KR20120083908A - 1,4-부탄다이올, 4-하이드록시부탄알, 4-하이드록시부티릴-ｃｏａ, 푸트레신 및 관련 화합물의 제조를 위한 미생물 및 관련 방법 - Google Patents

1,4-부탄다이올, 4-하이드록시부탄알, 4-하이드록시부티릴-ｃｏａ, 푸트레신 및 관련 화합물의 제조를 위한 미생물 및 관련 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20120083908A
KR20120083908A KR1020127012122A KR20127012122A KR20120083908A KR 20120083908 A KR20120083908 A KR 20120083908A KR 1020127012122 A KR1020127012122 A KR 1020127012122A KR 20127012122 A KR20127012122 A KR 20127012122A KR 20120083908 A KR20120083908 A KR 20120083908A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
dehydrogenase
putrescine
naturally occurring
pathway
coa
Prior art date
Application number
KR1020127012122A
Other languages
English (en)
Inventor
로버트 하셀벡
존 디 트라윅
웨이 뉴
안쏘니 피 버가드
Original Assignee
게노마티카 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 게노마티카 인코포레이티드 filed Critical 게노마티카 인코포레이티드
Publication of KR20120083908A publication Critical patent/KR20120083908A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/38—Nucleosides
    • C12P19/40—Nucleosides having a condensed ring system containing a six-membered ring having two nitrogen atoms in the same ring, e.g. purine nucleosides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1096—Transferases (2.) transferring nitrogenous groups (2.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/13—Transferases (2.) transferring sulfur containing groups (2.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/001—Amines; Imines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01037—Malate dehydrogenase (1.1.1.37)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01041—Isocitrate dehydrogenase (NAD+) (1.1.1.41)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01042—Isocitrate dehydrogenase (NADP+) (1.1.1.42)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01061—4-Hydroxybutyrate dehydrogenase (1.1.1.61)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y103/00—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3)
    • C12Y103/01—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.3.1)
    • C12Y103/01006—Fumarate reductase (NADH) (1.3.1.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
    • C12Y401/01071—2-Oxoglutarate decarboxylase (4.1.1.71)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 1,4-부탄다이올(BDO), 4-하이드록시부티릴-CoA, 4-하이드록시부탄알 또는 푸트레신을 생산하기에 충분한 양으로 발현되고 BDO의 발현에 대해 더욱 최적화된, BDO, 4-하이드록시부티릴-CoA, 4-하이드록시부탄알 또는 푸트레신 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 BDO, 4-하이드록시부티릴-CoA, 4-하이드록시부탄알 또는 푸트레신 경로를 포함하는 비-천연 미생물 유기체를 제공한다. 본 발명은 BDO, 4-하이드록시부티릴-CoA, 4-하이드록시부탄알 또는 푸트레신을 생산하는 상기와 같은 미생물 유기체의 사용 방법을 추가로 제공한다.

Description

1,4-부탄다이올, 4-하이드록시부탄알, 4-하이드록시부티릴-ＣＯＡ, 푸트레신 및 관련 화합물의 제조를 위한 미생물 및 관련 방법{MICROORGANISMS FOR THE PRODUCTION OF 1,4-BUTANEDIOL, 4-HYDROXYBUTANAL, 4-HYDROXYBUTYRYL-COA, PUTRESCINE AND RELATED COMPOUNDS, AND METHODS RELATED THERETO}
본 발명은 일반적으로 유기체의 인 실리코(in silico) 디자인 및 유기체의 조작, 보다 특히 1,4-부탄다이올, 4-하이드록시부티릴-CoA, 4-하이드록시부탄알 또는 푸트레신 생합성 능력을 갖는 유기체에 관한 것이다.
본 출원은 2009년 10월 13일자로 출원된 미국 가출원 제 61/251,287 호에 기초하여 우선권을 주장하고, 상기 출원은 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다.
화합물 4-하이드록시부탄산(4-하이드록시부타노에이트, 4-하이드록시부티레이트, 4-HB)은 다양한 상품 및 특수 화학물질용 구성 블록으로서 산업적인 가능성을 갖는 4-탄소 카복실산이다. 특히, 4-HB는 용매, 수지, 중합체 전구체 및 특수 화학물질을 포함한 화학물질들의 1,4-부탄다이올계로의 새로운 입구로서 작용할 잠재력을 갖는다. 1,4-부탄다이올(BDO)은 연간 약 30억 lb의 세계 시장을 갖는 중합체 중간체 및 산업 용매이다. BDO는 현재 석유화학 전구체, 주로 아세틸렌, 말레산 무수물, 및 프로필렌 옥사이드로부터 생산된다.
예를 들어, 아세틸렌은 2 분자의 폼알데하이드와 레페 합성 반응(문헌[Kroschwitz and Grant, Encyclopedia of Chem. Tech., John Wiley and Sons, Inc., New York(1999)])에서 반응한 다음, 접촉 수소화에 의해 1,4-부탄다이올을 형성한다. 미국에서 생산되는 아세틸렌의 90%가 부탄다이올 생산에 소비되는 것으로 추정되었다. 한편으로, 아세틸렌은 부탄으로부터 유도되는 말레산 무수물의 에스터화 및 접촉 수소화에 의해 형성될 수 있다. 하류 부분인 부탄다이올은 예를 들어 γ-부티로락톤으로의 산화에 의해서 추가로 변환될 수 있으며, 상기 락톤은 피롤리돈 및 N-메틸-피롤리돈으로 추가 전환되거나 또는 가수소분해에 의해 테트라하이드로퓨란으로 전환될 수 있다. 이들 화합물은 중합체 중간체, 용매 및 첨가제로서 다양한 용도를 가지며 연간 거의 20억 lb의 복합 시장을 갖는다.
석유 기재 공급원료를 재생 가능하게 대체할 뿐만 아니라 적은 에너지- 및 자본-집약적인 공정들을 사용하는 대체 수단에 의한 상기 화학물질의 생산 방법을 개발하는 것이 바람직하다. 에너지 국은 부탄다이올계 생성물의 제조에 생물학적으로 생산되는 핵심 중간체로서 1,4-이산, 및 특히 숙신산을 제안하였다(문헌[DOE Report, "Top Value-Added Chemicals from Biomass", 2004]). 그러나, 숙신산은 단리 및 정제에 비용이 들고 부탄다이올로의 접촉 환원을 위해 고온 및 고압을 필요로 한다.
따라서, 상업적인 양의 1,4-부탄다이올 및 그의 화학적 전구체들을 유효하게 생산하기 위한 대체 수단들이 필요하다. 본 발명은 상기 필요성을 만족시키며 또한 관련된 이점들을 제공한다.
본 발명은 1,4-부탄다이올(BDO), 4-하이드록시부탄알(4-HBal), 4-하이드록시부티릴-CoA(4-HBCoA) 및/또는 푸트레신을 생산하기에 충분한 양으로 발현된 BDO, 4-HBal 및/또는 푸트레신 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 BDO, 4-HBal, 4-HBCoA 및/또는 푸트레신 경로를 함유하는 비-천연 미생물 유기체를 제공한다. 상기 미생물 유기체는 BDO, 4-HBal, 4-HBCoA 및/또는 푸트레신의 발현에 더욱 최적화될 수 있다. 본 발명은 BDO, 4-HBal, 4-HBCoA 및/또는 푸트레신을 생산하는 상기와 같은 미생물 유기체의 사용 방법을 추가로 제공한다.
도 1은 4-하이드록시부티레이트(4-HB) 및 1,4-부탄다이올 생산으로의 생합성 경로를 나타내는 개략도이다. 처음 5 단계는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에 대해 내생적인 반면, 나머지는 이종으로 발현될 수 있다. 상기 생합성 반응들을 촉매화하는 효소는 (1) 숙시닐-CoA 신시타제; (2) CoA-의존성 숙시닉 세미알데하이드 데하이드로게나제; (3) α-케토글루타레이트 데하이드로게나제; (4) 글루타메이트:숙시네이트 세미알데하이드 트랜스아미나제; (5) 글루타메이트 데카복실라제; (6) CoA-의존성 숙시닉 세미알데하이드 데하이드로게나제; (7) 4-하이드록시부타노에이트 데하이드로게나제; (8) α-케토글루타레이트 데카복실라제; (9) 4-하이드록시부티릴 CoA:아세틸-CoA 트랜스퍼라제; (10) 부티레이트 키나제; (11) 포스포트랜스부티릴라제; (12) 알데하이드 데하이드로게나제; (13) 알콜 데하이드로게나제이다.
도 2는 에스케리키아 콜라이에서의 호모세린 생합성을 나타내는 개략도이다.
도 3은 4-HB 경로 유전자의 다양한 조합들을 발현하는 플라스미드를 갖고 있는 에스케리키아 콜라이 균주를 사용하는 글루코스 최소 배지에서의 4-HB의 생산을 도시한다. (a) 배양 브로쓰 중의 4-HB 농도; (b) 배양 브로쓰 중의 숙시네이트 농도; (c) 600 ㎚에서 측정된 배양물 OD. 막대들의 집단은 24 시간, 48 시간, 및 72 시간(측정되는 경우)의 시점들을 나타낸다. x-축을 따라 있는 부호들은 사용된 균주/플라스미드 조합을 가리킨다. 첫 번째 지수는 숙주 균주: 1, MG1655 lacIQ; 2, MG1655 ΔgabD lacIQ; 3, MG1655 ΔgabD ΔaldA lacIQ를 지칭한다. 두 번째 지수는 사용된 플라스미드 조합을 지칭한다: 1, pZE13-0004-0035 및 pZA33-0036; 2, pZE13-0004-0035 및 pZA33-0010n; 3, pZE13-0004-0008 및 pZA33-0036; 4, pZE13-0004-0008 및 pZA33-0010n; 5, 대조용 벡터 pZE13 및 pZA33.
도 4는 마이코박테리움 튜베르큘로시스(Mycobacterium tuberculosis)로부터의 α-케토글루타레이트 데카복실라제를 발현하는 에스케리키아 콜라이 균주에서 글루코스로부터의 4-HB의 생산을 도시한다. 균주 1-3은 pZE13-0032 및 pZA33-0036을 함유한다. 균주 4는 오직 빈 벡터 pZE13 및 pZA33만을 발현한다. 숙주 균주들은 하기와 같다: 1 및 4, MG1655 lacIQ; 2, MG1655 ΔgabD lacIQ; 3, MG1655 ΔgabD ΔaldA lacIQ. 막대들은 24 및 48 시간째의 농도에 관한 것이다.
도 5는 재조합 에스케리키아 콜라이 균주에서 10 mM 4-HB로부터 BDO의 생산을 도시한다. 번호를 매긴 위치들은, 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)로부터의 cat2를 발현하는, pZA33-0024를 함유하는 MG1655 lacIQ를 사용한 실험들에 상응하며, 하기의 유전자들이 pZE13 상에서 발현된다: 1, 없음(대조군); 2, 0002; 3, 0003, 4, 0003n; 5, 0011; 6, 0013; 7, 0023; 8, 0025; 9, 0008n; 10, 0035. 유전자 번호는 표 6에 정의된다. 각각의 위치에 대해서, 막대들은 각각 호기성, 미세호기성, 및 혐기성 조건들에 관한 것이다. 미세호기성 조건은 배양 튜브를 밀봉하지만 배기시키지 않음으로써 생성되었다.
도 6은 4 g/L의 표지되지 않은 글루코스(a, c, e 및 g) 균일하게 표지된 13C-글루코스(b, d, f 및 h)가 보충된 M9 최소 배지에서 증식된 MG1655 lacIQ pZE13-0004-0035-0002 pZA33-0034-0036에 의해 생산된 4-HB 및 BDO의 질량 스펙트럼을 도시한다. (a) 및 (b), 2 탄소 원자를 함유하는, 유도체화된 BDO의 질량 116 특징 단편; (c) 및 (d), 1 탄소 원자를 함유하는, 유도체화된 BDO의 질량 177 특징 단편; (e) 및 (f), 2 탄소 원자를 함유하는, 유도체화된 4-HB의 질량 117 특징 단편; (g) 및 (h), 4 탄소 원자를 함유하는, 유도체화된 4-HB의 질량 233 특징 단편.
도 7은 γ-부티로락톤의 생산을 위한 생물공정의 개략적인 공정 흐름도이다. 패널 (a)는 회분 분리식 유가(fed-batch) 발효를 예시하고 패널 (b)는 연속 분리식 유가 발효를 예시한다.
도 8a 및 8b는 예시적인 1,4-부탄다이올(BDO) 경로를 도시한다. 도 8a는 숙시닐-CoA로부터의 BDO 경로를 도시한다. 도 8b는 알파-케토글루타레이트로부터의 BDO 경로를 도시한다.
도 9a 내지 9c는 예시적인 BDO 경로를 도시한다. 도 9a 및 9b는 4-아미노부티레이트로부터의 경로를 도시한다. 도 9c는 아세토아세틸-CoA로부터 4-아미노부티레이트로의 경로를 도시한다.
도 10은 알파-케토글루타레이트로부터의 예시적인 BDO 경로를 도시한다.
도 11은 글루타메이트로부터의 예시적인 BDO 경로를 도시한다.
도 12는 아세토아세틸-CoA로부터의 예시적인 BDO 경로를 도시한다.
도 13은 호모세린으로부터의 예시적인 BDO 경로를 도시한다.
도 14는 에스케리키아 콜라이 숙시닐-CoA 신시타제의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 도시한다. 도 14a는 에스케리키아 콜라이 sucCD 오페론의 뉴클레오타이드 서열(서열번호)을 도시한다. 도 14b(서열번호) 및 14C(서열번호)는 sucCD 오페론에 의해 암호화된 숙시닐-CoA 신시타제 서브유닛의 아미노산 서열을 도시한다.
도 15는 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis) 알파케토글루타레이트 데카복실라제의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 도시한다. 도 15a는 마이코박테리움 보비스 sucA 유전자의 뉴클레오타이드 서열(서열번호)을 도시한다. 도 15b는 마이코박테리움 보비스 알파케토글루타레이트 데카복실라제의 아미노산 서열(서열번호)을 도시한다.
도 16은 혐기성(미세호기성) 조건 하에서 알파-케토글루타레이트를 통한 최소 배지에서의 글루코스로부터 4-하이드록시부티레이트의 에스케리키아 콜라이 생합성을 도시한다. 숙주 균주는 ECKh-401이다. 실험들을 하기와 같이 플라스미드 pZA33 상에 존재하는 상부 경로 유전자들에 따라 표지한다: 1) 4 hbd - sucA; 2) sucCD-sucD-4hbd; 3) sucCD - sucD -4 hbd - sucA.
도 17은 숙시네이트 및 알파-케토글루타레이트를 통한 최소 배지에서의 글루코스로부터 4-하이드록시부티레이트의 에스케리키아 콜라이 생합성을 도시한다. 숙주 균주는 야생형 MG1655이다. 실험들을 하기와 같이 플라스미드 pZE13 및 pZA33 상에 존재하는 유전자들에 따라 표지한다: 1) 빈 대조용 벡터 2) 빈 pZE13, pZA33-4hbd; 3) pZE13-sucA, pZA33-4hbd.
도 18A는 포르피로모나스 진지발리스로부터의 CoA-의존성 숙시네이트 세미알데하이드 데하이드로게나제(sucD)의 뉴클레오타이드 서열(서열번호)을 도시하고, 도 18B는 암호화된 아미노산 서열(서열번호)을 도시한다.
도 19A는 포르피로모나스 진지발리스로부터의 4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제(4hbd)의 뉴클레오타이드 서열(서열번호)을 도시하고, 도 19B는 암호화된 아미노산 서열(서열번호)을 도시한다.
도 20A는 포르피로모나스 진지발리스로부터의 4-하이드록시부티레이트 CoA 트랜스퍼라제(cat2)의 뉴클레오타이드 서열(서열번호)을 도시하고, 도 20B는 암호화된 아미노산 서열(서열번호)을 도시한다.
도 21A는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum)으로부터의 포스포트랜스부티릴라제(ptb)의 뉴클레오타이드 서열(서열번호)을 도시하고, 도 21B는 암호화된 아미노산 서열(서열번호)을 도시한다.
도 22A는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰으로부터의 부티레이트 키나제(buk1)의 뉴클레오타이드 서열(서열번호)을 도시하고, 도 22B는 암호화된 아미노산 서열(서열번호)을 도시한다.
도 23은 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 고유 서열에 비해 더 우세한 에스케리키아 콜라이 코돈에 대해 변경된 코돈을 갖는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 020(포스포트랜스부티릴라제)에 대한 또 다른 뉴클레오타이드 서열을 도시한다. 도 23A 내지 23D(각각 020A-020D, 서열번호)는 보다 우세한 코돈들에 의해 대체된 증가하는 수의 희귀 에스케리키아 콜라이 코돈을 갖는 서열들을 함유한다(A<B<C<D).
도 24는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 고유 서열에 비해 더 우세한 에스케리키아 콜라이 코돈에 대해 변경된 코돈을 갖는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 021(부티레이트키나제)에 대한 또 다른 뉴클레오타이드 서열을 도시한다. 도 24A 내지 24D(각각 021A-021B, 서열번호)는 보다 우세한 코돈들에 의해 대체된 증가하는 수의 희귀 에스케리키아 콜라이 코돈을 갖는 서열들을 함유한다(A<B<C<D).
도 25는 에스케리키아 콜라이에서의 발현에 대해 최적화된 코돈을 갖는 부티레이트 키나제(BK) 및 포스포트랜스부티릴라제(PTB)의 개선된 발현을 도시한다. 도 25a는 쿠마씨 블루에 의해 단백질 염색된 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 젤 전기영동(SDS-PAGE)을 도시한다; 레인 1, 삽입물이 없는 대조용 벡터; 레인 2, 에스케리키아 콜라이에서 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 고유 서열의 발현; 레인 3, 020B-021B 코돈 최적화된 PTB-BK의 발현; 레인 4, 020C-021C 코돈 최적화된 PTB-BK의 발현. BK 및 PTB의 위치를 나타낸다. 도 25b는 코돈 최적화된 020B-021B(2021B) 및 020C-021C(2021C)에 비해, 고유 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 서열(2021n)의 BK 및 PTB 활성을 도시한다.
도 26은 BDO 생산 효소: Cat2(034); 2021n; 2021B; 2021C를 발현하는 다양한 균주들에서 BDO 및 감마-부티릴락톤(GBL)의 생산을 도시한다.
도 27A는 고유 클로스트리듐 비에제링키이(Clostridium biejerinckii) ald 유전자(025n)의 뉴클레오타이드 서열(서열번호)을 도시하고, 도 27B는 암호화된 아미노산 서열(서열번호)을 도시한다.
도 28A 내지 28D는 클로스트리듐 베이제링키이(Clostridium beijerinckii) ald 유전자에 대한 또 다른 유전자 서열(각각 025A-025D, 서열번호)을 도시하며, 이때 증가하는 수의 희귀 코돈들은 더 우세한 코돈들에 의해 대체된다(A<B<C<D).
도 29는 고유 클로스트리듐 베이제링키이 ald 유전자 및 코돈 최적화된 변체; ins 없음(삽입물이 없는 대조군), 025n, 025A, 025B, 025C, 025D들의 발현을 도시한다.
도 30은 다양한 균주들에서 BDO 또는 BDO 및 에탄올 생산을 도시한다. 도 30은 고유 클로스트리듐 베이제링키이 ald 유전자(025n) 또는 에스케리키아 콜라이에서의 발현에 최적화된 코돈을 갖는 변체(025A-025D)를 함유하는 균주들에서의 BDO 생산을 도시한다. 도 30b는 코돈 최적화된 변체 025B에 비해, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 AdhE2(002C)를 발현하는 균주에서 에탄올 및 BDO의 생산을 도시한다. 세 번째 세트는 포르피로모나스 진지발리스 suD(035)의 발현을 나타낸다. 모든 경우에, 포르피로모나스 진지발리스 Cat2(034)가 또한 발현된다.
도 31A는 제오바실러스 써모글루코시다시우스(Geobacillus thermoglucosidasius)로부터의 adh1 유전자의 뉴클레오타이드 서열(서열번호)을 도시하고; 도 31B는 암호화된 아미노산 서열(서열번호)을 도시한다.
도 32a는 에스케리키아 콜라이에서 상기 제오바실러스 써모글루코시다시우스 adh1 유전자의 발현을 도시한다. 완전 세포 용해물 및 상등액 중 어느 하나를 SDS-PAGE에 의해 분석하고, 삽입물이 없는 플라스미드, 083(제오트리쿰 카피타툼(Geotrichum capitatum) N-벤질-3-피롤리디놀 데하이드로게나제)을 갖는 플라스미드 및 084(제오바실러스 써모글루코시다시우스 adh1) 삽입물을 갖는 플라스미드에 대해 쿠마씨 블루로 염색하였다. 도 32b는 기질로서 부티르알데하이드(다이아몬드) 또는 4-하이드록시부티르알데하이드(사각형)를 갖는 084의 활성을 도시한다.
도 33은 다양한 균주들에서 BDO의 생산을 도시한다: 삽입물이 없는 플라스미드; 025B, 025B-026n; 025B-026A; 025B-026B; 025B-026C; 025B-050; 025B-052; 025B-053; 025B-055; 025B-057; 025B-058; 025B-071; 025B-083; 025B-084; PTSlacO-025B; PTSlacO-025B-026n.
도 34는 벡터 pRE118-V2에 대한 플라스미드 지도를 도시한다.
도 35는 aceF 및 lpdA 유전자를 포함하는 ECKh-138 영역의 서열을 도시한다. 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumonia) lpdA 유전자를 밑줄 그었고 Glu354Lys 돌연변이체에서 변화된 코돈은 빗금을 그었다.
도 36은 고유 에스케리키아 콜라이 lpdA 및 돌연변이체 클렙시엘라 뉴모니아 lpdA의 단백질 서열 비교를 도시한다.
도 37은 균주 AB3, MG1655 ΔldhA 및 ECKh-138에서 4-하이드록시부티레이트(좌측 막대) 및 BDO(우측 막대) 생산을 도시한다. 모든 균주가 에스케리키아 콜라이 sucCD, 포르피로모나스 진지발리스 sucD, 중간 사본 플라스미드 pZA33 상의 포르피로모나스 진지발리스 4 hbd, 및 포르피로모나스 진지발리스 Cat2, 고 사본 플라스미드 pZE13 상의 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 AdhE2를 발현하였다.
도 38은 pflB-p6 프로모터 및 리보솜 결합 부위(RBS)에 융합된 aceE 유전자의 5' 단부의 뉴클레오타이드 서열을 도시한다. 5' 이탤릭체 서열은 aroP 유전자의 출발을 도시하며, 상기 유전자는 pdh 오페론으로부터 반대 방향으로 전사된다. 3' 이탤릭체 서열은 aceE 유전자의 출발을 도시한다. 상부 경우: pflB RBS. 밑줄: FNR 결합 부위. 굵은 글씨: pflB-p6 프로모터 서열.
도 39는 균주 ECKh-456에서 aceF - lpdA 영역 중의 뉴클레오타이드 서열(서열번호)을 도시한다.
도 40은 균주 ECKh-439, ECKh-455 및 ECKh-456 각각에 대한 4-하이드록시부티레이트, BDO 및 피루베이트(각각 좌측에서 우측 막대로)의 생산을 도시한다.
도 41a는 mdh 유전자의 결실에 대한 재조합 부위에 대한 개략도를 도시한다. 도 41b는 FRT 부위가 측면에 있는 클로람페니콜 내성 유전자(CAT)의 PCR 증폭 산물 및 플라스미드 pKD3으로부터의 mdh 유전자로부터의 상동성 영역의 서열을 도시한다.
도 42는 균주 ECKh-401 중의 arcA 결실된 영역의 서열을 도시한다.
도 43은 균주 ECKh-422의 돌연변이된 gltA 유전자를 포함하는 영역의 서열을 도시한다.
도 44는 야생형 gltA 유전자 산물 및 R163L 돌연변이체의 시트레이트 신타제 활성을 도시한다. 분석을 0.4 mM NADH의 부재(다이아몬드) 또는 존재(사각형) 하에서 수행하였다.
도 45는 균주 ECKh-401 및 ECKh-422에서 4-하이드록시부티레이트(좌측 막대) 및 BDO(우측 막대) 생산을 도시하며, 상기 두 균주 모두 플라스미드 상에서의 완전한 BDO 경로에 대한 유전자들을 발현한다.
도 46은 대사 표지 실험으로부터 중심 대사 흐름 및 관련된 95% 신뢰도 구간들을 도시한다. 값들은 1 mmol/hr의 글루코스 흡수율로 표준화된 몰 흐름이다. 결과는 탄소 흐름이 산화 방향으로 시트레이트 신타제를 통해 이동하고 상기 탄소의 대부분이 TCA 주기를 완성하기보다는 BDO 경로로 들어감을 가리킨다.
도 47은 균주 ECKh-138 및 ECKh-422에 대한 세포 외 생성물 형성을 도시하며, 상기 두 균주는 모두 플라스미드 상의 전체 BDO 경로를 발현한다. 상기 측정된 생성물은 아세테이트(Ace), 피루베이트(Pyr), 4-하이드록시부티레이트(4HB), 1,4-부탄다이올(BDO), 에탄올(EtOH), 및 다른 생성물(감마-부티로락톤(GBL), 숙시네이트 및 락테이트를 포함한다)이었다.
도 48은 하에모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae) 포스포에놀피루베이트 카복시키나제(pepck)에 의한 PEP 카복실라제(ppc)의 치환에 따른 영역의 서열을 도시한다. 상기 pepck 암호화 영역은 밑줄을 그었다.
도 49는 50 mM NaHCO3를 함유하는 최소 배지에서 증식된 진화된 pepCK 균주들의 증식을 도시한다.
도 50은 플라스미드 pZS*13 상에서 포르피로모나스 진지발리스 Cat2 및 클로스트리듐 베이제링키이 Ald를 발현하는 균주 ECKh-453에서의 생성물 형성을 도시한다. 상기 측정된 생성물은 1,4-부탄다이올(BDO), 피루베이트, 4-하이드록시부티레이트(4HB), 아세테이트, γ-부티로락톤(GBL) 및 에탄올이었다.
도 51은 2 개의 균주 ECKh-453 및 ECKh-432의 BDO 생산을 도시한다. 상기 두 균주는 모두 포르피로모나스 진지발리스 Cat2 및 클로스트리듐 베이제링키이 Ald를 발현하는 플라스미드 pZS*13을 함유한다. 상기 배양물을 나타낸 바와 같이, 27 또는 18 게이지 바늘로 천공한 용기를 사용하여, 미세호기성 조건 하에서 증식시켰다.
도 52는 프로모터, sucCD 유전자, sucD 유전자, 4 hbd 유전자 및 종결자 서열을 함유하는 다시스트론성 DNA 단편의 삽입 영역 중의 균주 ECKh-426의 게놈 DNA의 뉴클레오타이드 서열을 도시한다.
도 53은 프로모터, sucA 유전자, 클로스트리듐 클루이베리(Clostridium kluyveri) 4 hbd 유전자 및 종결자 서열을 함유하는 다시스트론성 서열의 삽입 영역 중의 균주 ECKh-432의 염색체 영역의 뉴클레오타이드 서열을 도시한다.
도 54는 염색체 내로 통합된 유전자를 암호화하는 상부 BDO 경로를 갖고 하부 BDO 경로 유전자를 갖는 플라스미드를 함유하는 ECKh-432 균주에서 최소 배지 중의 글루코스로부터의 BDO 합성을 도시한다.
도 55는 rrnC 영역과 상동성인 영역이 측면에 인접한 비 포스포트랜스퍼라제(비-PTS) 슈크로스 이용 유전자를 함유하는 PCR 산물을 도시한다.
도 56은 rrnC 오페론 중의 통합 부위의 개략도를 도시한다.
도 57은 글루코스 상에서 증식된 균주 ECKh-432 및 슈크로스 상에서 증식된 균주 ECKh-463의 48 시간 증식 후, 배양물 OD600에 대해 표준화된, 평균 생성물 농도를 도시한다. 상기 두 균주는 모두 포르피로모나스 진지발리스 Cat2 및 클로스트리듐 베이제링키이 Ald를 발현하는 플라스미드 pZS*13을 함유한다. 상기 데이터는 각 균주의 6 개의 복제 배양물에 대한 것이다. 상기 측정된 생성물은 1,4-부탄다이올(BDO), 4-하이드록시부티레이트(4HB), γ-부티로락톤(GBL), 피루베이트(PYR) 및 아세테이트(ACE)(각각 좌측에서 우측 막대로)이었다.
도 58은 숙시닐-CoA 및 알파-케토글루타레이트로부터 1,4-부탄다이올로의 예시적인 경로를 도시한다. 약어: A) 숙시닐-CoA 리덕타제(알데하이드 형성), B) 알파-케토글루타레이트 데카복실라제, C) 4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제, D) 4-하이드록시부티레이트 리덕타제, E) 1,4-부탄다이올 데하이드로게나제.
도 59a는 노카르디아 이오웬시스(Nocardia iowensis)(GNM_720)로부터의 카복실산 리덕타제의 뉴클레오타이드 서열(서열번호)을 도시하며, 도 59b는 암호화된 아미노산 서열(서열번호)을 도시한다.
도 60a는 코돈 최적화된, 포스프판테쎄인 트랜스퍼라제의 뉴클레오타이드 서열(서열번호)을 도시하고, 도 60b는 상기 암호화된 아미노산 서열을 도시한다.
도 61은 플라스미드 pZS*-13S-720 721opt의 플라스미드 지도를 도시한다.
도 62a 및 62b는 숙시네이트, 숙시닐-CoA, 및 알파-케토글루타레이트로부터 1,4-부탄다이올로의 경로를 도시한다. 약어: A) 숙시닐-CoA 리덕타제(알데하이드 형성), B) 알파-케토글루타레이트 데카복실라제, C) 4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제, D) 4-하이드록시부티레이트 리덕타제, E) 1,4-부탄다이올 데하이드로게나제, F) 숙시네이트 리덕타제, G) 숙시닐-CoA 트랜스퍼라제, H) 숙시닐-CoA 하이드롤라제, I) 숙시닐-CoA 신시타제(또는 숙시닐-CoA 리가제), J) 글루타메이트 데하이드로게나제, K) 글루타메이트 트랜스아미나제, L) 글루타메이트 데카복실라제, M) 4-아미노부티레이트 데하이드로게나제, N) 4-아미노부티레이트 트랜스아미나제, O) 4-하이드록시부티레이트 키나제, P) 포스포트랜스-4-하이드록시부티릴라제, Q) 4-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(알데하이드 형성), R) 4-하이드록시부티릴-포스페이트 리덕타제, S) 숙시닐-CoA 리덕타제(알콜 형성), T) 4-하이드록시부티릴-CoA 트랜스퍼라제, U) 4-하이드록시부티릴-CoA 하이드롤라제, V) 4-하이드록시부티릴-CoA 신시타제(또는 4-하이드록시부티릴-CoA 리가제), W) 4-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(알콜 형성), X) 알파-케토글루타레이트 리덕타제, Y) 5-하이드록시-2-옥소펜타노에이트 데하이드로게나제, Z) 5-하이드록시-2-옥소펜타노에이트 데카복실라제, AA) 5-하이드록시-2-옥소펜타노에이트 데하이드로게나제(탈카복실화).
도 63은 숙시네이트, 숙시닐-CoA, 및 알파-케토글루타레이트로부터 푸트레신으로의 경로를 도시한다. 약어: A) 숙시닐-CoA 리덕타제(알데하이드 형성), B) 알파-케토글루타레이트 데카복실라제, C) 4-아미노부티레이트 리덕타제, D) 푸트레신 데하이드로게나제, E) 푸트레신 트랜스아미나제, F) 숙시네이트 리덕타제, G) 숙시닐-CoA 트랜스퍼라제, H) 숙시닐-CoA 하이드롤라제, I) 숙시닐-CoA 신시타제(또는 숙시닐-CoA 리가제), J) 글루타메이트 데하이드로게나제, K) 글루타메이트 트랜스아미나제, L) 글루타메이트 데카복실라제, M) 4-아미노부티레이트 데하이드로게나제, N) 4-아미노부티레이트 트랜스아미나제, O) 알파-케토글루타레이트 리덕타제, P) 5-아미노-2-옥소펜타노에이트 데하이드로게나제, Q) 5-아미노-2-옥소펜타노에이트 트랜스아미나제, R) 5-아미노-2-옥소펜타노에이트 데카복실라제, S) 오르니틴 데하이드로게나제, T) 오르니틴 트랜스아미나제, U) 오르니틴 데카복실라제.
도 64a는 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis) mc(2) 155(890으로 표시됨)로부터의 카복실산 리덕타제의 뉴클레오타이드 서열(서열번호)을 도시하며, 도 64b는 상기 암호화된 아미노산 서열(서열번호)을 도시한다.
도 65a는 마이코박테리움 아비움 서브스페시즈 파라튜베르큘로시스(Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis) K-10(891로 표시됨)으로부터의 카복실산 리덕타제의 뉴클레오타이드 서열(서열번호)을 도시하며, 도 65b는 상기 암호화된 아미노산 서열(서열번호)을 도시한다.
도 66a는 마이코박테리움 마리눔(Mycobacterium marinum) M(892로 표시됨)으로부터의 카복실산 리덕타제의 뉴클레오타이드 서열(서열번호)을 도시하며, 도 66b는 상기 암호화된 아미노산 서열(서열번호)을 도시한다.
본 발명은 4-하이드록시부탄산(4-HB), γ-부티로락톤 및 1,4-부탄다이올(BDO), 4-하이드록시부탄알(4-HBal), 4-하이드록시부티릴-CoA(4-HBCoA) 및/또는 푸트레신에 대한 생합성 생산 능력을 갖는 세포 및 유기체의 디자인 및 생산에 관한 것이다. 본 발명은 특히 BDO, 4-HBal, 4-HBCoA 및/또는 푸트레신 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 핵산을 도입시킴으로써 BDO, 4-HBal, 4-HBCoA 및/또는 푸트레신을 생산할 수 있는 미생물 유기체의 디자인에 관한 것이다.
하나의 실시태양에서, 본 발명은 4-하이드록시부탄산(4-HB), 1,4-부탄다이올(BDO), 4-HBal, 4-HBCoA 및/또는 푸트레신의 생합성 생산에 대한 대사 디자인을 밝히는 에스케리키아 콜라이 대사의 인 실리코 화학량론 모델을 사용한다. 본 발명에서 개시된 결과는 에스케리키아 콜라이 및 다른 세포 또는 유기체에서 4-HBal, 4-HBCoA 또는 4-HB 및 하부 산물, 예를 들어 1,4-부탄다이올 또는 푸트레신의 생합성을 성취하기 위해 대사 경로를 디자인하고 재조합적으로 조작할 수 있음을 가리킨다. 예를 들어 인 실리코 디자인을 위해, 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 및/또는 푸트레신의 생합성 생산을 상기 디자인된 대사 유전자형을 갖는 균주의 구성에 의해 확인할 수 있다. 이들 대사적으로 조작된 세포 또는 유기체들에 또한, 이론적으로 최대 증식에 접근하는 조건들을 포함하여, 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 및/또는 푸트레신 생합성을 더욱 증대시키기 위한 적응 진화를 가할 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 상기 디자인된 균주의 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 및/또는 푸트레신 생합성 특성들은 상기 균주를 연속적인 생물공정들에 유전적으로 안정하고 특히 유용하게 한다. 별도의 균주 디자인 전략들이 CoA-독립적인 숙시닉 세미알데하이드 데하이드로게나제, 숙시닐-CoA 신시타제 및 CoA-의존적인 숙시닉 세미알데하이드 데하이드로게나제, 또는 글루타메이트:숙시닉 세미알데하이드 트랜스아미나제로부터 4-HB 및 1,4-부탄다이올 생산 대사 경로를 이끌어내는 에스케리키아 콜라이 또는 다른 숙주 유기체 내로의 상이한 비-고유 또는 이종 반응 능력의 통합에 의해 확인되었다. 상기 각각의 대사 경로들로부터 에스케리키아 콜라이 및 효모 종들 모두에서 4-HB의 생합성을 생성시킨 인 실리코 대사 디자인이 확인되었다. 상기 1,4-부탄다이올 중간체 γ-부티로락톤을 pH<7.5의 조건 하에서, 특히 산성 조건 하에서, 예를 들어 pH 5.5 이하, 예를 들어 pH<7, pH<6.5, pH<6, 및 특히 pH<5.5 이하에서 자발적인 환화에 의해 배양물 중에 생성시킬 수 있다.
상기 플랫폼의 계산 성분들을 통해 확인된 균주를, 4-HB, 1,4-부탄다이올 또는 다른 중간체 및/또는 하부 산물들의 생합성 생산을 유도하는 예측된 대사 변경들 중 임의의 변경을 유전자 조작하여 실제 생산에 대입할 수 있다. 더욱 추가의 실시태양에서, 상기 화합물의 생합성 생산을 발휘하는 균주들에, 생성물 생합성을 더욱 증대하도록 적응 진화를 추가로 가할 수 있다. 적응 진화에 따른 생성물 생합성 수율의 수준을 또한 상기 시스템의 계산 성분에 의해 예측할 수 있다.
다른 특정한 실시태양에서, 숙시네이트로부터 4-HB 및 4-HB-CoA로의 효소적 단계들을 암호화하는 4-HB 생합성 경로를 발현하도록 미생물 유기체를 제작할 수 있다. 숙주 미생물 유기체에서 숙시네이트 조효소 A 트랜스퍼라제, CoA-의존성 숙시닉 세미알데하이드 데하이드로게나제, NAD-의존성 4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제 및 4-하이드록시부티레이트 조효소 A 트랜스퍼라제의 공동 발현은 4-HB 생합성 경로가 없는 숙주 미생물 유기체에 비해 4-HB를 현저하게 생성시켰다. 더욱 특정한 실시태양에서, α-케토글루타레이트 데카복실라제 및 NAD-의존성 4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제를 암호화하는 핵산을 도입함으로써 기질로서α-케토글루타레이트를 사용하는 4-HB-생산 미생물 유기체를 생성시켰다.
또 다른 특정한 실시태양에서, 4-HB의 존재 하에서 배양 시 1,4-부탄다이올(BDO)을 생합성하는 BDO 생합성 경로를 함유하는 미생물 유기체를 제작하였다. 상기 BDO 생합성 경로는 다작용성 알데하이드/알콜 데하이드로게나제를 암호화하는 핵산 또는 알데하이드 데하이드로게나제 및 알콜 데하이드로게나제를 암호화하는 핵산으로 이루어졌다. 4-HB 기질 상에서의 증식을 지지하기 위해서, 상기 BDO-생산 미생물 유기체는 또한 포스포트랜스하이드록시부티릴라제와 함께 4-하이드록시부티레이트 CoA 트랜스퍼라제 또는 4-부티레이트 키나제를 발현하였다. 더욱 추가의 특정한 실시태양에서, 작용성 4-HB 생합성 경로 및 작용성 BDO 생합성 경로를 암호화하는 핵산의 외부 발현을 통해 BDO를 합성하는 미생물 유기체를 생성시켰다. 상기 4-HB 생합성 경로는 숙시네이트 조효소 A 트랜스퍼라제, CoA-의존성 숙시닉 세미알데하이드 데하이드로게나제, NAD-의존성 4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제 및 4-하이드록시부티레이트 조효소 A 트랜스퍼라제로 이루어졌다. 상기 BDO 경로는 다작용성 알데하이드/알콜 데하이드로게나제로 이루어졌다. BDO의 생산을 위한 추가적인 경로들을 본 발명에 추가로 개시한다(도 8 내지 13 참조).
추가의 실시태양에서, 4-하이드록시부탄알, 4-하이드록시부티릴-CoA 또는 1,4-부탄다이올 대사 경로에서 작용하는 카복실산 리덕타제 효소의 클로닝 및 발현을 본 발명에 개시한다. 아실-CoA 리덕타제와 상반되게 카복실산 리덕타제를 사용하여 4-하이드록시부티르알데하이드(4-하이드록시부탄알)를 형성시키는 이점은 BDO의 생산에 수반되는 저급 에탄올 및 GBL 부산물의 형성을 포함한다. 트라이카복실산(TCA) 주기 대사 산물, 예를 들어 숙시네이트, 숙시닐-CoA 및/또는 알파-케토글루타레이트로부터 1,4-부탄다이올 및 푸트레신을 생성시키는 추가적인 다수의 경로의 일부로서 카복실산 리덕타제의 용도를 본 발명에 개시한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "비-천연"이란 용어는 본 발명의 미생물 유기체 또는 미생물과 관련하여 사용될 때 상기 미생물 유기체가 기준 종의 야생형 균주를 포함하여, 상기 기준 종의 천연 균주에서 통상적으로 발견되지 않는 하나 이상의 유전자 변경을 가짐을 의미한다. 유전자 변경은 예를 들어 대사 폴리펩타이드를 암호화하는 발현 가능한 핵산 도입, 다른 핵산 첨가, 핵산 결실 및/또는 상기 미생물 유전 물질의 다른 작용성 파괴의 변형들을 포함한다. 상기와 같은 변형들은 예를 들어 상기 기준 종들에 대한 이종, 동종, 또는 이종 및 동종 모두의 폴리펩타이드에 대한 암호화 부위 및 그의 작용성 단편을 포함한다. 추가적인 변형은 예를 들어 상기 변형이 유전자 또는 오페론의 발현을 변경시키는 비-암호화 조절 부위를 포함한다. 예시적인 대사 폴리펩타이드는 4-HB, 4-HBal, 4-HBcoA, BDO 또는 푸트레신 계 화합물에 대한 생합성 경로 내의 효소 또는 단백질을 포함한다.
대사 변형은 천연 상태로부터 변경되는 생화학적 반응을 지칭한다. 따라서, 비-천연 미생물은 대사 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 또는 그의 작용성 단편에 대한 유전자 변형을 가질 수 있다. 예시적인 대사 변형은 본 발명에 개시된다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "단리된"이란 용어는 미생물 유기체와 관련하여 사용 시, 기준 미생물 유기체가 자연에서 발견될 때 하나 이상의 성분이 실질적으로 없는 유기체를 의미한다. 상기 용어는 자연 환경에서 발견될 때 일부 또는 전체 성분이 제거된 미생물 유기체를 포함한다. 상기 용어는 상기 미생물 유기체가 비-천연 환경에서 발견될 때 일부 또는 전체 성분이 제거된 미생물 유기체를 또한 포함한다. 따라서, 단리된 미생물 유기체는 자연에서 발견되거나 또는 비-천연 환경에서 생육, 저장 또는 연명될 때 다른 물질들과 부분적으로 또는 완전히 분리된다. 단리된 미생물 유기체의 구체적인 예는 부분적으로 순수한 미생물, 실질적으로 순수한 미생물 및 비-천연 배지에서 배양된 미생물을 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "미생물의", "미생물 유기체" 또는 "미생물"이란 용어는 고세균, 세균 또는 진핵생물 영역 내에 포함되는 미시적인 세포로서 존재하는 임의의 유기체를 의미한다. 따라서, 상기 용어는 미시적인 크기를 갖는 원핵생물 또는 진핵생물 세포 또는 유기체를 포함함을 의미하고 효모 및 진균과 같은 진핵 미생물뿐만 아니라 모든 종의 세균, 고세균 및 진정세균을 포함한다. 상기 용어는 또한 생화학적 생산을 위해 배양될 수 있는 임의의 종의 세포 배양물을 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "4-하이드록시부탄산"이란 용어는 화학식 C4H8O3 및 104.11 g/mol(그의 나트륨 염의 경우 126.09 g/mol)의 분자량을 갖는 부티르산의 4-하이드록시 유도체를 의미하는데 사용된다. 화학적 화합물 4-하이드록시부탄산은 또한 4-HB, 4-하이드록시부티레이트, 감마-하이드록시부티르산 또는 GHB로서 당해 분야에 공지되어 있다. 본 발명에 사용된 바와 같은 상기 용어는 상기 화합물의 다양한 염 형태들 중 임의의 형태를 포함함을 의미하며 예를 들어 4-하이드록시부타노에이트 및 4-하이드록시부티레이트를 포함한다. 4-HB에 대한 염 형태들의 구체적인 예로는 나트륨 4-HB 및 칼륨 4-HB가 있다. 따라서, 4-하이드록시부탄산, 4-HB, 4-하이드록시부티레이트, 4-하이드록시부타노에이트, 감마-하이드록시부티르산 및 GHB와 같은 용어들뿐만 아니라 당해 분야에서 인정되는 다른 명칭들은 본 발명에서 유의어로 사용된다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "단량체성"이란 용어는 4-HB에 관하여 사용될 때 비-중합체성 또는 유도체화되지 않은 형태의 4-HB를 의미하는데 사용된다. 중합체성 4-HB의 구체적인 예는 폴리-4-하이드록시부탄산, 및 예를 들어 4-HB 및 3-HB의 공중합체를 포함한다. 4-HB의 유도체화된 형태의 구체적인 예는 4-HB-CoA이다. 다른 중합체성 4-HB 형태 및 4-HB의 다른 유도체화된 형태들은 또한 당해 분야에 공지되어 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "γ-부티로락톤"이란 용어는 화학식 C4H6O2 및 86.089 g/mol의 분자량을 갖는 락톤을 의미하는데 사용된다. 화학적 화합물 γ-부티로락톤은 또한 당해 분야에서 GBL, 부티로락톤, 1,4-락톤, 4-부티로락톤, 4-하이드록시부티르산 락톤 및 감마-하이드록시부티르산 락톤으로서 공지되어 있다. 본 발명에 사용된 바와 같은 상기 용어는 상기 화합물의 다양한 염 형태들 중 임의의 형태를 포함함을 의미한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "1,4-부탄다이올"이란 용어는 화학식 C4H10O2 및 90.12 g/mol의 분자량을 갖는 2 개의 하이드록시 그룹을 수반하는, 알칸 부탄의 알콜 유도체를 의미하는데 사용된다. 화학적 화합물 1,4-부탄다이올은 또한 당해 분야에 BDO로서 공지되어 있으며 본 발명에서 BDO계 화합물로서 언급되는 화합물 계열의 화학적 중간체 또는 전구체이다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "4-하이드록시부탄알"이란 용어는 화학식 C4H8O2 및 88.10512 g/mol의 분자량을 갖는 알데하이드를 의미하는데 사용된다. 화학적 화합물 4-하이드록시부탄알(4-HBal)은 또한 당해 분야에 4-하이드록시부티르알데하이드로서 또한 공지되어 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "푸트레신"이란 용어는 화학식 C4H12N2 및 88.15148 g/mol의 분자량을 갖는 다이아민을 의미하는데 사용된다. 화학적 화합물 푸트레신은 또한 당해 분야에 1,4-부탄다이아민, 1,4-다이아미노부탄, 부틸렌다이아민, 테트라메틸렌다이아민, 테트라메틸다이아민, 및 1,4-부틸렌다이아민으로서 또한 공지되어 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "테트라하이드로퓨란"이란 용어는 화학식 C4H8O 및 72.11 g/mol의 분자량을 갖는 방향족 화합물의 완전히 수소화된 동족체에 상응하는 헤테로사이클릭 유기 화합물을 의미하는데 사용된다. 화학적 화합물 테트라하이드로퓨란은 또한 당해 분야에서 THF, 테트라하이드로퓨란, 1,4-에폭시부탄, 부틸렌 옥사이드, 사이클로테트라메틸렌 옥사이드, 옥사사이클로펜탄, 다이에틸렌 옥사이드, 옥솔란, 퓨라니딘, 하이드로퓨란, 테트라-메틸렌 옥사이드로서 공지되어 있다. 본 발명에 사용된 바와 같은 상기 용어는 상기 화합물의 다양한 염 형태들 중 임의의 형태를 포함함을 의미한다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "CoA" 또는 "조효소 A"란 용어는 활성 효소 시스템을 형성하기 위해 다수의 효소(주효소) 활성에 필요한 유기 보조인자 또는 보결분자단(효소의 비 단백질 부분)을 의미한다. 조효소 A는 몇몇 축합 효소에서 작용하고, 아세틸 또는 다른 아실 그룹 전달 및 지방산 합성 및 산화, 피루베이트 산화 및 다른 아세틸화에 작용한다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "실질적으로 혐기성"이란 용어는 배양 또는 생육 조건과 관련하여 사용될 때, 산소의 양이 액체 배지 중의 용존 산소 포화의 약 10% 미만임을 의미한다. 상기 용어는 또한 약 1% 미만의 산소 분위기에서 유지되는 액체 또는 고체 배지의 밀폐된 챔버를 포함함을 의미한다.
본 발명의 비-천연 미생물 유기체는 안정한 유전자 변경을 함유할 수 있으며, 이는 상기 변경의 상실 없이 5 세대를 초과하여 배양될 수 있는 미생물에 적용된다. 일반적으로, 안정한 유전자 변경은 10 세대를 초과하여 지속하는 변형을 포함하며, 특히 안정한 변형은 약 25 세대를 초과하여 지속할 것이고, 보다 특히 안정한 유전자 변형은 무한을 포함하여, 50 세대를 초과할 것이다.
당해 분야의 숙련가들은 본 발명에 예시된 대사 변형을 포함하여, 유전자 변경을 에스케리키아 콜라이와 같은 적합한 숙주 유기체 및 그의 상응하는 대사 반응 또는 목적하는 유전 물질에 적합한 공급원 유기체, 예를 들어 목적하는 대사 경로에 대한 유전자들에 관하여 개시한다. 그러나, 광범위하게 다양한 유기체의 완전한 게놈 서열화 및 상기 유전체학 분야의 높은 기술 수준의 제공으로, 당해 분야의 숙련가들은 본 발명에 제공된 교시 및 지침을 필수적으로 모든 다른 유기체들에 쉽게 적용할 수 있을 것이다. 예를 들어, 본 발명에 예시된 에스케리키아 콜라이 대사 변경을, 상기 기준 종 이외의 종들로부터 동일하거나 유사한 암호화 핵산을 통합시킴으로써 다른 종들에 쉽게 적용할 수 있다. 상기와 같은 유전자 변경은 예를 들어 일반적으로 종 상동 기관의 유전자 변경, 및 특히 이종 상동체, 상동체 또는 비-이종 상동성 유전자 치환을 포함한다.
이종 상동체(ortholog)는 수직 혈통에 의해 관계되고 상이한 유기체에서 실질적으로 동일한 작용들을 맡고 있는 유전자 또는 유전자들이다. 예를 들어, 마우스 에폭사이드 하이드롤라제 및 인간 에폭사이드 하이드롤라제를 에폭사이드의 가수분해의 생물학적 작용에 대해 이종 상동체인 것으로 간주할 수 있다. 유전자들은 예를 들어 이들이 동종임을 가리키기에 충분한 양의 서열 유사성을 공유하거나 공통 조상으로부터의 진화에 의해 관계되는 경우 수직 혈통에 의해 관계된다. 유전자들을 또한 이들이 3 차원 구조는 공유하지만 이들이 1 차 서열 유사성을 식별할 수 없을 정도로, 공통 조상으로부터 진화했음을 가리키기에 충분한 양의 서열 유사성을 반드시 갖지는 않는 경우 이종 상동체인 것으로 간주할 수 있다. 이종 상동성인 유전자는 약 25% 내지 100% 아미노산 서열 일치성의 서열 유사성을 갖는 단백질들을 암호화한다. 25% 미만의 아미노산 유사성을 공유하는 단백질들을 암호화하는 유전자를 또한 이들의 3차원 구조가 또한 유사성을 보이는 경우 수직 혈통에 의해 발생한 것으로 간주할 수 있다. 조직 플라스미노겐 활성화제 및 엘라스타제를 포함한 효소들의 세린 프로테아제 패밀리의 구성원들은 공통 조상으로부터 수직 혈통에 의해 발생한 것으로 간주된다.
이종 상동체는 예를 들어 진화를 통해 구조 또는 전체 활성이 갈라진 유전자 또는 그의 암호화된 유전자 산물을 포함한다. 예를 들어, 하나의 종이 2 개의 작용을 나타내는 유전자 산물을 암호화하고 상기와 같은 작용들이 두 번째 종에서 별도의 유전자로 분리된 경우, 상기 3 개의 유전자 및 이들의 상응하는 산물은 이종 상동체인 것으로 간주된다. 생육-결합된 생산을 포함하여, 상기 생화학적 생성물의 생산을 위해서, 당해 분야의 숙련가들은 비-천연 미생물의 제작을 위해 도입하거나 파괴하려는 대사 활성을 갖는 이종 상동성 유전자를 선택해야 함을 알 것이다. 분리 가능한 활성들을 나타내는 이종 상동체의 예는 별개의 활성들이 2 개 이상의 종 사이에서 또는 단일 종 내에서 별도의 유전자 산물들로 분리된 경우이다. 구체적인 예는 세린 프로테아제 활성의 2 가지 유형인 엘라스타제 단백질 분해 및 플라스미노겐 단백질 분해의, 플라스미노겐 활성화제 및 엘라스타제로서의 별개의 분자들로의 분리이다. 두 번째 예는 마이코플라스마 5'-3' 엑소뉴클레아제와 드로소필라 DNA 폴리머라제 III 활성의 분리이다. 상기 첫 번째 종으로부터의 DNA 폴리머라제를 두 번째 종으로부터의 엑소뉴클레아제 또는 폴리머라제 중 어느 하나 또는 이들 모두에 대한 이종 상동체인 것으로, 또 이와 역으로 간주할 수 있다.
대조적으로, 상동체(paralog)는 예를 들어 복제에 이은 진화적 분기에 의해 관계된 동족체이며 유사하거나 공통의, 그러나 동일하지는 않은 작용들을 갖는다. 상동체는 예를 들어 동일한 종으로부터 또는 상이한 종으로부터 기원하거나 유래할 수 있다. 예를 들어, 미생물 에폭사이드 하이드롤라제(에폭사이드 하이드롤라제 I) 및 용해성 에폭사이드 하이드롤라제(에폭사이드 하이드롤라제 II)는 이들이 별개의 반응들을 촉매화하고 동일한 종에서 별개의 작용을 갖는, 공통의 조상으로부터 함께 진화한 2 개의 별개의 효소를 나타내므로 상동체로서 간주될 수 있다. 상동체는 서로 상당한 서열 유사성을 갖는 동일한 종으로부터의 단백질이며, 이는 이들이 동종이거나 또는 공통의 조상으로부터 공 진화를 통해 관계됨을 암시한다. 상동성 단백질 패밀리의 그룹은 HipA 동족체, 루시페라제 유전자, 펩티다제 등을 포함한다.
비-이종 상동성(nonorthologous) 유전자 치환은 상이한 종들에서 기준 유전자 작용을 대체할 수 있는 하나의 종으로부터의 비-이종 상동성 유전자이다. 치환은 예를 들어 상이한 종들에서의 기준 작용에 비해 기원 종들에서 실질적으로 동일하거나 유사한 작용을 수행할 수 있음을 포함한다. 일반적으로 비-이종 상동성 유전자 치환을 상기 기준 작용을 암호화하는 기지 유전자와 구조적으로 관련된 것으로서 식별하겠지만, 구조적으로는 덜 관련되었지만 작용상 유사한 유전자들 및 그들의 상응하는 유전자 산물들은 그럼에도 불구하고 여전히 본 발명에 사용되는 상기 용어의 의미 내에 있을 것이다. 작용 유사성은 예를 들어 치환하고자 하는 작용을 암호화하는 유전자에 비해 비-이종 상동성 유전자 산물의 활성 부위 또는 결합 부위에서 적어도 일부의 구조 유사성을 필요로 한다. 따라서, 비-이종 상동성 유전자는 예를 들어 상동체 또는 관련되지 않은 유전자를 포함한다.
따라서, 4-HB, GBL, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 및/또는 푸트레신 생합성 능력을 갖는 본 발명의 비-천연 미생물 유기체의 동정 및 제작에 있어서, 당해 분야의 숙련가들은 대사 변형의 확인이 이종 상동체의 동정 및 포함 또는 불활성화를 포함할 수 있도록 본 발명에 제공된 교시 및 지침을 특정 종들에 적용함을 이해할 것이다. 당해 분야의 숙련가들은 또한 상동체 및/또는 비-이종 상동성 유전자 치환이 유사하거나 또는 실질적으로 유사한 대사 반응을 촉매화하는 효소를 암호화하는 기준 미생물 중에 존재하는 만큼, 이들 진화에 의해 관계된 유전자들을 사용할 수 있다.
이종 상동체, 상동체 및 비-이종 상동성 유전자 치환을 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지된 방법에 의해 측정할 수 있다. 예를 들어, 2 개의 폴리펩타이드에 대한 핵산 또는 아미노산 서열의 검사는 상기 두 비교된 서열들 간의 서열 일치성 및 유사성을 밝힐 것이다. 상기와 같은 유사성을 근거로, 당해 분야의 숙련가는 상기 유사성이 상기 단백질들이 공통 조상으로부터 진화를 통해 관계됨을 가리킬 만큼 충분히 높은지를 결정할 수 있다. 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지된 연산, 예를 들어 Align, BLAST, Clustal W 등은 원 서열 유사성 또는 일치성을 비교하고 측정하며, 중량 또는 점수를 지정할 수 있는 상기 서열 중 틈의 존재 또는 유의수준을 또한 측정할 수 있다. 상기와 같은 연산은 또한 당해 분야에 공지되어 있으며 뉴클레오타이드 서열 유사성 또는 일치성의 측정에 유사하게 적용될 수 있다. 관련성을 결정하기에 충분한 유사성에 대한 매개변수들을, 통계학적 유사성을 계산하기 위해 널리 공지된 방법, 또는 랜덤 폴리펩타이드에서 유사한 합치를 발견할 기회, 및 상기 측정된 합치의 유의수준을 근거로 측정한다. 2 개 이상 서열들의 컴퓨터 비교를 또한 경우에 따라 당해 분야의 숙련가들에 의해 가시적으로 최적화할 수 있다. 관련된 유전자 산물들 또는 단백질들은 높은 유사성, 예를 들어 25% 내지 100% 서열 일치성을 가질 것으로 예상될 수 있다. 관련되지 않은 단백질들은, 충분한 크기의 데이터베이스를 스캐닝하는 경우(약 5%), 우연히 발생할 것으로 예상되는 바와 같이 필수적으로 동일한 일치성을 가질 수 있다. 5% 내지 24%의 서열은, 비교된 서열들이 관련 있다는 결론을 내릴 만큼 충분한 상동성을 나타낼 수도, 나타내지 않을 수도 있다. 상기 데이터 세트의 크기가 제공된, 상기와 같은 합치의 유의수준을 측정하기 위한 추가적인 통계학적 분석을 이들 서열의 관련성을 측정하기 위해 수행할 수 있다.
예를 들어 BLAST 연산을 사용하는 2 개 이상 서열의 관련성을 측정하기 위한 예시적인 매개변수들을 하기에 열거할 수 있다. 간단히, 아미노산 서열 정렬을 BLASTP 버전 2.0.8(1999년 1월 5일) 및 하기의 매개변수들을 사용하여 수행할 수 있다: 행렬: 0 BLOSUM62; 간격 끊김(gap open): 11; 간격 연장(gap extension): 1; x_드롭오프: 50; 예상: 10.0; 워드크기: 3; 필터: 온. 핵산 서열 정렬을 BLASTN 버전 2.0.6(1998년 9월 16일) 및 하기의 매개변수들을 사용하여 수행할 수 있다: 합치: 1; 불합치: -2; 간격 끊김: 5; 간격 연장: 2; x_드롭오프: 50; 예상: 10.0; 워드크기: 11; 필터: 오프. 당해 분야의 숙련가들은 상기 매개변수들에 대해 예를 들어 상기 비교의 엄격성을 증가시키거나 감소시키고 2 개 이상 서열의 관련성을 측정하기 위해 변형을 수행할 수 있음을 알 것이다.
4-하이드록시부타노에이트 데하이드로게나제, CoA-독립적인 숙시닉 세미알데하이드 데하이드로게나제, 숙시닐-CoA 신시타제, CoA-의존성 숙시닉 세미알데하이드 데하이드로게나제, 글루타메이트:숙시닉 세미알데하이드 트랜스아미나제, 알파-케토글루타레이트 데카복실라제, 또는 글루타메이트 데카복실라제를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 4-하이드록시부탄산(4-HB) 생합성 경로를 갖는 미생물 유기체를 포함한 비-천연 미생물 생체촉매 또는 미생물 유기체를 본 발명에 개시하며, 여기에서 상기 외래 핵산은 단량체성 4-하이드록시부탄산(4-HB)을 생산하기에 충분한 양으로 발현된다. 4-하이드록시부타노에이트 데하이드로게나제를 또한 4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제 또는 4-HB 데하이드로게나제로서 지칭한다. 숙시닐-CoA 신시타제를 또한 숙시닐-CoA 신타제 또는 숙시닐-CoA 리가제로서 지칭한다.
4-하이드록시부타노에이트 데하이드로게나제, 숙시닐-CoA 신시타제, CoA-의존성 숙시닉 세미알데하이드 데하이드로게나제, 또는 α-케토글루타레이트 데카복실라제를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 4-하이드록시부탄산(4-HB) 생합성 경로를 갖는 미생물 유기체를 포함한 비-천연 미생물 생체촉매 또는 미생물 유기체를 또한 본 발명에 개시하며, 여기에서 상기 외래 핵산은 단량체성 4-하이드록시부탄산(4-HB)을 생산하기에 충분한 양으로 발현된다.
상기 비-천연 미생물 생체 촉매 또는 미생물 유기체는 본 발명의 화합물을 생합성적으로 생산하기 위한 대사 반응들의 조합을 사용하는 미생물 유기체를 포함할 수 있다. 상기 생합성된 화합물을 세포 내로 생산하고/하거나 배양 배지에 분비시킬 수 있다. 상기 비-천연 미생물에 의해 생산되는 예시적인 화합물은 예를 들어 4-하이드록시부탄산, 1,4-부탄다이올 및 γ-부티로락톤을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 비-천연 미생물 유기체를 4-HB를 생산하도록 조작한다. 상기 화합물은 1,4-부탄다이올계 화합물로의 유용한 하나의 입구이다. 숙시네이트로부터, 숙시닐-CoA를 통해 숙시네이트로부터, 또는 α-케토글루타레이트로부터 4-HB의 형성을 위한 생화학적 반응들을 도 1의 단계 1 내지 8에 도시한다.
BDO, 4-HBal, 4-HBCoA 및/또는 푸트레신 경로의 적합한 효소들의 임의의 조합을, 출발 성분으로부터 BDO, 4-HBal, 4-HBCoA 및/또는 푸트레신 생성물로의 전환이 성취되는 한, 사용할 수 있는 것으로 생각된다. 따라서, 본 발명에 개시된 대사 경로들 중 임의의 경로를 사용할 수 있는 것으로 생각되며 당해 분야의 숙련가들에게 본 발명에 개시된 바와 같이, 목적하는 경로를 성취하기 위해 적합한 효소를 선택하는 방법은 잘 이해될 것이다.
또 다른 실시태양에서, 1,4-부탄다이올(BDO)을 생산하기에 충분한 양으로 발현된 BDO 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 BDO 경로를 갖는 미생물 유기체를 포함하는 비-천연 미생물 유기체를 본 발명에 개시하며, 상기 BDO 경로는 4-아미노부티레이트 CoA 트랜스퍼라제, 4-아미노부티릴-CoA 하이드롤라제, 4-아미노부티레이트-CoA 리가제, 4-아미노부티릴-CoA 옥시도리덕타제(탈아민화), 4-아미노부티릴-CoA 트랜스아미나제, 또는 4-하이드록시부티릴-CoA 데하이드로게나제를 포함한다(실시예 VII 표 17 참조). 상기 BDO 경로는 4-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(알콜 형성), 4-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제, 또는 1,4-부탄다이올 데하이드로게나제를 추가로 포함할 수 있다.
당해 분야의 숙련가들은 본 발명에 개시된 바와 같이 상기 경로들의 다양한 조합들을 사용할 수 있을 것으로 생각된다. 예를 들어 비-천연 미생물 유기체에서 상기 핵산은 4-아미노부티레이트 CoA 트랜스퍼라제, 4-아미노부티릴-CoA 하이드롤라제, 4-아미노부티레이트-CoA 리가제, 4-아미노부티릴-CoA 옥시도리덕타제(탈아민화), 또는 4-아미노부티릴-CoA 트랜스아미나제, 및 4-하이드록시부티릴-CoA 데하이드로게나제를 암호화할 수 있다. 다른 예시적인 조합들은 하기에 구체적으로 개시되며 도 8 내지 13에서 추가로 발견될 수 있다. 예를 들어, 상기 BDO 경로는 4-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(알콜 형성), 4-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제, 또는 1,4-부탄다이올 데하이드로게나제를 추가로 포함할 수 있다.
BDO를 생산하기에 충분한 양으로 발현된 BDO 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 BDO 경로를 갖는 미생물 유기체를 포함하는 비-천연 미생물 유기체를 본 발명에 추가로 개시하며, 상기 BDO 경로는 4-아미노부티레이트 CoA 트랜스퍼라제, 4-아미노부티릴-CoA 하이드롤라제, 4-아미노부티레이트-CoA 리가제, 4-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(알콜 형성), 4-아미노부티릴-CoA 리덕타제, 4-아미노부탄-1-올 데하이드로게나제, 4-아미노부탄-1-올 옥시도리덕타제(탈아민화) 또는 4-아미노부탄-1-올 트랜스아미나제를 포함하고(실시예 VII 및 표 18 참조), 1,4-부탄다이올 데하이드로게나제를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 외래 핵산은 4-아미노부티레이트 CoA 트랜스퍼라제, 4-아미노부티릴-CoA 하이드롤라제, 또는 4-아미노부티레이트-CoA 리가제, 4-아미노부티릴-CoA 리덕타제(알콜 형성), 및 4-아미노부탄-1-올 옥시도리덕타제(탈아민화) 또는 4-아미노부탄-1-올 트랜스아미나제를 암호화할 수 있다. 또한, 상기 핵산은 4-아미노부티레이트 CoA 트랜스퍼라제, 4-아미노부티릴-CoA 하이드롤라제, 또는 4-아미노부티레이트-CoA 리가제; 4-아미노부티릴-CoA 리덕타제; 4-아미노부탄-1-올 데하이드로게나제; 및 4-아미노부탄-1-올 옥시도리덕타제(탈아민화) 또는 4-아미노부탄-1-올 트랜스아미나제를 암호화할 수 있다.
BDO를 생산하기에 충분한 양으로 발현된 BDO 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 BDO 경로를 갖는 미생물 유기체를 포함하는 비-천연 미생물 유기체를 본 발명에 추가로 개시하며, 상기 BDO 경로는 4-아미노부티레이트 키나제, 4-아미노부티르알데하이드 데하이드로게나제(인산화), 4-아미노부탄-1-올 데하이드로게나제, 4-아미노부탄-1-올 옥시도리덕타제(탈아민화), 4-아미노부탄-1-올 트랜스아미나제, [(4-아미노부탄올일)옥시]포스폰산 옥시도리덕타제(탈아민화), [(4-아미노부탄올일)옥시]포스폰산 트랜스아미나제, 4-하이드록시부티릴-포스페이트 데하이드로게나제, 또는 4-하이드록시부티르알데하이드 데하이드로게나제(인산화)를 포함한다(실시예 VII 및 표 19 참조). 예를 들어, 상기 외래 핵산은 4-아미노부티레이트 키나제; 4-아미노부티르알데하이드 데하이드로게나제(인산화); 4-아미노부탄-1-올 데하이드로게나제; 및 4-아미노부탄-1-올 옥시도리덕타제(탈아민화) 또는 4-아미노부탄-1-올 트랜스아미나제를 암호화할 수 있다. 한편으로, 상기 외래 핵산은 4-아미노부티레이트 키나제; [(4-아미노부탄올일)옥시]포스폰산 옥시도리덕타제(탈아민화) 또는 [(4-아미노부탄올일)옥시]포스폰산 트랜스아미나제; 4-하이드록시부티릴-포스페이트 데하이드로게나제; 및 4-하이드록시부티르알데하이드 데하이드로게나제(인산화)를 암호화할 수 있다.
BDO를 생산하기에 충분한 양으로 발현된 BDO 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 BDO 경로를 갖는 미생물 유기체를 포함하는 비-천연 미생물 유기체를 본 발명에 추가로 개시하며, 상기 BDO 경로는 알파-케토글루타레이트 5-키나제, 2,5-다이옥소펜타노익 세미알데하이드 데하이드로게나제(인산화), 2,5-다이옥소펜탄산 리덕타제, 알파-케토글루타레이트 CoA 트랜스퍼라제, 알파-케토글루타릴-CoA 하이드롤라제, 알파-케토글루타릴-CoA 리가제, 알파-케토글루타릴-CoA 리덕타제, 5-하이드록시-2-옥소펜탄산 데하이드로게나제, 알파-케토글루타릴-CoA 리덕타제(알콜 형성), 5-하이드록시-2-옥소펜탄산 데카복실라제, 또는 5-하이드록시-2-옥소펜탄산 데하이드로게나제(탈카복실화)를 포함한다(실시예 VIII 및 표 20 참조). 상기 BDO 경로는 4-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(알콜 형성), 4-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제 또는 1,4-부탄다이올 데하이드로게나제를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 외래 핵산은 알파-케토글루타레이트 5-키나제; 2,5-다이옥소펜타노익 세미알데하이드 데하이드로게나제(인산화); 2,5-다이옥소펜탄산 리덕타제; 및 5-하이드록시-2-옥소펜탄산 데카복실라제를 암호화할 수 있다. 한편으로, 상기 외래 핵산은 알파-케토글루타레이트 5-키나제; 2,5-다이옥소펜타노익 세미알데하이드 데하이드로게나제(인산화); 2,5-다이옥소펜탄산 리덕타제; 및 5-하이드록시-2-옥소펜탄산 데하이드로게나제(탈카복실화)를 암호화할 수 있다. 한편으로, 상기 외래 핵산은 알파-케토글루타레이트 CoA 트랜스퍼라제, 알파-케토글루타릴 CoA 하이드롤라제, 또는 알파-케토글루타릴-CoA 리가제; 알파-케토글루타릴-CoA 리덕타제, 5-하이드록시-2-옥소펜탄산 데하이드로게나제; 및 5-하이드록시-2-옥소펜탄산 데카복실라제를 암호화할 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 상기 외래 핵산은 알파-케토글루타레이트 CoA 트랜스퍼라제, 알파-케토글루타릴 CoA 하이드롤라제, 또는 알파-케토글루타릴-CoA 리가제; 알파-케토글루타릴-CoA 리덕타제, 5-하이드록시-2-옥소펜탄산 데하이드로게나제; 및 5-하이드록시-2-옥소펜탄산 데하이드로게나제(탈카복실화)를 암호화할 수 있다. 한편으로, 상기 외래 핵산은 알파-케토글루타레이트 CoA 트랜스퍼라제, 알파-케토글루타릴 CoA 하이드롤라제, 또는 알파-케토글루타릴-CoA 리가제; 알파-케토글루타릴-CoA 리덕타제(알콜 형성); 및 5-하이드록시-2-옥소펜탄산 데카복실라제를 암호화할 수 있다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 외래 핵산은 알파-케토글루타레이트 CoA 트랜스퍼라제, 알파-케토글루타릴 CoA 하이드롤라제, 또는 알파-케토글루타릴-CoA 리가제; 알파-케토글루타릴-CoA 리덕타제(알콜 형성); 및 5-하이드록시-2-옥소펜탄산 데하이드로게나제(탈카복실화)를 암호화할 수 있다.
BDO를 생산하기에 충분한 양으로 발현된 BDO 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 BDO 경로를 갖는 미생물 유기체를 포함하는 비-천연 미생물 유기체를 본 발명에 추가로 개시하며, 상기 BDO 경로는 글루타메이트 CoA 트랜스퍼라제, 글루타밀-CoA 하이드롤라제, 글루타밀-CoA 리가제, 글루타메이트 5-키나제, 글루타메이트-5-세미알데하이드 데하이드로게나제(인산화), 글루타밀-CoA 리덕타제, 글루타메이트-5-세미알데하이드 리덕타제, 글루타밀-CoA 리덕타제(알콜 형성), 2-아미노-5-하이드록시펜탄산 옥시도리덕타제(탈아민화), 2-아미노-5-하이드록시펜탄산 트랜스아미나제, 5-하이드록시-2-옥소펜탄산 데카복실라제, 5-하이드록시-2-옥소펜탄산 데하이드로게나제(탈카복실화)를 포함한다(실시예 IX 및 표 21 참조). 예를 들어, 상기 외래 핵산은 글루타메이트 CoA 트랜스퍼라제, 글루타밀-CoA 하이드롤라제, 또는 글루타밀-CoA 리가제; 글루타밀-CoA 리덕타제; 글루타메이트-5-세미알데하이드 리덕타제; 2-아미노-5-하이드록시펜탄산 옥시도리덕타제(탈아민화) 또는 2-아미노-5-하이드록시펜탄산 트랜스아미나제; 및 5-하이드록시-2-옥소펜탄산 데카복실라제 또는 5-하이드록시-2-옥소펜탄산 데하이드로게나제(탈카복실화)를 암호화할 수 있다. 한편으로, 상기 외래 핵산은 글루타메이트 5-키나제; 글루타메이트-5-세미알데하이드 데하이드로게나제(인산화); 글루타메이트-5-세미알데하이드 리덕타제; 2-아미노-5-하이드록시펜탄산 옥시도리덕타제(탈아민화) 또는 2-아미노-5-하이드록시펜탄산 트랜스아미나제; 및 5-하이드록시-2-옥소펜탄산 데카복실라제 또는 5-하이드록시-2-옥소펜탄산 데하이드로게나제(탈카복실화)를 암호화할 수 있다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 외래 핵산은 글루타메이트 CoA 트랜스퍼라제, 글루타밀-CoA 하이드롤라제, 또는 글루타밀-CoA 리가제; 글루타밀-CoA 리덕타제(알콜 형성); 2-아미노-5-하이드록시펜탄산 옥시도리덕타제(탈아민화) 또는 2-아미노-5-하이드록시펜탄산 트랜스아미나제; 및 5-하이드록시-2-옥소펜탄산 데카복실라제 또는 5-하이드록시-2-옥소펜탄산 데하이드로게나제(탈카복실화)를 암호화할 수 있다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 외래 핵산은 글루타메이트 5-키나제; 글루타메이트-5-세미알데하이드 데하이드로게나제(인산화); 2-아미노-5-하이드록시펜탄산 옥시도리덕타제(탈아민화) 또는 2-아미노-5-하이드록시펜탄산 트랜스아미나제; 및 5-하이드록시-2-옥소펜탄산 데카복실라제 또는 5-하이드록시-2-옥소펜탄산 데하이드로게나제(탈카복실화)를 암호화할 수 있다.
