009/0047719，其以引用方式并入本文))中大大提高。
WO2009/023493和美国公布2009/0047719中所述的最基本的OptKnock菌株设计从ECKh-138另外删除了编码苹果酸脱氢酶的mdh基因。这种基因的删除意在防止通量经由还原TCA循环到琥珀酸。利用λred同源重组方法进行mdh删除(Datsenko和Wanner,Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:6640-6645(2000))。利用如下寡核苷酸PCR扩增来自pKD3两侧是FRT位点的抗氯霉素基因(CAT)：
S-mdh-Kan5'- GTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'(SEQIDNO:)
AS-mdh-Kan5'- ATATGAATATCCTCCTTAG-3'(SEQIDNO”)。
下划线区域表示与KD3质粒同源性以及粗体序列表示mdhORF上游和下游的序列同源性。纯化之后，对PCR产物进行电穿孔，使其进入已用pRedET(tet)转换以及根据生产者的指示制备的ECKh-138电转感受态细胞(www.genebridges.com/gb/pdf/K001％20Q％20E％20BAC％20Modification％20Kit-version2.6-2007-screen.pdf)。设计PCR产物，使得其整合入该mdh基因的上游区域的ECKh-138基因组，如图41所示。
重组体被选定用于抗氯霉素以及划线纯化(streakpurified)。通过诊断PCR验证了mdh基因的缺失以及CAT的插入。为除去CAT基因，在30℃下将包含FLP重组酶的温度敏感型质粒pCP20(Datsenko和Wanner,Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:6640-6645(2000))转换进入细胞以及选定用于抗氨苄青霉素(AMP)。42℃下非选择性培育转化体过夜，以热诱导FLP的合成以及导致质粒的缺失。然后对培养物划线纯化，以及对个体菌落进行所有的抗生素抗性损失检测。大部分同时缺失了两侧是FRT的抗性基因和FLP辅助质粒。还有残余的“FRT”疤痕。所得的菌株称为ECKh-172。
厌氧条件下，CS和ACONT没有高活性或者被高度表达。为此，删除了为TCA循环的全局调节子编码的arcA基因。微好氧条件期间，ArcA起作用，以诱导基因产物的表达，所述基因产物允许对低氧水平、aceE、pflB和adhE敏感的中心代谢酶的活性。据显示，在微好氧条件下，arcA/arcB中的删除提高了ldh、icd、gltA、mdh以及gdh基因的比活(Salmon等人,J.Biol.Chem.280:15084-15096(2005)；Shalel-Levanon等人,Biotechnol.Bioeng.92(2):147-159(2005))。分别利用带有ArcA-上游-KpnI
(5’-tattattatggtaccaatatcatgcagcaaacggtgcaacattgccg-3’)(SEQIDNO:)的引物ArcA-上游-EcoRI(5’-ataataatagaattcgtttgctacctaaattgccaactaaatcgaaacagg-3’)(SEQIDNO:)以及带有ArcA-下游-PstI
(5’-ataaaaccctgcagcggaaacgaagttttatccatttttggttacctg-3’)(SEQIDNO:)的ArcA-下游-EcoRI(5’-tgatctggaagaattcatcggctttaccaccgtcaaaaaaaacggcg-3’)(SEQIDNO:)通过PCR扩增大肠杆菌MG1655的arcA基因的上游和下游区域。接着，用限制酶EcoRI和KpnI(上游片段)和EcoRI和PstI(下游)消化这些片段。然后将它们连接入用PstI和KpnI消化的pRE118-V2质粒，产生质粒pRE118-ΔarcA。对质粒pRE118-ΔarcA的序列进行了验证。将pRE118-ΔarcAw作为引入大肠杆菌菌株ECKh-172(ΔadhEΔldhAΔpflBlpdA::肺炎克雷伯菌lpdA322Δmdh)的电转感受态细胞。在如上文所述的LB-无盐-蔗糖平板上整合和分离后，通过测序验证了所得的菌株ECKh-401的染色体中的arcA基因删除以及如图42所示。
大肠杆菌的gltA基因为柠檬酸合酶编码。据先前显示，这种基因通过NADH来变构抑制，以及已经确认这种抑制中涉及氨基酸(Pereira等人,J.Biol.Chem.269(1):412-417(1994)；Stokell等人,J.Biol.Chem.278
(37):35435-35443(2003))。利用引物gltA-up(5’-ggaagagaggctggtacccagaagccacagcagga-3’)(SEQIDNO:)和gltA-PstI
(5’-gtaatcactgcgtaagcgccatgccccggcgttaattc-3’)(SEQIDNO:)通过PCR扩增大肠杆菌MG1655的gltA基因。用KpnI和PstI消化之后，将该扩增的片段克隆进入pRE118-V2。所得的质粒称为pRE118-gltA。然后利用引物R163L-f
(5’-attgccgcgttcctcctgctgtcga-3’)(SEQIDNO:)和R163L-r
(5’-cgacagcaggaggaacgcggcaat-3’)(SEQIDNO:)使这种质粒经受定点诱变*(SDM)，以将残基Arg163改变为Lys残基。通过测序验证了整个片段的序列。利用λred同源重组方法的变体(Datsenko和Wanner,Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:6640-6645(2000))来以R163L突变体等位基因替换原生gltA基因，而没有留下Frt疤痕。一般的重组程序与上文所述的进行mdh删除所用的相同。首先，利用λred同源重组方法引入rpsL无效突变使菌株ECKh-172具有链霉素抗性。接下来，进行重组以用由大肠杆菌rpsL基因的卡那霉素抗性基因(kanR)和野生型拷贝组成的盒替换这种菌株中的整个野生型gltA编码区域。当引入含有rpsL无效突变的大肠杆菌菌株时，该盒使细胞从对药物链霉素具有抗性改变为对链霉素具有敏感性。然后引入包括突变体形式的gltA基因的每种连同适当的同源性末端的DNA片段，以及在链霉素的存在下对所得的菌落生长进行检测。这被选定用于其中kanR/rpsL盒已被突变体gltA基因替换的菌株。通过PCR和DNA测序分析证实了正确位点中该突变体基因的插入。所得的菌株称为ECKh-422，以及具有基因型ΔadhEΔldhAΔpflBΔlpdA::肺炎克雷伯菌lpdA322ΔmdhΔarcAgltAR163L。通过测序验证了包含菌株ECKh-422的突变gltA基因的区域，如图43所示。
然后对菌株ECKh-401的粗提取物和gltAR163L突变体ECKh-422进行柠檬酸合酶活性评估。通过以4,500rpm(加利福尼亚富勒顿的Beckman-Coulter的AllegeraX-15R)离心10min收获细胞。在具有benzonase核酸酶和溶菌酶的0.3mLBugBuster(加利福尼亚圣地亚哥的Novagen/EMD)试剂中再悬浮细胞团，以及室温下轻轻摇晃使溶解进行15min。在4℃下通过以14,000rpm离心(德国汉堡的Eppendorfcentrifuge5402)30min获得不含细胞的裂解液。利用Bradford的方法(Bradford,Anal.Biochem.72:248-254(1976))确定样本中的细胞蛋白质。
游离辅酶A(HS-CoA)(其从乙酰基-CoA与草酰乙酸的反应中释放出来)形成之后确定柠檬酸合酶活性。HS-CoA的游离硫醇基团与5,5’-二硫双-(2-硝基苯甲酸)(DTNB)反应形成5-硫代-2-硝基苯甲酸(TNB)。然后通过测量410nm处(最大412nm处)的吸光度来分光光度监测TNB的浓度。检测混合物包含100mMTris/HCl缓冲液(pH7.5)、20mM乙酰基-CoA、10mMDTNB以及20mM草酰乙酸。为了评估NADH的抑制度，还向反应中添加了0.4mMNADH。通过添加5微升的细胞提取物开始检测，以及通过遵循吸光度随时间的改变测量了反应速率。比活的单位定义为每分钟每mg蛋白质转化的产物μmol。
图44显示野生型gltA基因产物和R163L突变体的柠檬酸合酶活性。在缺乏或者存在0.4mMNADH的条件下进行检测。
用表达完整BDO途径的质粒转换菌株ECKh-401和ECKh-422。在低拷贝质粒pZS*13表达大肠杆菌sucCD、牙龈卟啉单胞菌sucD、牙龈卟啉单胞菌4hbd以及牛结核分支杆菌sucA，以及在中拷贝质粒pZE23上表达牙龈卟啉单胞菌Cat2和丙酮丁醇梭菌AdhE2。在如上文所述的补充有20g/L葡萄糖和适当的抗生素的M9基本培养基中微好氧培育这些菌株的培养物。来自拷贝培养物诱导后平均48小时时4HB和BDO的浓度如图45所示。在ECKh-422中的两种浓度均高于在ECKh-401中的浓度，这表明由于gltA突变提高的柠檬酸合酶活性提高了到BDO途径的通量。
本节所述的宿主菌株修饰意在再引导碳通量通过氧化TCA循环，这与WO2009/023493和美国公布2009/0047719中所述的OptKnock菌株设计一致。为证实通量的确被引导通过该途径，利用菌株ECKh-432执行13C通量分析，该ECKh-432是ECKh-422的一种形式，其中上游途径被整合入染色体(如实施例XVII中所述)。为完善BDO途径，从pZS*13表达牙龈卟啉单胞菌Cat2和拜氏梭菌Ald。在包含4种不同标记比(1-13C，葡萄糖分子中仅第一碳原子用13C标记；统一13C，所有的碳原子是13C)的总共4g/L葡萄糖的M9基本培养基(6.78g/LNa2HPO4、3.0g/LKH2PO4、0.5g/LNaCl、1.0g/LNH4Cl、1mMMgSO4、0.1mMCaCl2)中培育4种平行培养物：
1.80mol％未标记，20mol％统一13C
2.10mol％未标记，90mol％统一13C
3.90mol％1-13C，10mol％统一13C
4.40mol％1-13C，60mol％统一13C
以一式两份培育平行未标记的培养物，从中频繁提取样本来评估生长速率、葡萄糖摄取速率以及产物形成速率。在指数生长末期，收获标记的培养物，分离蛋白质并水解为氨基酸，以及如先前所述，通过气相色谱分析-质谱分析法(GCMS)分析氨基酸的标记分发(Fischer和Sauer,Eur.J.Biochem.270:880-891(2003))。此外，如WO2008115840中所述，通过GCMS分析来自该标记的培养物的肉汤中分泌的4HB和BDO的标记分发。这些数据共同用来利用已建立的方法计算细胞内通量分布(Suthers等人,Metab.Eng.9:387-405(2007))。所得的中心代谢通量和关联的95％置信区间如图46所示。数值是归一化为1mmol/hr葡萄糖摄取速率的摩尔通量。该结果表明，碳通量的路径是按氧化方向通过柠檬酸合酶，以及表明，大部分碳进入BDO途径而非完成TCA循环。进一步地，这证实，由于这种菌株中mdh的删除，在苹果酸和草酰乙酸之间基本没有任何通量。
将敲除菌株(如利用OptKnock设计的菌株)用于BDO生产的优势(见WO2009/023493和美国公布2009/0047719)可以通过比较ECKh-422与原始菌株ECKh-138的典型发酵曲线观察得到，其中BDO经由还原TCA循环产自琥珀酸(见图47)。利用补充有20g/L葡萄糖的M9基本培养基，在2LBiostatB+生物反应器(Sartorius；CedexFrance)中用1L初始培养物体积执行发酵。将温度控制在37℃，以及利用2MNH4OH或者Na2CO3将pH控制在7.0。好氧培育细胞至OD600约为10，届时用0.2mMIPTG诱导培养物。诱导后1小时，空气流速降低到微好氧的条件下每分钟0.02标准升。将搅动速率设定在700rpm。提供浓缩葡萄糖以保持器皿中的葡萄糖浓度在0.5和10g/L之间。如上文实施例中，用带有完整BDO途径的质粒转换所述两种菌株。在ECKh-138中，乙酸、丙酮酸以及4HB在发酵中占主要成分，而对于ECKh-422，BDO是主要产物。
实施例XVI
表达磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶的BDO菌株
该实施例描述利用磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶(PEPCK)来提高BDO的产量。将流感嗜血杆菌PEPCK基因用于异源性表达。
据计算，证实从草酰乙酸到磷酸烯醇丙酮酸的生成ATP的转化需要达到1,4-丁二醇的最大理论收率(还见WO2008/115840、WO2009/023493、美国公布2009/0047719、美国公布2009/0075351)。假设厌氧条件下以及假设在外部电子受体(如硝酸或者氧)存在下，PEPCK活性的缺乏显示使BDO的最大理论收率分别降低了12％和3％。
在生物(如大肠杆菌)中，PEPCK按从草酰乙酸到磷酸烯醇丙酮酸的葡萄糖异生和ATP消耗的方向起作用。已作假设，大肠杆菌的PEPCK动力学限制阻止其有效地催化从PEP到草酰乙酸的形成。PEP羧化酶(PPC)(其不生成ATP但是为高效生长所需)自然地被大肠杆菌利用以从磷酸烯醇丙酮酸形成草酰乙酸。因此，对三种非原生的PEPCK酶(表26)进行他们对葡萄糖基本培养基中大肠杆菌的PPC突变体菌株的生长的互补能力的检测。
表26.磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶序列的源.
PEPCK源菌株 登记号，GenBank参考序列
流感嗜血杆菌 NC_000907.1
琥珀酸放线杆菌 YP_001343536.1
产琥珀酸曼氏杆菌 YP_089485.1
生长互补研究涉及从Keio株集获得的Δppc突变体大肠杆菌JW3978中候选基因的基于质粒的表达(Baba等人,MolecularSystemsBiology2:2006.0008(2006))。在表达载体pZA23(中拷贝)和pZE13(高拷贝)中在PA1lacO-1启动子后克隆所述基因。这些质粒已有先前的描述(Lutz和Bujard,NucleicAcidsRes.25:1203-1210(1997))，以及它们在表达BDO途径基因中的用途已在WO2008115840有先前的描述。
在具有4g/L葡萄糖的M9基本培养基中好氧培养预培养物。所有的预培养物都补充有天冬氨酸(2mM)以为Δppc突变体提供用于生成TCA循环中间体的源而不依赖于PEPCK表达。M9基本培养基也用于具有4g/L葡萄糖的检测条件中，但是不添加天冬氨酸以及添加IPTG到0.5mM。表27显示了生长互补研究的结果。
表27.当表达自载体pZA23或者pZE13时来自流感嗜血杆菌、琥珀酸放线杆菌和产琥珀酸曼氏杆菌的PEPCK与Δppc突变体的互补.