BDO를 생산하기에 충분한 양으로 발현된 BDO 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 BDO 경로를 갖는 미생물 유기체를 포함하는 비-천연 미생물 유기체를 본 발명에 추가로 개시하며, 상기 BDO 경로는 3-하이드록시부티릴-CoA 데하이드로게나제, 3-하이드록시부티릴-CoA 데하이드라타제, 비닐아세틸-CoA Δ-아이소머라제, 또는 4-하이드록시부티릴-CoA 데하이드라타제를 포함한다(실시예 X 및 표 22 참조). 예를 들어, 상기 외래 핵산은 3-하이드록시부티릴-CoA 데하이드로게나제; 3-하이드록시부티릴-CoA 데하이드라타제; 비닐아세틸-CoA Δ-아이소머라제; 및 4-하이드록시부티릴-CoA 데하이드라타제를 암호화할 수 있다.
BDO를 생산하기에 충분한 양으로 발현된 BDO 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 BDO 경로를 갖는 미생물 유기체를 포함하는 비-천연 미생물 유기체를 본 발명에 추가로 개시하며, 상기 BDO 경로는 호모세린 데아미나제, 호모세린 CoA 트랜스퍼라제, 호모세린-CoA 하이드롤라제, 호모세린-CoA 리가제, 호모세린-CoA 데아미나제, 4-하이드록시부트-2-에노일-CoA 트랜스퍼라제, 4-하이드록시부트-2-에노일-CoA 하이드롤라제, 4-하이드록시부트-2-에노일-CoA 리가제, 4-하이드록시부트-2-에노에이트 리덕타제, 4-하이드록시부티릴-CoA 트랜스퍼라제, 4-하이드록시부티릴-CoA 하이드롤라제, 4-하이드록시부티릴-CoA 리가제, 또는 4-하이드록시부트-2-에노일-CoA 리덕타제를 포함한다(실시예 XI 및 표 23 참조). 예를 들어 상기 외래 핵산은 호모세린 데아미나제; 4-하이드록시부트-2-에노일-CoA 트랜스퍼라제, 4-하이드록시부트-2-에노일-CoA 하이드롤라제, 4-하이드록시부트-2-에노일-CoA 리가제; 4-하이드록시부트-2-에노일-CoA 리덕타제를 암호화할 수 있다. 한편으로, 상기 외래 핵산은 호모세린 CoA 트랜스퍼라제, 호모세린-CoA 하이드롤라제, 또는 호모세린-CoA 리가제; 호모세린-CoA 데아미나제; 및 4-하이드록시부트-2-에노일-CoA 리덕타제를 암호화할 수 있다. 추가의 실시태양에서, 상기 외래 핵산은 호모세린 데아미나제; 4-하이드록시부트-2-에노에이트 리덕타제; 및 4-하이드록시부티릴-CoA 트랜스퍼라제, 4-하이드록시부티릴-CoA 하이드롤라제, 또는 4-하이드록시부티릴-CoA 리가제를 암호화할 수 있다. 한편으로, 상기 외래 핵산은 호모세린 CoA 트랜스퍼라제, 호모세린-CoA 하이드롤라제, 또는 호모세린-CoA 리가제; 호모세린-CoA 데아미나제; 및 4-하이드록시부트-2-에노일-CoA 리덕타제를 암호화할 수 있다.
BDO를 생산하기에 충분한 양으로 발현된 BDO 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 BDO 경로를 갖는 미생물 유기체를 포함하는 비-천연 미생물 유기체를 본 발명에 추가로 개시하며, 상기 BDO 경로는 숙시닐-CoA 리덕타제(알콜 형성), 4-하이드록시부티릴-CoA 하이드롤라제, 4-하이드록시부티릴-CoA 리가제, 4-하이드록시부탄알 데하이드로게나제(인산화)를 포함한다(표 15 참조). 상기와 같은 BDO 경로는 숙시닐-CoA 리덕타제, 4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제, 4-하이드록시부티릴-CoA 트랜스퍼라제, 4-하이드록시부티레이트 키나제, 포스포트랜스-4-하이드록시부티릴라제, 4-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제, 4-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(알콜 형성), 또는 1,4-부탄다이올 데하이드로게나제를 추가로 포함할 수 있다.
BDO를 생산하기에 충분한 양으로 발현된 BDO 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 BDO 경로를 갖는 미생물 유기체를 포함하는 비-천연 미생물 유기체를 본 발명에 추가로 개시하며, 상기 BDO 경로는 글루타메이트 데하이드로게나제, 4-아미노부티레이트 옥시도리덕타제(탈아민화), 4-아미노부티레이트 트랜스아미나제, 글루타메이트 데카복실라제, 4-하이드록시부티릴-CoA 하이드롤라제, 4-하이드록시부티릴-CoA 리가제, 4-하이드록시부탄알 데하이드로게나제(인산화)를 포함한다(표 16 참조). 상기와 같은 BDO 경로는 알파-케토글루타레이트 데카복실라제, 4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제, 4-하이드록시부티릴-CoA 트랜스퍼라제, 4-하이드록시부티레이트 키나제, 포스포트랜스-4-하이드록시부티릴라제, 4-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제, 4-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(알콜 형성), 또는 1,4-부탄다이올 데하이드로게나제를 추가로 포함할 수 있다.
상술한 경로들은 단지 예시적일 뿐이다. 당해 분야의 숙련가는 목적하는 바와 같이, 적합한 BDO 경로 또는 다른 대사 경로를 획득하기 위해 본 발명에 개시된 것들로부터 적합한 경로들을 쉽게 선택할 수 있다.
본 발명은 BDO와 같은 목적하는 생성물을 증가시키거나 또는 바람직하지 못한 부산물을 감소시킴으로써 상기 생성물의 개선된 생산을 허용하는 유전자 변형된 유기체를 제공한다. 본 발명에 개시된 바와 같이, 본 발명은 1,4-부탄다이올(BDO)을 생산하기에 충분한 양으로 발현된 BDO 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 BDO 경로를 함유하는 비-천연 미생물 유기체를 제공한다. 하나의 실시태양에서, 상기 미생물 유기체를 외래 숙시닐-CoA 신시타제를 발현하도록 유전자 변형시킨다(실시예 XII 참조). 예를 들어 상기 숙시닐-CoA 신시타제는 에스케리키아 콜라이 sucCD 유전자에 의해 암호화될 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 상기 미생물 유기체를 외래 알파-케토글루타레이트 데카복실라제를 발현하도록 유전자 변형시킨다(실시예 XIII 참조). 예를 들어 상기 알파-케토글루타레이트 데카복실라제는 마이코박테리움 보비스 sucA 유전자에 의해 암호화될 수 있다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 미생물 유기체를 외래 숙시네이트 세미알데하이드 데하이드로게나제 및 4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제 및 임의로 4-하이드록시부티릴-CoA/아세틸-CoA 트랜스퍼라제를 발현하도록 유전자 변형시킨다(실시예 XIII 참조). 예를 들어 상기 숙시네이트 세미알데하이드 데하이드로게나제(CoA-의존성) 및 4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제 및 4-하이드록시부티릴-CoA/아세틸-CoA 트랜스퍼라제는 포르피로모나스 진지발리스 W83 유전자에 의해 암호화될 수 있다. 추가의 실시태양에서, 상기 미생물 유기체를 외래 부티레이트 키나제 및 포스포트랜스부티릴라제를 발현하도록 유전자 변형시킨다(실시예 XIII 참조). 예를 들어 상기 부티레이트 키나제 및 포스포트랜스부티릴라제는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 buk1 및 ptb 유전자에 의해 암호화될 수 있다.
더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 미생물 유기체를 외래 4-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제를 발현하도록 유전자 변형시킨다(실시예 XIII 참조). 예를 들어 상기 4-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제는 클로스트리듐 베이제링키이 ald 유전자에 의해 암호화될 수 있다. 또한, 본 발명의 실시태양에서, 상기 미생물 유기체를 외래 4-하이드록시부탄알 리덕타제를 발현하도록 유전자 변형시킨다(실시예 XIII 참조). 예를 들어 상기 4-하이드록시부탄알 리덕타제는 제오바실러스 써모글루코시다시우스 adh1 유전자에 의해 암호화될 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 상기 미생물 유기체를 외래 피루베이트 데하이드로게나제 서브유닛들을 발현하도록 유전자 변형시킨다(실시에 XIV 참조). 예를 들어 상기 외래 피루베이트 데하이드로게나제는 NADH 둔감성일 수 있다. 상기 피루베이트 데하이드로게나제 서브유닛은 클렙시엘라 뉴모니아 lpdA 유전자에 의해 암호화될 수 있다. 특정 실시태양에서, 상기 미생물 유기체의 피루베이트 데하이드로게나제 서브유닛 유전자들은 피루베이트 포메이트 라이아제 프로모터의 조절 하에 있을 수 있다.
더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 미생물 유기체를 호기성 호흡 억제 조절 시스템을 암호화하는 유전자를 파괴하도록 유전자 변형시킨다(실시예 XV 참조). 예를 들어, 상기 파괴는 arcA 유전자에 의할 수 있다. 상기와 같은 유기체는 말레이트 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자의 파괴를 추가로 포함할 수 있다. 추가의 실시태양에서, 상기 미생물 유기체를 외래 NADH 둔감성 시트레이트 신타제를 발현하도록 유전자 변형시킨다(실시예 XV 참조). 예를 들어, 상기 NADH 둔감성 시트레이트 신타제는 gltA, 예를 들어 gltA의 R163L 돌연변이체에 의해 암호화될 수 있다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 미생물 유기체를 외래 포스포에놀피루베이트 카복시키나제를 발현하도록 유전자 변형시킨다(실시예 XVI 참조). 예를 들어, 상기 포스포에놀피루베이트 카복시키나제는 하에모필루스 인플루엔자 포스포에놀피루베이트 카복시키나제 유전자에 의해 암호화될 수 있다.
본 발명에 개시된 바와 같이, 다수의 유전자 변형들 중 임의의 변형을 단독으로 또는 본 발명에 개시된 유전자 변형들 중 하나 이상의 다양한 조합으로 사용하여 BDO 생산 미생물 유기체에서 BDO의 생산을 증가시킬 수 있는 것으로 생각된다. 특정 실시태양에서, 상기 미생물 유기체를 BDO의 증가된 생산을 도출하는 유전자 변형들 중 어느 하나 및 전체 이하를 포함하도록 유전자 변형시킬 수 있다. 특정 실시태양에서, BDO 경로를 함유하는 미생물 유기체를 외래 숙시닐-CoA 신시타제를 발현하고; 외래 알파-케토글루타레이트 데카복실라제를 발현하고; 외래 숙시네이트 세미알데하이드 데카하이드로게나제 및 4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제 및 임의로 4-하이드록시부티릴-CoA/아세틸-CoA 트랜스퍼라제를 발현하고; 외래 부티레이트 키나제 및 포스포트랜스부티릴라제를 발현하고; 외래 4-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제를 발현하고; 외래 4-하이드록시부탄알 리덕타제를 발현하고; 외래 피루베이트 데하이드로게나제를 발현하고; 호기성 호흡 억제 조절 시스템을 암호화하는 유전자를 파괴하고; 외래 NADH 둔감성 시트레이트 신타제를 발현하고; 외래 포스포에놀피루베이트 카복시키나제를 발현하도록 유전자 변형시킬 수 있다. 개선된 생산을 위한 상기와 같은 균주들을 실시예 XII 내지 XIX에 개시한다. 따라서, 상기와 같은 균주는 상술한 변형들 이외에, 본 발명에 개시된 다른 변형들을 추가로 포함할 수 있는 것으로 생각된다. 상기와 같은 변형은 비 제한적으로 내생 락테이트 데하이드로게나제(ldhA), 알콜 데하이드로게나제(adhE), 및/또는 피루베이트 포메이트 라이아제(pflB)의 결실을 포함한다(실시예 XII 내지 XIX 및 표 28 참조).
상기 외부적으로 발현된 효소들을 암호화하는 하나 이상의 유전자가 숙주 유기체의 fimD 유전자 좌에 통합된 미생물 유기체를 추가로 제공한다(실시예 XVII 참조). 예를 들어, BDO 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 유전자를 BDO의 증가된 생산을 위해 상기 fimD 유전자 좌에 통합시킬 수 있다. BDO의 생산을 증가시키는 비-포스포트랜스퍼라제 슈크로스 흡수 시스템을 발현하는 미생물 유기체를 또한 제공한다.
본 발명에 개시된 유전자 변형된 미생물 유기체를 특정 BDO 경로 효소를 함유하는 미생물 유기체로 예시하지만, 상기와 같은 변형을 상기 유전자 변형들의 존재 하에서 증대된 생산에 적합한 BDO, 4-HBal, 4-HBCoA 및/또는 푸트레신 경로를 갖는 임의의 미생물 유기체에 포함시킬 수 있는 것으로 생각된다. 따라서 본 발명의 미생물 유기체는 본 발명에 개시된 BDO, 4-HBal, 4-HBCoA 및/또는 푸트레신 경로들 중 임의의 경로를 가질 수 있다. 예를 들어, 상기 BDO 경로는 4-하이드록시부타노에이트 데하이드로게나제, 숙시닐-CoA 신시타제, CoA-의존성 숙시닉 세미알데하이드 데하이드로게나제, 4-하이드록시부티레이트:CoA 트랜스퍼라제, 4-부티레이트 키나제, 포스포트랜스부티릴라제, 알파-케토글루타레이트 데카복실라제, 알데하이드 데하이드로게나제, 알콜 데하이드로게나제 또는 알데하이드/알콜 데하이드로게나제를 포함할 수 있다(도 1 참조). 한편으로, 상기 BDO 경로는 4-아미노부티레이트 CoA 트랜스퍼라제, 4-아미노부티릴-CoA 하이드롤라제, 4-아미노부티레이트-CoA 리가제, 4-아미노부티릴-CoA 옥시도리덕타제(탈아민화), 4-아미노부티릴-CoA 트랜스아미나제, 또는 4-하이드록시부티릴-CoA 데하이드로게나제를 포함할 수 있다(표 17 참조). 상기와 같은 BDO 경로는 4-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(알콜 형성), 4-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제, 또는 1,4-부탄다이올 데하이드로게나제를 추가로 포함할 수 있다.
또한 상기 BDO 경로는 4-아미노부티레이트 CoA 트랜스퍼라제, 4-아미노부티릴-CoA 하이드롤라제, 4-아미노부티레이트-CoA 리가제, 4-아미노부티릴-CoA 리덕타제(알콜 형성), 4-아미노부티릴-CoA 리덕타제, 4-아미노부탄-1-올 데하이드로게나제, 4-아미노부탄-1-올 옥시도리덕타제(탈아민화) 또는 4-아미노부탄-1-올 트랜스아미나제를 포함할 수 있다(표 18 참조). 또한, 상기 BDO 경로는 4-아미노부티레이트 키나제, 4-아미노부티르알데하이드 데하이드로게나제(인산화), 4-아미노부탄-1-올 데하이드로게나제, 4-아미노부탄-1-올 옥시도리덕타제(탈아민화), 4-아미노부탄-1-올 트랜스아미나제, [(4-아미노부탄올일)옥시]포스폰산 옥시도리덕타제(탈아민화), [(4-아미노부탄올일)옥시]포스폰산 트랜스아미나제, 4-하이드록시부티릴-포스페이트 데하이드로게나제, 또는 4-하이드록시부티르알데하이드 데하이드로게나제(인산화)를 포함할 수 있다(표 19 참조). 상기와 같은 경로는 1,4-부탄다이올 데하이드로게나제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 BDO 경로는 또한 알파-케토글루타레이트 5-키나제, 2,5-다이옥소펜타노익 세미알데하이드 데하이드로게나제(인산화), 2,5-다이옥소펜탄산 리덕타제, 알파-케토글루타레이트 CoA 트랜스퍼라제, 알파-케토글루타릴-CoA 하이드롤라제, 알파-케토글루타릴-CoA 리가제, 알파-케토글루타릴-CoA 리덕타제, 5-하이드록시-2-옥소펜탄산 데하이드로게나제, 알파-케토글루타릴-CoA 리덕타제(알콜 형성), 5-하이드록시-2-옥소펜탄산 데카복실라제, 또는 5-하이드록시-2-옥소펜탄산 데하이드로게나제(탈카복실화)를 포함할 수 있다(표 20 참조). 상기와 같은 BDO 경로는 4-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(알콜 형성), 4-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제 또는 1,4-부탄다이올 데하이드로게나제를 추가로 포함할 수 있다. 또한 상기 BDO 경로는 글루타메이트 CoA 트랜스퍼라제, 글루타밀-CoA 하이드롤라제, 글루타밀-CoA 리가제, 글루타메이트 5-키나제, 글루타메이트-5-세미알데하이드 데하이드로게나제(인산화), 글루타밀-CoA 리덕타제, 글루타메이트-5-세미알데하이드 리덕타제, 글루타밀-CoA 리덕타제(알콜 형성), 2-아미노-5-하이드록시펜탄산 옥시도리덕타제(탈아민화), 2-아미노-5-하이드록시펜탄산 트랜스아미나제, 5-하이드록시-2-옥소펜탄산 데카복실라제, 5-하이드록시-2-옥소펜탄산 데하이드로게나제(탈카복실화)를 포함할 수 있다(표 21 참조). 상기와 같은 BDO 경로는 4-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(알콜 형성), 4-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제, 또는 1,4-부탄다이올 데하이드로게나제를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 상기 BDO 경로는 3-하이드록시부티릴-CoA 데하이드로게나제, 3-하이드록시부티릴-CoA 데하이드라타제, 비닐아세틸-CoA Δ-아이소머라제, 또는 4-하이드록시부티릴-CoA 데하이드라타제를 포함할 수 있다(표 22 참조). 또한, 상기 BDO 경로는 호모세린 데아미나제, 호모세린 CoA 트랜스퍼라제, 호모세린-CoA 하이드롤라제, 호모세린-CoA 리가제, 호모세린-CoA 데아미나제, 4-하이드록시부트-2-에노일-CoA 트랜스퍼라제, 4-하이드록시부트-2-에노일-CoA 하이드롤라제, 4-하이드록시부트-2-에노일-CoA 리가제, 4-하이드록시부트-2-에노에이트 리덕타제, 4-하이드록시부티릴-CoA 트랜스퍼라제, 4-하이드록시부티릴-CoA 하이드롤라제, 4-하이드록시부티릴-CoA 리가제, 또는 4-하이드록시부트-2-에노일-CoA 리덕타제를 포함할 수 있다(표 23 참조). 상기와 같은 BDO 경로는 4-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(알콜 형성), 4-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제, 또는 1,4-부탄다이올 데하이드로게나제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 BDO 경로는 숙시닐-CoA 리덕타제(알콜 형성), 4-하이드록시부티릴-CoA 하이드롤라제, 4-하이드록시부티릴-CoA 리가제, 또는 4-하이드록시부탄알 데하이드로게나제(인산화)를 포함할 수 있다(표 15 참조). 상기와 같은 경로는 숙시닐-CoA 리덕타제, 4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제, 4-하이드록시부티릴-CoA 트랜스퍼라제, 4-하이드록시부티레이트 키나제, 포스포트랜스-4-하이드록시부티릴라제, 4-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제, 4-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(알콜 형성), 또는 1,4-부탄다이올 데하이드로게나제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 BDO 경로는 글루타메이트 데하이드로게나제, 4-아미노부티레이트 옥시도리덕타제(탈아민화), 4-아미노부티레이트 트랜스아미나제, 글루타메이트 데카복실라제, 4-하이드록시부티릴-CoA 하이드롤라제, 4-하이드록시부티릴-CoA 리가제, 4-하이드록시부탄알 데하이드로게나제(인산화)를 포함할 수 있다(표 16 참조). 상기와 같은 BDO 경로는 알파-케토글루타레이트 데카복실라제, 4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제, 4-하이드록시부티릴-CoA 트랜스퍼라제, 4-하이드록시부티레이트 키나제, 포스포트랜스-4-하이드록시부티릴라제, 4-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제, 4-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(알콜 형성), 또는 1,4-부탄다이올 데하이드로게나제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 4-하이드록시부탄알을 생산하기에 충분한 양으로 발현된 4-하이드록시부탄알 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 4-하이드록시부탄알 경로를 포함하는 비-천연 미생물 유기체를 추가로 제공하며, 상기 4-하이드록시부탄알 경로는 숙시닐-CoA 리덕타제(알데하이드 형성); 4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제; 및 4-하이드록시부티레이트 리덕타제를 포함한다(도 58, 단계 A-C-D 참조). 본 발명은 4-하이드록시부탄알을 생산하기에 충분한 양으로 발현된 4-하이드록시부탄알 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 4-하이드록시부탄알 경로를 포함하는 비-천연 미생물 유기체를 또한 제공하며, 상기 4-하이드록시부탄알 경로는 알파-케토글루타레이트 데카복실라제; 4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제; 및 4-하이드록시부티레이트 리덕타제를 포함한다(도 58, 단계 B-C-D).
본 발명은 4-하이드록시부탄알을 생산하기에 충분한 양으로 발현된 4-하이드록시부탄알 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 4-하이드록시부탄알 경로를 포함하는 비-천연 미생물 유기체를 추가로 제공하며, 상기 4-하이드록시부탄알 경로는 숙시네이트 리덕타제; 4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제, 및 4-하이드록시부티레이트 리덕타제를 포함한다(도 62, 단계 F-C-D 참조). 더욱 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 4-하이드록시부탄알을 생산하기에 충분한 양으로 발현된 4-하이드록시부탄알 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 4-하이드록시부탄알 경로를 포함하는 비-천연 미생물 유기체를 제공하며, 상기 4-하이드록시부탄알 경로는 알파-케토글루타레이트 데카복실라제, 또는 글루타메이트 데하이드로게나제 또는 글루타메이트 트랜스아미나제 및 글루타메이트 데카복실라제 및 4-아미노부티레이트 데하이드로게나제 또는 4-아미노부티레이트 트랜스아미나제; 4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제; 및 4-하이드록시부티레이트 리덕타제를 포함한다(도 62, 단계 B 또는 (J 또는 K)-L-(M 또는 N))-C-D 참조).
본 발명은 4-하이드록시부탄알을 생산하기에 충분한 양으로 발현된 4-하이드록시부탄알 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 4-하이드록시부탄알 경로를 포함하는 비-천연 미생물 유기체를 또한 제공하며, 상기 4-하이드록시부탄알 경로는 알파-케토글루타레이트 리덕타제; 5-하이드록시-2-옥소펜타노에이트 데하이드로게나제; 및 5-하이드록시-2-옥소펜타노에이트 데카복실라제를 포함한다(도 62, 단계 X-Y-Z 참조). 더욱 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 4-하이드록시부티릴-CoA를 생산하기에 충분한 양으로 발현된 4-하이드록시부티릴-CoA 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 4-하이드록시부티릴-CoA 경로를 포함하는 비-천연 미생물 유기체를 제공하며, 상기 4-하이드록시부티릴-CoA 경로는 알파-케토글루타레이트 리덕타제; 5-하이드록시-2-옥소펜타노에이트 데하이드로게나제; 및 5-하이드록시-2-옥소펜타노에이트 데하이드로게나제(탈카복실화)를 포함한다(도 62, 단계 X-Y-AA 참조).
본 발명은 푸트레신을 생산하기에 충분한 양으로 발현된 푸트레신 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 푸트레신 경로를 포함하는 비-천연 미생물 유기체를 추가로 제공하며, 상기 푸트레신 경로는 숙시네이트 리덕타제; 4-아미노부티레이트 데하이드로게나제 또는 4-아미노부티레이트 트랜스아미나제; 4-아미노부티레이트 리덕타제; 및 푸트레신 데하이드로게나제 또는 푸트레신 트랜스아미나제를 포함한다(도 63, 단계 F-M/N-C-D/E 참조). 더욱 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 푸트레신을 생산하기에 충분한 양으로 발현된 푸트레신 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 푸트레신 경로를 포함하는 비-천연 미생물 유기체를 제공하며, 상기 푸트레신 경로는 알파-케토글루타레이트 데카복실라제; 4-아미노부티레이트 데하이드로게나제 또는 4-아미노부티레이트 트랜스아미나제; 4-아미노부티레이트 리덕타제; 및 푸트레신 데하이드로게나제 또는 푸트레신 트랜스아미나제를 포함한다(도 63, 단계 B-M/N-C-D/E 참조). 본 발명은 푸트레신을 생산하기에 충분한 양으로 발현된 푸트레신 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 푸트레신 경로를 포함하는 비-천연 미생물 유기체를 추가로 제공하며, 상기 푸트레신 경로는 글루타메이트 데하이드로게나제 또는 글루타메이트 트랜스아미나제; 글루타메이트 데카복실라제; 4-아미노부티레이트 리덕타제; 및 푸트레신 데하이드로게나제 또는 푸트레신 트랜스아미나제를 포함한다(도 63, 단계 J/K-L-C-D/E 참조).
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 푸트레신을 생산하기에 충분한 양으로 발현된 푸트레신 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 푸트레신 경로를 포함하는 비-천연 미생물 유기체를 제공하며, 상기 푸트레신 경로는 알파-케토글루타레이트 리덕타제; 5-아미노-2-옥소펜타노에이트 데하이드로게나제 또는 5-아미노-2-옥소펜타노에이트 트랜스아미나제; 5-아미노-2-옥소펜타노에이트 데카복실라제; 및 푸트레신 데하이드로게나제 또는 푸트레신 트랜스아미나제를 포함한다(도 63, 단계 O-P/Q-R-D/E 참조). 또한 푸트레신을 생산하기에 충분한 양으로 발현된 푸트레신 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 푸트레신 경로를 포함하는 비-천연 미생물 유기체를 제공하며, 상기 푸트레신 경로는 알파-케토글루타레이트 리덕타제; 5-아미노-2-옥소펜타노에이트 데하이드로게나제 또는 5-아미노-2-옥소펜타노에이트 트랜스아미나제; 오르니틴 데하이드로게나제 또는 오르니틴 트랜스아미나제; 및 오르니틴 데카복실라제를 포함한다(도 63, 단계 O-P/Q-S/T-U 참조).
추가의 실시태양에서, 본 발명은 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 경로를 갖는 비-천연 미생물 유기체를 제공하며, 여기에서 상기 비-천연 미생물 유기체는 본 발명에 개시된 경로들 중 임의의 경로의 기질을 전환시키는 효소 또는 단백질을 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함한다(예를 들어 실시예 및 도 1, 8 내지 13, 58, 62 및 63을 참조하시오). BDO의 생산을 위한 예시적인 실시태양에서, 상기 미생물 유기체는 기질을 숙시네이트에서 숙시닐-CoA로; 숙시닐-CoA에서 숙시닉 세미알데하이드로; 숙시닉 세미알데하이드에서 4-하이드록시부티레이트로; 4-하이드록시부티레이트에서 4-하이드록시부티릴-포스페이트로; 4-하이드록시부티릴-포스페이트에서 4-하이드록시부티릴-CoA로; 4-하이드록시부티릴-CoA에서 4-하이드록시부탄알로; 및 4-하이드록시부탄알에서 1,4-부탄다이올로 이루어진 그룹 중에서 선택된 생성물로 전환시킬 수 있다. 4-HBal의 생산을 위한 경로에서, 미생물 유기체는 예를 들어 숙시네이트를 숙시닉 세미알데하이드로; 숙시닉 세미알데하이드를 4-하이드록시부티레이트로; 및 4-하이드록시부티레이트를 4-하이드록시부탄알로 전환시킬 수 있다. 상기와 같은 유기체는 BDO를 생산하기 위해서 4-하이드록시부탄알을 1,4-부탄다이올로 전환시키는 능력을 추가로 포함할 수 있다. 4-HBal의 생산을 위한 더욱 또 다른 경로는 예를 들어 알파-케토글루타레이트의 숙시닉 세미알데하이드로; 숙시닉 세미알데하이드의 4-하이드록시부티레이트로; 및 4-하이드록시부티레이트의 4-하이드록시부탄알로의 경로일 수 있다. 4-HBal의 생산을 위한 또 다른 경로는 예를 들어 알파-케토글루타레이트의 2,5-다이옥소펜탄산으로; 2,5-다이옥소펜탄산의 5-하이드록시-2-옥소펜타노산으로; 및 5-하이드록시-2-옥소펜탄산의 4-하이드록시부탄알로의 경로일 수 있다. 예시적인 4-하이드록시부티릴-CoA 경로는 예를 들어 알파-케토글루타레이트의 2,5-다이옥소펜탄산으로; 2,5-다이옥소펜탄산의 5-하이드록시-2-옥소펜탄산으로; 및 5-하이드록시-2-옥소펜탄산의 4-하이드록시부티릴-CoA로의 경로일 수 있다. 예시적인 푸트레신 경로는 예를 들어 숙시네이트의 숙시닐-CoA로; 숙시닐-CoA의 숙시닉 세미알데하이드로; 숙시닉 세미알데하이드의 4-아미노부티레이트로; 4-아미노부티레이트의 4-아미노부탄알로의; 및 4-아미노부탄알의 푸트레신으로의 경로일 수 있다. 또 다른 푸트레신 경로는 예를 들어 숙시네이트의 숙시닉 세미알데하이드로; 숙시닉 세미알데하이드의 4-아미노부티레이트로; 4-아미노부티레이트의 4-아미노부탄알로; 및 4-아미노부탄알의 푸트레신으로의 경로일 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 이들이 단지 예시적이며 목적하는 생성물을 생산하기에 적합하고 상기 전환에 적합한 활성을 이용할 수 있는 본 발명에 개시된 기질-생성물 쌍들 중 임의의 쌍을 본 발명의 교시를 근거로 당해 분야의 숙련가가 쉽게 결정할 수 있음을 알 것이다. 따라서, 본 발명은 효소 또는 단백질을 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 함유하는 비-천연 미생물 유기체를 제공하며, 이때 상기 효소 또는 단백질은 경로의 기질 및 생성물을 전환시킨다(도 1, 8 내지 13, 58, 62 및 63 참조).
4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 경로를 함유하는 미생물 유기체로서 본 발명에 일반적으로 개시하였지만, 본 발명은 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 경로의 중간체를 생산하기에 충분한 양으로 발현된 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 경로 효소 또는 단백질을 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 비-천연 미생물 유기체를 추가로 제공하는 것으로 생각된다. 예를 들어, 본 발명에 개시된 바와 같이, 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 경로를 도 1, 8 내지 13, 58, 62 및 63에 예시한다. 따라서, 예를 들어 BDO를 생산하는 BDO 경로를 함유하는 미생물 유기체 이외에, 본 발명은 BDO 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 비-천연 미생물 유기체를 추가로 제공하며, 이때 상기 미생물 유기체는 상기 BDO 경로의 중간체라기보다는 생성물로서 BDO 경로 중간체를 생산한다. 예를 들어 도 62에 도시된 바와 같은 하나의 예시적인 실시태양에서, 본 발명은 중간체라기보다는 생성물로서 숙시닐-CoA, 숙시닉 세미알데하이드, 4-하이드록시부티레이트, 4-하이드록시부티릴-포스페이트, 4-하이드록시부티릴-CoA, 또는 4-하이드록시부탄알을 생산하는 미생물 유기체를 제공한다. 또 다른 예시적인 실시태양은 예를 들어 중간체라기보다는 생성물로서 알파-케토글루타레이트, 2,5-다이옥소펜탄산, 5-하이드록시-2-옥소펜탄산 또는 4-하이드록시부탄알을 생산하는 미생물 유기체를 포함한다. 푸트레신 경로의 예시적인 실시태양은 예를 들어 중간체라기보다는 생성물로서 글루타메이트, 4-아미노부티레이트, 또는 4-아미노부탄알을 생산하는 미생물 유기체를 포함한다. 푸트레신 경로의 또 다른 실시태양은 예를 들어 중간체라기보다는 생성물로서 2,5-다이옥소펜타노에이트, 5-아미노-2-옥소펜타노에이트, 또는 오르니틴을 생산하는 미생물 유기체일 수 있다.
도 1, 8 내지 13, 58, 62 및 63의 경로를 포함하여, 실시예에 개시되고 도면에 예시된 바와 같은 본 발명에 개시된 경로들 중 임의의 경로를 사용하여, 목적하는 바와 같은 임의의 경로 중간체 또는 생성물을 생산하는 비-천연 미생물 유기체를 생성시킬 수 있는 것으로 생각된다. 본 발명에 개시된 바와 같이, 중간체를 생산하는 상기와 같은 미생물 유기체를 하부 경로 효소를 발현하는 또 다른 미생물 유기체와 병용하여 목적하는 생성물을 생산할 수 있다. 그러나, 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 경로 중간체를 생산하는 비-천연 미생물 유기체를 사용하여 목적하는 생성물로서 상기 중간체를 생산할 수 있는 것으로 생각된다.
본 발명을 대사 반응, 반응물 또는 그의 생성물을 일반적으로 언급하거나, 또는 상기 언급된 대사 반응, 반응물 또는 생성물과 관련되거나 이를 촉매화하는 효소 또는 이와 관련된 단백질을 암호화하는 하나 이상의 핵산 또는 유전자를 구체적으로 언급하여 본 발명에서 개시한다. 달리 본 발명에 명확히 나타내지 않는 한, 당해 분야의 숙련가들은 반응에 대한 언급이 또한 상기 반응의 반응물 및 생성물에 대한 언급을 구성함을 알 것이다. 유사하게, 본 발명에서 명확히 나타내지 않는 한, 반응물 또는 생성물에 대한 언급은 또한 상기 반응을 언급하며, 이들 대사 구성성분들 중 임의의 구성성분에 대한 언급은 상기 언급한 반응, 반응물 또는 생성물을 촉매화하는 효소 또는 상기 중에 수반되는 단백질을 암호화하는 유전자 또는 유전자들을 또한 언급한다. 마찬가지로, 대사 생화학, 효소학 및 유전체학의 널리 공지된 분야에 제공된 바와 같이, 본 발명에서 유전자 또는 핵산 암호화에 대한 언급은 상응하는 암호화된 효소 및 상기 효소가 촉매화하는 반응 또는 상기 반응과 관련된 단백질뿐만 아니라 상기 반응의 반응물 및 생성물에 대한 언급을 또한 구성한다.
본 발명의 미생물 유기체를 사용하는 생합성 방식을 통한 4-HB의 생산은 단량체성 4-HB를 생산할 수 있기 때문에 특히 유용하다. 본 발명의 비-천연 미생물 유기체 및 그의 4-HB 및 BDO계 화합물의 생합성이 또한, 상기 4-HB 생성물이 (1) 분비될 수 있고; (2) 조효소 A와 같은 임의의 유도체화가 없을 수 있고; (3) 생합성 중 열역학적 변화를 피할 수 있고; (4) BDO의 직접적인 생합성을 허용할 수 있고; (5) 산성 pH 배지에서 4-HB의 γ-부티로락톤(GBL)으로의 자발적인 화학적 전환을 허용할 수 있기 때문에 특히 유용하다. 상기 후자의 특징은 또한 예를 들어 1,4-부탄다이올 및/또는 테트라하이드로퓨란(THF)과 같은 BDO계 화합물의 효율적인 화학 합성 또는 생합성에 특히 유용하다.
미생물 유기체는 일반적으로 4-HB를 합성하는 능력이 없으며 따라서 본 발명에 개시된 화합물들 중 임의의 화합물은 1,4-부탄다이올계 화합물 내에 있거나 또는 상기 1,4-부탄다이올계 화합물 내에 있는 것으로 당해 분야의 숙련가들에게 공지되어 있다. 더욱이, 상기 개시된 효소 및 본 발명에 예시된 생화학적 경로들로부터 4-HB를 생산하는, 필수적인 대사 효소 능력을 전부 갖는 유기체는 공지되어 있지 않다. 오히려, 하기에 추가로 개시되는 몇몇 혐기성 미생물들을 제외하는 것이 가능하다면, 상기 효소 능력을 갖는 미생물들은 기질로서 4-HB를 사용하여 예를 들어 숙시네이트를 생산한다. 대조적으로, 본 발명의 비-천연 미생물 유기체는 생성물로서 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신을 생성시킬 수 있다. 상술한 바와 같이, 단량체 형태의 4-HB의 생합성은 BDO 계 화합물의 화학 합성에 유용할 뿐만 아니라 BDO 계 화합물의 추가적인 생합성을 허용하고 화학 합성 과정을 전적으로 피할 수 있게 한다.
4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신을 생산할 수 있는 본 발명의 비-천연 미생물 유기체는 숙주 미생물 유기체가 본 발명의 하나 이상의 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 생합성 경로의 완전한 생화학적 합성에 대한 작용 능력을 포함하게 함으로써 생산된다. 하나 이상의 필수적인 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 생합성 경로의 보장은 상기 숙주 미생물 유기체에 4-HB 생합성 능력을 부여한다.
여러 개의 4-HB 생합성 경로들을 본 발명에 예시하며 도 1에 예시를 목적으로 도시하였다. 추가적인 4-HB 및 BDO 경로를 도 8 내지 13에 개시한다. 하나의 4-HB 생합성 경로는 숙시네이트로부터 4-HB의 생합성(숙시네이트 경로)을 포함한다. 상기 4-HB 경로에 관여하는 효소들은 CoA-독립적인 숙시닉 세미알데하이드 데하이드로게나제 및 4-하이드록시부타노에이트 데하이드로게나제를 포함한다. 이 경로에서, CoA-독립적인 숙시닉 세미알데하이드 데하이드로게나제는 도 1에 나타낸 화살표 방향으로 역 반응을 촉매화한다. 또 다른 4-HB 생합성 경로는 숙시닐-CoA를 통한 숙시네이트로부터의 생합성(숙시닐-CoA 경로)을 포함한다. 상기 4-HB 경로에 관여하는 효소는 숙시닐-CoA 신시타제, CoA-의존성 숙시닉 세미알데하이드 데하이드로게나제 및 4-하이드록시부타노에이트 데하이드로게나제를 포함한다. 3 개의 다른 4-HB 생합성 경로는 α-케토글루타레이트로부터의 4-HB의 생합성(α-케토글루타레이트 경로)을 포함한다. 따라서, 세 번째 4-HB 생합성 경로는 글루타메이트:숙시닉 세미알데하이드 트랜스아미나제, 글루타메이트 데카복실라제 및 4-하이드록시부타노에이트 데하이드로게나제를 통한 숙시닉 세미알데하이드의 생합성이다. 네 번째 4-HB 생합성 경로는 또한 α-케토글루타레이트로부터의 4-HB의 생합성을 포함하지만 α-케토글루타레이트 데카복실라제를 사용하여 숙시닉 세미알데하이드 합성을 촉매화한다. 4-하이드록시부타노에이트 데하이드로게나제는 숙시닉 세미알데하이드의 4-HB로의 전환을 촉매화한다. 다섯 번째 4-HB 생합성 경로는 숙시닐-CoA를 통한 α-케토글루타레이트로부터의 생합성을 포함하며 α-케토글루타레이트 데하이드로게나제를 사용하여 숙시닐-CoA를 생성시키고, 이는 상술한 숙시닐-CoA 경로로 모인다. 이들 각각의 4-HB 생합성 경로들, 그들의 기질, 반응물 및 생성물들을 하기 실시예에 추가로 개시한다. 본 발명에 개시되는 바와 같이, 4-HB를 BDO 생산에 적합한 효소들의 포함에 의해 BDO로 생합성적으로 전환시킬 수 있다(실시예 참조). 따라서, 4-HB 경로를, 4-HB를 BDO로 전환시키는 효소들과 함께 사용하여 BDO 경로를 생성시킬 수 있는 것으로 생각된다.
본 발명의 비-천연 미생물 유기체는 하나 이상의 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 생합성 경로에 관여하는 효소 또는 단백질 중 하나 이상을 암호화하는 발현 가능한 핵산을 도입시킴으로써 생성시킬 수 있다. 생합성에 대해 선택된 숙주 미생물 유기체에 따라, 특정 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 생합성 경로 중 일부 또는 전부에 대한 핵산을 발현시킬 수 있다. 예를 들어, 선택된 숙주가 목적하는 생합성 경로, 예를 들어 숙시네이트에서 4-HB 경로에 대해 하나 이상의 효소 또는 단백질이 결핍된 경우, 상기 결핍된 효소(들), 예를 들어 상기 예에서 CoA-의존성 숙시닉 세미알데하이드 데하이드로게나제 및 4-하이드록시부타노에이트 데하이드로게나제 모두에 대해 발현 가능한 핵산을 후속의 외래 발현을 위해 상기 숙주에 도입시킨다. 한편으로, 상기 선택된 숙주가 일부 경로 유전자들의 내생적인 발현을 나타내지만 다른 것들은 결핍된 경우, 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 생합성을 성취하기 위해 상기 결핍 효소(들)에 대해 암호화 핵산이 필요하다. 예를 들어 상기 선택된 숙주가 내생적인 CoA-의존성 숙시닉 세미알데하이드 데하이드로게나제를 나타내지만 4-하이드록시부타노에이트 데하이드로게나제는 결핍된 경우, 4-HB 생합성을 성취하기 위해서 상기 효소에 대해 암호화 핵산이 필요하다. 따라서, 본 발명의 비-천연 미생물 유기체를, 목적하는 생합성 경로를 획득하기 위해 외래 효소 또는 단백질 활성을 도입시킴으로써 생성시키거나, 또는 하나 이상의 내생적인 효소 또는 단백질과 함께 목적하는 생성물, 예를 들어 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신을 생산하는 하나 이상의 외래 효소 또는 단백질 활성을 도입시킴으로써 목적하는 생합성 경로를 획득할 수 있다.
같은 방식으로, 4-HB 생합성이 상기 숙시네이트에서 숙시닐-CoA로의 경로(숙시닐-CoA 경로)를 통해 발생하도록 선택되는 경우, 상기 효소 숙시닐-CoA 신시타제, CoA-의존성 숙시닉 세미알데하이드 데하이드로게나제 및/또는 4-하이드록시부타노에이트 데하이드로게나제가 결핍된 숙주에 대한 암호화 핵산은 수용 숙주에서 외부적으로 발현되어야 한다. α-케토글루타레이트에서 숙시닉 세미알데하이드로의 경로(α-케토글루타레이트 경로)를 통한 4-HB 생합성의 선택은 글루타메이트:숙시닉 세미알데하이드 트랜스아미나제, 글루타메이트 데카복실라제 및/또는 4-하이드록시부타노에이트 데하이드로게나제, 또는 α-케토글루타레이트 데카복실라제 및 4-하이드록시부타노에이트 데하이드로게나제에 대해, 상기 효소들 중 하나 이상이 결핍된 숙주에 대한 외부 발현을 사용할 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 본 발명에 개시된 바와 같이, 4-HB 또는 BDO의 생산을 위한 경로 효소들을 쉽게 결정할 수 있다.
선택된 숙주 미생물 유기체의 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 생합성 경로 구성성분들에 따라, 본 발명의 비-천연 미생물 유기체는 하나 이상의 외부적으로 발현된 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 경로-암호화 핵산 내지 하나 이상의 4-HB 또는 BDO 생합성 경로에 대한 암호화 핵산 전부를 포함할 것이다. 예를 들어, 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 생합성을, 상응하는 암호화 핵산의 외부 발현을 통해 경로 효소 또는 단백질이 결핍된 숙주에 확립시킬 수 있다. 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 경로의 모든 효소 또는 단백질이 결핍된 숙주에서, 상기 경로 중의 모든 효소 또는 단백질의 외부 발현을 포함할 수 있지만, 상기 숙주가 경로 효소 또는 단백질 중 적어도 하나를 함유한다 하더라도 상기 경로의 모든 효소 또는 단백질이 발현될 수 있는 것으로 이해된다. 경우에 따라, 4-HB, 4-HB, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신의 생산을 위한 경로 중의 모든 효소 또는 단백질의 외부 발현을 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 4-HB 생합성은, 4-하이드록시부타노에이트 데하이드로게나제 암호화 핵산의 외부 발현을 통해 4-하이드록시부타노에이트 데하이드로게나제가 결핍된 숙주에서의 5 개 경로 모두로부터 확립될 수 있다. 대조적으로, 4-HB 생합성을 CoA-독립적인 숙시닉 세미알데하이드 데하이드로게나제, 숙시닐-CoA 신시타제, CoA-의존성 숙시닉 세미알데하이드 데하이드로게나제, 글루타메이트:숙시닉 세미알데하이드 트랜스아미나제, 글루타메이트 데카복실라제, α-케토글루타레이트 데카복실라제, α-케토글루타레이트 데하이드로게나제 및 4-하이드록시부타노에이트 데하이드로게나제의 8 개 모두의 외부 발현을 통해 8 개 효소가 모두 결핍된 숙주에서 5 개 경로 모두로부터 확립시킬 수 있다.
본 발명에 제공된 교시 및 지침에 따라, 당해 분야의 숙련가들은 발현 가능한 형태로 도입되는 암호화 핵산의 수가 적어도 상기 선택된 숙주 미생물 유기체의 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 경로 결핍에, 최소한 필적할 것임을 알 것이다. 따라서, 본 발명의 비-천연 미생물 유기체는 본 발명에 개시된 하나 이상의 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 생합성 경로를 구성하는 효소를 암호화하는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 전체 이하 핵산을 가질 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 비-천연 미생물 유기체는 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 생합성을 촉진 또는 최적화하거나, 또는 상기 숙주 미생물 유기체에 다른 유용한 작용들을 부여하는 다른 유전자 변형을 또한 포함할 수 있다. 하나의 상기와 같은 다른 작용성은 예를 들어 4-HB 경로 전구체, 예를 들어 숙시네이트, 숙시닐-CoA, α-케토글루타레이트, 4-아미노부티레이트, 글루타메이트, 아세토아세틸-CoA, 및/또는 호모세린 중 하나 이상의 합성의 증대를 포함할 수 있다.
일반적으로, 숙주 미생물 유기체는 상기 유기체가 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 경로의 전구체를, 자연적으로 생성된 분자로서 또는 목적하는 전구체의 드 노보 생산을 제공하거나 또는 상기 숙주 미생물 유기체에 의해 자연적으로 생산된 전구체의 증가된 생산을 제공하도록 조작된 생성물로서 생산하도록 선택된다. 예를 들어, 숙시닐-CoA, α-케토글루타레이트, 4-아미노부티레이트, 글루타메이트, 아세토아세틸-CoA, 및 호모세린은 에스케리키아 콜라이와 같은 숙주 유기체에서 자연적으로 생산된다. 숙주 유기체를 본 발명에 개시된 바와 같이, 전구체의 생산을 증가하도록 조작할 수 있다. 또한, 목적하는 전구체를 생산하도록 조작된 미생물 유기체를 숙주 유기체로서 사용하고 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 경로의 효소 또는 단백질을 발현하도록 추가로 조작할 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 비-천연 미생물 유기체는 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신을 합성하는 효소적 능력을 함유하는 숙주로부터 생성된다. 상기 특정한 실시태양에서, 예를 들어 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 경로 반응이 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 생산을 향하도록 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 경로 생성물의 합성 또는 축적을 증가시키는 것이 유용할 수 있다. 증가된 합성 또는 축적을 예를 들어 상술한 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 경로 효소 중 하나 이상을 암호화하는 핵산의 과발현에 의해 수행할 수 있다. 상기 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 경로의 효소 또는 효소들의 과발현은 예를 들어 내생적인 유전자 또는 유전자들의 외부 발현을 통해서, 또는 이종 유전자 또는 유전자들의 외부 발현을 통해서 일어날 수 있다. 따라서, 천연 유기체를, 본 발명의 비-천연 미생물 유기체, 예를 들어 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 생합성 경로 효소를 암호화하는 1, 2, 3, 4, 5, 6 등 전체 이하의 핵산의 과발현을 통해 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신을 생산하는 미생물 유기체가 되도록 쉽게 생성시킬 수 있다. 또한, 비-천연 유기체를 상기 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 생합성 경로 효소의 활성을 증가시키는 내생 유전자의 돌연변이에 의해 생성시킬 수 있다.
특히 유용한 실시태양에서, 상기 암호화 핵산의 외부 발현을 사용한다. 외부 발현은 상기 발현 및/또는 조절 요소를 상기 숙주 및 용도의 주문에 맞추어 사용자에 의해 조절되는 목적하는 발현 수준을 성취하는 능력을 부여한다. 그러나, 내생적인 발현은 또한 예를 들어 유도 프로모터 또는 다른 조절 요소에 결합 시 상기 유전자의 프로모터의 음의 조절 효과기 또는 유도를 제거함으로써 다른 실시태양들에도 사용될 수 있다. 따라서, 천연 유도 프로모터를 갖는 내생 유전자를 적합한 유도체의 제공에 의해 상향 조절하거나, 또는 내생 유전자의 조절 부위를 유도 조절 요소를 통합하도록 조작할 수 있으며, 이에 의해 목적하는 시기에 내생 유전자의 증가된 발현의 조절을 허용할 수 있다. 유사하게, 유도 프로모터를 비-천연 미생물 유기체 내에 도입된 외래 유전자에 대한 조절 요소로서 포함할 수 있다(실시예 참조).
"외래"는 본 발명에서 사용 시 기준 분자 또는 기준 활성이 숙주 미생물 유기체 내에 도입됨을 의미한다. 상기 분자는 예를 들어 암호화 핵산의 숙주 유전 물질 내로의 도입에 의해, 예를 들어 숙주 염색체 내로의 통합 또는 비-염색체 유전 물질, 예를 들어 플라스미드로서의 통합에 의해 도입될 수 있다. 따라서, 상기 용어는 암호화 핵산의 발현과 관련하여 사용될 때 상기 암호화 핵산이 발현 가능한 형태로 미생물 유기체 내에 도입됨을 지칭한다. 생합성 활성과 관련하여 사용될 때, 상기 용어는 상기 숙주 기준 유기체 내로 도입되는 활성을 지칭한다. 상기 공급원은 예를 들어 상기 숙주 미생물 유기체 내로의 도입에 이어서 상기 기준 활성을 발현하는 동종 또는 이종 암호화 핵산일 수 있다. 따라서, "내생적인"이란 용어는 상기 숙주 중에 존재하는 기준 분자 또는 활성을 지칭한다. 유사하게, 상기 용어는 암호화 핵산의 발현과 관련하여 사용될 때 상기 미생물 유기체 내에 함유된 암호화 핵산의 발현을 지칭한다. "이종"이란 용어는 상기 기준 종 이외의 공급원으로부터 유래하는 분자 또는 활성을 지칭하는 반면, "동종"은 상기 숙주 미생물 유기체로부터 유래하는 분자 또는 활성을 지칭한다. 따라서, 본 발명의 암호화 핵산의 외래 발현은 이종 또는 동종 암호화 핵산 중 어느 하나 또는 이둘 모두를 사용할 수 있다.
하나보다 많은 외래 핵산이 미생물 유기체 중에 포함되는 경우, 상기 하나보다 많은 외래 핵산은 상기 논의된 바와 같이 기준 암호화 핵산 또는 생합성 활성을 지칭하는 것으로 생각된다. 또한 본 발명에 개시된 바와 같이, 상기와 같은 하나보다 많은 외래 핵산을 별도의 핵산 분자 상에서, 다시스트론 핵산 분자 상에서, 또는 이들의 조합 상에서 숙주 미생물 유기체에 도입할 수 있으며, 상기 핵산을 여전히 하나보다 많은 외래 핵산으로서 간주할 수 있는 것으로 생각된다. 예를 들어, 본 발명에서 논의된 바와 같이, 미생물 유기체를 목적하는 경로 효소 또는 단백질을 암호화하는 2 개 이상의 외래 핵산을 발현하도록 조작할 수 있다. 목적하는 활성을 암호화하는 2 개의 외래 핵산을 숙주 미생물 유기체에 도입하는 경우에, 상기 2 개의 외래 핵산을 단일 핵산으로서, 예를 들어 단일 플라스미드 상에, 별도의 플라스미드 상에 도입할 수 있으며, 단일 부위 또는 다수의 부위에서 상기 숙주 염색체에 통합시킬 수 있고 상기 핵산을 여전히 2 개의 외래 핵산으로서 간주할 수 있는 것으로 생각된다. 유사하게, 2 개 보다 많은 외래 핵산을 임의의 목적하는 조합으로 숙주 유기체 내로, 예를 들어 단일 플라스미드 상에, 별도의 플라스미드 상에 도입할 수 있으며, 단일 부위 또는 다수의 부위에서 상기 숙주 염색체에 통합시킬 수 있고 상기 핵산을 여전히 2 개 이상의 외래 핵산, 예를 들어 3 개의 외래 핵산으로서 간주할 수 있는 것으로 생각된다. 따라서, 기준 외래 핵산 또는 생합성 활성의 수는 암호화 핵산의 수 또는 생합성 활성의 수를 지칭하는 것이지, 숙주 유기체 내로 도입되는 별도의 핵산의 수를 지칭하는 것은 아니다.
4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 경로 효소에 대한 암호화 핵산들의 공급원들은 예를 들어 상기 암호화된 유전자 산물이 언급된 반응을 촉매화할 수 있는 임의의 종들을 포함할 수 있다. 상기와 같은 종은 원핵생물 및 진핵생물 유기체 모두, 예를 들어 비 제한적으로 세균, 예를 들어 고세균 및 진정세균, 및 효모, 식물, 곤충, 동물 및 인간을 포함한 포유동물을 포함한 진핵생물을 포함한다. 상기와 같은 공급원들의 예시적인 종들은 예를 들어 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 클루이베리(Saccharomyces kluyveri), 클로스트리듐 클루이베리(Clostridium kluyveri), 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridum acetobutylicum), 클로스트리듐 베이제링키이(Clostridium beijerinckii), 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰(Clostridium saccharoperbutylacetonicum), 클로스트리듐 페르프린젠스(Clostridium perfringens), 클로스트리듐 디피실레(Clostridium difficile), 클로스트리듐 보툴리늄(Clostridium botulinum), 클로스트리듐 타이로부티리움(Clostridium tyrobutyricum), 클로스트리듐 테타노몰품(Clostridium tetanomorphum), 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani), 클로스트리듐 프로피오니쿰(Clostridium propionicum), 클로스트리듐 아미노부티리쿰(Clostridium aminobutyricum), 클로스트리듐 서브터미날레(Clostridium subterminale), 클로스트리듐 스틱클란디이(Clostridium sticklandii), 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha), 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis), 마이코박테리움 튜베르큘로시스(Mycobacterium tuberculosis), 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 써무스 써모필루스(Thermus thermophilus), 슈도모나스 스페시즈(Pseudomonas species), (슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa ) 포함), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 슈도모나스 스투트제리(Pseudomonas stutzeri), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 호모 사피엔스(Homo sapiens), 오릭토라구스 쿠니큘러스(Oryctolagus cuniculus), 로도박터 스파에로이데스(Rhodobacter spaeroides), 써모아나에로박터 브록키이(Thermoanaerobacter brockii), 메탈로스파에라 세둘라( Metallosphaera sedula), 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 클로로플렉수스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus), 로세이플렉수스 카스텐홀지이(Roseiflexus castenholzii), 에리쓰로박터(Erythrobacter), 심몬디아 키넨시스(Simmondsia chinensis), 애시네토박터 스페시즈(Acinetobacter species), (애시네토박터 칼코아세티쿠스(Acinetobacter calcoaceticus) 및 애시네토박터 배일리이(Acinetobacter baylyi ) 포함), 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 설포로부스 토코다이이(Sulfolobus tokodaii), 설포로부스 솔파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus), 설포로부스 애시도칼다리우스(Sulfolobus acidocaldarius), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 바실러스 브레비스(Bacillus brevis), 바실러스 퓨밀루스(Bacillus pumilus), 라투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus), 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumonia), 클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 유글레나 그라실리스(Euglena gracilis), 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola), 무어렐라 써모아세티카(Moorella thermoacetica), 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima), 할로박테리움 살리나룸(Halobacterium salinarum), 제오바실러스 스테아로써모필루스(Geobacillus stearothermophilus), 아에로피룸 페르닉스(Aeropyrum pernix), 수스 스크로파(Sus scrofa), 카에노라브디티스 엘레간스(Caenorhabditis elegans), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 애시드아미노코커스 페르멘탄스(Acidaminococcus fermentans), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 스트렙토코커스 써모필루스(Streptococcus thermophilus), 엔테로박터 아에로제네스(Enterobacter aerogenes), 칸디다(Candida), 아스퍼질러스 테레우스(Aspergillus terreus), 페디코커스 펜토사세우스(Pedicoccus pentosaceus), 자이모모나스 모빌루스(Zymomonas mobilus), 아세토박터 파스퇴리안스(Acetobacter pasteurians), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 유박테리움 발케리(Eubacterium barkeri), 박테로이데스 카필로수스(Bacteroides capillosus), 아나에로트렁쿠스 콜리호미니스(Anaerotruncus colihominis), 나트라나에로비우스 써모필루스(Natranaerobius thermophilusm), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 하에모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 시트로박터 아말로나티쿠스(Citrobacter amalonaticus), 믹소코커스 잔투스(Myxococcus xanthus), 푸소박테리움 누클레아툼(Fusobacterium nuleatum), 페니실리움 크리소제눔(Penicillium chrysogenum) 해양 감마 프로테오박테리움, 부티레이트-생산 세균, 노카르디아 이오웬시스(Nocardia iowensis), 노카르디아 파르시니카(Nocardia farcinica), 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus), 시조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 제오바실러스 써모글루코시다시우스(Geobacillus thermoglucosidasius), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 비브리오 콜레라(Vibrio cholera), 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori), 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum), 오리자 사티바(Oryza sativa), 할로페락스 메디테라네이(Haloferax mediterranei), 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 아크로모박터 데니트리피칸스(Achromobacter denitrificans), 푸소박테리움 누클레아툼(Fusobacterium nucleatum), 스트렙토마이세스 클라불리제누스(Streptomyces clavuligenus), 애시네토박터 바우마니이(Acinetobacter baumanii), 무스 무스쿨루스(Mus musculus), 라칸세아 클루이베리(Lachancea kluyveri), 트리코모나스 바기날리스(Trichomonas vaginalis), 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei), 슈도모나스 스투트제리(Pseudomonas stutzeri), 브라디리조븀 자포니쿰(Bradyrhizobium japonicum), 메소리조븀 로티(Mesorhizobium loti), 보스 타우루스(Bos taurus), 니코티아나 글루티노사(Nicotiana glutinosa), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus), 셀레노모나스 루미난티움(Selenomonas ruminantium), 비브리오 파라하에모리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus), 알카에오글로부스 풀기두스(Archaeoglobus fulgidus), 할로알쿨라 마리스모르투이(Haloarcula marismortui), 파이로바쿨룸 아에로필룸(Pyrobaculum aerophilum), 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis) MC2 155, 마이코박테리움 아비움 서브스페시즈 파라튜베르큘로시스(Mycobacterium avium subsp . paratuberculosis) K-10, 마이코박테리움 마리눔(Mycobacterium marinum) M, 트수카뮤렐라 파우로메타볼라(Tsukamurella paurometabola) DSM 20162, 시아노븀(Cyanobium) PCC7001, 딕티오스텔륨 디스코이데움(Dictyostelium discoideum) AX4, 및 본 발명에 개시된 다른 것들(실시예 참조)을 포함한다. 예를 들어 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 생합성적 생산을 갖는 미생물 유기체들은 에스케리키아 콜라이 및 효모 숙주에 관하여 본 발명에서 예시한다. 그러나, 395 개 미생물 게놈 및 다양한 효모, 진균, 식물, 및 포유동물 게놈들을 포함하여, 현재 550 초과의 종들(이들 중 절반 이상을 NCBI와 같은 공개적인 데이터베이스 상에서 입수할 수 있다)에 대해 입수할 수 있는 완전한 게놈 서열과 함께, 관련된 또는 떨어진 종들 중의 하나 이상의 유전자들에 대한 필수적인 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 생합성 활성을 암호화하는 유전자들의 동정, 예를 들어 공지된 유전자들의 상동 기관, 이종 상동체, 상동체 및 비-이종 상동성 유전자 치환, 및 유기체들 간의 유전자 변경의 교환은 통상적이며 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 따라서, 에스케리키아 콜라이 또는 효모와 같은 특정 유기체에 관하여 본 발명에 개시된 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신의 생합성을 가능하게 하는 대사적 변경을 다른 미생물들, 예를 들어 원핵생물 및 진핵생물 유기체에도 마찬가지로 쉽게 적용할 수 있다. 본 발명에 제공된 교시 및 지침에 따라, 당해 분야의 숙련가들은 하나의 유기체에서 예시된 대사적 변경을 다른 유기체에도 동등하게 적용할 수 있음을 알 것이다.
일부 예에서, 예를 들어 대안적인 4-HB, 4-HBal, BDO 또는 푸트레신 생합성 경로가 관련없는 종들에서 존재하는 경우, 4-HB, 4-HBal, BDO 또는 푸트레신 생합성을, 예를 들어 유사하지만, 동일하지는 않은 대사 반응을 촉매화하는 상기 관련없는 종들로부터의 상동체 또는 상동체들의 외부 발현에 의해 숙주 종에 부여하여 상기 기준 반응을 대체할 수 있다. 대사 네트워크들 간에 어떤 차이가 상이한 유기체들 간에 존재하므로, 당해 분야의 숙련가들은 상이한 유기체들 간의 실제 유전자 사용이 상이할 수 있음을 알 것이다. 그러나, 본 발명에 제공된 교시 및 지침에 따라, 당해 분야의 숙련가들은 또한 본 발명의 교시 및 방법을 본 발명에 예시된 것들과 동족의 대사 변경을 사용하는 모든 미생물 유기체들에 적용하여 4-HB, 예를 들어 단량체성 4-HB, 4-HBal, BDO 또는 푸트레신을 합성하는 관심 종의 미생물 유기체를 제작할 수 있다.
숙주 미생물 유기체를 예를 들어 세균, 효모, 진균 또는 발효 공정에 적용할 수 있는 임의의 다양한 다른 미생물들 중에서 선택할 수 있으며 상기 비-천연 미생물 유기체를 이들 중에서 생성시킬 수 있다. 예시적인 세균은 에스케리키아 콜라이, 클렙시엘라 옥시토카, 아나에로비오스피릴룸 숙시니시프로듀센스(Anaerobiospirillum succiniciproducens), 액티노바실러스 숙시노제네스(Actinobacillus succinogenes), 만헤이미아 숙시니시프로듀센스, 리조븀 에틀리(Rhizobium etli), 바실러스 서브틸루스, 코리네박테리움 글루타미쿰, 글루코노박터 옥시단스, 자이모모나스 모빌리스, 락토코커스 락티스, 락토바실러스 플란타룸, 스트렙토마이세스 코엘리콜로르(Streptomycess coelicolor), 클로스트리듐 아세토부틸리쿰, 슈도모나스 플루오레센스, 및 슈도모나스 푸티다 중에서 선택된 종을 포함한다. 예시적인 효모 또는 진균은 사카로마이세스 세레비지아에, 시조사카로마이세스 폼베, 클루이베로마이세스 락티스, 클루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus), 아스퍼질러스 테레우스(Aspergillus terreus), 아스퍼질러스 니거, 피키아 파스토리스, 리조푸스 아리주스(Rhizopus arrhizus), 리조부스 오리자에(Rhizobus oryzae) 등 중에서 선택된 종을 포함한다. 에스케리키아 콜라이가 특히 유용한 숙주 유기체인데, 그 이유는 유전 공학에 적합한 널리 특성화된 미생물 유기체이기 때문이다. 다른 특히 유용한 유기체는 효모, 예를 들어 사카로마이세스 세레비지아에를 포함한다. 임의의 적합한 미생물 숙주 유기체를 사용하여 대사 및/또는 유전자 변형을 도입시켜 목적하는 생성물을 생성시킬 수 있는 것으로 생각된다.
비-천연 4-HB-, 4-HBal-, 4-HBCoA-, BDO- 또는 푸트레신-생산 숙주의 발현 수준을 구성하고 시험하기 위한 방법을 예를 들어 당해 분야에 널리 공지된 재조합체 및 검출 방법에 의해 수행할 수 있다. 상기와 같은 방법들은 예를 들어 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York(2001)] 및 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD(1999)]에 개시되어 있다. 4-HB 및 GBL을 예를 들어 스페리솔브(Spherisorb) 5 ODS1 컬럼 및 70% 10 mM 포스페이트 완충제(pH = 7) 및 30% 메탄올의 이동상을 사용하는 HPLC에 의해 분리시키고 215 ㎚에서 UV 검출기를 사용하여 검출할 수 있다(문헌[Hennessy et al. 2004, J. Forensic Sci. 46(6):1-9]). BDO를 기체 크로마토그래피에 의해, 또는 아미넥스(Aminex) HPX-87H 컬럼 및 0.5 mM 황산의 이동상을 사용하는 HPLC 및 굴절률 검출기에 의해 검출한다(문헌[Gonzalez-Pajuelo et al., Met. Eng. 7:329-336(2005)]).
4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신의 생산을 위한 경로에 관여하는 외부 핵산 서열들을 당해 분야에 널리 공지된 기법들, 예를 들어 비 제한적으로 접합, 일렉트로포레이션, 화학적 변환, 형질도입, 형질감염, 및 초음파 변환을 사용하여 숙주 세포에 안정하게 또는 일시적으로 도입시킬 수 있다. 에스케리키아 콜라이 또는 다른 원핵 세포에서의 외부 발현을 위해서, 상기 유전자의 일부 핵산 서열 또는 진핵생물 핵산의 cDNA는 표적화 신호, 예를 들어 N-말단 미토콘드리아 또는 다른 표적화 신호를 암호화할 수 있으며, 상기 신호를 경우에 따라 원핵생물 숙주 세포로의 형질전환 전에 제거할 수 있다. 예를 들어, 미토콘드리아 리더 서열의 제거로 에스케리키아 콜라이에서의 발현이 증가되었다(문헌[Hoffmeister et al., J. Biol. Chem. 280:4329-4338(2005)]). 효모 또는 다른 진핵생물 세포에서의 외부 발현을 위해서, 유전자를 리더 서열의 첨가 없이 시토솔에서 발현시키거나, 또는 미토콘드리온 또는 다른 세포 소기관에 표적화하거나, 또는 적합한 표적화 서열, 예를 들어 미토콘드리아 표적화 또는 상기 숙주 세포에 적합한 분비 신호의 첨가에 의해 분비에 대해 표적화할 수 있다. 따라서, 표적화 서열의 제거 또는 포함을 위한 핵산 서열에 대한 적합한 변형을 외래 핵산 서열에 결합시켜 바람직한 성질들을 부여할 수 있을 것으로 생각된다. 더욱 또한, 유전자에 대해 당해 분야에 널리 공지된 기법으로 코돈 최적화를 수행하여 상기 단백질의 최적화된 발현을 성취할 수 있다.
숙주 유기체 중에서 작용성인 발현 조절 서열에 작동적으로 결합된, 본 발명에 예시된 바와 같은 하나 이상의 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 생합성 경로 및/또는 하나 이상의 생합성 암호화 핵산을 포함하는 발현 벡터 또는 벡터들을 제작할 수 있다. 본 발명의 미생물 숙주 유기체에 사용하기에 적용 가능한 발현 벡터는 예를 들어 플라스미드, 파지 벡터, 바이러스 벡터, 에피솜 및 인공 염색체, 예를 들어 숙주 염색체 내로의 안정한 통합을 위해 작동 가능한 벡터 및 선택 서열 또는 마커를 포함한다. 또한, 상기 발현 벡터는 하나 이상의 선택성 마커 유전자 및 적합한 발현 조절 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어 항생제 또는 독소에 대한 내성, 상보성 영양요구성 결핍, 또는 배양 배지 중에 없는 결정적인 영양소를 제공하는 선택성 마커 유전자가 또한 포함될 수 있다. 발현 조절 서열은 당해 분야에 널리 공지된 구성 및 유도 프로모터, 전사 증진인자, 전사 종결자 등을 포함할 수 있다. 2 개 이상의 외래 암호화 핵산을 공동 발현시켜야 하는 경우, 상기 두 핵산을 모두 예를 들어 단일 발현 벡터 또는 별도의 발현 벡터에 삽입할 수 있다. 단일 벡터 발현의 경우, 상기 암호화 핵산을 하나의 공통 발현 조절 서열에 작동적으로 결합시키거나 또는 상이한 발현 조절 서열, 예를 들어 하나의 유도 프로모터 및 하나의 구성 프로모터에 결합시킬 수 있다. 대사 또는 합성 경로에 관여하는 외래 핵산 서열의 형질전환을 당해 분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 확인할 수 있다. 상기와 같은 방법은 예를 들어 핵산 분석, 예를 들어 mRNA의 노던 블럿 또는 폴리머라제 쇄 반응(PCR) 증폭, 또는 유전자 산물의 발현에 대한 면역블럿팅, 또는 도입된 핵산 서열 또는 그의 상응하는 유전자 산물의 발현을 시험하기 위한 다른 적합한 분석 방법을 포함한다. 당해 분야의 숙련가들은 상기 외래 핵산이 목적하는 생성물을 생산하기에 충분한 양으로 발현됨을 알 것이며, 발현 수준을 당해 분야에 널리 공지되고 본 발명에 개시된 바와 같은 방법을 사용하여 충분한 발현이 획득되도록 최적화할 수 있음을 또한 알 것이다.
본 발명의 비-천연 미생물 유기체를, 4-HB, 예를 들어 단량체성 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신을 생성시키기에 충분한 양의 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 핵산을 외부적으로 발현하도록 본 발명에 예시된 바와 같이 당해 분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 제작한다. 본 발명의 미생물을 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신을 생산하기에 충분한 조건 하에서 배양함이 이해된다. 각 경로에서 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 효소에 대한 예시적인 발현 수준을 하기 실시예에 추가로 개시한다. 본 발명에 제공된 교시 및 지침에 따라, 본 발명의 비-천연 미생물 유기체는 약 0.1 내지 200 mM 이상, 예를 들어 0.1 내지 25 mM 이상의 세포 내 농도를 생성시키는 4-HB, 예를 들어 단량체성 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신의 생합성을 성취할 수 있다. 일반적으로, 4-HB, 예를 들어 단량체성 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신의 세포 내 농도는 약 3 내지 150 mM 이상, 특히 약 5 내지 125 mM 이상, 및 보다 특히 8 내지 100 mM, 예를 들어 약 3 내지 20 mM, 특히 약 5 내지 15 mM 및 보다 특히 8 내지 12 mM, 예를 들어 약 10 mM, 20 mM, 50 mM, 80 mM 또는 그 이상이다. 이들 예시적인 범위 사이 및 그 이상의 세포 내 농도도 또한 본 발명의 비-천연 미생물 유기체로부터 성취될 수 있다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 미생물 유기체, 특히 균주, 예를 들어 본 발명에 개시된 것들(실시예 XII 내지 XIX 및 표 28 참조)은 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신의 생산을 증가시키고/시키거나 바람직하지 못한 부산물을 감소시킴으로써 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신과 같은 목적하는 생성물의 개선된 생산을 제공할 수 있다. 상기와 같은 생산 수준은 비 제한적으로 본 발명에 개시된 수준 및 예를 들어 리터당 약 1 그램 내지 약 25 그램, 예를 들어 리터당 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 훨씬 더 많은 양의 생성물을 포함한다.
본 발명에 개시된 배양 및 발효 조건 이외에, BDO, 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA 및/또는 푸트레신의 생합성을 성취하기 위한 생육 조건은 상기 배양 조건에 삼투보호제(osmoprotectant)의 첨가를 포함할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 비-천연 미생물 유기체를 삼투보호제의 존재 하에서 본 발명에 개시된 바와 같이 지속시키거나, 배양하거나 발효시킬 수 있다. 간단히, 삼투보호제는, 삼투물질로서 작용하고 본 발명에 개시된 바와 같은 미생물 유기체가 삼투 응력을 견디는데 일조하는 화합물을 의미한다. 삼투보호제는 비 제한적으로 베타인, 아미노산 및 상기 트레할로스 당을 포함한다. 상기와 같은 삼투보호제의 비 제한적인 예는 글리신 베타인, 프랄린 베타인, 다이메틸쎄틴, 다이메틸슬포니오프로프리오네이트, 3-다이메틸설포니오-2-메틸프로프리오네이트, 피페콜산, 다이메틸설포니오아세테이트, 콜린, L-카르니틴 및 엑토인이다. 하나의 태양에서, 상기 삼투보호제는 글리신 베타인이다. 당해 분야의 숙련가는 본 발명에 개시된 미생물 유기체를 삼투 응력으로부터 보호하기에 적합한 삼투보호제의 양 및 유형이, 사용되는 상기 미생물 유기체에 따라 변할 것임을 이해한다. 상기 배양 조건 하에서 삼투보호제의 양은 예를 들어 단지 약 0.1 mM, 단지 약 0.5 mM, 단지 약 1.0 mM, 단지 약 1.5 mM, 단지 약 2.0 mM, 단지 약 2.5 mM, 단지 약 3.0 mM, 단지 약 5.0 mM, 단지 약 7.0 mM, 단지 약 10 mM, 단지 약 50 mM, 단지 약 100 mM, 또는 단지 약 500 mM일 수 있다.
일부 실시태양에서, 배양 조건은 혐기성 또는 실질적으로 혐기성인 생육 또는 유지 조건을 포함한다. 예시적인 혐기성 조건들은 앞서 개시되었으며 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 발효 공정에 예시적인 혐기성 조건은 본 발명에 개시되어 있으며, 예를 들어 2007년 8월 10일자로 출원된 미국 공보 제 2009/0047719 호에 개시되어 있다. 이들 조건 중 어느 것이든 상기 비-천연 미생물 유기체뿐만 아니라 당해 분야에 널리 공지된 다른 혐기성 조건들과 함께 사용될 수 있다. 상기와 같은 혐기성 조건 하에서, 상기 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 생산자는 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신을 5 내지 10 mM 이상의 세포 내 농도뿐만 아니라 본 발명에 예시된 다른 농도들로 합성할 수 있다. 비록 상기 설명이 세포 내 농도를 지칭하지만, 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 생산 미생물 유기체가 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신을 세포 내적으로 및/또는 상기 생성물을 배양 배지 내로 분비할 수 있음이 이해된다.
상기 배양 조건은 예를 들어 액체 배양 과정뿐만 아니라 발효 및 다른 대규모 배양 과정을 포함할 수 있다. 본 발명에 개시된 바와 같이, 본 발명의 생합성 생성물의 특히 유용한 수율을 혐기성 또는 실질적으로 혐기성 배양 조건 하에서 획득할 수 있다.