PEPCK源菌株 载体 时间(h) OD600
流感嗜血杆菌 pZA23BB 40 0.950
Δppc对照 pZA23BB 40 0.038
琥珀酸放线杆菌 pZA23BB 40 0.055
产琥珀酸曼氏杆菌 pZA23BB 40 0.214
琥珀酸放线杆菌 pZE13BB 40 0.041
产琥珀酸曼氏杆菌 pZE13BB 40 0.024
Δppc对照 pZE13BB 40 0.042
发现，在基于质粒的筛选中检测的基因中，流感嗜血杆菌PEPCK最能互补Δppc突变体大肠杆菌中的生长。然后用上文讨论的pRE118-V2，利用SacB反向选择方法将这种基因整合入野生型大肠杆菌(MG1655)的PPC位点(Gay等人,J.Bacteriol.153:1424-1431(1983))。整合了PEPCK，保留了大肠杆菌原生PPC启动子，但是利用了非原生PEPCK终止子。用流感嗜血杆菌pepck替换ppc之后该区域的序列如图48所示。下划线部分是pepck编码区域。
将用于适应性进化的技术应用于改善大肠杆菌突变体(Δppc::流感嗜血杆菌pepCK)的生长速率。在厌氧环境中，将具有4g/L葡萄糖和50mM碳酸氢钠的M9基本培养基用于培养和进化这种菌株。用高碳酸氢钠浓度促使PEPCK反应达到平衡以形成草酰乙酸。为维持指数生长，每当实现0.5的OD600时便稀释培养物2倍。3周适应性进化约100代之后，厌氧生长速率从约8h改善为野生类型的约2h。进化之后，分离个体菌落，以及比较厌氧瓶中的生长情况与初始突变体和野生型菌株的生长情况(见图49)。采用了具有4g/L葡萄糖和50mM碳酸氢钠的M9培养基。
然后重复上文所述的ppc/pepck基因替换程序，这次利用产BDO的菌株ECKh-432(ΔadhEΔldhAΔpflBΔlpdA::肺炎克雷伯菌lpdA322ΔmdhΔarcAgltAR163LΔackAfimD::大肠杆菌sucCD、牙龈卟啉单胞菌sucD、牙龈卟啉单胞菌4hbdfimD:：牛结核分支杆菌sucA、克鲁佛氏梭菌4hbd)和ECKh-439作为宿主。这些菌株包含上文讨论的TCA循环增强以及染色体中整合的上游途径。ECKh-439是ECKh-432的删除了ackA基因的一种衍生物，其编码乙酸激酶。利用上文所述的sacB反向选择方法执行这种删除。
在发酵中运行了ECKh-439的Δppc::流感嗜血杆菌pepCK衍生物，称为ECKh-453。下游BDO途径由包含牙龈卟啉单胞菌Cat2和拜氏梭菌Ald的pZS*13提供。利用补充有20g/L葡萄糖和50mMNaHCO3的M9基本培养基，在2LBiostatB+生物反应器(Sartorius)中用1L初始培养物体积执行发酵。将温度控制在37℃，以及利用2MNH4OH或者Na2CO3将pH控制在7.0。好氧培育细胞至OD600约为2，届时用0.2mMIPTG诱导培养物。诱导后1小时，空气流速降低到微好氧的条件下每分钟0.01标准升。将搅动速率设定在700rpm。随着培养物密度增加，通气速率逐渐提高。提供浓缩葡萄糖溶液以保持器皿中的葡萄糖浓度在0.5和10g/L之间。产物曲线如图50所示。观察到的状态图(其中以大约1比1的摩尔比率生产BDO和乙酸)与WO2009/023493中针对设计#439(ADHEr,ASPT,LDH_D,MDH,PFLi)所做的预测高度类似。当通过天冬氨酸解氨酶的天然通量较低时，认为靶向ASPT反应的删除是不必要的。
OptKnock菌株的一个主要特征是相关代谢产物的产生一般地与生长相耦合，以及进一步地是，生产应该发生于指数生长期间以及稳定期。通过在微好氧的瓶培育以及在指数期期间频繁取样来评估ECKh-432和ECKh-453的生长耦合潜在性。采用了包含4g/L葡萄糖和10mMNaHCO3(对于ECKh-432)或者50mMNaHCO3(对于ECKh-453)的M9培养基，以及接种包括0.2mMIPTG。将18G针用于ECKh-432的微好氧培育，而为ECKh-453检测18G和27G两种针。针越细产生的通气越少。如图51所示，ECKh-432直到已经消耗了5g/L葡萄糖时才开始生产BDO，对应于稳定期的开始。整个实验过程中，ECKh-453生产BDO较均匀。此外，随着培养物通气的减少，生长耦合得以改善。
实施例XVII
编码基因的BDO途径在特定整合位点的整合
该实施例描述各种BDO途径基因整合入fimD位点以提供更高效的表达和稳定性。
已在fimD位点将产生4HB的整个上游BDO途径整合入大肠杆菌染色体。利用λred同源重组方法将该上游途径的琥珀酸支路整合入大肠杆菌染色体(Datsenko和Wanner,Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:6640-6645(2000))。受体大肠杆菌菌株是ECKh-422(ΔadhEΔldhAΔpflBΔlpdA::肺炎克雷伯菌lpdA322ΔmdhΔarcAgltAR163L)。将包含启动子、sucCD基因、sucD基因和4hbd基因以及终止子序列的多顺反子DNA片段插入pKD3质粒的AflIII位点。利用如下的引物扩增操纵子连同来自该质粒的氯霉素标记。下划线的序列与插入靶位点同源。
5’-GTTTGCACGCTATAGCTGAGGTTGTTGTCTTCCAGCAACGTACCGTATACAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTC-3’(SEQIDNO:)
5’-GCTACAGCATGTCACACGATCTCAACGGTCGGATGACCAATCTGGCTGGTATGGGAATTAGCCATGGTCC-3’(SEQIDNO:)
DpnI处理和DNA电泳之后，将纯化的PCR产物用于转换含有质粒pKD46的大肠杆菌菌株。在包含氯霉素的平板上选定候选菌株。纯化候选菌株的基因组DNA。通过DNA测序扩增和确认插入序列。通过翻转酶从染色体去除氯霉素抗性标记。插入和标记去除之后该区域的核苷酸序列如图52所示。
通过同源重组将该上游途径的α-酮戊二酸支路整合入染色体。这种修饰中所用的质粒衍生自如实施例XIV中引用的包含卡那霉素抗性基因、编码果聚糖蔗糖酶(sacB)的基因和R6K条件复制ori的载体pRE118-V2。整合质粒还包含具有启动子的多顺反子序列、sucA基因、克鲁佛氏梭菌4hbd基因以及插入两种与插入靶位点的两侧区域同源的1.5-kbDNA片段之间的终止子。所得的质粒被用来转换大肠杆菌菌株。在包含卡那霉素的平板上选定整合候选菌株。通过PCR验证正确的整合位点。为了分解(resolve)来自染色体的抗生素标记，选定细胞以在包含蔗糖的培养基上进行培育。通过PCR和DNA测序验证最终菌株。插入和标记去除之后该染色体区域的核苷酸序列如图53所示。
用含有下游途径基因的质粒转换所得的上游途径整合菌株ECKh-432。该构架能够在基本培养基中从葡萄糖生产BDO(见图54)。
实施例XVIII
非磷酸转移酶蔗糖摄取系统在减少丙酮酸副产物形成中的用途
该实施例描述利用非磷酸转移酶(PTS)蔗糖摄取系统以减少在蔗糖到BDO的转化中作为副产物的丙酮酸。
设计用于通过磷酸转移酶(PTS)系统利用蔗糖的菌株产生显著量的副产物丙酮酸。因此，非PTS蔗糖系统的用途可用于降低丙酮酸的形成，因为磷酸烯醇丙酮酸(PEP)到丙酮酸的转化不会完成蔗糖的输入。这将增加PEP池以及通过PPC或者PEPCK到草酰乙酸的通量。
将非PTS蔗糖操纵子插入rrnC区域。为了生成包含两侧是与该rrnC区域同源的区域的非PTS蔗糖基因的PCR产物，利用两种寡聚物来PCR扩增来自Mach1TM(加利福尼亚州卡尔斯巴的Invitrogen)的csc基因。这种菌株是W菌株的后代，所述W菌株是一种已知能够分解代谢蔗糖的大肠杆菌菌株(Orencio-Trejo等人,BiotechnologyBiofuels1:8(2008))。该序列衍生自大肠杆菌W菌株KO11(登记号AY314757)(Shukla等人,Biotechnol.Lett.26:689-693(2004))以及包括编码蔗糖通透酶(cscB)、D-果糖激酶(cscK)、蔗糖水解酶(cscA)以及LacI相关的蔗糖特异性抑制子(cscR)的基因。通过AS引物的放置有效地去除cscR的前53个氨基酸。寡聚物的序列是：rrnC23SdelS–CSC5’- CGAAATATGGCGTGACTCGATA C-3'(SEQIDNO:)和rrnC23SdelAS–CSC5’- TAAGATGCGCGCTCAAGGAC-3’(SEQIDNO:)。下划线区域表示与csc操纵子的同源性，以及粗体序列表示rrnC区域上游和下游的序列同源性。完整PCR产物的序列如图55所示。
纯化之后，将PCR产物进行电穿孔，使其进入已用pRedET(tet)转换以及根据生产者的指示制备的MG1655电转感受态细胞(www.genebridges.com/gb/pdf/K001％20Q％20E％20BAC％20Modification％20Kit-version2.6-2007-screen.pdf)。设计PCR产物，使得其整合入染色体rrnC区域的基因组。其有效地删除了rrlC(23SrRNA)上游的191核苷酸、所有的rrlCrRN基因和rrlC下游的3核苷酸以及替换以蔗糖操纵子，如图56所示。
在具有0.4％蔗糖的M9基本盐培养基上培育转化体以及通过诊断PCR对个体菌落进行蔗糖操纵子存在检测。通过P1转导将整个rrnC::crcAKB区域转移入BDO宿主菌株ECKh-432(Sambrook等人,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第三版,ColdSpringHarborLaboratory,NewYork(2001))，产生ECKh-463(ΔadhEΔldhAΔpflBΔlpdA::肺炎克雷伯菌lpdA322ΔmdhΔarcAgltAR163LfimD::大肠杆菌sucCD、牙龈卟啉单胞菌sucD、牙龈卟啉单胞菌4hbdfimD:：牛结核分支杆菌sucA、克鲁佛氏梭菌4hbdrrnC::cscAKB)。通过在蔗糖上培育选择重组体以及通过诊断PCR进行验证。
用包含牙龈卟啉单胞菌Cat2和拜氏梭菌Ald的pZS*13转换ECKh-463，以提供完整的BDO途径。在补充有10g/L蔗糖的M9基本培养基(6.78g/LNa2HPO4、3.0g/LKH2PO4、0.5g/LNaCl、1.0g/LNH4Cl、1mMMgSO4、0.1mMCaCl2)中培养细胞。从一开始，培养物中便存在0.2mMIPTG。利用带有23G针的瓶维持厌氧条件。作为对照，在相同的培养基(除了具有10g/L葡萄糖而非蔗糖这点不同)上培养包含相同质粒的ECKh-432。图57显示48小时生长之后归一化为培养OD600的平均产物浓度。数据针对每种菌株的6种复制培养物。这证实了蔗糖上ECKh-463的BDO产量类似于蔗糖上亲株的BDO产量。
实施例XIX
产BDO的菌株小结
该实施例描述各种产BDO的菌株。
表28总结了上文实施例XII-XVIII中披露的各种产BDO的菌株。
表28.各种产BDO的菌株小结
表28中总结的菌株如下：菌株1：删除内源性ldhA的大肠杆菌MG1655的单一删除衍生物；大肠杆菌sucCD、牙龈卟啉单胞菌sucD、牙龈卟啉单胞菌4hbd、牙龈卟啉单胞菌Cat2、丙酮丁醇梭菌AdhE2的质粒表达。菌株2：宿主菌株AB3，琥珀酸生产菌株，大肠杆菌MG1655的衍生物，删除了内源性adhEldhApflB；大肠杆菌sucCD、牙龈卟啉单胞菌sucD、牙龈卟啉单胞菌4hbd、牙龈卟啉单胞菌Cat2、丙酮丁醇梭菌AdhE2的质粒表达。
菌株3：宿主菌株ECKh-138，删除了内源性adhE、ldhA、pflB，删除了内源性lpdA以及在lpdA位点用Glu354Lys突变进行肺炎克雷伯菌lpdA的染色体插入；大肠杆菌sucCD、牙龈卟啉单胞菌sucD、牙龈卟啉单胞菌4hbd、牙龈卟啉单胞菌Cat2、丙酮丁醇梭菌AdhE2的质粒表达；菌株提供lpdA的改善以增加丙酮酸脱氢酶通量。菌株4：宿主菌株ECKh-138，删除内源性adhE、ldhA、pflB以及lpdA，用Glu354Lys突变进行肺炎克雷伯菌lpdA的染色体插入；大肠杆菌sucCD、牙龈卟啉单胞菌sucD、牙龈卟啉单胞菌4hbd、丙酮丁醇梭菌buk1、丙酮丁醇梭菌ptb、丙酮丁醇梭菌AdhE2的质粒表达。
菌株5：宿主菌株ECKh-401，删除了内源性adhE、ldhA、pflB，删除了内源性lpdA以及在lpdA位点用Glu354Lys突变进行肺炎克雷伯菌lpdA的染色体插入，删除了内源性mdh和arcA；大肠杆菌sucCD、牙龈卟啉单胞菌sucD、牙龈卟啉单胞菌4hbd、牙龈卟啉单胞菌Cat2、丙酮丁醇梭菌AdhE2的质粒表达；菌株在mdh和arcA中有删除以引导通量通过氧化TCA循环。菌株6：宿主菌株ECKh-401，删除了内源性adhE、ldhA、pflB，删除了内源性lpdA以及在lpdA位点用Glu354Lys突变进行肺炎克雷伯菌lpdA的染色体插入，删除了内源性mdh和arcA；牛结核分支杆菌sucA、大肠杆菌sucCD、牙龈卟啉单胞菌sucD、牙龈卟啉单胞菌4hbd、牙龈卟啉单胞菌Cat2、丙酮丁醇梭菌AdhE2的质粒表达。
菌株7：宿主菌株ECKh-422，删除了内源性adhE、ldhA、pflB，删除了内源性lpdA以及在lpdA位点用Glu354Lys突变进行肺炎克雷伯菌lpdA的染色体插入，删除了内源性mdh和arcA，用gltAArg163Leu突变体进行gltA染色体替换；大肠杆菌sucCD、牙龈卟啉单胞菌sucD、牙龈卟啉单胞菌4hbd、牙龈卟啉单胞菌Cat2、丙酮丁醇梭菌AdhE2的质粒表达；菌株在柠檬酸合酶具有突变以改善厌氧活性。菌株8：菌株ECKh-422，删除了内源性adhE、ldhA、pflB，删除了内源性lpdA以及在lpdA位点用Glu354Lys突变进行肺炎克雷伯菌lpdA的染色体插入，删除了内源性mdh和arcA，用gltAArg163Leu突变体进行gltA染色体替换；牛结核分支杆菌sucA、大肠杆菌sucCD、牙龈卟啉单胞菌sucD、牙龈卟啉单胞菌4hbd、牙龈卟啉单胞菌Cat2、丙酮丁醇梭菌AdhE2的质粒表达。菌株9：宿主菌株ECKh-422，删除了内源性adhE、ldhA、pflB，删除了内源性lpdA以及在lpdA位点用Glu354Lys突变进行肺炎克雷伯菌lpdA的染色体插入，删除了内源性mdh和arcA，用gltAArg163Leu突变体进行gltA染色体替换；牛结核分支杆菌sucA、大肠杆菌sucCD、牙龈卟啉单胞菌sucD、牙龈卟啉单胞菌4hbd、牙龈卟啉单胞菌Cat2、拜氏梭菌Ald的质粒表达。
菌株10：宿主菌株ECKh-426，删除了内源性adhE、ldhA、pflB，删除了内源性lpdA以及在lpdA位点用Glu354Lys突变进行肺炎克雷伯菌lpdA的染色体插入，删除了内源性mdh和arcA，用gltAArg163Leu突变体进行gltA染色体替换，在大肠杆菌sucCD、牙龈卟啉单胞菌sucD、牙龈卟啉单胞菌4hbd的fimD位点进行染色体插入；牙龈卟啉单胞菌Cat2、拜氏梭菌Ald的质粒表达；菌株具有在该fimD位点整合入菌株ECKh-422的上游途径琥珀酸支路。菌株11：宿主菌株ECKh-432，删除了内源性adhE、ldhA、pflB，删除了内源性lpdA以及在lpdA位点用Glu354Lys突变进行肺炎克雷伯菌lpdA的染色体插入，删除了内源性mdh和arcA，用gltAArg163Leu突变体进行gltA染色体替换，在大肠杆菌sucCD、牙龈卟啉单胞菌sucD、牙龈卟啉单胞菌4hbd的fimD位点进行染色体插入，在牛结核分支杆菌sucA、克鲁佛氏梭菌4hbd的fimD位点进行染色体插入；牙龈卟啉单胞菌Cat2、拜氏梭菌Ald的质粒表达；菌株具有整合入ECKh-422的琥珀酸和α-酮戊二酸上游途径支路。菌株12：宿主菌株ECKh-432，删除了内源性adhE、ldhA、pflB，删除了内源性lpdA以及在lpdA位点用Glu354Lys突变进行肺炎克雷伯菌lpdA的染色体插入，删除了内源性mdh和arcA，用gltAArg163Leu突变体进行gltA染色体替换，在大肠杆菌sucCD、牙龈卟啉单胞菌sucD、牙龈卟啉单胞菌4hbd的fimD位点进行染色体插入，在牛结核分支杆菌sucA、克鲁佛氏梭菌4hbd的fimD位点进行染色体插入；丙酮丁醇梭菌buk1、丙酮丁醇梭菌ptb、拜氏梭菌Ald的质粒表达。
菌株13：宿主菌株ECKh-439，删除了内源性adhE、ldhA、pflB，删除了内源性lpdA以及在lpdA位点用Glu354Lys突变进行肺炎克雷伯菌lpdA的染色体插入，删除了内源性mdh和arcA，用gltAArg163Leu突变体进行gltA染色体替换，删除了内源性ackA、在大肠杆菌sucCD、牙龈卟啉单胞菌sucD、牙龈卟啉单胞菌4hbd的fimD位点进行染色体插入，在牛结核分支杆菌sucA、克鲁佛氏梭菌4hbd的fimD位点进行染色体插入；牙龈卟啉单胞菌Cat2、拜氏梭菌Ald的质粒表达；菌株具有菌株ECKh-432中的乙酸激酶删除。菌株14：宿主菌株ECKh-453，删除了内源性adhE、ldhA、pflB，删除了内源性lpdA以及在lpdA位点用Glu354Lys突变进行肺炎克雷伯菌lpdA的染色体插入，删除了内源性mdh和arcA，用gltAArg163Leu突变体进行gltA染色体替换，删除了内源性ackA，删除了内源性ppc以及在ppc位点插入流感嗜血杆菌ppck，在大肠杆菌sucCD、牙龈卟啉单胞菌sucD、牙龈卟啉单胞菌4hbd的fimD位点进行染色体插入，在牛结核分支杆菌sucA、克鲁佛氏梭菌4hbd的fimD位点进行染色体插入；牙龈卟啉单胞菌Cat2、拜氏梭菌Ald的质粒表达；菌株具有菌株ECKh-432中的乙酸激酶删除和PPC/PEPCK替换。
菌株15：宿主菌株ECKh-456，删除了内源性adhE、ldhA、pflB，删除了内源性lpdA以及在lpdA位点用Glu354Lys突变进行肺炎克雷伯菌lpdA的染色体插入，删除了内源性mdh和arcA，用gltAArg163Leu突变体进行gltA染色体替换，在大肠杆菌sucCD、牙龈卟啉单胞菌sucD、牙龈卟啉单胞菌4hbd的fimD位点进行染色体插入，在牛结核分支杆菌sucA、克鲁佛氏梭菌4hbd的fimD位点进行染色体插入，用fnr结合位点、pflB-p6启动子和pflB的RBS替换lpdA启动子；牙龈卟啉单胞菌Cat2、拜氏梭菌Ald的质粒表达；菌株具有菌株ECKh-432中的厌氧启动子替换lpdA启动子。菌株16：宿主菌株ECKh-455，删除了内源性adhE、ldhA、pflB，删除了内源性lpdA以及在lpdA位点用Glu354Lys突变进行肺炎克雷伯菌lpdA的染色体插入，删除了内源性mdh和arcA，用gltAArg163Leu突变体进行gltA染色体替换，在大肠杆菌sucCD、牙龈卟啉单胞菌sucD、牙龈卟啉单胞菌4hbd的fimD位点进行染色体插入，在牛结核分支杆菌sucA、克鲁佛氏梭菌4hbdI的fimD位点进行染色体插入，用fnr结合位点、pflB-p6启动子和pflB的RBS替换pdhR和aceEF启动子；牙龈卟啉单胞菌Cat2、拜氏梭菌Ald的质粒表达；菌株具有ECKh-432中厌氧启动子替换pdhR和aceEF启动子。
菌株17：宿主菌株ECKh-459，删除了内源性adhE、ldhA、pflB，删除了内源性lpdA以及在lpdA位点用Glu354Lys突变进行肺炎克雷伯菌lpdA的染色体插入，删除了内源性mdh和arcA，用gltAArg163Leu突变体进行gltA染色体替换、在大肠杆菌sucCD、牙龈卟啉单胞菌sucD、牙龈卟啉单胞菌4hbd的fimD位点进行染色体插入，在牛结核分支杆菌sucA、克鲁佛氏梭菌4hbd的fimD位点进行染色体插入，在丙酮丁醇梭菌buk1、丙酮丁醇梭菌ptb的fimD位点进行染色体插入；拜氏梭菌Ald的质粒表达；菌株具有整合入菌株ECKh-432的BK/PTB。菌株18：宿主菌株ECKh-459，删除了内源性adhE、ldhA、pflB，删除了内源性lpdA以及在lpdA位点用Glu354Lys突变进行肺炎克雷伯菌lpdA的染色体插入，删除了内源性mdh和arcA，用gltAArg163Leu突变体进行gltA染色体替换，在大肠杆菌sucCD、牙龈卟啉单胞菌sucD、牙龈卟啉单胞菌4hbd的fimD位点进行染色体插入，在牛结核分支杆菌sucA、克鲁佛氏梭菌4hbd的fimD位点进行染色体插入，在丙酮丁醇梭菌buk1、丙酮丁醇梭菌ptb的fimD位点进行染色体插入；拜氏梭菌Ald、热葡糖苷酶地芽孢杆菌adh1的质粒表达。
菌株19：宿主菌株ECKh-463，删除了内源性adhE、ldhA、pflB，删除了内源性lpdA以及在lpdA位点用Glu354Lys突变进行肺炎克雷伯菌lpdA的染色体插入，删除了内源性mdh和arcA，用gltAArg163Leu突变体进行gltA染色体替换、在大肠杆菌sucCD、牙龈卟啉单胞菌sucD、牙龈卟啉单胞菌4hbd的fimD位点进行染色体插入，在牛结核分支杆菌sucA、克鲁佛氏梭菌4hbd的fimD位点进行染色体插入，在非PTS蔗糖操纵子基因蔗糖通透酶(cscB)、D-果糖激酶(cscK)、蔗糖水解酶(cscA)以及LacI相关的蔗糖特异性抑制子(cscR)的rrnC位点进行插入；牙龈卟啉单胞菌Cat2、拜氏梭菌Ald的质粒表达；菌株具有插入菌株ECKh-432的非PTS蔗糖基因。菌株20：宿主菌株ECKh-463，删除了内源性adhE、ldhA、pflB，删除了内源性lpdA以及在lpdA位点用Glu354Lys突变进行肺炎克雷伯菌lpdA的染色体插入，删除了内源性mdh和arcA，用gltAArg163Leu突变体进行gltA染色体替换，在大肠杆菌sucCD、牙龈卟啉单胞菌sucD、牙龈卟啉单胞菌4hbd的fimD位点进行染色体插入，在牛结核分支杆菌sucA、克鲁佛氏梭菌4hbd的fimD位点进行染色体插入，在非PTS蔗糖操纵子的rrnC位点进行插入；丙酮丁醇梭菌buk1、丙酮丁醇梭菌ptb、拜氏梭菌Ald的质粒表达。
除了本文披露的产BDO的菌株(包括表28披露的那些)之外，应理解，可以纳入进一步提高BDO产量和/或减少不需要的副产物的其他修饰。例如，产BDO的菌株或者表28菌株可以纳入其他的敲除，以进一步增加BDO产量或者减少不需要的副产物。示例性的敲除已经有先前描述(见美国公布2009/0047719)。这类敲除菌株包括但不仅限于ADHEr,NADH6；ADHEr,PPCK；ADHEr,SUCD4；ADHEr,ATPS4r；ADHEr,FUM；ADHEr,MDH；ADHEr,PFLi,PPCK；ADHEr,PFLi,SUCD4；ADHEr,ACKr,NADH6；ADHEr,NADH6,PFLi；ADHEr,ASPT,MDH；ADHEr,NADH6,PPCK；ADHEr,PPCK,THD2；ADHEr,ATPS4r,PPCK；ADHEr,MDH,THD2；ADHEr,FUM,PFLi；ADHEr,PPCK,SUCD4；ADHEr,GLCpts,PPCK；ADHEr,GLUDy,MDH；ADHEr,GLUDy,PPCK；ADHEr,FUM,PPCK；ADHEr,MDH,PPCK；ADHEr,FUM,GLUDy；ADHEr,FUM,HEX1；ADHEr,HEX1,PFLi；ADHEr,HEX1,THD2；ADHEr,FRD2,LDH_D,MDH；ADHEr,FRD2,LDH_D,ME2；ADHEr,MDH,PGL,THD2；ADHEr,G6PDHy,MDH,THD2；ADHEr,PFLi,PPCK,THD2；ADHEr,ACKr,AKGD,ATPS4r；ADHEr,GLCpts,PFLi,PPCK；ADHEr,ACKr,ATPS4r,SUCOAS；ADHEr,GLUDy,PFLi,PPCK；ADHEr,ME2,PFLi,SUCD4；ADHEr,GLUDy,PFLi,SUCD4；ADHEr,ATPS4r,LDH_D,SUCD4；ADHEr,FUM,HEX1,PFLi；ADHEr,MDH,NADH6,THD2；ADHEr,ATPS4r,MDH,NADH6；ADHEr,ATPS4r,FUM,NADH6；ADHEr,ASPT,MDH,NADH6；ADHEr,ASPT,MDH,THD2；ADHEr,ATPS4r,GLCpts,SUCD4；ADHEr,ATPS4r,GLUDy,MDH；ADHEr,ATPS4r,MDH,PPCK；ADHEr,ATPS4r,FUM,PPCK；ADHEr,ASPT,GLCpts,MDH；ADHEr,ASPT,GLUDy,MDH；ADHEr,ME2,SUCD4,THD2；ADHEr,FUM,PPCK,THD2；ADHEr,MDH,PPCK,THD2；ADHEr,GLUDy,MDH,THD2；ADHEr,HEX1,PFLi,THD2；ADHEr,ATPS4r,G6PDHy,MDH；ADHEr,ATPS4r,MDH,PGL；ADHEr,ACKr,FRD2,LDH_D；ADHEr,ACKr,LDH_D,SUCD4；ADHEr,ATPS4r,FUM,GLUDy；ADHEr,ATPS4r,FUM,HEX1；ADHEr,ATPS4r,MDH,THD2；ADHEr,ATPS4r,FRD2,LDH_D；ADHEr,ATPS4r,MDH,PGDH；ADHEr,GLCpts,PPCK,THD2；ADHEr,GLUDy,PPCK,THD2；ADHEr,FUM,HEX1,THD2；ADHEr,ATPS4r,ME2,THD2；ADHEr,FUM,ME2,THD2；ADHEr,GLCpts,GLUDy,PPCK；ADHEr,ME2,PGL,THD2；ADHEr,G6PDHy,ME2,THD2；ADHEr,ATPS4r,FRD2,LDH_D,ME2；ADHEr,ATPS4r,FRD2,LDH_D,MDH；ADHEr,ASPT,LDH_D,MDH,PFLi；ADHEr,ATPS4r,GLCpts,NADH6,PFLi；ADHEr,ATPS4r,MDH,NADH6,PGL；ADHEr,ATPS4r,G6PDHy,MDH,NADH6；ADHEr,ACKr,FUM,GLUDy,LDH_D；ADHEr,ACKr,GLUDy,LDH_D,SUCD4；ADHEr,ATPS4r,G6PDHy,MDH,THD2；ADHEr,ATPS4r,MDH,PGL,THD2；ADHEr,ASPT,G6PDHy,MDH,PYK；ADHEr,ASPT,MDH,PGL,PYK；ADHEr,ASPT,LDH_D,MDH,SUCOAS；ADHEr,ASPT,FUM,LDH_D,MDH；ADHEr,ASPT,LDH_D,MALS,MDH；ADHEr,ASPT,ICL,LDH_D,MDH；ADHEr,FRD2,GLUDy,LDH_D,PPCK；ADHEr,FRD2,LDH_D,PPCK,THD2；ADHEr,ACKr,ATPS4r,LDH_D,SUCD4；ADHEr,ACKr,ACS,PPC,PPCK；ADHEr,GLUDy,LDH_D,PPC,PPCK；ADHEr,LDH_D,PPC,PPCK,THD2；ADHEr,ASPT,ATPS4r,GLCpts,MDH；ADHEr,G6PDHy,MDH,NADH6,THD2；ADHEr,MDH,NADH6,PGL,THD2；ADHEr,ATPS4r,G6PDHy,GLCpts,MDH；ADHEr,ATPS4r,GLCpts,MDH,PGL；ADHEr,ACKr,LDH_D,MDH,SUCD4。
表29显示待从宿主生物如大肠杆菌敲除的相应基因的反应。表29中对应于缩写的相应的代谢产物如表30所示。
表29.待敲除以阻止具体的反应在大肠杆菌中发生的相应基因.