본 발명에 개시된 바와 같이, 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신의 생합성을 성취하기 위한 하나의 예시적인 생육 조건은 혐기성 배양 또는 발효 조건을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 비-천연 미생물 유기체를 혐기성 또는 실질적으로 혐기성인 조건 하에서 지속시키거나, 배양하거나 발효시킬 수 있다. 간단히, 혐기성 조건은 산소가 없는 환경을 지칭한다. 실질적으로 혐기성 조건은 예를 들어 배지 중에 용해된 산소 농도가 0 내지 10%의 포화율로 남아 있도록 하는 배양, 회분 발효 또는 연속 발효를 포함한다. 실질적으로 혐기성 조건은 또한 1% 미만의 산소 분위기로 유지된 밀폐된 챔버 내부의 액체 배지 중에서 또는 고체 아가 상에서의 세포의 생육 또는 휴지를 포함한다. 상기 산소의 퍼센트를 예를 들어 상기 배양물에 N2/CO2 혼합물 또는 다른 적합한 비-산소 기체 또는 기체들을 살포함으로써 유지시킬 수 있다.
본 발명은 또한 4-하이드록시부타노에이트 데하이드로게나제, CoA-독립적인 숙시닉 세미알데하이드 데하이드로게나제, 숙시닐-CoA 신시타제, CoA-의존성 숙시닉 세미알데하이드 데하이드로게나제, 4-하이드록시부티레이트:CoA 트랜스퍼라제, 글루타메이트:숙시닉 세미알데하이드 트랜스아미나제, 글루타메이트 데카복실라제, CoA-독립적인 알데하이드 데하이드로게나제, CoA-의존성 알데하이드 데하이드로게나제 또는 알콜 데하이드로게나제를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 4-하이드록시부탄산(4-HB) 및 1,4-부탄다이올(BDO) 생합성 경로를 갖는 미생물 유기체를 포함한 비-천연 미생물 생체촉매를 제공하며, 여기에서 상기 외래 핵산은 1,4-부탄다이올(BDO)을 생산하기에 충분한 양으로 발현된다. 4-하이드록시부티레이트:CoA 트랜스퍼라제는 또한 4-하이드록시부티릴 CoA:아세틸-CoA 트랜스퍼라제로서 공지되어 있다. 추가의 4-HB 또는 BDO 경로 효소들이 또한 본 발명에 개시되어 있다(실시예 및 도 8 내지 13 참조).
본 발명은 4-하이드록시부탄산(4-HB) 및 1,4-부탄다이올(BDO) 생합성 경로를 갖는 미생물 유기체를 포함한 비-천연 미생물 생체촉매를 제공하며, 상기 경로는 4-하이드록시부타노에이트 데하이드로게나제, 숙시닐-CoA 신시타제, CoA-의존성 숙시닉 세미알데하이드 데하이드로게나제, 4-하이드록시부티레이트:CoA 트랜스퍼라제, 4-부티레이트 키나제, 포스포트랜스부티릴라제, α-케토글루타레이트 데카복실라제, 알데하이드 데하이드로게나제, 알콜 데하이드로게나제 또는 알데하이드/알콜 데하이드로게나제를 포함하고, 여기에서 상기 외래 핵산은 1,4-부탄다이올(BDO)을 생산하기에 충분한 양으로 발현된다.
BDO를 생합성하는 비-천연 미생물 유기체를 또한 생성시킬 수 있다. 본 발명의 4-HB 생산 미생물 유기체와 같이, BDO 생산 미생물 유기체는 또한 상기 BDO를 세포 내적으로 생산하거나 배양 배지에 분비시킬 수 있다. 4-HB를 합성하는 미생물 유기체의 제작에 대해 앞서 제공된 교시 및 지침에 따라, 추가의 BDO 경로들을 상기 4-HB 생산 미생물 유기체에 통합시켜 BDO 및 다른 BDO 계 화합물을 또한 합성하는 유기체들을 생성시킬 수 있다. BDO 및 그의 하부 생성물들의 화학 합성은 공지되어 있다. BDO 생합성이 가능한 본 발명의 비-천연 미생물 유기체는 도 1에 예시된 바와 같이 4-HB를 입구로서 사용하여 상기 화학 합성을 앞지른다. 하기에 추가로 개시하는 바와 같이, 4-HB 생산자를 또한 예를 들어 4-HB를 GBL로, 및 이어서 BDO 또는 THF로 화학적으로 전환시키는데 사용할 수 있다. 한편으로, 상기 4-HB 생산자를, 4-HB 및/또는 GBL을 BDO로 전환하는 생합성 능력을 포함하도록 추가로 변형시킬 수 있다.
4-HB 생산자 내로의 도입을 위한 추가의 BDO 경로들은 예를 들어 숙주 결함 배경에서의 외부 발현 또는 단계 9 내지 13으로서 도 1에 예시된 효소들 중 하나 이상의 과발현을 포함한다. 하나의 상기와 같은 경로는 예를 들어 도 1에서 단계 9, 12 및 13으로서 도시된 반응들을 수행하는데 필요한 효소 활성들을 포함하며, 상기 단계에서 알데하이드 및 알콜 데하이드로게나제는 알데하이드와 알콜 데하이드로게나제 활성을 모두 갖는 별도의 효소 또는 다작용성 효소일 수 있다. 또 다른 상기와 같은 경로는 예를 들어 도 1에서 단계 10, 11, 12 및 13으로서 도시된 반응들을 수행하는데 필요한 효소 활성들을 포함하며, 상기 단계에서 알데하이드 및 알콜 데하이드로게나제는 알데하이드와 알콜 데하이드로게나제 활성을 모두 갖는 별도의 효소 또는 다작용성 효소일 수 있다. 따라서, 4-HB 생산자 내로의 도입을 위한 추가의 BDO 경로들은 예를 들어 숙주 결함 배경에서의 외부 발현 또는 4-하이드록시부티레이트:CoA 트랜스퍼라제, 부티레이트 키나제, 포스포트랜스부티릴라제, CoA-독립적인 알데하이드 데하이드로게나제, CoA-의존성 알데하이드 데하이드로게나제 또는 알콜 데하이드로게나제 중 하나 이상의 과발현을 포함한다. 4-HB를 변형시킬 수 있는 내생적인 아실-CoA 신시타제의 부재 하에서, 상기 비-천연 BDO 생산 미생물 유기체는 4-HB에 대해 선택성인 외래 아실-CoA 신시타제, 또는 4-HB의 4-HB-CoA로의 순 반응 전환을 갖는 다수 효소들의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 하기 실시예에 추가로 예시되는 바와 같이, 부티레이트 키나제 및 포스포트랜스부티릴라제는 BDO 경로 활성을 나타내며 4-HB 기질과 함께 도 1에 예시된 전환을 촉매화한다. 따라서, 이들 효소를 또한 본 발명에서는 각각 4-하이드록시부티레이트 키나제 및 포스포트랜스하이드록시부티릴라제로서 지칭할 수 있다.
4-HB에서 BDO로의 이들 생체 내 전환에 사용될 수 있는 예시적인 알콜 및 알데하이드 데하이드로게나제들을 하기 표 1에 나타낸다.
4-HB에서 BDO로의 전환을 위한 알콜 및 알데하이드 데하이드로게나제들
알콜 데하이드로게나제
ec:1.1.1.1 알콜 데하이드로게나제
ec:1.1.1.2 알콜 데하이드로게나제 (NADP+)
ec:1.1.1.4 (R,R)-부탄다이올 데하이드로게나제
ec:1.1.1.5 아세토인 데하이드로게나제
ec:1.1.1.6 글리세롤 데하이드로게나제
ec:1.1.1.7 프로판다이올-포스페이트 데하이드로게나제
ec:1.1.1.8 글리세롤-3-포스페이트 데하이드로게나제(NAD+)
ec:1.1.1.11 D-아라비니톨 4-데하이드로게나제
ec:1.1.1.12 L-아라비니톨 4-데하이드로게나제
ec:1.1.1.13 L-아라비니톨 2-데하이드로게나제
ec:1.1.1.14 L-이디톨 2-데하이드로게나제
ec:1.1.1.15 D-이디톨 2-데하이드로게나제
ec:1.1.1.16 갈락티톨 2-데하이드로게나제
ec:1.1.1.17 만니톨-1-포스페이트 5-데하이드로게나제
ec:1.1.1.18 이노시톨 2-데하이드로게나제
ec:1.1.1.21 알데하이드 리덕타제
ec:1.1.1.23 히스티디놀 데하이드로게나제
ec:1.1.1.26 글리옥실레이트 리덕타제
ec:1.1.1.27 L-락테이트 데하이드로게나제
ec:1.1.1.28 D-락테이트 데하이드로게나제
ec:1.1.1.29 글리세레이트 데하이드로게나제
ec:1.1.1.30 3-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제
ec:1.1.1.31 3-하이드록시아이소부티레이트 데하이드로게나제
ec:1.1.1.35 3-하이드록시아실-CoA 데하이드로게나제
ec:1.1.1.36 아세토아세틸-CoA 리덕타제
ec:1.1.1.37 말레이트 데하이드로게나제
ec:1.1.1.38 말레이트 데하이드로게나제(옥살로아세테이트-탈카복실화)
ec:1.1.1.39 말레이트 데하이드로게나제(탈카복실화)
ec:1.1.1.40 말레이트 데하이드로게나제(옥살로아세테이트-탈카복실화)(NADP+)
ec:1.1.1.41 아이소시트레이트 데하이드로게나제(NAD+)
ec:1.1.1.42 아이소시트레이트 데하이드로게나제(NADP+)
ec:1.1.1.54 알릴-알콜 데하이드로게나제
ec:1.1.1.55 락트알데하이드 리덕타제(NADPH)
ec:1.1.1.56 리비톨 2-데하이드로게나제
ec:1.1.1.59 3-하이드록시프로피오네이트 데하이드로게나제
ec:1.1.1.60 2-하이드록시-3-옥소프로피오네이트 리덕타제
ec:1.1.1.61 4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제
ec:1.1.1.66 오메가-하이드록시데카노에이트 데하이드로게나제
ec:1.1.1.67 만니톨 2-데하이드로게나제
ec:1.1.1.71 알콜 데하이드로게나제[NAD(P)+]
ec:1.1.1.72 글리세롤 데하이드로게나제(NADP+)
ec:1.1.1.73 옥탄올 데하이드로게나제
ec:1.1.1.75 (R)-아미노프로판올 데하이드로게나제
ec:1.1.1.76 (S,S)-부탄다이올 데하이드로게나제
ec:1.1.1.77 락트알데하이드 리덕타제
ec:1.1.1.78 메틸글리옥살 리덕타제(NADH-의존성)
ec:1.1.1.79 글리옥실레이트 리덕타제(NADP+)
ec:1.1.1.80 아이소프로판올 데하이드로게나제(NADP+)
ec:1.1.1.81 하이드록시피루베이트 리덕타제
ec:1.1.1.82 말레이트 데하이드로게나제(NADP+)
ec:1.1.1.83 D-말레이트 데하이드로게나제(탈카복실화)
ec:1.1.1.84 다이메틸말레이트 데하이드로게나제
ec:1.1.1.85 3-아이소프로필말레이트 데하이드로게나제
ec:1.1.1.86 케톨-산 리덕트아이소머라제
ec:1.1.1.87 호모아이소시트레이트 데하이드로게나제
ec:1.1.1.88 하이드록시메틸글루타릴-CoA 리덕타제
ec:1.1.1.90 아릴-알콜 데하이드로게나제
ec:1.1.1.91 아릴-알콜 데하이드로게나제(NADP+)
ec:1.1.1.92 옥살로글리콜레이트 리덕타제 (탈카복실화)
ec:1.1.1.94 글리세롤-3-포스테이트 데하이드로게나제[NAD(P)+]
ec:1.1.1.95 포스포글리세라이트 데하이드로게나제
ec:1.1.1.97 3-하이드록시벤질-알콜 데하이드로게나제
ec:1.1.1.101 아실글리세론-포스테이트 리덕타제
ec:1.1.1.103 L-쓰레오닌 3-데하이드로게나제
ec:1.1.1.104 4-옥소프롤린 리덕타제
ec:1.1.1.105 레티놀 데하이드로게나제
ec:1.1.1.110 인돌락테이트 데하이드로게나제
ec:1.1.1.112 인다놀 데하이드로게나제
ec:1.1.1.113 L-자일로스 1-데하이드로게나제
ec:1.1.1.129 L-쓰레오네이트 3-데하이드로게나제
ec:1.1.1.137 리비톨-5-포스테이트 2-데하이드로게나제
ec:1.1.1.138 만니톨 2-데하이드로게나제(NADP+)
ec:1.1.1.140 솔비톨-6-포스테이트 2-데하이드로게나제
ec:1.1.1.142 D-피니톨 데하이드로게나제
ec:1.1.1.143 세쿠오이톨 데하이드로게나제
ec:1.1.1.144 페릴일-알콜 데하이드로게나제
ec:1.1.1.156 글리세롤 2-데하이드로게나제(NADP+)
ec:1.1.1.157 3-하이드록시부티릴-CoA 데하이드로게나제
ec:1.1.1.163 사이클로펜탄올 데하이드로게나제
ec:1.1.1.164 헥사데칸올 데하이드로게나제
ec:1.1.1.165 2-알킨-1-올 데하이드로게나제
ec:1.1.1.166 하이드록시사이클로헥산카복실레이트 데하이드로게나제
ec:1.1.1.167 하이드록시말로네이트 데하이드로게나제
ec:1.1.1.174 사이클로헥산-1,2-다이올 데하이드로게나제
ec:1.1.1.177 글리세롤-3-포스테이트 1-데하이드로게나제(NADP+)
ec:1.1.1.178 3-하이드록시-2-메틸뷰틸릴-CoA 데하이드로게나제
ec:1.1.1.185 L-글리콜 데하이드로게나제
ec:1.1.1.190 인돌-3-아세트알데하이드 리덕타제(NADH)
ec:1.1.1.191 인돌-3-아세트알데하이드 리덕타제(NADPH)
ec:1.1.1.192 장쇄-알콜 데하이드로게나제(표1계속)
ec:1.1.1.194 코니페릴-알콜 데하이드로게나제
ec:1.1.1.195 신나밀-알콜 데하이드로게나제
ec:1.1.1.198 (+)-보르네올 데하이드로게나제
ec:1.1.1.202 1,3-프로판다이올 데하이드로게나제
ec:1.1.1.207 (-)-멘톨 데하이드로게나제
ec:1.1.1.208 (+)-네오멘톨 데하이드로게나제
ec:1.1.1.216 파르네솔 데하이드로게나제
ec:1.1.1.217 벤질-2-메틸-하이드록시뷰틸레이트 데하이드로게나제
ec:1.1.1.222 (R)-4-하이드록시페닐락테이트 데하이드로게나제
ec:1.1.1.223 아이소피페리테놀 데하이드로게나제
ec:1.1.1.226 4-하이드록사이클로헥산카복시레이트 데하이드로게나제
ec:1.1.1.229 다이에틸 2-메틸-3옥소숙시네이트
ec:1.1.1.237 하이드록시페닐피루베이트 리덕타제
ec:1.1.1.244 메탄올 데하이드로게나제
ec:1.1.1.245 사이클로헥산올 데하이드로게나제
ec:1.1.1.250 D-아라비니톨 2-데하이드로게나제
ec:1.1.1.251 갈락티톨 1-포스페이트 5-데하이드로게나제
ec:1.1.1.255 만니톨 데하이드로게나제
ec:1.1.1.256 플루오렌-9-올 데하이드로게나제
ec:1.1.1.257 4-(하이드록시메틸)벤젠설포네이트 데하이드로게나제
ec:1.1.1.258 6-하이드록시헥사노에이트 데하이드로게나제
ec:1.1.1.259 3-하이드록시피멜로일-CoA 데하이드로게나제
ec:1.1.1.261 글리세롤-1-포스테이트 데하이드로게나제[NAD(P)+]
ec:1.1.1.265 3-메틸부탄알 리덕타제
ec:1.1.1.283 메틸글리옥살 리덕타제(NADPH-의존성)
ec:1.1.1.286 아이소시트레이트-호모아이소시트레이트
ec:1.1.1.287 D-아라비니톨 데하이드로게나제(NADP+) 부탄올 데하이드로게나제
알데하이드 데하이드로게나제
ec:1.2.1.2 포메이트 데하이드로게나제
ec:1.2.1.3 알데하이드 데하이드로게나제(NAD+)
ec:1.2.1.4 알데하이드 데하이드로게나제(NADP+)
ec:1.2.1.5 알데하이드 데하이드로게나제[NAD(P)+]
ec:1.2.1.7 벤즈알데하이드 데하이드로게나제(NADP+)
ec:1.2.1.8 베타인-알데하이드 데하이드로게나제
ec:1.2.1.9 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제(NADP+)
ec:1.2.1.10 아세트알데하이드 데하이드로게나제(아세틸화)
ec:1.2.1.11 아스파테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제
ec:1.2.1.12 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제(인산화)
ec:1.2.1.13 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제(NADP+)(인산화)
ec:1.2.1.15 말로네이트-세미알데하이드 데하이드로게나제
ec:1.2.1.16 숙시네이트-세미알데하이드 데하이드로게나제[NAD(P)+]
ec:1.2.1.17 글리옥실레이트 데하이드로게나제(아실화)
ec:1.2.1.18 말로네이트-세미알데하이드 데하이드로게나제(아세틸화)
ec:1.2.1.19 아미노뷰틸알데하이드 데하이드로게나제
ec:1.2.1.20 글루타레이트-세미알데하이드 데하이드로게나제
ec:1.2.1.21 글리콜알데하이트 데하이드로게나제
ec:1.2.1.22 락트알데하이드 데하이드로게나제
ec:1.2.1.23 2-옥소알데하이드 데하이드로게나제(NAD+)
ec:1.2.1.24 숙시네이트-세미알데하이드 데하이드로게나제
ec:1.2.1.25 2-옥소아이소발레레이트 데하이드로게나제(아실화)
ec:1.2.1.26 2,5-다이옥소발레레이트 데하이드로게나제
ec:1.2.1.27 메틸말로네이트-세미알데하이드 데하이드로게나제(아실화)
ec:1.2.1.28 벤자알데하이드 데하이드로게나제(NAD+)
ec:1.2.1.29 아릴-알데하이드 데하이드로게나제
ec:1.2.1.30 아릴-알데하이드 데하이드로게나제(NADP+)
ec:1.2.1.31 L-아미노아디페이트-세미알데하이드 데하이드로게나제
ec:1.2.1.32 아미노뮤코네이트-세미알데하이드 데하이드로게나제
ec:1.2.1.36 레티날 데하이드로게나제
ec:1.2.1.39 페닐아세트알데하이드 데하이드로게나제
ec:1.2.1.41 글루타메이트-5-세미알데하이드 데하이드로게나제
ec:1.2.1.42 헥사데칸알 데하이드로게나제(아실화)
ec:1.2.1.43 포메이트 데하이드로게나제(NADP+)
ec:1.2.1.45 4-카복시-2-하이드록시뮤코네이트-6-세미알데하이드 데하이드로게나제
ec:1.2.1.46 폼알데하이드 데하이드로게나제
ec:1.2.1.47 4-트라이메틸암모니오부티르알데하이드 데하이드로게나제
ec:1.2.1.48 장쇄-알데하이드 데하이드로게나제
ec:1.2.1.49 2-옥소알데하이드 데하이드로게나제(NADP+)
ec:1.2.1.51 피루베이트 데하이드로게나제(NADP+)
ec:1.2.1.52 옥소글루타레이트 데하이드로게나제(NADP+)
ec:1.2.1.53 4-하이드록시페닐아세트알데하이드 데하이드로게나제
ec:1.2.1.57 부탄알 데하이드로게나제(표1계속)
ec:1.2.1.58 페닐글리옥실레이트 데하이드로게나제(아실화)
ec:1.2.1.59 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제(NAD(P)+)(인산화)
ec:1.2.1.62 4-폼일벤젠설포네이트 데하이드로게나제
ec:1.2.1.63 6-옥소헥사노에이트 데하이드로게나제
ec:1.2.1.64 4-하이드록시벤질알데하이드 데하이드로게나제
ec:1.2.1.65 살리실알데하이드 데하이드로게나제
ec:1.2.1.66 마이코티올-의존성 폼알데하이드 데하이드로게나제
ec:1.2.1.67 바닐린 데하이드로게나제
ec:1.2.1.68 코니페릴-알데하이드 데하이드로게나제
ec:1.2.1.69 플루오르아세트알데하이드 데하이드로게나제
ec:1.2.1.71 숙시닐글루타메이트-세미알데하이드 데하이드로게나제
다른 예시적인 효소들 및 경로들을 본 발명에 개시한다(실시예 참조). 더욱 또한, 상기 기질이 천연 기질이 아닌 반응들을 수행하기 위해 효소들을 사용할 수 있는 것으로 생각된다. 비-천연 기질에 대한 활성이 천연 기질보다 더 낮을 수도 있지만, 상기와 같은 효소를 본 발명에 개시되는 바와 같이 방향 진화 또는 적응 진화를 사용하여 천연으로 사용하거나 변형시킬 수 있을 것으로 생각된다(또한 실시예 참조).
본 발명에 개시된 경로들 중 임의의 경로를 통한 BDO 생산은 부분적으로 전구체들의 BDO로의 전환에 적합한 효소들의 동정에 근거한다. 상기 반응 단계들 중 몇몇에 대한 다수의 특이 효소들이 동정되었다. 반응 전구체에 특이적인 효소들이 동정되지 않은 형질전환들의 경우, 상기 반응 단계들을 수행하기에 가장 적합한 효소 후보들을 동정하였다. 효소들은 하기에 논의되는 바와 같이, 광범위한 기질 상에서 작동하는 것으로 입증되었다. 또한, 단백질 공학 분야의 진보는 효소들이, 자연 기질이 아니라 하더라도 기질 상에서 효율적으로 작용하도록 변경될 수 있게 한다. BDO 경로에 적합한 다양한 부류들로부터의 광범위한-특이 효소들의 몇몇 예 및 비-천연 기질 상에서 작용하도록 효소들을 진화시키는데 사용된 방법들을 하기에 개시한다.
BDO 경로들에서 효소의 핵심 부류는 케톤 또는 알데하이드를 알콜로 상호전환시키는 옥시도리덕타제이다(1.1.1). 상기 부류의 다수의 예시적인 효소들은 광범위한 기질 상에서 작용할 수 있다. 토양 세균 브레비박테리움(Brevibacterium) sp KU 1309로부터 정제된 알콜 데하이드로게나제(1.1.1.1)(문헌[Hirano et al., J. Biosci. Bioeng. 100:318-322(2005)])는 과잉의 지방족뿐만 아니라 방향족 알콜 상에서 고 활성으로 작용하는 것으로 입증되었다. 표 2는 상기 효소의 활성 및 상이한 알콜 상에서의 그의 Km을 나타낸다. 상기 효소는 가역적이며 또한 여러 알데하이드 상에서 매우 높은 활성을 갖는다(표 3).
다양한 알콜들을 산화시키는 브레비박테리움 sp KU로부터의 알콜 데하이드로게나제의 상대 활성
기질 상대 활성(%) KM(MM)
2-페닐에탄올 100* 0.025
(S)-2-페닐프로판올 156 0.157
(R)-2-페닐프로판올 63 0.020
벤질 알콜 199 0.012
3-페닐프로판올 135 0.033
에탄올 76
1-부탄올 111
1-옥탄올 101
1-도데칸올 68
1-페닐에탄올 46
2-프로판올 54
*19.2 U/㎎에 상응하는, 2-페닐에탄올의 활성을 100%로 간주하였다.
다양한 카보닐 화합물들을 환원시키는 브레비박테리움 sp KU 1309로부터의 알콜 데하이드로게나제의 상대 활성
기질 상대 활성(%) KM(MM)
페닐아세트알데하이드 100 0.261
2-페닐프로피온알데하이드 188 0.864
1-옥틸알데하이드 87
아세토페논 0
랄스토니아 유트로파로부터의 락테이트 데하이드로게나제(1.1.1.27)는 여러 2-옥소산, 예를 들어 2-옥소부티레이트, 2-옥소펜타노에이트 및 2-옥소글루타레이트(2-옥소아디페이트와 유사한 C5 화합물)에 대해 높은 활성을 갖는 것으로 입증된 또 다른 효소이다(문헌[Steinbuchel and Schlegel, Eur. J. Biochem. 130:329-334(1983)]). 표 4의 컬럼 2는 랄스토니아 유트로파(이전에는 알칼리제네스 유트로푸스(Alcaligenes eutrophus))로부터의 ldhA의 상이한 기질들에 대한 활성을 나타낸다(상기 Steinbuchel and Schlegel, 1983).
상이한 기질 상의 랄스토니아 유트로파 ldhA(상기 Steinbuchel and Schlegel, 1983)의 시험관 내 활성 및 피루베이트 상에서의 경우와 비교
기질 활성(%)
알칼리제네스 유트로푸스로부터의 L(+)-락테이트 데하이드로게나제 토끼 근육으로부터의 L(+)-락테이트 데하이드로게나제 락토바실러스 레이슈마니이(Lactobacillus leischmanii)로부터의 D(-)-락테이트 데하이드로게나제
글리옥실레이트 8.7 23.9 5.0
피루베이트 100.0 100.0 100.0
2-옥소부티레이트 107.0 18.6 1.1
2-옥소발레레이트 125.0 0.7 0.0
3-메틸-2-옥소부티레이트 28.5 0.0 0.0
3-메틸-2-옥소발레레이트 5.3 0.0 0.0
4-메틸-2-옥소펜타노에이트 39.0 1.4 1.1
옥살로아세테이트 0.0 33.1 23.1
2-옥소글루타레이트 79.6 0.0 0.0
3-플루오로피루베이트 33.6 74.3 40.0
2-옥소산을 그의 아실-CoA 대응물로 전환시킬 수 있는 옥시도리덕타제(1.2.1)가 또한 다수의 기질들을 수용하는 것으로 나타났다. 예를 들어, 분지쇄 2-케토산 데하이드로게나제 복합체(BCKAD)(또한 2-옥소아이소발레레이트 데하이드로게나제(1.2.1.25)로서 공지됨)는 분지쇄 아미노산 분해 경로에 관여하여, 발린, 류신 및 아이소류신의 2-케토산 유도체를 그들의 아실-CoA 유도체와 CO2로 전환시킨다. 라투스 노르베기쿠스(문헌[Paxton et al., Biochem. J. 234:295-303(1986)]) 및 사카로마이세스 세레비지아에(문헌[Sinclair et al., Biochem. Mol. Biol. Int. 31:911-922(1993)])를 포함한 일부 유기체들에서, 상기 복합체는 상기 분지쇄 아미노산 전구체들 이외에, 선형 옥소-산, 예를 들어 2-옥소부타노에이트 및 알파-케토글루타레이트를 포함한 광범위한 기질 범위를 갖는 것으로 나타났다.
더욱 또 다른 부류의 효소들의 구성원, 즉 아미노트랜스퍼라제(2.6.1)가 다수의 기질 상에서 작용하는 것으로 보고되었다. 파이로코커스 푸르셔스(Pyrococcus fursious)로부터의 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제(aspAT)가 동정되었으며, 에스케리키아 콜라이에서 발현되었고, 재조합 단백질은 상기 효소가 아스파테이트 및 알파-케토글루타레이트에 대해 가장 높은 활성을 갖지만, 알라닌, 글루타메이트 및 방향족 아미노산들에 대해서는 더 낮은, 그러나 유의수준의 활성을 가짐을 나타내는 것으로 특성화되었다(문헌[Ward et al., Archaea. 1:133-141(2002)]). 또 다른 경우에, 레이슈마니아 멕시카나(Leishmania mexicana)로부터 동정되고 에스케리키아 콜라이에서 발현된 아미노트랜스퍼라제(문헌[Vernal et al., FEMS Microbiol. Lett. 229:217-222(2003)])는 각각 타이로신(활성이 타이로신에 대해 100%로 간주되었다), 페닐알라닌(90%), 트립토판(85%), 아스파테이트(30%), 류신(25%) 및 메티오닌(25%)에 대해 광범위한 기질 특이성을 갖는 것으로 보고되었다(문헌[Vernal et al., Mol. Biochem. Parasitol. 96:83-92(1998)]). 유사한 광범위한 특이성이 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi)로부터 타이로신 아미노트랜스퍼라제에 대해 보고되었지만, 이들 두 효소 모두 단지 6%의 서열 상동성을 갖는다. 상기 나중의 효소가 효율적인 아미노 공여체로서 류신, 메티오닌뿐만 아니라 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판 및 알라닌을 수용할 수 있음에 주목한다(문헌[Nowicki et al., Biochim. Biophys. Acta 1546:268-281(2001)]).
CoA 트랜스퍼라제(2.8.3)는 하나보다 많은 기질 상에서 작용하는 능력을 갖는 것으로 입증되었다. 구체적으로, CoA 트랜스퍼라제는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰으로부터 정제되었으며 아세테이트, 프로피오네이트 및 부티레이트 상에서 최대의 활성을 갖는 것으로 보고되었다. 상기 효소는 또한 발레레이트, 아이소부티레이트 및 크로토네이트에 대해 현저한 활성을 가졌다(문헌[Wiesenborn et al., Appl. Environ. Microbiol. 55:323-329(1989)]). 또 다른 연구에서, 에스케리키아 콜라이 효소 아실-CoA:아세테이트-CoA 트랜스퍼라제(또한 아세테이트-CoA 트랜스퍼라제(EC 2.8.3.8)로서 공지됨)는 다양한 분지 및 선형 아실-CoA 기질, 예를 들어 아이소부티레이트(문헌[Matthies and Schink, Appl Environ Microbiol 58:1435-1439(1992)]), 발레레이트(문헌[Vanderwinkel et al., Biochem. Biophys. Res Commun. 33:902-908(1968b)]) 및 부타노에이트(문헌[Vanderwinkel et al., Biochem. Biophys. Res Commun. 33:902-908(1968a)])로부터 CoA 부분을 아세테이트로 운반하는 것으로 입증되었다.
다른 효소 부류들은 효소에 대한 넓은 기질 특이성을 추가로 지지한다. 일부 아이소머라제(5.3.3)가 또한 다수의 기질 상에서 작용하는 것으로 입증되었다. 예를 들어, 슈도모나스 스투트제리(stutzeri)로부터의 L-람노스 아이소머라제는 다양한 알돌라제와 케토오스 간의 이성화를 촉매화한다(문헌[Yoshida et al., J. Mol. Biol. 365:1505-1516(2007)]). 여기에는 L-람노스와 L-람눌로스, L-만노스와 L-프럭토스, L-자일로스와 L-자일룰로스, D-리보스와 D-리뷸로스, 및 D-알로스와 D-프시코스 간의 이성화가 있다.
더욱 또 다른 효소 부류에서, L-호모세린을 L-호모세린 포스페이트로 전환시키는 에스케리키아 콜라이로부터의 호모세린 키나제(2.7.1.39), 포스포트랜스퍼라제(2.7.1)는 다수의 호모세린 동족체들을 인산화하는 것으로 밝혀졌다. 이들 기질에서, R-위치에서 카복시 작용기는 에스터 또는 하이드록시메틸 그룹에 의해 치환되었다(문헌[Huo and Viola, Biochemistry 35:16180-16185(1996)]). 표 5는 상기 키나제의 넓은 기질 특이성을 나타낸다.
Figure pct00001
BDO 경로들에 유용한 또 다른 부류의 효소는 산-티올 리가제(6.2.1)이다. 다른 부류의 효소들처럼, 상기 부류의 몇몇 효소는 넓은 기질 특이성을 갖는 것으로 측정되었다. 예를 들어, 슈도모나스 푸티다로부터의 아실 CoA 리가제는 아세트산, 프로피온산, 부티르산, 발레르산, 헥산산, 헵탄산 및 옥탄산을 포함한 다수의 지방족 기질들, 및 페닐아세트산 및 페녹시아세트산과 같은 방향족 화합물들 상에서 작용하는 것으로 나타났다(문헌[Fernandez-Valverde et al, Appl. Envrion. Microbiol. 59:1149-1154(1993)]). 리조븀 트리폴리이(Rhizobium trifolii)로부터의 관련된 효소, 말로닐 CoA 신시타제(6.3.4.9)는 몇몇 이산, 즉 에틸-, 프로필-, 알릴-, 아이소프로필-, 다이메틸-, 사이클로프로필-, 사이클로프로필메틸렌-, 사이클로부틸- 및 벤질-말로네이트를 그들의 상응하는 모노티오에스터로 전환시킬 수 있었다(문헌[Pohl et al., J. Am. Chem. Soc. 123:5822-5823(2001)]). 유사하게, 광범위한 기질 범위를 갖는 데카복실라제(4.1.1)를 발견하였다. 피루베이트 데카복실라제(PDC)(또한 케토산 데카복실라제로 지칭됨)는 알콜 발효에 핵심 효소이며, 피루베이트의 아세트알데하이드로의 탈카복실화를 촉매화한다. 사카로마이세스 세레비지아에로부터의 효소는 2-케토부티레이트, 2-케토발레레이트, 및 2-페닐피루베이트를 포함한 지방족 2-케토산에 대해 광범위한 기질 범위를 갖는다(문헌[Li and Jordan, Biochemistry, 38:10004-10012(1999)]). 유사하게, 벤조일포메이트 데카복실라제는 넓은 기질 범위를 가지며 효소 공학 연구의 표적이었다. 슈도모나스 푸티다로부터의 효소가 광범위하게 연구되었으며 상기 효소의 결정 구조를 입수할 수 있다(문헌[Polovnikova et al., Biochemistry 42:1820-1830(2003); Hasson et al., Biochemistry 37:9918-9930(1998)]). 분지쇄 알파-케토산 데카복실라제(BCKA)가 탄소수 3 내지 6의 다양한 쇄 길이의 다양한 화합물들 상에서 작용하는 것으로 나타났다(문헌[Oku and Kaneda, J. Biol. Chem. 263:18386-18396(1998); Smit et al., Appl. Environ. Microbiol. 71:303-311(2005b)]). 락토코커스 락티스 중의 효소가 2-옥소부타노에이트, 2-옥소헥사노에이트, 2-옥소펜타노에이트, 3-메틸-2-옥소부타노에이트, 4-메틸-2-옥소부타노에이트 및 아이소카프로에이트를 포함한 다양한 분지 및 선형 기질들 상에서 특성화되었다(문헌[Smit et al., Appl Environ Microbiol 71:303-311(2005a)]).
흥미롭게, 하나의 우세한 활성을 갖는 효소들이 또한 매우 상이한 작용을 촉매화하는 것으로 지적되었다. 예를 들어, 바실러스 스테아로써모필루스(Bacillus stearothermophilus) 및 바실러스 서브틸리스로부터의 보조인자-의존성 포스포글리세레이트 뮤타제(5.4.2.1)는 또한 포스파타제로서 작용하는 것으로 공지되어 있다(문헌[Rigden et al., Protein Sci. 10:1835-1846(2001)]). 바실러스 스테아로써모필루스로부터의 효소는 3-포스포글리세레이트, 알파-나프틸포스페이트, p-나이트로페닐포스페이트, AMP, 프럭토스-6-포스페이트, 리보스-5-포스페이트 및 CMP를 포함한 몇몇 기질들에 대해 활성을 갖는 것으로 공지되어 있다.
상기 효소가 자연적으로 광범위한 기질 특이성을 갖는 상기 예와 대조적으로, 다수의 효소들을 비-천연 기질에 대한 그들의 특이성을 확장시키는 방향 진화를 사용하여 변형시켰다. 한편으로, 효소의 기질 선호를 또한 방향 진화를 사용하여 변화시켰다. 따라서, 주어진 효소를, 예를 들어 개선된 효율을 위해서는 천연 기질 상에서, 또는 예를 들어 증가된 효율을 위해서는 비-천연 기질 상에서 효율적으로 작용하도록 조작할 수 있다. 예를 들어, 슈도모나스 아에루기노사로부터의 리파제의 거울상 선택성이 현저하게 개선된 것으로 보고되었다(문헌[Reetz et al., Agnew. Chem. Int. Ed Engl. 36:2830-2832(1997)]). 상기 효소는 p-나이트로페닐 2-메틸데카노에이트를 (S)-산의 편에서 단지 2%의 거울상이성체 과잉(ee)으로 가수분해하였다. 그러나, 4 회의 연속적인 라운드의 실수유발 돌연변이 및 선별 후에, 상기 필수 반응을 81% ee로 촉매화한 변체가 생성되었다(문헌[Reetz et al., Angew. Chem. Int. Ed Engl. 36:2830-2832(1997)]).
방향 진화 방법은 효소가 비-천연 기질들의 배열상에서 작용하도록 상기 효소를 변형시키는데 사용되었다. 슈도모나스 아에루기노사 중의 리파제의 기질 특이성은 활성 부위 부근의 아미노산 잔기의 랜덤화에 의해 확대되었다. 이는 상기 효소에 의한 알파-치환된 카복실산 에스터의 수용을 허용하였다(문헌[Reetz et al., Angew. Chem. Int. Ed Engl. 44:4192-4196(2005)]). 또 다른 성공적인 시도에서, DNA 셔플링을 사용하여 β-분지된 기질(야생형 효소에 의해서는 불충분하게 수용되었다)을 수용한 에스케리키아 콜라이 아미노트랜스퍼라제를 생성시켰다(문헌[Yano et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:5511-5515(1998)]). 구체적으로, 4 라운드의 셔플링의 끝에서, 발린 및 2-옥소발린에 대한 아스파테이트 아미노트랜스러파제의 활성이 5 이하 정도의 크기까지 증가한 반면, 천연 기질인 아스파테이트에 대한 활성은 30 배 이하까지 감소하였다. 최근에, 연산방식을 사용하여, 비-천연 및 비-생물 기질, 4-하이드록시-4-(6-메톡시-2-나프틸)-2-부탄온 중의 탄소-탄소 결합 절단을 촉매화하는데 사용될 수 있는 레트로-알돌라제를 디자인하였다(문헌[Jiang et al., Science 319:1387-1391(2008)]). 상기 연산방식은 4 개의 상이한 촉매 동기들의 상이한 조합을 사용하여 새로운 효소들을 디자인하였으며, 상기 실험 특성화를 위해 선택된 디자인들 중 20 개는 촉매화되지 않은 반응에 대해 4 배 개선된 비율을 가졌다(문헌[Jiang et al., Science 319:1387-1391(2008)]). 따라서, 이들 공학적 접근법은 효소가 작용할 수 있는 기질들의 배열을 확장시킬 수 있을 뿐만 아니라 매우 효율적인 효소들의 디자인 및 제작을 허용한다. 예를 들어, DNA 셔플링 방법(일시적인 주형 상의 랜덤한 키메라 발생 또는 RACHITT)은 비-천연 기질의 20 배 더 빠른 전환뿐만 아니라 복합체 기질 상에서의 개선된 탈황 속도를 갖는 조작된 모노옥시게나제를 유도하는 것으로 보고되었다(문헌[Coco et al. Nat. Biotechnol. 19:354-359(2001)]). 유사하게, 느린 돌연변이체 트라이오스포스페이트 아이소머라제 효소의 비 활성이 1.3배에서 19배까지 개선되었다(문헌[Hermes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 87:696-700(1990)]). 이러한 비 활성의 향상은 상기 단백질의 전체 길이에 걸쳐 랜덤 돌연변이를 사용함으로써 성취되었으며 상기 개선은 6 개 아미노산 잔기 중의 돌연변이에 대해 역 추적될 수 있었다.
목적하는 기질에 대한 효소의 기질 특이성을 변경시키기 위한 단백질 공학 접근법의 유효성이 또한 몇몇 연구들에서 입증되었다. 써무스 써모필루스로부터의 아이소프로필말레이트 데하이드로게나제를, 상기 활성 부위에 가까운 잔기들을 이들 잔기가 기질로서 말레이트 및 D-락테이트 상에서 작용할 수 있도록 변화시킴으로써 변형시켰다(문헌[Fujita et al., Biosci. Biotechnol Biochem. 65:2695-2700(2001)]). 이 연구에서뿐만 아니라 다른 연구들에서, 하나 또는 몇 개의 잔기들을 상기 기질 특이성의 변경을 위해 변형시킬 수 있음이 지적되었다. 예를 들어, 단일 아미노산을, 다이하이드로카엠페롤을 우선적으로 환원시킬 수 있는 추정된 기질-결합 부위에서 변화시킨 다이하이드로플라보놀 4-리덕타제이다(문헌[Johnson et al., Plant J. 25:325-333(2001)]). 에스케리키아 콜라이로부터의 매우 특이적인 아이소시트레이트 데하이드록시게나제의 기질 특이성을, 상기 활성 부위 중의 하나의 잔기를 변화시킴으로써 아시소시트레이트에서 아이소프로필말레이트로 변화시켰다(문헌[Doyle et al., Biochemistry 40:4234-4241(2001)]). 유사하게, NAD+-의존성 1,5-하이드록시프로스타글란딘 데하이드로게나제의 보조인자 특이성을 상기 N-말단 단부 부근의 몇 개의 잔기를 변화시킴으로써 NAPD+로 변경시켰다(문헌[Cho et al., Arch. Biochem. Biophys. 419:139-146(2003)]). 서열 분석 및 분자 모델링 분석을 사용하여 변형을 위한 핵심 잔기를 동정하고, 이를 부위 지정 돌연변이에 의해 추가로 연구하였다.
효소의 작용을, 상기 효소의 천연 기질에 대해 하나의 비-천연 기질에 유리하도록 변화시킨 다양한 부류의 효소들에 걸쳐 있는 다수의 다른 예들이 존재한다. 푸코시다제는 DNA 셔플링 및 선별에 의해 에스케리키아 콜라이 중의 갈락토시다제로부터 진화되었다(문헌[Zhang et al., Proc natl Acad Sci U.S.A 94:4504-4509(1997)]). 유사하게, 에스케리키아 콜라이로부터의 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제를 상동성 모델링 및 부위 지정 돌연변이를 사용하여 타이로신 아미노트랜스퍼라제로 전환시켰다(문헌[Onuffer and Kirsch, Protein Sci. 4:1750-1757(1995)]). 슈도모나스 푸티다로부터의 벤조일포메이트 데카복실라제의 활성 부위 중의 2 개 잔사의 부위 지정 돌연변이는 전하는 바에 따르면, 천연 및 비-천연 기질들에 대한 친화성(Km)을 변경시켰다(문헌[Siegert et al., Protein Eng Des Sel 18:345-357(2005)]). 사카로마이세스 세레비지아에로부터의 시토크롬 c 퍼옥시다제(CCP)에 지정된 분자 진화를 가하여 전통적인 퍼옥시다제 기질 구아이아콜에 대한 증가된 활성을 갖는 돌연변이체를 생성시켜, 상기 CCP의 기질 특이성을 단백질 시토크롬 c로부터 작은 유기 분자로 변화시켰다. 3 라운드의 DNA 셔플링 및 선별 후에, 구아이아콜에 대해 300 배 증가된 활성 및 상기 천연 기질에 대한 경우에 비해 상기 기질에 대해 1000 배까지 증가한 특이성을 갖는 돌연변이체를 단리하였다(문헌[Iffland et al., Biochemistry 39:10790-10798(2000)]).
일부의 경우에, 상기 2 개의 모 효소 중 어느 하나와 상이한 기질 선호를 갖는 효소들이 획득되었다. 예를 들어, 다중 염소화된 바이페닐의 바이페닐-다이옥시게나제-매개된 분해는 2 개의 세균, 슈도모나스 슈도알칼리젠스(Pseudomonas pseudoalcaligens) 및 부르크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia)로부터 유전자들을 셔플링함으로써 개선되었다(문헌[Kumamaru et al., Nat. Biotechnol 16, 663-666(1998)]). 상기 생성되는 키메릭 바이페닐 옥시게나제는 상기 2 개의 모 효소 모두와 상이한 기질 선호를 나타내었으며, 관련된 바이페닐 화합물 및 단일 방향족 고리 탄화수소, 예를 들어 톨루엔 및 벤젠(원래는 상기 효소에 대해 불량한 기질이었다)에 대한 분해 활성을 향상시켰다.
상기 효소 특이성을 변화시키는 것뿐만 아니라 상기 효소가 천연적으로 낮은 활성을 갖는 기질들에 대한 활성을 향상시키는 것 또한 가능하다. 하나의 연구는 광범위한 기질 특이성(다른 것들 중에서도 리신, 아르기닌, 알라닌, 세린, 메티오닌, 시스테인, 류신 및 히스티딘에 대한)을 갖지만 트립토판에 대한 활성은 낮은, 슈도모나스 푸티다로부터의 아미노산 라세마제가 랜덤 돌연변이에 의해 현저하게 개선될 수 있음을 입증하였다(문헌[Kino et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 73:1299-1305(2007)]). 유사하게, 소 BCKAD의 활성 부위를, 또 다른 기질인 아세틸-CoA에 유리하도록 조작하였다(문헌[Meng and Chuang. Biochemistry 33:12879-12885(1994)]). 이러한 접근법에 대해 흥미로운 면은 랜덤한 방법을 적용하여 유효한 활성을 갖는 돌연변이된 효소들을 생성시켰을 때조차, 활성에 개선을 부여하는 정확한 돌연변이 또는 구조적 변화를 확인할 수 있다는 것이다. 예를 들어, 상기 언급한 연구에서, 트립토판에 대한 개선된 활성을 촉진한 돌연변이를 2 개의 상이한 위치에 대해 역추적할 수 있었다.
방향 진화를 또한 발현시키기 어려운 단백질들의 발현에 사용하였다. 예를 들어, 양고추냉이 퍼옥시다제에 랜덤한 돌연변이를 가하고 유전자 재조합에 의해, 야생형보다 14 배 더 큰 활성을 갖는 돌연변이체를 추출할 수 있었다(문헌[Lin et al., Biotechnol. Prog. 15:467-471(1999)]).
방향 진화의 또 다른 예는 일련의 목적하는 작용들을 성취하도록 효소에 가할 수 있는 광범위한 변형들을 나타낸다. 바실러스 스테아로써모필루스로부터의 효소, 락테이트 데하이드로게나제에 부위-지정된 돌연변이를 가하고, 지정된 부위에서 3 개의 아미노산 치환을 수행하여 상이한 하이드록시산들에 대한 특이성을 측정하였다(문헌[Clarke et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 148:15-23(1987)]). 이러한 돌연변이 후에, 피루베이트보다 옥살로아세테이트에 대한 특이성이, 옥살로아세테이트보다 1000의 피루베이트에 대한 촉매 특이성을 갖는 야생형 효소와 대조적으로 500까지 증가하였다. 상기 효소를 분지쇄 치환된 피루베이트에 대한 활성을 갖도록 부위 지정 돌연변이를 사용하여 추가로 조작하였다(문헌[Wilks et al., Biochemistry 29:8587-8591(1990)]). 구체적으로, 상기 효소는 알파-케토아이소카프로에이트에 대한 Kcat가 55 배 개선되었다. 3 개의 구조적 변형들이 동일한 효소에서 수행되어 그의 기질 특이성이 락테이트에서부터 말레이트로 변하였다. 상기 효소는 말레이트에 대해 매우 활성이고 특이적이었다(문헌[Wilks et al., Science 242:1541-1544(1988)]). 바실러스 스테아로써모필루스로부터의 동일한 효소를, 양으로 하전된 측쇄를 갖는 알파-케토산, 예를 들어 암모늄 그룹을 갖는 것들에 대해 높은 촉매 활성을 갖도록 후속적으로 조작하였다(문헌[Hogan et al., Biochemistry 34:4225-4230(1995)]). 상기 효소의 102번 위치에 산성 아미노산이 도입된 돌연변이체들은 상기와 같은 측쇄 암모늄 그룹의 결합을 촉진하였다. 상기 획득된 결과는 상기 돌연변이체가 오메가-아미노-알파-케토산 기질에 대한 Kcat/Km 값을 25배까지 개선시킴을 입증하였다. 흥미롭게도, 상기 효소를 또한 락테이트 데하이드로게나제 대신에 페닐아세테이트 데하이드로게나제로서 작용하도록 구조적으로 변형시켰다(문헌[Wilks et al., Biochemistry 31:7802-7806(1992)]). 제한 부위들을 상기 효소에 대한 유전자에 도입시켜 상기 유전자의 부위가 절제되도록 하였다. 상기 부위는 벌크 용매로부터 활성 부위 액포를 통상적으로 밀봉하고 기질 특이성의 주요 결정인자인 폴리펩타이드의 이동성 표면 고리(잔기 98 내지 110)를 암호화하였다. 상기 가변적인 길이 및 서열 고리를 상기 절단 유전자에 삽입하여 변경된 기질 특이성을 갖는 하이드록시산 데하이드로게나제를 합성하는데 사용하였다. 하나의 보다 긴 고리 제작과 함께, 피루베이트에 대한 활성이 100 만배 감소되었으나 페닐피루베이트에 대한 활성은 대체로 변경되지 않았다. 390,000 배의 특이성 변환(Kcat/Km)이 성취되었다. 피루베이트에 비해 페닐피루베이트에 대한 상기 효소의 1700:1 선택성은 페닐락테이트 데하이드로게나제에 필요한 것이다. 상술한 연구는 효소 공학의 다양한 접근법들을 사용하여 본 발명에 개시된 바와 같은 BDO 경로의 효소들을 수득할 수 있음을 가리킨다.
본 발명에 개시된 바와 같이, 아세틸-CoA, 숙시닐-CoA, 알파-케토글루타레이트, 글루타메이트, 4-아미노부티레이트 및 호모세린을 포함한, 다수의 중심 대사 중간체들로부터 1,4-부탄다이올로의 생합성 경로를 사용할 수 있다. 아세틸-CoA, 숙시닐-CoA 및 알파-케토글루타레이트는, 세포 호흡에 산소를 사용하는 거의 모든 살아있는 세포 중에 온전히 그대로 존재하고 다수의 혐기성 유기체 중의 절두된 형태로 존재하는 일련의 반응인 트라이카복실산(TCA) 주기의 공통 중간체들이다. 글루타메이트는 글루타메이트 데하이드로게나제 또는 다수의 트랜스아민화 반응들 중 임의의 반응을 통해 알파-케토글루타레이트로부터 유도되는 아미노산이다(도 8b 참조). 4-아미노부티레이트는 글루타메이트의 탈카복실화에 의해(도 8b 참조) 또는 도 9c에 개시된 경로를 통해 아세토아세틸-CoA로부터 형성될 수 있다. 아세토아세틸-CoA는 효소, 아세틸-조효소 A 아세틸트랜스퍼라제, 또는 동등하게는 아세토아세틸-조효소 A 티올라제에 의해 2 개의 아세틸-CoA 분자들의 축합으로부터 유도된다. 호모세린은 아스파테이트를 통해 옥살로아세테이트로부터 형성되는, 쓰레오닌 및 메티오닌 대사의 중간체이다. 옥살로아세테이트에서 호모세린으로의 전환은 하나의 NADH, 2 개의 NADPH, 및 하나의 ATP를 필요로 한다.
상기 예시된 것들 이외의 경로들을 또한 비-천연 미생물 유기체에서 BDO의 생합성을 생성시키는데 사용할 수 있다. 하나의 실시태양에서, L-호모세린에서 BDO 경로를 사용하여 생합성을 성취할 수 있다(도 13 참조). 이 경로는 0.90 mol/mol 글루코스의 몰 수율을 가지며, 이는 환원 당량의 유효성에 의해 제한되는 것으로 보인다. 두 번째 경로는 아세토아세틸-CoA로부터 BDO를 합성하고 1.091 mol/mol 글루코스의 최대 이론 수율을 성취할 수 있다(도 9 참조). 어느 한 경로의 실행은 2 개의 외래 효소의 숙주 유기체, 예를 들어 에스케리키아 콜라이 내로의 도입에 의해 성취될 수 있으며, 상기 두 경로는 모두 숙시닐-CoA를 통해 BDO 생산을 추가로 완료할 수 있다. 경로 효소, 열역학, 이론 수율 및 전체 실행 가능성을 하기에 추가로 개시한다.
호모세린 경로는 또한 BDO-생산 미생물 유기체를 생성하도록 조작될 수 있다. 호모세린은 아스파테이트를 통해 옥살로아세테이트로부터 형성되는, 쓰레오닌 및 메티오닌 대사의 중간체이다. 옥살로아세테이트에서 호모세린으로의 전환은 하나의 NADH, 2 개의 NADPH, 및 하나의 ATP를 필요로 한다(도 2). 호모세린은 일단 형성되면, 쓰레오닌 및 메티오닌 둘 모두에 대한 생합성 경로 내로 들어간다. 대부분의 유기체에서, 높은 수준의 쓰레오닌 또는 메티오닌 피드백은 호모세린 생합성 경로를 억제한다(문헌[Caspi et al., Nucleic Acids Res. 34:D511-D516(1990)]).
호모세린의 4-하이드록시부티레이트(4-HB)로의 변환을 본 발명에 개시된 바와 같이 2 개의 효소 단계에서 수행할 수 있다. 상기 경로의 첫 번째 단계는 추정적인 암모니아 라이아제에 의한 호모세린의 탈아민화이다. 단계 2에서, 생성물 알켄, 4-하이드록시부트-2-에노에이트는 하나의 NADH의 비용으로 추정적인 리덕타제에 의해 4-HB로 환원된다. 이어서 4-HB는 BDO로 전환될 수 있다.
상기 변환을 촉매화하는데 이용할 수 있는 효소들을 본 발명에 개시한다. 예를 들어, 상기 경로의 단계 1에서의 암모니아 라이아제는 아스파테이트 암모니아-라이아제(아스파타제)의 화학과 아주 비슷하다. 아스파타제는 미생물 중에 만연된 효소이며, 광범위하게 특성화되었다(문헌[Viola, R.E., Mol. Biol. 74:295-341(2008)]). 에스케리키아 콜라이 아스파타제의 결정 구조가 해명되었으며(문헌[Shi et al., Biochemistry 36:9136-9144(1997)]), 따라서 호모세린을 포함하도록 기질 특이성을 변경시키는 상기 효소의 활성 부위의 돌연변이를 직접 조작할 수 있다. 단계 2의 옥시도리덕타제는 에스케리키아 콜라이 TCA 주기의 퓨마레이트 리덕타제를 포함한 여러 잘 특성화된 효소들과 유사한 화학을 갖는다. 상기 반응의 열역학은 매우 유리하기 때문에, 광범위한 기질 특이성을 갖는 내생적인 리덕타제는 4-하이드록시부트-2-에노에이트를 환원시킬 수 있는 듯하다. 혐기성 조건 하에서 상기 경로의 수율은 글루코스 mol 당 0.9 mol BDO이다.
상기 숙시닐-CoA 경로는 상기 경로가 보다 에너지학적으로 효율적이라는 점으로 인해 보다 높은 수율을 갖는 것으로 밝혀졌다. 상기 호모세린 경로를 통한 하나의 옥살로아세테이트 분자의 BDO로의 전환은 2 ATP 당량의 지출을 필요로 할 것이다. 글루코스의 2 개의 옥살로아세테이트 분자로의 전환은 최대 3 ATP 분자를 생성시킬 수 있으므로(PEP 카복시키나제가 역전될 수 있는 것으로 가정하여), 호모세린을 통한 글루코스의 BDO로의 전체적인 전환은 음의 에너지 수율을 갖는다. 예상되는 바와 같이, 호흡을 통해 에너지가 생성될 수 있는 것으로 가정한다면, 상기 호모세린 경로의 최대 수율은 1.05 mol/mol 글루코스로 증가하며, 이는 상기 숙시닐-CoA 경로 수율의 96%이다. 상기 숙시닐-CoA 경로는 피루베이트 데하이드로게나제 및 상기 TCA 주기의 산화 가지를 통해 탄소 흐름의 일부를 보내어 에너지 지출 없이 환원 당량 및 숙시닐-CoA를 모두 생성시킬 수 있다. 따라서, 상기 흐름의 전부가 옥살로아세테이트를 통해 숙시닐-CoA에서 BDO로 흐르지는 않기 때문에 상기 호모세린 경로와 같은 에너지 곤란에 부닥치지는 않는다. 전체적으로, 상기 호모세린 경로는 BDO로의 고 수율 경로를 나타낸다.
아세토아세테이트 경로를 또한 BDO-생산 미생물 유기체를 생성하도록 조작할 수 있다. 아세토아세테이트는 지방산 대사와 관련된 효소들, 예를 들어 아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼라제 및 아세토아세틸-CoA 트랜스퍼라제에 의해 아세틸-CoA로부터 형성될 수 있다. 아세토아세테이트를 통한 생합성 경로들은 또한 특히 단일 탄소 화합물, 예를 들어 일산화 탄소, 이산화 탄소 또는 메탄올을 대사하여 아세틸-CoA를 형성시킬 수 있는 미생물 유기체에 유용하다.
아세토아세틸-CoA로부터 4-아미노부티레이트로의 3 단계 경로(도 9c 참조)를 사용하여 아세토아세틸-CoA를 통해 BDO를 합성할 수 있다. 4-아미노부티레이트를 도 8b에 도시된 바와 같이 숙시닉 세미알데하이드로 전환시킬 수 있다. 숙시닐-CoA로부터 제거된 하나의 환원 단계 또는 α-케토글루타레이트로부터 제거된 하나의 탈카복실화 단계인 숙시닉 세미알데하이드를 3 개의 환원 단계들에 따라서 BDO로 전환시킬 수 있다(도 1). 간단히, 상기 경로의 단계 1은 예를 들어 atoA 및 atoD 유전자에 의해 암호화되는 에스케리키아 콜라이 아세토아세틸-CoA 트랜스퍼라제에 의한 아세토아세틸-CoA의 아세토아세테이트로의 전환을 수반한다(문헌[Hanai et al., Appl. Environ. Microbiol. 73:7814-7818(2007)]). 상기 아세토아세틸-CoA 생합성의 단계 2는 ω-아미노트랜스퍼라제에 의한 아세토아세테이트의 3-아미노부타노에이트로의 전환을 수반한다. 알칼리젠스 데니트리피칸스(Alcaligens denitrificans)로부터의 ω-아미노산:피루베이트 아미노트랜스퍼라제(ω-APT)는 에스케리키아 콜라이에서 과발현되었으며 시험관 내에서 3-아미노부타노에이트에 대해 높은 활성을 갖는 것으로 나타났다(문헌[Yun et al., Appl. Environ. Microbiol. 70:2529-2534(2004)]).
단계 2에서, 추정적인 아미노뮤타제는 상기 아민 그룹을 탄소 주쇄의 3 번 위치에서 4 번 위치로 이동시킨다. 3-아미노부타노에이트 상에서 상기 작용을 수행하는 아미노뮤타제는 특성화되지 않았지만, 클로스트리듐 스틱클란디이(Clostridium sticklandii)로부터의 효소는 매우 유사한 기전을 갖는다. 효소, D-리신-5,6-아미노뮤타제는 리신 생합성에 관련된다.
아세토아세틸-CoA로부터 BDO로의 합성 경로는, 글루타메이트의 탈카복실화로부터 통상적으로 형성되는 에스케리키아 콜라이에서의 대사산물인 4-아미노부타노에이트를 통과한다. 4-아미노부타노에이트는 일단 형성되면, 생화학적으로 특성화된 효소인 4-아미노부타노에이트 트랜스아미나제(2.6.1.19)에 의해 숙시닉 세미알데하이드로 전환될 수 있다.
상기 경로에서 후보 효소들을 선택하기 위한 한 가지 고려사항은 단계 2 및 3에 관련된 효소의 입체선택성이다. 알칼리젠스 데니트리피칸스(Alcaligens denitrificans) 중의 ω-ABT는 3-아미노부타노에이트의 L-입체이성체에 특이적인 반면, D-리신-5,6-아미노뮤타제는 D-입체이성체를 필요로 하는 듯하다. 상보적인 입체선택성을 갖는 효소가 초기에 발견되거나 조작되지 않는 경우, L-3-아미노부타노에이트를 D-3-아미노부타노에이트로 전환시킬 수 있는 라세마제 활성을 갖는 세 번째 효소를 상기 경로에 첨가할 수 있다. 아미노산 라세마제가 만연되어 있지만, 이들 효소가 ω-아미노산 상에서 작용할 수 있는 지의 여부는 공지되어 있지 않다.
혐기성 조건 하에서 상기 경로의 최대 이론 몰 수율은 1.091 mol/mol 글루코스이다. 아세토아세틸-CoA로부터 BDO로의 흐름을 생성시키기 위해서는 아세틸-CoA:아세토아세틸-CoA 트랜스퍼라제가 가역적임을 가정할 필요가 있었다. 에스케리키아 콜라이에서 상기 효소의 작용은 우선 단쇄 지방산을 티오에스터로 전환시킴으로써 상기 지방산을 대사하는 것이다.
아세테이트-소비 방향에서 아세틸-CoA:아세토아세틸-CoA 트랜스퍼라제의 작용은 에스케리키아 콜라이에서 실험적으로 입증되지 않았지만, 다른 유기체에서 유사한 효소들에 대한 연구는 상기 반응이 가역적이라는 가정을 지지한다. 장 미생물 로세부리아(Roseburia) 스페시즈 및 에프 프라스니트지이(F. prasnitzii) 중의 효소 부티릴-CoA:아세테이트:CoA 트랜스퍼라제는 아세테이트 사용 방향으로 작용하여 부티레이트를 생산한다(문헌[Duncan et al., Appl. Environ. Microbiol 68:5186-5190(2002)]). 또 다른 매우 유사한 효소인, 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei) 중의 아세틸:숙시네이트 CoA-트랜스퍼라제도 또한 아세테이트 사용 방향으로 작용한다. 상기 반응은 평형에 가까운 ΔrxnG를 가지며, 따라서 높은 농도의 아세테이트는 아마도 상기 반응을 관심 방향으로 몰아갈 것이다. 1.09 mol/mol 글루코스의 최대 이론 BDO 생산율에서 시뮬레이션은 에스케리키아 콜라이가 발효 부산물 없이 글루코스 mol당 1.098 mol의 ATP를 생산할 수 있음을 예측한다. 상기 ATP 수율은 세포 증식, 유지 및 생산에 충분할 것이다. 상기 아세토아세타틸-CoA 생물경로는 아세틸-CoA로부터 BDO로의 고 수율 경로이다.
따라서, 선택된 숙주에서 4-HB 생합성을 확립시키기 위해 앞서 예시된 다양한 변형들 중 임의의 변형 이외에, 상기 BDO 생산 미생물 유기체는 CoA-독립적인 알데하이드 데하이드로게나제, CoA-의존성 알데하이드 데하이드로게나제 또는 알콜 데하이드로게나제 또는 GBL 및/또는 BDO에 대한 생합성 경로를 생성시키는 것으로 본 발명에 개시된 다른 효소들에 대한 임의의 발현 조합뿐만 아니라 4-HB 경로 대사 변형들의 임의의 선행 조합 및 순열을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 BDO 생산자는 상기 4-HB 경로 중 임의의 경로 및/또는 본 발명에 개시된 BDO 경로 효소들 중 임의의 효소에 상응하는, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 전체 이하 효소의 외부 발현을 가질 수 있다.
상기 유전자 변형된 미생물 유기체의 디자인 및 제작을, BDO를 생산하기에 충분한 양의 발현을 성취하는 것으로 당해 분야에 널리 공지된 방법들을 사용하여 수행한다. 특히, 본 발명의 비-천연 미생물 유기체는 상기 논의된 바와 같이, 약 0.1 내지 200 mM 이상, 예를 들어 약 0.1 내지 25 mM 이상의 세포 내 농도를 생성시키는 BDO의 생합성을 성취할 수 있다. 예를 들어, 상기 BDO의 세포 내 농도는 약 3 내지 20 mM, 특히 약 5 내지 15 mM 및 보다 특히 약 8 내지 12 mM, 예를 들어 약 10 mM 이상이다. 이들 예시적인 각 범위들의 사이 및 상기 범위 이상의 세포 내 농도들을 또한 본 발명의 비-천연 미생물 유기체로부터 성취할 수 있다. 상기 4-HB 생산자의 경우와 같이, BDO 생산자들을 또한 혐기성 조건 하에서 지속시키거나, 배양하거나 발효시킬 수 있다.
본 발명은 4-HB의 생산 방법을 또한 제공한다. 상기 방법은 단량체성 4-하이드록시부탄산(4-HB)의 생산에 충분한 기간 동안 실질적으로 혐기성 조건 하에서 4-하이드록시부타노에이트 데하이드로게나제, CoA-독립적인 숙시닉 세미알데하이드 데하이드로게나제, 숙시닐-CoA 신시타제, CoA-의존성 숙시닉 세미알데하이드 데하이드로게나제, 글루타메이트:숙시닉 세미알데하이드 트랜스아미나제, α-케토글루타레이트 데카복실라제, 또는 글루타메이트 데카복실라제를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 4-하이드록시부탄산(4-HB) 생합성 경로를 갖는 비-천연 미생물 유기체를 배양함을 포함한다. 상기 방법은 4-HB의 예를 들어 GBL 및 BDO 또는 THF로의 화학적 전환을 추가로 포함할 수 있다.
4-HB의 생산 방법을 추가로 제공한다. 상기 방법은 단량체성 4-하이드록시부탄산(4-HB)의 생산에 충분한 기간 동안 실질적으로 혐기성 조건 하에서 4-하이드록시부타노에이트 데하이드로게나제, 숙시닐-CoA 신시타제, CoA-의존성 숙시닉 세미알데하이드 데하이드로게나제, 또는 α-케토글루타레이트 데카복실라제를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 4-하이드록시부탄산(4-HB) 생합성 경로를 갖는 미생물 유기체를 포함한 비-천연 미생물 유기체를 배양함을 포함한다. 상기 4-HB 생성물은 배양 배지 내로 분비될 수 있다.
BDO의 생산 방법을 추가로 제공한다. 상기 방법은 1,4-부탄다이올(BDO)의 생산에 충분한 기간 동안 4-하이드록시부탄산(4-HB) 및 1,4-부탄다이올(BDO) 생합성 경로를 갖는 미생물 유기체를 포함하는, 비-천연 미생물 생체촉매 또는 미생물 유기체를 배양함을 포함하며, 상기 경로는 4-하이드록시부타노에이트 데하이드로게나제, 숙시닐-CoA 신시타제, CoA-의존성 숙시닉 세미알데하이드 데하이드로게나제, 4-하이드록시부티레이트:CoA 트랜스퍼라제, 4-하이드록시부티레이트 키나제, 포스포트랜스하이드록시부티릴라제, α-케토글루타레이트 데카복실라제, 알데하이드 데하이드로게나제, 알콜 데하이드로게나제 또는 알데하이드/알콜 데하이드로게나제를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함한다. 상기 BDO 생성물은 배양 배지 내로 분비될 수 있다.
본 발명의 BDO 경로를 갖는 비-천연 미생물 유기체를 배양함으로써 BDO를 생산하는 방법을 추가로 제공한다. 상기 BDO 경로는 BDO의 생산에 충분한 기간 및 조건 하에서 BDO의 생산에 충분한 양으로 발현되는 BDO 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함할 수 있으며, 상기 BDO 경로는 4-아미노부티레이트 CoA 트랜스퍼라제, 4-아미노부티릴-CoA 하이드롤라제, 4-아미노부티레이트-CoA 리가제, 4-아미노부티릴-CoA 옥시도리덕타제(탈아민화), 4-아미노부티릴-CoA 트랜스아미나제, 또는 4-하이드록시부티릴-CoA 데하이드로게나제를 포함한다(실시예 VII 및 표 17 참조).
한편으로, 상기 BDO 경로는 BDO의 생산에 충분한 기간 및 조건 하에서 BDO의 생산에 충분한 양으로 발현되는 BDO 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함할 수 있으며, 상기 BDO 경로는 4-아미노부티레이트 CoA 트랜스퍼라제, 4-아미노부티릴-CoA 하이드롤라제, 4-아미노부티레이트-CoA 리가제, 4-아미노부티릴-CoA 리덕타제(알콜 형성), 4-아미노부티릴-CoA 리덕타제, 4-아미노부탄-1-올 데하이드로게나제, 4-아미노부탄-1-올 옥시도리덕타제(탈아민화) 또는 4-아미노부탄-1-올 트랜스아미나제를 포함한다(실시예 VII 및 표 18 참조).
또한, 본 발명은 BDO의 생산에 충분한 기간 및 조건 하에서 BDO의 생산에 충분한 양으로 발현되는 BDO 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 BDO 경로를 갖는 비-천연 미생물 유기체를 배양함을 포함하는 BDO의 생산 방법을 제공하며, 상기 BDO 경로는 4-아미노부티레이트 키나제, 4-아미노부티르알데하이드 데하이드로게나제(인산화), 4-아미노부탄-1-올 데하이드로게나제, 4-아미노부탄-1-올 옥시도리덕타제(탈아민화), 4-아미노부탄-1-올 트랜스아미나제, [(4-아미노부탄올일)옥시]포스폰산 옥시도리덕타제(탈아민화), [(4-아미노부탄올일)옥시]포스폰산 트랜스아미나제, 4-하이드록시부티릴-포스페이트 데하이드로게나제, 또는 4-하이드록시부티르알데하이드 데하이드로게나제(인산화)를 포함한다(실시예 VII 및 표 19 참조).
본 발명은 또한 BDO의 생산에 충분한 기간 및 조건 하에서 BDO의 생산에 충분한 양으로 발현되는 BDO 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 BDO 경로를 갖는 비-천연 미생물 유기체를 배양함을 포함하는 BDO의 생산 방법을 제공하며, 상기 BDO 경로는 알파-케토글루타레이트 5-키나제, 2,5-다이옥소펜타노익 세미알데하이드 데하이드로게나제(인산화), 2,5-다이옥소펜탄산 리덕타제, 알파-케토글루타레이트 CoA 트랜스퍼라제, 알파-케토글루타릴-CoA 하이드롤라제, 알파-케토글루타릴-CoA 리가제, 알파-케토글루타릴-CoA 리덕타제, 5-하이드록시-2-옥소펜탄산 데하이드로게나제, 알파-케토글루타릴-CoA 리덕타제(알콜 형성), 5-하이드록시-2-옥소펜탄산 데카복실라제, 또는 5-하이드록시-2-옥소펜탄산 데하이드로게나제(탈카복실화)를 포함한다(실시예 VIII 및 표 20 참조).
본 발명은 BDO의 생산에 충분한 기간 및 조건 하에서 BDO의 생산에 충분한 양으로 발현되는 BDO 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 BDO 경로를 갖는 비-천연 미생물 유기체를 배양함을 포함하는 BDO의 생산 방법을 추가로 제공하며, 상기 BDO 경로는 글루타메이트 CoA 트랜스퍼라제, 글루타밀-CoA 하이드롤라제, 글루타밀-CoA 리가제, 글루타메이트 5-키나제, 글루타메이트-5-세미알데하이드 데하이드로게나제(인산화), 글루타밀-CoA 리덕타제, 글루타메이트-5-세미알데하이드 리덕타제, 글루타밀-CoA 리덕타제(알콜 형성), 2-아미노-5-하이드록시펜탄산 옥시도리덕타제(탈아민화), 2-아미노-5-하이드록시펜탄산 트랜스아미나제, 5-하이드록시-2-옥소펜탄산 데카복실라제, 5-하이드록시-2-옥소펜탄산 데하이드로게나제(탈카복실화)를 포함한다(실시예 IX 및 표 21 참조).
본 발명은 BDO의 생산에 충분한 기간 및 조건 하에서 BDO의 생산에 충분한 양으로 발현되는 BDO 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 BDO 경로를 갖는 비-천연 미생물 유기체를 배양함을 포함하는 BDO의 생산 방법을 추가로 제공하며, 상기 BDO 경로는 3-하이드록시부티릴-CoA 데하이드로게나제, 3-하이드록시부티릴-CoA 데하이드라타제, 비닐아세틸-CoA Δ-아이소머라제, 또는 4-하이드록시부티릴-CoA 데하이드라타제를 포함한다(실시예 X 및 표 22 참조).
또한, BDO의 생산에 충분한 기간 및 조건 하에서 BDO의 생산에 충분한 양으로 발현되는 BDO 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 BDO 경로를 갖는 비-천연 미생물 유기체를 배양함을 포함하는 BDO의 생산 방법을 제공하며, 상기 BDO 경로는 호모세린 데아미나제, 호모세린 CoA 트랜스퍼라제, 호모세린-CoA 하이드롤라제, 호모세린-CoA 리가제, 호모세린-CoA 데아미나제, 4-하이드록시부트-2-에노일-CoA 트랜스퍼라제, 4-하이드록시부트-2-에노일-CoA 하이드롤라제, 4-하이드록시부트-2-에노일-CoA 리가제, 4-하이드록시부트-2-에노에이트 리덕타제, 4-하이드록시부티릴-CoA 트랜스퍼라제, 4-하이드록시부티릴-CoA 하이드롤라제, 4-하이드록시부티릴-CoA 리가제, 또는 4-하이드록시부트-2-에노일-CoA 리덕타제를 포함한다(실시예 XI 및 표 23 참조).
본 발명은 BDO의 생산에 충분한 기간 및 조건 하에서 BDO의 생산에 충분한 양으로 발현되는 BDO 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 BDO 경로를 갖는 비-천연 미생물 유기체를 배양함을 포함하는 BDO의 생산 방법을 추가로 제공하며, 상기 BDO 경로는 숙시닐-CoA 리덕타제(알콜 형성), 4-하이드록시부티릴-CoA 하이드롤라제, 4-하이드록시부티릴-CoA 리가제, 4-하이드록시부탄알 데하이드로게나제(인산화)를 포함한다. 상기와 같은 BDO 경로는 숙시닐-CoA 리덕타제, 4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제, 4-하이드록시부티릴-CoA 트랜스퍼라제, 4-하이드록시부티레이트 키나제, 포스포트랜스-4-하이드록시부티릴라제, 4-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제, 4-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(알콜 형성), 또는 1,4-부탄다이올 데하이드로게나제를 추가로 포함할 수 있다.
또한 BDO의 생산에 충분한 기간 및 조건 하에서 BDO의 생산에 충분한 양으로 발현되는 BDO 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 BDO 경로를 갖는 비-천연 미생물 유기체를 배양함을 포함하는 BDO의 생산 방법을 제공하며, 상기 BDO 경로는 글루타메이트 데하이드로게나제, 4-아미노부티레이트 옥시도리덕타제(탈아민화), 4-아미노부티레이트 트랜스아미나제, 글루타메이트 데카복실라제, 4-하이드록시부티릴-CoA 하이드롤라제, 4-하이드록시부티릴-CoA 리가제, 4-하이드록시부탄알 데하이드로게나제(인산화)를 포함한다.