表30.对应于表29所用的缩写的代谢产物名称.
实施例XX
用于生产BDO的示例性途径
该实施例描述利用羧酸还原酶作为BDO途径酶来生产4-羟基丁醛(4-HBa)和/或BDO的示例性途径。
用于生产BDO的示例性途径包括利用NAD+或者NADP+芳基醛脱氢酶(E.C.：1.2.1.29和1.2.1.30)来将4-羟基丁酸盐转化为4-羟基丁醛以及利用醇脱氢酶来将4-羟基丁醛转化为1,4-丁二醇。4-羟基丁酸盐可以从三羧酸循环中间体琥珀酰-CoA和/或α-酮戊二酸衍生得到，如图58所示。
芳基醛脱氢酶(或者羧酸还原酶).可以在艾瓦诺卡氏菌中发现芳基醛脱氢酶或者对等地羧酸还原酶。羧酸还原酶催化从羧酸到其相应的醛的依赖镁,ATP和NADPH的还原反应(Venkitasubramanian等人,J.Biol.Chem.282:478-485(2007))以及能够催化从4-羟基丁酸盐到4-羟基丁醛的转化。这种由car编码的酶被克隆以及功能表达于大肠杆菌中(Venkitasubramanian等人,J.Biol.Chem.282:478-485(2007))。npt基因产物的表达经由转录后修饰改善了该酶的活性。npt基因编码将钝化脱辅基酶转化为活性全酶的特异性磷酸泛酰巯基乙胺转移酶(PPtase)。这种酶的天然底物是香草酸，以及该酶显示对芳香族和脂肪族底物的广泛接受性(Venkitasubramanian等人,inBiocatalysisinthePharmaceuticalandBiotechnologyIndustires,ed.R.N.Patel,Chapter15,pp.425-440,CRCPressLLC,BocaRaton,FL.(2006))。
基因名称 GI号 GenBank登记号 生物
car 40796035 AAR91681.1 艾瓦诺卡氏菌(sp.NRRL 5646)
npt 114848891 ABI83656.1 艾瓦诺卡氏菌(sp.NRRL 5646)
其他的car和npt基因可以基于序列同源性得到确认。
发现于灰色链霉菌的另一种候选酶由griC和griD基因编码。认为，这种酶将3-氨基-4-羟基苯甲酸转化为3-氨基-4-羟基苯甲醛，因为griC或者griD的删除导致细胞外3-乙酰基氨基-4-羟基苯甲酸(3-氨基-4-羟基苯甲酸代谢的一种分路产物)的累积(Suzuki,等人,J.Antibiot.60(6):380-387(2007))。griC和griD与SGR_665(一种在序列上类似于艾瓦诺卡氏菌npt的酶)的共表达会是有益处的。
基因名称 GI号 GenBank登记号 生物
griC 182438036 YP_001825755.1 灰色链霉菌亚种灰色NBRC 13350
griD 182438037 YP_001825756.1 灰色链霉菌亚种灰色NBRC 13350
一种具有类似特性的酶α-氨基己二酸还原酶(AAR,EC1.2.1.31)参与一些真菌物种中的赖氨酸生物合成途径。这种酶自然地将α-氨基己二酸还原为α-氨基己二酸半醛。首先通过依赖ATP的腺苷酸形成激活羧基基团，然后通过NAD(P)H还原所述腺苷酸以收获醛和AMP。如同CAR，这种酶利用镁并需要通过PPtase进行激活。用于AAR及其相应的PPtase的候选酶发现于酿酒酵母(Morris等人,Gene98:141-145(1991))、白色念珠菌(Guo等人,Mol.Genet.Genomics269:271-279(2003))以及人体酵母菌探针(Ford等人,Curr.Genet.28:131-137(1995))。来自人体酵母菌探针的AAR当表达于大肠杆菌中时显示出显著的活性(Guo等人,Yeast21:1279-1288(2004))。来自产黄青霉的AAR接受S-羧基甲基-L-半胱氨酸作为替代性底物，但是不与己二酸、L-谷氨酸或者二氨基庚二酸反应(Hijarrubia等人,J.Biol.Chem.278:8250-8256(2003))。迄今为止还未确认编码产黄青霉PPtase的基因。
基因名称 GI号 GenBank登记号 生物
LYS2 171867 AAA34747.1 酿酒酵母
LYS5 1708896 P50113.1 酿酒酵母
LYS2 2853226 AAC02241.1 白色念珠菌
LYS5 28136195 AAO26020.1 白色念珠菌
Lys1p 13124791 P40976.3 人体酵母菌探针
Lys7p 1723561 Q10474.1 人体酵母菌探针
Lys2 3282044 CAA74300.1 产黄青霉
将羧酸还原酶用于BDO生产有多种优势。经由羧酸还原酶从4-羟基丁酸盐形成4-羟基丁醛与经由酰基-CoA或者酰基-磷酸还原酶从激活形式的4-羟基丁酸盐(例如4-羟基丁酰-CoA、4-羟基丁酰-Pi)形成4-羟基丁醛比较至少有两种优势。首先，作为副产物形成的γ-丁内酯(GBL)大大减少。认为，激活形式的4-羟基丁酸盐比未激活的4-羟基丁酸盐更容易环化为GBL。羧酸还原酶的使用使得无需通过通过游离的激活4-羟基丁酸盐中间体，从而减少了伴随BDO生产作为副产物形成的GBL。其次，作为副产物形成的乙醇也大大减少。当使用醛形成或者醇形成4-羟基丁酰-CoA还原酶来将4-羟基丁酰-CoA分别转化为4-羟基丁醛或者1,4-丁二醇时，常常形成不等量的乙醇。这是因为大部分(若不是所有的)醛形成或者醇形成4-羟基丁酰-CoA还原酶除了4-羟基丁酰-CoA之外还可以接受乙酰基-CoA作为底物。例如，醛形成酶常常催化乙酰基-CoA到乙醛的转化，乙醛后续通过原生或非原生醇脱氢酶还原为乙醇。接受乙酰基-CoA作为底物的醇形成4-羟基丁酰-CoA还原酶将直接转化乙酰基-CoA到乙醇。看起来，羧酸还原酶对乙酰基-CoA的活性远低于醛形成或者醇形成酰基-CoA还原酶，因此它们应用于BDO生产导致的乙醇副产物形成最小(见以下)。
实施例XXI
利用羧酸还原酶的1,4-丁二醇的生物合成
该实施例描述利用羧酸还原酶生产1,4-丁二醇的微生物的生成。
将大肠杆菌用作目标生物以设计图58所示的用于1,4-丁二醇合成的途径。大肠杆菌提供良好的宿主用于生成能够生产1,4-丁二醇的非天然存在的微生物。大肠杆菌经得起基因操纵以及已知能够在各种氧化条件下有效地生产各种产物，像乙醇、乙酸、甲酸、乳酸以及琥珀酸。
4-羟基丁酸盐途径基因整合入染色体：ECKh-432的构建。在大肠杆菌指定的ECKh-432(其构架如实施例XVII中所述)菌株中表达羧酸还原酶。这种菌株包含BDO途径的组分，产生4HB，在fimD位点整合入大肠杆菌的染色体。
如实施例XVII中所述，利用λred同源重组方法将上游途径的琥珀酸支路整合入大肠杆菌染色体(Datsenko和Wanner,Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:6640-6645(2000))。将多顺反子DNA片段插入pKD3质粒的AflIII位点，所述片段包含启动子、大肠杆菌的编码琥珀酰-CoA连接酶的sucCD基因、牙龈红棕色单胞菌的编码琥珀酰-CoA还原酶(醛形成)的sucD基因(图58步骤A)、牙龈红棕色单胞菌的编码4-羟基丁酸脱氢酶的4hbd基因(图58步骤C)以及终止子序列。
如实施例XVII中所述，通过同源重组将上游途径的α-酮戊二酸支路整合入所述染色体。这种修饰所用的质粒是pRE118-V2(删除了oriT和IS序列的pRE118(ATCC87693))，其包含卡那霉素抗性基因、编码果聚糖蔗糖酶(sacB)的基因和R6K条件复制ori。整合质粒还包含具有启动子的多顺反子序列、来自牛结核分支杆菌编码α-酮戊二酸脱羧酶的sucA基因(图58步骤B)、编码4-羟基丁酸脱氢酶的克鲁佛氏梭菌4hbd基因(图58步骤C)以及插入两种与插入靶位点的两侧区域同源的1.5-kbDNA片段之间的终止子。所得的质粒被用来转换大肠杆菌菌株。在包含卡那霉素的平板上选定整合候选菌株。通过PCR验证正确的整合位点。为了分解来自染色体的抗生素标记，选定细胞以在包含蔗糖的培养基上进行培育。通过PCR和DNA测序验证最终菌株。
受体大肠杆菌菌株是ECKh-422(ΔadhEΔldhAΔpflBΔlpdA::K.p.lpdA322ΔmdhΔarcAgltAR163L)，其构架的描述见实施例XV。ECKh-422包含突变gltAR163L，导致由gltA编码的柠檬酸合酶的NADH不敏感性。它进一步包含来自肺炎克雷伯氏杆菌的如下文所述被整合入染色体的NADH不敏感形式lpd基因。
用来自肺炎克雷伯氏杆菌的NADH不敏感的lpdA替换原生lpdA，如实施例XIV中所述。所得的载体是指定的pRE118-V2(见图34)。
羧酸还原酶和PPtase的克隆和表达.为了生成设计以生产1,4-丁二醇的大肠杆菌菌株，利用熟知的分子生物技术在大肠杆菌中表达编码羧酸还原酶和磷酸泛酰巯基乙胺转移酶的核酸(见，例如，Sambrook，同上，2001；Ausubel同上,1999)。具体地，在PA1/lacO启动子下将car(AAR91681.1)和npt(ABI83656.1)基因克隆进入pZS*13载体(德国Ruelzheim的Expressys)。通过PCR从诺卡氏菌属基因组DNA克隆car基因(GNM_720)。其核酸和蛋白质序列分别如图59A和59B所示。
通过GeneArt(德国Regensburg)合成密码子优化形式npt基因(GNM_721)。其核酸和蛋白质序列分别如图60A和60B所示。从克隆GNM_720和GNM_721进入pZS*13所得的载体如图61所示。
将质粒转换进入ECKh-432以表达1,4-丁二醇生产所需的蛋白质和酶。还构建了仅包含GNM_720和GNM_721的替代性形式的质粒。
利用羧酸还原酶生产1,4-BDO的验证.利用大肠杆菌全细胞培养物验证1,4-丁二醇途径的功能表达。将用包含GNM_720和GNM_721两者的pZS*13质粒转换的大肠杆菌ECKh-432的单菌落接种进入包含适当抗生素的5mLLB培养基。类似地，将用包含GNM_720或者GNM_721的pZS*13质粒转换的大肠杆菌ECKh-432的单菌落接种进入包含适当抗生素的其他5mL等分试样的LB培养基。通过用1％第一培养物接种包含适当抗生素的新鲜的体内转化基本培养基(见下文)开始10mL微好氧培养。
该体内转化基本培养基(达1000mL)的配方如下：
通过在接种后起初用氮冲洗加盖厌氧瓶5min，然后用18G针刺穿垫片建立微好氧的条件。在培育期间将该针保持在该瓶中，以允许少量的空气进入该瓶中。当培养物达到对数生长中期时，用0.2mMIPTG诱导蛋白质表达。认为时间＝0hr。如上文以及WO2008115840中所述，对培养上清液进行BDO、4HB和其他副产物的分析(见表31)。
表31.各种菌株中BDO、4-HB和其他产物的生产.
PA＝丙酮酸、SA＝琥珀酸、LA＝乳酸、4HB＝4-羟基丁酸盐、BDO＝1,4-丁二醇、GBL＝γ-丁内酯、Etoh＝乙醇、LLOQ＝定量下限
这些结果证实，羧酸还原酶基因GNM_720为ECKh-432中BDO形成所需以及当与PPtaseGNM_721共表达时，其有效性得以提高。在表达GNM_720本身或者表达GNM_720连同GNM_721的菌株中，生产的GBL和乙醇的量要远少于BDO。
采用羧酸还原酶通向BDO的其他途径.预期，羧酸还原酶可以用作从TCA循环代谢产物：琥珀酸、琥珀酰-CoA以及α-酮戊二酸到1,4-丁二醇的许多途径的组分。图62披露了多个这类途径。假设葡萄糖作为碳源，所有的路径都可以产生大于或者等于1mol/mol的理论BDO收率。可以从许多其他路径中包括蔗糖、木糖、阿拉伯糖、合成气体的另外底物获得类似高的理论收率。预期，倘若存在足够的内源性醇脱氢酶活性以催化图62的步骤C和E，羧酸还原酶单独或者结合PPtase的表达(即，催化图62步骤F和D)足以从琥珀酸生产1,4-丁二醇。用于图62步骤A到Z的候选酶如XXIII节所述。
实施例XXII
采用羧酸还原酶通向腐胺的途径
该实施例描述利用羧酸还原酶的示例性腐胺途径。腐胺(也称为1,4-二氨基丁烷或者丁烷二胺)是式NH2(CH2)4NH2的有机化合物。它可以与己二酸反应以收获聚酰胺尼龙-4,6，其由DSM(荷兰海尔伦)以商标名StanylTM进行销售。腐胺通过例如，在活体和死亡生物中的氨基酸的自然断裂得以自然地产生。已对大肠杆菌进行设计，以通过过表达原生鸟氨酸生物合成机构以及鸟氨酸脱羧酶来生产腐胺(Qian,等人,Biotechnol.Bioeng.104(4):651-662(2009))。
图63描述了许多其他的生物合成途径，所述途径导致从琥珀酸、琥珀酰-CoA或者α-酮戊二酸到腐胺的生产以及采用羧酸还原酶。注意，这些途径无一需要形成激活形式的4-氨基丁酸(如4-氨基丁酰-CoA)，其可以通过酰基-CoA还原酶还原为4-氨基丁醛，而且还可以容易地环化为内酰胺、2-吡咯烷酮(Ohsugi,等人,J.Biol.Chem.256:7642-7651(1981))。假设葡萄糖作为碳源，所有的路径都可以产生大于或者等于1mol/mol的理论腐胺收率。可以从许多其他路径中包括蔗糖、木糖、阿拉伯糖、合成气体的另外底物获得类似高的理论收率。用于图63步骤A到U的候选酶如实施例XXIII所述。
实施例XXIII
用于生产C4化合物的示例性酶
该实施例描述用于生产C4化合物(如1,4-丁二醇、4-羟基丁醛和腐胺的示例性酶。
酶类别.图58、62和63描述的所有的转换都落入表32所示的转换的一般类别。该实施例描述了每种类别中许多生物化学表征的基因。专门列出了当克隆和表达时可以应用于催化图58、62和63中适当的转换的基因。每种标签的前三个数字对应酶委员会编号的前三个数字(其指明不依赖于底物特异性的一般转换类型)。
表32.图58、62和63描述的酶转换类别.