본 발명은 생성물을 증가시키거나 바람직하지 못한 부산물을 감소시킴으로써 BDO와 같은 목적하는 생성물의 개선된 생산을 허용하는, 본 발명에 개시된 유전자 변형된 유기체를 사용하여 목적하는 생성물을 제조하는 방법을 추가로 제공한다. 따라서, 본 발명은 1,4-부탄다이올(BDO)의 생산에 충분한 기간 및 조건 하에서 본 발명에 개시된 비-천연 미생물 유기체들을 배양함을 포함하는, BDO의 생산 방법을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명은 1,4-부탄다이올(BDO)의 생산에 충분한 기간 및 조건 하에서 BDO의 생산에 충분한 양으로 발현되는 BDO 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 BDO 경로를 갖는 비-천연 미생물 유기체를 포함하는, 비-천연 미생물 유기체를 사용하는 BDO의 생산 방법을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 상기 미생물 유기체를 외래 숙시닐-CoA 신시타제를 발현하도록 유전자 변형시킨다(실시예 XII 참조). 예를 들어, 상기 숙시닐-CoA 신시타제는 에스케리키아 콜라이 sucCD 유전자에 의해 암호화될 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 상기 미생물 유기체를 외래 알파-케토글루타레이트 데카복실라제를 발현하도록 유전자 변형시킨다(실시예 XIII 참조). 예를 들어, 상기 알파-케토글루타레이트 데카복실라제는 마이코박테리움 보비스 sucA 유전자에 의해 암호화될 수 있다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 미생물 유기체를 외래 숙시네이트 세미알데하이드 데하이드로게나제 및 4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제 및 임의로 4-하이드록시부티릴-CoA/아세틸-CoA 트랜스퍼라제를 발현하도록 유전자 변형시킨다(실시예 XIII 참조). 예를 들어, 상기 숙시네이트 세미알데하이드 데하이드로게나제(CoA-의존성), 4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제 및 4-하이드록시부티릴-CoA/아세틸-CoA 트랜스퍼라제는 포르피로모나스 진지발리스 W83 유전자에 의해 암호화될 수 있다. 추가의 실시태양에서, 상기 미생물 유기체를 외래 부티레이트 키나제 및 포스포트랜스부티릴라제를 발현하도록 유전자 변형시킨다(실시예 XIII 참조). 예를 들어, 상기 부티레이트 키나제 및 포스포트랜스부티릴라제는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 buk1 및 ptb 유전자에 의해 암호화될 수 있다.
더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 미생물 유기체를 외래 4-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제를 발현하도록 유전자 변형시킨다(실시예 XIII 참조). 예를 들어, 상기 4-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제는 클로스트리듐 베이제링키이 ald 유전자에 의해 암호화될 수 있다. 추가로, 본 발명의 실시태양에서, 상기 미생물 유기체를 외래 4-하이드록시부탄알 리덕타제를 발현하도록 유전자 변형시킨다(실시예 XIII 참조). 예를 들어, 상기 4-하이드록시부탄알 리덕타제는 제오바실러스 써모글루코시다시우스 adh1 유전자에 의해 암호화될 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 상기 미생물 유기체를 외래 피루베이트 데하이드로게나제 서브유닛을 발현하도록 유전자 변형시킨다(실시예 XIV 참조). 예를 들어, 상기 외래 피루베이트 데하이드로게나제는 NADH 둔감성일 수 있다. 상기 피루베이트 데하이드로게나제 서브유닛은 클렙시엘라 뉴모니아 lpdA 유전자에 의해 암호화될 수 있다. 특정 실시태양에서, 상기 미생물 유기체의 피루베이트 데하이드로게나제 서브유닛은 피루베이트 포메이트 라이아제의 조절 하에 있을 수 있다.
더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 미생물 유기체를 호기성 호흡 억제 조절 시스템을 암호화하는 유전자를 파괴하도록 유전자 변형시킨다(실시예 XV 참조). 예를 들어, 상기 파괴는 arcA 유전자에 의할 수 있다. 상기와 같은 유기체는 말레이트 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자의 파괴를 또한 포함할 수 있다. 추가의 실시태양에서, 상기 미생물 유기체를 외래 NADH 둔감성 시트레이트 신타제를 발현하도록 유전자 변형시킨다(실시예 XV 참조). 예를 들어, 상기 NADH 둔감성 시트레이트 신타제는 gltA, 예를 들어 gltA의 R163L 돌연변이체에 의해 암호화될 수 있다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 미생물 유기체를 외래 포스포에놀피루베이트 카복시키나제를 발현하도록 유전자 변형시킨다(실시예 XVI 참조). 예를 들어, 상기 포스포에놀피루베이트 카복시키나제는 하에모필루스 인플루엔자 포스포에놀피루베이트 카복시키나제 유전자에 의해 암호화될 수 있다. BDO의 개선된 생산을 위해 본 발명에 예시된 균주들을 적합하게 변형시켜 유사하게 사용하여 다른 목적하는 생성물, 예를 들어 4-하이드록시부티레이트 또는 본 발명에 개시된 다른 목적하는 생성물을 생성시킬 수 있는 것으로 생각된다.
본 발명은 4-하이드록시부탄알을 생산하기에 충분한 양으로 발현된 4-하이드록시부탄알 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 4-하이드록시부탄알 경로를 포함하는 비-천연 미생물 유기체를 배양함으로써 4-하이드록시부탄알을 생성시키는 방법을 추가로 제공하며, 상기 4-하이드록시부탄알 경로는 숙시닐-CoA 리덕타제(알데하이드 형성); 4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제; 및 4-하이드록시부티레이트 리덕타제를 포함한다(도 58, 단계 A-C-D 참조). 본 발명은 4-하이드록시부탄알을 생산하기에 충분한 양으로 발현된 4-하이드록시부탄알 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 4-하이드록시부탄알 경로를 포함하는 비-천연 미생물 유기체를 배양함으로써 4-하이드록시부탄알을 생성시키는 방법을 또한 제공하며, 상기 4-하이드록시부탄알 경로는 알파-케토글루타레이트 데카복실라제; 4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제; 및 4-하이드록시부티레이트 리덕타제를 포함한다(도 58, 단계 B-C-D).
본 발명은 4-하이드록시부탄알을 생산하기에 충분한 양으로 발현된 4-하이드록시부탄알 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 4-하이드록시부탄알 경로를 포함하는 비-천연 미생물 유기체를 배양함으로써 4-하이드록시부탄알을 생성시키는 방법을 추가로 제공하며, 상기 4-하이드록시부탄알 경로는 숙시네이트 리덕타제; 4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제, 및 4-하이드록시부티레이트 리덕타제를 포함한다(도 62, 단계 F-C-D 참조). 더욱 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 4-하이드록시부탄알을 생산하기에 충분한 양으로 발현된 4-하이드록시부탄알 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 4-하이드록시부탄알 경로를 포함하는 비-천연 미생물 유기체를 배양함으로써 4-하이드록시부탄알을 생성시키는 방법을 제공하며, 상기 4-하이드록시부탄알 경로는 알파-케토글루타레이트 데카복실라제, 또는 글루타메이트 데하이드로게나제 또는 글루타메이트 트랜스아미나제 및 글루타메이트 데카복실라제 및 4-아미노부티레이트 데하이드로게나제 또는 4-아미노부티레이트 트랜스아미나제; 4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제; 및 4-하이드록시부티레이트 리덕타제를 포함한다(도 62, 단계 B 또는 (J 또는 K)-L-(M 또는 N))-C-D 참조).
본 발명은 4-하이드록시부탄알을 생산하기에 충분한 양으로 발현된 4-하이드록시부탄알 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 4-하이드록시부탄알 경로를 포함하는 비-천연 미생물 유기체를 배양함으로써 4-하이드록시부탄알을 생성시키는 방법을 또한 제공하며, 상기 4-하이드록시부탄알 경로는 알파-케토글루타레이트 리덕타제; 5-하이드록시-2-옥소펜타노에이트 데하이드로게나제; 및 5-하이드록시-2-옥소펜타노에이트 데카복실라제를 포함한다(도 62, 단계 X-Y-Z 참조). 본 발명은 4-하이드록시부티릴-CoA를 생산하기에 충분한 양으로 발현된 4-하이드록시부티릴-CoA 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 4-하이드록시부티릴-CoA 경로를 포함하는 비-천연 미생물 유기체를 배양함으로써 4-하이드록시부티릴-CoA를 생성시키는 방법을 제공하며, 상기 4-하이드록시부티릴-CoA 경로는 알파-케토글루타레이트 리덕타제; 5-하이드록시-2-옥소펜타노에이트 데하이드로게나제; 및 5-하이드록시-2-옥소펜타노에이트 데하이드로게나제(탈카복실화)를 포함한다(도 62, 단계 X-Y-AA 참조).
본 발명은 푸트레신을 생산하기에 충분한 양으로 발현된 푸트레신 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 푸트레신 경로를 포함하는 비-천연 미생물 유기체를 배양함으로써 푸트레신을 생성시키는 방법을 추가로 제공하며, 상기 푸트레신 경로는 숙시네이트 리덕타제; 4-아미노부티레이트 데하이드로게나제 또는 4-아미노부티레이트 트랜스아미나제; 4-아미노부티레이트 리덕타제; 및 푸트레신 데하이드로게나제 또는 푸트레신 트랜스아미나제를 포함한다(도 63, 단계 F-M/N-C-D/E 참조). 더욱 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 푸트레신을 생산하기에 충분한 양으로 발현된 푸트레신 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 푸트레신 경로를 포함하는 비-천연 미생물 유기체를 배양함으로써 푸트레신을 생성시키는 방법을 제공하며, 상기 푸트레신 경로는 알파-케토글루타레이트 데카복실라제; 4-아미노부티레이트 데하이드로게나제 또는 4-아미노부티레이트 트랜스아미나제; 4-아미노부티레이트 리덕타제; 및 푸트레신 데하이드로게나제 또는 푸트레신 트랜스아미나제를 포함한다(도 63, 단계 B-M/N-C-D/E 참조). 본 발명은 푸트레신을 생산하기에 충분한 양으로 발현된 푸트레신 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 푸트레신 경로를 포함하는 비-천연 미생물 유기체를 배양함으로써 푸트레신을 생성시키는 방법을 추가로 제공하며, 상기 푸트레신 경로는 글루타메이트 데하이드로게나제 또는 글루타메이트 트랜스아미나제; 글루타메이트 데카복실라제; 4-아미노부티레이트 리덕타제; 및 푸트레신 데하이드로게나제 또는 푸트레신 트랜스아미나제를 포함한다(도 63, 단계 J/K-L-C-D/E 참조).
본 발명은 푸트레신을 생산하기에 충분한 양으로 발현된 푸트레신 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 푸트레신 경로를 포함하는 비-천연 미생물 유기체를 배양함으로써 푸트레신을 생성시키는 방법을 추가로 제공하며, 상기 푸트레신 경로는 알파-케토글루타레이트 리덕타제; 5-아미노-2-옥소펜타노에이트 데하이드로게나제 또는 5-아미노-2-옥소펜타노에이트 트랜스아미나제; 5-아미노-2-옥소펜타노에이트 데카복실라제; 및 푸트레신 데하이드로게나제 또는 푸트레신 트랜스아미나제를 포함한다(도 63, 단계 O-P/Q-R-D/E 참조). 또한 푸트레신을 생산하기에 충분한 양으로 발현된 푸트레신 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 푸트레신 경로를 포함하는 비-천연 미생물 유기체를 배양함으로써 푸트레신을 생성시키는 방법을 제공하며, 상기 푸트레신 경로는 알파-케토글루타레이트 리덕타제; 5-아미노-2-옥소펜타노에이트 데하이드로게나제 또는 5-아미노-2-옥소펜타노에이트 트랜스아미나제; 오르니틴 데하이드로게나제 또는 오르니틴 트랜스아미나제; 및 오르니틴 데카복실라제를 포함한다(도 63, 단계 O-P/Q-S/T-U 참조). 본 발명에 개시된 경로들 중 임의의 경로를 포함하는 미생물 유기체를 사용하여, 4-HB, 4-HBal, BDO 또는 푸트레신을 포함한 목적하는 생성물 또는 중간체를 생성시킬 수 있는 것으로 생각된다.
본 발명의 방법에서, 상기 하나 이상의 외래 핵산들 중 임의의 핵산을 미생물 유기체에 도입시켜 본 발명의 비-천연 미생물 유기체를 생성시킬 수 있는 것으로 생각된다. 상기 핵산을 상기 미생물 유기체에, 예를 들어 4-HB, BDO, THF 또는 GBL 생합성 경로를 부여하기 위해 도입시킬 수 있다. 한편으로, 암호화 핵산을 4-HB, BDO, THF 또는 GBL 생합성 능력을 부여하는데 필요한 반응들 중 일부를 촉매화하는 생합성 능력을 갖는 중간 미생물 유기체가 생성되도록 도입시킬 수 있다. 예를 들어, 4-HB 생합성 경로를 갖는 비-천연 미생물 유기체는 목적하는 효소들, 예를 들어 4-하이드록시부타노에이트 데하이드로게나제 및 α-케토글루타레이트 데카복실라제; 4-하이드록시부타노에이트 데하이드로게나제 및 CoA-독립적인 숙시닉 세미알데하이드 데하이드로게나제; 4-하이드록시부타노에이트 데하이드로게나제 및 CoA-의존성 숙시닉 세미알데하이드 데하이드로게나제; CoA-의존성 숙시닉 세미알데하이드 데하이드로게나제 및 숙시닐-CoA 신시타제; 숙시닐-CoA 신시타제 및 글루타메이트 데카복실라제 등의 조합을 암호화하는 2 개 이상의 외래 핵산들을 포함할 수 있다. 따라서, 생합성 경로의 2 개 이상의 효소들의 임의의 조합을 본 발명의 비-천연 미생물 유기체에 포함시킬 수 있는 것으로 생각된다. 유사하게, 생합성 경로의 3 개 이상의 효소들의 임의의 조합, 예를 들어 4-하이드록시부타노에이트 데하이드로게나제, α-케토글루타레이트 데카복실라제 및 CoA-의존성 숙시닉 세미알데하이드 데하이드로게나제; CoA-독립적인 숙시닉 세미알데하이드 데하이드로게나제 및 숙시닐-CoA 신시타제; 4-하이드록시부타노에이트 데하이드로게나제, CoA-의존성 숙시닉 세미알데하이드 데하이드로게나제 및 글루타메이트:숙시닉 세미알데하이드 트랜스아미나제 등을, 경우에 따라, 상기 목적하는 생합성 경로의 효소들의 조합이 상응하는 목적하는 생성물을 생성시키는 한, 본 발명의 비-천연 미생물 유기체에 포함시킬 수 있는 것으로 생각된다.
유사하게, 예를 들어 BDO 생산을 부여하기 위해 도입되는 임의의 하나 이상의 외래 핵산에 관하여, BDO 생합성 경로를 갖는 비-천연 미생물 유기체는 목적하는 효소들, 예를 들어 4-하이드록시부타노에이트 데하이드로게나제 및 α-케토글루타레이트 데카복실라제; 4-하이드록시부타노에이트 데하이드로게나제 및 4-하이드록시부티릴-CoA:아세틸-CoA 트랜스퍼라제; 4-하이드록시부타노에이트 데하이드로게나제 및 부티레이트 키나제; 4-하이드록시부타노에이트 데하이드로게나제 및 포스포트랜스부티릴라제; 4-하이드록시부티릴 CoA:아세틸-CoA 트랜스퍼라제 및 알데하이드 데하이드로게나제; 4-하이드록시부티릴 CoA:아세틸-CoA 트랜스퍼라제 및 알콜 데하이드로게나제; 4-하이드록시부티릴 CoA:아세틸-CoA 트랜스퍼라제 및 알데하이드/알콜 데하이드로게나제, 4-아미노부티레이트-CoA 트랜스퍼라제 및 4-아미노부티릴-CoA 트랜스아미나제; 4-아미노부티레이트 키나제 및 4-아미노부탄-1-올 옥시도리덕타제(탈아민화) 등의 조합을 암호화하는 2 개 이상의 외래 핵산을 포함할 수 있다. 따라서, 생합성 경로의 2 개 이상의 효소들의 임의의 조합을 본 발명의 비-천연 미생물 유기체에 포함시킬 수 있는 것으로 생각된다. 유사하게, 생합성 경로의 3 개 이상의 효소들의 임의의 조합, 예를 들어 4-하이드록시부타노에이트 데하이드로게나제, α-케토글루타레이트 데카복실라제 및 4-하이드록시부티릴 CoA:아세틸-CoA 트랜스퍼라제; 4-하이드록시부타노에이트 데하이드로게나제, 부티레이트 키나제 및 포스포트랜스부티릴라제; 4-하이드록시부타노에이트 데하이드로게나제, 4-하이드록시부티릴 CoA:아세틸-CoA 트랜스퍼라제 및 알데하이드 데하이드로게나제; 4-하이드록시부티릴 CoA:아세틸-CoA 트랜스퍼라제, 알데하이드 데하이드로게나제 및 알콜 데하이드로게나제; 부티레이트 키나제, 포스포트랜스부티릴라제 및 알데하이드/알콜 데하이드로게나제; 4-아미노부티릴-CoA 하이드롤라제, 4-아미노부티릴-CoA 리덕타제 및 4-아미노부탄-1-올 트랜스아미나제; 3-하이드록시부티릴-CoA 데하이드로게나제; 3-하이드록시부티릴-CoA 데하이드라타제 및 4-하이드록시부티릴-CoA 데하이드라타제 등을 본 발명의 비-천연 미생물 유기체에 포함시킬 수 있는 것으로 생각된다. 유사하게, 본 발명에 개시된 생합성 경로의 4, 5 개 또는 그 이상의 효소들의 임의의 조합을 경우에 따라, 상기 목적하는 생합성 경로의 효소들의 조합이 상응하는 목적하는 생성물을 생성시키는 한, 본 발명의 비-천연 미생물 유기체에 포함시킬 수 있다.
본 발명에 개시된 비-천연 미생물 유기체들 중 임의의 유기체를 배양하여 본 발명의 생합성 생성물들을 생산하고/하거나 분비시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 4-HB 생산자를 4-HB의 생합성 생산을 위해 배양할 수 있다. 상기 4-HB를 하기에 개시된 바와 같이 단리하거나 처리하여 GBL, THF 및/또는 BDO를 생성시킬 수 있다. 유사하게, 상기 BDO 생산자를 BDO의 생합성 생산을 위해 배양할 수 있다. 상기 BDO를 본 발명에 개시된 바와 같이 단리하거나 BDO 계 화합물의 화학 합성을 위한 추가의 처리를 가할 수 있다.
상기 증식 배지는 예를 들어 상기 비-천연 미생물에 탄소 원을 공급할 수 있는 임의의 탄수화물 공급원을 포함할 수 있다. 상기와 같은 공급원은 예를 들어 당, 예를 들어 글루코스, 슈크로스, 자일로스, 아라비노스, 갈락토스, 만노오스, 프럭토스 및 전분을 포함한다. 탄수화물의 다른 공급원으로는 예를 들어 재생 가능한 공급원료 및 바이오매스가 있다. 본 발명의 방법에 공급원료로서 사용될 수 있는 예시적인 유형의 바이오매스는 셀룰로스 바이오매스, 헤미셀룰로스 바이오매스 및 리그닌 공급원료 또는 공급원료의 부분들을 포함한다. 상기와 같은 바이오매스 공급원료는 예를 들어 탄소 원으로서 유용한 탄수화물 기질, 예를 들어 글루코스, 슈크로스, 자일로스, 아라비노스, 갈락토스, 만노오스, 프럭토스 및 전분을 포함한다. 본 발명에 제공된 교시 및 지침에 따라, 당해 분야의 숙련가들은 상기 예시된 것들 이외의 재생 가능한 공급원료 및 바이오매스를 또한 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 및 본 발명의 다른 화합물들의 생산을 위한 본 발명의 미생물 유기체의 배양에 사용할 수 있음을 알 것이다.
따라서, 본 발명의 교시 및 지침에 따라, 당해 분야의 숙련가들은 탄소 원, 예를 들어 탄수화물 상에서 생육 시 본 발명의 생합성된 화합물을 분비하는 비-천연 미생물 유기체를 생성시킬 수 있음을 알 것이다. 상기와 같은 화합물은 예를 들어 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신, 및 상기 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 경로 및/또는 결합된 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 경로의 중간 대사 산물들 중 어느 것이든 포함한다. 필요한 것은 상기 필요한 효소 또는 단백질 활성들 중 하나 이상에서 상기 목적하는 화합물 또는 중간체의 생합성을 성취하도록, 예를 들어 상기 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 생합성 경로 중 일부 또는 전부를 포함하도록 조작하는 것이다. 따라서, 본 발명은 탄수화물 상에서 생육 시 4-HB를 분비하고, 탄수화물 상에서 생육 시 BDO를 분비하고/하거나 탄수화물 상에서 생육 시 도 1, 8 내지 13, 58, 62 또는 63에 나타낸 중간 대사 산물들 중 임의의 것을 분비하는 비-천연 미생물 유기체를 제공한다. 본 발명의 BDO 생산 미생물 유기체는 숙시네이트, 숙시닐-CoA, α-케토글루타레이트, 숙시닉 세미알데하이드, 4-HB, 4-하이드록시부티릴포스페이트, 4-하이드록시부티릴-CoA(4-HB-CoA) 및/또는 4-하이드록시부티르알데하이드로부터 합성을 개시시킬 수 있다.
일부 실시태양에서, 배양 조건은 혐기성 또는 실질적으로 혐기성인 생육 또는 유지 조건을 포함한다. 예시적인 혐기성 조건들은 앞서 개시되었으며 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 발효 공정에 예시적인 혐기성 조건은 하기 실시예에 개시된다. 이들 조건 중 어느 것이든 상기 비-천연 미생물 유기체뿐만 아니라 당해 분야에 널리 공지된 다른 혐기성 조건들과 함께 사용될 수 있다. 상기와 같은 혐기성 조건 하에서, 상기 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 생산자는 단량체성 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신을 각각 5 내지 10 mM 이상의 세포 내 농도뿐만 아니라 본 발명에 예시된 다른 농도들로 합성할 수 있다.
본 발명의 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 생산 비-천연 미생물 유기체에 대해 다수의 하류 화합물들이 또한 생성될 수 있다. 본 발명의 4-HB 생산 미생물 유기체에 관하여, 단량체성 4-HB 및 GBL이 배양 배지 중에 평형으로 존재한다. 4-HB의 GBL로의 전환을 예를 들어 산 pH 배지에서 상기 미생물 유기체를 배양함으로써 효율적으로 수행할 수 있다. 7.5 이하, 특히 5.5 이하의 pH는 4-HB를 자발적으로 GBL로 전환시킨다.
상기 GBL을 당해 분야에 널리 공지된 다양한 방법을 사용하여 상기 배양물 중의 다른 성분들로부터 분리시킬 수 있다. 상기와 같은 분리 방법은 예를 들어 실시예에 예시된 추출 과정뿐만 아니라 연속적인 액체-액체 추출, 투석 증발, 막 여과, 막 분리, 역삼투, 전기투석, 증류, 결정화, 원심분리, 추출 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피, 및 한외여과를 포함한다. 상기 방법들은 모두 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 분리된 GBL을 예를 들어 증류에 의해 추가로 정제할 수 있다.
본 발명의 4-HB 생산 비-천연 미생물 유기체로부터 생성될 수 있는 또 다른 하류 화합물은 예를 들어 BDO를 포함한다. 상기 화합물을 예를 들어 GBL의 화학적 수소화에 의해 합성할 수 있다. 화학적 수소화 반응은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 하나의 예시적인 과정은 4-HB 및/또는 GBL 또는 상기 배양물로부터 유래하는 이들 두 성분의 혼합물을 수소와 함께 이종 또는 동종 수소화 촉매를 사용하여, 또는 화학량론적으로 또는 촉매적으로 사용된 하이드라이드 기재 환원제를 사용하여 화학적으로 환원시켜 1,4-부탄다이올을 생성시킴을 포함한다.
당해 분야에 널리 공지된 다른 과정들을 상기 화학 반응에 동등하게 적용할 수 있으며, 상기 과정의 예로는 하기의 것들이 있다. WO 82/03854(Bradley, et al.)는 산화 구리 및 산화 아연 촉매 상에서의 증기 상 중의 감마-부티로락톤의 가수소분해를 개시한다. 영국 특허 제 1,230,276 호는 산화 구리-산화 크롬 촉매를 사용하는 감마-부티로락톤의 수소화를 개시한다. 상기 수소화를 액체 상 중에서 수행한다. 높은 전체 반응기 압력을 갖는 회분 반응들이 또한 예시된다. 상기 반응기 중의 반응물 및 생성물 분압은 각각의 이슬점 위에 있다. 영국 특허 제 1,314,126 호는 니켈-코발트-산화 토륨 촉매 상에서의 액체 상 중의 감마-부티로락톤의 수소화를 개시한다. 높은 전체 압력 및 성분 분압 뿐만 아니라 각 성분 이슬점 위에 있는 성분 분압을 갖는 회분 반응들이 예시된다. 영국 특허 제 1,344,557 호는 산화 구리-산화 크롬 촉매 상에서의 액체 상중의 감마-부티로락톤의 수소화를 개시한다. 증기 상 또는 증기 함유 혼합 상이 일부의 경우 적합한 것으로 지시된다. 높은 전체 반응기 압력을 사용하는 연속 흐름 관상 반응기가 예시된다. 영국 특허 제 1,512,751 호는 산화 구리-산화 크롬 촉매 상에서의 액체 상 중 감마-부티로락톤의 1,4-부탄다이올로의 수소화를 개시한다. 높은 전체 반응기 압력 및 측정 가능한 경우, 각 이슬점보다 높은 반응물 및 생성물 분압을 갖는 회분 반응들이 예시된다. 미국 특허 제 4,301,077 호는 Ru-Ni-Co-Zn 촉매 상에서의 감마-부티로락톤의 1,4-부탄다이올로의 수소화를 개시한다. 상기 반응을 액체 또는 기체 상 또는 혼합된 액체-기체 상 중에서 수행할 수 있다. 높은 전체 반응기 압력 및 비교적 낮은 반응기 생산성의 연속 흐름 액체 상 반응들이 예시된다. 미국 특허 제 4,048,196 호는 산화 구리-산화 아연 촉매 상에서의 감마-부티로락톤의 액체 상 수소화에 의한 1,4-부탄다이올의 생산을 개시한다. 높은 전체 반응기 압력 및 높은 반응물 및 생성물 분압으로 작동하는 연속 흐름 관상 반응기가 추가로 예시된다. 미국 특허 제 4,652,685 호는 락톤에서 글리콜로의 수소화를 개시한다.
본 발명의 4-HB 생산 미생물 유기체로부터 생성될 수 있는 추가의 하류 화합물들은 예를 들어 THF를 포함한다. 상기 화합물을 예를 들어 GBL의 화학적 수소화에 의해 합성할 수 있다. GBL의 THF로의 전환에 적용 가능한 당해 분야에 널리 공지된 하나의 예시적인 과정은 예를 들어 4-HB 및/또는 GBL 또는 상기 배양물로부터 유래하는 이들 두 성분의 혼합물을 수소와 함께 이종 또는 동종 수소화 촉매를 사용하여, 또는 화학량론적으로 또는 촉매적으로 사용된 하이드라이드 기재 환원제를 사용하여 화학적으로 환원시켜 테트라하이드로퓨란을 생성시킴을 포함한다. 당해 분야에 널리 공지된 다른 과정을 상기 화학 반응에 동등하게 적용할 수 있으며, 상기 과정은 예를 들어 수소화 촉매에 의해 준비되는 고 표면적 졸-겔 경로를 개시하는 미국 특허 제 6,686,310 호를 포함한다. 말레산의 테트라하이드로퓨란(THF) 및 1,4-부탄다이올(BDO)로의 환원 및 감마 부티로락톤의 테트라하이드로퓨란 및 1,4-부탄다이올로의 환원에 대한 과정이 또한 개시된다.
상기 배양 조건은 예를 들어 액체 배양 과정뿐만 아니라 발효 및 다른 대규모 배양 과정을 포함할 수 있다. 본 발명에 개시된 바와 같이, 본 발명의 생합성 생성물의 특히 유용한 수율을 혐기성 또는 실질적으로 혐기성 배양 조건 하에서 획득할 수 있다.
상기 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신의 생산을 시험하기에 적합한 정제 및/또는 분석을 널리 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 3중 배양물과 같은 적합한 복제물을 시험되는 각각의 조작된 균주에 대해 생육시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 조작된 생산 숙주 중의 생성물 및 부산물 형성을 모니터할 수 있다. 최종 생성물 및 중간체, 및 다른 유기 화합물들을 HPLC(고성능 액체 크로마토그래피), GC-MS(기체 크로마토그래피-질량 분광학) 및 LC-MS(액체 크로마토그래피-질량 분광학) 또는 당해 분야에 널리 공지된 통상적인 과정을 사용하는 다른 적합한 분석 방법에 의해 분석할 수 있다. 발효 브로쓰 중의 생성물의 방출을 또한 배양 상등액을 사용하여 시험할 수 있다. 부산물 및 잔류 글루코스를 예를 들어 글루코스 및 알콜의 경우 굴절률 검출기, 및 유기산의 경우 UV 검출기(문헌[Lin et al., Biotechnol. Bioeng. 90:775-779(2005)])를 사용하는 HPLC, 또는 당해 분야에 널리 공지된 다른 적합한 분석 및 검출 방법에 의해 정량분석할 수 있다. 상기 외래 DNA 서열로부터의 개별적인 효소 또는 단백질 활성을 당해 분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 분석할 수 있다.
상기 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 생성물을 당해 분야에 널리 공지된 다양한 방법을 사용하여 상기 배양물 중의 다른 성분들로부터 분리시킬 수 있다. 상기와 같은 분리 방법은 예를 들어 추출 과정뿐만 아니라 연속적인 액체-액체 추출, 투석 증발, 막 여과, 막 분리, 역삼투, 전기투석, 증류, 결정화, 원심분리, 추출 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피, 및 한외여과를 포함한다. 상기 방법들은 모두 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
본 발명은 4-HB의 제조 방법을 또한 제공한다. 상기 방법은 단량체성 4-하이드록시부탄산(4-HB)의 생산에 충분한 기간 동안 실질적으로 혐기성 조건 하에서 4-하이드록시부타노에이트 데하이드로게나제, CoA-독립적인 숙시닉 세미알데하이드 데하이드로게나제, 숙시닐-CoA 신시타제, CoA-의존성 숙시닉 세미알데하이드 데하이드로게나제, 글루타메이트:숙시닉 세미알데하이드 트랜스아미나제, α-케토글루타레이트 데카복실라제, 또는 글루타메이트 데카복실라제를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 4-하이드록시부탄산(4-HB) 생합성 경로를 갖는 비-천연 미생물 유기체를 발효시킴을 포함하며, 상기 공정은 유가 발효 및 회분 분리; 유가 발효 및 연속 분리, 또는 연속 발효 및 연속 분리를 포함한다.
상술한 배양 및 화학적 수소화를 또한 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, GBL, BDO 및/또는 THF 또는 푸트레신의 제조를 위해 규모 확대하고 연속적으로 키울 수 있다. 예시적인 생육 과정은 예를 들어 유가 발효 및 회분 분리; 유가 발효 및 연속 분리, 또는 연속 발효 및 연속 분리를 포함한다. 이들 과정은 모두 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 상기 4-HB 생산자의 사용은 상기 수소화 과정을 연속적인 배양 방법, 예를 들어 발효와 동시에 사용함으로써 동시적인 4-HB 생합성과 GBL, BDO 및/또는 THF로의 화학 전환을 허용한다. 다른 수소화 과정들이 또한 당해 분야에 널리 공지되어 있으며 이를 본 발명의 방법들에 동등하게 적용할 수 있다.
발효 과정은 상업적인 양의 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신의 생합성적 생산에 특히 유용하다. 일반적으로, 및 비-연속 배양 과정의 경우에서와 같이, 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신의 연속 및/또는 거의 연속 생산은 본 발명의 비-천연 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 생산 유기체를, 생육을 지수 생육기에서 유지 및/또는 거의 유지시키기에 충분한 양분 및 배지에서 배양함을 포함할 것이다. 상기와 같은 조건 하에서 연속 배양은 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 또한, 연속 배양은 1, 2, 3, 4 또는 5 주 또는 그 이상 수 개월 이하를 포함할 수 있다. 한편으로, 본 발명의 유기체를 특정 용도에 적합한 경우, 수 시간 동안 배양할 수 있다. 상기 연속 및/또는 거의 연속 배양 조건이 이들 예시적인 기간들 사이의 모든 시간 간격들을 포함할 수 있음은 물론이다. 본 발명의 미생물 유기체의 배양 시간은 원하는 목적을 위해 충분한 양의 생성물을 생산하기에 충분한 기간 동안인 것으로 또한 여겨진다.
발효 과정은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 간단히, 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 또는 본 발명의 다른 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 유도된 생성물의 생합성적 생산을 위한 발효를 예를 들어 유가 발효 및 회분 분리; 유가 발효 및 연속 분리, 또는 연속 발효 및 연속 분리에 사용할 수 있다. 당해 분야에 널리 공지된 회분 및 연속 발효 과정의 예들은 하기 실시예에 추가로 예시된다.
단량체성 4-HB를 포함하여, 상당량의 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 각각의 연속 생산을 위해 본 발명의 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 생산자를 사용하는 상기 발효 과정 이외에, 상기 4-HB 생산자에 또한 단량체성 4-HB를 예를 들어 GBL, BDO 및/또는 THF로 화학 전환시키는 화학적 합성 과정을 동시에 가할 수 있다. 유사하게 상기 BDO 생산자에 또한 BDO를 예를 들어 THF, GBL, 피롤리돈 및/또는 다른 BDO 계 화합물로 화학 전환시키기 위해 앞서 개시된 바와 같은 화학적 합성 과정을 동시에 가할 수 있다. 또한, 상기 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 생산자의 생성물들을 상기 발효 배양물로부터 분리시키고, 경우에 따라 본 발명에 개시된 바와 같이 상기 생성물을 다른 화합물로 전환시키기 위해 화학적 전환을 연속해서 가할 수 있다.
간단히, 상기 발효 브로쓰에서 GBL의 수소화를 문헌[Frost et al., Biotechnology Progress 18:201-211(2002)]에 개시된 바와 같이 수행할 수 있다. 발효 도중 수소화를 위한 또 다른 과정들로는 예를 들어 미국 특허 제 5,478,952 호에 개시된 방법들이 있다. 상기 방법을 하기 실시예에 추가로 예시한다.
따라서, 본 발명은 γ-부티로락톤(GBL), 테트라하이드로퓨란(THF) 또는 1,4-부탄다이올(BDO)의 제조 방법을 추가로 제공한다. 상기 방법은 1,4-부탄다이올(BDO), GBL 또는 THF의 생산에 충분한 기간 동안 실질적으로 혐기성인 조건 하에서 4-하이드록시부탄산(4-HB) 및/또는 1,4-부탄다이올(BDO) 생합성 경로를 갖는 비-천연 미생물 유기체를 발효시킴을 포함하며, 상기 경로는 4-하이드록시부타노에이트 데하이드로게나제, CoA-독립적인 숙시닉 세미알데하이드 데하이드로게나제, 숙시닐-CoA 신시타제, CoA-의존성 숙시닉 세미알데하이드 데하이드로게나제, 4-하이드록시부티레이트:CoA 트랜스퍼라제, 글루타메이트:숙시닉 세미알데하이드 트랜스아미나제, α-케토글루타레이트 데카복실라제, 글루타메이트 데카복실라제, 4-하이드록시부타노에이트 키나제, 포스포트랜스부티릴라제, CoA-독립적인 1,4-부탄다이올 세미알데하이드 데하이드로게나제, CoA-의존성 1,4-부탄다이올 알콜 데하이드로게나제, CoA-독립적인 1,4-부탄다이올 알콜 데하이드로게나제 또는 CoA-의존성 1,4-부탄다이올 알콜 데하이드로게나제를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하고, 상기 발효는 유가 발효 및 회분 분리; 유가 발효 및 연속 분리, 또는 연속 발효 및 연속 분리를 포함한다.
본 발명에 개시된 바와 같은 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 및 본 발명의 다른 생성물들의 생합성 이외에, 본 발명의 비-천연 미생물 유기체 및 방법을 또한 서로 및 다른 경로들에 의해 생성물 생합성을 성취하기 위해 당해 분야에 널리 공지된 다른 미생물 유기체 및 방법들과 다양한 조합으로 사용할 수 있다. 예를 들어 상기 4-HB 생산자의 사용 및 화학적 단계들 또는 상기 BDO 생산자의 사용 이외에 BDO를 생산하는 한 가지 대안은 4-HB 또는 본 발명에 예시된 4-HB 생성물을 BDO로 전환시킬 수 있는 또 다른 미생물 유기체의 첨가를 통해서이다.
한 가지 상기와 같은 과정은 상기 및 하기에 개시된 바와 같이, 예를 들어 4-HB를 생산하기 위한 본 발명의 4-HB 생산 미생물 유기체의 발효를 포함한다. 이어서 상기 4-HB를, 상기 4-HB를 예를 들어 BDO, GBL 및/또는 THF로 전환시키는 두 번째 미생물 유기체에 대한 기질로서 사용할 수 있다. 상기 4-HB를 상기 두 번째 유기체의 또 다른 배양물에 직접 가하거나 또는 상기 4-HB 생산자의 원래 배양물을 예를 들어 세포 분리에 의해 상기 미생물 유기체에서 고갈시킬 수 있으며, 이어서 상기 두 번째 유기체의 발효 브로쓰에의 후속 첨가를 사용하여 중간 정제 단계 없이 최종 생성물을 생성시킬 수 있다. 4-HB를 예를 들어 BDO로의 전환을 위한 기질로서 생화학적으로 사용하는 능력을 갖는 하나의 예시적인 두 번째 유기체는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰이다(예를 들어 문헌[Jewell et al., Current Microbiology, 13:215-19(1986)]을 참조하시오).
따라서, 상기와 같은 과정은 예를 들어 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 경로 중간체를 생산하는 미생물 유기체의 발효를 포함한다. 이어서 상기 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 경로 중간체를, 상기 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 경로 중간체를 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신으로 전환시키는 두 번째 미생물 유기체에 대한 기질로서 사용할 수 있다. 상기 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 경로 중간체를 상기 두 번째 유기체의 또 다른 배양물에 직접 가하거나 또는 상기 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 경로 중간체 생산자의 원래 배양물을 예를 들어 세포 분리에 의해 상기 미생물 유기체에서 고갈시킬 수 있으며, 이어서 상기 두 번째 유기체의 발효 브로쓰에의 후속 첨가를 사용하여 중간 정제 단계 없이 최종 생성물을 생성시킬 수 있다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 비-천연 미생물 유기체 및 방법을 개시된 바와 같이 광범위하게 다양한 하위 경로들로 조립하여 예를 들어 4-HB 및/또는 BDO의 생합성을 성취할 수 있다. 이들 실시태양에서, 본 발명의 목적하는 생성물에 대한 생합성 경로들을 상이한 미생물 유기체들로 분리할 수 있으며, 상기 상이한 미생물 유기체들을 함께 배양하여 최종 생성물을 생산할 수 있다. 상기와 같은 생합성 설계에서, 한 미생물 유기체의 생성물은 상기 최종 생성물이 합성될 때까지 두 번째 미생물 유기체에 대한 기질이다. 예를 들어, BDO의 생합성을, 하나의 경로 중간체의 또 다른 경로 중간체 또는 생성물로의 전환, 예를 들어 4-HB를 통해 내생적인 숙시네이트와 같은 기질의 최종 생성물 BDO로의 전환에 대한 생합성 경로를 함유하는 미생물 유기체를 제작함으로써 수행할 수 있다. 한편으로, BDO를 또한 동일한 용기에서 2 개의 유기체를 사용하여 공동 배양 또는 공동 발효를 통해 미생물 유기체들로부터 생합성적으로 생산할 수 있으며, 이때 첫 번째 미생물 유기체는 숙신산으로부터 4-HB를 생산하는 유전자를 갖는 4-HB 생산자이고, 두 번째 미생물 유기체는 4-HB를 BDO로 전환시키는 유전자를 갖는 BDO 생산자이다. 예를 들어, 상기 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신의 생합성을, 하나의 경로 중간체의 또 다른 경로 중간체 또는 생성물로의 전환에 대한 생합성 경로를 함유하는 미생물 유기체를 제작함으로써 수행할 수 있다. 한편으로, 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신을 또한 동일한 용기에서 2 개의 유기체를 사용하여 공동 배양 또는 공동 발효를 통해 미생물 유기체들로부터 생합성적으로 생산할 수 있으며, 이때 첫 번째 미생물 유기체는 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 중간체를 생산하고, 두 번째 미생물 유기체는 상기 중간체를 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신으로 전환시킨다.
본 발명에 제공된 교시 및 지침에 따라, 당해 분야의 숙련가들은 본 발명의 비-천연 미생물 유기체 및 방법들에 대해서, 다른 미생물 유기체, 하위 경로들을 갖는 다른 비-천연 미생물 유기체들의 공동 배양, 및 본 발명의 4-HB, BDO, GBL 및 THF를 생성시키는 것으로 당해 분야에 널리 공지된 다른 화학적 및/또는 생화학적 과정들의 조합과 함께 광범위하게 다양한 조합 및 순열들이 존재함을 알 것이다.
본 발명의 방법에서, 상기 하나 이상의 외래 핵산들 중 임의의 핵산을 미생물 유기체에 도입시켜 본 발명의 비-천연 미생물 유기체를 생성시킬 수 있는 것으로 생각된다. 상기 핵산을 상기 미생물 유기체에, 예를 들어 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 생합성 경로를 부여하기 위해 도입시킬 수 있다. 한편으로, 암호화 핵산을 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 생합성 능력을 부여하는데 필요한 반응들 중 일부를 촉매화하는 생합성 능력을 갖는 중간 미생물 유기체가 생성되도록 도입시킬 수 있다. 예를 들어, 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 생합성 경로를 갖는 비-천연 미생물 유기체는 목적하는 효소 또는 단백질, 예를 들어 본 발명에 개시된 바와 같은 효소들의 조합(실시예 및 도 1, 8 내지 13, 58, 62 및 63 참조) 등을 암호화하는 2 개 이상의 외래 핵산을 포함할 수 있다. 따라서 생합성 경로의 2 개 이상의 효소 또는 단백질의 임의의 조합을 본 발명의 비-천연 미생물 유기체에 포함시킬 수 있는 것으로 생각된다. 유사하게, 경우에 따라 본 발명에 개시된 바와 같이, 목적하는 생합성 경로의 효소 및/또는 단백질의 조합이 상응하는 목적하는 생성물을 생성시키는 한, 예를 들어 생합성 경로의 3 개 이상의 효소 또는 단백질의 임의의 조합을 본 발명의 비-천연 미생물 유기체에 포함시킬 수 있는 것 등으로 생각된다. 유사하게, 경우에 따라, 목적하는 생합성 경로의 효소 및/또는 단백질의 조합이 상응하는 목적하는 생성물을 생성시키는 한, 본 발명에 개시된 바와 같은 생합성 경로의 4 개 이상의 효소 또는 단백질의 임의의 조합을 본 발명의 비-천연 미생물 유기체에 포함시킬 수 있다.
더 양호한 생산자를 생성시키기 위해서, 대사 모델링을 생육 조건의 최적화에 사용할 수 있다. 모델링을 또한 상기 경로의 사용을 추가로 최적화하는 유전자 녹아웃의 디자인에 사용할 수 있다(예를 들어 미국 특허 공보 제 US 2002/0012939, US 2003/0224363, US 2004/0029149, US 2004/0072723, US 2003/0059792, US 2002/0168654 및 US 2004/0009466 호, 및 미국 특허 제 7,127,379 호를 참조하시오). 모델링 분석은 상기 대사가 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신의 보다 효율적인 생산을 향해 이동하는 세포 생육에 대한 영향들의 신뢰성 있는 예견을 허용한다.
목적하는 생성물의 생합성에 유리한 대사 변경들을 확인하고 디자인하기 위한 한 가지 계산적인 방법은 옵트녹(OptKnock) 계산 체계이다(문헌[Burgard et al., Biotechnol. Bioeng. 84:647-657(2003)]). 옵트녹은 표적 생성물을 과생산하는 유전적으로 안정한 미생물을 생성시키는 유전자 결실 전략을 제시하는 대사 모델링 및 시뮬레이션 프로그램이다. 구체적으로, 상기 체계는 목적하는 생화학을 강제로 세포 생육의 필수적인 부산물로 되게 하는 유전자 조작을 제시하기 위해서 미생물의 완전한 대사 및/또는 생화학적 네트워크를 검사한다. 전략적으로 배치된 유전자 결실 또는 다른 작용성 유전자 파괴를 통해 생화학적 생산과 세포 생육을 결합시킴으로써, 생물반응기에서 보다 긴 시간 후에 상기 조작된 균주에 부과된 생육 선택 압력은 강제적인 생육-결합된 생화학적 생산의 결과로서 실행의 개선을 도출시킨다. 마지막으로, 유전자 결실을 제작하는 경우에, 옵트녹에 의해 선택된 유전자들이 상기 게놈으로부터 완전히 제거되기 때문에 상기 디자인된 균주가 그의 야생형 상태로 되돌아가는 가능성은 무시할만하다. 따라서, 상기 계산적인 방법을, 목적하는 생성물의 생합성을 도출하는 대안 경로를 확인하거나 또는 목적하는 생성물의 생합성을 추가로 최적화하기 위해 비-천연 미생물 유기체와 함께 사용할 수 있다.
간단히, 옵트녹은 본 발명에서 세포 대사를 모델링하기 위한 계산 방법 및 시스템을 지칭하는데 사용되는 용어이다. 상기 옵트녹 프로그램은 특정한 구속을 유출 균형 분석(FBA) 모델에 통합시키는 방법 및 모델 체계와 관련된다. 이들 구속은 예를 들어 정량적인 동역학 정보, 정량적인 조절 정보, 및/또는 DNA 미세배열 실험 데이터를 포함한다. 옵트녹은 또한 예를 들어 유출 균형 모델로부터 유도된 유출 경계를 엄격히 하고 후속적으로 유전자 첨가 또는 결실의 존재 하에서 대사 네트워크의 실행 한계를 탐침함으로써 다양한 대사 문제들에 대한 해법을 계산한다. 옵트녹 계산 체계는 상기 대사 네트워크의 실행 한계의 유효 질문을 가능하게 하는 모델 제형의 제작을 허용하며 상기 생성되는 혼합-정수 선형 프로그래밍 문제를 해결하는 방법을 제공한다. 본 발명에서 옵트녹으로서 지칭되는 대사 모델링 및 시뮬레이션 방법들이 예를 들어 2002년 1월 10일자로 출원된 미국 공보 2002/016854, 2002년 1월 10일자로 출원된 국제 특허 제 PCT/US02/00660 호, 및 2007년 8월 10일자로 출원된 미국 공보 2009/0047719에 개시되어 있다.
생성물의 생합성 생산에 유리한 대사 변경을 확인하고 디자인하기 위한 또 다른 계산 방법은 심페니(SimPheny)(등록상표)라 칭하는 대사 모델링 및 시뮬레이션 시스템이다. 상기 계산 방법 및 시스템은 예를 들어 2002년 6월 14일자로 출원된 미국 공보 2003/0233218 및 2003년 6월 13일자로 출원된 국제 특허 출원 PCT/US03/18838에 개시되어 있다. 심페니(등록상표)는 인실리코 네트워크 모델을 생성시키고 생물 시스템의 화학 반응들을 통해 질량, 에너지 또는 충전의 유출을 시뮬레이션하여 상기 시스템 중의 화학 반응들의 임의의 및 모든 가능한 작용기들을 함유하는 해법 공간을 한정하여, 상기 생물 시스템에 대한 일련의 허용되는 활성들을 결정할 수 있는 계산 시스템이다. 이러한 접근법은 상기 해법 공간이 상기 포함된 반응들의 공지된 화학량론 뿐만 아니라 반응 열역학과 같은 구속 및 반응들을 통한 최대 유출과 관련된 용량 구속에 의해 한정되므로 구속-기재 모델링이라 지칭된다. 이들 구속에 의해 한정된 공간은 상기 생물 시스템 또는 그의 생화학적 성분들의 표현형 능력 및 반응을 측정하기 위해 의심될 수 있다.
이러한 계산적 접근법은 생물 시스템들이 가요성이고 많은 상이한 방법들에서 동일한 결과에 도달할 수 있기 때문에 생물학적 실재와 일치한다. 생물 시스템은 모든 살아있는 시스템들이 직면해야 하는 근본적인 구속들에 의해 제한된 진화 기전을 통해 디자인된다. 따라서, 구속 기재 모델링 전략은 이들 일반적인 실재를 포함한다. 더욱이, 구속의 엄격화를 통해 네트워크 모델에 추가의 제한들을 연속적으로 부과하는 능력은 상기 해법 공간의 크기를 감소시키고, 이에 의해 생리학적 실행 또는 표현형을 예견할 수 있는 예견을 향상시킨다.
본 발명의 교시 및 지침에 따라, 당해 분야의 숙련가들은 숙주 미생물 유기체에서의 목적하는 화합물의 생합성을 디자인 및 실행하는데 대사 모델링 및 시뮬레이션에 대한 다양한 계산 체계를 적용할 것이다. 상기와 같은 대사 모델링 및 시뮬레이션 방법은 예를 들어 심페니(등록상표) 및 옵트녹으로서 상기 예시된 계산 시스템들을 포함한다. 본 발명의 예시를 위해서, 일부 방법들을 모델링 및 시뮬레이션에 대해 상기 옵트녹 계산 체계와 관련하여 본 발명에 개시한다. 당해 분야의 숙련가들은 상기 대사 변경의 확인, 디자인 및 실행을 옵트녹을 사용하여 당해 분야에 널리 공지된 상기와 같은 다른 대사 모델링 및 시뮬레이션 계산 체계 및 방법들에 어떻게 적용하는 지를 알 것이다.
상술한 방법들은 파괴하고자 하는 하나의 대사 반응 세트를 제공할 것이다. 상기 세트 또는 대사 변형 내의 각 반응의 제거 결과 목적하는 생성물이 상기 유기체의 생육 단계 동안 필수적인 산물로서 생성될 수 있다. 상기 반응들은 공지되어 있으므로, 상기 2단 옵트녹 문제에 대한 해법은 또한 상기 반응 세트 내의 각 반응을 촉매화하는 하나 이상의 효소를 암호화하는 관련된 유전자 또는 유전자들을 제공할 것이다. 각 반응에 관여하는 효소들을 암호화하는 일련의 반응 및 그의 상응하는 유전자들의 확인은 일반적으로 자동화된 공정이며, 상기 반응과, 효소와 암호화 유전자들 간의 관계를 갖는 반응 데이터베이스와의 상관성을 통해 수행된다.
일단 확인되었으면, 목적하는 생성물의 생산을 성취하기 위해서 파괴해야 하는 반응 세트를 표적 세포 또는 유기체에서 상기 세트 내의 각 대사 반응을 암호화하는 하나 이상의 유전자의 작용 파괴에 의해 실행한다. 상기 반응의 작용 파괴를 성취하는데 특히 유용한 하나의 수단은 각 암호화 유전자의 결실에 의한 것이다. 그러나, 일부의 경우, 상기 반응을 다른 유전자 이상, 예를 들어 돌연변이, 조절 부위, 예를 들어 프로모터 또는 조절 인자에 대한 시스 결합 부위의 결실에 의해, 또는 임의의 다수의 위치들에서 암호화 서열의 절두에 의해 파괴하는 것이 유리할 수 있다. 상기 후자의 이상(상기 유전자 세트의 전체 미만의 결실을 생성시킨다)은, 예를 들어 생성물의 결합에 대한 신속한 평가를 원하는 경우 또는 격세 유전이 덜 발생할 듯한 경우 유용할 수 있다.
목적하는 생성물의 생육-결합된 생합성을 포함한 생합성을 생성시킬 수 있는 대사 변형 또는 파괴하고자 하는 반응들의 추가의 세트를 도출시키는 상술한 2단 옵트녹 문제에 대한 추가의 생산적인 해법들을 확인하기 위해서, 정수 컷이라 칭하는 최적화 방법을 실행시킬 수 있다. 상기 방법은 상기 예시된 옵트녹 문제를 각 반복부에서 정수 컷이라 지칭되는 추가의 구속의 통합에 의해 반복적으로 해결함으로써 진행된다. 정수 컷 구속은 상기 해결 과정이, 임의의 선행 반복 시 확인된 정확하게 동일한 반응 세트를 선택하는 것(생성물 생합성을 생육과 강제로 결합시킨다)을 유효하게 방지한다. 예를 들어 앞서 확인된 생육-결합된 대사 변형이 파괴를 위한 반응 1, 2 및 3을 명시하는 경우, 하기의 구속은 동일한 반응이 후속 해법에 동시에 고려되는 것을 방지한다. 상기 정수 컷 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있으며 예를 들어 문헌[Burgard et al., Biotechnol. Prog. 17:791-797(2001)]에서 찾을 수 있다. 본 발명에 개시된 모든 방법들을 대사 모델링 및 시뮬레이션에 대한 상기 옵트녹 계산 체계와 함께 이들의 사용에 관하여, 반복적인 계산 분석에서 쓸데없는 반복을 감소시키는 정수 컷 방법을 또한 예를 들어 심페니(등록상표)를 포함하여 당해 분야에 널리 공지된 다른 계산 체계와 함께 적용할 수 있다.
본 발명에 예시된 방법들, 예를 들어 표적 생화학적 생성물의 생산을, 확인된 유전자 변경을 갖도록 조작된 세포 또는 유기체의 생육과 강제로 결합시키는 것은 목적하는 생성물을 생합성적으로 생산하는 세포 및 유기체를 제작할 수 있게 한다. 따라서, 본 발명에 개시된 계산 방법은 옵트녹 및 심페니(등록상표) 중에서 선택된 인 실리코 방법에 의해 확인되는 대사 변형의 확인 및 실행을 허용한다. 상기 대사 변형의 세트는 예를 들어 하나 이상의 생합성 경로 효소들의 첨가 및/또는 예를 들어 유전자 결실에 의한 파괴를 포함하여 하나 이상의 대사 반응들의 작용 파괴를 포함할 수 있다.
상기 논의된 바와 같이, 옵트녹 방법은 긴 생육 선택 기간이 가해지는 경우, 돌연변이 미생물 네트워크가 그의 계산적으로 예견된 최대-생육 표현형을 향해 진화할 수 있다는 전제 하에 개발되었다. 즉 상기 접근법은 선택성 압력 하에서 유기체의 자기 최적화 능력을 활용한다. 상기 옵트녹 체계는 네트워크 화학량론에 근거하여 생화학적 생산과 세포 생육 사이를 강제로 결부시키는 유전자 결실 조합을 총망라하여 열거한다. 최적의 유전자/반응 녹아웃의 확인은 상기 생성 네트워크에 대한 최적 생육 해법이 관심 생화학을 과생산하도록 활성 반응 세트를 선택하는 2단 최적화 문제의 해법을 필요로 한다(문헌[Burgard et al., Biotechnol. Bioeng. 84:647-657(2003)]).
에스케리키아 콜라이 대사의 인 실리코 화학량론 모델을 사용하여 앞서 예시되고 예를 들어 미국 특허 공보 제 US 2002/0012939, US 2003/0224363, US 2004/0029149, US 2004/0072723, US 2003/0059792, US 2002/0168654 및 US 2004/0009466 호, 및 미국 특허 제 7,127,379 호에 개시된 바와 같이 대사 경로에 대한 필수 유전자들을 동정할 수 있다. 본 발명에 개시된 바와 같이, 상기 옵트녹 수학 체계를 정밀한 유전자 결실에 적용하여 목적하는 생성물의 생육-결합된 생산을 도출시킬 수 있다. 더욱이, 상기 2단 옵트녹 문제의 해법은 오직 하나의 결실 세트만을 제공한다. 모든 의미 있는 해법들, 즉 생육-결합된 생산 형성을 도출하는 모든 녹아웃 세트들을 열거하기 위해서, 정수 컷이라 지칭되는 최적화 기법을 실행할 수 있다. 이는 상기 옵트녹 문제를 상기 논의된 바와 같이, 각 반복 시 정수 컷이라 지칭되는 추가의 구속을 결합시켜 반복적으로 해결함을 수반한다.
상기 예시되고 하기 실시예에 추가로 예시되는 방법들은 표적 생화학적 생성물의 생산을, 확인된 유전자 변경을 갖도록 조작된 세포 또는 유기체의 생육과 강제로 결합시키는 것을 포함하여, 생합성적으로 생산하는 세포 및 유기체를 제작할 수 있게 한다. 이 점에 관하여, 4-HB 및 1,4-부탄다이올의 생합성을 생성시키는 대사 변형이 확인되었다. 상기 확인된 대사 변형에 의해 제작된 미생물 균주는 변형되지 않은 미생물 유기체에 비해 상승된 수준의 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신을 생성시킨다. 상기 균주를, 음의 도태압을 가하지 않고서 연속적인 발효 공정으로, 예를 들어 4-HB, BDO, THF, GBL, 4-HBal, 4-HBCoA 또는 푸트레신의 상업적인 생산에 유리하게 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명에 개시된 계산 방법은 옵트녹 및 심페니(등록상표) 중에서 선택된 인 실리코 방법에 의해 확인되는 대사 변형의 확인 및 실행을 가능하게 한다. 상기 대사 변형의 세트는 예를 들어 하나 이상의 생합성 경로 효소들의 첨가 및/또는 예를 들어 유전자 결실에 의한 파괴를 포함하여 하나 이상의 대사 반응들의 작용 파괴를 포함할 수 있다.
본 발명의 다양한 실시태양들의 활성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 변형들이 또한 본 발명에 제공된 본 발명의 정의 내에 있음은 물론이다. 따라서, 하기의 실시예들은 본 발명을 예시하고자 하는 것이지 제한하고자 하는 것은 아니다.
본 발명에 개시된 비-천연 미생물 유기체들 중 어느 것이든 본 발명의 생합성 산물을 생성 및/또는 분리하도록 배양할 수 있다. 예를 들어, 상기 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 생산자를 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신의 생합성 생산을 위해 배양할 수 있다.
4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신의 생산을 위해서, 상기 재조합 균주를 탄소원 및 다른 필수 영양소를 갖는 배지에서 배양한다. 전체 공정의 비용을 줄이기 위해서 상기 발효기 중에 혐기성 조건을 유지시키는 것이 매우 바람직하다. 상기와 같은 조건은 예를 들어 먼저 상기 배지를 질소로 살포하고 이어서 상기 플라스크를 격막 및 크림프(crimp)-뚜껑으로 밀봉하여 획득할 수 있다. 생육이 혐기성 조건 하에서 관찰되지 않는 균주의 경우, 상기 격막에 제한된 통기를 위한 작은 구멍을 뚫어 미세 호기성 조건을 적용시킬 수 있다. 예시적인 혐기성 조건은 앞서 개시되었으며 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예시적인 호기성 및 혐기성 조건들은 예를 들어 2007년 8월 10일자로 출원된, 미국 공보 제 2009/0047719 호에 개시되어 있다. 발효를 본 발명에 개시된 바와 같이 회분, 유가 또는 연속 방식으로 수행할 수 있다.
경우에 따라, 상기 배지의 pH를 필요에 따라 목적하는 pH에서 유지시키기 위해 염기, 예를 들어 NaOH 또는 다른 염기, 또는 산의 첨가에 의해 목적하는 pH, 특히 중성 pH, 예를 들어 대략 7의 pH에서 유지시킬 수 있다. 생육률을 분광광도계(600 ㎚)를 사용하여 광학 밀도를 측정함으로써 측정할 수 있고 글루코스 흡수율을 시간에 따른 탄소원 고갈을 모니터함으로써 측정할 수 있다.
상기 예시된 바와 같은 재생 가능한 공급 원료 이외에, 본 발명의 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 생산 미생물 유기체를 그의 탄소 원으로서 합성 가스상에서의 생육을 위해 변형시킬 수 있다. 상기 특정 실시태양에서, 하나 이상의 단백질 또는 효소를 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 생산 유기체 중에서 발현시켜 합성 가스 또는 다른 기상 탄소 원의 사용을 위한 대사 경로를 제공한다.
합성 가스(또한 합성 기체 또는 생산자 기체로서 공지됨)는 농작물 및 잔사를 포함한, 바이오매스 물질과 같은 탄소성 물질 및 목탄 기화의 주 생성물이다. 합성 가스는 주로 H2와 CO의 혼합물이며 임의의 유기 공급원료, 예를 들어 비 제한적으로 석탄, 석유, 천연 가스, 바이오매스 및 폐 유기 물질의 기화로부터 수득될 수 있다. 기화는 일반적으로 높은 연료 대 산소 비 하에서 수행된다. 합성가스는 주로 H2 및 CO이기는 하지만, CO2 및 다른 가스들도 보다 소량으로 또한 포함할 수 있다. 따라서, 합성 가스는 비용 효과적인 기상 탄소원, 예를 들어 CO 및 추가로 CO2를 제공한다.
우드 정달(Wood-Ljungdahl) 경로는 CO 및 H2의 아세틸-CoA 및 다른 산물들, 예를 들어 아세테이트로의 전환을 촉매화한다. CO 및 합성 가스를 사용할 수 있는 유기체들은 또한 일반적으로 상기 우드 정달 경로에 의해 포함되는 동일한 기본적인 효소 및 형질전환 조합을 통해 CO2 및 CO2/H2 혼합물을 사용하는 능력을 갖는다. 미생물에 의한 CO2의 아세테이트로의 H2-의존성 전환은, CO가 또한 동일한 유기체에 의해 사용될 수 있고 동일한 경로들이 관련된 것이 밝혀지기 전까지 오랫동안 인정되었다. 다수의 아세토젠(acetogen)이 CO2의 존재 하에서 증식하며 필요한 환원 당량을 공급하기 위해서 수소가 존재하는 한 아세테이트와 같은 화합물을 생산하는 것으로 나타났다(예를 들어 문헌[Drake, Acetogenesis, pp. 3-60 Chapman and Hall, New York, (1994)]을 참조하시오). 이를 하기식에 의해 요약할 수 있다:
2 CO2 + 4 H2 + n ADP + n Pi → CH3COOH + 2 H2O + n ATP
따라서, 상기 우드 정달 경로를 갖는 비-천연 미생물은 아세틸-CoA 및 다른 목적하는 생성물의 생산을 위해서 CO2 및 H2 혼합물을 또한 사용할 수 있다.
상기 우드 정달 경로는 당해 분야에 널리 공지되어 있으며 2 개의 가지로 분리될 수 있는 12 개의 반응들로 이루어진다: (1) 메틸 가지; 및 (2) 카보닐 가지. 상기 메틸 가지는 합성 가스를 메틸-테트라하이드로폴레이트(메틸-THF)로 전환시키는 반면 상기 카보닐 가지는 메틸-THF를 아세틸-CoA로 전환시킨다. 상기 메틸 가지에서의 반응들은 하기의 효소들 또는 단백질들에 의해 차례대로 촉매화된다: 페레독신 옥시도리덕타제, 포메이트 데하이드로게나제, 폼일테트라하이드로폴레이트 신시타제, 메테닐테트라하이드로폴레이트 사이클로데하이드라타제, 메틸렌테트라하이드로폴레이트 데하이드로게나제 및 메틸렌테트라하이드로폴레이트 리덕타제. 상기 카보닐 가지에서의 반응들은 하기의 효소들 또는 단백질들에 의해 차례대로 촉매화된다: 메틸테트라하이드로폴레이트:코리노이드 단백질 메틸트랜스퍼라제(예를 들어 AcsE), 코리노이드 철-황 단백질, 니켈-단백질 조립 단백질(예를 들어 AcsF), 페레독신, 아세틸-CoA 신타제, 일산화 탄소 데하이드로게나제 및 니켈-단백질 조립 단백질(예를 들어 CooC). 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 경로를 생성시키기에 충분한 수의 암호화 핵산을 도입시키기 위해 본 발명에 제공된 교시 및 지침에 따라, 당해 분야의 숙련가들은 숙주 유기체 중에 존재하지 않는 상기 우드 정달 효소 또는 단백질을 암호화하는 하나 이상의 핵산을 도입시키는 것에 관하여 동일한 공학 디자인을 또한 수행할 수 있음을 알 것이다. 따라서, 변형된 유기체가 완전한 우드 정달 경로를 함유하도록 하나 이상의 암호화 핵산을 본 발명의 미생물 유기체에 도입시키는 것은 합성가스 사용 능력을 부여할 것이다.
또한, 환원적 (역) 트라이카복실산 주기 및/또는 하이드로게나제 활성을 또한 CO, CO2 및/또는 H2의 아세틸-CoA 및 다른 생성물, 예를 들어 아세테이트로의 전환에 사용할 수 있다. 상기 환원적 TCA 경로를 통해 탄소를 고정할 수 있는 유기체는 하기의 효소들 중 하나 이상을 사용할 수 있다: ATP 시트레이트-라이아제, 시트레이트 라이아제, 아코니타제, 아이소시트레이트 데하이드로게나제, 알파-케토글루타레이트:페레독신 옥시도리덕타제, 숙시닐-CoA 신시타제, 숙시닐-CoA 트랜스퍼라제, 퓨마레이트 리덕타제, 퓨마라제, 말레이트 데하이드로게나제, NAD(P)H:페레독신 옥시도리덕타제, 일산화 탄소 데하이드로게나제, 및 하이드로게나제. 구체적으로, 상기 일산화 탄소 데하이드로게나제 및 하이드로게나제에 의해 CO 및/또는 H2로부터 추출된 환원 당량을 사용하여 CO2를 상기 환원적 TCA 주기를 통해 아세틸-CoA 또는 아세테이트 내로 고정시킨다. 아세테이트를 아세틸-CoA 트랜스퍼라제, 아세테이트 키나제/포스포트랜스아세틸라제, 및 아세틸-CoA 신시타제와 같은 효소들에 의해 아세틸-CoA로 전환시킬 수 있다. 아세틸-CoA를 피루베이트:페레독신 옥시도리덕타제 및 글루코스 신생 합성 효소에 의해 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 전구체, 글리세르알데하이드-3-포스페이트, 포스포에놀피루베이트, 및 피루베이트로 전환시킬 수 있다. 상기 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 경로를 생성시키기에 충분한 수의 암호화 핵산을 도입시키기 위해 본 발명에 제공된 교시 및 지침에 따라, 당해 분야의 숙련가들은 동일한 조작 디자인을 또한 숙주 유기체 중에 없는 상기 환원적 TCA 경로 효소 또는 단백질을 암호화하는 하나 이상의 핵산을 도입시키는 것에 대해 수행할 수 있음을 이해할 것이다.
따라서, 상기 변형된 유기체가 완전한 환원적 TCA 경로를 함유하도록 본 발명의 미생물 유기체에 하나 이상의 암호화 핵산을 도입시키는 것은 합성 가스 이용 능력을 부여할 것이다.
따라서, 본 발명의 교시 및 지침에 따라, 당해 분야의 숙련가들은 탄소 원, 예를 들어 탄수화물 상에서 생육 시 본 발명의 생합성된 화합물을 분비하는 비-천연 미생물 유기체를 생성시킬 수 있음을 알 것이다. 상기와 같은 화합물은 예를 들어 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 및 상기 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 경로의 중간 대사 산물들 중 어느 것이든 포함한다. 필요한 것은 상기 필요한 효소 또는 단백질 활성들 중 하나 이상에서 상기 목적하는 화합물 또는 중간체의 생합성을 성취하도록, 예를 들어 상기 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 생합성 경로 중 일부 또는 전부를 포함하도록 조작하는 것이다. 따라서, 본 발명은 탄수화물 또는 다른 탄소 원 상에서 생육 시 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신을 생산하고/하거나 분비하고 탄수화물 또는 다른 탄소 원상에서 생육 시 상기 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 경로에 나타낸 중간 대사 산물들 중 임의의 것을 생산하고/분비하는 비-천연 미생물 유기체를 제공한다. 본 발명의 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 생산 미생물 유기체는 본 발명에 개시된 바와 같이, 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 경로 중의 중간체로부터 합성을 개시시킬 수 있다.
더 양호한 생산자를 생성시키기 위해서, 대사 모델링을 생육 조건의 최적화에 사용할 수 있다. 모델링을 또한 상기 경로의 사용을 추가로 최적화하는 유전자 녹아웃의 디자인에 사용할 수 있다(예를 들어 미국 특허 공보 제 US 2002/0012939, US 2003/0224363, US 2004/0029149, US 2004/0072723, US 2003/0059792, US 2002/0168654 및 US 2004/0009466 호, 및 미국 특허 제 7,127,379 호를 참조하시오). 모델링 분석은 상기 대사가 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신의 보다 효율적인 생산을 향해 이동하는 세포 생육에 대한 영향들의 신뢰성 있는 예견을 허용한다.
목적하는 생성물의 생합성에 유리한 대사 변경들을 확인하고 디자인하기 위한 한 가지 계산적인 방법은 옵트녹 계산 체계이다(문헌[Burgard et al., Biotechnol. Bioeng. 84:647-657(2003)]). 옵트녹은 표적 생성물을 과생산하는 유전적으로 안정한 미생물을 생성시키는 유전자 결실 전략을 제시하는 대사 모델링 및 시뮬레이션 프로그램이다. 구체적으로, 상기 체계는 목적하는 생화학을 강제로 세포 생육의 필수적인 부산물로 되게 하는 유전자 조작을 제시하기 위해서 미생물의 완전한 대사 및/또는 생화학적 네트워크를 검사한다. 전략적으로 배치된 유전자 결실 또는 다른 작용성 유전자 파괴를 통해 생화학적 생산과 세포 생육을 결합시킴으로써, 생물반응기에서 보다 긴 시간 후에 상기 조작된 균주에 부과된 생육 선택 압력은 강제적인 생육-결합된 생화학적 생산의 결과로서 실행의 개선을 도출시킨다. 마지막으로, 유전자 결실을 제작하는 경우에, 옵트녹에 의해 선택된 유전자들이 상기 게놈으로부터 완전히 제거되기 때문에 상기 디자인된 균주가 그의 야생형 상태로 되돌아가는 가능성은 무시할만하다. 따라서, 상기 계산적인 방법을, 목적하는 생성물의 생합성을 도출하는 대안 경로를 확인하거나 또는 목적하는 생성물의 생합성을 추가로 최적화하기 위해 비-천연 미생물 유기체와 함께 사용할 수 있다.
간단히, 옵트녹은 본 발명에서 세포 대사를 모델링하기 위한 계산 방법 및 시스템을 지칭하는데 사용되는 용어이다. 상기 옵트녹 프로그램은 특정한 구속을 유출 균형 분석(FBA) 모델에 통합시키는 방법 및 모델 체계와 관련된다. 이들 구속은 예를 들어 정량적인 동역학 정보, 정량적인 조절 정보, 및/또는 DNA 미세배열 실험 데이터를 포함한다. 옵트녹은 또한 예를 들어 유출 균형 모델로부터 유도된 유출 경계를 엄격히 하고 후속적으로 유전자 첨가 또는 결실의 존재 하에서 대사 네트워크의 실행 한계를 탐침함으로써 다양한 대사 문제들에 대한 해법을 계산한다. 옵트녹 계산 체계는 상기 대사 네트워크의 실행 한계의 유효 질문을 가능하게 하는 모델 제형의 제작을 허용하며 상기 생성되는 혼합-정수 선형 프로그래밍 문제를 해결하는 방법을 제공한다. 본 발명에서 옵트녹으로서 지칭되는 대사 모델링 및 시뮬레이션 방법들이 예를 들어 2002년 1월 10일자로 출원된 미국 공보 2002/016854, 2002년 1월 10일자로 출원된 국제 특허 제 PCT/US02/00660 호, 및 2007년 8월 10일자로 출원된 미국 공보 2009/0047719에 개시되어 있다.
생성물의 생합성 생산에 유리한 대사 변경을 확인하고 디자인하기 위한 또 다른 계산 방법은 심페니(SimPheny)(등록상표)라 칭하는 대사 모델링 및 시뮬레이션 시스템이다. 상기 계산 방법 및 시스템은 예를 들어 2002년 6월 14일자로 출원된 미국 공보 2003/0233218 및 2003년 6월 13일자로 출원된 국제 특허 출원 PCT/US03/18838에 개시되어 있다. 심페니(등록상표)는 인실리코 네트워크 모델을 생성시키고 생물 시스템의 화학 반응들을 통해 질량, 에너지 또는 충전의 유출을 시뮬레이션하여 상기 시스템 중의 화학 반응들의 임의의 및 모든 가능한 작용기들을 함유하는 해법 공간을 한정하여, 상기 생물 시스템에 대한 일련의 허용되는 활성들을 결정할 수 있는 계산 시스템이다. 이러한 접근법은 상기 해법 공간이 상기 포함된 반응들의 공지된 화학량론 뿐만 아니라 반응 열역학과 같은 구속 및 반응들을 통한 최대 유출과 관련된 용량 구속에 의해 한정되므로 구속-기재 모델링이라 지칭된다. 이들 구속에 의해 한정된 공간은 상기 생물 시스템 또는 그의 생화학적 성분들의 표현형 능력 및 반응을 측정하기 위해 의심될 수 있다.
이러한 계산적 접근법은 생물 시스템들이 가요성이고 많은 상이한 방법들에서 동일한 결과에 도달할 수 있기 때문에 생물학적 실재와 일치한다. 생물 시스템은 모든 살아있는 시스템들이 직면해야 하는 근본적인 구속들에 의해 제한된 진화 기전을 통해 디자인된다. 따라서, 구속 기재 모델링 전략은 이들 일반적인 실재를 포함한다. 더욱이, 구속의 엄격화를 통해 네트워크 모델에 추가의 제한들을 연속적으로 부과하는 능력은 상기 해법 공간의 크기를 감소시키고, 이에 의해 생리학적 실행 또는 표현형을 예견할 수 있는 예견을 향상시킨다.
본 발명의 교시 및 지침에 따라, 당해 분야의 숙련가들은 숙주 미생물 유기체에서의 목적하는 화합물의 생합성을 디자인 및 실행하는데 대사 모델링 및 시뮬레이션에 대한 다양한 계산 체계를 적용할 것이다. 상기와 같은 대사 모델링 및 시뮬레이션 방법은 예를 들어 심페니(등록상표) 및 옵트녹으로서 상기 예시된 계산 시스템들을 포함한다. 본 발명의 예시를 위해서, 일부 방법들을 모델링 및 시뮬레이션에 대해 상기 옵트녹 계산 체계와 관련하여 본 발명에 개시한다. 당해 분야의 숙련가들은 상기 대사 변경의 확인, 디자인 및 실행을 옵트녹을 사용하여 당해 분야에 널리 공지된 상기와 같은 다른 대사 모델링 및 시뮬레이션 계산 체계 및 방법들에 어떻게 적용하는지를 알 것이다.
상술한 방법들은 파괴하고자 하는 하나의 대사 반응 세트를 제공할 것이다. 상기 세트 또는 대사 변형 내의 각 반응의 제거 결과 목적하는 생성물이 상기 유기체의 생육 단계 동안 필수적인 산물로서 생성될 수 있다. 상기 반응들은 공지되어 있으므로, 상기 2단 옵트녹 문제에 대한 해법은 또한 상기 반응 세트 내의 각 반응을 촉매화하는 하나 이상의 효소를 암호화하는 관련된 유전자 또는 유전자들을 제공할 것이다. 각 반응에 관여하는 효소들을 암호화하는 일련의 반응 및 그의 상응하는 유전자들의 확인은 일반적으로 자동화된 공정이며, 상기 반응과, 효소와 암호화 유전자들 간의 관계를 갖는 반응 데이터베이스와의 상관성을 통해 수행된다.
일단 확인되었으면, 목적하는 생성물의 생산을 성취하기 위해서 파괴해야 하는 반응 세트를 표적 세포 또는 유기체에서 상기 세트 내의 각 대사 반응을 암호화하는 하나 이상의 유전자의 작용 파괴에 의해 실행한다. 상기 반응의 작용 파괴를 성취하는데 특히 유용한 하나의 수단은 각 암호화 유전자의 결실에 의한 것이다. 그러나, 일부의 경우, 상기 반응을 다른 유전자 이상, 예를 들어 돌연변이, 조절 부위, 예를 들어 프로모터 또는 조절 인자에 대한 시스 결합 부위의 결실에 의해, 또는 임의의 다수의 위치들에서 암호화 서열의 절두에 의해 파괴하는 것이 유리할 수 있다. 상기 후자의 이상(상기 유전자 세트의 전체 미만의 결실을 생성시킨다)은, 예를 들어 생성물의 결합에 대한 신속한 평가를 원하는 경우 또는 격세 유전이 덜 발생할 듯한 경우 유용할 수 있다.
목적하는 생성물의 생육-결합된 생합성을 포함한 생합성을 생성시킬 수 있는 대사 변형 또는 파괴하고자 하는 반응들의 추가의 세트를 도출시키는 상술한 2단 옵트녹 문제에 대한 추가의 생산적인 해법들을 확인하기 위해서, 정수 컷이라 칭하는 최적화 방법을 실행시킬 수 있다. 상기 방법은 상기 예시된 옵트녹 문제를 각 반복부에서 정수 컷이라 지칭되는 추가의 구속의 통합에 의해 반복적으로 해결함으로써 진행된다. 정수 컷 구속은 상기 해결 과정이, 임의의 선행 반복 시 확인된 정확하게 동일한 반응 세트를 선택하는 것(생성물 생합성을 생육과 강제로 결합시킨다)을 유효하게 방지한다. 예를 들어 앞서 확인된 생육-결합된 대사 변형이 파괴를 위한 반응 1, 2 및 3을 명시하는 경우, 하기의 구속은 동일한 반응이 후속 해법에 동시에 고려되는 것을 방지한다. 상기 정수 컷 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있으며 예를 들어 문헌[Burgard et al., Biotechnol. Prog. 17:791-797(2001)]에서 찾을 수 있다. 본 발명에 개시된 모든 방법들을 대사 모델링 및 시뮬레이션에 대한 상기 옵트녹 계산 체계와 함께 이들의 사용에 관하여, 반복적인 계산 분석에서 쓸데없는 반복을 감소시키는 정수 컷 방법을 또한 예를 들어 심페니(등록상표)를 포함하여 당해 분야에 널리 공지된 다른 계산 체계와 함께 적용할 수 있다.
본 발명에 예시된 방법들, 예를 들어 표적 생화학적 생성물의 생산을, 확인된 유전자 변경을 갖도록 조작된 세포 또는 유기체의 생육과 강제로 결합시키는 것은 목적하는 생성물을 생합성적으로 생산하는 세포 및 유기체를 제작할 수 있게 한다. 따라서, 본 발명에 개시된 계산 방법은 옵트녹 및 심페니(등록상표) 중에서 선택된 인 실리코 방법에 의해 확인되는 대사 변형의 확인 및 실행을 허용한다. 상기 대사 변형의 세트는 예를 들어 하나 이상의 생합성 경로 효소들의 첨가 및/또는 예를 들어 유전자 결실에 의한 파괴를 포함하여 하나 이상의 대사 반응들의 작용 파괴를 포함할 수 있다.
상기 논의된 바와 같이, 옵트녹 방법은 긴 생육 선택 기간이 가해지는 경우, 돌연변이 미생물 네트워크가 그의 계산적으로 예견된 최대-생육 표현형을 향해 진화할 수 있다는 전제 하에 개발되었다. 즉 상기 접근법은 선택성 압력 하에서 유기체의 자기 최적화 능력을 활용한다. 상기 옵트녹 체계는 네트워크 화학량론에 근거하여 생화학적 생산과 세포 생육 사이를 강제로 결부시키는 유전자 결실 조합을 총망라하여 열거한다. 최적의 유전자/반응 녹아웃의 확인은 상기 생성 네트워크에 대한 최적 생육 해법이 관심 생화학을 과생산하도록 활성 반응 세트를 선택하는 2단 최적화 문제의 해법을 필요로 한다(문헌[Burgard et al., Biotechnol. Bioeng. 84:647-657(2003)]).
에스케리키아 콜라이 대사의 인 실리코 화학량론 모델을 사용하여 앞서 예시되고 예를 들어 미국 특허 공보 제 US 2002/0012939, US 2003/0224363, US 2004/0029149, US 2004/0072723, US 2003/0059792, US 2002/0168654 및 US 2004/0009466 호, 및 미국 특허 제 7,127,379 호에 개시된 바와 같이 대사 경로에 대한 필수 유전자들을 동정할 수 있다. 본 발명에 개시된 바와 같이, 상기 옵트녹 수학 체계를 정밀한 유전자 결실에 적용하여 목적하는 생성물의 생육-결합된 생산을 도출시킬 수 있다. 더욱이, 상기 2단 옵트녹 문제의 해법은 오직 하나의 결실 세트만을 제공한다. 모든 의미 있는 해법들, 즉 생육-결합된 생산 형성을 도출하는 모든 녹아웃 세트들을 열거하기 위해서, 정수 컷이라 지칭되는 최적화 기법을 실행할 수 있다. 이는 상기 옵트녹 문제를 상기 논의된 바와 같이, 각 반복 시 정수 컷이라 지칭되는 추가의 구속을 결합시켜 반복적으로 해결함을 수반한다.
본 발명에 개시된 바와 같이, 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 경로의 목적하는 활성을 암호화하는 핵산을 숙주 유기체에 도입시킬 수 있다. 일부의 경우에, 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 경로 효소 또는 단백질의 활성을 변형시켜 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신의 생산을 증가시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 단백질 또는 효소의 활성을 증가시키는 공지된 돌연변이를 암호화 핵산 분자에 도입시킬 수 있다. 또한, 최적화 방법을 적용하여 효소 또는 단백질의 활성을 증가시키고/시키거나 억제 활성을 감소, 예를 들어 음의 조절 인자의 활성을 감소시킬 수 있다.
하나의 상기와 같은 최적화 방법이 방향 진화이다. 방향 진화는 효소의 성질들을 개선 및/또는 변경시키기 위해서 특정 유전자에 표적화된 돌연변이의 도입을 수반하는 강력한 접근법이다. 개선 및/또는 변경된 효소를 다수의 효소 변체들(예를 들어 >104)의 자동화된 선별을 허용하는 민감한 고속 대량 선별 분석의 개발 및 실행을 통해 확인할 수 있다. 반복되는 라운드의 돌연변이 및 선별을 전형적으로 수행하여 최적화된 성질을 갖는 효소를 제공한다. 돌연변이에 대한 유전자 영역을 확인하는데 일조할 수 있는 컴퓨터 연산방식이 또한 개발되었으며 이는 생성 및 선별에 필요한 효소 변체의 수를 현저하게 줄일 수 있다. 다양한 변체 라이브러리를 생성시키는데 유효한 다수의 방향 진화 기술들이 개발되었으며(문헌[Hibbert et al., Biomol. Eng 22:11-19(2005); Huisman and Lalonde, In Biocatalysis in the pharmaceutical and biotechnology industries pgs. 717-742(2007), Patel(ed.), CRC Press; Otten and Quax. Biomol.Eng 22:1-9(2005); and Sen et al., Appl Biochem.Biotechnol 143:212-223(2007)]), 이들 방법은 다수의 효소 부류들에 걸쳐 광범위한 성질들의 개발에 성공적으로 적용되었다. 방향 진화 기술에 의해 개선되고/되거나 변경된 효소 특징들은 예를 들어 비-천연 기질 전환의 경우 선택성/특이성; 확고한 고온 처리의 경우 온도 안정성; 보다 낮거나 보다 높은 pH 조건 하에서 생물처리의 경우 pH 안정성; 높은 생성물 역가를 성취할 수 있도록 하기 위한 기질 또는 생성물 허용성; 비-천연 기질을 포함하도록 기질 결합을 확장시키는 결합(Km); 생성물, 기질 또는 핵심 중간체에 의한 억제를 제거하기 위한 억제(Ki); 목적하는 유출을 성취하기 위해 효소 반응 속도를 증가시키는 활성(kcat); 단백질 수율 및 전체 경로 유출을 증가시키는 발현 수준; 호기성 조건 하에서 공기 민감성 효소의 작용을 위한 산소 안정성; 및 산소의 부재 하에서 호기성 효소의 작용을 위한 혐기성 활성을 포함한다.
특정 효소들의 목적하는 성질들을 표적화하기 위한 유전자들의 돌연변이 및 변형을 위해 다수의 예시적인 방법들이 개발되었다. 상기와 같은 방법들은 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지되어 있다. 이들 중 어느 것이든 사용하여 4-HB, 4-HBal, 4-HBCoA, BDO 또는 푸트레신 경로 효소 또는 단백질의 활성을 변경/최적화할 수 있다. 상기와 같은 방법은 비 제한적으로, PCR 반응에서 DNA 폴리머라제의 충실도를 감소시킴으로써 랜덤한 점 돌연변이를 도입시키는 EpPCR(문헌[Pritchard et al., J Theor. Biol 234:497-509(2005)]); 전체 환상 플라스미드가 주형으로서 사용되고 마지막 2 개의 뉴클레오타이드 상에 엑소뉴클레아제 내성 티오포스페이트 결합을 갖는 랜덤한 6-머들을 사용하여 상기 플라스미드를 증폭시킨 다음 세포 내로 형질전환시키고, 여기에서 상기 플라스미드를 직렬 반복부에서 다시 환화시킴을 제외하고, epPCR과 유사한 실수유발 회전 환 증폭(epRCA)(문헌[Fujii et al., Nucleic Acids Res 32:e145(2004); and Fujii et al., Nat.Protoc. 1:2493-2497(2006)]); Dnase I 또는 EndoV와 같은 뉴클레아제들로 2 개 이상의 변체 유전자를 절단하여 DNA 폴리머라제의 존재 하에서 어닐링 및 연장의 주기에 의해 재조립되어 키메릭 유전자들의 라이브러리를 생성시키는 랜덤한 단편들의 풀을 생성시킴을 전형적으로 수반하는 DNA 또는 패밀리 셔플링(문헌[Stemmer, Proc Natl Acad Sci U.S.A 91:10747-10751(1994); and Stemmer, Nature 370:389-391(1994)]); 주형 점화에 이어서 변성 및 어닐링/연장의 매우 짧은 지속(5초 정도로 짧은)의 반복된 주기의 2 단계 PCR을 수반하는 엇갈린 연장(StEP)(문헌[Zhao et al., Nat. Biotechnol 16:258-261(1998)]); 랜덤 서열 프라이머를 사용하여 상기 주형의 상이한 분절들에 상보성인 다수의 짧은 DNA 단편들을 생성시키는 랜덤 프라이밍 재조합(RPR)(문헌[Shao et al., Nucleic Acids Res 26:681-683(1998)])을 포함한다.
추가적인 방법들은, 선형화된 플라스미드 DNA를 사용하여 이형 이중 가닥을 형성시키며, 이는 불일치 수복에 의해 수복되는 이형 이중 가닥 재조합(문헌[Volkov et al., Nucleic Acids Res 27:e18(1999); and Volkov et al., Methods Enzymol. 328:456-463(2000)]); Dnase I 단편화 및 단일 가닥 DNA의 크기 분류를 사용하는 일시적인 주형 상의 랜덤 키메라 발생(RACHITT)(문헌[Coco et al., Nat. Biotechnol 19:354-359(2001)]); 주형의 풀로서 사용된 단일방향 ssDNA 단편들의 존재 하에서 프라이머들로부터 단일방향으로 성장하는 가닥들의 주형 스위칭을 수반하는 절두된 주형 상에서의 재조합 연장(RETT)(문헌[Lee et al., J. Molec. Catalysis 26:119-129(2003)]); 퇴화된 프라이머를 사용하여 분자들 간의 재조합을 조절하는 퇴화된 올리고뉴클레오타이드 유전자 셔플링(DOGS)(문헌[Bergquist and Gibbs, Methods Mol. Biol 352:191-204(2007); Bergquist et al., Biomol.Eng 22:63-72(2005); Gibbs et al., Gene 271:13-20(2001)]); 관심 유전자 또는 유전자 단편의 1 염기쌍 결실과의 조합적인 라이브러리를 생성시키는 하이브리드 효소의 생성을 위한 점증적인 절두(ITCHY)(문헌[Ostermeier et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A. 96:3562-3567(1999); and Ostermeier et al, Nat. Biotechnol. 17:1205-1209(1999)]); 포스포티올레이트 dNTP를 사용하여 절두를 생성시킴을 제외하고 ITCHY와 유사한 상기 하이브리드 효소의 생산을 위한 티오-증분 절두(THIO-ITCHY)(문헌[Lutz et al., Nucleic Acids Res 29:E16(2001)]); 2 개의 유전자 재조합 방법, 즉 ITCHY와 DNA 셔플링을 겸하는 SCRATCH(문헌[Lutz et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A. 98:11248-11253(2001)]); 돌연변이가 epPCR에 이어서 유용한 활성을 보유하는 것들에 대한 선별/선택을 통해 이루어지는 랜덤 표류 돌연변이(RNDM)(문헌[Bergquist et al., Biomol. Eng. 22:63-72(2005)]); 포스포티오에이트 뉴클레오타이드의 랜덤한 통합 및 절단을 사용하여 랜덤한 길이의 단편들의 풀을 생성시키고; 상기 풀을 주형으로서 사용하여 이노신과 같은 "보편적인" 염기의 존재 하에서 연장시키고, 이노신-함유 보체의 복제가 랜덤한 염기 통합 및 결과적으로 돌연변이를 제공하는 랜덤한 돌연변이 방법인 서열 포화 돌연변이(SeSaM)(문헌[Wong et al., Biotechnol J. 3:74-82(2008); Wong et al., Nucleic Acids Res 32:e26(2004); and Wong et al., Anal.Biochem. 341:187-189(2005)]); "표적 중의 모든 유전자 다양성"을 암호화하도록 디자인된 중복되는 올리고뉴클레오타이드를 사용하고 상기 셔플링된 자손에 대해 매우 높은 다양성을 허용하는 합성 셔플링(문헌[Ness, et al, Nat. Biotechnol 20:1251-1255(2002)]); dUTP 통합에 이은 유라실 DNA 글리코실라제 및 이어서 피페리딘에 의한 처리의 조합을 활용하여 종점 DNA 단편화를 수행하는 뉴클레오타이드 교환 및 절제 기술 NexT(문헌[Muller et al., Nucleic Acids Res 33:e117(2005)])를 포함한다.
추가의 방법들은, 링커를 사용하여 2 개의 멀리 관련되거나 또는 관련되지 않은 유전자들 간의 융합을 촉진하며, 상기 두 유전자 사이에 일련의 키메라들을 생성시켜, 단일-교차 하이브리드의 라이브러리가 생성되는 서열 상동성-독립적인 단백질 재조합(SHIPREC)(문헌[Sieber et al., Nat.Biotechnol 19:456-460(2001)]); 출발 물질이 삽입물을 함유하는 초나선(supercoiled) 이중 가닥 DNA(dsDNA) 플라스미드 및 목적하는 돌연변이 부위에서 퇴화되는 2 개의 프라이머를 포함하는 유전자 부위 포화 돌연변이TM(GSSMTM)(문헌[Kretz et al., Methods Enzymol. 388:3-11(2004)]); 한정된 부위들을 다수의 가능한 아미노산 서열 변경으로 대체하는 짧은 올리고뉴클레오타이드 카세트의 사용을 포함하는 조합적인 카세트 돌연변이(CCM)(문헌[Reidhaar-Olson et al. Methods Enzymol. 208:564-586(1991); and Reidhaar-Olson et al. Science 241:53-57(1988)]); CCM과 본질적으로 유사하고 높은 돌연변이율에서 epPCR을 사용하여 다발점 및 다발 영역을 확인하고 이어서 CMCM에 의한 연장으로 단백질 서열 공간의 한정된 부위를 포함하는 조합적인 복합 카세트 돌연변이(CMCM)(문헌[Reetz et al., Angew. Chem. Int. Ed Engl. 40:3589-3591(2001)]); DNA 폴리머라제 III의 돌연변이 서브유닛을 암호화하는, mutD5 유전자를 사용하는, 조합적인 ts 돌연변이유발 플라스미드가 선택 중에 랜덤한 천연 돌연변이 빈도의 20- 내지 4000-X의 증가를 허용하고 선택이 필요하지 않은 경우 유해 돌연변이의 축적을 방지하는 돌연변이 유발 균주 기법(문헌[Selifonova et al., Appl Environ Microbiol 67:3645-3649(2001)); Low et al., J. Mol. Biol. 260:359-3680(1996)])을 포함한다.
추가의 예시적인 방법들은, 선택된 아미노산들의 조합적인 돌연변이들을 평가하고 최적화하는 다차원적 돌연변이 방법인 룩-스루(Look-Through) 돌연변이(LTM)(문헌[Rajpal et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A 102:8466-8471(2005)]); 한번에 다수의 유전자에 적용되거나 또는 단일 유전자의 큰 키메라 라이브러리(다수의 돌연변이)를 생성시키는데 적용될 수 있는 DNA 셔플링 방법인 유전자 재조립(베레늄 코포레이션(Verenium Corporation)에 의해 공급된 Tunable GeneReassemblyTM(TGRTM) 기술); 특정한 주름을 갖는 구조적으로 한정된 단백질 주쇄를 고정시키고 상기 주름 및 전체 단백질 에너지학을 안정화할 수 있는 아미노산 치환을 위한 서열 공간을 탐색하며, 공지된 3차원 구조를 갖는 단백질에 대해 일반적으로 가장 유효하게 작용하는 최적화 연산방식인 인 실리코(In silico) 단백질 디자인 자동화(PDA)(문헌[Hayes et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A. 99:15926-15931(2002)]); 및 효소 개선에 가능한 부위를 선택하기 위한 구조/작용 지식의 사용, 스트라타진 퀵체인지(Stratagene QuikChange)(Stratagene; San Diego CA, USA)와 같은 돌연변이 방법을 사용하는 선택된 부위에서의 포화 돌연변이의 수행, 목적하는 성질에 대한 선별/선택, 개선된 클론(들)과 함께, 또 다른 부위에서의 다시 시작 및 목적하는 활성이 성취될 때까지 연속적인 반복을 수반하는, 반복하는 포화 돌연변이(ISM)(문헌[Reetz et al., Nat. Protoc. 2:281-903(2007); and Reetz et al., Angew. Chem. Int. Ed Engl. 45:7745-7751(2006)])를 포함한다.
상기 언급한 돌연변이 방법들 중 임의의 방법을 단독으로 사용하거나 병행할 수 있다. 또한, 상기 방향 진화 방법들 중 어느 하나 또는 조합을 본 발명에 개시된 바와 같이 적응 진화 기법들과 함께 사용할 수 있다.
본 발명의 다양한 실시태양들의 활성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 변형들이 또한 본 발명에 제공된 본 발명의 정의 내에 있음은 물론이다. 따라서, 하기의 실시예들은 본 발명을 예시하고자 하는 것이지 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 I
4- 하이드록시부탄산의 생합성
본 실시예는 4-HB 생산을 위한 예시적인 생화학적 경로를 개시한다.
미생물에서 4-HB 합성에 대한 선행의 보고서들은 상기 화합물을 생분해성 플라스틱 폴리-하이드록시알카노에이트(PHA) 생산의 중간체로서 초점을 맞추었다(미국 특허 제 6,117,658 호). 폴리-3-하이드록시부티레이트 중합체(PHB)에 대한 4-HB/3-HB 공중합체의 사용은 덜 취약한 플라스틱을 생성시킬 수 있다(문헌[Saito and Doi, Intl. J. Biol. Macromol. 16:99-104(1994)]). 본 발명에 개시된 단량체성 4-HB의 생산은 여러 이유로 인해 근본적으로 독특한 공정이다: (1) 상기 생성물은 세포 내적으로 생산되고 세포 중에 남아있는 PHA와 상반되게, 분비되고; (2) 하이드록시부타노에이트 중합체를 생산하는 유기체의 경우에, 유리 4-HB가 생성되지 않고, 오히려 조효소 A 유도체가 상기 폴리하이드록시알카노에이트 신타제에 의해 사용되고; (3) 상기 중합체의 경우에, 상기 과립형 생성물의 형성은 열역학을 변화시키고; (4) 세포 외 pH는 상기 중합체의 생산에는 문제가 되지 않는 반면, 4-HB가 유리산으로 존재하는지 혹은 공액 염기 상태로 존재하는지의 여부, 및 또한 4-HB와 GBL 간의 평형에 영향을 미칠 것이다.
4-HB를 중간체로서 숙시닉 세미알데하이드와, TCA 주기의 중심 대사 산물인 숙시네이트로부터의 2 개의 효소 환원 단계로 생성시킬 수 있다(도 1). 상기 효소들 중 첫 번째인 숙시닉 세미알데하이드 데하이드로게나제는 에스케리키아 콜라이를 포함한 다수의 유기체들에 대해 고유하며, 이중 NADH- 및 NADPH-의존성 효소들이 밝혀졌다(문헌[Donnelly and Cooper, Eur. Biochem. 113:555-561(1981); Donnelly and Cooper, J. Bacteriol. 145:1425-1427(1981); Marek and Henson, J. Bacteriol. 170:991-994(1988)]). 사카로마이세스 세레비지아에에서 숙시닉 세미알데하이드 데하이드로게나제 활성을 지지하는 증거가 또한 존재하며(문헌[Ramos et al., Eur. J. Biochem. 149:401-404(1985)]), 추정적인 유전자가 서열 상동성에 의해 동정되었다. 그러나, 대부분의 보고서들은 상기 효소가 도 1에 도시된 바와 같이 숙시네이트 합성의 방향으로 진행하며(상기 문헌[Donnelly and Cooper; Lutke-Eversloh and Steinbuchel, FEMS Microbiol. Lett. 181:63-71(1999)]), 4-HB 및 감마-아미노부티레이트의 분해 경로에 관여함을 지적한다. 숙시닉 세미알데하이드는 또한 2 가지 효소, 즉 글루타메이트:숙시닉 세미알데하이드 트랜스아미나제 및 글루타메이트 데카복실라제의 작용을 거쳐 TCA 주기 중간체 α-케토글루테레이트를 통해 에스케리키아 콜라이와 같은 몇몇 미생물 유기체에 의해 자연적으로 생산된다. 숙시네이트를 분해하는 절대 혐기성 생물인 클로스트리듐 클루이베리에 의해 사용되는 또 다른 경로는 숙시네이트를 숙시닐-CoA로 활성화시키고, 이어서 하기 전환 방향으로 작용하는 것으로 공지된 또 다른 숙시닉 세미알데하이드 데하이드로게나제를 사용하여 숙시닐-CoA를 숙시닉 세미알데하이드로 전환시킨다(문헌[Sohling and Gottschalk, Eur. J. Biochem. 212:121-127(1993)]). 그러나, 상기 경로는 숙시네이트를 숙시닐-CoA로 전환시키는데 ATP의 에너지 비용을 필요로 한다.
상기 경로의 두 번째 효소인 4-하이드록시부타노에이트 데하이드로게나제는 에스케리키아 콜라이 또는 효모에 고유하지 않지만 다양한 세균들, 예를 들어 클로스트리듐 클루이베리 및 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha)에서 발견된다(상기 문헌[Lutke-Eversloh and Steinbuchel; Sohling and Gottschalk, J. Bacteriol. 178:871-880(1996); Valentin et al., Eur. J. Biochem. 227:43-60(1995); Wolff and Kenealy, Protein Expr. Purif. 6:206-212(1995)]). 이들 효소는 NADH-의존성인 것으로 공지되어 있지만, NADPH-의존성 형태도 또한 존재한다. 폴리(4-하이드록시부티르산)을 축적시키는 알파-케토글루타레이트로부터 4-HB로의 추가적인 경로가 에스케리키아 콜라이에서 입증되었다(문헌[Song et al., Wei Sheng Wu Xue.Bao. 45:382-386(2005)]). 상기 재조합 균주는 2 개의 고유 에스케리키아 콜라이 유전자, 글루타메이트:숙시닉 세미알데하이드 트랜스아미나제 및 글루타메이트 데카복실라제와 함께, 3 개의 이종 유전자, PHA 신타제(랄스토니아 유트로파), 4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제(랄스토니아 유트로파) 및 4-하이드록시부티레이트:CoA 트랜스퍼라제(클로스트리듐 클루이베리)의 과발현을 필요로 하였다. 도 1의 단계 4 및 5를 한편으로 알파-케토글루타레이트 데카복실라제, 예를 들어 유글레나 그라실리스(Euglena gracilis)에서 동정된 것에 의해 수행할 수 있다(문헌[Shigeoka et al., Biochem. J. 282(Pt2):319-323(1992); Shigeoka and Nakano, Arch. Biochem. Biophys. 288:22-28(1991); Shigeoka and Nakano, Biochem J. 292(Pt2):463-467(1993)]). 그러나, 상기 효소는 이전에는 임의의 유기체에서 4-HB 또는 관련된 중합체의 생산에 영향을 미치기 위해 적용되지 않았다.
4-하이드록시부티레이트의 미생물 생산 능력이 2 개의 미생물, 에스케리키아 콜라이 및 사카로마이세스 세레비지아에에서, 각 유기체의 인 실리코 대사 모델을 사용하여 조사되었다. 4-HB로의 잠재적인 경로들이 도 1에 도시된 바와 같이 숙시네이트, 숙시닐-CoA 또는 알파-케토글루타레이트 중간체를 경유하여 진행된다.
상기 숙시네이트로부터 4-HB 생산 경로의 첫 번째 단계는 NADH- 또는 NADPH-의존성 숙시닉 세미알데하이드 데하이드로게나제를 통한 숙시네이트의 숙시닉 세미알데하이드로의 전환을 수반한다. 에스케리키아 콜라이에서, gabD는 NADP-의존성 숙시닉 세미알데하이드 데하이드로게나제이며 4-아미노부티레이트 흡수 및 분해에 관여하는 유전자 클러스터의 일부이다(문헌[Niegemann et al., Arch. Microbiol. 160:454-460(1993); Schneider et al., J. Bacteriol. 184:6976-6986(2002)]). sad는 NAD-의존성 숙시닉 세미알데하이드 데하이드로게나제 활성에 대해 상기 효소를 암호화하는 것으로 여겨진다(상기 Marek and Henson). 사카로마이세스 세레비지아에는 추정 상 UGA2(시토솔에 집중되어 있다)로 지정된 NADPH-의존성 숙시닉 세미알데하이드 데하이드로게나제만을 함유한다(문헌[Huh et al., Nature 425:686-691(2003)]). 상기 에스케리키아 콜라이 및 사카로마이세스 세레비지아에 모두에서 4-HB로의 숙시네이트 경로를 추정하는 최대 수율 계산은 단지 비-고유 4-HB 데하이드로게나제가 그의 대사 네트워크에 가해졌다는 가정만을 요한다.
숙시닐-CoA로부터 4-하이드록시부티레이트로의 경로가 4-하이드록시부티레이트 단량체 단위를 포함하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조 방법의 일부로서 미국 특허 제 6,117,658 호에 개시되었다. 클로스트리듐 클루이베리는 CoA-의존성 숙시닉 세미알데하이드 데하이드로게나제 활성을 갖는 것으로 공지된 유기체의 일례이다(상기 문헌[Sohling and Gottschalk; 상기 Sohling and Gottschalk]). 이 연구에서, 클로스트리듐 클루이베리 또는 또 다른 유기체로부터의 상기 효소는 비-고유 또는 이종 4-HB 데하이드로게나제와 함께 에스케리키아 콜라이 또는 사카로마이세스 세레비지아에에서 발현되어 숙시닐-CoA로부터 4-HB로의 경로를 완성하는 것으로 추정된다. 건조 세포 중량의 30%까지 폴리(4-하이드록시부티르산)을 축적시키는 알파-케토글루타레이트로부터 4-HB로의 경로가 에스케리키아 콜라이에서 입증되었다(상기 Song et al.). 에스케리키아 콜라이 및 사카로마이세스 세레비지아에는 글루타메이트:숙시닉 세미알데하이드 트랜스아미나제 및 글루타메이트 데카복실라제 모두를 고유하게 또는 내생적으로 소유하므로(문헌[Coleman et al., J. Biol. Chem. 276:244-250(2001)]), 단지 비-고유 4-HB 데하이드로게나제가 존재한다는 가정만으로 상기 두 유기체 모두에서 AKG로부터 4-HB로의 경로를 완성할 수 있다.
실시예 II
숙시네이트 및 알파- 케토글루타레이트로부터 1,4- 부탄다이올의 생합성
본 실시예는 미생물 유기체로부터 4-HB 및 BDO의 제조 및 생합성적 생산을 예시한다. 4-HB 및 BDO에 대한 경로들은 본 발명에 개시되어 있다.
상술한 경로에 사용될 수 있는 대안적인 효소들이 다수 존재한다. 숙시네이트에서 숙시닐-CoA로의 전환(도 1에서 단계 1)을 위한 고유 또는 내생적인 효소를 CoA 트랜스퍼라제, 예를 들어 클로스트리듐 클루이베리 cat1 유전자에 의해 암호화된 것(문헌[Sohling and Gottschalk, Eur. J Biochem. 212:121-127(1993)])(단계 9와 유사한 방식으로 작용한다)에 의해 대체할 수 있다. 그러나, 상기 효소에 의한 아세테이트의 생산은, 아세틸-CoA로 다시 전환되기보다는 오히려 분비될 수도 있기 때문에 최적이지 않을 수도 있다. 이 점에 관하여, 단계 9에서 아세테이트 형성을 제거하는 것이 또한 유리할 수 있다. 상기 CoA 트랜스퍼라제에 대한 하나의 대안으로서, 아세테이트의 아세틸-CoA로의 전환에 대한 에스케리키아 콜라이에서의 아세테이트 키나제/포스포트랜스아세틸라제 경로와 유사하게, 상기 4-HB를 먼저 ATP에 의해 인산화하고 이어서 CoA 유도체로 전환하는 기전을 사용할 수 있다. 상기 경로의 순 비용은 1 ATP이며, 이는 아세테이트로부터 아세틸-CoA를 재생하는데 필요한 것과 같다. 효소 포스포트랜스부티릴라제(ptb) 및 부티레이트 키나제(bk)는 상기 단계들을 클로스크리듐 아세토부틸리쿰에서 부티레이트 생산을 위해 비-하이드록실화된 분자 상에서 수행하는 것으로 공지되어 있다(문헌[Cary et al., Appl Environ Microbiol 56:1576-1583(1990); Valentine, R.C. and R.S. Wolfe, J Biol Chem. 235:1948-1952(1960)]). 이들 효소는 가역적이어서, 합성이 4-HB의 방향으로 진행할 수 있게 한다.
BDO는 또한 숙시네이트를 통하는 것 이외에 또는 상기를 대신하여 α-케토글루타레이트를 경유하여 생산될 수 있다. 앞서 개시되고 하기에 추가로 예시하는 바와 같이, 생성물 생합성을 수행하기 위한 하나의 경로는 내생적인 효소들을 사용하여 α-케토글루타레이트를 통해 숙시닉 세미알데하이드를 생산함에 의한다(도 1, 단계 4 내지 5). 대안은 상기 전환을 1 단계로 수행할 수 있는 α-케토글루타레이트 데카복실라제를 사용하는 것이다(도 1, 단계 8; 문헌[Tian et al. Proc Natl Acad Sci U.S.A 102:10670-10675(2005)]).
BDO 생산 미생물 유기체의 상이한 균주들의 제작을 위해서, 적용 가능한 유전자들의 목록을 보강증거를 위해 모아 정리하였다. 간단히, 상기 4-HB 및/또는 BDO 생합성 경로들 내의 하나 이상의 유전자들이, 입수할 수 있는 문헌 자원, NCBI 유전자 데이터베이스, 및 상동성 검색을 사용하여, 도 1에 도시된 완전한 BDO-생산 경로의 각 단계들에 대해 동정되었다. 본 연구에서 클로닝되고 평가된 유전자들을, 상기 폴리펩타이드 서열에 대한 URL 인용 및 적합한 참고문헌들과 함께, 하기 표 6에 제공한다. 하기에 추가로 논의되는 바와 같이, 일부 유전자들은 코돈 최적화를 위해 합성된 반면, 다른 것들은 고유 또는 야생형 유기체의 게놈 DNA로부터 PCR을 통해 클로닝되었다. 일부 유전자들의 경우 상기 두 접근법이 모두 사용되었으며, 이 경우 고유 유전자를 실험에 사용되었을 때의 유전자 식별 번호에 대한 접미사 "n"에 의해 표시한다. 단지 DNA 서열만이 상이한 경우, 단백질들은 동일함에 유의한다.
Figure pct00002
Figure pct00003
BDO 경로를 위한 발현 벡터 제작
벡터 주쇄 및 일부 균주들을 롤프 루츠 박사(Dr. Rolf Luts of Expressys)(www.expressys.de/)로부터 수득하였다. 상기 벡터 및 균주는 롤프 루츠 박사와 헤르만 부야르트 교수(Prof. Hermann Bujard)에 의해 개발된 pZ 발현 시스템(문헌[Lutz, R. and H. Bujard, Nucleic Acids Res 25:1203-1210(1997)])에 근거한다. 수득된 벡터는 pZE13luc, pZA33luc, pZS*13luc 및 pZE22luc이었으며, 스터퍼 단편으로서 루시페라제 유전자를 함유하였다. 상기 루시페라제 스터퍼 단편을 적합한 제한 효소 부위들이 측면에 인접한 lacZ-알파 단편으로 치환하기 위해서, 상기 루시페라제 스터퍼 단편을 먼저 EcoRI 및 XbaI에 의한 절단에 의해 각 벡터로부터 제거하였다. 상기 lacZ-알파 단편을 하기의 프라이머들을 사용하여 pUC19로부터 PCR 증폭시켰다:
lacZ 알파-RI
5'GACGAATTCGCTAGCAAGAGGAGAAGTCGACATGTCCAATTCACTGGCCGTCGTTTTAC3'
lacZ 알파 3'BB
5'-GACCCTAGGAAGCTTTCTAGAGTCGACCTATGCGGCATCAGAGCAGA-3'
상기 증폭은 EcoRI 부위, NheI 부위, 리보솜 결합 부위, SalI 부위의 5' 단부 및 출발 코돈을 갖는 단편을 생성시켰다. 상기 단편의 3' 단부에 정지 코돈, XbaI, HindIII, 및 AvrII 부위를 함유하였다. 상기 PCR 산물을 EcoRI 및 AvrII로 절단하고 EcoRI 및 XabI으로 절단된 기본 벡터에 연결시켰다(XbaI 및 AvrII는 양립성 단부를 가지며 비-부위를 생성시킨다). NheI 및 XbaI 제한 효소 부위는 함께 연결될 수 있는 양립성 단부를 생성시키므로(그러나 어느 한 효소에 의해서는 절단되지 않는 NheI/XbaI 비-부위를 생성시킨다), 상기 벡터 내로 클로닝된 유전자들은 함께 "바이오브릭(biobrick)"될 수 있다(http://openwetware.org/wiki/Synthetic_Biology:BioBricks). 간단히, 상기 방법은 동일한 2 개의 제한 부위들을 사용하여 벡터 내로의 무제한 수의 유전자들의 결합을 가능하게 하는데(상기 부위들이 상기 유전자에 내부적인 것으로 보이지 않는 한), 그 이유는 상기 유전자들 사이의 부위들이 각각의 첨가 후 파괴되기 때문이다.
모든 벡터는 복제 기원, 항생제 내성 마커 및 프로모터/조절 단위를 표시하는 문자 및 숫자들이 이어지는 pZ 명칭을 갖는다. 상기 복제 기원은 두 번째 문자이며 ColE1의 경우 E, p15A의 경우 A 및 pSC101계 기원의 경우 S에 의해 표시된다. 첫 번째 숫자는 항생제 내성 마커를 나타낸다(암피실린의 경우 1, 가나마이신의 경우 2, 클로람페니콜의 경우 3, 스펙티노마이신의 경우 4 및 테트라사이클린의 경우 5). 마지막 숫자는 관심 유전자를 조절하는 프로모터를 한정한다(PLtetO -1의 경우 1, PLlacO-1의 경우 2, PAllacO -1의 경우 3 및 Plac / ara -1의 경우 4). MCS 및 관심 유전자가 바로 뒤에 이어진다. 본 발명에서 논의되는 연구의 경우, 우리는 2 개의 기본 벡터, pZA33 및 pZE13을 사용하였으며, 이는 상기 논의된 바와 같이 바이오브릭 삽입에 대해 변형되었다. 일단 관심 유전자(들)가 상기 벡터 내로 클로닝되었으면, 생성되는 플라스미드를 표 6에 제공된 4 개의 숫자 유전자 코드를 사용하여 표시한다; 예를 들어 pZA33-XXXX-YYYY-....
숙주 균주 제작
본 발명에 개시된 모든 연구들에서 모 균주는 에스케리키아 콜라이 K-12 균주 MG1655이다. 무 마커(markerless) adhE, gabD 및 aldA 결실 균주를 redET 방법을 사용하여 제3자에 의한 서비스 접촉 하에서 제작하였다(문헌[Datsenko, K.A. and B.L. Wanner, Proc Natl Acad Sci U.S.A 97:6640-6645(2000)]). 박테리오파지 P1 매개된 형질도입을 통해 후속 균주들을 제작하였다(문헌[Miller, J. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratories, New York(1973)]). 균주 C600Z1(laciq, PN25-tetR, SpR, lacY1, leuB6, mcrB+, supE44, thi-1, thr-1, tonA21)을 익스프레시스(Expressys)로부터 수득하였으며 P1 형질도입을 위한 lacIq 대립유전자의 출처로서 사용하였다. 박테리오파지 P1vir을 C600Z1 에스케리키아 콜라이 균주 상에서 증식시켰으며, 상기 균주는 lacIq에 결합된 스펙티노마이신 내성 유전자를 갖는다. 상기 C600Z1 상에서 증식한 P1 융해물을 사용하여 MG1655를 감염시키고 스펙티노마이신 내성에 대해 선택하였다. 이어서 상기 스펙티노마이신 내성 콜로니들을, PAllacO -1 프로모터에 결합된 유전자의 발현을 억제하는 상기 형질도입체의 능력을 측정함으로써 상기 결합된 lacIq에 대해 선별하였다. 생성 균주를 MG1655 lacIq로 표시하였다. 유사한 과정을 사용하여 lacIQ를 상기 결실 균주에 도입시켰다.
숙시네이트로부터 4- HB 의 생산
숙시네이트로부터 4-HB 생산자를 제작하기 위해서, 숙시네이트로부터 4-HB 및 4-HB-CoA로의 단계들을 암호화하는 유전자들(도 1에서 1, 6, 7 및 9)을 하기에 개시하는 바와 같이 pZA33 및 pZE13 벡터 상에 조립하였다. 다양한 유전자들의 조합뿐만 아니라 대조군으로서 불완전한 경로를 갖는 구조물들을 평가하였다(표 7 및 8). 이어서 상기 플라스미드를, lacIQ를 함유하는 숙주 균주 내로 형질전환시켰으며, 이는 아이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)의 첨가에 의한 유도 발현을 허용한다. 야생형 및 고유의 숙시닉 세미알데하이드 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자가 결실된 숙주(도 1, 단계 2)를 모두 시험하였다.
상기 이종 효소의 활성을 먼저, 상기 경로 유전자들을 함유하는 플라스미드 구조물에 대한 숙주로서 균주 KG1655 lacIQ를 사용하여 시험관 내 분석으로 시험하였다. 세포를 각각의 구조물에 대해 적합한 항생제를 함유하는 LB 배지(Difco)에서 호기성으로 증식시키고, 광학 밀도(OD600)가 대략 0.5에 도달하면 1 mM의 IPTG의 첨가에 의해 유도하였다. 세포를 6 시간 후에 수확하고, 효소 분석을 하기 논의되는 바와 같이 수행하였다.
시험관 내 효소 분석
활성 분석을 위한 조 추출물을 수득하기 위해서, 세포를 10 분간 4,500 rpm에서 원심분리(Beckman-Coulter, Allegera X-15R)에 의해 수확하였다. 펠릿을 벤조나제 및 리소자임과 함께 0.3 ㎖ 버그버스터(BugBuster)(Novagen) 시약에 재현탁시키고, 실온에서 서서히 진탕하면서 15 분간 용해를 진행시켰다. 무 세포 용해물을 4 ℃에서 30 분간 14,000 rpm에서의 원심분리(에펜도르프 원심분리기 5402)에 의해 수득하였다. 상기 샘플 중의 세포 단백질을 문헌[Bradford et al., Anal. Biochem. 72:248-254(1976)]의 방법을 사용하여 측정하고 비 효소 분석을 하기 개시되는 바와 같이 수행하였다. 활성을 단위/㎎ 단백질로 기록하며, 이때 활성 단위는 실온에서 1 분간 기질 1 μmol을 전환시키는데 필요한 효소의 양으로서 정의된다. 일반적으로, 보고된 값들은 3 회 이상 중복 분석의 평균이다.
숙시닐-CoA 트랜스퍼라제(Cat1) 활성을 앞서 개시된 과정(문헌[Sohling and Gottschalk, J. Bacteriol. 178:871-880(1996)])에 따라, 숙시닐-CoA 및 아세테이트로부터 아세틸-CoA의 형성을 모니터함으로써 측정하였다. 숙시닐-CoA 신시타제(SucCD) 활성을 ATP의 존재 하에서 숙시네이트 및 CoA로부터 숙시닐-CoA의 형성을 추적함으로써 측정하였다. 상기 실험은 문헌[Cha and Parks, J. Biol. Chem. 239:1961-1967(1964)]에 개시된 과정에 따라 수행하였다. CoA-의존성 숙시네이트 세미알데하이드 데하이드로게나제(SucD) 활성을 숙시네이트 세미알데하이드 및 CoA의 존재 하에 340 ㎚에서 NAD의 NADH로의 전환을 추적하여 측정하였다(문헌[Sohling and Gottschalk, Eur. J. Biochem. 212:121-127(1993)]). 4-HB 데하이드로게나제(4-HBd) 효소 활성을 숙시네이트 세미알데하이드의 존재 하에 340 ㎚에서 NADH에서 NAD로의 산화를 모니터하여 측정하였다. 상기 실험은 공개된 과정(문헌[Gerhardt et al., Arch. Microbiol. 174:189-199(2000)])에 따라 수행되었다. 4-HB CoA 트랜스퍼라제(Cat2) 활성을 문헌[Scherf and Buckel, Appl. Environ. Microbiol. 57:2699-2702(1991)]으로부터의 변형된 과정을 사용하여 측정하였다. 아세틸-CoA 및 4-HB 또는 부티레이트로부터 4-HB-CoA 또는 부티릴-CoA의 형성을 HPLC를 사용하여 측정하였다.
알콜(ADH) 및 알데하이드(ALD) 데하이드로게나제를 여러 문헌 출처들로부터 적합화된 과정을 사용하여 환원 방향으로 분석하였다(문헌[Durre et al., FEMS Microbiol. Rev. 17:251-262(1995); Palosaari and Rogers, J. Bacteriol. 170:2971-2976(1988); and Welch et al., Arch. Biochem. Biophys. 273:309-318(1989)]). NADH의 산화에 이어서 실온에서 총 240 초 동안 매 4초마다 340 nM에서 흡광도를 판독한다. 상기 환원 분석을 100 mM MOPS(KOH에 의해 pH 7.5로 조절됨), 0.4 mM NADH, 및 1 내지 50 ㎕의 세포 추출물 중에서 수행하였다. 상기 반응은 하기 시약들의 첨가에 의해 개시된다: ADH의 경우 100 ㎕의 100 mM 아세트알데하이드 또는 부티르알데하이드, 또는 ALD의 경우 100 ㎕의 1 mM 아세틸-CoA 또는 부티릴-CoA. 분광광도계를 신속히 비우고 이어서 동역학적 판독을 개시한다. 상기 생성되는 분당 340 nM에서의 흡광도 감소 기울기를 340 nM(6000)에서 NAD(P)H의 몰 흡광 계수 및 추출물의 단백질 농도와 함께 사용하여 비 활성을 측정할 수 있다.
PTB의 효소 활성을 문헌[Cary et al. J. Bacteriol. 170:4613-4618(1988)]에 개시된 바와 같이 부티릴-CoA의 부티릴-포스페이트로의 방향으로 측정한다. 이는 상기 전환에 대해 무기 포스페이트를 제공하며, 시약 5,5'-다이티오비스-(2-나이트로벤조산), 또는 DTNB에 의한 유리 CoA의 증가가 이어진다. DTNB는 유리 CoA와 같은 티올 그룹과 빠르게 반응하여 황색 2-나이트로-5-머캅토벤조산(TNB)을 유리시키며, 상기 산은 14,140 M㎝-1의 몰 흡광 계수로 412 ㎚에서 흡수한다. 상기 분석 완충제는 150 mM 인산 칼륨(pH 7.4), 0.1 mM DTNB, 및 0.2 mM 부티릴-CoA를 함유하며, 상기 반응을 2 내지 50 ㎕의 세포 추출물의 첨가에 의해 개시시켰다. BK의 효소 활성을 ATP의 비용으로 부티레이트에서 부티릴-포스페이트 형성 방향으로 측정한다. 상기 과정은 앞서 문헌[Rose et al., J. Biol. Chem. 211:737-756(1954)]에 개시된 아세테이트 키나제에 대한 분석과 유사하다. 그러나, 우리는 시그마(Sigma)에 의해 보다 유용하고 민감한 것으로 제공된 또 다른 아세테이트 키나제 효소 분석 프로토콜을 발견하였다. 상기 분석은 아세테이트 키나제에 의한 ATP의 ADP로의 전환을 피루베이트 키나제에 의한 ADP 및 포스포에놀 피루베이트(PEP)의 ATP 및 피루베이트로의 연계된 전환에 결부시킨 다음, 락테이트 데하이드로게나제에 의한 피루베이트 및 NADH의 락테이트 및 NAD+로의 전환에 결부시킨다. 아세테이트 대신 부티레이트를 사용하는 것은 상기 분석이 BK 효소 활성을 추적할 수 있게 하는 유일한 주요 변형이다. 상기 분석 혼합물은 80 mM 트라이에탄올아민 완충제(pH 7.6), 200 mM 나트륨 부티레이트, 10 mM MgCl2, 0.1 mM NADH, 6.6 mM ATP, 1.8 mM 포스포에놀피루베이트를 함유하였다. 피루베이트 키나제, 락테이트 데하이드로게나제, 및 마이오키나제를 제조자의 지시에 따라 첨가하였다. 2 내지 50 ㎕의 세포 추출물을 첨가함으로써 상기 반응을 개시시키고, NADH 산화를 가리키는 340 ㎚에서의 흡광도 감소를 근거로 상기 반응을 모니터하였다.
HPLC 에 의한 CoA 유도체의 분석
조효소 A(CoA) 이동을 수반하는 효소 반응을 모니터하기 위한 HPLC 기재 분석이 개발되었다. 상기 개발된 방법은 시험관 내 반응 혼합물 중에 존재하는 CoA, 아세틸 CoA(AcCoA), 부티릴 CoA(BuCoA) 및 4-하이드록시부티레이트 CoA(4-HBCoA)의 정량적인 측정에 의해 효소 활성 특성화를 가능하게 하였다. 낮은 μM까지 내려간 민감성뿐만 아니라 모든 관심 CoA 유도체들의 탁월한 분석이 성취되었다.
화학물질 및 샘플 제조를 하기와 같이 수행하였다. 간단히, CoA, AcCoA, BuCoA 및 모든 다른 화학물질들을 시그마 알드리치(Sigma-Aldrich)로부터 수득하였다. 용매, 메탄올 및 아세토나이트릴은 HPLC 등급의 것이었다. 표준 눈금화 곡선은 0.01 내지 1 ㎎/㎖ 농도 범위에서 탁월한 선형성을 나타내었다. 효소 반응 혼합물은 100 mM 트리스 HCl 완충제(pH 7)를 함유하였으며, 상이한 시점들에서 분액들을 취하고, 폼산(0.04% 최종 농도)으로 급냉시키고 HPLC에 의해 직접 분석하였다.
HPLC 분석을 2원 펌프, 탈기기, 온도조절된 자동샘플러 및 컬럼 구획이 구비된 에이질런트(Agilent) 1100 HPLC 시스템을 사용하여 수행하고, 다이오드 배열 검출기(DAD)를 상기 분석에 사용하였다. 역상 컬럼, 크로마실(Kromasil) 100 5 um C18, 4.6 x 150 ㎜(Peeke Scientific)을 사용하였다. 25 mM 인산 칼륨(pH 7) 및 메탄올 또는 아세토나이트릴을 수성 및 유기 용매로서 1 ㎖/분 유량으로 사용하였다. 2 가지 방법, 즉 잘 분해된 CoA, AcCoA 및 BuCoA의 분석을 위해 더 빠른 구배를 갖는 짧은 방법, 및 가깝게 용출되는 AcCoA 및 4-HBCoA를 구분하기 위한 보다 긴 방법이 개발되었다. 짧은 방법은 아세토나이트릴 구배(0분-5%, 6분-30%, 6.5분-5%, 10분-5%)를 사용하였으며 CoA, AcCoA 및 BuCoA에 대해 각각 2.7, 4.1 및 5.5 분의 체류 시간을 생성시켰다. 상기 긴 방법에서, 메탄올을 하기의 선형 구배로 사용하였다: 0분-5%, 20분-35%, 20.5분-5%, 25분-5%. CoA, AcCoA, 4-HBCoA 및 BuCoA에 대한 체류 시간은 각각 5.8, 8.4, 9.2 및 16.0 분이었다. 주입 부피는 5 ㎕이고, 컬럼 부피는 30 ℃이며, UV 흡광도를 260 ㎚에서 모니터하였다.
상기 결과는, 활성이 명백히 유전자 출처, 벡터 중의 유전자 위치, 및 발현되는 다른 유전자들의 상황에 따라 변하기는 하지만, 4 개의 경로 단계들 각각의 활성을 입증하였다(표 7). 예를 들어, 유전자 0035는 008에 의해 암호화된 것보다 더 활성인 숙시닉 세미알데하이드 데하이드로게나제를 암호화하고, 0036 및 0010n은 009보다 더 활성인 4-HB 데하이드로게나제 유전자이다. 또한 동일한 오페론상에서 선행하는 또 다른 유전자가 존재하는 경우 4-HB 데하이드로게나제 활성이 더 양호한 것으로 보인다.
Figure pct00004
유전자는 colE1 기원 및 암피실린 내성을 갖는 고 사본 플라스미드인, pZE13 상의 Plac로부터 발현되었다. 유전자 식별 번호는 표 6에 제공된 바와 같다. 유전자는 pACYC 기원 및 클로람페니콜 내성을 갖는 중간 사본 플라스미드인, pZA33 상의 Plac로부터 발현되었다.
(c) 추출물 ㎖당 단백질 ㎎으로서 제공된 세포 단백질.
이어서 상기 4-HB 경로 중의 유전자들을 함유하는 재조합 균주들을 중심 대사 중간체들로부터 생체 내에서 4-HB를 생산하는 능력에 대해 평가하였다. 세포를 LB 배지에서 대략 0.4의 OD600으로 혐기적으로 증식시키고, 이어서 1 mM IPTG로 유도하였다. 1 시간 후에, 나트륨 숙시네이트를 10 mM로 가하고, 샘플들을 추가로 24 및 48 시간 후에 분석을 위해 취하였다. 상기 배양 브로쓰 중의 4-HB를 하기 개시하는 바와 같이 GC-MS에 의해 분석하였다. 결과는 상기 재조합 균주가 대조용 균주에서 필수적으로 0인 것에 비해, 24 시간 후에 2 mM 이상의 4-HB를 생산할 수 있음을 가리킨다(표 8).
Figure pct00005
(a) 표준화된 4-HB 농도, μM/OD600 단위.
숙시네이트로부터 숙시닐-CoA를 생산하기 위해 CoA 트랜스퍼라제(cat1)를 사용하는 것에 대한 대안은 숙시닐-CoA 신시타제를 암호화하는 고유 에스케리키아 콜라이 sucCD 유전자를 사용하는 것이다. 상기 유전자 클러스터를 4-HB로의 나머지 단계들에 대한 후보 유전자들과 함께 pZE13 상에 클로닝하여 pZE13-0038-0035-0036을 생성시켰다.
글루코스로부터 4- HB 의 생산
상기 실험들이 중심 대사 중간체(숙시네이트)로부터 4-HB로의 작용성 경로들을 입증하지만, 산업적인 공정은 저렴한 탄수화물 공급원료, 예를 들어 글루코스 또는 슈크로스로부터 화학물질의 생산을 필요로 한다. 따라서, 다음 실험 세트는 글루코스 상에서 증식하는 동안 상기 세포에 의해 생산된 내생적인 숙시네이트가 상기 4-HB 경로에 연료를 공급할 수 있는지의 여부를 측정하는 것을 목적으로 하였다. 세포를, 20 g/L 글루코스, 완충 용량을 개선시키기 위한 100 mM 3-(N-모폴리노)프로판설폰산(MOPS), 10 ㎍/㎖ 티아민, 및 적합한 항생제가 보충된 M9 최소 배지(6.78 g/L Na2HPO4, 3.0 g/L KH2PO4, 0.5 g/L NaCl, 1.0 g/L NH4Cl, 1 mM MgSO4, 0.1 mM CaCl2)에서 혐기적으로 증식시켰다. OD600이 대략 0.2에 도달하면 0.25 mM IPTG를 가하고, 유도에 이어서 매 24 시간마다 4-HB 분석을 위해 샘플을 취하였다. 모든 경우에 4-HB는 24 시간 후에 평탄역에 도달한 반면(최상의 균주에서 최대 약 1 mM로)(도 3a), 숙시네이트 농도는 계속해서 상승하였다(도 3b). 이는 상기 경로에 대한 숙시네이트의 공급은 제한이 없는 듯하며, 상기 효소들 자체의 활성 또는 NADH 유효성에 병목이 있을 수도 있음을 가리킨다. 0035 및 0036은 각각 CoA-의존성 숙시닉 세미알데하이드 데하이드로게나제 및 4-HB 데하이드로게나제에 대해 분명히 최상의 유전자 후보들이다. 공지된(gabD) 또는 추정적인(adlA) 고유 숙시닉 세미알데하이드 데하이드로게나제를 암호화하는 상기 유전자들 중 하나 또는 둘 모두의 제거는 성능에 거의 영향을 미치지 않았다. 마지막으로, 상기 세포는 대조군에서보다 상기 4-HB 생산 균주에서 훨씬 더 낮은 OD까지 증식하였음을 주목해야 한다(도 3c).
글루코스로부터 4-HB의 생성을 위한 또 다른 경로는 α-케토글루타레이트를 통해서이다. 우리는 α-케토글루타레이트로부터 직접 숙시닉 세미알데하이드를 생성시키기 위해서 마이코박테리움 튜베르큘로시스로부터 α-케토글루타레이트 데카복실라제(Tian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:10670-10675(2005))의 사용을 조사하였다(도 1, 단계 8). 상기 유전자(0032)가 생체 내에서 작용성임을 입증하기 위해서, 우리는 상기 유전자를 pZA33 상의 4-HB 데하이드로게나제(유전자 0036)와 동일한 숙주에서 pZE13 상에서 발현시켰다. 상기 균주는 1 mM IPTG로 유도 후 24 시간 이내에 1.0 mM 이상의 4-HB를 생산할 수 있었다(도 4). 상기 균주는 CoA-의존성 숙시닉 세미알데하이드 데하이드로게나제를 발현하지 못하기 때문에, 숙시닐-CoA를 통한 숙시닉 세미알데하이드 생산의 가능성이 제거된다. 숙시닉 세미알데하이드의 생산을 맡고 있는 고유 유전자가 상기 경로에서 작용하는 것도 또한 가능하지만(도 1, 단계 4 및 5); 상기 pZE13-0032 플라스미드가 상기 숙주 밖으로 떠날 때 생산되는 4-HB의 양은 무시할만하다.
4- HB 로부터 BDO 의 생산
4-HB로부터 BDO의 생산은 데하이드로게나제에 의해 촉매화되는 2 개의 환원 단계를 필요로 하였다. 알콜 및 알데하이드 데하이드로게나제(각각 ADH 및 ALD)는 함께 분자 상의 카복실산 그룹을 알콜 그룹으로 환원시키거나, 또는 역으로 카복실산으로의 알콜의 산화를 수행할 수 있는 NAD+/H 및/또는 NADP+/H-의존성 효소이다. 상기 생물변환은 야생형 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Jewell et al., Current Microbiology, 13:215-19(1986))에서 입증되었으나, 책임이 있는 효소도 유전자도 동정되지 않았다. 또한, 4-HB-CoA로의 활성화가 먼저 필요한지(도 1, 단계 9) 또는 상기 알데하이드 데하이드로게나제(단계 12)가 4-HB 상에서 직접 작용할 수 있는지는 공지되어 있지 않다. 우리는 4-HB 및 경로 중간체에 대한 비-하이드록실화된 유사체와 함께 공지된 활성을 근거로 또는 이들 특성화된 유전자에 대한 유사성에 의해 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 및 관련된 유기체로부터 후보 효소들의 목록을 개발하였다(표 6). 상기 후보들 중 일부는 다작용성 데하이드로게나제이므로, 상기 산(또는 CoA-유도체)의 알데하이드로의, 및 상기 알데하이드의 알콜로의 NAD(P)H-의존성 환원을 모두 잠재적으로 촉매화할 수 있다. 에스케리키아 콜라이에서 상기 유전자들에 대한 연구를 시작하기 전에, 우리는 먼저 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ATCC824를 사용하여 상기 참고로 한 결과를 확인하였다. 세포를 30 ℃에서 10% CO2, 10% H2 및 80% N2의 혐기성 분위기 하에서 10 mM 4-HB가 보충된 스카에들러(Schaedler) 브로쓰(Accumedia, Lansing, MI, USA)에서 증식시켰다. 주기적인 배양 샘플을 취하고, 원심분리하고 상기 브로쓰를 하기에 개시하는 바와 같이 GC-MS에 의해 BDO에 대해 분석하였다. 0.1 mM, 0.9 mM 및 1.5 mM의 BDO 농도가 각각 1일, 2일 및 7일 배양 후 검출되었다. 4-HB 첨가 없이 증식된 배양물에서는 BDO가 검출되지 않았다. 상기 생성된 BDO가 글루코스로부터 유도되었음을 입증하기 위해서, 우리는 최상의 BDO 생산 균주인 MG1655 lacIQ pZE13-0004-0035-0002 pZA33-0034-0036을 4 g/L의 균일하게 표지된 13C-글루코스가 보충된 M9 최소 배지에서 증식시켰다. 세포를 1 mM IPTG로 0.67의 OD에서 유도하고 24 시간 후에 샘플을 취하였다. 상기 배양 상등액의 분석을 질량 분광측정법에 의해 수행하였다.
이어서 상기 4-HB의 BDO로의 전환에 대한 유전자 후보들을 에스케리키아 콜라이 숙주 MG1655 lacIQ 에서 발현 시의 활성에 대해 시험하였다. pZA33 상에서 발현된 각각의 유전자 후보를 함유하는 재조합 균주를 37 ℃에서 4 시간 동안 0.25 mM IPTG의 존재 하에서 증식시켜 상기 효소의 발현을 충분히 유도하였다. 유도 후 4 시간째에, 세포를 수확하고 상술한 바와 같이 ADH 및 ALD 활성에 대해 분석하였다. 4-HB-CoA 및 4-하이드록시부티르알데하이드는 상업적으로 입수할 수 없기 때문에, 분석을 비-하이드록실화된 기질을 사용하여 수행하였다(표 9). 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 adhE2(0002) 및 에스케리키아 콜라이 adhE(0011)에 대한 4-탄소 및 2-탄소 기질들 간의 활성 비는 문헌[Atsumi et al., Biochim. Biophys. Acta. 1207:1-11(1994)]에 앞서 보고된 바와 유사하였다.
Figure pct00006
BDO 생산 실험의 경우에, 포르피로모나스 진지발리스 W83(유전자 0034)으로부터의 cat2를 4-HB에서 4-HB-CoA로의 전환을 위해 pZA33 상에 포함시킨 반면, 상기 후보 데하이드로게나제 유전자는 pZE13 상에서 발현시켰다. 숙주 균주는 MG1655 lacIQ 이었다. 상기 알콜 및 알데하이드 데하이드로게나제 후보들과 함께, 우리는 또한 상기 기질들의 유사성으로 인해, 상기 단계에서 작용하는 CoA-의존성 숙시닉 세미알데하이드 데하이드로게나제(sucD)의 능력을 시험하였다. 세포를 10 mM 4-HB가 보충된 LB 배지에서 약 0.5의 OD로 증식시키고, 1 mM IPTG로 유도하고, 24 시간 후에 배양 브로쓰 샘플을 취하고 하기에 개시하는 바와 같이 BDO에 대해 분석하였다. 최상의 BDO 생산은 클로스트리듐 아세토부틸리쿰으로부터의 adhE2, 클로스트리듐 클루이베리로부터의 sucD, 또는 포르피로모나스 진지발리스로부터의 sucD를 사용하여 발생하였다(도 5). 흥미롭게도, 생산되는 BDO의 절대 량은 호기성 조건 하에서 더 높았으나; 이는 주로 혐기성 배양물 중에서 성취된 보다 낮은 세포 밀도에 기인한다. 세포 OD에 표준화 시, 단위 바이오매스당 BDO 생산은 혐기성 조건 하에서 더 높다(표 10).
Figure pct00007
상기 논의된 바와 같이, 부산물로서 아세테이트를 생성시키지 않는 4-HB에서 4-HB-CoA로의 전환에 대한 경로를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 상기 목적을 위해서, 우리는 도 1에서 단계 10 및 11을 통해 상기 전환을 수행하기 위해 클로스트리듐 아세토부틸리쿰으로부터의 포스포트랜스부티릴라제(ptb) 및 부티레이트 키나제(bk)의 사용을 시험하였다. 클로스트리듐 아세토부틸리쿰으로부터의 고유 ptb/bk 오페론(유전자 0020 및 0021)을 pZA33에 클로닝하고 발현시켰다. 생성 구조물을 함유하는 세포로부터 추출물을 취하고 본 발명에 개시된 바와 같이 상기 두 효소 활성에 대해 분석하였다. BK에 대한 비 활성은 대략 65 U/㎎인 반면, PTB의 비 활성은 대략 5 U/㎎이었다. 1 단위(U)의 활성은 실온에서 1 분간 1 μM 기질의 전환으로서 정의된다. 마지막으로, 상기 구조물을 4-HB에서 BDO로의 전환에 관여하는 것에 대해 시험하였다. 숙주 균주를 개시된 pZA33-0020-0021 구조물 및 pZE13-0002로 형질전환시키고, 도 5에서 상기 사용된 호기성 과정을 사용하여 BDO 생산에서의 cat2의 사용과 비교하였다. 상기 BK/PTB 균주는 cat2를 사용한 경우의 2 mM에 비해, 1 mM BDO를 생산하였다(표 11). 흥미롭게도, 상기 결과는 상기 숙주 균주가 고유 adhE 유전자의 결실을 함유하였는지의 여부에 따라 변하였다.
pZA33 상의 포르피로모나스 진지발리스로부터의 cat2(0034) 또는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰으로부터의 PTB/BK 유전자와 함께 pZE13 중의 클로스트리듐 아세토부틸리쿰으로부터의 adhE2를 발현하는 세포의 배양물로부터의 절대 및 표준화된 BDO 농도. 숙주 균주는 MG1655 lacIQ 또는 MG1655 ΔadhE lacIQ 이었다.
유전자 숙주 균주 BDO(μM) OD(600㎚) BDO/OD
0034 MG1655 lacIQ 0.827 19.9 0.042
0020+0021 MG1655 lacIQ 0.007 9.8 0.0007
0034 MG1655 ΔadhE lacIQ 2.084 12.5 0.166
0020+0021 MG1655 ΔadhE lacIQ 0.975 18.8 0.052
글루코스로부터 BDO 의 생산
경로 보강증거의 최종 단계는 에스케리키아 콜라이에서 상기 경로의 4-HB 및 BDO 분절 모두를 발현시키고 글루코스 최소 배지에서 BDO의 생산을 입증하는 것이다. 필요한 모든 유전자가 2 개의 플라스미드에 적합하도록 새로운 플라스미드를 제작하였다. 일반적으로, cat1, adhE 및 sucD 유전자들이 pZE13으로부터 발현되고, cat2 및 4-HBd는 pZA33으로부터 발현되었다. 유전자 출처 및 유전자 순서의 다양한 조합들을 MG1655 lacIQ 배경에서 시험하였다. 세포를, 20 g/L 글루코스, 완충 용량을 개선시키기 위한 100 mM 3-(N-모폴리노)프로판설폰산(MOPS), 10 ㎍/㎖ 티아민, 및 적합한 항생제가 보충된 M9 최소 배지(6.78 g/L Na2HPO4, 3.0 g/L KH2PO4, 0.5 g/L NaCl, 1.0 g/L NH4Cl, 1 mM MgSO4, 0.1 mM CaCl2)에서 혐기적으로 증식시켰다. 접종에 이어서 대략 15 시간째에 0.25 mM IPTG를 가하고, 배양 상등액 샘플을 유도 후 24 및 48 시간째에 BDO, 4-HB 및 숙시네이트 분석을 위해 취하였다. 상기 BDO의 생산은 유전자 순서에 대한 의존성을 보이는 것으로 나타났다(표 12). 0.5 mM에 걸쳐, 최고의 BDO 생산이, 먼저 발현된 cat2에 의해서, 이어서 pZA33 상의 4-HBd 및 cat1에 이어서 pZE13 상의 포르피로모나스 진지발리스 sucD에 의해서 획득되었다. pZE13 상의 최종 위치에서 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 adhE2의 첨가는 약간의 개선을 생성시켰다. 4-HB 및 숙시네이트가 또한 보다 높은 농도에서 생산되었다.
Figure pct00008
GCMS 에 의한 BDO , 4- HB 및 숙시네이트의 분석
발효 및 세포 배양 샘플 중의 BDO, 4-HB 및 숙시네이트를 실릴화에 의해 유도체화하고 문헌 보고서로부터 적합화된 방법을 사용하여 GCMS에 의해 정량적으로 분석하였다(Simonov et al., J. Aanl Chem. 59:965-971(2004)). 상기 개발된 방법은 1 μM까지 내려간 양호한 민감성, 25 mM 이상까지의 선형성뿐만 아니라 탁월한 선택성 및 재현성을 나타내었다.
샘플 제조를 하기와 같이 수행하였다: 100 ㎕의 여과된(0.2 ㎛ 또는 0.45 ㎛ 주사기 필터) 샘플, 예를 들어 발효 브로쓰, 세포 배양물 또는 표준 용액을 주변 온도에서 대략 1 시간 동안 스피드 백(Speed Vac) 농축기(Savant SVC-100H)에서 건조시킨 다음, 20 ㎕의 다이메틸폼아미드 중의 10 mM 사이클로헥산올 용액을 내부 표준으로서 첨가하였다. 상기 혼합물을 와동시키고 수욕(Branson 3510)에서 15 분간 초음파 처리하여 균질성을 보장하였다. 100 ㎕의, 1% 트라이메틸클로로실란을 갖는 실릴화 유도체화 시약, N,O-비스(트라이메틸실릴)트라이플루오로-아세트이미드(BSTFA)를 가하고, 상기 혼합물을 70 ℃에서 30 분간 배양하였다. 상기 유도체화된 샘플을 5 분간 원심분리하고, 등명한 용액을 GCMS에 직접 주입하였다. 모든 화학물질 및 시약은 시그마 알드리치사의 것이나, 단 BDO는 제이티 베이커(J.T. Baker)로부터 구입하였다.
GCMS를 에이질런트 기체 크로마토그래프 6890N 상에서 수행하였으며, 이는 전자 충격 이온화(EI) 모드로 작동하는 질량-선택성 검출기(MSD) 5973N에 접촉 연결되었다. DB-5MS 모세관 컬럼(J&W Scientific, Agilent Technologies), 30 m x 0.25 ㎜ 내부 직경 x 0.25 ㎛ 필름 두께를 사용하였다. 상기 GC는, 1 ㎕의 샘플을 20:1 분할비로 도입시키는 분할 주입 모드로 작동하였다. 상기 주입구 온도는 250 ℃였다. 헬륨을 캐리어 가스로서 사용하였으며, 유량은 1.0 ㎖/분으로 유지시켰다. 온도 구배 프로그램을 관심 분석물의 양호한 분석 및 최소 기질 간섭이 보장되도록 최적화하였다. 오븐을 처음에는 80 ℃에서 1 분간 유지시키고, 이어서 2 ℃/분으로 120 ℃까지 상승시킨 다음, 100 ℃/분으로 320 ℃까지 빠르게 상승시키고 마지막으로 320 ℃에서 6 분간 유지시켰다. 상기 MS 접촉 면 이동 라인을 280 ℃에서 유지시켰다. 상기 데이터를 '저질량' MS 변조 설정 및 30 내지 400 m/z 질량-범위 스캔을 사용하여 획득하였다. 전체 분석 시간은 용매 지연 3 분을 포함하여 29 분이었다. 상기 체류 시간은 BSTFA-유도체화된 사이클로헥산올, BDO, 4-HB 및 숙시네이트에 대해 각각 5.2, 10.5, 14.0 및 18.2 분에 상응하였다. 정량적인 분석을 위해서, 하기의 특정 질량 단편들을 선택하였다(추출된 이온 크로마토그램): 내부 표준 사이클로헥산올의 경우 m/z 157, BDO의 경우 116, 및 4-HB 및 숙시네이트 모두의 경우 147. 표준 눈금화 곡선을 가능한 한 가깝게 샘플 기질과 합치되도록 상응하는 세포 배양물 또는 발효 배지 중의 분석물 용액들을 사용하여 작성하였다. GCMS 데이터를 환경 데이터 분석 켐스테이션(ChemStation) 소프트웨어(Agilent Technologies)를 사용하여 처리하였다.
결과는 상기 생성된 4-HB 및 BDO의 대부분이 13C로 표지됨을 가리켰다(도 6, 오른편). 표지되지 않은 글루코스에서 증식된 병행 배양물로부터의 질량 스펙트럼을 비교를 위해 도시한다(도 6, 왼편). 나타낸 피크들은 상기 대사 산물로부터 상이한 수의 탄소 원자들을 함유하는 유도체화된 분자의 단편들에 대한 것임에 유의한다. 상기 유도체화 시약은 또한 자연 발생 표지 분포에 약간의 탄소 및 규소 원자를 제공하며, 따라서 결과는 엄격히는 정량적이지 않다.
또 다른 경로를 사용한 4- HB 로부터 BDO 의 생산
다양한 대안 경로들을 또한 BDO 생산에 대해 시험하였다. 이는 숙시네이트를 숙시닐-CoA로 전환시키는 고유 에스케리키아 콜라이 SucCD 효소의 사용(표 13, 2 내지 3열), α-케토글루타레이트 경로에서 α-케토글루타레이트 데카복실라제의 사용(표 13, 4열), 및 4HB의 CoA-유도체를 생성시키기 위한 또 다른 수단으로서 PTB/BK의 사용(표 13, 1열)을 포함한다. 표 13에 나타낸 유전자들을 발현하는 플라스미드를 함유하는 균주들을 제작하였으며, 이들은 상기 변체들을 포함한다. 결과는 모든 경우에 4-HB 및 BDO의 생산이 발생하였음을 나타낸다(표 13).
20 g/L 글루코스가 보충된 최소 배지에서 혐기적으로 증식되고 0.1 mM IPTG로 유도 후 24 시간째에 수확된, 상이한 BDO 경로 변체들에 대한 재조합 에스케리키아 콜라이 균주들에서 BDO, 4-HB 및 숙시네이트의 생산. 농도는 mM로 제공된다.
pZE13 상의 유전자 pZA33 상의 유전자 숙시네이트 4-HB BDO
0002+0004+0035 0020n-0021n-0036 0.336 2.91 0.230
0038+0035 0034-0036 0.814 2.81 0.126
0038+0035 0036-0034 0.741 2.57 0.114
0035+0032 0034-0036 5.01 0.538 0.154
실시예 III
4- 하이드록시부탄산 , γ- 부티로락톤 및 1,4- 부탄다이올의 생합성
본 실시예는 발효 및 다른 생물공정들을 사용하는 4-하이드록시부탄산, γ-부티로락톤 및 1,4-부탄다이올의 생합성적 생산을 개시한다.
정제된 GBL, 1,4-부탄다이올(BDO) 및 테트라하이드로퓨란(THF)의 생산을 위한 완전한 공정에의 상기 4-HB 발효 단계의 통합 방법을 하기에 개시한다. 4-HB 및 GBL은 평형으로 존재하기 때문에, 발효 브로쓰는 상기 두 화합물을 모두 함유할 것이다. 낮은 pH에서 상기 평형은 GBL에 유리하게 이동한다. 따라서, 상기 발효를 pH 7.5 이하, 일반적으로는 pH 5.5 이하에서 실행시킬 수 있다. 바이오매스의 제거 후, 상기 생성물 스트림은 분리 단계로 들어가고 여기에서 GBL이 제거되며 4-HB가 풍부한 나머지 스트림은 재순환된다. 마지막으로, GBL을 증류시켜 임의의 불순물을 제거한다. 상기 공정은 3 개의 방법들 중 하나로 실행된다: 1) 유가 발효 및 회분 분리; 2) 유가 발효 및 연속 분리; 3) 연속 발효 및 연속 분리. 상기 방식들 중 처음 둘은 도 7에 도식적으로 도시된다. 하기에 개시되는 통합된 발효 과정들을 또한 BDO 및 후속의 BDO 계 생성물의 생합성을 위해 본 발명의 BDO 생산 세포에 사용한다.