标签 功能
1.1.1.a 氧化还原酶(氧到醇)
1.1.1.c 氧化还原酶(2步，酰基-CoA到醇)
1.2.1.b 氧化还原酶(酰基-CoA到醛)
1.2.1.c 氧化还原酶(2-氧代酸到酰基-CoA，脱羧)
1.2.1.d 氧化还原酶(膦酸酯还原酶)
1.2.1.e 酸还原酶
1.4.1.a 氧化还原酶(氨基化)
2.3.1.a 酰基转移酶(转移磷酸基团到CoA)
2.6.1.a 氨基转移酶
2.7.2.a 磷酸转移酶(羧基受体)
2.8.3.a CoA转移酶
3.1.2.a CoA水解酶
4.1.1.a 羧基裂解酶
6.2.1.a CoA合成酶
1.1.1.a氧化还原酶(氧到醇)
醛到醇.图58、62和63所述的三种转换涉及从醛到醇的转化。这些转换是4-羟基丁酸脱氢酶(图58和62步骤C)、1,4-丁二醇脱氢酶(图58和62步骤E)以及5-羟基-2-戊酸(图62步骤Y)。编码催化醛到醇转化的酶(即醇脱氢酶或者对等地，醛还原酶)的示例性基因包括编码C2-C14的中链醇脱氢酶的alrA(Tani等人.Appl.Environ.Microbiol.66:5231-5235(2000))、来自酿酒酵母的ADH2(Atsumi等人.Nature451:86-89(2008))、来自大肠杆菌偏向长于C(3)的分子的yqhD(Sulzenbacher等人.J.Mol.Biol.342:489-502(2004))以及来自丙酮丁醇梭菌将丁醛转化为丁醇的bdhI和bdhII(Walter等人.J.Bacteriol.174:7149-7158(1992))。利用如下的GenBank登记号可以找到这些示例性的基因产物的每个的蛋白质序列：
基因 登记号 GI号 生物
alrA BAB12273.1 9967138 不动杆菌菌株M-1
ADH2 NP_014032.1 6323961 酿酒酵母
yqhD NP_417484.1 16130909 大肠杆菌
bdh I NP_349892.1 15896543 丙酮丁醇梭菌
bdh II NP_349891.1 15896542 丙酮丁醇梭菌
显示4-羟基丁酸脱氢酶活性的酶(EC1.1.1.61)也属于这一类别。这类酶已经表征于富养罗尔斯通氏菌(Bravo等人.J.ForensicSci.,49:379-387(2004))、克鲁弗氏梭菌(Wolff等人.ProteinExpr.Purif.,6:206-212(1995))和拟南芥(Breitkreuz等人.J.Biol.Chem.,278:41552-41556(2003))。
基因 登记号 GI号 生物
4hbd YP_726053.1 113867564 富养罗尔斯通氏菌H16
4hbd EDK35022.1 146348486 克鲁佛氏梭菌DSM 555
4hbd Q94B07 75249805 拟南芥
据显示，来自热葡糖苷酶地芽孢杆菌M10EXG的adh1基因(Jeon等人,J.Biotechnol.135:127-133(2008))对4-羟基丁醛和丁醛均显示出高活性(见上文)。因此，这种酶显示出1,4-丁二醇脱氢酶活性。
基因 登记号 GI号 生物
adh1 AAR91477.1 40795502 热葡糖苷酶地芽孢杆菌M10EXG
另一示例性的酶是对3-羟基异丁酸到甲基丙二酸半醛的可逆氧化进行催化的3-羟基异丁酸脱氢酶。这种酶参与缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的降解并且已经发现于细菌、真核生物以及哺乳动物中。由来自嗜热栖热菌HB8的P84067编码的酶已经有结构表征(Lokanath等人.J.Mol.Biol.,352:905-917(2005))。人3-羟基异丁酸脱氢酶的可逆性通过利用同位素标记的底物得到了证明(Manning等人,BiochemJ.，231:481-484(1985))。编码这种酶的其他的基因包括智人(Hawes等人.MethodsEnzymol,324:218-228(2000))和穴兔(Chowdhury等人.Biosci.BiotechnolBiochem.,60:2043-2047(1996)；Hawes等人.MethodsEnzymol.324:218-228(2000))中的3hidh、绿脓假单胞菌中的mmsb以及恶臭假单胞菌(Aberhart等人.JChem.Soc.[Perkin1]6:1404-1406(1979)；Chowdhury等人.Biosci.BiotechnolBiochem.67:438-441(2003)；Chowdhury等人.Biosci.BiotechnolBiochem.60:2043-2047(1996))中的dhat。
基因 登记号 GI号 生物142 -->
P84067 P84067 75345323 嗜热栖热菌
mmsb P28811.1 127211 绿脓假单胞菌
dhat Q59477.1 2842618 恶臭假单胞菌
3hidh P31937.2 12643395 智人
3hidh P32185.1 416872 穴兔
若干3-羟基异丁酸脱氢酶也已经显示转化丙二酸半醛到3-羟基丙酸(3-HP)。显示这种活性的三种候选基因是来自绿脓假单胞菌PAO1(62)的mmsB、来自恶臭假单胞菌KT2440(Liao等人,美国公布2005/0221466)的mmsB和来自恶臭假单胞菌E23(Chowdhury等人,Biosci.Biotechnol.Biochem.60:2043-2047(1996))的mmsB。也已经确认粪产碱菌M3A中具有3-羟基丁酸脱氢酶活性的酶(Gokam等人,美国专利号7,393,676；Liao等人,美国公布号2005/0221466)。通过序列相似性可以推断出来自其他生物(包括类球红细菌)的其他候选基因。
基因 登记号 GI号 生物
mmsB AAA25892.1 151363 绿脓假单胞菌
mmsB NP_252259.1 15598765 绿脓假单胞菌PAO1
mmsB NP_746775.1 26991350 恶臭假单胞菌KT2440
mmsB JC7926 60729613 恶臭假单胞菌E23
orfB1 AAL26884 16588720 类球红细菌
丙二酸半醛到3-HP的转化还可以通过两种其他的酶完成：NADH-依赖的3-羟基丙酸脱氢酶和NADPH-依赖的丙二酸半醛还原酶。认为，NADH-依赖的3-羟基丙酸脱氢酶参与细菌和植物中从丙酸到β-丙氨酸的生物合成途径(Rathinasabapathi,B.JournalofPlantPathology159:671-674(2002)；Stadtman,E.R.J.Am.Chem.Soc.77:5765-5766(1955))。迄今为止，这种酶仍未与任何生物中的基因有所关联。NADPH-依赖的丙二酸半醛还原酶催化固定CO2的自养细菌中的逆反应。虽然已在勤奋生金球菌中检测到该酶的活性，但是基因的身份尚未可知(Alber等人.J.Bacteriol.188:8551-8559(2006))。
1.1.1.c氧化还原酶(2步，酰基-CoA到醇).
图62的步骤S和W描述可以分别形成4-羟基丁酸盐和1,4-丁二醇的双功能还原酶。转化酰基-CoA到醇的示例性2步氧化还原酶包括那些转换底物的酶，如转换乙酰基-CoA到乙醇(例如，来自大肠杆菌的adhE(Kessler等人FEBS.Lett.281:59-63(1991))以及转换丁酰-CoA到丁醇(例如，来自丙酮丁醇梭菌的adhE2(Fontaine等人.J.Bacteriol.184:821-830(2002))。丙酮丁醇梭菌adhE2基因显示转化4-羟基丁酰-CoA到1,4-丁二醇(见上文)。除了还原乙酰基-CoA到乙醇之外，由肠膜明串珠菌中的adhE编码的酶也已显示将支链化合物异丁醛氧化为异丁酰-CoA(Kazahaya等人.J.,Gen.Appl.Microbiol.18:43-55(1972)；Koo等人.BiotechnolLett.27:505-510(2005))。
基因 登记号 GI号 生物
adhE NP_415757.1 16129202 大肠杆菌
adhE2 AAK09379.1 12958626 丙酮丁醇梭菌143 -->
adhE AAV66076.1 55818563 肠膜明串珠菌
另一示例性的酶可以将丙二酰基-CoA转化为3-HP。具有这种活性的NADPH-依赖的酶已经表征在橙色绿屈挠菌中，其中它参与3-羟基丙酸循环(Hugler等人,J.Bacteriol.184:2404-2410(2002)；Strauss和Fuchs,Eur.J.Biochem.215:633-643(1993))。这种酶(具有300kDa的量)具有高底物特异性并显示与其他已知的氧化还原酶几乎没有序列相似性(Hugler等人,J.Bacteriol.184:2404-2410(2002))。在其他生物中没有显示为催化这一特异性反应的酶；然而存在其他生物可以具有相似途径的生物信息证据(Klatt等人,Environ.Microbiol.,9:2067-2078(2007))。可以通过序列相似性推断在其他生物(包括Roseiflexuscastenholzii、赤细菌NAP1和海洋γ-蛋白质菌HTCC2080)中的候选酶。
基因 登记号 GI号 生物
mcr AAS20429.1 42561982 橙色绿屈挠菌
Rcas_2929 YP_001433009.1 156742880 Roseiflexus castenholzii
NAP1_02720 ZP_01039179.1 85708113 赤细菌NAP1
MGP2080_00535 ZP_01626393.1 119504313 海洋γ蛋白质菌HTCC2080
较长链的酰基-CoA分子可以通过酶被还原，如编码醇-形成脂肪酰基-CoA还原酶的荷荷巴(加州希蒙得木)FAR。其在大肠杆菌中的过表达导致FAR活性和脂肪醇的累积(Metz等人,PlantPhysiology,122:635-644(2000))。
基因 登记号 GI号 生物
FAR AAD38039.1 5020215 加州希蒙得木
1.2.1.b氧化还原酶(酰基-CoA到醛).
图58、62和63的步骤A涉及通过醛形成琥珀酰-CoA还原酶从琥珀酰-CoA到琥珀酸半醛的转化。图62的步骤Q描述通过醛-形成4-羟基丁酰-CoA还原酶从4-羟基丁酰-CoA到4-羟基丁醛的转化。若干酰基-CoA脱氢酶能够将酰基-CoA还原为其相应的醛。编码这类酶的示例性基因包括编码脂肪酰基-CoA还原酶的乙酸钙不动杆菌acr1(Reiser和Somerville,J.Bacteriol.179:2969-2975(1997))、编码脂肪酰基-CoA还原酶的嗜精不动杆菌M-1(Ishige等人,Appl.Environ.Microbiol.,68:1192-1195(2002))和克鲁弗氏梭菌中编码CoA-和NADP-依赖的琥珀酸半醛脱氢酶的sucD基因(Sohling和Gottschalk,J.Bacteriol.178:871-80(1996)；Sohling和Gottschalk,J.Bacteriol.178:871-880(1996))。牙龈卟啉单胞菌的sucD是另一种醛-形成琥珀酰-CoA还原酶(Takahashi等人,J.Bacteriol.182:4704-4710(2000))。假单胞菌中由bphG编码的酶酰化型乙醛脱氢酶仍然是另一种被证明对乙醛、丙醛、丁醛、异丁醛和甲醛氧化和酰化的酶(Powlowski等人,J.Bacteriol.175:377-385(1993))。除了还原乙酰基-CoA到乙醇，肠膜明串珠菌中由adhE编码的该酶已显示氧化支链化合物异丁醛到异丁酰-CoA(Koo等人,Biotechnol.Lett.27:505-510(2005))。丁醛脱氢酶催化生溶剂性生物(solventogenicorganism)，如糖乙酸多丁醇梭菌(Kosaka等人,Biosci.Biotechnol.Biochem.71:58-68(2007))中的类似反应，丁酰-CoA到丁醛的转化。
基因 登记号 GI号 生物
acr1 YP_047869.1 50086359 乙酸钙不动杆菌
acr1 AAC45217 1684886 贝氏不动杆菌
acr1 BAB85476.1 18857901 不动杆菌菌株M-1
sucD P38947.1 730847 克鲁佛氏梭菌
sucD NP_904963.1 34540484 牙龈红棕色单胞菌
bphG BAA03892.1 425213 假单胞菌
adhE AAV66076.1 55818563 肠膜明串珠菌
bld AAP42563.1 31075383 糖乙酸多丁醇梭菌
其他的将酰基-CoA转化为其相应的醛的酶型是将丙二酰基-CoA转化为丙二酸半醛的丙二酰基-CoA还原酶。丙二酰基-CoA还原酶是在嗜热酸古生细菌中通过3-羟基丙酸循环的自养碳固定中的关键酶(Berg等人Science318:1782-1786(2007)；Thauer,R.K.Science318:1732-1733(2007))。所述酶利用NADPH作为辅因子并已经表征在生金球菌和硫化叶菌菌种中(Alber等人J.Bacteriol.188:8551-8559(2006)；Berg等人Science318:1782-1786(2007))。来自硫化叶菌tokodaii的编码丙二酰基-CoA还原酶的基因被克隆并异源表达在大肠杆菌中(Alber等人J.Bacteriol.188:8551-8559(2006))。虽然这些酶的醛脱氢酶功能性与来自橙色绿屈挠菌的双功能脱氢酶相似，但是几乎没有序列相似性。两种丙二酰基-CoA还原酶具有相对于天冬氨酸半醛脱氢酶(一种催化天冬氨酰基-4-磷酸到天冬氨酸半醛的还原和同时发生的脱磷酸作用)的高度序列相似性。其他的基因可以通过蛋白质序列同源性发现于其他的生物，包括硫磺矿硫化叶菌和嗜酸热硫化叶菌。用于CoA-酰基化醛脱氢酶的仍然另一候选是来自拜氏梭菌的ald基因(Toth等人,Appl.Environ.Microbiol.65:4973-4980(1999))。已有报告称，这种酶将乙酰基-CoA和丁酰-CoA还原为它们相应的醛。这种基因非常类似于编码鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌的乙醛脱氢酶的eutE(Toth等人,Appl.Environ.Microbiol.65:4973-4980(1999))。
基因 登记号 GI号 生物
Msed_0709 YP_001190808.1 146303492 勤奋生金球菌
mcr NP_378167.1 15922498 硫化叶菌tokodaii
asd-2 NP_343563.1 15898958 硫磺矿硫化叶菌
Saci_2370 YP_256941.1 70608071 嗜酸热硫化叶菌
Ald AAT66436 49473535 拜氏梭菌
eutE AAA80209 687645 鼠伤寒沙门氏菌
eutE P77445 2498347 大肠杆菌
1.2.1.c-氧化还原酶(2-氧代酸到酰基-CoA，脱羧)
图62的步骤AA描述了5-羟基-2-氧代戊酸到4-羟基丁酰-CoA的转化。用于这种转换的酶包括1)支链2-酮酸脱氢酶、2)α-酮戊二酸脱氢酶以及3)丙酮酸脱氢酶多酶复合物(PDHC)。这些酶是催化导致2-酮酸酰基化氧化脱羧的一系列部分反应的多酶复合物。2-酮酸脱氢酶复合物的每种都在中间代谢中占据关键位置，以及酶活性通常经过紧密调节(Fries等人Biochemistry42:6996-7002(2003))。所述酶具有由如下三种催化组分的多个拷贝组成的复合但是常见的结构：α-酮酸脱羧酶(E1)、二氢硫辛酰胺酰基转移酶(E2)和二氢硫辛酰胺脱氢酶(E3)。生物中所有的2-酮酸脱氢酶复合物均有E3组分，而该E1和E2组分则由不同的基因编码。酶组分在复合物中以大量的拷贝形式存在以及利用多个辅因子经由底物通道(substratechanneling)催化反应的定向序列。这些脱氢酶复合物的整体尺寸非常大，具有的分子量在4百万和1千万Da之间(即大于核糖体)。
在厌氧条件下，大肠杆菌中2-酮酸脱氢酶家族中的酶活性通常较低或者受限。NADH(或者NADPH)产量的提高会导致氧化还原剂失衡，以及NADH本身起酶功能抑制剂的作用。工程方面的努力已经使得大肠杆菌丙酮酸脱氢酶复合物的厌氧活性提高(Kim等人.Appl.Environ.Microbiol.73:1766-1771(2007)；Kim等人.J.Bacteriol.190:3851-3858)2008)；Zhou等人Biotechnol.Lett.30:335-342(2008))。例如，通过在E3组分中设计H322Y突变可以克服NADH的抑制作用(Kim等人J.Bacteriol.190:3851-3858(2008))。个体组分的结构研究以及它们在复合物中的工作机理使人洞察这种家族中酶的催化机理和架构(Aevarsson等人.Nat.Struct.Biol.6:785-792(1999)；Zhou等人.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:14802-14807(2001))。脱氢酶复合物的底物特异性因生物不同而不同，但是一般地，支链酮酸脱氢酶具有最广泛的底物范围。
α-酮戊二酸脱氢酶(AKGD)将α-酮戊二酸转化为琥珀酰-CoA以及是控制通过TCA循环的代谢通量的基本位点(Hansford,R.G.Curr.top.Bioenerg.10:217-278(1980))。由大肠杆菌中的基因sucA、sucB和lpd编码，AKGD基因表达在厌氧条件下以及在葡萄糖上培养期间下调(Park等人.Mol.Microbiol.15:473-482(1995))。虽然AKGD的底物范围较窄，但是对E2组分催化核心的结构研究精准地定位了导致底物特异性的具体残基(Knapp等人.J.Mol.Biol.280:655-668(1998))。由odhAB(E1和E2)和pdhD(E3，共有域)编码的枯草芽孢杆菌AKGD以转录水平进行调节以及依赖于生物的碳源和生长期(Resnekov等人.Mol.Gen.Genet.234:285-296(1992))。在酵母中，通过葡萄糖以转录水平调节编码E3组分的LPD1基因(Roy和DawesJ.Gen.Microbiol.133:925-933(1987))。由KGD1编码的E1组分也通过葡萄糖进行调节以及通过产物HAP2和HAP3激活(Repetto和TzagoloffMol.CellBiol.9:2695-2705(1989))。受产物NADH和琥珀酰-CoA抑制的AKGD酶复合物在哺乳动物系统中得到了很好的研究，因为其功能缺欠已与多种神经疾病相关联(Tretter和dam-ViziPhilos.Trans.R.Soc.LondBBiol.Sci.360:2335-2345(2005))。
基因 登记号 GI号 生物
sucA NP_415254.1 16128701 大肠杆菌菌株K12亚株MG1655
sucB NP_415255.1 16128702 大肠杆菌菌株K12亚株MG1655
lpd NP_414658.1 16128109 大肠杆菌菌株K12亚株MG1655
odhA P23129.2 51704265 枯草芽孢杆菌
odhB P16263.1 129041 枯草芽孢杆菌
pdhD P21880.1 118672 枯草芽孢杆菌
KGD1 NP_012141.1 6322066 酿酒酵母
KGD2 NP_010432.1 6320352 酿酒酵母146 -->
LPD1 NP_116635.1 14318501 酿酒酵母
支链2-酮酸脱氢酶复合物(BCKAD)(也称为2-氧代异戊酸脱氢酶)参与支链氨基酸降解途径，将缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的2-酮酸衍生物转化为它们的酰基-CoA衍生物和CO2。已在许多生物中对该复合物进行研究，所述生物包括枯草芽孢杆菌(Wang等人.Eur.J.Biochem.213:1091-1099(1993))、褐鼠(Namba等人.J.Biol.Chem.244:4437-4447(1969))和恶臭假单胞菌(SokatchJ.Bacteriol.148:647-652(1981))。在枯草芽孢杆菌中，该酶由基因pdhD(E3组分)、bfmBB(E2组分)、bfmBAA和bfmBAB(E1组分)编码(Wang等人.Eur.J.Biochem.213:1091-1099(1993))。在哺乳动物中，通过特异性磷酸酶和蛋白质激酶磷酸化对该复合物进行调节。已在大鼠干细胞中对该复合物进行了研究(Chicco等人.J.Biol.Chem.269:19427-19434(1994))以及该复合物由基因Bckdha(E1α)、Bckdhb(E1β)、Dbt(E2)和Dld(E3)编码。恶臭假单胞菌BCKAD复合物的E1和E3组分已经被结晶化(Aevarsson等人.Nat.Struct.Biol.6:785-792(1999)；MatteviScience255:1544-1550(1992))以及已对该酶复合物进行研究(Sokatch等人.J.Bacteriol.148:647-652(1981))。通过bkdR的基因产物激活恶臭假单胞菌BCKAD基因的转录(Hester等人.Eur.J.Biochem.233:828-836(1995))。在一些生物(包括褐鼠(Paxton等人.Biochem.J.234:295-303(1986))和酿酒酵母(Sinclair等人.Biochem.Mol.Biol.Int.31:911-922(1993))中，这种复合物已显示出具有广泛的底物范围，所述范围除了支链氨基酸前体之外还包括直链氧代酸(如2-氧代丁酸和α-酮戊二酸)。对牛BCKAD的活性位点进行设计，以支持替代性的底物乙酰基-CoA(Meng和Chuang,Biochemistry33:12879-12885(1994))。
基因 登记号 GI号 生物