4- HB / GBL 을 생산하기 위한 발효 프로토콜(회분):
생산 유기체를 5 g/L 인산 칼륨, 2.5 g/L 염화 암모늄, 0.5 g/L 황산 마그네슘, 및 30 g/L 옥수수 침지액을 함유하는 5 L 브로쓰 및 20 g/L의 초기 글루코스 농도를 사용하여, N2/CO2 혼합물이 살포된 10 L 생물반응기에서 증식시킨다. 상기 세포가 증식하여 상기 글루코스를 사용하므로, 추가의 70% 글루코스를, 글루코스 소비와 대략적으로 균형을 이루는 속도로 상기 생물반응기에 공급한다. 상기 생물반응기의 온도를 30 ℃에서 유지시킨다. 4-HB가 20 내지 200 g/L의 농도에 도달할 때까지 대략 24 시간 동안 증식을 계속하며, 이때 상기 세포 밀도는 5 내지 10 g/L이다. pH는 조절되지 않으며, 전형적으로는 상기 실행의 끝에 pH 3 내지 6으로 감소할 것이다. 상기 배양 기간의 종료 시, 상기 발효기 내용물을 세포 분리 유닛(예를 들어 원심분리기)에 통과시켜 세포 및 세포 찌꺼기를 제거하고, 상기 발효 브로쓰를 생성물 분리 유닛으로 옮긴다. 4-HB 및/또는 GBL의 단리는 묽은 수용액으로부터 유기 생성물을 분리시키는 것으로 당해 분야에 공지된 표준 분리 과정들, 예를 들어 수 불혼화성 유기 용매(예를 들어 톨루엔)를 사용하는 액체-액체 추출에 의해 발생하여 4-HB/GBL의 유기 용액을 제공한다. 이어서 상기 생성 용액에 표준 증류 방법을 가하여 유기 용매를 제거 및 재순환시키고, GBL(비등점 204 내지 205 ℃)을 제공하며, 이는 정제된 액체로서 단리된다.
4- HB / GBL 을 생산하기 위한 발효 프로토콜(완전 연속식):
생산 유기체를 먼저 상술한 장치 및 배지 조성을 사용하여 회분 방식으로 증식시키나, 단 초기 글루코스 농도는 30 내지 50 g/L이다. 글루코스가 고갈되면, 동일한 조성의 공급물 배지를 0.5 L/시간 내지 1 L/시간의 유량으로 연속적으로 공급하고 액체를 같은 유량으로 회수한다. 상기 생물반응기 중의 4-HB 농도는 30 내지 40 g/L로 일정하게 남아있으며, 세포 밀도는 3 내지 5 g/L로 일정하게 남아있는다. 온도는 30 ℃에서 유지시키고, pH는 필요에 따라 농축된 NaOH 및 HCl을 사용하여 4.5에서 유지시킨다. 상기 생물반응기를 1 개월 동안 연속적으로 작동시키며, 이때 샘플을, 4-HB 농도의 일관성을 보장하기 위해서 매일 취한다. 연속적인 방식에서, 발효기 내용물을 새로운 공급물 배지가 공급됨에 따라 끊임없이 제거한다. 이어서 세포, 배지 및 생성물 4-HB 및/또는 GBL을 함유하는 출구 스트림에, 세포 및 세포 찌꺼기를 제거하거나 상기 제거 없이, 연속적인 생성물 분리 과정을 가하며, 상기 분리는 묽은 수용액으로부터 유기 생성물을 분리시키는 것으로 당해 분야에 사용되는 표준 연속 분리 방법들, 예를 들어 수 불혼화성 유기 용매(예를 들어 톨루엔)를 사용하는 연속적인 액체-액체 추출에 의해 발생하여 4-HB/GBL의 유기 용액을 제공한다. 상기 생성 용액에 후속적으로 표준 연속 증류 방법을 가하여 유기 용매를 제거 및 재순환시키고, GBL(비등점 204 내지 205 ℃)을 제공하며, 이는 정제된 액체로서 단리된다.
GBL 환원 프로토콜:
일단 GBL이 상술한 바와 같이 단리 및 정제되면, 상기 GBL에 환원 프로토콜, 예를 들어 당해 분야에 널리 공지된(참고문헌에 인용된) 프로토콜을 가하여 1,4-부탄다이올 또는 테트라하이드로퓨란(THF) 또는 이들의 혼합물을 생성시킬 것이다. 수소 압 하에서 GBL과 병용되는 이종 또는 동종 수소화 촉매들은 생성물 1,4-부탄다이올 또는 테트라하이드로퓨란(THF) 또는 이들의 혼합물을 제공하는 것으로 널리 공지되어 있다. 상술한 바와 같이 상기 발효 브로쓰로부터 분리된 4-HB/GBL 생성물 혼합물에, GBL 단리 및 정제 전에, 상기 동일한 환원 프로토콜을 가하여 생성물 1,4-부탄다이올 또는 테트라하이드로퓨란 또는 이들의 혼합물을 제공할 수도 있음을 아는 것은 중요하다. 이어서 상기 생성되는 생성물 1,4-부탄다이올 및 테트라하이드로퓨란을 당해 분야에 널리 공지된 과정에 의해 단리 및 정제한다.
BDO 또는 THF 를 직접 생산하기 위한 발효 및 수소화 프로토콜(회분):
세포를 5 g/L 인산 칼륨, 2.5 g/L 염화 암모늄, 0.5 g/L 황산 마그네슘, 및 30 g/L 옥수수 침지액을 함유하는 5 L 브로쓰 및 20 g/L의 초기 글루코스 농도를 사용하여, N2/CO2 혼합물이 살포된 10 L 생물반응기에서 증식시킨다. 상기 세포가 증식하여 상기 글루코스를 사용하므로, 추가의 70% 글루코스를, 글루코스 소비와 대략적으로 균형을 이루는 속도로 상기 생물반응기에 공급한다. 상기 생물반응기의 온도를 30 ℃에서 유지시킨다. 4-HB가 20 내지 200 g/L의 농도에 도달할 때까지 대략 24 시간 동안 증식을 계속하며, 이때 상기 세포 밀도는 5 내지 10 g/L이다. pH는 조절되지 않으며, 전형적으로는 상기 실행의 끝에 pH 3 내지 6으로 감소할 것이다. 상기 배양 기간의 종료 시, 상기 발효기 내용물을 세포 분리 유닛(예를 들어 원심분리기)에 통과시켜 세포 및 세포 찌꺼기를 제거하고, 상기 발효 브로쓰를 환원 유닛(예를 들어 수소화 용기)으로 옮기며, 여기에서 상기 혼합물 4-HB/GBL이 1,4-부탄다이올 또는 THF 또는 이들의 혼합물로 직접 환원된다. 상기 환원 과정의 완료에 이어서, 상기 반응기 내용물을 생성물 분리 유닛으로 옮긴다. 1,4-부탄다이올 및/또는 THF의 단리는 묽은 수용액으로부터 유기 생성물을 분리시키는 것으로 당해 분야에 공지된 표준 분리 과정들, 예를 들어 수 불혼화성 유기 용매(예를 들어 톨루엔)를 사용하는 액체-액체 추출에 의해 발생하여 1,4-부탄다이올 및/또는 THF의 유기 용액을 제공한다. 이어서 상기 생성 용액에 표준 증류 방법을 가하여 유기 용매를 제거 및 재순환시키고, 1,4-부탄다이올 및/또는 THF를 제공하며, 이는 정제된 액체로서 단리된다.
BDO 또는 THF 를 직접 생산하기 위한 발효 및 수소화 프로토콜(완전 연속식):
상기 세포를 먼저 상술한 장치 및 배지 조성을 사용하여 회분 방식으로 증식시키나, 단 초기 글루코스 농도는 30 내지 50 g/L이다. 글루코스가 고갈되면, 동일한 조성의 공급물 배지를 0.5 L/시간 내지 1 L/시간의 유량으로 연속적으로 공급하고 액체를 같은 유량으로 회수한다. 상기 생물반응기 중의 4-HB 농도는 30 내지 40 g/L로 일정하게 남아있으며, 세포 밀도는 3 내지 5 g/L로 일정하게 남아있는다. 온도는 30 ℃에서 유지시키고, pH는 필요에 따라 농축된 NaOH 및 HCl을 사용하여 4.5에서 유지시킨다. 상기 생물반응기를 1 개월 동안 연속적으로 작동시키며, 이때 샘플을, 4-HB 농도의 일관성을 보장하기 위해서 매일 취한다. 연속적인 방식에서, 발효기 내용물을 새로운 공급물 배지가 공급됨에 따라 끊임없이 제거한다. 이어서 세포, 배지 및 생성물 4-HB 및/또는 GBL을 함유하는 출구 스트림을 세포 분리 유닛(예를 들어 원심분리기)에 통과시켜 세포 및 세포 찌꺼기를 제거하고, 상기 발효 브로쓰를 환원 유닛(예를 들어 수소화 용기)으로 옮기며, 여기에서 상기 혼합물 4-HB/GBL이 1,4-부탄다이올 또는 THF 또는 이들의 혼합물로 직접 환원된다. 상기 환원 과정의 완료에 이어서, 상기 반응기 내용물을 생성물 분리 유닛으로 옮긴다. 1,4-부탄다이올 및/또는 THF의 단리는 묽은 수용액으로부터 유기 생성물을 분리시키는 것으로 당해 분야에 공지된 표준 분리 과정들, 예를 들어 수 불혼화성 유기 용매(예를 들어 톨루엔)를 사용하는 액체-액체 추출에 의해 발생하여 1,4-부탄다이올 및/또는 THF의 유기 용액을 제공한다. 이어서 상기 생성 용액에 표준 증류 방법을 가하여 유기 용매를 제거 및 재순환시키고, 1,4-부탄다이올 및/또는 THF를 제공하며, 이는 정제된 액체로서 단리된다.
BDO 를 직접 생산하기 위한 발효 프로토콜(회분):
생산 유기체를 5 g/L 인산 칼륨, 2.5 g/L 염화 암모늄, 0.5 g/L 황산 마그네슘, 및 30 g/L 옥수수 침지액을 함유하는 5 L 브로쓰 및 20 g/L의 초기 글루코스 농도를 사용하여, N2/CO2 혼합물이 살포된 10 L 생물반응기에서 증식시킨다. 상기 세포가 증식하여 상기 글루코스를 사용하므로, 추가의 70% 글루코스를, 글루코스 소비와 대략적으로 균형을 이루는 속도로 상기 생물반응기에 공급한다. 상기 생물반응기의 온도를 30 ℃에서 유지시킨다. BDO가 20 내지 200 g/L의 농도에 도달할 때까지 대략 24 시간 동안 증식을 계속하며, 이때 상기 세포 밀도는 일반적으로 5 내지 10 g/L이다. 상기 배양 기간의 종료 시, 상기 발효기 내용물을 세포 분리 유닛(예를 들어 원심분리기)에 통과시켜 세포 및 세포 찌꺼기를 제거하고, 상기 발효 브로쓰를 생성물 분리 유닛으로 옮긴다. BDO의 단리는 묽은 수용액으로부터 유기 생성물을 분리시키는 것으로 당해 분야에 공지된 표준 분리 과정들, 예를 들어 수 불혼화성 유기 용매(예를 들어 톨루엔)를 사용하는 액체-액체 추출에 의해 발생하여 BDO의 유기 용액을 제공한다. 이어서 상기 생성 용액에 표준 증류 방법을 가하여 유기 용매를 제거 및 재순환시키고, BDO(비등점 228 내지 229 ℃)을 제공하며, 이는 정제된 액체로서 단리된다.
BDO 를 직접 생산하기 위한 발효 프로토콜(완전 연속식):
생산 유기체를 먼저 상술한 장치 및 배지 조성을 사용하여 회분 방식으로 증식시키나, 단 초기 글루코스 농도는 30 내지 50 g/L이다. 글루코스가 고갈되면, 동일한 조성의 공급물 배지를 0.5 L/시간 내지 1 L/시간의 유량으로 연속적으로 공급하고 액체를 같은 유량으로 회수한다. 상기 생물반응기 중의 BDO 농도는 30 내지 40 g/L로 일정하게 남아있으며, 세포 밀도는 3 내지 5 g/L로 일정하게 남아있는다. 온도는 30 ℃에서 유지시키고, pH는 필요에 따라 농축된 NaOH 및 HCl을 사용하여 4.5에서 유지시킨다. 상기 생물반응기를 1 개월 동안 연속적으로 작동시키며, 이때 샘플을, BDO 농도의 일관성을 보장하기 위해서 매일 취한다. 연속적인 방식에서, 발효기 내용물을 새로운 공급물 배지가 공급됨에 따라 끊임없이 제거한다. 이어서 세포, 배지 및 생성물 BDO를 함유하는 출구 스트림에, 세포 및 세포 찌꺼기를 제거하거나 상기 제거 없이, 연속적인 생성물 분리 과정을 가하며, 상기 분리는 묽은 수용액으로부터 유기 생성물을 분리시키는 것으로 당해 분야에 사용되는 표준 연속 분리 방법들, 예를 들어 수 불혼화성 유기 용매(예를 들어 톨루엔)를 사용하는 연속적인 액체-액체 추출에 의해 발생하여 BDO의 유기 용액을 제공한다. 상기 생성 용액에 후속적으로 표준 연속 증류 방법을 가하여 유기 용매를 제거 및 재순환시키고, BDO(비등점 228 내지 229 ℃)을 제공하며, 이는 정제된 액체로서 단리된다.
실시예 IV
예시적인 BDO 경로들
본 실시예는 1,4-부탄다이올(BDO) 합성 경로에 대한 예시적인 효소 및 상응하는 유전자들을 개시한다.
예시적인 BDO 합성 경로들을 도 8 내지 13에 도시한다. 도 8 내지 13에 도시된 경로들은 1,4-부탄다이올로의 공통의 중심 대사 중간체들로부터의 경로들이다. 도 8 내지 13에 도시된 모든 형질전환들은 표 14에 나타낸 형질전환의 18 개의 일반적인 범주 내에 있다. 하기에는 각 범주 중의 다수의 생화학적으로 특성화된 유전자들이 개시되어 있다. 숙주 유기체에 클로닝되고 발현될 때 도 9 내지 13에서 적합한 형질전환을 촉매화하기 위해 적용될 수 있는 유전자들을 구체적으로 나열한다. 도 9 내지 13의 핵심 단계들 각각에 대한 최고 3 개의 예시적인 유전자들을 하기 표 15 내지 23에 제공한다(하기 참조). 예시적인 유전자들이, 도 8에 묘사되고 본 발명에 개시된 경로들에 대해 제공되었다.
통상적인 중심 대사 중간체를 1,4-부탄다이올로 전환시키는데 필요한 효소 유형들. 각 표지의 처음 3 개 숫자는 기질 특이성과 무관하게 일반적인 형질전환 유형을 나타내는 상기 처음 3 개 효소 위원회 번호 숫자에 상응한다.
표지 작용
1.1.1.a 옥시도리덕타제(케톤에서 하이드록실로 또는 알데하이드에서 알콜로)
1.1.1.c 옥시도리덕타제(2 단계, 아실-CoA에서 알콜로)
1.2.1.b 옥시도리덕타제(아실-CoA에서 알데하이드로)
1.2.1.c 옥시도리덕타제(2-옥소산에서 아실-CoA로, 탈카복실화)
1.2.1.d 옥시도리덕타제(인산화/탈인산화)
1.3.1.a CH-CH 공여체 상에서 작용하는 옥시도리덕타제
1.4.1.a 아미노 산 상에서 작용하는 옥시도리덕타제
2.3.1.a 아실트랜스퍼라제(포스페이트 그룹 운반)
2.6.1.a 아미노트랜스퍼라제
2.7.2.a 포스포트랜스퍼라제, 카복시 그룹 수용체
2.8.3.a 조효소-A 트랜스퍼라제
3.1.2.a 티올에스터 하이드롤라제(CoA 특이적)
4.1.1.a 카복시-라이아제
4.2.1.a 하이드로-라이아제
4.3.1.a 암모니아-라이아제
5.3.3.a 아이소머라제
5.4.3.a 아미노뮤타제
6.2.1.a 산-티올 리가제
1.1.1.a - 옥시도리덕타제( 알데하이드에서 알콜로 또는 케톤에서 하이드록실로 )
알데하이드에서 알콜로.
알데하이드의 알콜로의 전환을 촉매화하는 효소, 즉 알콜 데하이드로게나제 또는 동등하게 알데하이드 리덕타제를 암호화하는 예시적인 유전자는 C2-C14의 경우 중간-쇄 알콜 데하이드로게나제를 암호화하는 alrA(문헌[Tani et al., Appl. Environ. Microbiol., 66:5231-5235(2000)]), 사카로마이세스 세레비지아에로부터 ADH2(문헌[Atsumi et al., Nature, 451:86-89(2008)]), C(3)보다 긴 분자를 선호하는 에스케리키아 콜라이로부터의 yqhD(문헌[Sulzenbacher et al., J. of Molecular Biology, 342:489-502(2004)]), 및 부티르알데하이드를 부탄올로 전환시키는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰으로부터의 bdhI 및 bdhII(문헌[Walter et al., J. of Bacteriology, 174:7149-7158(1992)])를 포함한다. 이들 예시적인 유전자 산물들 각각에 대한 단백질 서열을, 입수할 수 있는 경우, 하기 젠뱅크(GenBank) 수납 번호를 사용하여 찾을 수 있다:
Figure pct00009
4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제 활성을 나타내는 효소들(EC 1.1.1.61)이 또한 상기 범주 내에 있다. 상기와 같은 효소들은 랄스토니아 유트로파(문헌[Bravo et al., J. Forensic Sci., 49:379-387(2004)]), 클로스트리듐 클루이베리(문헌[Wolff et al., Protein Expr. Purif., 6:206-212(1995)]) 및 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)(문헌[Breitkreuz et al., J. Biol. Chem., 278:41552-41556(2003)])에서 특성화되었다.
Figure pct00010
또 다른 예시적인 효소는 3-하이드록시아이소부티레이트의 메틸말로네이트 세미알데하이드로의 가역적인 산화를 촉매화하는 3-하이드록시아이소부티레이트 데하이드로게나제이다. 상기 효소는 발린, 류신 및 아이소류신 분해에 관여하며 세균, 진핵생물 및 포유동물에서 동정되었다. 써무스 써모필루스(Thermus thermophilus) HB8로부터 P84067에 의해 암호화된 효소가 구조적으로 특성화되었다(문헌[Lokanath et al., J. Mol. Biol., 352:905-917(2005)]). 상기 인간 3-하이드록시아이소부티레이트 데하이드로게나제의 가역성을 동위원소 표지된 기질을 사용하여 입증하였다(문헌[Manning et al., Biochem J., 231:481-484(1985)]). 상기 효소를 암호화하는 추가의 유전자들은 호모 사피엔스(Homo sapiens)(문헌[Hawes et al., Methods Enzymol, 324:218-228(2000)]) 및 오릭토라구스 쿠니큘러스(Oryctolagus cuniculus)(문헌[Chowdhury et al., Biosci. Biotechnol Biochem., 60:2043-2047(1996); Hawes et al., Methods Enzymol. 324:218-228(2000)]) 중의 3hidh, 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 중의 mmsb, 및 슈도모나스 푸티다 중의 dhat(문헌[Aberhart et al., J. Chem. Soc., [Perkin 1] 6:1404-1406(1979); Chowdhury et al., Biosci. Biotechnol Biochem., 67:438-441(2003); Chowdhury et al., Biosci. Biotechnol Biochem., 60:2043-2047(1996)])를 포함한다.
Figure pct00011
여러 3-하이드록시아이소부티레이트 데하이드로게나제 효소들이 또한 말로닉 세미알데하이드를 3-하이드록시프로피온산(3-HP)으로 전환시키는 것으로 나타났다. 상기 활성을 나타내는 3 개의 유전자 후보는 슈도모나스 아에루기노사 PAO1(62)으로부터의 mmsB, 슈도모나스 푸티다 KT2440(Liao et al., 미국 특허 공보 2005/0221466)으로부터의 mmsB 및 슈도모나스 푸티다 E23(문헌[Chowdhury et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 60:2043-2047(1996)])으로부터의 mmsB이다. 알칼리제네스 파에칼리스(Alcaligenes faecalis) M3A에서 3-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제 활성을 갖는 효소가 또한 동정되었다(Gokam et al., 미국 특허 제 7,393,676 호; Liao et al., 미국 특허 공보 2005/0221466). 로도박터 스파에로이데스(Rhodobacter spaeroides)를 포함한 다른 유기체로부터의 추가적인 유전자 후보들을 서열 유사성에 의해 추리할 수 있다.
Figure pct00012
말로닉 세미알데하이드의 3-HP로의 전환을 또한 2 개의 다른 효소, 즉 NADH-의존성 3-하이드록시프로피오네이트 데하이드로게나제 및 NADPH-의존성 말로네이트 세미알데하이드 리덕타제에 의해 수행할 수 있다. NADH-의존성 3-하이드록시프로피오네이트 데하이드로게나제는 세균 및 식물 중의 프로피오네이트로부터 베타-알라닌 생합성 경로에 관여하는 것으로 생각된다(문헌[Rathinasabapathi, B. Journal of Plant Pathology 159:671-674(2002); Stadtman, E.R. J. Am. Chem. Soc. 77:5765-5766(1955)]). 상기 효소는 지금까지 어떠한 유기체 중의 유전자와도 관련되지 않았다. NADPH-의존성 말로네이트 세미알데하이드 리덕타제는 독립영양 CO2-고정 세균에서의 역 반응을 촉매화한다. 상기 효소 활성이 메탈로스파에라 세둘라(Metallosphaera sedula)에서 검출되었지만, 상기 유전자의 정체는 알려지지 않고 있다(문헌[Alber et al., J. Bacteriol. 188:8551-8559(2006)]).
케톤에서 하이드록실로.
케톤을 하이드록실 작용기로 전환시키는 여러 개의 예시적인 알콜 데하이드로게나제가 존재한다. 에스케리키아 콜라이로부터의 2 개의 상기와 같은 효소들은 말레이트 데하이드로게나제(mdh) 및 락테이트 데하이드로게나제(ldhA)에 의해 암화화된다. 또한, 랄스토니아 유트로파로부터의 락테이트 데하이드로게나제는 다양한 쇄 길이의 기질들, 예를 들어 락테이트, 2-옥소부티레이트, 2-옥소펜타노에이트 및 2-옥소글루타레이트에 대해 높은 활성을 나타내는 것으로 입증되었다(문헌[Steinbuchel A. and H.G. Schlegel, Eur. J. Biochem. 130:329-334(1983)]). 알파-케토아디페이트의 알파-하이드록시아디페이트로의 전환은 또한 래트 및 인간 태반에서 발견되는 것으로 보고된 효소인 2-케토아디페이트 리덕타제에 의해 촉매화될 수 있다(문헌[Suda et al., Arch. Biochem. Biophys., 176:610-620(1976); Suda et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 77:586-591(1977)]). 이들 단계에 추가적인 후보는 인간 심장으로부터의 미토콘드리아 3-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제(bdh)(클로닝되고 특성화되었다)이다(문헌[Marks et al., J. Biol. Chem. 267:15459-15463(1992)]). 상기 효소는 3-하이드록시산 상에서 작용하는 데하이드로게나제이다. 또 다른 예시적인 알콜 데하이드로게나제가 클로스트리듐 베이제링키이(문헌[Ismaiel et al., J. Bacteriol. 175:5097-5105(1993)]) 및 써모아나에로박터 브록키이(Thermoanaerobacter brockii)(문헌[Lamed et al. Biochem. J. 195:183-190(1981); Peretz and Burstein Biochemistry 28:6549-6555(1989)])에서 나타난 바와 같이 아세톤을 아이소프로판올로 전환시킨다.
Figure pct00013
아세토아세틸-CoA를 3-하이드록시부티릴-CoA로 전환시키는 예시적인 3-하이드록시아실 데하이드로게나제는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰으로부터의 hbd(문헌[Boynton et al. Journal of Bacteriology 178:3015-3024(1996)]), 클로스트리듐 베이제링키이로부터의 hbd(문헌[Colby et al. Appl Environ. Microbiol 58:3297-3302(1992)]), 및 메탈로스파에라 세둘라로부터의 다수의 유사한 효소들(문헌[Berg et al. Archaea. Science. 318:1782-1786(2007)])을 포함한다.
Figure pct00014
1.1.1.c - 옥시도리덕타제(2 단계, 아실- CoA 에서 알콜로 )
아실-CoA를 알콜로 전환시키는 예시적인 2-단계 옥시도리덕타제는 기질을 형질전환시키는 것들, 예를 들어 아세틸-CoA를 에탄올로(예를 들어 에스케리키아 콜라이로부터 adhE(문헌[Kessler et al., FEBS. Lett., 281-59-63(1991)]) 및 부티릴-CoA를 부탄올로(예를 들어 클로스트리듐 아세토부틸리쿰으로부터 adhE2(문헌[Fontaine et al., J. Bacteriol., 184:821-830(2002)])로 형질전환시키는 것들을 포함한다. 아세틸-CoA를 에탄올로 환원시키는 것 이외에, 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 중의 adhE에 의해 암호화되는 효소는 분지쇄 화합물 아이소부티르알데하이드를 아이소부티릴-CoA로 산화시키는 것으로 입증되었다(문헌[Kazahaya et al., J. Gen. Appl. Microbiol., 18:43-55(1972); Koo et al.,, Biotechnol. Lett., 27:505-510(2005)]).
Figure pct00015
또 다른 예시적인 효소는 말로닐-CoA를 3-HP로 전환시킬 수 있다. 상기 활성을 갖는 NADPH-의존성 효소는 클로로플렉수스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus)에서 특성화되었으며, 여기에서 3-하이드록시프로피오네이트 주기에 관여한다(문헌[Hugler et al., J. Bacteriol., 184:2404-2410(2002); Strauss and Fuchs, Eur. J. Biochem., 215:633-643(1993)]). 상기 효소는 300 kDa의 질량을 가지며, 매우 기질-특이성이고, 다른 공지된 옥시도리덕타제들과 서열 유사성을 거의 나타내지 않는다(문헌[Hugler et al., J. Bacteriol., 184:2404-2410(2002)]). 다른 유기체들 중에서 상기 특이적인 반응을 촉매화하는 것으로 입증된 효소들은 없으나; 다른 유기체들이 유사한 경로를 가질 수 있다는 생물정보학적 증거가 존재한다(문헌[Klatt et al., Environ. Microbiol., 9:2067-2078(2007)]). 로세이플렉수스 카스텐홀지이(Roseiflexus castenholzii), 에리쓰로박터(Erythrobacter) 스페시즈 NAP1 및 해양 감마 프로테오박테리움 HTCC2080을 포함한 다른 유기체들 중의 효소들이 서열 유사성에 의해 추리될 수 있다.
Figure pct00016
보다 긴 쇄 아실-CoA 분자들이 알콜-형성 지방 아실-CoA 리덕타제를 암호화하는 호호바(심몬드시아 키넨시스(Simmondsia chinensis)) FAR과 같은 효소들에 의해 환원될 수 있다. 에스케리키아 콜라이에서의 그의 과발현은 FAR 활성 및 지방 알콜의 축적을 생성시켰다(문헌[Metz et al., Plant Physiology, 122:635-644(2000)]).
Figure pct00017
1.2.1.b - 옥시도리덕타제(아실- CoA 에서 알데하이드로 )
몇몇 아실-CoA 데하이드로게나제들이 아실-CoA를 그의 상응하는 알데하이드로 환원시킬 수 있다. 상기와 같은 효소를 암호화하는 예시적인 유전자는 지방 아실-CoA 리덕타제를 암호화하는 애시네토박터 칼코아세티쿠스(Acinetobacter calcoaceticus) acr1(문헌[Reiser and Somerville, J. of Bacteriology, 179:2969-2975(1997)]), 애시네토박터 스페시즈 M-1 지방 아실-CoA 리덕타제(문헌[Ishige et al., Appl. Environ. Microbiol., 68:1192-1195(2002)]) 및 클로스트리듐 클루이베리 중의 sucD 유전자에 의해 암호화되는 CoA- 및 NADP-의존성 숙시네이트 세미알데하이드 데하이드로게나제(문헌[Sohling and Gottschalk, J. Bacteriol., 178:871-80(1996); Sohling and Gottschalk, J. Bacteriol., 178:871-880(1996)])를 포함한다. 포르피로모나스 진지발리스의 SucD는 또 다른 숙시네이트 세미알데하이드 데하이드로게나제이다(문헌[Takahashi et al., J. Bacteriol., 182:4704-4710(2000)]). bphG에 의해 암호화되는, 슈도모나스 스페시즈 중의 아세트알데하이드 데하이드로게나제를 아실화하는 효소는 아세트알데하이드, 프로피온알데하이드, 부티르알데하이드, 아이소부티르알데하이드 및 폼알데하이드를 산화하고 아실화하는 것으로 입증된 더욱 또 다른 효소이다(문헌[Powlowski et al., J. Bacteriol., 175:377-385(1993)]).
Figure pct00018
아실-CoA를 그의 상응하는 알데하이드로 전환시키는 추가의 효소 유형은 말로닐-CoA를 말로닉 세미알데하이드로 형질전환시키는 말로닐-CoA 리덕타제이다. 말로닐-CoA 리덕타제는 호열호산성 고세균에서 3-하이드록시프로피오네이트 주기를 통한 독립영양성 탄소 고정에 핵심 효소이다(문헌[Berg et al. Science 318:1782-1786(2007); Thauer, R.K., Science, 318:1732-1733(2007)]). 상기 효소는 보조인자로서 NADPH를 이용하며 메탈로스파에라(Metallosphaera) 및 설포로부스 스페시즈(Sulfolobus spp)에서 특성화되었다(문헌[Alber et al., J. Bacteriol., 188:8551-8559(2006); Hugler et al. J. Bacteriol. 184:2404-2410(2002)]). 상기 효소는 메탈로스파에라 세둘라(Metallosphaera sedula)에서 Msed_0709에 의해 암호화된다(문헌[Alber et al., J. Bacteriol., 188:8551-8559(2006); Berg et al. Science 318:1782-1786(2007)]). 설포로부스 토코다이이(Sulfolobus tokodaii)로부터의 말로닐-CoA 리덕타제를 암호화하는 유전자가 클로닝되었으며 에스케리키아 콜라이에서 이종 발현되었다(문헌[Alber et al., J. Bacteriol., 188:8551-8559(2006)]). 이들 효소의 알데하이드 데하이드로게나제 작용성이 클로로플렉수스 아우란티아쿠스로부터의 이작용성 데하이드로게나제와 유사하지만, 서열 유사성은 거의 없다. 상기 두 말로닐-CoA 리덕타제 효소들은 모두 아스파틸-4-포스페이트의 아스파테이트 세미알데하이드로의 환원 및 동시적인 탈인산화를 촉매화하는 효소인 아스파테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제와 높은 서열 유사성을 갖는다. 추가적인 유전자들을 설포로부스 솔파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus) 및 설포로부스 애시도칼다리우스(Sulfolobus acidocaldarius)를 포함한 다른 유기체들 중의 단백질들에 대한 서열 상동성에 의해 발견할 수 있다.
Figure pct00019
1.2.1.c - 옥시도리덕타제(2- 옥소산에서 아실- CoA 로, 탈카복실화 )
본 계열의 효소들은 1) 분지쇄 2-케토-산 데하이드로게나제, 2) 알파-케토글루타레이트 데하이드로게나제, 및 3) 피루베이트 데하이드로게나제 다중효소 복합체(PDHC)를 포함한다. 이들 효소는 2-케토산의 산화적 탈카복실화를 아실화하는 일련의 부분 반응들을 촉매화하는 다중 효소 복합체이다. 상기 2-케토산 데하이드로게나제 복합체는 각각 중간 대사의 핵심 위치들을 차지하며, 효소 활성은 전형적으로는 엄격히 조절된다(문헌[Fries et al. Biochemistry 42:6996-7002(2003)]). 상기 효소는 3 개의 촉매 성분, 즉 알파-케토산 데카복실라제(E1), 다이하이드로리포아미드 아실트랜스퍼라제(E2) 및 다이하이드로리포아미드 데하이드로게나제(E3)의 다중 사본들로 구성된 복잡하지만 공통의 구조를 공유한다. 상기 E3 성분은 유기체 중에서 모든 2-케토산 데하이드로게나제 복합체들 사이에 공유되는 반면, E1 및 E2 성분은 상이한 유전자들에 의해 암호화된다. 상기 효소 성분들은 상기 복합체 중에서 다수의 사본 수로 존재하며 다중의 보조 인자들을 사용하여 기질 채널링을 통해 반응들의 지정된 서열을 촉매화한다. 이들 데하이드로게나제 복합체의 전체 크기는 매우 크며, 이때 분자 질량은 4 백만 내지 천만 Da이다(즉, 리보솜보다 크다).
상기 2-케토산 데하이드록나제 계열 중 효소들의 활성은 에스케리키아 콜라이에서 혐기성 조건 하에서 통상적으로 낮거나 제한된다. NADH(또는 NADPH)의 증가된 생산은 산화환원 불균형을 도출할 수 있으며, NADH 자체는 효소 작용에 대한 억제제로서 작용한다. 공학 노력은 에스케리키아 콜라이 피루베이트 데하이드로게나제 복합체의 혐기성 활성을 증가시켰다(문헌[Kim et al. Appl. Environ. Microbiol. 73:1766-1771(2007); Kim et al. J. Bacteriol. 190:3851-3858(2008)); Zhou et al. Biotechnol. Lett. 30:335-342(2008)]). 예를 들어, NADH의 억제 효과는 E3 성분에서 H322Y 돌연변이를 조작함으로써 극복될 수 있다(문헌[Kim et al. J. Bacteriol. 190:3851-3858(2008)]). 개별적인 성분들의 구조 연구 및 상기 성분들이 복합체 중에서 함께 작용하는 방법은 상기 계열 효소들의 촉매 기전 및 구조에 대한 통찰력을 제공한다(문헌[Aevarsson et al. Nat. Struct. Biol. 6:785-792(1999); Zhou et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:14802-14807(2001)]). 상기 데하이드로게나제 복합체의 기질 특이성은 상이한 유기체들에서 다양하지만, 일반적으로 분지쇄 케토산 데하이드로게나제가 가장 넓은 기질 범위를 갖는다.
알파-케토글루타레이트 데하이드로게나제(AKGD)는 알파-케토글루타레이트를 숙시닐-CoA로 전환시키며 TCA 주기를 통한 대사 흐름의 조절에 주요 부위이다(문헌[Hansford, R.G. Curr. Top. Bioenerg. 10:217-278(1980)]). 에스케리키아 콜라이에서 유전자 sucA , sucB 및 lpd에 의해 암호화되는 경우, AKGD 유전자 발현은 글루코스 상에서 증식하는 동안 혐기성 조건 하에서 하향 조절된다(문헌[Park et al. Mol. Microbiol. 15:473-482(1995)]). AKGD의 기질 범위는 좁지만, E2 성분의 촉매 코어의 구조 연구는 기질 특이성을 맡고 있는 특정 잔기를 정확히 지적한다(문헌[Knapp et al. J. Mol. Biol. 280:655-668(1998)]). odhAB(E1 및 E2) 및 pdhD(E3, 공유된 도메인)에 의해 암호화된, 바실러스 서브틸리스 AKGD는 전사 수준에서 조절되며, 유기체의 탄소원 및 증식 단계에 의존한다(문헌[Resnekov et al. Mol. Gen. Genet. 234:285-296(1992)]). 효모에서, E3 성분을 암호화하는 LPD1 유전자는 글루코스에 의해 전사 수준에서 조절된다(문헌[Roy and Dawes J.Gen.Microbiol. 133:925-933(1987)]). KGD1에 의해 암호화된, E1 성분은 또한 글루코스에 의해 조절되고 HAP2 및 HAP3의 산물에 의해 활성화된다(문헌[Repetto and Tzagoloff Mol. Cell Biol. 9:2695-2705(1989)]). 생성물 NADH 및 숙시닐-CoA에 의해 억제된 AKGD 효소 복합체는 포유동물 계에서 잘 연구되고 있으며, 그의 손상된 기능은 여러 신경학적 질병들에 연루되어 왔다(문헌[Tretter and dam-Vizi Philos. Trans. R. Soc. Lond B Biol. Sci. 360:2335-2345(2005)]).
Figure pct00020
분지쇄 2-케토산 데하이드로게나제 복합체(BCKAD)(또한 2-옥소아이소발레레이트 데하이드로게나제로서 공지됨)는, 발린, 류신 및 아이소류신의 2-케토산 유도체를 그들의 아실-CoA 유도체 및 CO2로 전환시키는 분지쇄 아미노산 분해 경로에 관여한다. 상기 복합체는 바실러스 서브틸리스(문헌[Wang et al. Eur. J. Biochem. 213:1091-1099(1993)]), 라투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus)(문헌[Namba et al. J. Biol. Chem. 244:4437-4447(1969)]) 및 슈도모나스 푸티다(문헌[Sokatch J. Bacteriol. 148:647-652(1981)])를 포함한 다수의 유기체들에서 연구되었다. 바실러스 서브틸리스에서 상기 효소는 유전자 pdhD(E3 성분), bfmBB(E2 성분), bfmBAA 및 bfmBAB(E1 성분)에 의해 암호화된다(문헌[Wang et al. Eur. J. Biochem. 213:1091-1099(1993)]). 포유동물에서, 상기 복합체는 특정 포스파타제 및 단백질 키나제에 의한 인산화에 의해 조절된다. 상기 복합체는 래트 간세포에서 연구되었으며(문헌[Chicco et al. J. Biol. Chem. 269:19427-19434(1994)]) 유전자 Bckdha(E1 알파), Bckdhb(E1 베타), Dbt(E2), 및 Dld(E3)에 의해 암호화된다. 슈도모나스 푸티다 BCKAD 복합체의 E1 및 E3 성분들이 결정화되었으며(문헌[Aevarsson et al. Nat. Sturct. Biol. 6:785-792(1999); Mattevi Science 255:1544-1550(1992)]), 상기 효소 복합체가 연구되었다(문헌[Sokatch et al. J. Bacteriol. 148:647-652(1981)]). 슈도모나스 푸티다 BCKAD 유전자의 전사는 bkdR의 유전자 산물에 의해 활성화된다(문헌[Hester et al. Eur. J. Biochem. 233:828-836(1995)]). 라투스 노르베기쿠스(문헌[Paxton et al. Biochem. J. 234:295-303(1986)]) 및 사카로마이세스 세레비지아에(문헌[Sinclair et al. Biochem. Mol. Biol. Int. 31:911-922(1993)])를 포함한 일부 유기체에서. 상기 복합체는 분지쇄 아미노산 전구체들 이외에, 2-옥소부타노에이트 및 알파-케토글루타레이트와 같은 선형 옥소산을 포함한 광범위한 기질 범위를 갖는 것으로 나타났다. 소 BCKAD의 활성 부위가 또 다른 기질 아세틸-CoA에 유리하도록 조작되었다(문헌[Meng and Chuang, Biochemistry 33:12879-12885(1994)]).
Figure pct00021
피루베이트에서 아세틸-CoA로의 전환을 촉매화하는 피루베이트 데하이드로게나제가 또한 광범위하게 연구되어 왔다. 에스케리키아 콜라이 효소에서, 상기 E1 성분 중의 특정 잔기들이 기질 특이성을 맡고 있다(문헌[Bisswanger, H. J Biol Chem. 256:815-822(1981); Bremer, J. Eur. J Biochem. 8:535-540(1969); Gong et al. J Biol Chem. 275:13645-13653(2000)]). 앞서 언급한 바와 같이, 효소 공학 노력은 혐기성 조건 하에서 에스케리키아 콜라이 PDH 효소 활성을 개선시켰다(문헌[Kim et al. Appl. Environ. Microbiol. 73:1766-1771(2007); Kim J. Bacteriol. 190:3851-3858(2008); Zhou et al. Biotechnol. Lett. 30:335-342(2008)]). 상기 에스케리키아 콜라이 PDH와 대조적으로, 바실러스 서브틸리스 복합체는 혐기성 조건 하에서 활성이며 상기 조건 하에서의 증식을 요한다(문헌[Nakano J. Bacteriol. 179:6749-6755(1997)]). 글리세롤 상에서 증식하는 동안 특성화된, 클렙시엘라 뉴모니아에 PDH가 또한 혐기성 조건 하에서 활성이다(문헌[Menzel et al. J. Biotechnol. 56:135-142(1997)]). 소 신장으로부터의 상기 효소 복합체의 결정 구조(문헌[Zhou et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:14802-14807(2001)]) 및 아조토박터 비넬란디이(Azotobacter vinelandii)로부터의 E2 촉매 도메인을 입수할 수 있다(문헌[Mattevi et al. Science 255:1544-1550(1992)]). 일부 포유동물 PDH 효소 복합체는 또 다른 기질, 예를 들어 2-옥소부타노에이트 상에서 반응할 수 있지만, 라투스 노르베기쿠스 PDH 및 BCKAD의 비교 동역학은 BCKAD가 기질로서 2-옥소부타노에이트 상에서 더 큰 활성을 가짐을 나타낸다(문헌[Paxton et al. Biochem. J. 234:295-303(1986)]).
Figure pct00022
상술한 큰 다중효소 2-케토산 데하이드로게나제 복합체에 대한 대안으로서, 일부 혐기성 유기체들은 2-케토산의 산화적 탈카복실화의 아실화를 촉매화하는 2-케토산 옥시도리덕타제 계열(OFOR)의 효소들을 사용한다. 데하이드로게나제 복합체와 달리, 이들 효소는 철-황 클러스터를 함유하며, 상이한 보조 인자들을 사용하고, NAD(P)H 대신에 전자 수용체로서 페레독신 또는 플라보딕신을 사용한다. 상기 계열의 대부분의 효소들은 기질로서 피루베이트에 특이적인 반면(POR), 일부 2-케토산:페레독신 옥시도리덕타제는 알파-케토글루타레이트 및 2-옥소부타노에이트를 포함하여 기질로서 광범위한 2-케토산들을 수용하는 것으로 나타났다(문헌[Fukuda and Wakagi Biochim. Biophys. Acta 1597:74-80(2002); Zhang et al. J. Biochem. 120:587-599(1996)]). 하나의 상기와 같은 효소는 호열호산성 고세균인 설포로부스 토코다이이(Sulfolobus tokodaii) 7로부터의 OFOR이며, 이는 유전자 ST2300에 의해 암호화되는 알파 및 베타 서브유닛을 함유한다(문헌[Fukuka and Wakagi Biochim. Biophys. Acta 1597:74-80(2002); Zhang et al. J. Biochem. 120:587-599(1996)]). 플라스미드 기재 발현 시스템이 에스케리키아 콜라이에서의 상기 단백질의 효율적인 발현을 위해 개발되었으며(문헌[Fukuka et al. Eur. J. Biochem. 268:5639-5646(2001)]) 기질 특이성에 관련된 잔기들이 결정되었다(문헌[Fukuda and Wakagi Biochim. Biophys. Acta 1597:74-80(2002)]). 아에로피룸 페르닉스(Aeropyrum pernix) 균주 K1으로부터 2 개의 OFOR이 또한 최근에 에스케리키아 콜라이 내로 클로닝되었으며, 특성화되었고, 광범위한 2-옥소산들과 반응하는 것으로 밝혀졌다(문헌[Nishizawa et al. FEBS Lett. 579:2319-2322(2005)]). 이들 OFOR 후보들의 유전자 서열을 입수할 수 있지만, 이들은 지금까지 지정된 젠뱅크 식별자를 갖고 있지 않다. 유사한 효소들이 모든 고세균, 일부 혐기성 세균 및 비미토콘드리아(amitochondrial) 진핵생물 중에 존재한다는 생물정보학적 증거가 존재한다(문헌[Fukuda and Wakagi Biochim. Biophys. Acta 1597:74-80(2005)]). 상기 부류의 효소는 또한, 환원된 페레독신을 사용하여 페레독신-NAD 리덕타제에 의해 NADH를 생성시킬 수 있으므로, 활력적인 견지에서 흥미롭다(문헌[Petitdemange et al. Biochim. Biophys. Acta 421:334-337(1976)]). 또한, 상기 효소들 중 대부분은 혐기성 조건 하에서 작용하도록 디자인되므로, 혐기성 환경에서 활성을 위해 상기 2-케토산 데하이드로게나제 복합체 계열의 효소들에 비해 적은 효소 조작을 필요로 할 수도 있다.
Figure pct00023
1.2.1.d - 옥시도리덕타제(인산화/ 탈인산화 )
상기 부류의 예시적인 효소들은 글리세르알데하이드-3-포스페이트를 D-글리세레이트 1,3-비스포스페이트로 전환시키는 글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제(예를 들어 에스케리키아 콜라이 gapA(문헌[Branlant and Branlant Eur. J. Biochem. 150:61-66(1985)]), L-아스파테이트-4-세미알데하이드를 L-4-아스파틸-포스페이트로 전환시키는 아스파테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제(예를 들어 에스케리키아 콜라이 asd(문헌[Biellmann et al. Eur. J. Biochem. 104:53-58(1980)]), N-아세틸-L-글루타메이트-5-세미알데하이드를 N-아세틸-L-글루타밀-5-포스페이트로 전환시키는 N-아세틸-감마-글루타밀-포스페이트 리덕타제(예를 들어 에스케리키아 콜라이 argC(문헌[Parsot et al. Gene 68:275-283(1988)]), 및 L-글루타메이트-5-세미알데하이드를 L-글루타밀-5-포스페이트로 전환시키는 글루타메이트-5-세미알데하이드 데하이드로게나제(예를 들어 에스케리키아 콜라이 proA(문헌[Smith et al., J. Bacteriol. 157:545-551(1984)])를 포함한다.
Figure pct00024
1.3.1.a - CH - CH 공여체 상에서 작용하는 옥시도리덕타제
하나의 예시적인 에노일-CoA 리덕타제는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰으로부터의 bcd의 유전자 산물(문헌[Boynton et al., J. Bacteriol. 178:3015-3024(1996); Atsumi et al., Metab. Eng(2007)])이고, 이는 크로토닐-CoA의 부티릴-CoA로의 환원을 자연적으로 촉매화한다. 상기 효소의 활성은, 전자 전달 플라보 단백질을 암호화하는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 etfAB 유전자의 발현과 함께 bcd를 발현함으로써 향상될 수 있다. 상기 에노일-CoA 리덕타제 단계에 대한 추가의 효소는 유글레나 그라실리스(Euglena gracilis)로부터의 미토콘드리아 에노일-CoA 리덕타제(문헌[Hoffmeister et al., J. Biol. Chem. 280:4329-4338(2005)])이다. 미토콘드리아 표적화 리더 서열의 제거에 따라 상기 서열로부터 유도된 구조물을 에스케리키아 콜라이에 클로닝하여 활성 효소를 생성시켰다(상기 Hoffmeister et al.(2005)). 상기 접근법은 진핵생물 유전자, 특히 유전자 산물을 원핵생물 유기체 중에서 특정한 세포 내 구획에 표적화할 수 있는 리더 서열을 갖는 것들을 발현하는 분야의 숙련가들에게 널리 공지되어 있다. 원핵생물 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola)로부터의 상기 유전자의 밀접한 동족체 TDE0597은, 클로닝되고 에스케리키아 콜라이에서 발현된 제 3의 에노일-CoA 리덕타제를 나타낸다(문헌[Tucci and Martin, FEBS Lett, 581:1561-1566(2007)]).
Figure pct00025
예시적인 2-에노에이트 리덕타제(EC 1.3.1.31) 효소는 광범위한 α,β-불포화된 카복실산 및 알데하이드의 NADH-의존성 환원을 촉매화하는 것으로 공지되어 있다(문헌[Rohdich et al., J. Biol. Chem. 276:5779-5787(2001)]). 2-에노에이트 리덕타제는 클로스트리듐 타이로부티리쿰(Clostridium tyrobutyricum) 및 클로스트리듐 써모아세티쿰(Clostridium thermoaceticum)(현재는 무어렐라 써모아세티쿰(Moorella thermoaceticum)으로서 지칭됨)을 포함하여 클로스트리듐의 몇몇 종 중의 enr(문헌[Giesel and Simon, Arch Microbiol. 135(1): p. 51-57(2001)])에 의해 암호화된다(상기 Rohdich et al.(2001)). 클로스트리듐 클루이베리의 최근에 공개된 게놈 서열에서 에노에이트 리덕타제에 대한 9 개의 암호화 서열들이 보고되었으며, 이들 중 하나가 특성화되었다(문헌[Seedorf et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105:2128-2133(2008)]). 상기 두 클로스트리듐 타이로부티리쿰 및 클로스트리듐 써모아세티쿰으로부터의 enr 유전자들이 클로닝되고 서열화되었으며 서로 59% 일치성을 나타낸다. 앞의 유전자가 또한 클로스트리듐 클루이베리에서 특성화된 유전자와 대략 75% 유사성을 갖는 것으로 밝혀졌다(문헌[Giesel and Simon, Arch Microbiol. 135(1): p. 51-57(1983)]). 이러한 서열 결과를 근거로 enr은 에스케리키아 콜라이 중의 다이에노일 CoA 리덕타제(fadH)와 매우 유사한 것으로 보고되었다(163 상기 Rohdich et al.(2001)). 상기 클로스트리듐 써모아세티쿰 enr 유전자는 에스케리키아 콜라이에서 효소 활성 형태로 또한 발현되었다(163 상기 Rohdich et al.(2001)).
Figure pct00026
1.4.1.a - 아미노산 상에서 작용하는 옥시도리덕타제
아미노산 상에서 작용하는 대부분의 옥시도리덕타제는 수용체로서 NAD+ 또는 NADP+를 갖는 알파-아미노산의 산화적 탈아민화를 촉매화한다. 아미노산 상에서 작용하는 예시적인 옥시도리덕타제는 gdhA에 의해 암호화되는 글루타메이트 데하이드로게나제(탈아민화), ldh에 의해 암호화되는 류신 데하이드로게나제(탈아민화), 및 nadX에 의해 암호화되는 아스파테이트 데하이드로게나제(탈아민화)를 포함한다. 에스케리키아 콜라이로부터의 상기 gdhA 유전자 산물(문헌[McPherson et al., Nucleic. Acids Res. 11:5257-5266(1983); Korber et al., J. Mol. Biol. 234:1270-1273(1993)]), 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima)로부터의 gdh(문헌[Kort et al., Extremophiles 1:52-60(1997); Lebbink et al., J. Mol. Biol. 280:287-296(1998); Lebbink et al, J. Mol. Biol. 289:357-369(1999)]), 및 할로박테리움 살리나룸(Halobacterium salinarum)으로부터의 gdhA1(문헌[Ingoldsby et al, Gene. 349:237-244(2005)])은, 각각 NADP(H), NAD(H), 또는 이둘 모두를 촉진하면서, 글루타메이트의 2-옥소글루타레이트 및 암모니아로의 가역적인 상호전환을 촉매화한다. 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)의 ldh 유전자는 류신, 아이소류신, 발린 및 2-아미노부타노에이트를 포함한 광범위한 기질을 수용하는 LeuDH 단백질을 암호화한다(문헌[Stoyan et al., J. Biotechnol 54:77-80(1997); Ansorge and Kula Biotechnol Bioeng. 68:557-562(2000)]). 상기 아스파테이트 데하이드로게나제를 암호화하는 써모토가 마리티마로부터의 nadX 유전자는 NAD의 생합성에 관련된다(문헌[Yang et al., J. Biol. Chem. 278:8804-8808(2003)]).
Figure pct00027
lysDH 유전자에 의해 암호화되는 리신 6-데하이드로게나제(탈아민화)는 L-리신의 ε-아미노 그룹의 산화적 탈아민화를 촉매화하여 2-아미노아디페이트-6-세미알데하이드를 형성하고, 이는 차례로 비 효소적으로 환화되어 Δ1-피페리딘-6-카복실레이트를 형성한다(문헌[Misono and Nagasaki, J Bacteriol. 150:398-401(1982)]). 제오바실러스 스테아로써모필루스(Geobacillus stearothermophilus)로부터의 lysDH 유전자는 호열성 NAD-의존성 리신 6-데하이드로게나제를 암호화한다(문헌[Heydari et al., Appl Environ. Microbiol 70:937-942(2004)]). 또한, 아에로피룸 페르닉스 K1으로부터의 lysDH 유전자가 게놈 프로젝트로부터 상동성을 통해 동정된다.
Figure pct00028
2.3.1.a - 아실트랜스퍼라제 ( 포스페이트 그룹 운반)
예시적인 포스페이트 운반 아실트랜스퍼라제는 pta에 의해 암호화되는 포스포트랜스아세틸라제, 및 ptb에 의해 암호화되는 포스포트랜스부티릴라제를 포함한다. 에스케리키아 콜라이로부터의 pta 유전자는 아세틸-CoA를 아세틸-포스페이트로, 및 이와 역으로 전환할 수 있는 효소를 암호화한다(문헌[Suzuki, T. Biochim. Biophys. Acta 191:559-569(1969)]). 상기 효소는 또한 상기 과정에서 아세틸-CoA 대신에 프로피오닐-CoA를 사용하여 프로피오네이트를 형성할 수 있다(문헌[Hesslinger et al. Mol. Microbiol 27:477-492(1998)]). 유사하게, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰으로부터의 ptb 유전자는 부티릴-CoA를 부티릴-포스페이트로 전환할 수 있는 효소를 암호화한다(문헌[Walter et al. Gene 134(1):p. 107-11(1993)); Huang et al. J Mol Microbiol Biotechnol 2(1):p. 33-38(2000)]). 추가적인 ptb 유전자를 부티레이트-생산 세균 L2-50(문헌[Louis et al. J. Bacteriol. 186:2099-2106(2004)]) 및 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium)에서 발견할 수 있다(문헌[Vazquez et al. Curr. Microbiol 42:345-349(2001)]).
Figure pct00029
2.6.1.a - 아미노트랜스퍼라제
아스파테이트 아미노트랜스퍼라제는 아미노 그룹을 아스파테이트로부터 알파-케토글루타레이트로 운반하여 글루타메이트 및 옥살로아세테이트를 형성시킨다. 상기 전환은 예를 들어 에스케리키아 콜라이로부터의 aspC(문헌[Yagi et al., FEBS Lett., 100:81-84(1979); Yagi et al., Methods Enzymol., 113:83-89(1985)]), 사카로마이세스 세레비지아에로부터의 AAT2(문헌[Yagi et al., J. Biochem., 92:35-43(1982)]), 및 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)로부터의 ASP5(48, 108, 225 48. 문헌[de la et al., Plant J. 46:414-425(2006); Kwok and Hanson J. Exp. Bot., 55:595-604(2004); Wilkie and Warren Protein Expr. Purif., 12:381-389(1998)])의 유전자 산물들에 의해 촉매화된다. 발린 아미노트랜스퍼라제는 발린 및 피루베이트의 2-케토아이소발레레이트 및 알라닌으로의 전환을 촉매화한다. 에스케리키아 콜라이 유전자 avtA는 하나의 상기와 같은 효소를 암호화한다(문헌[Whalen and Berg J. Bacteriol., 150:739-746(1982)]). 상기 유전자 산물은 또한 α-케토부티레이트의 아민화를 촉매화하여 α-아미노부티레이트를 생성시키지만, 상기 반응에서 아민 공여체는 동정되지 않았다(문헌[Whalen and Berg J. Bacteriol., 158:571-574(1984)]). 에스케리키아 콜라이 serC의 유전자 산물은 2 개의 반응, 즉 포스포세린 아미노트랜스퍼라제 및 포스포하이드록시쓰레오닌 아미노트랜스퍼라제를 촉매화하며(문헌[Lam and Winkler J. Bacteriol. 172:6518-6528(1990)]), 비-인산화된 기질 상에서의 활성은 검출할 수 없었다(문헌[Drewke et al. FEBS. Lett. 390:179-182(1996)]).
Figure pct00030
카길(Cargill)은 말로닐-세미알데하이드를 통해 베타-알라닌으로부터 3-HP를 생산하는 베타-알라닌/알파-케토글루타레이트 아미노트랜스퍼라제를 개발하였다(PCT/US2007/076252(Jessen et al.)). 사카로마이세스 클루이베리 중의 SkPYD4의 유전자 산물이 또한 아미노 그룹 공여체로서 베타-알라닌을 우선적으로 사용하는 것으로서 입증되었다(문헌[Andersen et al. FEBS.J. 274:1804-1817(2007)]). SkUGA1은 사카로마이세스 세레비지아에 GABA 아미노트랜스퍼라제의 동족체인 UGA1(문헌[Ramos et al. Eur. J. Biochem. 149:401-404(1985)])를 암호화하는 반면, SkPYD4는 β-알라닌 및 GABA 트랜스아민화 모두에 관련된 효소를 암호화한다(문헌[Andersen et al. FEBS. J. 274:1804-1817(2007)]). 3-아미노-2-메틸프로피오네이트 트랜스아미나제는 메틸말로네이트 세미알데하이드로부터 3-아미노-2-메틸프로피오네이트로의 형질전환을 촉매화한다. 상기 효소는 라투스 노르베기쿠스 및 수스 스크로파(Sus scrofa)에서 특성화되었으며 Abat에 의해 암호화된다(문헌[Kakimoto et al. Biochim. Biophys. Acta 156:374-380(1968); Tamaki et al. Methods Enzymol 324:376-389(2000)]). 3-아미노-2-메틸프로피오네이트 트랜스아미나제에 대해 높은 서열 상동성을 갖는 다른 유기체 중의 효소 후보들은 카에노라브디티스 엘레간스(Caenorhabditis elegans) 중의 Gta -1 및 바실러스 서브틸루스 중의 gabT를 포함한다. 또한, 유전자 gabT에 의해 암호화되는, 에스케리키아 콜라이 중의 고유 GABA 아미노트랜스퍼라제들 중 하나는 광범위한 기질 특이성을 갖는 것으로 나타났다(문헌[Liu et al. Biochemistry 43:10896-10905(2004); Schulz et al. Appl Environ Microbiol 56:1-6(1990)]). 유전자 puuE는 에스케리키아 콜라이 중의 다른 4-아미노부티레이트 트랜스아미나제를 암호화한다(문헌[Kurihara et al., J. Biol. Chem., 280:4602-4608(2005)]).
Figure pct00031
억제제에 비 결합 및 결합된 에스케리키아 콜라이 4-아미노부티레이트 트랜스아미나제의 X-선 결정 구조들이 보고되었다(문헌[Liu et al. Biochemistry 43:10896-10905(2004)]). 상기 기질 결합 및 기질 특이성들이 연구되고 제시되었다. 활성 부위 잔기의 역할이 부위 지정 돌연변이 및 X-선 결정학에 의해 연구되었다(문헌[Liu et al. Biochemistry 44:2982-2992(2005)]). 상기 구조 정보를 근거로, 신규의 효소 활성을 갖는 에스케리키아 콜라이 4-아미노부티레이트 트랜스아미나제에 대한 조작이 시도되었다. 이들 연구는 BDO 경로에 대한 트랜스아미나제 활성을 발전시킬 토대를 제공한다.
2.7.2.a - 포스포트랜스퍼라제 , 카복실 그룹 수용체
예시적인 키나제는 ackA에 의해 암호화되는 에스케리키아 콜라이 아세테이트 키나제(문헌[Skarstedt and Silverstein J. Biol. Chem. 251:6775-6783(1976)]), buk1 및 buk2에 의해 암호화되는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 부티레이트 키나제(문헌[Walter et al. Gene 134(1):107-111(1993)(Huang et al. J Mol Microbiol Biotechnol 2(1):33-38(2000)]), 및 proB에 의해 암호화되는 에스케리키아 콜라이 감마-글루타밀 키나제(문헌[Smith et al. J. Bacteriol. 157:545-551(1984)])를 포함한다. 상기 효소들은 각각 아세테이트, 부티레이트 및 글루타메이트를 인산화한다. 에스케리키아 콜라이로부터의 ackA 유전자 산물은 프로피오네이트를 인산화한다(문헌[Hesslinger et al. Mol. Microbiol 27:477-492(1998)]).
Figure pct00032
2.8.3.a - 조효소-A 트랜스퍼라제
CoA-트랜스퍼라제 계열에서, 에스케리키아 콜라이 효소 아실-CoA:아세테이트-CoA 트랜스퍼라제(또한 아세테이트-CoA 트랜스퍼라제(EC 2.8.3.8)로서도 공지됨)는 아이소부티레이트(문헌[Matthies and Schink, Appl. Environ. Microbiol. 58:1435-1439(1992)]), 발레레이트(문헌[Vanderwinkel et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 33:902-908(1968)]) 및 부타노에이트(상기 Vanderwinkel(1968))를 포함하여, 다양한 분지 및 선형 아실-CoA 기질로부터 상기 CoA 부분을 아세테이트로 운반하는 것으로 또한 입증되었다. 상기 효소는 에스케리키아 콜라이 스페시즈 K12(문헌[Korolev et al., Acta Crystallagr. D Biol Crystallagr. 58:2116-2121(2002)]; 상기 Vanderwinkel(1968)) 중의 atoA(알파 서브유닛) 및 atoD(베타 서브유닛), 및 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) ATCC 13032(문헌[Duncan et al. Appl. Environ. Miocrobiol. 68:5186-5190(2002)]) 중의 actA 및 cg0592에 의해 암호화된다. 서열 상동성에 의해 발견된 추가의 유전자들은 에스케리키아 콜라이 UT189 중의 atoD 및 atoA를 포함한다.
Figure pct00033
유사한 형질전환들이 각각 숙시닐-CoA, 4-하이드록시부티릴-CoA, 및 부티릴-CoA 아세틸트랜스퍼라제 활성을 나타내는 것으로 입증된 클로스트리듐 클루이베리의 cat1, cat2 및 cat3의 유전자 산물에 의해 촉매화된다(문헌[Seedorf et al. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105(6):2128-2133(2008); Sohling and Gottschalk J Bacteriol 178(3):871-880(1996)]).
Figure pct00034
혐기성 세균 애시드아미노코커스 페르멘탄스(Acidaminococcus fermentans)로부터의 글루타코네이트-CoA-트랜스퍼라제(EC 2.8.3.12) 효소는 이산 글루타코닐-CoA 및 3-부테노일-CoA와 반응한다(문헌[Mack and Buckel FEBS Lett. 405:209-212(1997)]). 상기 효소를 암호화하는 유전자는 gctA 및 gctB이다. 상기 효소는 글루타릴-CoA, 2-하이드록시글루타릴-CoA, 아디필-CoA 및 아크릴일-CoA를 포함한 다른 CoA 유도체들을 환원시키지만 이들에 의해 검출 가능한 활성을 갖는다(문헌[Buckel et al. Eur. J. Biochem. 118:315-321(1981)]). 상기 효소는 에스케리키아 콜라이에서 클로닝되고 발현되었다(문헌[Mack et al., Eur. J. Biochem. 226:41-51(1994)]).
Figure pct00035
3.1.2.a - 티올에스터 하이드롤라제 ( CoA 특이성)
CoA 하이드롤라제 계열에서, 효소 3-하이드록시아이소부티릴-CoA 하이드롤라제는 3-HIBCoA에 특이적이며 발린 분해 중에 목적하는 전환을 효율적으로 촉매화하는 것으로 개시되었다(문헌[Shimomura et al., J. Biol. Chem. 269:14248-14253(1994)]). 상기 효소를 암호화하는 유전자는 라투스 노르베기쿠스(상기 문헌[Shimomura(1994); Shimomura et al., Methods Enzymol. 324:229-240(2000)]) 및 호모 사피엔스(상기 Shimomura et al.(2000))의 hibch를 포함한다. 서열 상동성에 의한 후보 유전자는 사카로마이세스 세레비지아에의 hibch 및 바실러스 세레우스의 BC_2292를 포함한다.
Figure pct00036
아디필-CoA에서 아디페이트로의 전환은 아실-CoA 하이드롤라제 또는 동등하게 티오에스테라제에 의해 수행될 수 있다. 최고의 에스케리키아 콜라이 유전자 후보는 tesB(문헌[Naggert et al. J Biol Chem. 266(17):11044-11050(1991)]), 이는 아디필-CoA에 대한 활성을 갖는 다이카복실산 아세틸트랜스퍼라제인 인간 acot8과 고도의 유사성을 보인다(문헌[Westin et al. J Biol Chem 280(46):38125-38132(2005)]). 상기 활성은 래트 간에서 또한 특성화되었다(문헌[Deana, Biochem Int. 26(4):p.767-773(1992)]).
Figure pct00037
다른 잠재적인 에스케리키아 콜라이 티올에스터 하이드롤라제는 tesA(문헌[Bonner and Bloch, J. Biol. Chem. 247:3123-3133(1972)), ybgC(Kuznetsova et al., FEMS Microbiol. Rev. 29:263-279(2005); Zhuang et al., FEBS Lett. 516:161-163(2002)), paaI(Song et al., J. Biol. Chem. 281:11028-11038(2006)]) 및 ybdB(문헌[Leduc et al., J. Bacteriol. 189:7112-7126(2007)])의 유전자 산물을 포함한다.
Figure pct00038
여러 진핵생물 아세틸-CoA 하이드롤라제(EC 3.1.2.1)는 넓은 기질 특이성을 갖는다. 라투스 노르베기쿠스 뇌로부터의 효소(문헌[Robinson et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 71:959-965(1976)])는 부티릴-CoA, 헥사노일-CoA 및 말로닐-CoA와 반응할 수 있다.
Figure pct00039
4.1.1.a - 카복시 - 라이아제
예시적인 카복시-라이아제는 시트레이트 이화작용, 및 2-아세토락테이트를 아세토인으로 전환시키는 분지쇄 아미노산 생합성에 관여하는 아세토락테이트 데카복실라제이다. 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)에서, 상기 효소는 유전자 aldB에 의해 암호화되는 6 개의 서브유닛들로 구성되며, 발린, 류신 및 아이소류신에 의해 활성화된다(문헌[Goupil et al. Appl. Environ. Micorbiol. 62:2636-2640(1996); Goupil-Feuillerat et al. J. Bacteriol. 182:5399-5408(2000)]). 상기 효소는 에스케리키아 콜라이에서 과발현되고 특성화되었다(문헌[Phalip et al. FEBS Lett. 351:95-99(1994)]). 다른 유기체들에서 상기 효소는 스트렙토코커스 써모필루스 중의 aldC(문헌[Monnet et al. Lett. Appl. Microbiol. 36:399-405(2003)]), 바실러스 브레비스 중의 aldB(문헌[Diderichsen et al. J. Bacteriol. 172:4315-4321(1990); Najmudin et al. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 59:1073-1075(2003)]) 및 엔테로박터 아에로게네스(Enterobacter aerogenes) 중의 budA(문헌[Diderichsen et al. J. Bacteriol. 172:4315-4321(1990)])에 의해 암호화되는 이량체이다 . 바실러스 브레비스로부터의 효소가 클로닝되고 바실러스 서브틸리스 중에서 과발현되었으며 결정학적으로 특성화되었다(문헌[Najmudin et al. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 59:1073-1075(2003)]). 또한, 류코노스톡 락티스(Leuconostoc lactis)로부터의 효소들이 정제되고 특성화되었으나 상기 유전자는 단리되지 않았다(문헌[O'Sullivan et al. FEMS Microbiol. Lett. 194:245-249(2001)]).
Figure pct00040
아코니테이트 데카복실라제는 칸디다 균주 및 또한 섬유상 진균 아스퍼질러스 테레우스(Aspergillus terreus)에서 이타코네이트 생합성의 최종 단계를 촉매화한다(문헌[Bonnarme et al., J. Bacteriol., 177:3573-3578(1995); Willke and Vorlop Appl. Microbiol. Biotechnol., 56:289-295(2001)]). 이타코네이트는 생물공학적으로 중요한 화합물이지만, 상기 아코니테이트 데카복실라제 유전자 또는 단백질 서열은 지금까지 보고되지 않았다.
4-옥살로크로네이트 데카복실라제가 다수의 유기체들로부터 단리되고 특성화되었다. 상기 효소를 암호화하는 유전자는 슈도모나스 스페시즈(균주 600) 중의 dmpH 및 dmpE(문헌[Shingler et al., J. Bacteriol., 174:711-724(1992)]), 슈도모나스 푸티다 중의 xylII 및 xylIII(문헌[Kato and Asano Arch. Microbiol., 168:457-463(1997); Lian and Whitman J. Am. Chem. Soc., 116:10403-10411(1994); Stanley et al., Biochemistry, 39:3514(2000)]) 및 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha) JMP 134로부터 Reut _B5691 및 Reut _B5692(문헌[Hughes et al., J. Bacteriol., 158:79-83(1984)])를 포함한다. 슈도모나스 스페시즈(균주 600)로부터의 효소를 암호화하는 유전자가 클로닝되고 에스케리키아 콜라이에서 발현되었다(문헌[Shingler et al. J Bacteriol. 174:711-724(1992)]).
Figure pct00041
신나메이트(페닐아크릴레이트) 및 치환된 신나메이트 유도체의 상응하는 스타이렌 유도체로의 전환을 촉매화하는 추가 부류의 데카복실라제들이 특성화되었다. 이들 효소는 다양한 유기체들에 공통이며, 에스케리키아 콜라이에서 클로닝되고 발현된 이들 효소를 암호화하는 특정 유전자들은 하기와 같다: 사카로마이세스 세레비지아에로부터의 pad 1(문헌[Clausen et al., Gene, 142:107-112(1994)]), 락토바실러스 플란타룸으로부터의 pdc(문헌[Barthelmebs et al., Appl. Environ. Microbiol., 67:1063-1069(2001); Qi et al. Metab Eng 9:268-276(2007); Rodriguez et al., J. Agric. Food Chem., 56:3068-3072(2008)]), 클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca)(문헌[Hashidoko et al. Biosci. Biotech. Biochem. 58:217-218(1994); Uchiyama et al. Biosci. Biotechnol. Biochem. 72:116-123(2008)]), 페디코커스 펜토사세우스(Pedicoccus pentosaceus)(문헌[Barthelmebs et al. Appl Environ Microbiol 67:1063-1069(2001)])로부터의 pofK ( pad), 및 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 퓨밀루스(Bacillus pumilus)로부터의 padC(문헌[Lingen et al. Protein Eng 15:585-593(2002)]). 슈도모나스 플루오레센스로부터의 페룰산 데카복실라제가 또한 정제되고 특성화되었다(문헌[Huang et al., J. Bacteriol., 176:5912-5918(1994)]). 중요하게, 상기 부류의 효소들은 안정한 것으로 입증되었으며 외래 또는 내부적으로 결합된 보조 인자들을 필요로 하지 않고, 따라서 이는 이들 효소를 생물 형질전환에 이상적으로 적합하게 만든다(문헌[Sariaslani, Annu. Rev. Microbiol., 61:51-69(2007)]).
Figure pct00042
추가의 데카복실라제 효소들은 알파-케토글루타레이트로부터 숙시닉 세미알데하이드를 형성할 수 있다. 이들은 유글레나 그라실리스(Euglena gracilis)(문헌[Shigeoka et al. Biochem. J. 282(Pt2):319-323(1992); Shigeoka and Nakano Arch. Biochem. Biophys. 288:22-28(1991); Shigeoka and Nakano Biochem. J. 292(Pt2):463-467(1993)])(상응하는 유전자 서열은 아직 측정되지 않았다) 및 마이코박테리움 튜베르큘로시스(문헌[Tian et al. Proc Natl Acad Sci USA 102:10670-10675(2005)])로부터의 알파-케토글루타레이트 데카복실라제 효소를 포함한다. 또한, 글루타메이트 데카복실라제 효소들은 글루타메이트를 4-아미노부티레이트, 예를 들어 에스케리키아 콜라이 gadA 및 gadB 유전자의 산물들로 전환할 수 있다(문헌[De Biase et al., Protein. Expr. Purif. 8:430-438(1993)]).
Figure pct00043
케토산 데카복실라제
피루베이트 데카복실라제(PDC, EC 4.1.1.1)(또한 케토산 데카복실라제로 지칭됨)는 알콜 발효에 핵심 효소이며, 피루베이트의 아세트알데하이드로의 탈카복실화를 촉매화한다. 상기 효소는 2-케토부티레이트, 2-케토발레레이트, 3-하이드록시피루베이트 및 2-페닐피루베이트를 포함한 지방족 2-케토산에 대해 광범위한 기질 범위를 갖는다(문헌[Berg et al. Science 318:1782-1786(2007)]). pdc에 의해 암호화되는, 자이모모나스 모빌루스(Zymomonas mobilus)로부터의 PDC는 상이한 기질들에 대한 친화성 변경에 지정된 공학 연구의 주제였다(문헌[Siegert et al., Protein Eng. Des. Sel., 18:345-357(2005)]). 사카로마이세스 세레비지아에로부터의 PDC가 또한 변경된 활성에 대해 광범위하게 연구되고, 조작되었으며, 에스케리키아 콜라이에서 작용적으로 발현되었다(문헌[Killenberg-Jabs et al. Eur. J. Biochem. 268:1698-1704(2001); Li and Jordan Biochemistry 38:10004-10012(1999); ter Schure et al. Appl. Environ. Microbiol. 64:1303-1307(1998)]). 상기 효소의 결정 구조를 입수할 수 있다(문헌[Killenberg-Jabs et al. Eur. J. Biochem. 268:1698-1704(2001)]). 다른 잘-특성화된 PDC 후보는 아세토박터 파스퇴리안스(Acetobacter pasteurians)(문헌[Chandra et al., Arch. Microbiol. 176:443-451(2001)]) 및 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)(문헌[Krieger et al., Eur. J. Biochem., 269:3256-3263(2002)])로부터의 효소들을 포함한다.
Figure pct00044
PDC처럼, 벤조일포메이트 데카복실라제(EC 4.1.1.7)는 광범위한 기질 범위를 가지며 효소 공학 연구의 표적이었다. 슈도모나스 푸티다로부터의 효소가 광범위하게 연구되어 왔으며 상기 효소의 결정 구조를 입수할 수 있다(문헌[Hasson et al., Biochemistry, 37:9918-9930(1998); Polovnikova et al., Biochemistry 42:1820-1830(2003)]). 상기 슈도모나스 푸티다 효소의 활성 부위 중 2 개 잔사의 부위-지정된 돌연변이는 천연 및 비-천연 기질들의 친화성(Km)을 변경시켰다(문헌[Siegert et al., Protein Eng. Des. Sel., 18:345-357(2005)]). 상기 효소의 성질들은 지정된 공학에 의해 추가로 개질되었다(문헌[Lingen et al., Protein Eng., 15:585-593(2002); Lingen et al., Chembiochem 4:721-726(2003)]). mdlC에 의해 암호화되는, 슈도모나스 아에루기노사로부터의 효소가 또한 실험적으로 특성화되었다(문헌[Barrowman et al., FEMS Micriobiol Letters, 34:57-60(1986)]). 슈도모나스 스투트제리(Pseudomonas stutzeri), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) 및 다른 유기체들로부터의 추가의 유전자들이 서열 상동성에 의해 추리되거나 또는 슈도모나스 푸티다에서 개발된 생육 선택 시스템을 사용하여 동정될 수 있다(문헌[Henning et al., Appl. Environ. Microbiol., 72:7510-7512(2006)]).
Figure pct00045
4.2.1.a - 하이드로 - 라이아제
유박테리움 발케리(Eubacterium barkeri)의 2-(하이드록시메틸)글루타레이트 데하이드라타제는 예시적인 하이드로-라이아제이다. 상기 효소는 니코티나제 이화작용과 관련하여 연구되었으며 hmd에 의해 암호화된다(문헌[Alhapel et al. Proc Natl Acad Sci USA 103:12341-12346(2006)]). 높은 서열 상동성을 갖는 유사한 효소들이 박테로이데스 카필로수스(Bacteroides capillosus), 아나에로트렁쿠스 콜리호미니스(Anaerotruncus colihominis), 및 나트라나에로비우스 써모필루스(Natranaerobius thermophilius)에서 발견된다.
Figure pct00046
두 번째 예시적인 하이드로-라이아제는 말레이트에서 퓨마레이트로의 탈수를 촉매화하는 효소인 퓨마레이트 하이드라타제이다. 상기 효소에 대한 구조 정보를 다량으로 입수할 수 있으며 다른 연구자들은 상기 효소를 활성, 억제 및 국소화가 변경되도록 성공적으로 조작하였다(문헌[Weaver, T Acta Crystallorgr. D Biol. Crystallogr., 61:1395-1401(2005)]). 추가의 퓨마레이트 하이드라타제는 에스케리키아 콜라이(문헌[Estevez et al. Protein Sci. 11:1552-1557(200); Hong and Lee Biotechnol. Bioprocess Eng. 9:252-255(2004); Rose and Weaver Proc Natl Acad Sci USA 101:3393-3397(2004)]), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)(문헌[Smith et al., Int. J. Biochem. Cell Biol., 31:961-975(1999)]), 및 써무스 써모필루스(문헌[Mizobata et al., Arch. Biochem. Biophys., 355:49-55(1998)])로부터의 fumC 및 라투스 노르베기쿠스(문헌[Kobayashi et al., J. Biochem., 89:1923-1931(1981)])로부터의 fumH에 의해 암호화되는 것들을 포함한다. 높은 서열 상동성을 갖는 유사한 효소들은 아라비도프시스 탈리아나로부터의 fum1 및 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터의 fumC를 포함한다.
Figure pct00047
2-메틸말레이트 데하이드라타제로도 지칭되는 시트라말레이트 하이드롤리아제는 2-메틸말레이트를 메사코네이트로 전환한다. 2-메틸말레이트 데하이드라타제 활성은 글루타메이트 분해 VI 경로와 관련하여 클로스트리듐 테타노몰품(Clostridium tetanomorphum), 모르가넬라 모르가니이(Morganella morganii), 시트로박터 아말로나티쿠스(Citrobacter amalonaticus)에서 검출되었으나(문헌[Kato and Asano Arch. Microbiol 168:457-463(1997)]); 상기 효소를 암호화하는 유전자는 지금까지 서열화되지 않았다.
클로스트리듐 아세토부틸리쿰으로부터의 crt의 유전자 산물은 3-하이드록시부티릴-CoA의 크로토닐-CoA로의 탈수를 촉매화한다(문헌[Atsumi et al. Metab Eng.; 29(2007); Boynton et al. Journal of Bacteriology 178:3015-3024(1996)]). 상기 슈도모나스 푸티다의 에노일-CoA 하이드라타제, phaA 및 phaB는 페닐아세테이트 이화 작용 중에 이중 결합의 하이드록실화를 수행하는 것으로 여겨진다(문헌[Olivera et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 95(11):6419-6424(1998)]). 슈도모나스 플루오레센스로부터의 paaA 및 paaB는 유사한 형질전환을 촉매화한다(14 상기 Olivera et al., 1998). 마지막으로, 다수의 에스케리키아 콜라이 유전자들이 maoC(문헌[Park and Lee, J. Bacteriol., 185(18):5391-5398(2003)), paaF(Park and Lee Biotechnol Bioeng., 86(6):681-686(2004a); Park and Lee Appl. Biochem. Biotechnol., 113-116:335-346(2004b); Ismail et al., Eur. J. Biochem., 270(14):3047-3054(2003)]) 및 paaG(상기 Ismail et al.(2003); 상기 Park et al.(2004); 상기 Park et al.(2004b))를 포함한 에노일-CoA 하이드라타제 작용기들을 나타내는 것으로 입증되었다.
Figure pct00048
에스케리키아 콜라이 유전자 fadA 및 fadB는 케토아실-CoA 티올라제, 3-하이드록시아실-CoA 데하이드로게나제, 및 에노일-CoA 하이드라타제 활성을 나타내는 다중효소 복합체를 암호화한다(문헌[Yang et al. Biochemistry 30(27):p. 6788-6795(1991); Yang et al. J Biol Chem 265(18): p. 10424-10429(1990); Yang et al. J Biol Chem 266(24): p. 16255(1991); Nakahigashi and Inokuchi Nucleic Acids Res 18(16): p. 4937(1990)]). 상기 fadI 및 fadJ 유전자는 유사한 작용들을 암호화하며 혐기성 조건 하에서 자연적으로 발현된다(문헌[Campbell et al. Mol Microbiol 47(3): p. 793-805(2003)]). fadB를 활성화하고(음의 조절 인자, fadR을 녹아웃시킴으로써) 비-고유 케토티올라제(랄스토니아 유트로파로부터의 phaA)를 함께 발현시킴을 수반하는 에스케리키아 콜라이 중의 폴리[(R)-3-하이드록시부티레이트의 제조 방법은 앞서 개시되었다(문헌[Sato et al. J Biosci Bioeng 103(1):38-44(2007)]). 상기 연구는 β-산화 효소, 특히 3-하이드록시아실-CoA 데하이드로게나제와 에노일-CoA 하이드라타제 활성을 모두 암호화하는 fadB의 유전자 산물이 아세틸-CoA 전구체로부터 보다 긴 쇄 분자를 생산하도록 하는 경로의 일부로서 작용할 수 있다.
Figure pct00049
4.3.1.a - 암모니아- 라이아제
아스파테이트에서 퓨마레이트로의 탈아민화를 촉매화하는 아스파타제(EC 4.3.1.1)는 미생물 중에 만연된 효소이며, 광범위하게 특성화되었다(문헌[Viola, R.E. Adv. Enzymol. Relat Areas Mol. Biol 74:295-341(2000)]). aspA에 의해 암호화되는 에스케리키아 콜라이의 결정 구조가 풀렸다(문헌[Shi et al. Biochemistry 36:9136-9144(1997)]). 상기 에스케리키아 콜라이 효소는 또한 또 다른 기질 아스파테이트페닐메틸에스터, 아스파라진, 벤질-아스파테이트 및 말레이트와 반응하는 것으로 나타났다(문헌[Ma et al. Ann N.Y. Acad Sci 672:60-65(1992)]). 별도의 연구에서, 기질 특이성을 변경시키기 위해 상기 효소에 대해 방향 진화가 사용되었다(문헌[Asano et al. Biomol. Eng 22:95-101(2005)]). 아스파타제 작용성을 갖는 효소가 또한 하에모필루스 인플루엔자에(문헌[Sjostrom et al. Biochim. Biophys. Acta 1324:182-190(1997)]), 슈도모나스 플루오레센스(문헌[Takagi et al. J. Biochem. 96:545-552(1984)]), 바실러스 서브틸루스(문헌[Sjostrom et al. Biochim. Biophys. Acta 1324:182-190(1997)]), 및 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens)(문헌[Takagi and Kisumi J Bacteriol. 161:1-6(1985)])에서 특성화되었다.
Figure pct00050
3-메틸아스파타제(EC 4.3.1.2)(또한 베타-메틸아스파타제 또는 3-메틸아스파테이트 암모니아-라이아제로서도 공지됨)는 쓰레오-3-메틸아스파테이트의 메사코네이트로의 탈아민화를 촉매화한다. 클로스트리듐 테타노몰품으로부터의 3-메틸아스파타제가 클로닝되고, 에스케리키아 콜라이에서 작용적으로 발현되었으며, 결정화되었다(문헌[Asuncion et al. Acta Crystallogr. D Biol Crystallogr. 57:731-733(2001); Asuncion et al. J Biol Chem. 277:8306-8311(2002); Botting et al. Biochemistry 27:2953-2955(1988); Goda et al. Biochemistry 31:10747-10756(1992)]). 시트로박터 아말로나티쿠스(Citrobacter amalonaticus)에서, 상기 효소는 BAA28709에 의해 암호화된다(문헌[Kato and Asano Arch. Microbiol 168:457-463(1997)]). 3-메틸아스파타제는 또한 에스케리키아 콜라이 YG1002(문헌[Asano and Kato FEMS Microbiol Lett. 118:255-258(1994)])로부터 결정화되었지만 상기 단백질 서열은 젠뱅크와 같은 공개 데이터베이스에 나열되어 있지 않다. 서열 상동성을 사용하여 클로스트리듐 테타니 중의 CTC _02563 및 에스케리키아 콜라이 O157:H7 중의 ECs0761을 포함한, 추가의 후보 유전자들을 동정할 수 있다.
Figure pct00051
에노일-CoA 산물을 형성하는 암모니아-라이아제 효소는 베타-알라닐-CoA 암모니아-라이아제(EC 4.3.1.6)(베타-알라닐-CoA를 탈아민화한다), 및 3-아미노부티릴-CoA 암모니아-라이아제(EC 4.3.1.14)를 포함한다. 2 개의 베타-알라닐-CoA 암모니아 라이아제가 동정되었으며 클로스트리듐 프로피오니쿰에서 특성화되었다(문헌[Hermann et al. FEBS J. 272:813-821(2005)]). 지금까지 다른 베타-알라닐-CoA 암모니아 라이아제가 연구되지는 않았지만, 서열 유사성에 의해 유전자 후보들을 동정할 수 있다. 하나의 상기와 같은 후보는 믹소코커스 잔투스(Myxococcus xanthus) 중의 MXAN_4385이다.
Figure pct00052
5.3.3.a - 아이소머라제
클로스트리듐 아미노부티리움 및 클로스트리듐 클루이베리 모두로부터의 4-하이드록시부티릴-CoA 데하이드라타제는 4-하이드록시부티릴-CoA의 크로토닐-CoA로의 가역적인 전환을 촉매화하고 비닐아세틸-CoA Δ-아이소머라제 활성을 갖는다(문헌[Scherf and Buckel, Eur. J. Biochem., 215:421-429(1993); Scherf et al., Arch. Microbiol., 161:239-245(1994)]). 상기 두 고유 효소들은 N-말단 아미노산 서열을 포함하여, 정제되고 특성화되었다(상기 문헌[Scherf and Buckel, 1993; 상기 Scherf et al.(1994)]). 클로스트리듐 아미노부티리움(Clostridium . aminobutyrium) 및 클로스트리듐 클루이베리로부터의 abfD 유전자는 상기 N-말단 아미노산 서열과 정확히 합치하며, 따라서 4-하이드록시부티룰-CoA 데하이드라타제/비닐아세틸-CoA Δ-아이소머라제를 암호화한다. 또한, 포르피로모나스 진지발리스 ATCC 33277로부터의 abfD 유전자가 게놈 프로젝트로부터 상동성을 통해 동정된다.
Figure pct00053
5.4.3.a - 아미노뮤타제
리신 2,3-아미노뮤타제(EC 5.4.3.2)는 리신을 (3S)-3,6-다이아미노헥사노에이트로 전환하여, 아민 그룹을 2번 위치에서 3번 위치로 이동시키는 예시적인 아미노뮤타제이다. 상기 효소는 푸소박테리움 눌레아툼(Fusobacterium nuleatum)(kamA)(문헌[Barker et al. J. Bacteriol. 152:201-207(1982)]) 및 클로스트리듐 서브터미날레(Clostridium subterminale )( kamA)(Chirpich et al. J. Biol. Chem. 245:1778-1789(1970))을 포함하여, 리신을 아세테이트 및 부티레이트로 발효시키는 세균에서 발견된다. 상기 클로스트리듐 서브터미날레로부터의 효소는 결정화되었다(문헌[Lepore et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:13819-13824(2005)]). 상기 작용을 암호화하는 효소는 바실러스 서브틸루스 중의 yodO에 의해 또한 암호화된다(문헌[Chen et al. Biochem. J. 348 Pt 3:539-549(2000)]). 상기 효소는 보조 인자로서 피리독살 5'-포스페이트를 사용하고, S-아데노실메토이오닌에 의한 활성화를 필요로 하며, 입체 선택성이어서, L-리신과만 반응한다. 상기 효소가 또 다른 기질과 반응하는 것은 입증되지 않았다.
Figure pct00054
두 번째 아미노뮤타제인 베타-리신 5,6-아미노뮤타제(EC 5.4.3.3)는 아세테이트 및 부티레이트로의 다음 리신 발효 단계를 촉매화하며, (3S)-3,6-다이아미노헥사노에이트를 (3S,5S)-3,5-다이아미노헥사노에이트로 전환시키고, 말단 아민 그룹을 6번 위치에서 5번 위치로 이동시킨다. 상기 효소는 또한 리신의 2,5-다이아미노헥사노에이트로의 전환을 촉매화하고, 또한 리신-5,6-아미노뮤타제(EC 5.4.3.4)로서 지칭된다. 상기 효소는 클로스트리듐 스틱클란디이(kamD, kamE)에서 결정화되었다(문헌[Berkovitch et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:15870-15875(2004)]). 포르피로모나스 진지발리스로부터의 상기 효소가 또한 특성화되었다(문헌[Tang et al. Biochemistry 41:8767-8776(2002)]).
Figure pct00055
오르니틴 4,5-아미노뮤타제(EC 5.4.3.5)는 D-오르니틴을 2,4-다이아미노펜타노에이트로 전환시키고, 또한 말단 아민을 인접 탄소로 이동시킨다. 클로스트리듐 스틱클란디이로부터의 효소는 2 개의 유전자, oraE 및 oraS에 의해 암호화되며, 에스케리키아 콜라이에서 클로닝되고, 서열화되고, 발현되었다(문헌[Chen et al. J. Biol. Chem. 276:44744-44750(2001)]). 상기 효소는 지금까지 다른 유기체에서 특성화되지 않았다.
Figure pct00056
타이로신 2,3-아미노뮤타제(EC 5.4.3.6)는 타이로신 생합성에 관여하여, 아민을 2번 위치에서 3번 위치로 이동시킴으로써 타이로신을 3-아미노-3-(4-하이드록시페닐)프로파노에이트로 가역적으로 전환시킨다. 스트렙토마이세스 글로비스포루스(Streptomyces globisporus)에서, 상기 효소는 또한 타이로신 유도체와 반응하는 것으로 나타났다(문헌[Christenson et al. Biochemistry 42:12708-12718(2003)]). 서열 정보는 입수할 수 없다.
류신 2,3-아미노뮤타제(EC 5.4.3.7)는 류신 분해 및 생합성 동안 L-류신을 베타-류신으로 전환시킨다. 류신 2,3-아미노뮤타제에 대한 분석은 다수의 유기체들에서 활성을 검출하였으나(문헌[Poston, J.M. Methods Enzymol. 166:130-135(1988)]) 상기 효소를 암호화하는 유전자는 지금까지 동정되지 않았다.
카길은 L-알라닌을 β-알라닌으로 전환시키는 신규의 2,3-아미노뮤타제 효소를 개발하였으며, 따라서 4 개의 생화학적 단계로 피루베이트로부터 3-HP로의 경로를 생성시켰다(Liao et al., 미국 공보 2005-0221466).
6.2.1.a - 산- 티올 리가제
예시적인 산-티올 리가제는 생체 내에서 가역적인 반응인, 1 ATP의 동반 소비와 함께 숙시네이트로부터의 숙시닐-CoA의 형성을 함께 촉매화하는 에스케리키아 콜라이의 sucCD의 유전자 산물이다(문헌[Buck et al. Biochemistry 24(22): p. 6245-6252(1985)]). 추가의 예시적인 CoA-리가제는 래트 다이카복실레이트-CoA 리가제(서열은 아직 특성화되지 않았다)(문헌[Vamecq et al. Biochem J. 230(3): p. 683-693(1985)]), 페니실리움 크리소게눔(Penicillium chrysogenum)으로부터의 2 개의 특성화된 페닐아세테이트-CoA 리가제 중 어느 하나(문헌[Lamas-Maceiras et al. Biochem J 395(1):147-155(2006); Wang et al. Biochem Biophys Res Commun, 360(2):453-458(2007)]), 슈도모나스 푸티다로부터의 페닐아세테이트-CoA 리가제(문헌[Martinez-Blanco et al. J Biol Chem. 265(12): 7084-7090(1990)]), 및 바실러스 서브틸리스로부터의 6-카복시헥사노에이트-CoA 리가제(문헌[Bower et al. J Bacteriol 178(14):4122-4130(1996)])를 포함한다.
Figure pct00057
실시예 V
숙시닐 - CoA 로부터 예시적인 BDO 경로
본 실시예는 숙시닐-CoA로부터 예시적인 BDO 경로를 개시한다.
숙시닐-CoA로부터의 BDO 경로는 본 발명에 개시되어 있으며 앞서 개시되었다(2008년 3월 14일자로 출원된 미국 출원 제 12/049,256 호, 및 2008년 3월 14일자로 출원된 PCT 출원 제 US08/57168 호 참조, 이들은 각각 본 발명에 참고로 인용된다). 추가의 경로들을 도 8a에 도시한다. 상기와 같은 예시적인 BDO 경로의 효소들을, 상기 효소들을 암호화하는 예시적인 유전자들과 함께 표 15에 나열한다.
간단히, 숙시닐-CoA를 숙시닐-CoA 리덕타제(또는 숙시네이트 세미알데하이드 데하이드록나제)(EC 1.2.1.b)에 의해 숙시닉 세미알데하이드로 전환시킬 수 있다. 숙시네이트 세미알데하이드를 앞서 개시된 바와 같이 4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제(EC 1.1.1.a)에 의해 4-하이드록시부티레이트로 전환시킬 수 있다. 한편으로, 숙시닐-CoA를 숙시닐-CoA 리덕타제(알콜 형성)(EC 1.1.1.c)에 의해 4-하이드록시부티레이트로 전환시킬 수 있다. 4-하이드록시부티레이트를 앞서 개시한 바와 같이 4-하이드록시부티릴-CoA 트랜스퍼라제(EC 2.8.3.a)에 의해 또는 4-하이드록시부티릴-CoA 하이드롤라제(EC 3.1.2.a) 또는 4-하이드록시부티릴-CoA 리가제(또는 4-하이드록시부티릴-CoA 신시타제)(EC 6.2.1.a)에 의해 4-하이드록시부티릴-CoA로 전환시킬 수 있다. 한편으로, 4-하이드록시부티레이트를 앞서 개시한 바와 같이, 4-하이드록시부티레이트 키나제(EC 2.7.2.a)에 의해 4-하이드록시부티릴-포스페이트로 전환시킬 수 있다. 4-하이드록시부티릴-포스페이트를 앞서 개시한 바와 같이, 포스포트랜스-4-하이드록시부티릴라제(EC 2.3.1.a)에 의해 4-하이드록시부티릴-CoA로 전환시킬 수 있다. 한편으로, 4-하이드록시부티릴-포스페이트를 4-하이드록시부탄알 데하이드로게나제(인산화)(EC 1.2.1.d)에 의해 4-하이드록시부탄알로 전환시킬 수 있다. 4-하이드록시부티릴-CoA를 4-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(또는 4-하이드록시부탄알 데하이드로게나제)(EC 1.2.1.b)에 의해 4-하이드록시부탄알로 전환시킬 수 있다. 한편으로, 4-하이드록시부티릴-CoA를 4-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(알콜 형성)(EC 1.1.1.c)에 의해 1,4-부탄다이올로 전환시킬 수 있다. 4-하이드록시부탄알을 앞서 개시한 바와 같이, 1,4-부탄다이올 데하이드로게나제(EC 1.1.1.a)에 의해 1,4-부탄다이올로 전환시킬 수 있다.
Figure pct00058
Figure pct00059
Figure pct00060
Figure pct00061
Figure pct00062
실시예 VI
알파- 케토글루타레이트로부터 추가의 예시적인 BDO 경로
본 실시예는 알파-케토글루타레이트로부터 예시적인 BDO 경로를 개시한다.
숙시닐-CoA로부터의 BDO 경로는 본 발명에 개시되어 있으며 앞서 개시되었다(2008년 3월 14일자로 출원된 미국 출원 제 12/049,256 호, 및 2008년 3월 14일자로 출원된 PCT 출원 제 US08/57168 호 참조, 이들은 각각 본 발명에 참고로 인용된다). 추가의 경로들을 도 8b에 도시한다. 상기와 같은 예시적인 BDO 경로의 효소들을, 상기 효소들을 암호화하는 예시적인 유전자들과 함께 표 16에 나열한다.
간단히, 알파-케토글루타레이트를 앞서 개시한 바와 같이, 알파-케토글루타레이트 데카복실라제(EC 4.1.1.a)에 의해 숙시닉 세미알데하이드로 전환시킬 수 있다. 한편으로, 알파-케토글루타레이트를 글루타메이트 데하이드로게나제(EC 1.4.1.a)에 의해 글루타메이트로 전환시킬 수 있다. 4-아미노부티레이트를 4-아미노부티레이트 옥시도리덕타제(탈아민화)(EC 1.4.1.a) 또는 4-아미노부티레이트 트랜스아미나제(EC 2.6.1.a)에 의해 숙시닉 세미알데하이드로 전환시킬 수 있다. 글루타메이트를 글루타메이트 데카복실라제(EC 4.1.1.a)에 의해 4-아미노부티레이트로 전환시킬 수 있다. 숙시네이트 세미알데하이드를 앞서 개시한 바와 같이, 4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제(EC 1.1.1.a)에 의해 4-하이드록시부티레이트로 전환시킬 수 있다. 4-하이드록시부티레이트를 앞서 개시한 바와 같이 4-하이드록시부티릴-CoA 트랜스퍼라제(EC 2.8.3.a)에 의해 또는 4-하이드록시부티릴-CoA 하이드롤라제(EC 3.1.2.a) 또는 4-하이드록시부티릴-CoA 리가제(또는 4-하이드록시부티릴-CoA 신시타제)(EC 6.2.1.a)에 의해 4-하이드록시부티릴-CoA로 전환시킬 수 있다. 4-하이드록시부티레이트를 4-하이드록시부티레이트 키나제(EC 2.7.2.a)에 의해 4-하이드록시부티릴-포스페이트로 전환시킬 수 있다. 4-하이드록시부티릴-포스페이트를 앞서 개시한 바와 같이, 포스포트랜스-4-하이드록시부티릴라제(EC 2.3.1.a)에 의해 4-하이드록시부티릴-CoA로 전환시킬 수 있다. 한편으로, 4-하이드록시부티릴-포스페이트를 4-하이드록시부탄알 데하이드로게나제(인산화)(EC 1.2.1.d)에 의해 4-하이드록시부탄알로 전환시킬 수 있다. 4-하이드록시부티릴-CoA를 앞서 개시한 바와 같이, 4-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(또는 4-하이드록시부탄알 데하이드로게나제)(EC 1.2.1.b)에 의해 4-하이드록시부탄알로 전환시킬 수 있다. 4-하이드록시부티릴-CoA를 4-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(알콜 형성)(EC 1.1.1.c)에 의해 1,4-부탄다이올로 전환시킬 수 있다. 4-하이드록시부탄알을 앞서 개시한 바와 같이, 1,4-부탄다이올 데하이드로게나제(EC 1.1.1.a)에 의해 1,4-부탄다이올로 전환시킬 수 있다.
Figure pct00063
Figure pct00064
Figure pct00065
Figure pct00066
Figure pct00067
실시예 VII
4- 아미노부티레이트로부터 BDO 경로
본 실시예는 4-아미노부티레이트로부터 예시적인 BDO 경로를 개시한다.
도 9a는 4-아미노부티레이트를 BDO로 전환시키는 예시적인 BDO 경로를 도시한다. 상기와 같은 예시적인 BDO 경로의 효소들을, 상기 효소들을 암호화하는 예시적인 유전자들과 함께 표 17에 나열한다.
간단히, 4-아미노부티레이트를 4-아미노부티레이트-CoA 트랜스퍼라제(EC 2.8.3.a), 4-아미노부티릴-CoA 하이드롤라제(EC 3.1.2.a) 또는 4-아미노부티레이트-CoA 리가제(또는 4-아미노부티릴-CoA 신시타제)(EC 6.2.1.a)에 의해 4-아미노부티릴-CoA로 전환시킬 수 있다. 4-아미노부티릴-CoA를 4-아미노부티릴-CoA 옥시도리덕타제(탈아민화)(EC 1.4.1.a) 또는 4-아미노부티릴-CoA 트랜스아미나제(EC 2.6.1.a)에 의해 4-옥소부티릴-CoA로 전환시킬 수 있다. 4-옥소부티릴-CoA를 4-하이드록시부티릴-CoA 데하이드로게나제(EC 1.1.1.a)에 의해 4-하이드록시부티릴-CoA로 전환시킬 수 있다. 4-하이드록시부티릴-CoA를 4-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(알콜 형성)(EC 1.1.1.c)에 의해 1,4-부탄다이올로 전환시킬 수 있다. 한편으로, 4-하이드록시부티릴-CoA를 4-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(또는 4-하이드록시부탄알 데하이드로게나제)(EC 1.2.1.b)에 의해 4-하이드록시부탄알로 전환시킬 수 있다. 4-하이드록시부탄알을 1,4-부탄다이올 데하이드로게나제(EC 1.1.1.a)에 의해 1,4-부탄다이올로 전환시킬 수 있다.
Figure pct00068
Figure pct00069
Figure pct00070
Figure pct00071
4-아미노부티레이트를 BDO로 전환시키는 또 다른 예시적인 BDO 경로에 대한 효소들을 도 9a에 도시한다. 상기와 같은 예시적인 BDO 경로의 효소들을, 상기 효소들을 암호화하는 예시적인 유전자들과 함께 표 18에 나열한다.
간단히, 4-아미노부티레이트를 4-아미노부티레이트-CoA 트랜스퍼라제(EC 2.8.3.a), 4-아미노부티릴-CoA 하이드롤라제(EC 3.1.2.a) 또는 4-아미노부티레이트-CoA 리가제(또는 4-아미노부티릴-CoA 신시타제)(EC 6.2.1.a)에 의해 4-아미노부티릴-CoA로 전환시킬 수 있다. 4-아미노부티릴-CoA를 4-아미노부티릴-CoA 리덕타제(알콜 형성)(EC 1.1.1.c)에 의해 4-아미노부탄-1-올로 전환시킬 수 있다. 한편으로, 4-아미노부티릴-CoA를 4-아미노부티릴-CoA 리덕타제(또는 4-아미노부탄알 데하이드로게나제)(EC 1.2.1.b)에 의해 4-아미노부탄알로 전환시키고, 4-아미노부탄알을 4-아미노부탄-1-올 데하이드로게나제(EC 1.1.1.a)에 의해 4-아미노부탄-1-올로 전환시킬 수 있다. 4-아미노부탄-1-올을 4-아미노부탄-1-올 옥시도리덕타제(탈아민화)(EC 1.4.1.a) 또는 4-아미노부탄-1-올 트랜스아미나제(EC 2.6.1.a)에 의해 4-하이드록시부탄알로 전환시킬 수 있다. 4-하이드록시부탄알을 1,4-부탄다이올 데하이드로게나제(EC 1.1.1.a)에 의해 1,4-부탄다이올로 전환시킬 수 있다.
Figure pct00072
Figure pct00073
Figure pct00074
Figure pct00075
도 9b는 4-아미노부티레이트를 BDO로 전환시키는 또 다른 예시적인 BDO 경로에 대한 효소들을 도시한다. 상기와 같은 예시적인 BDO 경로의 효소들을, 상기 효소들을 암호화하는 예시적인 유전자들과 함께 표 19에 나열한다.
간단히, 4-아미노부티레이트를 4-아미노부티레이트 키나제(EC 2.7.2.a)에 의해 [(4-아미노부탄올일)옥시] 포스폰산으로 전환시킬 수 있다. [(4-아미노부탄올일)옥시] 포스폰산을 4-아미노부티르알데하이드 데하이드로게나제(인산화)(EC 1.2.1.d)에 의해 4-아미노부탄알로 전환시킬 수 있다. 4-아미노부탄알을 4-아미노부탄-1-올 데하이드로게나제(EC 1.1.1.a)에 의해 4-아미노부탄-1-올로 전환시킬 수 있다. 4-아미노부탄-1-올을 4-아미노부탄-1-올 옥시도리덕타제(탈아민화)(EC 1.4.1.a) 또는 4-아미노부탄-1-올 트랜스아미나제(EC 2.6.1.a)에 의해 4-하이드록시부탄알로 전환시킬 수 있다. 한편으로, [(4-아미노부탄올일)옥시] 포스폰산을 [(4-아미노부탄올일)옥시] 포스폰산 옥시도리덕타제(탈아민화)(EC 1.4.1.a) 또는 [(4-아미노부탄올일)옥시] 포스폰산 트랜스아미나제(EC 2.6.1.a)에 의해 [(4-옥소부탄올일)옥시] 포스폰산으로 전환시킬 수 있다. [(4-옥소부탄올일)옥시] 포스폰산을 4-하이드록시부티릴-포스페이트 데하이드로게나제(EC 1.1.1.a)에 의해 4-하이드록시부티릴-포스페이트로 전환시킬 수 있다. 4-하이드록시부티릴-포스페이트를 4-하이드록시부티르알데하이드 데하이드로게나제(인산화)(EC 1.2.1.d)에 의해 4-하이드록시부탄알로 전환시킬 수 있다. 4-하이드록시부탄알을 1,4-부탄다이올 데하이드로게나제(EC 1.1.1.a)에 의해 1,4-부탄다이올로 전환시킬 수 있다.
Figure pct00076
Figure pct00077
Figure pct00078
Figure pct00079
도 9c는 아세토아세테이트를 통한 예시적인 경로를 도시한다.
실시예 VIII
알파- 케토글루타레이트로부터 예시적인 BDO 경로
본 실시예는 알파-케토글루타레이트로부터 예시적인 BDO 경로를 개시한다.
도 10은 알파-케토글루타레이트를 BDO로 전환시키는 예시적인 BDO 경로를 도시한다. 상기와 같은 예시적인 BDO 경로의 효소들을, 상기 효소들을 암호화하는 예시적인 유전자들과 함께 표 20에 나열한다.
간단히, 알파-케토글루타레이트를 알파-케토글루타레이트 5-키나제(EC 2.7.2.a)에 의해 알파-케토글루타릴-포스페이트로 전환시킬 수 있다. 알파-케토글루타릴-포스페이트를 2,5-다이옥소펜타노익 세미알데하이드 데하이드로게나제(인산화)(EC 1.2.1.d)에 의해 2,5-다이옥소펜탄산으로 전환시킬 수 있다. 2,5-다이옥소펜탄산을 2,5-다이옥소펜탄산 리덕타제(EC 1.1.1.a)에 의해 5-하이드록시-2-옥소펜탄산으로 전환시킬 수 있다. 한편으로, 알파-케토글루타레이트를 알파-케토글루타레이트 CoA 트랜스퍼라제(EC 2.8.3.a), 알파-케토글루타릴-CoA 하이드롤라제(EC 3.1.2.a) 또는 알파-케토글루타릴-CoA 리가제(또는 알파-케토글루타릴-CoA 신시타제)(EC 6.2.1.a)에 의해 알파-케토글루타릴-CoA로 전환시킬 수 있다. 알파-케토글루타릴-CoA를 알파-케토글루타릴-CoA 리덕타제(또는 2,5-다이옥소펜탄산 데하이드로게나제)(EC 1.2.1.b)에 의해 2,5-다이옥소펜탄산으로 전환시킬 수 있다. 2,5-다이옥소펜탄산을 5-하이드록시-2-옥소펜탄산 데하이드로게나제에 의해 5-하이드록시-2-옥소펜탄산으로 전환시킬 수 있다. 한편으로, 알파-케토글루타릴-CoA를 알파-케토글루타릴-CoA 리덕타제(알콜 형성)(EC 1.1.1.c)에 의해 5-하이드록시-2-옥소펜탄산으로 전환시킬 수 있다. 5-하이드록시-2-옥소펜탄산을 5-하이드록시-2-옥소펜탄산 데카복실라제(EC 4.1.1.a)에 의해 4-하이드록시부탄알로 전환시킬 수 있다. 4-하이드록시부탄알을 1,4-부탄다이올 데하이드로게나제(EC 1.1.1.a)에 의해 1,4-부탄다이올로 전환시킬 수 있다. 5-하이드록시-2-옥소펜탄산을 5-하이드록시-2-옥소펜탄산 데하이드로게나제(탈카복실화)(EC 1.2.1.c)에 의해 4-하이드록시부티릴-CoA로 전환시킬 수 있다.
Figure pct00080
Figure pct00081
Figure pct00082
Figure pct00083
Figure pct00084
실시예 IX
글루타메이트로부터 예시적인 BDO 경로
본 실시예는 글루타메이트로부터 예시적인 BDO 경로를 개시한다.
도 11은 글루타메이트를 BDO로 전환시키는 예시적인 BDO 경로를 도시한다. 상기와 같은 예시적인 BDO 경로의 효소들을, 상기 효소들을 암호화하는 예시적인 유전자들과 함께 표 21에 나열한다.
간단히, 글루타메이트를 글루타메이트 CoA 트랜스퍼라제(EC 2.8.3.a), 글루타밀-CoA 하이드롤라제(EC 3.1.2.a) 또는 글루타밀-CoA 리가제(또는 글루타밀-CoA 신시타제)(EC 6.2.1.a)에 의해 글루타밀-CoA로 전환시킬 수 있다. 한편으로, 글루타메이트를 글루타메이트 5-키나제(EC 2.7.2.a)에 의해 글루타메이트-5-포스페이트로 전환시킬 수 있다. 글루타메이트-5-포스페이트를 글루타메이트-5-세미알데하이드 데하이드로게나제(인산화)(EC 1.2.1.d)에 의해 글루타메이트-5-세미알데하이드로 전환시킬 수 있다. 글루타밀-CoA를 글루타밀-CoA 리덕타제(또는 글루타메이트-5-세미알데하이드 데하이드로게나제)(EC 1.2.1.b)에 의해 글루타메이트-5-세미알데하이드로 전환시킬 수 있다. 글루타메이트-5-세미알데하이드를 글루타메이트-5-세미알데하이드 리덕타제(EC 1.1.1.a)에 의해 2-아미노-5-하이드록시펜탄산으로 전환시킬 수 있다. 한편으로, 글루타밀-CoA를 글루타밀-CoA 리덕타제(알콜 형성)(EC 1.1.1.c)에 의해 2-아미노-5-하이드록시펜탄산으로 전환시킬 수 있다. 2-아미노-5-하이드록시펜탄산을 2-아미노-5-하이드록시펜탄산 옥시도리덕타제(탈아민화)(EC 1.4.1.a) 또는 2-아미노-5-하이드록시펜탄산 트랜스아미나제(EC 2.6.1.a)에 의해 5-하이드록시-2-옥소펜탄산으로 전환시킬 수 있다. 5-하이드록시-2-옥소펜탄산을 5-하이드록시-2-옥소펜탄산 데카복실라제(EC 4.1.1.a)에 의해 4-하이드록시부탄알로 전환시킬 수 있다. 4-하이드록시부탄알을 1,4-부탄다이올 데하이드로게나제(EC 1.1.1.a)에 의해 1,4-부탄다이올로 전환시킬 수 있다. 한편으로, 5-하이드록시-2-옥소펜탄산을 5-하이드록시-2-옥소펜탄산 데하이드로게나제(탈카복실화)(EC 1.2.1.c)에 의해 4-하이드록시부티릴-CoA로 전환시킬 수 있다.
Figure pct00085
Figure pct00086
Figure pct00087
Figure pct00088
Figure pct00089
Figure pct00090
실시예 X
아세토아세틸 - CoA 로부터 예시적인 BDO 경로
본 실시예는 아세토아세틸-CoA로부터 예시적인 BDO 경로를 개시한다.
도 12는 아세토아세틸-CoA를 BDO로 전환시키는 예시적인 BDO 경로를 도시한다. 상기와 같은 예시적인 BDO 경로의 효소들을, 상기 효소들을 암호화하는 예시적인 유전자들과 함께 표 22에 나열한다.
간단히, 아세토아세틸-CoA를 3-하이드록시부티릴-CoA 데하이드로게나제(EC 1.1.1.a)에 의해 3-하이드록시부티릴-CoA로 전환시킬 수 있다. 3-하이드록시부티릴-CoA를 3-하이드록시부티릴-CoA 데하이드로게나제(EC 4.2.1.a)에 의해 크로토노일-CoA로 전환시킬 수 있다. 크로토노일-CoA를 비닐아세틸-CoA Δ-아이소머라제(EC 5.3.3.3)에 의해 비닐아세틸-CoA로 전환시킬 수 있다. 비닐아세틸-CoA를 4-하이드록시부티릴-CoA 데하이드라타제(EC 4.2.1.a)에 의해 4-하이드록시부티릴-CoA로 전환시킬 수 있다. 4-하이드록시부티릴-CoA를 4-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(알콜 형성)(EC 1.1.1.c)에 의해 1,4-부탄다이올로 전환시킬 수 있다. 한편으로, 4-하이드록시부티릴-CoA를 4-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(또는 4-하이드록시부탄알 데하이드로게나제)(EC 1.2.1.b)에 의해 4-하이드록시부탄알로 전환시킬 수 있다. 4-하이드록시부탄알을 1,4-부탄다이올 데하이드로게나제(EC 1.1.1.a)에 의해 1,4-부탄다이올로 전환시킬 수 있다.
Figure pct00091
Figure pct00092
Figure pct00093
실시예 XI
호모세린으로부터 예시적인 BDO 경로
본 실시예는 호모세린으로부터 예시적인 BDO 경로를 개시한다.
도 13은 호모세린을 BDO로 전환시키는 예시적인 BDO 경로를 도시한다. 상기와 같은 예시적인 BDO 경로의 효소들을, 상기 효소들을 암호화하는 예시적인 유전자들과 함께 표 23에 나열한다.
간단히, 호모세린을 호모세린 데아미나제(EC 4.3.1.a)에 의해 4-하이드록시부트-2-에노에이트로 전환시킬 수 있다. 한편으로, 호모세린을 호모세린 CoA 트랜스퍼라제(EC 2.8.3.a), 호모세린-CoA 하이드롤라제(EC 3.1.2.a) 또는 호모세린-CoA 리가제(또는 호모세린-CoA 신시타제)(EC 6.2.1.a)에 의해 호모세린-CoA로 전환시킬 수 있다. 호모세린-CoA를 호모세린-CoA 데아미나제(EC 4.3.1.a)에 의해 4-하이드록시부트-2-에노일-CoA로 전환시킬 수 있다. 4-하이드록시부트-2-에노에이트를 4-하이드록시부트-2-에노일-CoA 트랜스퍼라제(EC 2.8.3.a), 4-하이드록시부트-2-에노일-CoA 하이드롤라제(EC 3.1.2.a) 또는 4-하이드록시부트-2-에노일-CoA 리가제(또는 4-하이드록시부트-2-에노일-CoA 신시타제)(EC 6.2.1.a)에 의해 4-하이드록시부트-2-에노일-CoA로 전환시킬 수 있다. 한편으로, 4-하이드록시부트-2-에노에이트를 4-하이드록시부트-2-에노에이트 리덕타제(EC 1.3.1.a)에 의해 4-하이드록시부티레이트로 전환시킬 수 있다. 4-하이드록시부티레이트를 4-하이드록시부티릴-CoA 트랜스퍼라제(EC 2.8.3.a), 4-하이드록시부티릴-CoA 하이드롤라제(EC 3.1.2.a) 또는 4-하이드록시부티릴-CoA 리가제(또는 4-하이드록시부티릴-CoA 신시타제)(EC 6.2.1.a)에 의해 4-하이드록시부티릴-CoA로 전환시킬 수 있다. 4-하이드록시부트-2-에노일-CoA를 4-하이드록시부트-2-에노일-CoA 리덕타제(EC 1.3.1.a)에 의해 4-하이드록시부티릴-CoA로 전환시킬 수 있다. 4-하이드록시부티릴-CoA를 4-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(알콜 형성)(EC 1.1.1.c)에 의해 1,4-부탄다이올로 전환시킬 수 있다. 한편으로, 4-하이드록시부티릴-CoA를 4-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제(또는 4-하이드록시부탄알 데하이드로게나제)(EC 1.2.1.b)에 의해 4-하이드록시부탄알로 전환시킬 수 있다. 4-하이드록시부탄알을 1,4-부탄다이올 데하이드로게나제(EC 1.1.1.a)에 의해 1,4-부탄다이올로 전환시킬 수 있다.
Figure pct00094
Figure pct00095
Figure pct00096
Figure pct00097
Figure pct00098
Figure pct00099
실시예 XII
숙시닐 - CoA 신시타제를 발현하는 BDO 생산 균주
본 실시예는 숙시닐-CoA 신시타제를 발현하는 BDO 생산 균주에서 BDO의 증가된 생산을 개시한다.
상기 논의된 바와 같이, 숙시네이트는 숙시닐-CoA로의 전환에 의한 BDO의 생산을 위한 전구체일 수 있다(또한 WO2008/115840, WO 2009/023493, 미국 공보 2009/0047719, 미국 공보 2009/0075351 참조). 따라서, 숙주 균주는, 숙시닐-CoA 신시타제를 암호화하는 에스케리키아 콜라이 sucCD 유전자를 과발현하도록 유전자 변형되었다. 상기 에스케리키아 콜라이 sucCD 오페론의 뉴클레오타이드 서열을 도 14에 도시하며, 상기 암호화된 숙시닐-CoA 신시타제 서브유닛에 대한 아미노산 서열은 도 14B 및 14C에 도시한다. 간단히, 상기 에스케리키아 콜라이 sucCD 유전자를 에스케리키아 콜라이 염색체 DNA로부터 PCR에 의해 클로닝하고 표준 분자 생물학 과정을 사용하여 PA1lacO-1 프로모터 뒤에, 다중사본 플라스미드 pZS*13, pZA13 및 pZE33 내로 도입시켰다(문헌[Lutz and Bujard, Nucleic Acids Res. 25:1203-1210(1997)]).
상기 숙시닐-CoA 신시타제를 암호화하는 에스케리키아 콜라이 sucCD 유전자가 과발현되었다. 상기 결과는 숙시닐-CoA 신시타제를 발현시키기 위해 상기 균주에 sucCD를 도입시키는 것이 고유 발현 수준 또는 cat1(숙시닐-CoA/아세틸-CoA 트랜스퍼라제이다)의 발현에 비해 다양한 균주에서 BDO 생산을 개선시킴을 보였다. 따라서, 상기 숙시닐-CoA 신시타제를 암호화하는 고유 에스케리키아 콜라이 sucCD 유전자를 과발현시킴으로써 BDO 생산을 개선시켰다.
실시예 XIII
BDO 경로 효소를 암호화하는 이종 유전자의 발현
본 실시예는 BDO의 개선된 생산을 제공하기 위한 다양한 비-고유 경로 효소들의 발현을 개시한다.
알파- 케토글루타레이트 데카복실라제 .
알파-케토글루타레이트 데카복실라제를 암호화하는 마이코박테리움 보비스 sucA 유전자를 숙주 균주에서 발현시켰다. 마이코박테리움 보비스 sucA의 과발현은 BDO 생산을 개선시켰다(또한 WO2008/115840, WO 2009/023493, 미국 공보 2009/0047719, 미국 공보 2009/0075351 참조). 마이코박테리움 보비스 sucA의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 도 15에 도시한다.
마이코박테리움 보비스 sucA 발현 균주를 제작하기 위해서, 상기 알파-케토글루타레이트 데카복실라제를 암호화하는 sucA 유전자의 단편을 하기 나타낸 프라이머들을 사용하여 마이코박테리움 보비스 BCG(ATCC 19015; American Type Culture Collection, Manassas VA, USA)의 게놈 DNA로부터 증폭시켰다. 완전 길이 유전자를 4 개의 증폭된 DNA 단편들의 연결 반응에 의해 조립하고, PA1lacO -1 프로모터 뒤에, 발현 벡터 pZS*13 및 pZE23 내로 클로닝시켰다(Lutz and Bujard, Nucleic Acids Res. 25:1203-1210(1997)). 상기 조립된 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 DNA 서열화에 의해 확인하였다.
단편 1의 프라이머:
5'-ATGTACCGCAAGTTCCGC-3'(서열번호)
5'-CAATTTGCCGATGCCCAG-3'(서열번호)
단편 2의 프라이머:
5'-GCTGACCACTGAAGACTTTG-3'(서열번호)
5'-GATCAGGGCTTCGGTGTAG-3'(서열번호)
단편 3의 프라이머:
5'-TTGGTGCGGGCCAAGCAGGATCTGCTC-3'(서열번호)
5'-TCAGCCGAACGCCTCGTCGAGGATCTCCTG-3'(서열번호)
단편 4의 프라이머:
5'-TGGCCAACATAAGTTCACCATTCGGGCAAAAC-3'(서열번호)
5'-TCTCTTCAACCAGCCATTCGTTTTGCCCG-3'(서열번호)
상기 알파-케토글루타레이트 데카복실라제의 작용성 발현을 시험관 내 및 생체 내 분석 모두를 사용하여 입증하였다. SucA 효소 활성을 앞서 보고된 방법에 따라 측정하였다(Tian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:10670-10675(2005)). 상기 반응 혼합물은 50 mM 칼륨 포스페이트 완충제, pH 7.0, 0.2 mM 티아민 피로포스페이트, 1 mM MgCl2, 0.8 mM 페리시아나이드, 1 mM 알파-케토글루타레이트 및 세포 조 용해물을 함유하였다. 상기 효소 활성을 430 ㎚에서 페리시아나이드의 환원에 의해 모니터하였다. 상기 SucA 효소의 생체 내 작용을 에스케리키아 콜라이 완전-세포 배양물을 사용하여 확인하였다. 상기 SucA 효소 및 4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제(4Hbd)를 암호화하는 플라스미드로 형질전환된 에스케리키아 콜라이 MG1655 lacIQ의 단일 콜로니를 적합한 항생제를 함유하는 5 ㎖의 LB 배지에 접종하였다. 상기 세포를 37 ℃에서 밤새 호기성 하에서 배양하였다. 200 uL의 상기 밤샘 배양물을, 20 g/L 글루코스, 완충 용량을 개선시키기 위한 100 mM 3-(N-모폴리노)프로판설폰산(MOPS), 10 ㎍/㎖ 티아민, 및 적합한 항생제가 보충된 M9 최소 배지(6.78 g/L Na2HPO4, 3.0 g/L KH2PO4, 0.5 g/L NaCl, 1.0 g/L NH4Cl, 1 mM MgSO4, 0.1 mM CaCl2) 8 ㎖에 도입시켰다. 미세호기성 조건을, 상기 접종에 이어서 먼저, 캡핑된 혐기성 병을 5 분간 질소로 플러싱시키고, 이어서 상기 격막을 23G 바늘로 천공하여 확립시켰다. 상기 바늘을 증식하는 동안 상기 병에서 유지시켜 소량의 공기가 상기 병 안으로 들어가게 하였다. 상기 배양물이 중간 대수 증식기에 도달했을 때 0.2 mM 아이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)로 단백질 발현을 유도하였다. 대조군으로서, 단지 4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제를 함유하는 플라스미드만으로, 및 단지 빈 벡터만으로 형질전환시킨 에스케리키아 콜라이 MG1655 lacIq 균주를 동일한 조건 하에서 배양하였다(표 23 참조). 상기 배양 배지 중의 4-하이드록시부티레이트(4HB)의 축적을 LCMS 방법을 사용하여 모니터하였다. 상기 마이코박테리움 알파-케토글루타레이트 데카복실라제를 발현하는 에스케리키아 콜라이 균주만이 현저한 양의 4HB를 생산하였다(도 16 참조).
다양한 플라스미드 대조군들을 함유하고 sucA 및 4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제를 암호화하는 3 개의 균주
숙주 pZE13 pZA33
1 MG1655 lacIq 벡터 벡터
2 MG1655 lacIq 벡터 4hbd
3 MG1655 lacIq sucA 4hbd
별도의 실험은 상기 알파-케토글루타레이트 데카복실라제 경로가 상기 환원적 TCA 주기와 독립적으로 작용함을 입증한다. 에스케리키아 콜라이 균주 ECKh-401(ΔadhE ΔldhA ΔpflB ΔlpdA::K.p.lpdA322 Δmdh ΔarcA)을 숙주 균주로서 사용하였다(표 25 참조). 상기 3 개의 구조물은 모두 4HB 데하이드로게나제(4Hbd)를 암호화하는 유전자를 함유하였다. 구조물 1은 알파-케토글루타레이트 데카복실라제(sucA)를 암호화하는 유전자를 또한 함유하였다. 구조물 2는 숙시닐-CoA 신시타제(sucCD) 및 CoA-의존성 숙시네이트 세미알데하이드 데하이드로게나제(sucD)를 암호화하는 유전자들을 함유하였으며, 이들 유전자는 상기 환원적 TCA 주기를 통한 4HB의 합성에 필요하다. 구조물 3은 1 및 2로부터의 모든 유전자들을 함유한다. 상기 3 개의 에스케리키아 콜라이 균주를 상술한 바와 동일한 조건 하에서 배양하였으나, 단 상기 두 번째 배양물은 미세호기성 조건 하에 있었다. 상기 SucA 효소를 발현시킴으로써, 구조물 3은 구조물 2(4HB 합성을 위해 상기 환원적 TCA 주기에 의존한다)보다 더 많은 4HB를 생산하였다(도 17 참조).
4HB 및 BDO의 생산을 위한 알파-케토글루타레이트 데카복실라제의 기여에 대한 추가의 지지가 흐름 분석 실험에 의해 제공되었다. 염색체상에 sucCD - sucD 및 sucA 모두를 함유하는 ECKh-432의 배양물을 1-13C-글루코스(60%) 및 U-13C-글루코스(40%)의 혼합물을 함유하는 M9 최소 배지에서 증식시켰다. 상기 바이오매스를 수확하고, 상기 단백질을 단리하고 아미노산으로 가수분해시키며, 상기 아미노산의 표지 분포를 앞서 개시한 바와 같이(문헌[Fischer and Sauer, Eur. J. Biochem. 270:880-891(2003)]) 기체 크로마토그래피-질량 분광측정(GCMS)에 의해 분석하였다. 또한, 상기 분비된 4HB 및 BDO의 표지 분포를 WO2008115840 A2에 개시된 바와 같이 GCMS에 의해 분석하였다. 상기 데이터를 사용하여 확립된 방법으로 세포 내 흐름 분포를 계산하였다(문헌[Suthers et al., Metab. Eng. 9:387-405(2007)]). 상기 결과는 상기 알파-케토글루타레이트의 56% 내지 84%가 알파-케토글루타레이트 데카복실라제를 통해 BDO 경로로 흘러들어감을 가리켰다. 나머지는 알파-케토글루타레이트 데하이드로게나제에 의해 산화되었고, 이는 이어서 숙시닐-CoA 경로를 통해 BDO로 들어갔다.
이들 결과는 마이코박테리움 보비스 BCG로부터의 sucA 유전자를 함유하는 4-하이드록시부티레이트 생산 균주가 플라스미드 상에서 발현됨을 입증한다. 상기 유전자를 암호화하는 플라스미드가 존재하지 않는 경우, 4-하이드록시부티레이트 생산은 sucD(CoA-의존성 숙시네이트 세미알데하이드 데하이드로게나제)가 발현되지 않을 때 무시할만하다. 상기 마이코박테리움 보비스 유전자는 앞서 특성화된(상기 Tian et al., 2005) 효소 생성물을 갖는 마이코박테리움 튜베르큘로시스 유전자와 가까운 동족체이다.
숙시네이트 세미알데하이드 데하이드로게나제 ( CoA -의존성), 4- 하이드록시부티레이트 데하이드로게나제 , 및 4- 하이드록시부티릴 - CoA /아세틸- CoA 트랜스퍼라제
상기 포르피로모나스 진지발리스 W83으로부터의 유전자는 1,4-부탄다이올 생산 경로에 유효한 성분들일 수 있다(또한 WO2008/115840, WO 2009/023493, 미국 공보 2009/0047719, 미국 공보 2009/0075351 참조). 포르피로모나스 진지발리스로부터의 CoA-의존성 숙시네이트 세미알데하이드 데하이드로게나제(sucD)의 뉴클레오타이드 서열을 도 18A에 도시하며, 상기 암호화된 아미노산 서열은 도 18B에 도시한다. 포르피로모나스 진지발리스로부터의 4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제(4 hbd)의 뉴클레오타이드 서열을 도 19A에 도시하며, 상기 암호화된 아미노산 서열은 도 19B에 도시한다. 포르피로모나스 진지발리스로부터의 4-하이드록시부티레이트 CoA 트랜스퍼라제(cat2)의 뉴클레오타이드 서열을 도 20A에 도시하며, 상기 암호화된 아미노산 서열은 도 20B에 도시한다.
간단히, 숙시네이트 세미알데하이드 데하이드로게나제(CoA-의존성) 및 4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제, 및 일부의 경우 추가로 4-하이드록시부티릴-CoA/아세틸-CoA를 암호화하는 포르피로모나스 진지발리스 W83으로부터의 유전자를 포르피로모나스 진지발리스 염색체 DNA로부터 PCR에 의해 클로닝하고 표준 분자 생물학 과정을 사용하여 PA1lacO-1 프로모터 뒤에, 다중사본 플라스미드 pZS*13, pZA13 및 pZE33 내로 도입시켰다(문헌[Lutz and Bujard, Nucleic Acids Res. 25:1203-1210(1997)]). 이어서 이들 플라스미드를 숙주 균주 내로 도입시켰다.
상기 포르피로모나스 진지발리스 W83 유전자를 상술한 바와 같이 생산 균주에 도입시켰다. 일부 균주는 4-하이드록시부티릴-CoA/아세틸-CoA 트랜스퍼라제 없이 오직 숙시네이트 세미알데하이드 데하이드로게나제(CoA-의존성) 및 4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제만을 포함하였다.
부티레이트 키나제 및 포스포트랜스부티릴라제
부티레이트 키나제(BK) 및 포스포트랜스부티릴라제(PTB) 효소를 사용하여 4-하이드록시부티릴-CoA를 생산할 수 있다(또한 WO2008/115840, WO 2009/023493, 미국 공보 2009/0047719, 미국 공보 2009/0075351 참조). 특히, 상기 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 유전자, buk1 및 ptb를 작용성 BDO 경로의 일부로서 사용할 수 있다.
초기 실험은 에스케리키아 콜라이 중의 고유 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 PTB(020) 및 BK(021)의 클로닝 및 발현을 수반하였다. 경우에 따라, 각 유전자에 대한 개시 코돈 및 정지 코돈을 에스케리키아 콜라이에서의 보다 최적의 발현을 위해 "ATG" 및 "TAA"로 변형시켰다. 상기 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 유전자 서열(020N 및 021N) 및 이들의 상응하는 번역된 펩타이드 서열을 도 21 및 22에 도시한다.
상기 PTB 및 BK 유전자는 오페론으로서 클로스트리듐 아세토부틸리쿰에 존재하며, 이때 PTB(020) 유전자가 먼저 발현된다. 상기 두 유전자는 하부 BK(021) 유전자에 대한 재개시 리보솜 결합 부위를 포함하는 서열 "atta aagttaagtg gaggaatgtt aac"에 의해 연결된다. 이와 관련하여 상기 두 유전자는 에스케리키아 콜라이에서의 발현을 위한 발현 벡터 중의 lac-조절된 프로모터에 융합되었다(문헌[Lutz and Bujard, Nucleic Acids Res. 25:1203-1210(1997)]).
이들 벡터 구조물로부터의 상기 두 단백질의 발현은 상기 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 중에서의 높은 코돈 발생률로 인해(에스케리키아 콜라이에서는 단지 드물게 발생한다) 다른 외부적으로 발현된 유전자들에 비해 낮은 것으로 밝혀졌다. 따라서 에스케리키아 콜라이 유전자 서열 중에 보다 고도로 나타나는 대체물로 희귀 코돈을 교환한 새로운 020 및 021 유전자가 예측되었다. 상기 코돈 최적화 방법에 이어서 앞서 개시된 연산이 수행되었다(문헌[Sivaraman et al., Nucleic Acids Res. 36:e16(2008)]). 상기 방법은 어느 한 쪽에 몇몇 코돈들이 측면 인접할 때 발생 빈도와 관련하여 코돈 치환을 예측한다. 증가하는 수의 희귀 코돈을 이웃하는 코돈 상황에서 발생률에 근거하여 보다 우세한 코돈들로 대체한(A<B<C<D) 020(도 23) 및 021(도 24)에 대한 또 다른 유전자 서열들이 결정되었다. 고유 020 및 021 펩타이드 서열에 비해 변화가 없는 실제 펩타이드 서열을 이들 예측된 서열에 도입시켰다.
코돈 최적화로부터 생성되는 상기 BK 및 PTB 단백질의 발현의 개선을 도 25A에 도시한다. 상기 고유 유전자 서열의 발현을 레인 2에 도시하는 반면, 020B - 021B 및 020C - 021C의 발현은 각각 레인 3 및 4에 도시한다. 상기 코돈-최적화된 오페론 020B - 021B(2021B) 및 020C - 021C(2021C)에서의 단백질 발현의 보다 높은 수준은 또한 동등하게 발현된 에스케리키아 콜라이 조 추출물 중의 고유 오페론(2021n)에 비해 증가된 활성을 생성시켰다(도 25B).
코돈 최적화된 오페론을 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 알데하이드 데하이드로게나제와 함께 균주 ECKh-432(ΔadhE ΔldhA ΔpflB ΔlpdA::K.p.lpdA322 Δmdh ΔarcA gltAR163L fimD::에스케리키아 콜라이 sucCD, 포르피로모나스 진지발리스 sucD, 포르피로모나스 진지발리스 4 hbd fimD::마이코박테리움 보비스 sucA, 클로스트리듐 클루이베리 4 hbd) 중의 플라스미드 상에서 발현시켜 완전한 BDO 경로를 제공하였다. 세포를 상술한 바와 같이 미세호기성 조건을 유지시키기 위해 23G 바늘을 사용하여, 20 g/L 글루코스를 함유하는 M9 최소 배지에서 배양하였다. 생성되는 글루코스에서 최종 생성물 BDO로의 전환을 측정하였다. 또한 감마-부티릴락톤(GBL)(상기 PTB-BK 효소 쌍의 중간 산물인 4Hb-CoA로부터 유도된 자발적으로 재배열된 분자이다)의 축적을 측정하였다. 도 26은 고유 2021n 오페론의 발현이 4HB 및 유리 CoA를 4HB-CoA로 전환시킬 수 있는 또 다른 효소 작용, Cat2(034)에 필적할만한 BDO 수준을 생성시켰음을 보인다. 034의 GBL 수준은 2021n보다 현저하게 더 높았으며, 이는 선행 효소가 고유 유전자로부터 발현된 PTB-BK보다 더 큰 활성을 가짐을 암시한다. 그러나 BDO 및 GBL 모두의 수준은 코돈-최적화된 변체 2021B 및 2021C가 발현될 때 034 또는 2021n보다 더 높았으며, 이는 상기 PTB 및 BK에 대한 유전자의 코돈 최적화가 에스케리키아 콜라이에서 BDO 합성에 대한 그들의 기여를 현저하게 증가시킴을 가리킨다.
상기 결과는 부티레이트 키나제(BK) 및 포스포트랜스부티릴라제(PTB) 효소를 사용하여 4-하이드록시부티레이트를 4-하이드록시부티릴-CoA로 전환시킬 수 있음을 입증한다. 이는 4-하이드록시부티릴-CoA/아세틸-CoA 트랜스퍼라제와 같은 트랜스퍼라제 효소(이는 생성된 4-하이드록시부티릴-CoA 몰당 1 몰의 아세테이트를 생성시킬 것이다)에 대한 필요성을 제거한다. 클로스트리듐 아세토부틸리쿰으로부터의 효소들은 BDO 생산에 대해 조작된 다수의 균주들 중에 존재한다.
4- 하이드록시부티릴 - CoA 리덕타제
클로스트리듐 베이제링키이 ald 유전자를 작용성 BDO 경로의 일부로서 사용할 수 있다(또한 WO2008/115840, WO 2009/023493, 미국 공보 2009/0047719, 미국 공보 2009/0075351 참조). 상기 클로스트리듐 베이제링키이 ald를 또한 BDO 생산 균주에서 에탄올 생산을 낮추는데 사용할 수 있다. 또한, 특정한 코돈-최적화된 ald 변체(GNM0025B)가 BDO 생산을 개선시키는 것으로 밝혀졌다.
상기 고유 클로스트리듐 베이제링키이 ald 유전자(025n) 및 상기 효소의 예측된 단백질 서열을 도 27에 도시한다. 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 PTB 및 BK 유전자에 대해 나타낸 바와 같이, 고유 클로스트리듐 베이제링키이 ald 유전자의 발현은 에스케리키아 콜라이에서 매우 낮았다. 따라서, 상기 유전자의 4 개의 코돈 최적화된 변체들이 예측되었다. 도 28A 내지 28D는 증가하는 수의 희귀 코돈을 이웃하는 코돈 상황에서의 그의 발생률을 근거로 보다 우세한 코돈들(A<B<C<D)로 대체한, 025에 대한 또 다른 유전자 서열들을 나타낸다(25A, P=0.05; 25B: P=0.1; 25C, P=0.15; 25D, P=1). 고유 025 펩타이드 서열에 비해 변화가 없는 실제 펩타이드 서열을 상기 예측에 도입하였다. 코돈 최적화는 상기 클로스트리듐 베이제링키이 ald 의 발현을 현저하게 증가시켰으며(도 29 참조), 이는 전체 BDO 경로를 발현하는 세포에서 글루코스에서 BDO로의 현저하게 더 큰 전환을 생성시켰다(도 30a).
상기 고유 및 코돈 최적화된 유전자들을 숙주 균주 ECKh-432(ΔadhE ΔldhA ΔpflB ΔlpdA::K.p.lpdA322 Δmdh ΔarcA gltAR163L fimD::에스케리키아 콜라이 sucCD, 포르피로모나스 진지발리스 sucD, 포르피로모나스 진지발리스 4 hbd fimD::마이코박테리움 보비스 sucA, 클로스트리듐 클루이베리 4 hbd) 중에서, 포르피로모나스 진지발리스 Cat2와 함께 플라스미드 상에서 발현시켰으며, 따라서 완전한 BDO 경로를 함유하였다. 세포를 상술한 바와 같이 20 g/L 글루코스를 함유하는 M9 최소 배지에서 배양하였다. 상기 클로스트리듐 베이제링키이 Ald 효소(코돈 최적화된 변체 유전자 025B로부터 발현됨)에 의한 BDO 및 에탄올의 상대적인 생산을 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 AdhE2 효소와 비교하였다(도 30b 참조). 상기 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 AdhE2 효소(002C)는 BDO보다 거의 4 배 더 많은 에탄올을 생성시켰다. 비교 시, 상기 클로스트리듐 베이제링키이 Ald(025B)(내생적인 ADH 활성과 함께)는 동등한 양의 BDO를 생성시켰지만, BDO 대 에탄올 생산의 비는 002C에 비해 상기 효소의 경우 역전되었다. 이는 클로스트리듐 베이제링키이 Ald가 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 AdhE2보다 아세틸-CoA에 대해 4HB-CoA에 더 특이적임을 암시하며, 따라서 전자가 BDO 경로에 포함시키기에 바람직한 효소임을 암시한다.
클로스트리듐 베이제링키이 ald 유전자(문헌[Toth et al., Appl. Environ. Microbiol. 65:4973-4980(1999)])를 4-하이드록시부티릴-CoA에서 4-하이드록시부탄알로의 전환을 촉매화하는 후보로서 시험하였다. 50 개가 넘는 알데하이드 데하이드로게나제를 4-하이드록시부티릴-CoA의 4-하이드록시부티르알데하이드로의 전환을 촉매화하는 능력에 대해 선별하였다. 클로스트리듐 베이제링키이 ald 유전자를, 아세틸-CoA에 상반되는 기질로서 4-하이드록시부티릴-CoA에 대한 상기 효소의 선호로 인해 BDO-생산 균주 내로 실행시키기 위해 선택하였다. 이는 알데하이드 데하이드로게나제 작용성(예를 들어 클로스트리듐 아세토부틸리쿰으로부터의 adhE2(문헌[Fontaine et al., J Bacteriol. 184:821-830(2002)])을 갖는 대부분의 다른 효소들이 우선적으로 아세틸-CoA를 아세트알데하이드로 전환시키고, 차례로 에탄올로 전환시키기 때문에 중요하다. 상기 클로스트리듐 베이제링키이 유전자의 사용은 BDO 생산 유기체에서 부산물로서 생산되는 에탄올의 양을 낮춘다. 또한, 상기 유전자의 코돈 최적화된 버전은 에스케리키아 콜라이에서 매우 잘 발현된다(문헌[Sivaraman et al., Nucleic Acids Res. 36:e16(2008)]).
4- 하이드록시부탄알 리덕타제
제오바실러스 써모글루코시다시우스(M10EXG)로부터의 adh1의 4-하이드록시부탄알 리덕타제 활성을 사용하였다. 이는 4-하이드록시부탄알 리덕타제 활성을 내생적인 수준 이상으로 증가시킴으로써 개선된 BDO 생산을 도출하였다.
다수의 알콜 데하이드로게나제를 4-하이드록시부탄알의 BDO로의 환원을 촉매화하는 능력에 대해 선별하였다. 부티르알데하이드에 대해 높은 활성을 갖는 대부분의 알콜 데하이드로게나제들은 4-하이드로시부티르알데하이드에 대해 훨씬 더 낮은 활성을 나타내었다. 하나의 주목할 만한 예외는 제오바실러스 써모글루코시다시우스 M10EXG로부터의 adh1 유전자이며(문헌[Jeon et al., J. Biotechnol. 135:127-133(2008)])(GNM0084), 이는 4-하이드록시부탄알 및 부탄알 모두에 대해 높은 활성을 나타낸다.
제오바실러스 써모글루코시다시우스로부터의 adh1 유전자의 고유 유전자 서열 및 암호화된 단백질 서열을 도 31에 도시한다. 상기 제오바실러스 써모글루코시다시우스 adh1 유전자를 에스케리키아 콜라이에서 발현시켰다.
상기 Adh1 효소(084)는 에스케리키아 콜라이에서 그의 고유 유전자로부터 매우 잘 발현되었다(도 32a 참조). ADH 효소 분석에서, 상기 에스케리키아 콜라이 발현된 효소는 부티르알데하이드 또는 4HB-알데하이드를 기질로서 사용한 경우 매우 높은 환원 활성을 나타내었다(도 32b 참조). 이들 기질에 대해 측정된 Km 값은 각각 1.2 mM 및 4.0 mM이었다. 이들 활성 값은 상기 Adh1 효소가 시험된 모든 후보들의 4HB-알데하이드의 환원에 대해 가장 활성임을 보였다.
상기 084 효소를 상기 클로스트리듐 베이제링키이 ald와 결합 시 BDO 생산을 증대시키는 그의 능력에 대해 시험하였다. 상기 084 유전자를 상기 클로스트리듐 베이제링키이 ald 변체 025B 유전자 뒤에 삽입하여 합성 오페론을 생성시켜 상기 두 유전자의 결합된 발현을 생성시켰다. 유사한 구조물들이 025B를 다른 ADH 후보 유전자들과 결합시켰으며, BDO 생산에 대한, 025B와 각 ADH의 포함 효과를 시험하였다. 사용된 숙주 균주는 ECKh-432(ΔadhE ΔldhA ΔpflB ΔlpdA::fnr-pflB6-K.p.lpdA322 Δmdh ΔarcA gltAR163L fimD::에스케리키아 콜라이 sucCD, 포르피로모나스 진지발리스 sucD, 포르피로모나스 진지발리스 4 hbd fimD::마이코박테리움 보비스 sucA, 클로스트리듐 클루이베리 4 hbd fimD::클로스트리듐 아세토부틸리쿰 buk1, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ptb)이었으며, 이는 염색체상에 BDO 경로의 나머지를 함유한다. 025B와 함께 발현된 084 ADH는 단지 025B(도 33의 좌측 화살표) 및 내생적인 ADH 작용에 비해 최고 량의 BDO(도 33의 우측 화살표)를 나타내었다. 상기는 또한 025B와 짝을 이루었을 때 하기와 같은 다른 ADH 효소들보다 더 많은 BDO를 생산하였다: 026A-C, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 부탄올 데하이드로게나제의 코돈 최적화된 변체; 050, 자이모모나스 모빌리스 알콜 데하이드로게나제 I; 052, 시트로박터 프레운디이 1,3-프로판다이올 데하이드로게나제; 053, 락토바실러스 브레비스 1,3-프로판다이올 데하이드로게나제; 057, 박테로이데스 프라질리스 락트알데하이드 리덕타제; 058, 에스케리키아 콜라이 1,3-프로판다이올 데하이드로게나제; 071, 바실러스 서브틸리스 168 알파-케토글루타레이트 세미알데하이드 데하이드로게나제. "PT5lacO" 표지된 구조물은 유전자가 PT5lacO 프로모터에 의해 구동되는 것이다. 다른 모든 경우에, PA1lacO-1 프로모터를 사용하였다. 이는 상기 BDO 경로 중에 084 ADH의 포함이 BDO 생산을 증가시켰음을 보인다.
실시예 XIV
피루베이트 데하이드로게나제를 발현하는 BDO 생산 균주
본 실시예는 BDO 생산을 향상시키기 위한 피루베이트 데하이드로게나제(PDH)의 사용을 개시한다. 클렙시엘라 뉴모니아 lpdA 유전자의 이종 발현을 사용하여 BDO 생산을 향상시켰다.
계산상, 피루베이트의 아세틸-CoA로의 NADH-생성 전환이 1,4-부탄다이올의 최대 이론 수율의 도달에 요구된다(WO2008/115840, WO2009/023493, 미국 공보 2009/0047719, 미국 공보 2009/0075351; WO 2008/018930; 문헌[Kim et al. Appl. Environ. Microbiol. 73:1766-1771(2007); Kim et al. J. Bacteriol. 190:3851-3858(2008); Menzel et al., J. Biotechnol. 56:135-142(1997)]). PDH 활성의 결여는 BDO의 최대 혐기성 이론 수율을, 포스포에놀피루베이트 카복시키나제(PEPCK) 활성이 획득될 수 없는 경우 11%까지, PEPCK 활성을 획득할 수 있는 경우 3%까지 감소시키는 것으로 나타났다. 그러나, 보다 중요하게는, 옵트녹 균주 #439(WO 2009/023493 및 미국 공보 2009/0047719에 개시됨, ADHEr, ASPT, LDH_D, MDH 및 PFLi의 녹아웃을 가짐)에서 PDH 활성의 부재는 PEPCK 활성이 부재하거나 존재하는 경우 BDO의 최대 혐기성 수율을 각각 54% 또는 43%까지 감소시킬 것이다. 외부 전자 수용체의 존재 하에서, PDH 활성의 결여는 PEPCK 활성이 부재하거나 존재하는 것을 가정할 때 상기 녹아웃 균주의 최대 수율을 각각 10% 또는 3%까지 감소시킬 것이다.
PDH는 중심 대사의 가장 복잡한 효소들 중 하나이며 24 사본 수의 피루베이트 데카복실라제(E1) 및 12 분자의 다이하이드롤리포일 데하이드로게나제(E3)(다이하이드롤리포일 트랜스아세틸라제(E2) 코어의 외부에 결합한다)를 포함한다. PDH는 높은 NADH/NAD, ATP/ADP, 및 아세틸-CoA/CoA 비에 의해 억제된다. 상기 효소는 자연적으로 에스케리키아 콜라이와 같은 유기체 중에서 산소 제한되거나 혐기성 조건 하에 대부분, lpdA에 의해 암호화된 E3의 NADH 민감성으로 인해 매우 낮은 활성을 나타낸다. 이 때문에, 상기 NADH/NAD 비가 높을 것으로 예상되는 조건 하에서 PDH의 활성을 증가시키기 위해 클렙시엘라 뉴모니아로부터의 lpdA 유전자의 NADH-둔감성 버전을 클로닝하고 발현시켰다.
고유 lpdA 의 치환
클렙시엘라 뉴모니아에의 피루베이트 데하이드로게나제 오페론은 에스케리키아 콜라이의 동등한 오페론에 대해 뉴클레오타이드 수준에서 78 내지 95% 동일하다. 클렙시엘라 뉴모니아에가 글리세롤의 존재 하에서 혐기적으로 증식하는 능력을 가짐은 앞서 입증되었다(문헌[Menzel et al., J. Biotechnol. 56:135-142(1997); Menzel et al., Biotechnol. Bioeng. 60:617-626(1998)]). 에스케리키아 콜라이의 오페론의 lpdA 유전자에서 2 개의 돌연변이가 혐기적으로 증식하는 능력을 증가시킴이 또한 입증되었다(문헌[Kim et al., Appl. Environ. Microbiol. 73:1766-1771(2007); Kim et al., J. Bacteriol. 190:3851-3858(2008)]). 클렙시엘라 뉴모니아의 lpdA 유전자를 주형으로서 게놈 DNA(ATCC700721D) 및 프라이머 KP-lpdA-Bam(5'-acacgcggatccaacgtcccgg-3')(서열번호) 및 KP-lpdA-Nhe(5'-agcggctccgctagccgcttatg-3')(서열번호)를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 생성 단편을 벡터 pCR-BluntII-TOPO(Invitrogen; Carlsbad CA) 내로 클로닝시켜, 플라스미드 pCR-KP-lpdA를 생성시켰다.