bfmBB NP_390283.1 16079459 枯草芽孢杆菌
bfmBAA NP_390285.1 16079461 枯草芽孢杆菌
bfmBAB NP_390284.1 16079460 枯草芽孢杆菌
pdhD P21880.1 118672 枯草芽孢杆菌
lpdV P09063.1 118677 恶臭假单胞菌
bkdB P09062.1 129044 恶臭假单胞菌
bkdA1 NP_746515.1 26991090 恶臭假单胞菌
bkdA2 NP_746516.1 26991091 恶臭假单胞菌
Bckdha NP_036914.1 77736548 褐鼠
Bckdhb NP_062140.1 158749538 褐鼠
Dbt NP_445764.1 158749632 褐鼠
Dld NP_955417.1 40786469 褐鼠
已经对催化从丙酮酸到乙酰基-CoA的转化的丙酮酸脱氢酶复合物进行了广泛研究。在大肠杆菌酶中，E1组分中的特定残基对底物特异性负责(Bisswanger,H.JBiolChem.256:815-822(1981)；Bremer,J.Eur.JBiochem.8:535-540(1969)；Gong等人.JBiolChem.275:13645-13653(2000))。如前文所述，酶工程方面的努力已经改善了厌氧条件下的大肠杆菌PDH酶活性(Kim等人.Appl.Environ.Microbiol.73:1766-1771(2007)；KimJ.Bacteriol.190:3851-3858(2008)；Zhou等人.Biotechnol.Lett.30:335-342(2008))。与大肠杆菌PDH相反，枯草芽孢杆菌复合物具有活性以及需要在厌氧条件下培育(NakanoJ.Bacteriol.179:6749-6755(1997))。在甘油上培育期间被表征的肺炎克雷伯菌PDH在厌氧条件下也具有活性(Menzel等人.J.Biotechnol.56:135-142(1997))。来自牛肾脏的所述酶复合物的晶体结构(Zhou等人.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:14802-14807(2001))以及来自维涅兰德固氮菌的E2催化区是可得的(Mattevi等人.Science255:1544-1550(1992))。一些哺乳动物PDH酶复合物可以反作用于替代性的底物，如2-氧代丁酸，尽管褐鼠PDH和BCKAD的比较动力学表明，BCKAD对作为底物的2-氧代丁酸具有更高的活性(Paxton等人.Biochem.J.234:295-303(1986))。
基因 登记号 GI号 生物
aceE NP_414656.1 16128107 大肠杆菌菌株K12亚株MG1655
aceF NP_414657.1 16128108 大肠杆菌菌株K12亚株MG1655
lpd NP_414658.1 16128109 大肠杆菌菌株K12亚株MG1655
pdhA P21881.1 3123238 枯草芽孢杆菌
pdhB P21882.1 129068 枯草芽孢杆菌
pdhC P21883.2 129054 枯草芽孢杆菌
pdhD P21880.1 118672 枯草芽孢杆菌
aceE YP_001333808.1 152968699 肺炎克雷伯氏杆菌MGH78578
aceF YP_001333809.1 152968700 肺炎克雷伯氏杆菌MGH78578
lpdA YP_001333810.1 152968701 肺炎克雷伯氏杆菌MGH78578
Pdha1 NP_001004072.2 124430510 褐鼠
Pdha2 NP_446446.1 16758900 褐鼠
Dlat NP_112287.1 78365255 褐鼠
Dld NP_955417.1 40786469 褐鼠
作为上文所述的大型多酶2-酮酸脱氢酶复合物的替代性选择，一些厌氧生物利用2-酮酸氧化还原酶家族(OFOR)中的酶催化2-酮酸的酰基化氧化脱羧。与脱氢酶复合物不同，这些酶包含铁硫簇，利用不同的辅因子以及利用铁氧还蛋白或者黄素氧还蛋白代替NAD(P)H作为电子受体。虽然这种家族中的大部分酶对作为底物(POR)的丙酮酸具有特异性，一些2-酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶已经显示接受一大批2-酮酸作为底物，包括α-酮戊二酸和2-氧代丁酸(Fukuda和WakagiBiochim.Biophys.Acta1597:74-80(2002)；Zhang等人.J.Biochem.120:587-599(1996))。一种这类酶是来自嗜酸热古菌硫化叶菌tokodaii7的OFOR，其包含基因ST2300编码的α和β亚基(Fukuda和WakagiBiochim.Biophys.Acta1597:74-80(2002)；Zhang等人.J.Biochem.120:587-599(1996))。已开发了基于质粒的表达系统用于高效表达大肠杆菌中的这种蛋白质(Fukuda等人.Eur.J.Biochem.268:5639-5646(2001))以及确定了涉及底物特异性的残基(Fukuda和WakagiBiochim.Biophys.Acta1597:74-80(2002))。最近来自嗜热泉生古细菌菌株K1的两种OFOR也已被克隆入大肠杆菌、表征以及发现与一大批2-氧代酸反应(Nishizawa等人.FEBSLett.579:2319-2322(2005))。这些候选OFOR的基因序列是可得的，尽管它们迄今为止尚未指定GenBank标识符。具有类似的酶存在于所有的古菌、一些厌氧细菌和线粒体真核生物中的生物信息证据(Fukuda和WakagiBiochim.Biophys.Acta1597:74-80(2005))。从能源观点来看，这种类别的酶也是有趣的，因为还原的铁氧还蛋白可以用来通过铁氧还蛋白-NAD还原酶生成NADH(Petitdemange等人.Biochim.Biophys.Acta421:334-337(1976))。此外，由于大部分所述酶设计以在厌氧条件下起作用，厌氧环境中的活性相对于2-酮酸脱氢酶复合物家族中的酶可能需要较少的酶工程。
基因 登记号 GI号 生物
ST2300 NP_378302.1 15922633 硫化叶菌tokodaii 7
1.2.1.d-氧化还原酶(膦酸酯还原酶)
4-羟基丁酰-磷酸到4-羟基丁醛的转化可以通过EC类别1.2.1的氧化还原酶来催。天冬氨酸半醛脱氢酶(ASD，EC1.2.1.11)催化4-天冬氨酰基磷酸到天冬氨酸-4-半醛的NADPH-依赖的还原反应。ASD参与氨基酸生物合成以及最近已被作为抗菌目标进行研究(Hadfield等人,Biochemistry40:14475-14483(2001)。大肠杆菌ASD结构已得到解析(Hadfield等人,.J.Mol.Biol.289:991-1002(1999))以及该酶已显示接受替代性的底物β-3-甲基天冬氨酰基磷酸(Shames等人,J.Biol.Chem.259:15331-15339(1984))。流感嗜血杆菌酶已成为酶工程研究中的主题，以改变活性位点上底物亲合力(Blanco等人,ActaCrystallogr.D.Biol.Crystallogr.60:1388-1395(2004)；Blanco等人,ActaCrystallogr.D.Biol.Crystallogr.60:1808-1815(2004))。其他ASD候选酶发现于结核分枝杆菌(Shafiani等人,J.Appl.Microbiol.98:832-838(2005)、詹氏甲烷球菌(Faehnle等人,.J.Mol.Biol.353:1055-1068(2005))以及传染性微生物霍乱弧菌和幽门螺杆菌(Moore等人,ProteinExpr.Purif.25:189-194(2002))中。一种相关的候选酶是乙酰基谷氨酰基磷酸还原酶(EC1.2.1.38)，这是一种发现于酿酒酵母(Pauwels等人,Eur.J.Biochem.270:1014-1024(2003)、枯草芽孢杆菌(O'Reilly和Devine,Microbiology140(Pt5):1023-1025(1994))和其他生物中的自然地还原乙酰基谷氨酰基磷酸到乙酰基谷氨酸-5-半醛的酶。
基因 登记号 GI号 生物
asd NP_417891.1 16131307 大肠杆菌
asd YP_248335.1 68249223 流感嗜血杆菌
asd AAB49996 1899206 结核分枝杆菌
VC2036 NP_231670 15642038 霍乱弧菌
asd YP_002301787.1 210135348 幽门螺杆菌
ARG5,6 NP_010992.1 6320913 酿酒酵母
argC NP_389001.1 16078184 枯草芽孢杆菌
这种类别的其他示例性酶包括将甘油醛-3-磷酸转化为D-甘油酸1,3-二磷酸的甘油醛3-磷酸脱氢酶(例如，大肠杆菌gapA(Branlant和BranlantEur.J.Biochem.150:61-66(1985))、将N-乙酰基-L-谷氨酸-5-半醛转化为N-乙酰基-L-谷氨酰基-5-磷酸的N-乙酰基-γ-谷氨酰基-磷酸还原酶(例如，大肠杆菌argC(Parsot等人,基因68:275-283(1988))以及将L-谷氨酸-5-半醛转化为L-谷氨酰基-5-磷酸的谷氨酸-5-半醛脱氢酶(例如，大肠杆菌proA(Smith等人,J.Bacteriol.157:545-551(1984))。编码来自鼠伤寒沙门氏菌(Mahan和Csonka,J.Bacteriol.156:1249-1262(1983))和空肠弯曲杆菌(Louie和Chan,Mol.Gen.Genet.240:29-35(1993))的谷氨酸-5-半醛脱氢酶的基因被克隆并表达于大肠杆菌中。
基因 登记号 GI号 生物
gapA P0A9B2.2 71159358 大肠杆菌
argC NP_418393.1 16131796 大肠杆菌
proA NP_414778.1 16128229 大肠杆菌
proA NP_459319.1 16763704 鼠伤寒沙门氏菌
proA P53000.2 9087222 空肠弯曲杆菌
1.2.1.e酸还原酶.
图58、62和63中的多个步骤描述通过酸还原酶从未激活的酸到醛的转化。这些包括分别从4-羟基丁酸盐、琥珀酸、α-酮戊二酸以及4-氨基丁酸到4-羟基丁醛,琥珀酸半醛、2,5-二氧代戊酸以及4-氨基丁醛的转化。一类显著的羧酸还原酶可以发现在艾瓦诺卡氏菌中，其催化从羧酸到其相应的醛的依赖镁,ATP和NADPH的还原反应(Venkitasubramanian等人,J.Biol.Chem.282:478-485(2007))。这种酶由car基因编码以及被克隆和功能表达于大肠杆菌中(Venkitasubramanian等人,J.Biol.Chem.282:478-485(2007))。npt基因产物的表达经由转录后修饰改善了该酶的活性。npt基因编码将钝化脱辅基酶转化为活性全酶的特异性磷酸泛酰巯基乙胺转移酶(PPtase)。这种酶的天然底物是香草酸，以及该酶显示对芳香族和脂肪族底物的广泛接受性(Venkitasubramanian等人,inBiocatalysisinthePharmaceuticalandBiotechnologyIndustires,ed.R.N.Patel,Chapter15,pp.425-440,CRCPressLLC,BocaRaton,FL.(2006))。
基因 登记号 GI号 生物
car AAR91681.1 40796035 艾瓦诺卡氏菌(sp.NRRL 5646)
npt ABI83656.1 114848891 艾瓦诺卡氏菌(sp.NRRL 5646)
其他的car和npt基因可以基于序列同源性得到确认。
基因 登记号 GI号 生物
fadD9 YP_978699.1 121638475 牛结核分支杆菌BCG
BCG_2812c YP_978898.1 121638674 牛结核分支杆菌BCG
nfa20150 YP_118225.1 54023983 皮疽诺卡氏菌IFM 10152
nfa40540 YP_120266.1 54026024 皮疽诺卡氏菌IFM 10152
SGR_6790 YP_001828302.1 182440583 灰色链霉菌亚种灰色NBRC 13350
SGR_665 YP_001822177.1 182434458 灰色链霉菌亚种灰色NBRC 13350
发现于灰色链霉菌的另一种候选酶由griC和griD基因编码。认为，这种酶将3-氨基-4-羟基苯甲酸转化为3-氨基-4-羟基苯甲醛，因为griC或者griD的删除导致细胞外3-乙酰基氨基-4-羟基苯甲酸(3-氨基-4-羟基苯甲酸代谢的一种分路产物)的累积(Suzuki,等人,J.Antibiot.60(6):380-387(2007))。griC和griD与SGR_665(一种在序列上类似于艾瓦诺卡氏菌npt的酶)的共表达会是有益处的。
基因 登记号 GI号 生物
griC 182438036 YP_001825755.1 灰色链霉菌亚种灰色NBRC 13350
griD 182438037 YP_001825756.1 灰色链霉菌亚种灰色NBRC 13350
MSMEG_2956 YP_887275.1 YP_887275.1 包皮垢分支杆菌MC2155
MSMEG_5739 YP_889972.1 118469671 包皮垢分支杆菌MC2155
MSMEG_2648 YP_886985.1 118471293 包皮垢分支杆菌MC2155
MAP1040c NP_959974.1 41407138 鸟型分枝杆菌亚种类结核K-10
MAP2899c NP_961833.1 41408997 鸟型分枝杆菌亚种类结核K-10
MMAR_2117 YP_001850422.1 183982131 海洋分支杆菌M
MMAR_2936 YP_001851230.1 183982939 海洋分支杆菌M
MMAR_1916 YP_001850220.1 183981929 海洋分支杆菌M
TpauDRAFT_33060 ZP_04027864.1 227980601 微代谢冢村氏菌DSM 20162
TpauDRAFT_20920 ZP_04026660.1 227979396 微代谢冢村氏菌DSM 20162
CPCC7001_1320 ZP_05045132.1 254431429 蓝菌属PCC7001
DDBDRAFT_0187729 XP_636931.1 66806417 盘基网柄菌AX4
一种具有类似特性的酶α-氨基己二酸还原酶(AAR,EC1.2.1.31)参与一些真菌物种中的赖氨酸生物合成途径。这种酶自然地将α-氨基己二酸还原为α-氨基己二酸半醛。首先通过依赖ATP的腺苷酸形成激活羧基基团，然后通过NAD(P)H还原所述腺苷酸以收获醛和AMP。如同CAR，这种酶利用镁并需要通过PPtase进行激活。用于AAR及其相应的PPtase的候选酶发现于酿酒酵母(Morris等人,Gene98:141-145(1991))、白色念珠菌(Guo等人,Mol.Genet.Genomics269:271-279(2003))以及人体酵母菌探针(Ford等人,Curr.Genet.28:131-137(1995))。来自人体酵母菌探针的AAR当表达于大肠杆菌中时显示出显著的活性(Guo等人,Yeast21:1279-1288(2004))。来自产黄青霉的AAR接受S-羧基甲基-L-半胱氨酸作为替代性底物，但是不与己二酸、L-谷氨酸或者二氨基庚二酸反应(Hijarrubia等人,J.Biol.Chem.278:8250-8256(2003))。迄今为止还未确认编码产黄青霉PPtase的基因。
1.4.1.a氧化还原酶(氨基化).
谷氨酸脱氢酶(图62和63步骤J)、4-氨基丁酸脱氢酶(图62和63步骤M)、腐胺脱氢酶(图63步骤D)、5-氨基-2-氧代戊酸脱氢酶(图63步骤P)、以及鸟氨酸脱氢酶(图63步骤S)可以通过使氧化还原酶氨基化进行催化。这种EC类别的酶催化将NAD+或者NADP+作为受体的α-氨基酸的氧化脱氨基化，以及所述反应通常是可逆的。作用于氨基酸的示例性的氧化还原酶包括由gdhA编码的谷氨酸脱氢酶(脱氨基)、由ldh编码的亮氨酸脱氢酶(脱氨基)以及由nadX编码的天冬氨酸脱氢酶(脱氨基)。来自大肠杆菌的gdhA基因产物(Korber等人,J.Mol.Biol.234:1270-1273(1993)；McPherson和Wootton,Nucleic.AcidsRes.11:5257-5266(1983))、来自海栖热袍菌的gdh(Kort等人,Extremophiles1:52-60(1997)；Lebbink,等人.J.Mol.Biol.280:287-296(1998))；Lebbink等人.J.Mol.Biol.289:357-369(1999))以及来自盐沼沙雷氏菌的gdhA1(Ingoldsby等人,Gene349:237-244(2005))催化谷氨酸到2-氧代戊二酸和氨的可逆的相互转化，同时分别支持NADP(H)、NAD(H)或者两者。蜡样芽胞杆菌的ldh基因编码具有宽底物范围(包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸以及2-氨基丁酸)的LeuDH蛋白质(Ansorge和KulaBiotechnolBioeng.68:557-562(2000)；Stoyan等人.J.Biotechnol54:77-80(1997))。NAD生物合成涉及来自海栖热袍菌用于编码天冬氨酸脱氢酶的nadX基因(Yang等人,J.Biol.Chem.278:8804-8808(2003))。
基因 登记号 GI号 生物
gdhA P00370 118547 大肠杆菌
gdh P96110.4 6226595 海栖热袍菌
gdhA1 NP_279651.1 15789827 盐沼沙雷氏菌
ldh P0A393 61222614 蜡样芽胞杆菌
nadX NP_229443.1 15644391 海栖热袍菌
其他谷氨酸脱氢候选酶基因发现于枯草芽孢杆菌(Khan等人,Biosci.Biotechnol.Biochem.69:1861-1870(2005))、烟草(Purnell等人,Planta222:167-180(2005))、水稻(Abiko等人,PlantCellPhysiol.46:1724-1734(2005))、地中海富盐菌(Diaz等人,Extremophiles10:105-115(2006))和极端嗜盐古菌(Halobactreiumsalinarum)(Hayden等人,FEMSMicrobiol.Lett.211:37-41(2002))。烟草酶由gdh1和gdh2编码的α和β亚基组成(Purnell等人,Planta222:167-180(2005))。发现，NADH-依赖的谷氨酸脱氢酶的过表达改善酿酒酵母的设计菌株中的乙醇产量(Roca等人,Appl.Environ.Microbiol.69:4732-4736(2003))。
基因 登记号 GI号 生物
rocG NP_391659.1 16080831 枯草芽孢杆菌
gdh1 AAR11534.1 38146335 烟草
gdh2 AAR11535.1 38146337 烟草
GDH Q852M0 75243660 水稻
GDH Q977U6 74499858 地中海富盐菌
GDH P29051 118549 极端嗜盐古菌152 -->
GDH2 NP_010066.1 6319986 酿酒酵母
用于催化醛到其相应的伯胺的转化的示例性酶是由lysDH基因编码的赖氨酸6-脱氢酶(EC1.4.1.18)。由lysDH基因编码的赖氨酸6-脱氢酶(脱氨基)催化L-赖氨酸的ε-氨基基团的氧化脱氨基化以形成2-氨基己二酸-6-半醛，其转而非酶环化以形成Δ1-哌啶-6-羧酸(Misono和Nagasaki,J.Bacteriol.150:398-401(1982))。来自嗜热脂肪土芽孢杆菌的lysDH基因编码嗜热NAD-依赖的赖氨酸6-脱氢酶(Heydari等人,Appl.Environ.Microbiol70:937-942(2004))。通过来自基因组计划的同系物对来自嗜热泉生古细菌K1的lysDH基因进行了确认。其他酶可发现于根癌农杆菌(Hashimo到等人,J.Biochem.106:76-80(1989)；Misono和Nagasaki,J.Bacteriol.150:398-401(1982))和反硝化无色杆菌(Ruldeekulthamrong等人,BMB.Rep.41:790-795(2008))。
基因 登记号 GI号 生物
lysDH BAB39707 13429872 嗜热脂肪土芽孢杆菌
lysDH NP_147035.1 14602185 嗜热泉生古细菌K1
lysDH NP_353966 15888285 根癌农杆菌
lysDH AAZ94428 74026644 反硝化无色杆菌
一种将3-氧代酸转化为3-氨基酸的酶是3,5-二氨基己酸脱氢酶(EC1.4.1.11)，一种发现于发酵赖氨酸的生物中的酶。最近在具核梭杆菌中确认了编码这种酶基因kdd(Kreimeyer等人,J.Biol.Chem.282:7191-7197(2007))。该酶已被纯化并表征于其他生物(Baker等人,J.Biol.Chem.247:7724-7734(1972)；Baker和vanderDrift,Biochemistry13:292-299(1974)),但是与这些酶关联的基因是未知的。可以通过序列同源性推断黄色粘球菌、牙龈红棕色单胞菌W83和其他测序的生物中的候选酶。
基因 登记号 GI号 生物
kdd AAL93966.1 19713113 具核梭杆菌
mxan_4391 ABF87267.1 108462082 黄色粘球菌
pg_1069 AAQ66183.1 34397119 牙龈红棕色单胞菌
2.3.1.a酰基转移酶(转移磷酸基团到CoA).
图62的步骤P描述4-羟基丁酰-CoA到4-羟基丁酰-Pi的转换。示例性转移磷酸的酰基转移酶包括由pta编码的磷酸转乙酰酶以及由ptb编码的磷酸丁酰转移酶。来自大肠杆菌的pta基因编码可以将乙酰基-CoA转化为乙酰基-磷酸以及进行相反转化的酶(Suzuki,Biochim.Biophys.Acta191:559-569(1969))。在该过程中，这种酶还可以利用丙酰基-CoA取代乙酰基-CoA形成丙酸(Hesslinger等人,Mol.Microbiol27:477-492(1998))。类似地，来自丙酮丁醇梭菌的ptb基因编码可以将丁酰-CoA转化为丁酰-磷酸的酶(Walter等人,Gene134:107-11(1993))；Huang等人,JMol.Microbiol.Biotechno.l2:33-38(2000))。其他ptb基因可以发现于产丁酸细菌L2-50(Louis等人,J.Bacteriol.186:2099-2106(2004))和巨大芽孢杆菌(Vazquez等人,Curr.Microbiol42:345-349(2001))。
基因 登记号 GI号 生物153 -->
pta NP_416800.1 16130232 大肠杆菌
ptb NP_349676 15896327 丙酮丁醇梭菌
ptb AAR19757.1 38425288 产丁酸盐的细菌L2-50
ptb CAC07932.1 10046659 巨大芽孢杆菌
2.6.1.a氨基转移酶.
氨基转移酶可逆地转化醛或酮到氨基基团。常见的氨基供体/受体组合包括谷氨酸/α-酮戊二酸、丙氨酸/丙酮酸以及天冬氨酸/草酰乙酸。多种酶已经显示转化醛到伯胺，如4-氨基丁酸、腐胺以及5-氨基-2-氧代戊酸，以及转化伯胺到醛。这些酶尤其很好地适合于执行如下转换：图62和63的步骤N、图63的步骤E和Q。赖氨酸-6-氨基转移酶(EC2.6.1.36)是一种能够形成伯胺的示例性酶。这种酶将赖氨酸转化为α-氨基己二酸半醛的功能已在酵母和细菌中得到证实。已经表征来自产朊假丝酵母菌(Hammer和Bode,J.BasicMicrobiol.32:21-27(1992))、泥色黄杆菌(Fujii等人,J.Biochem.128:391-397(2000))和带小棒链霉菌(Romero等人,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.18:241-246(1997))的候选酶。来自带小棒链霉菌的重组赖氨酸-6-氨基转移酶功能表达于大肠杆菌中(Tobin等人,J.Bacteriol.173:6223-6229(1991))。泥色黄杆菌酶对作为氨基受体的α-酮戊二酸具有特异性(Soda和Misono,Biochemistry7:4110-4119(1968))。转化醛到末端胺的其他酶包括鲍氏不动杆菌中编码2,4-二氨基丁酸:2-酮戊二酸4-转氨酶的dat基因产物(Ikai和Yamamoto,J.Bacteriol.179:5118-5125(1997))。除了其天然底物2,4-二氨基丁酸之外，DAT诱导赖氨酸、4-氨基丁酸和鸟氨酸的末端胺转氨。
基因 登记号 GI号 生物
lat BAB13756.1 10336502 泥色黄杆菌
lat AAA26777.1 153343 带小棒链霉菌
dat P56744.1 6685373 鲍氏不动杆菌
醛到末端胺的转化还可以通过γ-氨基丁酸转氨酶(GABA转氨酶或者4-氨基丁酸转氨酶)进行催化。这种酶自然地促进琥珀半醛和谷氨酸到4-氨基丁酸和α-酮戊二酸的相互转化以及已知具有广泛的底物范围(Liu等人,Biochemistry43:10896-109052004)；Schulz等人,Appl.Environ.Microbiol.56:1-6(1990))。大肠杆菌中的两种GABA转氨酶由gabT(Bartsch等人,J.Bacteriol.172:7035-7042(1990))和puuE(Kurihara等人,J.Biol.Chem.280:4602-4608.(2005))编码。小家鼠、荧光假单胞菌以及野猪中的GABA转氨酶已经显示与包括6-氨基己酸的众多替代性底物反应(Cooper,MethodsEnzymol.113:80-82(1985)；Scott和Jakoby,J.Biol.Chem.234:932-936(1959))。
基因 登记号 GI号 生物
gabT NP_417148.1 16130576 大肠杆菌
puuE NP_415818.1 16129263 大肠杆菌
abat NP_766549.2 37202121 小家鼠
gabT YP_257332.1 70733692 荧光假单胞菌
abat NP_999428.1 47523600 野猪
用于醛和伯胺相互转化的其他候选酶是腐胺转氨酶或者其他二胺氨基转移酶。大肠杆菌腐胺氨基转移酶由ygjG基因编码，以及纯化酶也能够诱导尸胺和亚精胺转氨(Samsonova等人,BMCMicrobiol.3:2(2003))。此外，已有报告称这种酶对1,7-二氨基庚烷有活性以及具有非2-氧代戊二酸的氨基受体(例如，丙酮酸、2-氧代丁酸)(Kim,J.Biol.Chem.239:783-786(1964)；Samsonova等人,BMCMicrobiol.3:2(2003))。把丙酮酸而非α-酮戊二酸作为氨基受体的具有较高活性的腐胺氨基转移酶是绿脓假单胞菌的spuC基因(Lu等人,J.Bacteriol.184:3765-3773(2002))。
基因 登记号 GI号 生物
ygjG NP_417544 145698310 大肠杆菌
spuC AAG03688 9946143 绿脓假单胞菌
诱导3-氧代酸转氨的酶包括GABA氨基转移酶(上文所述)、β-丙氨酸/α-酮戊二酸氨基转移酶和3-氨基-2-甲基丙酸氨基转移酶。β-丙氨酸/α-酮戊二酸氨基转移酶(WO08027742)与β-丙氨酸反应以形成丙二酸半醛，一种3-氧代酸。克鲁弗氏酵母中SkPYD4基因产物显示优选地把β-丙氨酸作为氨基团供体(Andersen和Hansen,Gene124:105-109(1993))。SkUGA1编码酿酒酵母GABA氨基转移酶的同系物UGA1(Ramos等人,Eur.J.Biochem.149:401-404(1985)),而SkPYD4编码β-丙氨酸和GABA转氨中均涉及的酶(Andersen和Hansen,Gene124:105-109(1993))。3-氨基-2-甲基丙酸转氨酶催化从甲基丙二酸半醛到3-氨基-2-甲基丙酸的转换。该酶已被表征于褐鼠和野猪以及由Abat编码(Kakimoto等人,Biochim.Biophys.Acta156:374-380(1968)；Tamaki等人,MethodsEnzymol.324:376-389(2000))。
基因 登记号 GI号 生物
SkyPYD4 ABF58893.1 98626772 克鲁佛氏酵母菌
SkUGA1 ABF58894.1 98626792 克鲁佛氏酵母菌
UGA1 NP_011533.1 6321456 酿酒酵母
Abat P50554.3 122065191 褐鼠
Abat P80147.2 120968 野猪
多种氨基转移酶诱导氨基酸的氨基团转氨以形成2-氧代酸。天冬氨酸氨基转移酶是一种自然地将氧代基团从草酰乙酸转移到谷氨酸，从而形成α-酮戊二酸和天冬氨酸的酶。天冬氨酸在结构上与OHED和2-AHD类似。通过，例如，来自大肠杆菌(Yagi等人,FEBSLett.100:81-84(1979)；Yagi等人,MethodsEnzymol.113:83-89(1985))的aspC、来自酿酒酵母(Yagi等人,J.Biochem.92:35-43(1982))的AAT2和来自拟南芥(delatorre等人,PlantJ.46:414-425(2006)；Kwok和Hanson.J.Exp.Bot.55:595-604(2004)；Wilkie和Warren,ProteinExpr.Purif.12:381-389(1998))的ASP5的基因产物催化天冬氨酸氨基转移酶活性。来自褐鼠的所述酶已显示诱导替代性底物如2-氨基己二酸和2,4-二氨基丁酸的转氨(Recasens等人,Biochemistry19:4583-4589(1980))。对其他氨基酸底物起作用的氨基转移酶还可以能够催化这种转换。缬氨酸氨基转移酶催化缬氨酸和丙酮酸到2-酮异戊酸和丙氨酸的转化。大肠杆菌基因avtA编码一种这类酶(Whalen和Berg,J.Bacteriol.150:739-746(1982))。这种基因产物还催化α-酮丁酸的促转氨以生成α-氨基丁酸，虽然这种反应中的胺供体还未得到确认(Whalen和Berg,J.Bacteriol.158:571-574(1984))。大肠杆菌serC的基因产物催化两种反应，磷酸丝氨酸氨基转移酶和磷酸羟基苏氨酸氨基转移酶(Lam和Winkler,J.Bacteriol.172:6518-6528(1990))，以及未能检测到非磷酸化底物上的活性(Drewke等人,FEBS.Lett.390:179-182(1996))。
基因 登记号 GI号 生物
aspC NP_415448.1 16128895 大肠杆菌
AAT2 P23542.3 1703040 酿酒酵母
ASP5 P46248.2 20532373 拟南芥
Got2 P00507 112987 褐鼠
avtA YP_026231.1 49176374 大肠杆菌
serC NP_415427.1 16128874 大肠杆菌
另一候选酶是α-氨基己二酸氨基转移酶(EC2.6.1.39)，一种参与某些生物中赖氨酸生物合成和降解的酶。这种酶利用α-酮戊二酸作为氨基受体催化2-氨基己二酸和2-氧代己二酸的相互转化。候选基因发现于智人(Okuno等人,EnzymeProtein47:136-148(1993))和嗜热栖热菌(Miyazaki等人,Microbiology150:2327-2334(2004))。由lysN编码的嗜热栖热菌酶对多种替代性的底物具有活性，所述底物包括草酰乙酸、2-氧代异已酸、2-氧代异戊酸以及2-氧代-3-甲基戊酸。
基因 登记号 GI号 生物
lysN BAC76939.1 31096548 嗜热栖热菌
AadAT-II Q8N5Z0.2 46395904 智人
2.7.2.a磷酸转移酶(羧基受体).
EC类别2.7.2的磷酸转移酶将羧酸转换为磷酸，同时发生一种ATP的水解。图62的步骤O涉及通过这类酶4-羟基丁酸盐到4-羟基丁酰-磷酸的转化。丁酸激酶(EC2.7.2.7)在丙酮丁醇梭菌中产酸期间执行丁酰-磷酸到丁酸盐的可逆的转化(Cary等人,Appl.Environ.Microbiol.56:1576-1583(1990))。这种酶由两种buk基因产物的任意一种编码(Huang等人,J.Mol.Microbiol.Biotechnol.2:33-38(2000))。其他丁酸激酶发现于丁酸梭菌和破伤风形梭菌(Twarog和Wolfe,J.Bacteriol.86:112-117(1963))。来自海栖热袍菌的相关酶异丁酸激酶也已经被表达于大肠杆菌中并进行结晶化(Diao等人,ActaCrystallogr.D.Biol.Crystallogr.59:1100-1102(2003)；Diao和Hasson,J.Bacteriol.191:2521-2529(2009))。天冬氨酸激酶催化天冬氨酸的依赖ATP的磷酸化反应以及参与多种氨基酸的合成。大肠杆菌中由lysC编码的天冬氨酸激酶III酶具有广泛的底物范围，以及底物特异性涉及的催化残基已经得到澄清(Keng和Viola,Arch.Biochem.Biophys.335:73-81(1996))。大肠杆菌中两种其他激酶也是不错的候选酶：乙酸激酶和γ-谷氨酰基激酶。由ackA(Skarstedt和Silverstein,J.Biol.Chem.251:6775-6783(1976))编码的大肠杆菌乙酸激酶除了使乙酸磷酸化之外还使丙酸磷酸化(Hesslinger等人,Mol.Microbiol.27:477-492(1998))。由proB(Smith等人,J.Bacteriol.157:545-551(1984))编码的大肠杆菌γ-谷氨酰基激酶使谷氨酸的γ碳酸基团磷酸化。
基因 登记号 GI号 生物
buk1 NP_349675 15896326 丙酮丁醇梭菌
buk2 Q97II1 20137415 丙酮丁醇梭菌
buk2 Q9X278.1 6685256 海栖热袍菌
lysC NP_418448.1 16131850 大肠杆菌
ackA NP_416799.1 16130231 大肠杆菌
proB NP_414777.1 16128228 大肠杆菌
乙酰基谷氨酸激酶在精氨酸生物合成期间使乙酰基化的谷氨酸磷酸化。这种酶是否接受替代性的底物尚未可知；然而，大肠杆菌酶的多种残基涉及底物结合以及已经通过定点诱变阐明磷酸化作用(Marco-Marin等人,J.Mol.Biol.334:459-476(2003)；Ramon-Maiques等人,Structure10:329-342(2002))。该酶由枯草芽孢杆菌和大肠杆菌中的argB(Parsot等人,Gene68:275-283(1988))以及酿酒酵母中的ARG5,6(Pauwels等人,Eur.J.Biochem.270:1014-1024(2003))编码。酿酒酵母的ARG5,6基因编码多蛋白质前体，所述多蛋白质前体在线粒体基质中长成以变为乙酰基谷氨酸激酶和乙酰基谷氨酰基磷酸还原酶。
基因 登记号 GI号 生物
argB NP_418394.3 145698337 大肠杆菌
argB NP_389003.1 16078186 枯草芽孢杆菌
ARG5,6 NP_010992.1 6320913 酿酒酵母
2.8.3.aCoA转移酶.
克鲁佛氏梭菌的cat1、cat2和cat3基因产物已经显示分别具有琥珀酰-CoA(图62和63步骤G)、4-羟基丁酰-CoA(图62步骤T)以及丁酰-CoA乙酰基转移酶活性(Seedorf等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA105:2128-2133(2008)；Sohling和Gottschalk,JBacteriol178:871-880(1996))。类似CoA转移酶活性还存在于阴道滴虫(vanGrinsven等人,J.Biol.Chem.283:1411-1418(2008))和布氏锥虫(Riviere等人,J.Biol.Chem.279:45337-45346(2004))中。
基因 登记号 GI号 生物
cat1 P38946.1 729048 克鲁佛氏梭菌
cat2 P38942.2 1705614 克鲁佛氏梭菌
cat3 EDK35586.1 146349050 克鲁佛氏梭菌
TVAG_395550 XP_001330176 123975034 阴道滴虫G3
Tb11.02.0290 XP_828352 71754875 布氏锥虫
用于这类转换的另一有用的酶是酰基-CoA：乙酸-CoA转移酶，也称为乙酸-CoA转移酶(EC2.8.3.8)已显示将来自各种支链和直链酰基-CoA底物的CoA部分转移到乙酸，所述底物包括异丁酸(Matthies和Schink,Appl.Environ.Microbiol.58:1435-1439(1992))、戊酸(Vanderwinkel等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.33:902-908(1968))和丁酸酯(Vanderwinkel,同上(1968))。这种酶由大肠杆菌属K12中的atoA(α亚基)和atoD(β亚基)(Korolev等人,ActaCrystallogr.DBiolCrystallogr.58:2116-2121(2002)；Vanderwinkel,同上(1968))编码。类似酶的存在于谷氨酸棒杆菌ATCC13032(Duncan等人,Appl.Environ.Microbiol.68:5186-5190(2002))、丙酮丁醇梭菌(Cary等人,Appl.Environ.Microbiol.56:1576-1583(1990)；Wiesenborn等人,Appl.Environ.Microbiol.55:323-329(1989))以及糖乙酸多丁醇梭菌(Kosaka等人,Biosci.Biotechnol.Biochem.71:58-68(2007))中。
基因 登记号 GI号 生物
atoA P76459.1 2492994 大肠杆菌K12
atoD P76458.1 2492990 大肠杆菌K12
actA YP_226809.1 62391407 谷氨酸棒杆菌
cg0592 YP_224801.1 62389399 谷氨酸棒杆菌
ctfA NP_149326.1 15004866 丙酮丁醇梭菌
ctfB NP_149327.1 15004867 丙酮丁醇梭菌
ctfA AAP42564.1 31075384 糖乙酸多丁醇梭菌
ctfB AAP42565.1 31075385 糖乙酸多丁醇梭菌
来自厌氧细菌发酵氨基酸球菌的戊烯二酸-CoA-转移酶(EC2.8.3.12)与二酸戊烯二酰基-CoA和3-丁烯酰基-CoA反应(Mack和Buckel,FEBSLett.405:209-212(1997))。编码这种酶的基因是gctA和gctB。这种酶对其他CoA衍生物(包括戊二酰基-CoA、2-羟基戊二酰基-CoA、己二酰-CoA和烯丙酰-CoA)具有降低的但是可检测出的活性(Buckel等人,Eur.J.Biochem.118:315-321(1981))。该酶已被克隆和表达在大肠杆菌中(Mac等人,Eur.J.Biochem.226:41-51(1994))。
基因 登记号 GI号 生物
gctA CAA57199.1 559392 发酵氨基酸球菌
gctB CAA57200.1 559393 发酵氨基酸球菌
3.1.2.aCoA水解酶.
3.1.2家族中的酶将酰基-CoA分子水解为它们相应的酸。然而，这类酶可被修饰以便如果耦合至能源(如质子泵)时赋予CoA-连接酶或合成酶功能或者引导ATP水解。多种真核乙酰基-CoA水解酶(EC3.1.2.1)具有广泛的底物特异性。例如，来自褐鼠脑的酶(Robinson等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.71:959-965(1976))可以与丁酰-CoA、己酰-CoA和丙二酰基-CoA反应。虽然尚未有关于其序列的报告，来自豌豆叶子的线粒体的酶也具有广泛的底物特异性，其对乙酰基-CoA、丙酰基-CoA、丁酰-CoA、棕榈酰基-CoA、油酰基-CoA、琥珀酰-CoA以及巴豆酰基-CoA的活性已得到证实(Zeiher和Randall,Plant.Physiol.94:20-27(1990))。来自酿酒酵母的乙酰基-CoA水解酶ACH1代表另一候选水解酶(Buu等人,J.Biol.Chem.278:17203-17209(2003))。
基因 登记号 GI号 生物
acot12 NP_570103.1 18543355 褐鼠
ACH1 NP_009538 6319456 酿酒酵母
其他候选水解酶是人二羧酸硫酯酶acot8，其显示出对戊二酰基-CoA、己二酰-CoA、环庚基-CoA、癸二酰基-CoA以及十二烷基二酰基-CoA的活性(Westin等人,J.Biol.Chem.280:38125-38132(2005))；以及最接近的大肠杆菌同系物tesB，其也可以水解一大批CoA硫酯(Naggert等人,J.Biol.Chem.266:11044-11050(1991))。类似的酶也已经被表征于大鼠肝脏中(Deana,Biochem.Int.26:767-773(1992))。其他潜在的大肠杆菌硫酯水解酶包括tesA(Bonner和Bloch,J.Biol.Chem.247:3123-3133(1972))、ybgC(Kuznetsova等人,FEMSMicrobiol.Rev.29:263-279(2005)；Zhuang等人,FEBSLett.516:161-163(2002))、paaI(Song等人,J.Biol.Chem.281:11028-11038(2006))以及ybdB(Leduc等人,J.Bacteriol.189:7112-7126(2007))的基因产物。
基因 登记号 GI号 生物
acot8 CAA15502 3191970 智人
tesB NP_414986 16128437 大肠杆菌
acot8 NP_570112 51036669 褐鼠
tesA NP_415027 16128478 大肠杆菌
ybgC NP_415264 16128711 大肠杆菌
paaI NP_415914 16129357 大肠杆菌
ybdB NP_415129 16128580 大肠杆菌
仍然另一候选水解酶是来自发酵氨基酸球菌的戊烯二酸CoA-转移酶。这种酶通过定点诱变被转换成对戊二酰基-CoA、乙酰基-CoA和3-丁烯酰基-CoA具有活性的酰基-CoA水解酶(Mack和Buckel,FEBSLett.405:209-212(1997))。这表明，编码琥珀酰-CoA:3-酮酸-CoA转移酶和乙酰乙酰基-CoA：乙酰基-CoA转移酶的酶也可以用作用于这种反应步骤的候选酶，但是很可能需要某些突变以改变它们的功能。
基因 登记号 GI号 生物
gctA CAA57199.1 559392 发酵氨基酸球菌
gctB CAA57200.1 559393 发酵氨基酸球菌
其他水解酶包括3-羟基异丁酰-CoA水解酶，其已被描述在缬氨酸降解期间高效地催化3-羟基异丁酰-CoA到3-羟基异丁酸盐的转化(Shimomura等人,J.Biol.Chem.269:14248-14253(1994))。编码这种酶的基因包括褐鼠(Shimomura等人,同上(1994)；Shimomura等人,MethodsEnzymol.324:229-240(2000))和智人(Shimomura等人,同上(1994)的hibch。通过序列同源性确认的候选基因包括酿酒酵母的hibch和蜡样芽胞杆菌的BC_2292。
基因 登记号 GI号 生物159 -->
hibch Q5XIE6.2 146324906 褐鼠
hibch Q6NVY1.2 146324905 智人
hibch P28817.2 2506374 酿酒酵母
BC_2292 AP09256 29895975 蜡样芽胞杆菌
4.1.1.a-羧基裂解酶.
α-酮酸的脱羧.α-酮戊二酸脱羧酶(图58、62和63的步骤B)、5-羟基-2-氧代戊酸脱羧酶(图62的步骤Z)以及5-氨基-2-氧代戊酸脱羧酶(图63的步骤R)全部涉及α-酮酸的脱羧。酮酸的脱羧通过各种各样的具有多样化底物特异性的酶催化，所述酶包括丙酮酸脱羧酶(EC4.1.1.1)、苯甲酰基甲酸脱羧酶(EC4.1.1.7)、α-酮戊二酸脱羧酶和支链α-酮酸脱羧酶。
丙酮酸脱羧酶(PDC,EC4.1.1.1)(又称为酮酸脱羧酶)是在生醇发酵中对丙酮酸到乙醛的脱羧基化进行催化的关键酶。来自酿酒酵母的这种酶具有针对脂肪族2-酮酸(包括2-酮丁酸、2-酮戊酸、3-羟基丙酮酸和2-苯基丙酮酸)的广泛的底物范围(Davie等人,J.Biol.Chem.267:16601-16606(1992))。还已对这种酶进行了广泛研究、设计以改变活性以及功能表达于大肠杆菌中(Killenberg-Jabs等人,Eur.J.Biochem.268:1698-1704(2001)；Li和Jordan,Biochemistry38:10004-10012(1999)；terSchure等人,Appl.Environ.Microbiol.64:1303-1307(1998))。来自运动发酵单胞菌的由pdc编码的PDC也具有广泛的底物范围以及已然是定向工程研究的主题，以改变针对不同的底物的亲和性(Siegert等人,ProteinEng.Des.Sel.,18:345-357(2005))。这种酶的晶体结构是可得的(Killenberg-Jabs等人,Eur.J.Biochem.268:1698-1704(2001))。其他很好地表征的PDC候选酶包括来自巴氏醋杆菌(Chandra等人,Arch.Microbiol.176:443-451(2001))和乳酸克鲁维酵母(Krieger等人,Eur.J.Biochem.,269:3256-3263(2002))的酶。
基因 登记号 GI号 生物
pdc P06672.1 118391 运动发酵单胞菌
pdc1 P06169 30923172 酿酒酵母
pdc AM21208 20385191 巴氏醋杆菌
pdc1 Q12629 52788279 乳酸克鲁维酵母
与PDC类似，苯甲酰基甲酸脱羧酶(EC4.1.1.7)具有广泛的底物范围并已然是酶工程研究的目标。已经对来自恶臭假单胞菌的酶进行广泛研究并得到这种酶的晶体结构(Hasson等人,Biochemistry37:9918-9930(1998)；Polovnikova等人,Biochemistry42:1820-1830(2003))。该恶臭假单胞菌酶的活性位点中两种残基的定点诱变改变了天然和非天然存在的底物的亲和性(Km)(Siegert等人,Protein.Eng.Des.Sel.18:345-357(2005))。已经通过定向工程对这种酶的特性进行进一步修改(Lingen等人,ProteinEng.15:585-593(2002)；Lingen等人,Chembiochem.4:721-726(2003))。也已经对来自绿脓假单胞菌由mdlC编码的酶进行试验性的表征(Barrowman等人,FEMSMicrobiol.Lett.34:57-60(1986))。可以通过序列同源性推断或利用恶臭假单胞菌中培养的生长选择系统确定来自施氏假单胞菌、萤光假单胞菌和其他生物的其他基因(Henning等人,Appl.Environ.Microbiol.72:7510-7517(2006))。
基因 登记号 GI号 生物
mdlC P20906.2 3915757 恶臭假单胞菌
mdlC Q9HUR2.1 81539678 绿脓假单胞菌
dpgB ABN80423.1 126202187 施氏假单胞菌
ilvB-1 YP_260581.1 70730840 荧光假单胞菌
能够使2-氧代酸脱羧基化的第三种酶是α-酮戊二酸脱羧酶(KGD)。迄今为止还未对这种类别的酶的底物范围进行研究。已克隆和功能表达来自结核分枝杆菌的KDC(Tian等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA102:10670-10675(2005))。然而，它不是用于菌株工程的理想候选，因为其量大(～130kD)以及富含GC。已在多种根瘤菌(包括大豆慢生根瘤菌和百脉根中慢生根瘤菌)中检测出KDC酶活性(Green等人,J.Bacteriol.182:2838-2844(2000)。虽然还未在这些生物中分离得到编码KDC的基因，但是得到了基因组序列，以及将每个基因组的多种基因注释为假定的KDC。也已经表征来自薄肌眼虫的KDC，但是迄今为止尚未确认与这种活性关联的基因(Shigeoka和Nakano,Arch.Biochem.Biophys.288:22-28(1991))。对始自N-末端的前二十个氨基酸进行了测序(MTYKAPVKDVKFLLDKVFKV；SEQIDNO:)(Shigeoka和Nakano,Arch.Biochem.Biophys.288:22-28(1991))。可以通过对包含这种N-末端序列的候选基因进行KDC活性检测来确认基因。
基因 登记号 GI号 生物
kgd O50463.4 160395583 结核分枝杆菌
kgd NP_767092.1 27375563 大豆慢生根瘤菌
kgd NP_105204.1 13473636 百脉根中慢生根瘤菌
用于催化这种反应的第四种候选酶是支链α-酮酸脱羧酶(BCKA)。这种类别的酶已显示对链长从3到6个碳不等的各种化合物起作用(Oku和Kaneda,J.Biol.Chem.263:18386-18396(1988)；Smit等人,B.A.,J.E.HylckamaVlieg,W.J.Engels,L.Meijer,J.T.Wouters和G.Smit.Identification,cloning,andcharacterizationofaLactococcuslactisbranched-chainalpha-ketoaciddecarboxylaseinvolvedinflavorformation.Appl.Environ.Microbiol.71:303-311(2005))。已经将乳酸乳球菌中的酶表征于各种支链和直链底物(包括2-氧代丁酸、2-氧代己酸、2-氧代戊酸、3-甲基-2-氧代丁酸、4-甲基-2-氧代丁酸和异已酸)(Smit等人,Appl.Environ.Microbiol.71:303-311(2005))。已对该酶进行结构表征(Berg等人,Science318:1782-1786(2007))。运动发酵单胞菌的乳酸乳球菌酶和丙酮酸脱羧酶之间序列对比表明，催化和底物识别残基是几乎相同的(Siegert等人,ProteinEng.Des.Sel.18:345-357(2005))，因此这种酶将是用于定向工程的潜在候选酶。在枯草芽孢杆菌中检测到了通过BCKA的α-酮戊二酸的脱羧基化；然而，这种活性相对于对其他支链底物的活性较低(5％)(Oku和Kaneda.Biosynthesisofbranched-chainfattyacidsinBacillussubtilis.Adecarboxylaseisessentialforbranched-chainfattyacidsynthetase.J.Biol.Chem.263:18386-18396(1988))，以及迄今为止尚未确认编码这种酶的基因。可以通过与乳酸乳球菌蛋白质序列的同源性确认其他BCK候选基因。这种酶的许多高得分的BLASTp匹配(hit)被注释为吲哚丙酮酸脱羧酶(EC4.1.1.74)。吲哚丙酮酸脱羧酶(IPDA)是一种在植物和植物细菌催化吲哚丙酮酸到吲哚乙醛的脱羧基化的酶。
基因 登记号 GI号 生物
kdcA AAS49166.1 44921617 乳酸乳球菌
衍生自来自智人和牛的线粒体支链酮酸脱氢酶复合物的E1亚基的重组支链α-酮酸脱羧酶已经被克隆以及功能表达于大肠杆菌中(Davie等人,J.Biol.Chem.267:16601-166061992)；Wynn等人,J.Biol.Chem.267:1881-1887(1992)；Wynn等人,J.Biol.Chem.267:12400-12403(1992))。在这些研究中，作者发现陪伴蛋白GroEL和GroES的共表达将脱羧酶的比活提高了500倍(Wynn等人,J.Biol.Chem.267:12400-12403(1992))。这些酶由两种α和两种β亚基组成。
基因 登记号 GI号 生物
BCKDHB NP_898871.1 34101272 智人
BCKDHA NP_000700.1 11386135 智人
BCKDHB P21839 115502434 牛
BCKDHA P11178 129030 牛
α-酮酸的脱羧.多种鸟氨酸脱羧酶(图63的步骤U)也显示对赖氨酸和其他类似化合物的活性。这类酶发现于粘毛烟草(Lee和Cho,Biochem.J.360:657-665(2001))、乳酸杆菌30a(Guirard和Snell,J.Biol.Chem.255:5960-5964(1980))和创伤弧菌(Lee等人,J.Biol.Chem.282:27115-27125(2007))。来自乳酸杆菌30a(Momany等人,J.Mol.Biol.252:643-655(1995))和创伤弧菌的所述酶已被结晶化。创伤弧菌酶高效地催化赖氨酸脱羧基化，以及底物特异性中涉及的残基已经阐明(Lee等人,J.Biol.Chem.282:27115-27125(2007))。类似的酶已被表征于阴道滴虫，但是编码这种酶的基因未可知(Yarlett等人,Biochem.J.293(Pt2):487-493(1993))。
基因 登记号 GI号 生物
AF323910.1:1..1299 AAG45222.1 12007488 粘毛烟草
odc1 P43099.2 1169251 乳酸杆菌30a
VV2_1235 NP_763142.1 27367615 创伤弧菌
谷氨酸脱羧酶(图62和63的步骤L)也具有良好表征。示例性的谷氨酸脱羧酶可以发现与大肠杆菌(DeBiase等人,ProteinExpr.Purif.8:430-438(1996))、酿酒酵母(Coleman等人,J.Biol.Chem.276:244-250(2001))以及智人(Bu等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:2115-2119(1992)；Bu和Tobin,Genomics21:222-228(1994))中。
基因 登记号 GI号 生物
GAD1 NP_000808 58331246 智人
GAD2 NP_001127838 197276620 智人162 -->
gadA NP_417974 16131389 大肠杆菌
gadB NP_416010 16129452 大肠杆菌
GAD1 NP_013976 6323905 酿酒酵母
赖氨酸脱羧酶(EC4.1.1.18)催化赖氨酸到尸胺的脱羧基化。这种酶的两种同功酶在大肠杆菌基因组由基因cadA和ldcC编码。CadA涉及抗酸性以及易受cadC基因产物的正向调节(Lemonnier和Lane,Microbiology144(Pt3):751-760(1998))。CadC接受羟基赖氨酸和S-氨基乙基半胱氨酸作为替代性底物，以及2-氨基庚二酸和6-ACA作为针对这种酶的竞争性抑制剂起作用(Sabo等人,Biochemistry13:662-670(1974))。可用定向进化或者其他酶工程方法来提高这种酶对2-氨基庚二酸脱羧基化的活性。这种构成表达的ldc基因产物的活性低于CadA(Lemonnier和Lane,Microbiology144(Pt3):751-760(1998))。最近在副溶血性弧菌中确认了CadA的赖氨酸脱羧酶类似物(Tanaka等人,J.Appl.Microbiol.104:1283-1293(2008))。来自反刍动物月形单胞菌由ldc编码的赖氨酸脱羧酶具有与真核鸟氨酸脱羧酶的序列相似性，以及接受L-赖氨酸和L-鸟氨酸作为底物(Takatsuka等人,Biosci.Biotechnol.Biochem.63:1843-1846(1999))。确认了活性位点残基并设计以改变该酶的底物特异性(Takatsuka等人,J.Bacteriol.182:6732-6741(2000))。
基因 登记号 GI号 生物
cadA AAA23536.1 145458 大肠杆菌
ldcC AAC73297.1 1786384 大肠杆菌
ldc O50657.1 13124043 反刍动物月形单胞菌
cadA AB124819.1 44886078 副溶血性弧菌
6.2.1.aCoA合成酶.
CoA合成酶或者连接酶反应为图62和63的步骤I以及图62的步骤V所需。琥珀酸或者4-羟基丁酸盐是所需的底物。编码很可能执行这些转换的酶的示例性基因包括大肠杆菌的sucCD基因，其自然地形成琥珀酰-CoA合成酶复合物。这种酶复合物自然地催化从琥珀酸到琥珀酰-CoA的形成以及伴随消耗一种ATP(一种在体内可逆的反应)(Buck等人,Biochem.24:6245-6252(1985))。
基因 登记号 GI号 生物
sucC NP_415256.1 16128703 大肠杆菌
sucD AAC73823.1 1786949 大肠杆菌
其他示例性的CoA-连接酶包括序列尚未表征的大鼠二羧酸-CoA连接酶(Vamecq等人,BiochemicalJ.230:683-693(1985))、来自产黄青霉的两种表征的苯基乙酸-CoA连接酶的任一种(Lamas-Maceiras等人,Biochem.J.395:147-155(2005)；Wang等人,BiochemBiophyResCommun360(2):453-458(2007))、来自恶臭假单胞菌的苯基乙酸-CoA连接酶(Martinez-Blanco等人,J.Biol.Chem.265:7084-7090(1990))以及来自枯草芽孢杆菌的6-羧基己酸-CoA连接酶(Bower等人,J.Bacteriol.178(14):4122-4130(1996))。其他候选酶是来自小家鼠(Hasegawa等人,Biochim.Biophys.Acta1779:414-419(2008))和智人(Ohgami等人,Biochem.Pharmacol.65:989-994(2003))的乙酰乙酰基-CoA合成酶，其自然地催化乙酰乙酸到乙酰乙酰基-CoA的依赖ATP的转化。4-羟基丁酰-CoA合成酶活性已在勤奋生金球菌中得到证实(Berg等人,Science318:1782-1786(2007))。这种功能已经尝试性地分配给了Msed_1422基因。
基因 登记号 GI号 生物
phl CAJ15517.1 77019264 产黄青霉
phlB ABS19624.1 152002983 产黄青霉
paaF AAC24333.2 22711873 恶臭假单胞菌
bioW NP_390902.2 50812281 枯草芽孢杆菌
AACS NP_084486.1 21313520 小家鼠
AACS NP_076417.2 31982927 智人
Msed_1422 YP_001191504 146304188 勤奋生金球菌
ADP形成乙酰基-CoA合成酶(ACD，EC6.2.1.13)是另一候选酶，其将酰基-CoA酯到其相应酸的转化与同时发生的ATP合成耦合起来。具有广泛底物特异性的多种酶已经在文献中有描述。来自闪烁古生球菌由AF1211编码的ACDI显示对各种直链和支链底物(包括乙酰基-CoA、丙酰基-CoA、丁酰基-CoA、乙酸、丙酸、丁酸盐、异丁酸盐、异戊酸、琥珀酸、延胡索酸、苯基乙酸、吲哚乙酸)起作用(Musfeldt等人,J.Bacteriol.184:636-644(2002))。来自死海盐盒菌的酶(注释为琥珀酰-CoA合成酶)接受丙酸、丁酸盐以及支链酸(异戊酸和异丁酸盐)作为底物，以及显示按正向和逆向方向起作用(Brasen等人,Arch.Microbiol.182:277-287(2004))。由来自超嗜热泉古菌耐超高温热棒菌的PAE3250编码的ACD显示具有所有的表征的ACD的最广泛的底物范围，与乙酰基-CoA、异丁酰-CoA(优选的底物)和苯基乙酰基-CoA反应(Brasen等人,同上(2004))。来自闪烁古生球菌、死海盐盒菌和耐超高温热棒菌的酶已经被克隆、功能表达以及表征于大肠杆菌中(Musfeldt等人,同上；Brasen等人,同上(2004))。
基因 登记号 GI号 生物
AF1211 NP_070039.1 11498810 闪烁古生球菌DSM 4304
scs YP_135572.1 55377722 死海盐盒菌ATCC 43049
PAE3250 NP_560604.1 18313937 耐超高温热棒菌菌株IM2
实施例XXIII
利用羧酸还原酶生产BDO
该实施例描述利用羧酸还原酶生产1,4-丁二醇的微生物的生成。
大肠杆菌被用作目标生物以设计图58所述的用于1,4-丁二醇合成的途径。大肠杆菌提供用于生成能够生产1,4-丁二醇的非天然存在的微生物的良好宿主。大肠杆菌经得起基因操纵以及已知能够在各种氧化条件下有效地生产各种产物，像乙醇、乙酸、甲酸、乳酸以及琥珀酸。
4-羟基丁酸盐途径基因整合入染色体：ECKh-432的构建.在大肠杆菌指定的ECKh-761(其是另外删除编码琥珀酸半醛脱氢酶的sad和gabD基因的ECKh-432的后代)菌株中表达羧酸还原酶。如实施例XXI所述，这种菌株包含BDO途径的组分，产生4HB，在fimD位点整合入大肠杆菌的染色体。
羧酸还原酶和PPtase的克隆和表达.为了生成设计以生产1,4-丁二醇的大肠杆菌菌株，利用熟知的分子生物技术在大肠杆菌中表达编码羧酸还原酶和磷酸泛酰巯基乙胺转移酶的核酸(见，例如，Sambrook，同上，2001；Ausubel同上,1999)。具体地，在PA1/lacO启动子的控制下，将来自艾瓦诺卡氏菌(称为720)、包皮垢分支杆菌mc(2)155(称为890)、鸟型分枝杆菌亚种类结核K-10(称为891)和海洋分支杆菌M(称为892)的car基因克隆进入pZS*13载体(德国Ruelzheim的Expressys)。在与pZS*13所用的那些类似的启动子和核醣体结合位点的控制下将npt(ABI83656.1)基因(即721)克隆进入pKJL33S载体(原始mini-F质粒载体PML31的一种衍生物)。
通过PCR克隆来自诺卡氏菌属基因组DNA的car基因(GNM_720)。其核酸和蛋白质序列分别如图59A和59B所示。通过GeneArt(德国Regensburg)合成密码子优化形式npt基因(GNM_721)。其核酸和蛋白质序列分别如图60A和60B所示。包皮垢分支杆菌mc(2)155(称为890)、鸟型分枝杆菌亚种类结核K-10(称为891)和海洋分支杆菌M(称为892)基因和酶的核酸和蛋白质序列可分别见于图64、65以及66。将质粒转换进入ECKh-761以表达1,4-丁二醇生产所需的蛋白质和酶。
利用羧酸还原酶生产1,4-BDO的验证.利用大肠杆菌全细胞培养物验证1,4-丁二醇途径的功能表达。将用分别包含car基因和GNM_721的pZS*13和pKJL33S质粒转换的大肠杆菌ECKh-761的单菌落接种进入包含适当抗生素的5mLLB培养基。类似地，将用无插入物的包含car的pZS*13质粒和pKJL33S质粒转换的大肠杆菌ECKh-761的单菌落接种进入包含适当抗生素的其他5mL等分试样的LB培养基。通过用1.5％第一培养物接种包含适当抗生素的新鲜的体内转化基本培养基(见下文)开始10mL微好氧培养。
该体内转化基本培养基(达1000mL)的配方如下：
通过在接种后起初用氮冲洗加盖厌氧瓶5min，然后用18G针刺穿垫片建立微好氧的条件。在培育期间将该针保持在该瓶中，以允许少量的空气进入该瓶中。当培养物达到对数生长中期时，用0.2mMIPTG诱导蛋白质表达。认为时间＝0hr。如上文以及WO2008115840中所述，对培养上清液进行BDO、4HB和其他副产物的分析(见表31)。
表33显示在表达各种羧酸还原酶的菌株中各种产物的生产，包括BDO。
表33.在表达各种羧酸还原酶的菌株中各种产物的生产.
PA＝丙酮酸、SA＝琥珀酸、LA＝乳酸、4HB＝4-羟基丁酸盐、BDO＝1,4-丁二醇、GBL＝γ-丁内酯、Etoh＝乙醇、LLOQ＝定量下限
这些结果显示，各种羧酸还原酶可以在BDO途径中起作用以生产BDO。
本申请通篇中已经引用了各种出版物。本申请中特此以引用方式并入这些出版物披露的全文(包括GenBank和GI编码公布)，以便更充分地描述本发明所属的现有技术水平。虽然已经就上文提供的实施例对本发明进行了描述，但是应该应理解，可以做各种修改而不背离本发明的精神。

Claims (16)

1.一种非天然存在的微生物，所述微生物包括具有4-羟基丁醛途径的微生物，该途径包括编码以足以生产4-羟基丁醛的量表达的4-羟基丁醛途径酶的至少一种外源性核酸，所述4-羟基丁醛途径包括琥珀酰-CoA还原酶(醛形成)；4-羟基丁酸脱氢酶；以及4-羟基丁酸还原酶。
2.一种非天然存在的微生物，所述微生物包括具有4-羟基丁醛途径的微生物，该途径包括编码以足以生产4-羟基丁醛的量表达的4-羟基丁醛途径酶的至少一种外源性核酸，所述4-羟基丁醛途径包括α-酮戊二酸脱羧酶；4-羟基丁酸脱氢酶；以及4-羟基丁酸还原酶。
3.一种非天然存在的微生物，所述微生物包括具有4-羟基丁醛途径的微生物，该途径包括编码以足以生产4-羟基丁醛的量表达的4-羟基丁醛途径酶的至少一种外源性核酸，所述4-羟基丁醛途径包括琥珀酸还原酶；4-羟基丁酸脱氢酶，以及4-羟基丁酸还原酶。
4.一种非天然存在的微生物，所述微生物包括具有4-羟基丁醛途径的微生物，该途径包括编码以足以生产4-羟基丁醛的量表达的4-羟基丁醛途径酶的至少一种外源性核酸，所述4-羟基丁醛途径包括α-酮戊二酸脱羧酶或者谷氨酸脱氢酶或者谷氨酸转氨酶和谷氨酸脱羧酶和4-氨基丁酸脱氢酶或者4-氨基丁酸转氨酶；4-羟基丁酸脱氢酶；以及4-羟基丁酸还原酶。
5.一种非天然存在的微生物，所述微生物包括具有4-羟基丁醛途径的微生物，该途径包括编码以足以生产4-羟基丁醛的量表达的4-羟基丁醛途径酶的至少一种外源性核酸，所述4-羟基丁醛途径包括α-酮戊二酸还原酶；5-羟基-2-氧代戊酸脱氢酶；以及5-羟基-2-氧代戊酸脱羧酶。
6.一种用于生产4-羟基丁醛的方法，该方法包括在一定条件下培养权利要求1-5任意一项的非天然存在的微生物达足够长的时间以生产4-羟基丁醛。
7.一种非天然存在的微生物，所述微生物包括具有腐胺途径的微生物，该途径包括编码以足以生产腐胺的量表达的腐胺途径酶的至少一种外源性核酸，所述腐胺途径包括琥珀酸还原酶；4-氨基丁酸脱氢酶或者4-氨基丁酸转氨酶；4-氨基丁酸还原酶；以及腐胺脱氢酶或者腐胺转氨酶。
8.一种非天然存在的微生物，所述微生物包括具有腐胺途径的微生物，该途径包括编码以足以生产腐胺的量表达的腐胺途径酶的至少一种外源性核酸，所述腐胺途径包括α-酮戊二酸脱羧酶；4-氨基丁酸脱氢酶或者4-氨基丁酸转氨酶；4-氨基丁酸还原酶；以及腐胺脱氢酶或者腐胺转氨酶。
9.一种非天然存在的微生物，所述微生物包括具有腐胺途径的微生物，该途径包括编码以足以生产腐胺的量表达的腐胺途径酶的至少一种外源性核酸，所述腐胺途径包括谷氨酸脱氢酶或者谷氨酸转氨酶；谷氨酸脱羧酶；4-氨基丁酸还原酶；以及腐胺脱氢酶或者腐胺转氨酶。
10.一种非天然存在的微生物，所述微生物包括具有腐胺途径的微生物，该途径包括编码以足以生产腐胺的量表达的腐胺途径酶的至少一种外源性核酸，所述腐胺途径包括α-酮戊二酸还原酶；5-氨基-2-氧代戊酸脱氢酶或者5-氨基-2-氧代戊酸转氨酶；5-氨基-2-氧代戊酸脱羧酶；以及腐胺脱氢酶或者腐胺转氨酶。
11.一种非天然存在的微生物，所述微生物包括具有腐胺途径的微生物，该途径包括编码以足以生产腐胺的量表达的腐胺途径酶的至少一种外源性核酸，所述腐胺途径包括α-酮戊二酸还原酶；5-氨基-2-氧代戊酸脱氢酶或者5-氨基-2-氧代戊酸转氨酶；鸟氨酸脱氢酶或者鸟氨酸转氨酶；以及鸟氨酸脱羧酶。
12.一种用于生产腐胺的方法，该方法包括在一定条件下培养权利要求8-11任意一项的非天然存在的微生物达足够长的时间以生产腐胺。
13.一种非天然存在的微生物，所述微生物包括具有4-羟基丁酰-CoA(4-HBCoA)途径的微生物，该途径包括编码以足够的量表达以生产4-羟基丁酰-CoA的4-羟基丁酰-CoA途径酶的至少一种外源性核酸，所述4-羟基丁酰-CoA途径包括α-酮戊二酸还原酶；5-羟基-2-氧代戊酸脱氢酶；以及5-羟基-2-氧代戊酸脱氢酶(脱羧)。
14.一种用于生产4-羟基丁酰-CoA的方法，该方法包括在一定条件下培养权利要求13的非天然存在的微生物达足够长的时间以生产4-羟基丁酰-CoA。
15.一种非天然存在的微生物，所述非天然存在的微生物选自：
(A)具有还原TCA途径的微生物，该途径包括编码以足够的量表达以将CO、CO2或H2转化为乙酰基-CoA的还原TCA途径酶的至少一种外源性核酸，其中所述酶选自ATP柠檬酸-裂解酶、柠檬酸裂解酶、α-酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶以及延胡索酸还原酶，
其中所述微生物进一步包括1,4-丁二醇途径，该途径包括选自3-羟基丁酰-CoA脱氢酶；4-羟基丁酰-CoA还原酶(醇形成)；4-羟基丁酰-CoA还原酶(醛形成)；1,4-丁二醇脱氢酶；4-羟基丁酰-CoA转移酶、4-羟基丁酰-CoA合成酶或4-羟基丁酰-CoA水解酶；磷酸转-4-羟基丁酰酶；4-羟基丁酸激酶和4-羟基丁酸还原酶的至少五种酶；
(B)具有一氧化碳脱氢酶或氢化酶活性以及还原TCA途径的微生物，该途径包括编码以足够的量表达以将CO、CO2或H2转化为乙酰基-CoA的还原TCA途径酶的至少一种外源性核酸，其中所述酶选自ATP柠檬酸-裂解酶、柠檬酸裂解酶、乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶和α-酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、琥珀酰-CoA合成酶、琥珀酰-CoA转移酶、延胡索酸还原酶、延胡索酸酶和苹果酸脱氢酶，
其中所述微生物进一步包括1,4-丁二醇途径，该途径包括：3-羟基丁酰-CoA脱氢酶；4-羟基丁酰-CoA还原酶(醇形成)；4-羟基丁酰-CoA还原酶(醛形成)；1,4-丁二醇脱氢酶；以及4-羟基丁酸还原酶；
(C)具有还原TCA途径的微生物，该途径包括编码以足够的量表达以将CO、CO2或H2转化为乙酰基-CoA的还原TCA途径酶的至少一种外源性核酸，其中所述酶选自ATP柠檬酸-裂解酶、柠檬酸裂解酶、α-酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶以及延胡索酸还原酶，
其中所述微生物进一步包括4-羟基丁酸途径，且
其中所述微生物包括选自3-羟基丁酰-CoA脱氢酶；4-羟基丁酰-CoA转移酶、4-羟基丁酰-CoA水解酶或4-羟基丁酰-CoA合成酶；磷酸转-4-羟基丁酰酶；以及4-羟基丁酸激酶的五种酶；
(D)具有一氧化碳脱氢酶或氢化酶活性以及还原TCA途径的微生物，该途径包括编码以足够的量表达以将CO、CO2或H2转化为乙酰基-CoA的还原TCA途径酶的至少一种外源性核酸，其中所述酶选自ATP柠檬酸-裂解酶、柠檬酸裂解酶、乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶、α-酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、琥珀酰-CoA合成酶、琥珀酰-CoA转移酶、延胡索酸还原酶、延胡索酸酶以及苹果酸脱氢酶，
其中所述微生物进一步包括4-羟基丁酸途径，该途径包括：3-羟基丁酰-CoA脱氢酶；4-羟基丁酰-CoA转移酶、4-羟基丁酰-CoA水解酶或4-羟基丁酰-CoA合成酶；磷酸转-4-羟基丁酰酶；以及4-羟基丁酸激酶；
(E)一种微生物，其包括编码以足够的量表达以由一氧化碳或氢生成还原当量从而通过还原TCA循环固定CO2的酶的至少一种外源性核酸，其中所述至少一种外源性核酸选自一氧化碳脱氢酶、氢化酶、NAD(P)H:铁氧还蛋白氧化还原酶和铁氧还蛋白，
其中所述微生物进一步包括4-丁二醇途径，该途径包括编码选自以下的酶的至少一种外源性核酸：琥珀酰-CoA转移酶或琥珀酰-CoA合成酶；琥珀酰-CoA还原酶(醛形成)；4-羟基丁酸脱氢酶；4-羟基丁酸激酶；磷酸转-4-羟基丁酰酶；4-羟基丁酰-CoA还原酶(醛形成)；1,4-丁二醇脱氢酶；琥珀酸还原酶；琥珀酰-CoA还原酶(醇形成)；4-羟基丁酰-CoA转移酶、4-羟基丁酰-CoA水解酶或4-羟基丁酰-CoA合成酶；4-羟基丁酸还原酶；4-羟基丁酰-磷酸还原酶；以及4-羟基丁酰-CoA还原酶(醇形成)；
(F)一种微生物，其包括编码以足够的量表达以由一氧化碳或氢生成还原当量从而通过还原TCA循环固定CO2的酶的至少一种外源性核酸，其中所述至少一种外源性核酸选自一氧化碳脱氢酶、氢化酶、NAD(P)H:铁氧还蛋白氧化还原酶，
其中所述微生物进一步包括4-丁二醇途径，该途径包括编码选自以下的酶的至少一种外源性核酸：琥珀酰-CoA转移酶或琥珀酰-CoA合成酶；琥珀酰-CoA还原酶(醛形成)；4-羟基丁酸脱氢酶；4-羟基丁酸激酶；磷酸转-4-羟基丁酰酶；4-羟基丁酰-CoA还原酶(醛形成)；1,4-丁二醇脱氢酶；琥珀酸还原酶；琥珀酰-CoA还原酶(醇形成)；4-羟基丁酰-CoA转移酶、4-羟基丁酰-CoA水解酶或4-羟基丁酰-CoA合成酶；4-羟基丁酸还原酶；4-羟基丁酰-磷酸还原酶；以及4-羟基丁酰-CoA还原酶(醇形成)；
(G)具有还原TCA途径的微生物，该途径包括编码还原TCA途径酶的至少一种外源性核酸，其中所述至少一种外源性核酸选自ATP-柠檬酸裂解酶、柠檬酸裂解酶、延胡索酸还原酶以及α-酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；以及
包括编码选自一氧化碳脱氢酶、氢化酶、NAD(P)H:铁氧还蛋白氧化还原酶和铁氧还蛋白的酶的至少一种外源性核酸，
其中所述酶以足够的量表达以从1)CO，2)CO2和H2，3)CO和CO2，4)包含CO和H2的合成气，或5)包含CO、CO2和H2的合成气通过所述还原TCA途径固定碳，
其中所述微生物进一步包括4-丁二醇途径，且
其中所述微生物包括选自3-羟基丁酰-CoA脱氢酶；4-羟基丁酰-CoA还原酶(醇形成)；4-羟基丁酰-CoA还原酶(醛形成)；1,4-丁二醇脱氢酶；4-羟基丁酰-CoA转移酶、4-羟基丁酰-CoA合成酶或4-羟基丁酰-CoA水解酶；磷酸转-4-羟基丁酰酶；4-羟基丁酸激酶和4-羟基丁酸还原酶的五种酶；
(H)具有还原TCA途径的微生物，该途径包括编码以足够的量表达以将1)CO，2)CO2和H2，3)CO和CO2，4)包含CO和H2的合成气，和5)包含CO、CO2和H2的合成气转化为乙酰基-CoA的还原TCA途径酶的至少一种外源性核酸，其中所述至少一种外源性核酸选自ATP柠檬酸-裂解酶、柠檬酸裂解酶、乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶、α-酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、琥珀酰-CoA合成酶、琥珀酰-CoA转移酶、延胡索酸还原酶、延胡索酸酶和苹果酸脱氢酶.；以及
包括生成还原当量的途径，该途径包括编码选自一氧化碳脱氢酶、氢化酶和NAD(P)H:铁氧还蛋白氧化还原酶的生成还原当量的酶的至少一种外源性核酸，
其中所述微生物进一步包括4-丁二醇途径，该途径包括：3-羟基丁酰-CoA脱氢酶；4-羟基丁酰-CoA还原酶(醇形成)；4-羟基丁酰-CoA还原酶(醛形成)；1,4-丁二醇脱氢酶；以及4-羟基丁酸还原酶；
(I)具有还原TCA途径的微生物，该途径包括编码还原TCA途径酶的至少一种外源性核酸；其中所述至少一种外源性核酸选自ATP-柠檬酸裂解酶、柠檬酸裂解酶、延胡索酸还原酶以及α-酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶；以及
包括编码选自一氧化碳脱氢酶、氢化酶、NAD(P)H:铁氧还蛋白氧化还原酶和铁氧还蛋白的酶的至少一种外源性核酸，
其中所述酶以足够的量表达以从1)CO，2)CO2和H2，3)CO和CO2，4)包含CO和H2的合成气，或5)包含CO、CO2和H2的合成气通过所述还原TCA途径固定碳，
其中所述微生物进一步包括4-羟基丁酸途径，且
其中所述微生物包括选自3-羟基丁酰-CoA脱氢酶；4-羟基丁酰-CoA转移酶、4-羟基丁酰-CoA水解酶或4-羟基丁酰-CoA合成酶；磷酸转-4-羟基丁酰酶；以及4-羟基丁酸激酶的五种酶；以及
(J)具有还原TCA途径的微生物，该途径包括编码以足够的量表达以将1)CO，2)CO2和H2，3)CO和CO2，4)包含CO和H2的合成气，和5)包含CO、CO2和H2的合成气转化为乙酰基-CoA的还原TCA途径酶的至少一种外源性核酸，
其中所述至少一种外源性核酸选自ATP柠檬酸-裂解酶、柠檬酸裂解酶、乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶、α-酮戊二酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、琥珀酰-CoA合成酶、琥珀酰-CoA转移酶、延胡索酸还原酶、延胡索酸酶和苹果酸脱氢酶.；以及
包括生成还原当量的途径，该途径包括编码选自一氧化碳脱氢酶、氢化酶和NAD(P)H:铁氧还蛋白氧化还原酶的生成还原当量的酶的至少一种外源性核酸，
其中所述微生物进一步包括4-羟基丁酸途径，该途径包括：3-羟基丁酰-CoA脱氢酶；4-羟基丁酰-CoA转移酶、4-羟基丁酰-CoA水解酶或4-羟基丁酰-CoA合成酶；磷酸转-4-羟基丁酰酶；以及4-羟基丁酸激酶。
16.一种生产1,4-丁二醇或4-羟基丁酸的方法，该方法包括该方法包括在一定条件下培养权利要求15的非天然存在的微生物达足够长的时间以生产1,4-丁二醇或4-羟基丁酸。
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