상기 염색체 유전자 치환을 비-복제성 플라스미드 및 반대선택 수단으로서 바실러스 서브틸리스로부터의 sacB 유전자를 사용하여 수행하였다(문헌[Gay et al., J. Bacteriol. 153:1424-1431(1983)]). 사용된 벡터는, 크기가 3.6 kb이고 가나마이신 내성 유전자를 지니는, oriT 및 IS 서열이 결실된 pRE118(ATCC87693)이다. 상기 서열을 확인하였으며, 상기 벡터를 pRE118-V2라 칭하였다(도 34 참조).
lpdA 유전자가 측면에 인접한 에스케리키아 콜라이 단편을 하기 프라이머들의 조합을 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다: EC-aceF-Pst(5'-aagccgttgctgcagctcttgage-3')(서열번호) + EC-aceF-Bam2(5'-atctccggcggtcggatccgtcg-3')(서열번호) 및 EC-yacH-Nhe(5'-aaagcggctagccacgccgc-3'(서열번호) + EC-yacH-Kpn(5'-attacacgaggtacccaacg-3')(서열번호). 클렙시엘라 뉴모니아의 lpdA 유전자를 함유하는 BamHI-XbaI 단편을 플라스미드 pCR-KP-lpdA로부터 단리하고 이어서 각각 PstI + BamHI 및 NheI-KpnI로 절단한 상기 에스케리키아 콜라이 단편, 및 KpnI 및 PstI로 절단한 pRE118-V2 플라스미드에 연결시켰다. 생성 플라스미드(pRE118-M2.1 lpdA yac라 칭함)에, Tyr 잔기에 대한 His 322 잔기의 돌연변이의 경우 프라이머 KP-lpdA-HisTyr-F(5'-atgctggcgtacaaaggtgtcc-3')(서열번호) 및 (5'-ggacacctttgtacgccagcat-3')(서열번호), 또는 Lys 잔기에 대한 잔기 Glu 354의 돌연변이의 경우 프라이머 KP-lpdA-GluLys-F(5'-atcgcctacactaaaccagaagtgg-3')(서열번호) 및 KP-lpdA-GluLys-R(5'-ccacttctggtttagtgtaggcgat-3')(서열번호)의 조합을 사용하여 부위 지정 돌연변이(SDM)를 가하였다. PCR을 폴리머라제 Pfu Turbo(Stratagene; San Diego CA USA)로 수행하였다. 전체 단편의 서열뿐만 아니라 목적하는 돌연변이의 존재를 확인하였다. 생성 플라스미드를 형질전환에 의해 에스케리키아 콜라이 ΔadhE::Frt-ΔldhA::Frt의 전기 수용성 세포에 도입시켰다. 염색체 중의 첫 번째 통합 사건을 가나마이신(25 또는 50 ㎎/L)을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에서 선택하였다. 정확한 삽입을 2 개의 프라이머, 즉 삽입 영역 밖에 위치한 것 및 가나마이신 유전자 중의 것(5'-aggcagttccataggatggc-3')(서열번호)을 사용하여 PCR에 의해 확인하였다. 정확한 삽입을 갖는 클론들을 분석용으로 선택하였다. 이들을 목적하는 온도에서 평탄한 액체 LB 중에서 2 회 계대 배양하고 일련의 희석물을 LB-무염-슈크로스 10% 플레이트 상에 도말하였다. 슈크로스 함유 플레이트 상에서 증식한 클론들을 LB-저염 아가 배지 상에서 가나마이신 내성 유전자의 상실에 대해 선별하고 lpdA 유전자 치환을 PCR 및 포함 영역의 서열화에 의해 확인하였다. 상기 삽입 영역의 서열을 확인하였으며 이는 하기에 개시하는 바와 같다. Glu354Lys 돌연변이를 갖는 하나의 클론(4-4-P1이라 칭함)을 선택하였다. 이어서 상기 클론을 에스케리키아 콜라이 ΔPflB::Frt의 P1 용해물로 형질도입시켜 균주 ECKh-138(ΔadhE ΔldhA ΔpflB ΔlpdA::K.p.lpdA322)을 생성시켰다.
상기 aceF 및 lpdA 유전자를 포함하는 ECKh-138의 서열을 도 35에 도시한다. 클렙시엘라 뉴모니아 lpdA 유전자에 밑줄을 긋고, Glu354Lys 돌연변이체 중에 변화된 코돈은 빗금을 그었다. 고유 에스케리키아 콜라이 lpdA 및 돌연변이 클렙시엘라 뉴모니아 lpdA의 단백질 서열 비교를 도 36에 도시한다.
BDO 생산 균주에 클렙시엘라 뉴모니아에 lpdA를 사용하는 이점을 평가하기 위해서, 숙주 균주 AB3 및 ECKh-138을 강한 유도 프로모터들로부터 전체 BDO 경로를 발현하는 플라스미드에 의해 형질전환시켰다. 구체적으로, 에스케리키아 콜라이 sucCD, 포르피로모나스 진지발리스 sucD, 포르피로모나스 진지발리스 4 hbd를 상기 중간 사본 플라스미드 pZA33 상에 발현시키고, 포르피로모나스 진지발리스 Cat2 및 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 AdhE2를 고 사본 플라스미드 pZE13 상에 발현시켰다. 이들 플라스미드는 문헌에 개시되었으며(문헌[Lutz and H. Bujard, Nucleic Acids Res 25:1203-1210(1997)]), BDO 경로 발현에 대한 그들의 용도는 실시예 XIII 및 WO2008/115840에 개시되어 있다.
세포를 37 ℃에서, 20 g/L 글루코스, 완충 용량을 개선시키기 위한 100 mM 3-(N-모폴리노)프로판설폰산(MOPS), 10 ㎍/㎖ 티아민, 및 적합한 항생제가 보충된 M9 최소 배지(6.78 g/L Na2HPO4, 3.0 g/L KH2PO4, 0.5 g/L NaCl, 1.0 g/L NH4Cl, 1 mM MgSO4, 0.1 mM CaCl2)에서 혐기적으로 증식시켰다. 미세호기성 조건은 상기 접종에 이어서, 먼저, 캡핑된 혐기성 병을 5 분간 질소로 플러싱시키고, 이어서 상기 격막을 23G 바늘로 천공하여 확립시켰다. 상기 바늘을 증식하는 동안 상기 병에서 유지시켜 소량의 공기가 상기 병 안으로 들어가게 하였다. OD600이 대략 0.2에 도달했을 때 0.25 mM IPTG를 가하여 경로 유전자들을 유도하였으며, 유도에 이어서 매 24시간마다 분석용 샘플을 취하였다. 배양 상등액을 실시예 II 및 WO 2008/115840에 개시된 바와 같이 BDO, 4HB 및 다른 부산물에 대해 분석하였다. ECKh-138 중의 BDO 및 4HB 생산은 AB3 또는 선행 연구에 사용된 숙주인 MG1655 ΔldhA에서보다 48 시간 후에 현저하게 더 높았다(도 37).
PDH 프로모터 치환
Fnr 결합 부위, pflB 프로모터들 중 하나, 및 그의 리보솜 결합 부위(RBS)를 함유하는 전사 융합에 의한 상기 pdhR 억제인자의 치환(따라서 혐기성 프로모터에 의한 aceEF-lpd 오페론의 발현을 도출한다)은 pdh 활성을 혐기적으로 증가시키는 것으로 앞서 입증되었다(문헌[Zhou et al., Biotechnol. Lett. 30:335-342(2008)]). Fnr 결합 부위, pflB-p6 프로모터 및 RBS 결합 부위를 함유하는 융합물을 중복 PCR에 의해 제작하였다. 2 개의 단편, 즉 프라이머 aceE-상부-RC(5'-tgacatgtaacacctaccttctgtgcctgtgccagtggttgctgtgatatagaag-3')(서열번호) 및 pflBp6-Up-Nde(5'-ataataatacatatgaaccatgcgagttacgggcctataagccaggcg-3')(서열번호)를 사용하는 것, 및 프라이머 aceE-EcoRV-EC(5'-agtttttcgatatctgcatcagacaccggcacattgaaacgg-3')(서열번호) 및 aceE-상부(5'-ctggcacaggcacagaaggtaggtgttacatgtcagaacgtttacacaatgacgtggatc-3')(서열번호)을 사용하는 다른 것을 증폭시켰다. 상기 2 개의 단편을 중복 PCR에 의해 조립하고, 최종 DNA 단편을 제한효소 NdeI 및 BamHI으로 절단하였다. 상기 단편을 후속적으로 상술한 바와 같이 pRE118-V2를 사용하여 에스케리아 콜라이 오페론의 aceE 유전자의 상부에 도입시켰다. 상기 치환을 균주 ECKh-138 및 ECKh-422에서 수행하였다. 상기 aceE 유전자의 5' 영역을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 확인하고 도 37에 도시한다. 도 37은 pflB-p6 프로모터 및 리보솜 결합 부위(RBS)에 융합된 aceE 유전자의 5' 단부의 뉴클레오타이드 서열을 도시한다. 상기 5' 이탤릭체 서열은 aroP 유전자의 개시를 도시하며, 이는 pdh 오페론으로부터 반대 방향으로 전사된다. 상기 3' 이탤릭체 서열은 aceE 유전자의 개시를 도시한다. 상부의 경우: pflB RBS. 밑줄: FNR 결합 부위. 굵은 선: pflB-p6 프로모터 서열.
lpdA 프로모터 치환
상기 fnr 결합 부위, pflB-p6 프로모터 및 pflB 유전자의 RBS를 함유하는 프로모터 영역을 염색체 DNA 주형 및 프라이머 aceF-pflBp6-순방향(5'-agacaaatcggttgccgtttgttaagccaggcgagatatgatctatatc-3')(서열번호) 및 lpdA-RBS-B-역방향(5'-gagttttgatttcagtactcatcatgtaacacctaccttcttgctgtgatatag-3')(서열번호)을 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 플라스미드 2-4a를 프라이머 B-RBS-lpdA 순방향(5'-ctatatcacagcaagaaggtaggtgttacatgatgagtactgaaatcaaaactc-3')(서열번호) 및 pflBp6-aceF-역방향(5'-gatatagatcatatctcgcctggcttaacaaacggcaaccgatttgtct-3')(서열번호)을 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 2 개의 생성 단편을 BPS 클로닝 키트(BPS Bioscience; San Diego CA USA)를 사용하여 조립하였다. 생성 구조물을 서열화하고 확인하고 상술한 pRE118-V2 방법을 사용하여 균주 ECKh-439에 도입시켰다. 상기 생성 균주 ECKh-456 중의 aceF - lpdA 영역을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 도 39에 도시한다.
숙주 균주 ECKh-439(ΔadhE ΔldhA ΔpflB ΔlpdA::K.p.lpdA322 Δmdh ΔarcA gltAR163L ackA fimD::에스케리키아 콜라이 sucCD, 포르피로모나스 진지발리스 sucD, 포르피로모나스 진지발리스 4 hbd fimD::마이코박테리움 보비스 sucA, 클로스트리듐 클루이베리 4 hbd)(제작은 하기에 개시된다), 및 pdhR 및 lpdA 프로모터 치환 유도체 ECKh-455 및 ECKh-456을 BDO 생산에 대해 시험하였다. 상기 균주들을 포르피로모나스 진지발리스 Cat2 및 클로스트리듐 베이제링키이 Ald를 함유하는 pZS*13으로 형질전환시켜 완전한 BDO 경로를 제공하였다. 세포를 상술한 바와 같이 20 g/L 글루코스가 보충된 M9 최소 배지에서 배양하였다. 0.2 mM IPTG로 유도 후 48 시간째에, BDO, 4HB 및 피루베이트 농도는 도 40에 도시된 바와 같았다. 상기 프로모터 치환 균주는 동질 유전자 부모보다 BDO를 약간 더 생산한다.
상기 결과는 피루베이트 데하이드로게나제의 발현이 BDO 생산 균주에서 BDO의 생산을 증가시킴을 입증하였다.
실시예 XV
시트레이트 신타제 및 아코니타제를 발현하는 BDO 생산 균주
본 실시예는 BDO의 생산을 증가시키는 시트레이트 신타제 및 아코니타제의 활성 증가를 개시한다. gltA로의 R163L 돌연변이는 BDO 생산을 개선시키는 것으로 밝혀졌다. 또한, arcA 녹아웃을 사용하여 BDO 생산을 개선시켰다.
계산상, 시트레이트 신타제(CS) 및 아코니타제(ACONT)를 통한 흐름이 1,4-부탄다이올의 최대 이론 수율에 도달하는데 필요한 것으로 측정되었다(WO2008/115840, WO2009/023493, 미국 공보 2009/0047719, 미국 공보 2009/0075351 참조). CS 또는 ACONT 활성의 결여는 최대 이론 수율을 혐기성 조건 하에서 14%까지 감소시킬 것이다. 외부 전자 수용체의 존재 하에서, 상기 최대 수율은 PEPCK 활성의 부재 또는 존재를 가정할 때 CS 또는 ACONT를 통한 흐름 없이 각각 9% 또는 6%까지 감소한다. 피루베이트 데하이드로게나제(PDH)의 경우와 같이, CS 및 ACONT의 중요성은 ADHEr, ASPT, LDH_D, MDH 및 PFLi가 녹아웃된 녹아웃 균주(디자인 #439)에서 크게 증폭된다(WO 2009/023493 및 미국 공보 2009/0047719 참조, 이들 공보는 본 발명에 참고로 인용된다).
WO 2009/023493 및 미국 공보 2009/0047719에 개시된 최소 옵트녹 균주 디자인은 ECKh-138 뒤에, 말레이트 데하이드로게나제를 암호화하는 mdh 유전자의 하나의 추가적인 결실을 가졌다. 상기 유전자의 결실은 환원적 TCA 주기를 통한 숙시네이트로의 흐름을 방지하고자 하는 것이다. 상기 mdh 결실을 λ 레드 상동성 재조합 방법(Datsenko and Wanner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645(2000)을 사용하여 수행하였다. 하기의 올리고뉴클레오타이드들을 사용하여 pKD3으로부터의 FRT 부위가 측면에 인접한 클로람페니콜 내성 유전자(CAT)를 PCR 증폭시켰다:
S-mdh-Kan 5' - TAT TGT GCA TAC AGA TGA ATT TTT ATG CAA ACA GTC AGC CCT GAA GAA GG G TGT AGG CTG GAG CTG CTT C - 3'(서열번호)
AS-mdh-Kan 5'-CAA AAA ACC GGA GTC TGT GCT CCG GTT TTT TAT TAT CCG CTA ATC AAT TAC ATA TGA ATA TCC TCC TTA G - 3'(서열번호)
밑줄 그은 영역은 pKD3 플라스미드에 대한 상동성을 가리키고 굵은 서열은 mdhORF의 상부 및 하부 서열 상동성에 관한 것이다. 정제 후, 상기 PCR 산물을 pRedET(tet)로 형질전환시키고 제조자의 설명(www.genebridges.com/gb/pdf/K001%20Q%20E%20BAC%20Modification%20Kit-version2.6-2007-screen.pdf)에 따라 제조된 ECKh-138 전기수용성 세포 내로 일렉트로포레이션시켰다. 상기 PCR 산물을 도 41에 도시된 바와 같이 mdh 유전자의 상부 영역에서 ECKh-138 게놈내로 통합되도록 디자인하였다.
재조합체들을 클로람페니콜 내성에 대해 선택하고 스트리킹 정제하였다. mdh 유전자의 상실 및 CAT의 삽입을 진단 PCR에 의해 확인하였다. 상기 CAT 유전자를 제거하기 위해서, FLP 리콤비나제(문헌[Datsenko and Wanner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645(2000)])를 함유하는 온도 민감성 플라스미드 pCP20을 30 ℃에서 세포 내로 형질전환시키고 암피실린 내성(AMP)에 대해 선택하였다. 형질전환체를 42 ℃에서 비 선택적으로 밤새 증식시켜 FLP 합성을 열적으로 유도하고 상기 플라스미드의 상실을 유발하였다. 이어서 상기 배양물을 스트리킹 정제하고, 개별적인 콜로니들을 모든 항생제 내성에 대해 시험하였다. 대다수는 상기 FRT-측면 인접한 내성 유전자 및 FLP 헬퍼 플라스미드를 동시에 상실하였다. 또한 "FRT" 상흔이 존재하였다. 생성 균주를 ECKh-172라 명명하였다.
CS 및 ACONT는 혐기성 조건 하에서 고도로 활성이거나 고도로 발현되지 않는다. 이 때문에, 상기 TCA 주기의 전면적인 조절인자를 암호화하는 arcA 유전자를 결실시켰다. arcA는 미세호기성 조건 하에서 작용하여 낮은 산소 수준, aceE , pflB 및 adhE에 민감한 중심 대사 효소들의 활성을 허용하는 유전자 산물의 발현을 유도한다. 미세호기성 하에서 arcA / arcB의 결실은 ldh , icd , gltA , mdh, 및 gdh 유전자의 비 활성을 증가시키는 것으로 나타났다(문헌[Salmon et al., J. Biol. Chem. 280:15084-15096(2005); Shalel-Levanon et al., Biotechnol. Bioeng. 92(2):147-159(2005)]). 에스케리키아 콜라이 MG1655의 arcA 유전자의 상부 및 하부 영역을 각각 프라이머 ArcA-상부-EcoRI(5'-ataataatagaattcgtttgctacctaaattgccaactaaatcgaaacagg-3')(서열번호)과 ArcA-상부-KpnI(5'-tattattatggtaccaatatcatgcagcaaacggtgcaacattgccg-3')(서열번호) 및 ArcA-하부-EcoRI(5'-tgatctggaagaattcatcggctttaccaccgtcaaaaaaaacggcg-3')(서열번호)과 ArcA-하부-PstI(5'-ataaaaccctgcagcggaaacgaagttttatccatttttggttacctg-3')(서열번호)를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 이들 단편을 후속적으로 제한 효소 EcoRI 및 KpnI(상부 단편) 및 EcoRI 및 PstI(하부)로 절단시켰다. 이어서 이들을 PstI 및 KpnI로 절단시킨 pRE118-V2 플라스미드에 연결시켜 플라스미드 pRE118-ΔarcA를 생성시켰다. 플라스미드 pRE118-ΔarcA의 서열을 확인하였다. pRE118-ΔarcA를 에스케리키아 콜라이 ECKh-172(ΔadhE ΔldhA ΔpflB ΔlpdA::K.p.lpdA322 Δmdh)의 전기 수용성 세포에 도입시켰다. 상술한 바와 같이 LB-무염-슈크로스 플레이트 상에 통합 및 분석 후에, 생성 균주 ECKh-401의 염색체 중의 arcA 유전자의 결실을 서열화에 의해 확인하고 도 42에 도시한다.
에스케리키아 콜라이의 gltA 유전자는 시트레이트 신타제를 암호화한다. 상기 유전자가 NADH에 의해 알로스테릭하게 억제되는 것은 앞서 입증되었으며, 상기 억제와 관련된 아미노산들이 동정되었다(문헌[Pereira et al., J. Biol. Chem. 269(1):412-417(1994); Stokell et al., J. Biol. Chem. 278(37):35435-35443(2003)]). 에스케리키아 콜라이 MG1655의 gltA 유전자를 프라이머 gltA-상부(5'-ggaagagaggctggtacccagaagccacagcagga-3')(서열번호) 및 gltA-PstI(5'-gtaatcactgcgtaagcgccatgccccggcgttaattc-3')(서열번호)를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 상기 증폭된 단편을 KpnI 및 PstI로 절단 후 pRE118-V2 내로 클로닝하였다. 생성 플라스미드를 pRE118-gltA라 칭하였다. 이어서 상기 플라스미드에, 잔기 Arg163을 Lys 잔기로 변화시키기 위해 프라이머 R163L-f(5'-attgccgcgttcctcctgctgtcga-3')(서열번호) 및 R163L-r(5'-cgacagcaggaggaacgcggcaat-3')(서열번호)를 사용하여 부위 지정 돌연변이(SDM)를 가하였다. 상기 전체 단편의 서열을 서열화에 의해 확인하였다. 상기 λ 레드 상동성 재조합 방법(문헌[Datsenko and Wanner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645(2000)])의 변형을 사용하여 Frt 흔적을 남기지 않고 상기 R163L 돌연변이 대립유전자로 고유 gltA 유전자를 치환하였다. 상기 일반적인 재조합 과정은 상술한 mdh 결실의 수행에 사용된 바와 동일하다. 먼저, 균주 ECKh-172를 상기 λ 레드 상동성 재조합 방법을 사용하여 rpsL 삭제 돌연변이를 도입시킴으로써 스트렙토마이신 내성으로 만들었다. 이어서, 상기 균주 중의 전체 야생형 gltA 암호화 영역을 가나마이신 내성 유전자(kanR) 및 에스케리키아 콜라이 rpsL 유전자의 야생형 사본으로 구성된 카세트로 치환하여 재조합을 수행하였다. 상기 카세트는 rpsL 삭제 돌연변이를 갖는 에스케리키아 콜라이 균주에 도입 시, 상기 세포를 스트렙토마이신 약물 내성에서 스트렙토마이신 감수성으로 변화되게 한다. 이어서 적합한 상동성 단부와 함께 상기 gltA 유전자의 각각의 돌연변이 버전을 포함하는 DNA 단편을 도입시키고, 생성되는 콜로니 증식을 스트렙토마이신의 존재 하에서 시험하였다. 상기 kanR/rpsL 카세트가 돌연변이 gltA 유전자로 치환된 균주가 선택되었다. 정확한 유전자 좌에의 상기 돌연변이 유전자의 삽입을 PCR 및 DNA 서열화 분석에 의해 입증하였다. 상기 생성 균주를 ECKh-422라 칭하였으며 상기 균주는 ΔadhE ΔldhA ΔpflB ΔlpdA::K.p.lpdA322 Δmdh ΔarcA gltAR 163L 유전자형을 갖는다. 상기 균주 ECKh-422의 돌연변이된 gltA 유전자를 포함하는 영역을 도 43에 나타낸 바와 같이 서열화에 의해 확인하였다.
이어서 상기 균주 ECKh-401 및 gltAR163L 돌연변이 ECKh-422의 조 추출물들을 시트레이트 신타제 활성에 대해 평가하였다. 세포를 4,500 rpm에서 10 분간 원심분리에 의해 수확하였다(Beckman-Coulter, Allegera X-15R; Fullerton CA USA). 상기 펠릿을 벤조나제 및 라이소자임과 함께 0.3 ㎖ 버그버스터(BugBuster)(Novagen/EMD; San Diego CA USA)에 재현탁하고, 실온에서 서서히 진탕하면서 15 분간 용해를 진행시켰다. 4 ℃에서 30 분간 14,000 rpm에서 원심분리(에펜도르프 원심분리기 5402; Hamburg Germany)에 의해 무 세포 용해물을 수득하였다. 상기 샘플 중의 세포 단백질을 브래드포드(문헌[Bradford, Anal. Biochem. 72:248-254(1976)])의 방법을 사용하여 측정하였다.
시트레이트 신타제 활성을 유리 조효소 A(HS-CoA)(아세틸-CoA와 옥살로아세테이트의 반응으로부터 유리됨)의 형성에 따라서 측정하였다. 상기 HS-CoA의 유리 티올 그룹은 5,5'-다이티오비스-(2-나이트로벤조산)(DTNB)과 반응하여 5-티오-2-나이트로벤조산(TNB)을 형성한다. 이어서 TNB의 농도를 410 ㎚에서 흡광도(412 ㎚에서 최대)를 측정함으로써 분광광도측정에 의해 모니터한다. 상기 분석 혼합물은 100 mM 트리스/HCl 완충제(pH 7.5), 20 mM 아세틸-CoA, 10 mM DTNB, 및 20 mM 옥살로아세테이트를 함유하였다. NADH 억제의 평가를 위해서, 0.4 mM NADH를 또한 상기 반응에 가하였다. 상기 분석을 5 마이크로리터의 세포 추출물을 가하여 개시시키고, 반응 속도를 시간에 따른 흡광도 변화에 따라 측정하였다. 비 활성의 단위는 단백질 ㎎당 분당 전환되는 생성물의 μmol로서 정의된다.
도 44는 야생형 gltA 유전자 산물 및 R163L 돌연변이체의 시트레이트 신타제 활성을 도시한다. 상기 분석을 0.4 mM NADH의 존재 또는 부재 하에서 수행하였다.
균주 ECKh-401 및 ECKh-422를 전체 BDO 경로를 발현하는 플라스미드로 형질전환시켰다. 에스케리키아 콜라이 sucCD, 포르피로모나스 진지발리스 sucD, 포르피로모나스 진지발리스 4 hbd, 및 마이코박테리움 보비스 sucA를 저 사본 플라스미드 pZS*13 상에서 발현시키고 포르피로모나스 진지발리스 Cat2 및 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 AdhE2는 중간 사본 플라스미드 pZE33 상에 발현시켰다. 이들 균주의 배양물을 상술한 바와 같이 20 g/L 글루코스 및 적합한 항생제가 보충된 M9 최소 배지에서 미세 호기성으로 증식시켰다. 중복 배양물로부터의, 48 시간 유도 후 4HB 및 BDO 평균 농도를 도 45에 도시한다. 상기 둘 모두 ECKh-401에서보다 ECKh-422에서 더 높았으며, 이는 상기 gltA 돌연변이로 인해 향상된 시트레이트 신타제 활성이 BDO 경로로의 흐름을 증가시킴을 입증한다.
본 섹션에 개시된 숙주 균주 변형은, WO 2009/023493 및 미국 공보 2009/0047719에 개시된 옵트녹 균주 디자인과 일치하는 산화적 TCA 주기를 통해 탄소 흐름을 예측하고자 했다. 흐름이 실제로 상기 경로를 통해 이동하는 지를 입증하기 위해서, 13C 흐름 분석을, 상부 경로가 염색체에 통합되어 있는 ECKh-422의 한 버전인 균주 ECKh-432를 사용하여 수행하였다(실시예 XVII에 개시된 바와 같이). 상기 BDO 경로를 완성하기 위해서, 포르피로모나스 진지발리스 Cat2 및 클로스트리듐 베이제링키이 Ald를 pZS*13으로부터 발현시켰다. 4 개의 병행 배양물들을 4 개의 상이한 표지 비(1-13C, 오직 글루코스 분자의 첫 번째 탄소 원자만 13C로 표지한다; 균일한-13C, 모든 탄소 원자는 13C이다)의 총 4 g/L의 글루코스를 함유하는 M9 최소 배지(6.78 g/L Na2HPO4, 3.0 g/L KH2PO4, 0.5 g/L NaCl, 1.0 g/L NH4Cl, 1 mM MgSO4, 0.1 mM CaCl2)에서 증식시켰다:
1. 80 몰% 비 표지됨, 20 몰% 균일-13C
2. 10 몰% 비 표지됨, 90 몰% 균일-13C
3. 90 몰% 1-13C, 10 몰% 균일-13C
4. 40 몰% 1-13C, 60 몰% 균일-13C
병행된 비 표지된 배양물들을 중복 증식시키고, 이로부터 증식률, 글루코스 흡수율, 생성물 형성률을 평가하기 위해 빈번히 샘플을 취하였다. 말기 지수 증식기에서, 상기 표지된 배양물을 수확하고, 단백질을 단리하고 아미노산으로 가수분해시키고, 상기 아미노산의 표지 분포를 앞서 개시된 바와 같이 기체 크로마토그래피-질량 분광측정(GCMS)에 의해 분석하였다(문헌[Fischer and Sauer, Eur. J. Biochem. 270:880-891(2003)]). 또한, 상기 표지된 배양물로부터의 브로쓰 중에 분비된 4HB 및 BDO의 표지 분포를 WO 2008115840에 개시된 바와 같이 GCMS에 의해 분석하였다. 상기 데이터를 집합적으로 사용하여 확립된 방법(문헌[Suthers et al., Metab. Eng. 9:387-405(2007)])으로 세포 내 흐름 분포를 계산하였다. 생성되는 중심 대사 흐름 및 관련된 95% 신뢰도 구간을 도 46에 도시한다. 값들은 1 mmol/시간의 글루코스 흡수율로 표준화된 몰 흐름이다. 상기 결과는 탄소 흐름이 산화 방향으로 시트레이트 신타제를 통해 이동하고, 상기 탄소의 대부분이 TCA 주기를 완성하기보다는 BDO 경로로 들어감을 가리킨다. 더욱 또한, 상기 균주 중의 mdh 결실로 인해 말레이트와 옥살로아세테이트 간에 필수적으로 흐름은 없음이 입증된다.
BDO 생산을 위해 옵트녹을 사용하여 디자인한 균주(WO 2009/023493 및 미국 공보 2009/0047719 참조)와 같은 녹아웃 균주를 사용한 이점을, ECKh-422의 전형적인 발효 프로파일과 원래 균주 ECKh-138(BDO가 환원적 TCA 주기를 통해 숙시네이트로부터 생산된다)의 것을 비교하여 관찰할 수 있다(도 47 참조). 발효를 20 g/L 글루코스가 보충된 M9 최소 배지를 사용하여 2L 바이오스탯 B + 생물반응기(Sartorius; Cedex France)에서 1L 초기 배양 부피로 수행하였다. 상기 온도를 37 ℃에서 조절하고, pH를 2M NH4OH 또는 Na2CO3를 사용하여 7.0으로 조절하였다. 세포를 대략 10의 OD600으로 호기성으로 증식시켰으며, 이때 상기 배양물을 0.2 mM IPTG로 유도하였다. 유도 후 1 시간째에, 공기 유량을 미세호기성 조건을 위해서 분당 0.02 표준 리터로 감소시켰다. 교반 속도를 700 rpm으로 고정시켰다. 농축된 글루코스를 공급하여 상기 용기 중의 글루코스 농도를 0.5 내지 10 g/L로 유지시켰다. 상기 두 균주 모두 상기 실시예들에서와 같이, 전체 BDO 경로를 갖는 플라스미드로 형질전환시켰다. ECKh-138에서는 아세테이트, 피루베이트 및 4HB가 상기 발효를 지배하는 반면, ECKh-422의 경우 BDO가 주 생성물이다.
실시예 XVI
포스포에놀피루베이트 카복시키나제를 발현하는 BDO 균주
본 실시예는 BDO 생산을 향상시키기 위한 포스포에놀피루베이트 카복시키나제(PEPCK)의 사용을 개시한다. 하에모필루스 인플루엔자 PEPCK 유전자를 이종 발현에 사용하였다.
계산상, 옥살로아세테이트의 포스포에놀피루베이트로의 ATP-생성 전환이 1,4-부탄다이올의 최대 이론 수율에 도달하는데 필요한 것으로 측정되었다(WO2008/115840, WO2009/023493, 미국 공보 2009/0047719, 미국 공보 2009/0075351 참조). PEPCK 활성의 결여는 BDO의 최대 이론 수율을 혐기성 조건을 가정하는 경우 12%까지, 나이트레이트 또는 산소와 같은 외부 전자 수용체가 존재하는 것을 가정하는 경우 3%까지 감소시킬 것이다.
에스케리키아 콜라이와 같은 유기체에서, PEPCK는 글루코스신생합성 및 옥살로아세테이트로부터 포스포에놀피루베이트를 향한 ATP 소비 방향으로 작용한다. 에스케리키아 콜라이의 PEPCK의 동역학적 제한은 상기 PEPCK가 PEP로부터 옥살로아세테이트의 형성을 유효하게 촉매화하는 것을 방지하는 것으로 가정되었다. PEP 카복실라제(PPC)(ATP를 발생시키지 않지만 효율적인 증식에 필요하다)는 에스케리키아 콜라이에 의해 자연적으로 사용되어 포스포에놀피루베이트로부터 옥살로아세테이트를 형성한다. 따라서, 3 개의 비 고유 PEPCK 효소(표 26)를 글루코스 최소 배지에서 에스케리키아 콜라이의 PPC 돌연변이 균주의 증식을 보완하는 능력에 대해 시험하였다.
포스포에놀피루베이트 카복시키나제 서열의 출처
PEPCK 출처 균주 수납 번호, 젠뱅크 참조서열
하에모필루스 인플루엔자에 NC_000907.1
액티노바실러스 숙시노제네스 YP_001343536.1
만헤이미아 숙시니시프로듀센스 YP_089485.1
증식 보완 연구는 게이오 콜렉션(Keio collection)(문헌[Baba et al., Molecular Systems Biology 2:2006.0008(2006)])으로부터 수득한 Δppc 돌연변이 에스케리키아 콜라이 JW3978에서 후보 유전자들의 플라스미드 기재 발현을 수반하였다. 상기 유전자들을 발현 벡터 pZA23(중간 사본) 및 pZE13(고 사본)에서 PA1lacO-1 프로모터 뒤에 클로닝하였다. 이들 플라스미드는 앞서 개시되었으며(문헌[Lutz and Bujard, Nucleic Acids Res. 25:1203-1210(1997)]) 발현 BDO 경로 유전자들에서의 용도는 앞서 WO 2008115840에 개시되었다.
예비 배양물을 4 g/L 글루코스가 있는 M9 최소 배지에서 호기적으로 증식시켰다. 모든 예비 배양물에 아스파테이트(2 mM)를 보충하여 Δppc 돌연변이체에 PEPCK 발현과 무관하게 TCA 주기 중간체를 생성시키는 공급원을 제공하였다. M9 최소 배지를 또한 4 g/L 글루코스가 있는 시험 조건 하에서 사용하였으나, 아스파테이트는 첨가하지 않았고 IPTG를 0.5 mM로 첨가하였다. 표 27은 증식 보완 연구의 결과를 나타낸다.
벡터 pZA23 또는 pZE13으로부터 발현 시 하에모필루스 인플루엔자에, 액티노바이러스 숙시노제네스 및 만헤이미아 숙시노프로듀센스로부터의 PEPCK에 의한 Δppc 돌연변이체의 보완
PEPCK 출처 균주 벡터 시간(h) OD600
하에모필루스 인플루엔자에 pZA23BB 40 0.950
Δppc 대조군 pZA23BB 40 0.038
액티노바실러스 숙시노제네스 pZA23BB 40 0.055
만헤이미아 숙시노프로듀센스 pZA23BB 40 0.214
액티노바실러스 숙시노제네스 pZE13BB 40 0.041
만헤이미아 숙시노프로듀센스 pZE13BB 40 0.024
Δppc 대조군 pZE13BB 40 0.042
하에모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza) PEPCK는 상기 플라스미드 기재 선별에서 시험된 유전자들 가운데 Δppc 돌연변이 에스케리키아 콜라이에서의 증식을 가장 잘 보완하는 것으로 밝혀졌다. 이어서 상기 유전자를 상기 논의된 pRE118-V2에 의한 SacB 반대 선택을 사용하여 야생형 에스케리키아 콜라이(MG1655)의 PPC 유전자 좌에 통합시켰다(문헌[Gay et al., J. Bacteriol. 153:1424-1431(1983)]). PEPCK는 통합되어 상기 에스케리키아 콜라이 고유 PPC 프로모터를 남기지만 비 고유 PEPCK 종결자를 사용하였다. 하에모필루스 인플루엔자에 pepck에 의한 ppc의 치환에 따른 상기 영역의 서열을 도 48에 도시한다. 상기 pepck 암호화 영역은 밑줄을 그었다.
적응 진화 기법을 적용시켜 상기 에스케리키아 콜라이 돌연변이체(Δppc::H. inf pepCK)의 증식률을 개선시켰다. 4 g/L 글루코스 및 50 mM 나트륨 바이카보네이트가 있는 M9 최소 배지를 사용하여 혐기성 환경 하에서 상기 균주를 배양하고 진화시켰다. 높은 나트륨 바이카보네이트 농도를 사용하여 상기 PEPCK의 평형을 옥살로아세테이트 형성 쪽으로 몰아갔다. 지수 증식을 유지하기 위해서, 상기 배양물을 0.5의 OD600이 성취될 때마다 2 배 희석하였다. 3 주의 적응 진화에 걸쳐 약 100 세대 후에, 혐기성 증식률이 약 8 시간으로부터 야생형의 증식률, 약 2 시간까지 개선되었다. 진화에 이어서, 개별적인 콜로니들을 단리하고, 혐기성 병 중에서의 증식을 초기 돌연변이체 및 야생형 균주의 경우와 비교하였다(도 49 참조). 4 g/L 글루코스 및 50 mM 나트륨 바이카보네이트가 있는 M9 배지를 사용하였다.
이어서 상술한 ppc/pepck 유전자 치환을 반복하였으며, 이때 숙주로서 BDO 생산 균주 ECKh-432(ΔadhE ΔldhA ΔpflB ΔlpdA::K.p.lpdA322 Δmdh ΔarcA gltAR163L ΔackA fimD::에스케리키아 콜라이 sucCD, 포르피로모나스 진지발리스 sucD, 포르피로모나스 진지발리스 4 hbd fimD::마이코박테리움 보비스 sucA, 클로스트리듐 클루이베리 4 hbd) 및 ECKh-439를 사용하였다. 이들 균주는 상기 논의된 TAC 주기 향상뿐만 아니라 염색체에 통합된 상부 경로를 함유한다. ECKh-439는 ackA 유전자(아세테이트 키나제를 암호화한다)가 결실된 ECKh-432의 유도체이다. 상기 결실을 상술한 sacB 반대 선택 방법을 사용하여 수행하였다.
상기 ECKh-439의 Δppc::H. infpepCK 유도체(ECKh-453이라 칭한다)를 발효에서 실행시켰다. 하부 BDO 경로는 포르피로모나스 진지발리스 Cat2 및 클로스트리듐 베이제링키이 Ald를 함유하는 pZS*13에 의해 공급되었다. 이를 20 g/L 글루코스 및 50 mM NaHCO3가 보충된 M9 최소 배지를 사용하여 2L 바이오스탯 + 생물반응기(Sartorius)에서 1L 초기 배양 부피로 수행하였다. 상기 온도를 37 ℃에서 조절하고, pH를 2M NH4OH 또는 Na2CO3를 사용하여 7.0으로 조절하였다. 세포를 대략 2의 OD600으로 호기성으로 증식시켰으며, 이때 상기 배양물을 0.2 mM IPTG로 유도하였다. 유도 후 1 시간째에, 공기 유량을 미세호기성 조건을 위해서 분당 0.01 표준 리터로 감소시켰다. 교반 속도를 700 rpm으로 고정시켰다. 상기 배양물 밀도가 증가함에 따라 상기 발효 전체를 통해 통기율을 점진적으로 증가시켰다. 농축된 글루코스 용액을 공급하여 상기 용기 중의 글루코스 농도를 0.5 내지 10 g/L로 유지시켰다. 상기 생성물 프로파일을 도 50에 도시한다. 관찰된 표현형(여기에서 BDO 및 아세테이트가 대략 1:1 몰비로 생산된다)은 디자인 #439(ADHEr, ASPT, LDH_D, MDH, PFLi)에 대해 WO 2009/023493에 예측된 바와 대단히 유사하다. 상기 ASPT 반응을 표적화하는 결실은, 아스파테이트 암모니아-라이아제를 통한 천연 흐름이 낮기 때문에 불필요한 것처럼 보인다.
옵트녹 균주의 핵심 특징은 관심 대사산물의 생산이 일반적으로 증식과 결합되고, 더욱이, 생산이 지수 증식기뿐만 아니라 정지 기 동안에도 발생한다는 것이다. ECKh-432와 ECKh-453의 증식 커플링 잠재성을 지수 증식기 동안 빈번한 샘플링과 함께 미세호기성 병에서의 증식에 의해 평가하였다. 4 g/L 글루코스 및 10 mM NaHCO3(ECKh-432의 경우) 또는 50 mM NaHCO3(ECKh-453의 경우)를 함유하는 M9 배지를 사용하였으며, 0.2 mM IPTG를 접종으로부터 포함시켰다. 18G 바늘을 ECKh-432의 미세호기성 증식을 위해 사용한 반면, ECKh-453의 경우에는 18G 및 27G 바늘을 모두 시험하였다. 바늘 게이지가 높을수록 통기가 덜 된다. 도 51에 도시된 바와 같이, ECKh-432는 5 g/L 글루코스가 소비될 때까지(정지 기의 개시에 상응한다) BDO를 생산하기 시작하지 않는다. ECKh-453은 상기 실험 전체를 통해 BDO를 고르게 더 많이 생산한다. 또한, 증식 커플링은 상기 배양물의 통기가 감소됨에 따라 개선된다.
실시예 XVII
특정한 통합 부위에서 BDO 경로 암호화 유전자의 통합
본 실시예는 fimD 유전자 좌 내로 다양한 BDO 경로 유전자들을 통합시켜 보다 효율적인 발현 및 안정성을 제공함을 개시한다.
4HB를 도출하는 전체 상부 BDO 경로를 fimD 유전자 좌에서 에스케리키아 콜라이 염색체에 통합시켰다. 상기 상부 경로의 숙시네이트 가지를 λ 레드 상동성 재조합 방법(문헌[Datsenko and Wanner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645(2000)])을 사용하여 상기 에스케리키아 콜라이 염색체에 통합시켰다. 에스케리키아 콜라이 수용 균주는 ECKh-422(ΔadhE ΔldhA ΔpflB ΔlpdA::K.p.lpdA322 Δmdh ΔarcA gltAR163L)이었다. 프로모터, sucCD 유전자, sucD 유전자 및 4 hbd 유전자 및 종결자 서열을 함유하는 다시스트론성 DNA 단편을 상기 pKD3 플라스미드의 AflIII 부위에 삽입하였다. 하기의 프라이머들을 사용하여 상기 플라스미드로부터의 클로람페니콜 마커와 함께 상기 오페론을 증폭시켰다. 밑줄 그은 서열은 표적 삽입 부위와 상동성이다.
5'-GTTTGCACGCTATAGCTGAGGTTGTTGTCTTCCAGCAACGTACCGTATACAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTC-3'(서열번호)
5'-GCTACAGCATGTCACACGATCTCAACGGTCGGATGACCAATCTGGCTGGTATGGGAATTAGCCATGGTCC-3'(서열번호)
DpnI 처리 및 DNA 전기영동에 이어서, 상기 정제된 PCR 산물을 사용하여 플라스미드 pKD46을 갖는 에스케리키아 콜라이 균주를 형질전환시켰다. 상기 후보 균주를 클로람페니콜을 함유하는 플레이트 상에서 선택하였다. 상기 후보 균주의 게놈 DNA를 정제하였다. 상기 삽입 서열을 증폭시키고 DNA 서열화에 의해 확인하였다. 상기 클로람페니콜-내성 마커를 플리파제에 의해 염색체로부터 제거하였다. 상기 삽입 및 마커 제거 후 상기 부위의 뉴클레오타이드 서열을 도 52에 도시한다.
상기 상부 경로의 알파-케토글루타레이트 가지를 동종 재조합에 의해 상기 염색체에 통합시켰다. 상기 변형에 사용된 플라스미드는 실시예 XIV에서 언급한 바와 같은 벡터 pRE118-V2(가나마이신-내성 유전자, 레반슈크라제를 암호화하는 유전자(sacB) 및 R6K 조건 복제 기원을 함유한다)로부터 유도되었다. 상기 통합 플라스미드는 또한 프로모터, sucA 유전자, 클로스트리듐 클루이베리 4 hbd 유전자, 및 표적 삽입 부위의 측면 부위에 상동성인 2 개의 1.5 kb DNA 단편들 사이에 삽입되는 종결자를 함유하였다. 상기 생성 플라스미드를 사용하여 에스케리키아 콜라이 균주를 형질전환시켰다. 상기 통합 후보를 가나마이신을 함유하는 플레이트 상에서 선택하였다. 정확한 통합 부위를 PCR에 의해 확인하였다. 상기 염색체로부터 항생제 마커를 분석하기 위해서, 상기 세포를 슈크로스를 함유하는 배지 상에서의 증식을 위해 선택하였다. 최종 균주를 PCR 및 DNA 서열화에 의해 확인하였다. 상기 삽입 및 마커 제거 후의 염색체 부위의 뉴클레오타이드 서열을 도 53에 도시한다.
생성되는 상부 경로 통합 균주 ECKh-432를 하부 경로 유전자를 갖는 플라스미드로 형질전환시켰다. 상기 구조물은 최소 배지에서 글루코스로부터 BDO를 생산할 수 있었다(도 54 참조).
실시예 XVIII
피루베이트 부산물 형성을 감소시키기 위한 비- 포스포트랜스퍼라제 슈크로스 흡수 시스템의 용도
본 실시예는 슈크로스에서 BDO로의 전환에서 부산물로서 피루베이트를 감소시키기 위한 비-포스포트랜스퍼라제(PTS) 슈크로스 흡수 시스템의 사용을 개시한다.
포스포트랜스퍼라제(PTS) 시스템을 통한 슈크로스의 사용을 위해 조작된 균주는 부산물로서 상당량의 피루베이트를 생산한다. 따라서, 슈크로스의 유입은 포스포에놀피루베이트(PEP)의 피루베이트로의 전환에 의해 동반되지 않을 것이므로 비-PTS 슈크로스 시스템을 사용하여 피루베이트 형성을 감소시킬 수 있다. 이는 PEP 풀, 및 PPC 또는 PEPCK를 통한 옥살로아세테이트로의 상기 흐름을 증가시킬 것이다.
상기 rrnC 영역 내로의 비-PTS 슈크로스 오페론의 삽입을 수행하였다. 상기 rrnC 영역에 상동성인 영역들이 측면에 인접한 비-PTS 슈크로스 유전자를 함유하는 PCR 산물을 생성시키기 위해서, 2 개의 올리고들을 사용하여 Mach1TM(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)으로부터 csc 유전자를 PCR 증폭시켰다. 상기 균주는, 슈크로스를 이화할 수 있는 것으로 공지된 에스케리키아 콜라이 균주인 W 균주의 자손이다(문헌[Orencio-Trejo et al., Biotechnology Biofuels 1:8(2008)]). 상기 서열은 에스케리키아 콜라이 W 균주 KO11(수납 번호 AY314757)(문헌[Shukla et al., Biotechnol. Lett. 26:689-693(2004)])으로부터 유도되었으며 슈크로스 퍼미아제(cscB), D-프럭토키나제(cscK), 슈크로스 하이드롤라제(cscA), 및 LacI-관련된 슈크로스-특이적인 억제인자(cscR)를 암호화하는 유전자들을 포함한다. cscR의 처음 53 개 아미노산은 상기 AS 프라이머의 배치에 의해 유효하게 제거되었다. 상기 올리고들의 서열은 하기와 같다: rrnC 23S del S-CSC 5'-TGT GAG TGA AAG TCA CCT GCC TTA ATA TCT CAA AAC TCA TCT TCG GGT GA C GAA ATA TGG CGT GAC TCG ATA C-3'(서열번호) 및 rrnC 23S del AS-CSC 5'-TCT GTA TCA GGC TGA AAA TCT TCT CTC ATC CGC CAA AAC AGC TTC GGC GT T AAG ATG CGC GCT CAA GGA C-3'(서열번호). 밑줄 그은 영역은 csc 오페론에 상동성임을 가리키고, 굵은 서열은 상기 rrnC 영역의 상부 및 하부 서열 상동성을 지칭한다. 전체 PCR 산물의 서열을 도 55에 도시한다.
정제 후, 상기 PCR 산물을 pRedET(tet)로 형질전환시키고 제조자의 설명(www.genebridges.com/gb/pdf/K001%20Q%20E%20BAC%20Modification%20Kit-version2.6-2007-screen.pdf)에 따라 제조된 MG1655 전기수용성 세포 내로 일렉트로포레이션시켰다. 상기 PCR 산물을 상기 염색체의 rrnC 영역 내 게놈 내로 통합되도록 디자인하였다. 상기는 도 56에 도시된 바와 같이, rrlC의 191 뉴클레오타이드 상부(23S rRNA), 상기 rrlC rRNA 유전자 전부 및 rrlC의 3 뉴클레오타이드 하부를 유효하게 결실시켰으며, 슈크로스 오페론으로 치환시켰다.
형질전환체들을 0.4% 슈크로스가 있는 M9 최소 염 배지 상에서 증식시켰으며 개별적인 콜로니들을 진단 PCR에 의해 상기 슈크로스 오페론의 존재에 대해 시험하였다. 전체 rrnC::crcAKB 영역을 P1 형질도입(문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York(2001)])에 의해 BDO 숙주 균주 ECKh-432 내로 옮겨, ECKh-463(ΔadhE ΔldhA ΔpflB ΔlpdA::K.p.lpdA322 Δmdh ΔarcA gltAR163L fimD::에스케리키아 콜라이 sucCD, 포르피로모나스 진지발리스 sucD, 포르피로모나스 진지발리스 4 hbd fimD::마이코박테리움 보비스 sucA, 클로스트리듐 클루이베리 4 hbd rrnC::cscAKB)를 생성시켰다. 재조합을 슈크로스 상에서의 증식에 의해 선택하고 진단 PCR에 의해 확인하였다.
ECKh-463을 포르피로모나스 진지발리스 Cat2 및 클로스트리듐 베이제링키이 Ald를 함유하는 pZS*13으로 형질전환시켜 완전한 BDO 경로를 제공하였다. 세포를 10 g/L 슈크로스가 보충된 M9 최소 배지(6.78 g/L Na2HPO4, 3.0 g/L KH2PO4, 0.5 g/L NaCl, 1.0 g/L NH4Cl, 1 mM MgSO4, 0.1 mM CaCl2)에서 배양하였다. 0.2 mM IPTG가 상기 출발 시 배양물 중에 존재하였다. 혐기성 조건을 23G 바늘이 있는 병을 사용하여 유지시켰다. 대조군으로서, 동일한 플라스미드를 함유하는 ECKh-432를 동일한 배지 상에서 배양하였으나, 단 슈크로스 대신에 10 g/L 글루코스를 사용하였다. 도 57은 48 시간 증식 후, OD600 배양에 대해 표준화된, 평균 생성물 농도를 도시한다. 상기 데이터는 각 균주의 6 회 복제 배양물에 대한 것이다. 이는 슈크로스 상의 ECKh-463으로부터의 BDO 생산이 슈크로스 상의 모 균주의 경우와 유사함을 입증한다.
실시예 XIX
BDO 생산 균주의 요약
본 실시예는 다양한 BDO 생산 균주들을 개시한다.
표 28은 상기 실시예 XII 내지 XVIII에 개시된 다양한 BDO 생산 균주들을 요약한다.
다양한 BDO 생산 균주들의 요약
균주# 숙주 균주# 숙주 염색체 숙주 설명 폴라스미드 기재
1 ΔldhA 에스케리키아 콜라이 MG1655의 단일 결실 유도체 에스케리키아 콜라이 sucCD, 포르피로모나스 진지발리스 sucD, 포르피로모나스 진지발리스 4hbd, 포르피로모나스 진지발리스 Cat2, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 AdhE2
2 AB3 ΔadhE ΔldhA ΔpflB 숙시네이트 생산 균주: 에스케리키아 콜라이 MG1655의 유도체 에스케리키아 콜라이 sucCD, 포르피로모나스 진지발리스 sucD, 포르피로모나스 진지발리스 4hbd, 포르피로모나스 진지발리스 Cat2, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 AdhE2
3 ECKh-138 ΔadhE ΔldhA ΔpflB
ΔlpdA::K.p.lpdA322		 피루베이트 데하이드로게나제 흐름을 증가시키기 위한 lpdA의 개선 에스케리키아 콜라이 sucCD, 포르피로모나스 진지발리스 sucD, 포르피로모나스 진지발리스 4hbd, 포르피로모나스 진지발리스 Cat2, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 AdhE2
4 ECKh-138 ΔadhE ΔldhA ΔpflB
ΔlpdA::K.p.lpdA322		 에스케리키아 콜라이 sucCD, 포르피로모나스 진지발리스 sucD, 포르피로모나스 진지발리스 4hbd, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 buk1, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ptb, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 AdhE2
5 ECKh-401 ΔadhE ΔldhA ΔpflB
ΔlpdA::K.p.lpdA322 Δmdh
ΔarcA		 산화적 TCA 주기를 통한 흐름을 조정하기 위한 mdh 및 arcA의 결실 에스케리키아 콜라이 sucCD, 포르피로모나스 진지발리스 sucD, 포르피로모나스 진지발리스 4hbd, 포르피로모나스 진지발리스 Cat2, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 AdhE2
6 ECKh-401 ΔadhE ΔldhA ΔpflB
ΔlpdA::K.p.lpdA322 Δmdh
ΔarcA		 마이코박테리움 보비스 sucA, 에스케리키아 콜라이 sucCD, 포르피로모나스 진지발리스 sucD, 포르피로모나스 진지발리스 4hbd, 포르피로모나스 진지발리스 Cat2, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 AdhE2
7 ECKh-422 ΔadhE ΔldhA ΔpflB
ΔlpdA::K.p.lpdA322 Δmdh
ΔarcA gltAR163L		 혐기적 활성을 개선시키기 위한 시트레이트 신타제의 돌연변이 에스케리키아 콜라이 sucCD, 포르피로모나스 진지발리스 sucD, 포르피로모나스 진지발리스 4hbd, 포르피로모나스 진지발리스 Cat2, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 AdhE2
8 ECKh-422 ΔadhE ΔldhA ΔpflB
ΔlpdA::K.p.lpdA322 Δmdh
ΔarcA gltAR163L		 마이코박테리움 보비스 sucA, 에스케리키아 콜라이 sucCD, 포르피로모나스 진지발리스 sucD, 포르피로모나스 진지발리스 4hbd, 포르피로모나스 진지발리스 Cat2, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 AdhE2
9 ECKh-401 ΔadhE ΔldhA ΔpflB
ΔlpdA::K.p.lpdA322 Δmdh
ΔarcA gltAR163L		 마이코박테리움 보비스 sucA, 에스케리키아 콜라이 sucCD, 포르피로모나스 진지발리스 sucD, 포르피로모나스 진지발리스 4hbd, 포르피로모나스 진지발리스 Cat2, 클로스트리듐 베이제링키이 Ald
10 ECKh-426 ΔadhE ΔldhA ΔpflB
ΔlpdA::K.p.lpdA322 Δmdh
ΔarcA gltAR163L fimD:: 에스케리키아 콜라이 sucCD, 포르피로모나스 진지발리스 sucD, 포르피로모나스 진지발리스 4hbd		 ECKh-422 내로 통합된 상부 경로의 숙시네이트 가지 포르피로모나스 진지발리스 Cat2, 클로스트리듐 베이제링키이 Ald
11 ECKh-432 ΔadhE ΔldhA ΔpflB
ΔlpdA::K.p.lpdA322 Δmdh
ΔarcA gltAR163L fimD:: 에스케리키아 콜라이 sucCD, 포르피로모나스 진지발리스 sucD, 포르피로모나스 진지발리스 4hbd fimD:: 마이코박테리움 보비스 sucA, 클로스트리듐 클루이베리 4hbd		 ECKh-422 내로 통합된 숙시네이트 및 알파-케토글루타레이트 상부 경로 가지 포르피로모나스 진지발리스 Cat2, 클로스트리듐 베이제링키이 Ald
12 ECKh-432 ΔadhE ΔldhA ΔpflB
ΔlpdA::K.p.lpdA322 Δmdh
ΔarcA gltAR163L fimD:: 에스케리키아 콜라이 sucCD, 포르피로모나스 진지발리스 sucD, 포르피로모나스 진지발리스 4hbd fimD:: 마이코박테리움 보비스 sucA, 클로스트리듐 클루이베리 4hbd		 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 buk1, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ptb, 클로스트리듐 베이제링키이 Ald
13 ECKh-439 ΔadhE ΔldhA ΔpflB
ΔlpdA::K.p.lpdA322 Δmdh
ΔarcA gltAR163L ΔackA fimD:: 에스케리키아 콜라이 sucCD, 포르피로모나스 진지발리스 sucD, 포르피로모나스 진지발리스 4hbd fimD:: 마이코박테리움 보비스 sucA, 클로스트리듐 클루이베리 4hbd		 ECKh-432의 아세테이트 키나제 결실 포르피로모나스 진지발리스 Cat2, 클로스트리듐 베이제링키이 Ald
14 ECKh-453 ΔadhE ΔldhA ΔpflB
ΔlpdA::K.p.lpdA322 Δmdh
ΔarcA gltAR163L ΔackA Δppc::H.i.ppck fimD:: 에스케리키아 콜라이 sucCD, 포르피로모나스 진지발리스 sucD, 포르피로모나스 진지발리스 4hbd fimD:: 마이코박테리움 보비스 sucA, 클로스트리듐 클루이베리 4hbd		 ECKh-432의 아세테이트 키나제 결실 및 PPC/PEPCK 치환 포르피로모나스 진지발리스 Cat2, 클로스트리듐 베이제링키이 Ald
15 ECKh-456 ΔadhE ΔldhA ΔpflB
ΔlpdA::K.p.lpdA322 Δmdh
ΔarcA gltAR163L fimD:: 에스케리키아 콜라이 sucCD, 포르피로모나스 진지발리스 sucD, 포르피로모나스 진지발리스 4hbd fimD:: 마이코박테리움 보비스 sucA, 클로스트리듐 클루이베리 4hbd		 ECKh-432에서 lpdA 프로모터의 혐기성 프로모터에 의한 치환 포르피로모나스 진지발리스 Cat2, 클로스트리듐 베이제링키이 Ald
16 ECKh-455 ΔadhE ΔldhA ΔpflB
ΔlpdA::K.p.lpdA322 ΔpdhR::fnr-pflB6 Δmdh
ΔarcA gltAR163L fimD:: 에스케리키아 콜라이 sucCD, 포르피로모나스 진지발리스 sucD, 포르피로모나스 진지발리스 4hbd fimD:: 마이코박테리움 보비스 sucA, 클로스트리듐 클루이베리 4hbd		 ECKh-432에서 pdhR 및 aceEF 프로모터의 혐기성 프로모터에 의한 치환 포르피로모나스 진지발리스 Cat2, 클로스트리듐 베이제링키이 Ald
17 ECKh-459 ΔadhE ΔldhA ΔpflB
ΔlpdA::K.p.lpdA322 Δmdh
ΔarcA gltAR163L fimD:: 에스케리키아 콜라이 sucCD, 포르피로모나스 진지발리스 sucD, 포르피로모나스 진지발리스 4hbd fimD:: 마이코박테리움 보비스 sucA, 클로스트리듐 클루이베리 4hbd fimD:: 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 buk1, 클리스트리듐 아세토부틸리쿰 ptb		 ECKh-432 내로의 BK/PTB의 통합 클로스트리듐 베이제링키이 Ald
18 ECKh-459 ΔadhE ΔldhA ΔpflB
ΔlpdA::K.p.lpdA322 Δmdh
ΔarcA gltAR163L fimD:: 에스케리키아 콜라이 sucCD, 포르피로모나스 진지발리스 sucD, 포르피로모나스 진지발리스 4hbd fimD:: 마이코박테리움 보비스 sucA, 클로스트리듐 클루이베리 4hbd fimD:: 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 buk1, 클리스트리듐 아세토부틸리쿰 ptb		 클로스트리듐 베이제링키이 Ald, 제오바실러스 써모글루코시다시우스 adh1
19 ECKh-463 ΔadhE ΔldhA ΔpflB
ΔlpdA::K.p.lpdA322 ΔpdhR::fnr-pflB6 Δmdh
ΔarcA gltAR163L fimD:: 에스케리키아 콜라이 sucCD, 포르피로모나스 진지발리스 sucD, 포르피로모나스 진지발리스 4hbd fimD:: 마이코박테리움 보비스 sucA, 클로스트리듐 클루이베리 4hbd rrnC::cscAKB		 ECKh-432 내로 삽입된 비-PTS 슈크로스 유전자 포르피로모나스 진지발리스 Cat2, 클로스트리듐 베이제링키이 Ald
20 ECKh-463 ΔadhE ΔldhA ΔpflB
ΔlpdA::K.p.lpdA322 ΔpdhR::fnr-pflB6 Δmdh
ΔarcA gltAR163L fimD:: 에스케리키아 콜라이 sucCD, 포르피로모나스 진지발리스 sucD, 포르피로모나스 진지발리스 4hbd fimD:: 마이코박테리움 보비스 sucA, 클로스트리듐 클루이베리 4hbd rrnC::cscAKB		 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 buk1, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ptb, 클로스트리듐 베이제링키이 Ald
표 28에 요약된 균주들은 하기와 같다. 균주 1: 내생적인 ldhA의 결실을 갖는, 에스케리키아 콜라이 MG1655의 단일 결실 유도체; 에스케리키아 콜라이 sucCD, 포르피로모나스 진지발리스 sucD, 포르피로모나스 진지발리스 4 hbd, 포르피로모나스 진지발리스 Cat2, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 AdhE2의 플라스미드 발현. 균주 2: 숙주 균주 AB3, 숙시네이트 생산 균주, 내생적인 adhE ldhA pflB의 결실을 갖는, 에스케리키아 콜라이 MG1655의 유도체; 에스케리키아 콜라이 sucCD, 포르피로모나스 진지발리스 sucD, 포르피로모나스 진지발리스 4 hbd, 포르피로모나스 진지발리스 Cat2, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 AdhE2의 플라스미드 발현.
균주 3: 숙주 균주 ECKh-138, 내생적인 adhE , ldhA , pflB의 결실, 내생적인 lpdA의 결실, 및 lpdA 유전자 좌에서 Glu354Lys 돌연변이를 갖는 클렙시엘라 뉴모니아에 lpdA의 염색체 삽입; 에스케리키아 콜라이 sucCD, 포르피로모나스 진지발리스 sucD, 포르피로모나스 진지발리스 4 hbd, 포르피로모나스 진지발리스 Cat2, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 AdhE2의 플라스미드 발현; 균주는 lpdA의 개선을 제공하여 피루베이트 데하이드로게나제 흐름을 증가시킨다. 균주 4: 숙주 균주 ECKh-138, 내생적인 adhE , ldhA , pflB 및 lpdA의 결실, Glu354Lys 돌연변이를 갖는 클렙시엘라 뉴모니아에 lpdA의 염색체 삽입; 에스케리키아 콜라이 sucCD, 포르피로모나스 진지발리스 sucD, 포르피로모나스 진지발리스 4 hbd, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 buk1, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ptb, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 AdhE2의 플라스미드 발현.
균주 5: 숙주 균주 ECKh-401, 내생적인 adhE , ldhA , pflB의 결실, 내생적인 lpdA의 결실, 및 lpdA 유전자 좌에서 Glu354Lys 돌연변이를 갖는 클렙시엘라 뉴모니아에 lpdA의 염색체 삽입, 내생적인 mdh 및 arcA의 결실; 에스케리키아 콜라이 sucCD, 포르피로모나스 진지발리스 sucD, 포르피로모나스 진지발리스 4 hbd, 포르피로모나스 진지발리스 Cat2, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 AdhE2의 플라스미드 발현; 균주는 mdh 및 arcA의 결실을 가져 산화적 TAC 주기를 통한 흐름을 조정한다. 균주 6: 숙주 균주 ECKh-401, 내생적인 adhE , ldhA , pflB의 결실, 내생적인 lpdA의 결실, 및 lpdA 유전자 좌에서 Glu354Lys 돌연변이를 갖는 클렙시엘라 뉴모니아에 lpdA의 염색체 삽입, 내생적인 mdh 및 arcA의 결실; 마이코박테리움 보비스 sucA, 에스케리키아 콜라이 sucCD, 포르피로모나스 진지발리스 sucD, 포르피로모나스 진지발리스 4 hbd, 포르피로모나스 진지발리스 Cat2, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 AdhE2의 플라스미드 발현.
균주 7: 숙주 균주 ECKh-422, 내생적인 adhE , ldhA , pflB의 결실, 내생적인 lpdA의 결실, 및 lpdA 유전자 좌에서 Glu354Lys 돌연변이를 갖는 클렙시엘라 뉴모니아에 lpdA의 염색체 삽입, 내생적인 mdh 및 arcA의 결실, gltA Arg163Leu 돌연변이체에 의한 gltA의 염색체 치환; 에스케리키아 콜라이 sucCD, 포르피로모나스 진지발리스 sucD, 포르피로모나스 진지발리스 4 hbd, 포르피로모나스 진지발리스 Cat2, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 AdhE2의 플라스미드 발현; 균주는 시트레이트 신타제에 돌연변이를 가져 혐기성 활성을 개선시킨다. 균주 8: 균주 ECKh-422, 내생적인 adhE , ldhA , pflB의 결실, 내생적인 lpdA의 결실, 및 lpdA 유전자 좌에서 Glu354Lys 돌연변이를 갖는 클렙시엘라 뉴모니아에 lpdA의 염색체 삽입, 내생적인 mdh 및 arcA의 결실, gltA Arg163Leu 돌연변이체에 의한 gltA의 염색체 치환; 마이코박테리움 보비스 sucA, 에스케리키아 콜라이 sucCD, 포르피로모나스 진지발리스 sucD, 포르피로모나스 진지발리스 4 hbd, 포르피로모나스 진지발리스 Cat2, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 AdhE2의 플라스미드 발현. 균주 9: 숙주 균주 ECKh-422, 내생적인 adhE , ldhA , pflB의 결실, 내생적인 lpdA의 결실, 및 lpdA 유전자 좌에서 Glu354Lys 돌연변이를 갖는 클렙시엘라 뉴모니아에 lpdA의 염색체 삽입, 내생적인 mdh 및 arcA의 결실, gltA Arg163Leu 돌연변이체에 의한 gltA의 염색체 치환; 마이코박테리움 보비스 sucA, 에스케리키아 콜라이 sucCD, 포르피로모나스 진지발리스 sucD, 포르피로모나스 진지발리스 4 hbd, 포르피로모나스 진지발리스 Cat2, 클로스트리듐 베이제링키이 Ald의 플라스미드 발현.
균주 10: 숙주 균주 ECKh-426, 내생적인 adhE , ldhA , pflB의 결실, 내생적인 lpdA의 결실, 및 lpdA 유전자 좌에서 Glu354Lys 돌연변이를 갖는 클렙시엘라 뉴모니아에 lpdA의 염색체 삽입, 내생적인 mdh 및 arcA의 결실, gltA Arg163Leu 돌연변이체에 의한 gltA의 염색체 치환, 에스케리키아 콜라이 sucCD, 포르피로모나스 진지발리스 sucD, 포르피로모나스 진지발리스 4 hbd의 fimD 유전자 좌에서 염색체 삽입; 포르피로모나스 진지발리스 Cat2, 클로스트리듐 베이제링키이 Ald의 플라스미드 발현; 균주는 상기 fimD 유전자 좌에서 균주 ECKh-422 내로 통합된 상부 경로의 숙시네이트 가지를 갖는다. 균주 11: 숙주 균주 ECKh-432, 내생적인 adhE , ldhA , pflB의 결실, 내생적인 lpdA의 결실, 및 lpdA 유전자 좌에서 Glu354Lys 돌연변이를 갖는 클렙시엘라 뉴모니아에 lpdA의 염색체 삽입, 내생적인 mdh 및 arcA의 결실, gltA Arg163Leu 돌연변이체에 의한 gltA의 염색체 치환, 에스케리키아 콜라이 sucCD, 포르피로모나스 진지발리스 sucD, 포르피로모나스 진지발리스 4 hbd의 fimD 유전자 좌에서 염색체 삽입, 마이코박테리움 모비스 sucA, 클로스트리듐 클루이베리 4 hbd의 fimD 유전자 좌에서 염색체 삽입; 포르피로모나스 진지발리스 Cat2, 클로스트리듐 베이제링키이 Ald의 플라스미드 발현; 균주는 균주 ECKh-422 내로 통합된 숙시네이트 및 알파-케토글루타레이트 상부 경로 가지를 갖는다. 균주 12: 숙주 균주 ECKh-432, 내생적인 adhE , ldhA , pflB의 결실, 내생적인 lpdA의 결실, 및 lpdA 유전자 좌에서 Glu354Lys 돌연변이를 갖는 클렙시엘라 뉴모니아에 lpdA의 염색체 삽입, 내생적인 mdh 및 arcA의 결실, gltA Arg163Leu 돌연변이체에 의한 gltA의 염색체 치환, 에스케리키아 콜라이 sucCD, 포르피로모나스 진지발리스 sucD, 포르피로모나스 진지발리스 4 hbd의 fimD 유전자 좌에서 염색체 삽입; 마이코박테리움 모비스 sucA, 클로스트리듐 클루이베리 4 hbd의 fimD 유전자 좌에서 염색체 삽입; 클로스트리듐 buk1, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ptb, 클로스트리듐 베이제링키이 Ald의 플라스미드 발현.
균주 13: 숙주 균주 ECKh-439, 내생적인 adhE , ldhA , pflB의 결실, 내생적인 lpdA의 결실, 및 lpdA 유전자 좌에서 Glu354Lys 돌연변이를 갖는 클렙시엘라 뉴모니아에 lpdA의 염색체 삽입, 내생적인 mdh 및 arcA의 결실, gltA Arg163Leu 돌연변이체에 의한 gltA의 염색체 치환, 내생적인 ackA의 결실, 에스케리키아 콜라이 sucCD, 포르피로모나스 진지발리스 sucD, 포르피로모나스 진지발리스 4 hbd의 fimD 유전자 좌에서 염색체 삽입, 마이코박테리움 모비스 sucA, 클로스트리듐 클루이베리 4 hbd의 fimD 유전자 좌에서 염색체 삽입; 포르피로모나스 진지발리스 Cat2, 클로스트리듐 베이제링키이 Ald의 플라스미드 발현; 균주는 균주 ECKh-432에서 아세테이트 키나제 결실을 갖는다. 균주 14: 숙주 균주 ECKh-453, 내생적인 adhE , ldhA, pflB의 결실, 내생적인 lpdA의 결실, 및 lpdA 유전자 좌에서 Glu354Lys 돌연변이를 갖는 클렙시엘라 뉴모니아에 lpdA의 염색체 삽입, 내생적인 mdh 및 arcA의 결실, gltA Arg163Leu 돌연변이체에 의한 gltA의 염색체 치환, 내생적인 ackA의 결실, 내생적인 ppc의 결실 및 ppc 유전자 좌에서 하에모필루스 인플루엔자 ppck의 삽입, 에스케리키아 콜라이 sucCD, 포르피로모나스 진지발리스 sucD, 포르피로모나스 진지발리스 4 hbd의 fimD 유전자 좌에서 염색체 삽입, 마이코박테리움 모비스 sucA, 클로스트리듐 클루이베리 4 hbd의 fimD 유전자 좌에서 염색체 삽입; 포르피로모나스 진지발리스 Cat2, 클로스트리듐 베이제링키이 Ald의 플라스미드 발현; 균주는 균주 ECKh-432에서 아세테이트 키나제 결실 및 PPC/PEPCK 치환을 갖는다.
균주 15: 숙주 균주 ECKh-456, 내생적인 adhE , ldhA , pflB의 결실, 내생적인 lpdA의 결실, 및 lpdA 유전자 좌에서 Glu354Lys 돌연변이를 갖는 클렙시엘라 뉴모니아에 lpdA의 염색체 삽입, 내생적인 mdh 및 arcA의 결실, gltA Arg163Leu 돌연변이체에 의한 gltA의 염색체 치환, 에스케리키아 콜라이 sucCD, 포르피로모나스 진지발리스 sucD, 포르피로모나스 진지발리스 4 hbd의 fimD 유전자 좌에서 염색체 삽입, 마이코박테리움 모비스 sucA, 클로스트리듐 클루이베리 4 hbd의 fimD 유전자 좌에서 염색체 삽입, lpdA 프로모터의 fnr 결합 부위, pflB-p6 프로모터 및 pflB의 RBS에 의한 치환; 포르피로모나스 진지발리스 Cat2, 클로스트리듐 베이제링키이 Ald의 플라스미드 발현; 균주는 균주 ECKh-432에서 lpdA 프로모터의 혐기성 프로모터에 의한 치환을 갖는다. 균주 16: 숙주 균주 ECKh-455, 내생적인 adhE , ldhA , pflB의 결실, 내생적인 lpdA의 결실, 및 lpdA 유전자 좌에서 Glu354Lys 돌연변이를 갖는 클렙시엘라 뉴모니아에 lpdA의 염색체 삽입, 내생적인 mdh 및 arcA의 결실, gltA Arg163Leu 돌연변이체에 의한 gltA의 염색체 치환, 에스케리키아 콜라이 sucCD, 포르피로모나스 진지발리스 sucD, 포르피로모나스 진지발리스 4 hbd의 fimD 유전자 좌에서 염색체 삽입, 마이코박테리움 모비스 sucA, 클로스트리듐 클루이베리 4 hbdI의 fimD 유전자 좌에서 염색체 삽입, pdhR 및 aceEF 프로모터의 fnr 결합 부위, pflB-p6 프로모터 및 pflB의 RBS에 의한 치환; 포르피로모나스 진지발리스 Cat2, 클로스트리듐 베이제링키이 Ald의 플라스미드 발현; 균주는 균주 ECKh-432에서 pdhR 및 aceEF 프로모터의 혐기성 프로모터에 의한 치환을 갖는다.
균주 17: 숙주 균주 ECKh-459, 내생적인 adhE , ldhA , pflB의 결실, 내생적인 lpdA의 결실, 및 lpdA 유전자 좌에서 Glu354Lys 돌연변이를 갖는 클렙시엘라 뉴모니아에 lpdA의 염색체 삽입, 내생적인 mdh 및 arcA의 결실, gltA Arg163Leu 돌연변이체에 의한 gltA의 염색체 치환, 에스케리키아 콜라이 sucCD, 포르피로모나스 진지발리스 sucD, 포르피로모나스 진지발리스 4 hbd의 fimD 유전자 좌에서 염색체 삽입, 마이코박테리움 모비스 sucA, 클로스트리듐 클루이베리 4 hbd의 fimD 유전자 좌에서 염색체 삽입, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 buk1, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ptb의 fimD 유전자 좌에서 염색체 삽입; 클로스트리듐 베이제링키이 Ald의 플라스미드 발현; 균주는 균주 ECKh-432 내로의 BK/PTB의 통합을 갖는다. 균주 18: 숙주 균주 ECKh-459, 내생적인 adhE , ldhA , pflB의 결실, 내생적인 lpdA의 결실, 및 lpdA 유전자 좌에서 Glu354Lys 돌연변이를 갖는 클렙시엘라 뉴모니아에 lpdA의 염색체 삽입, 내생적인 mdh 및 arcA의 결실, gltA Arg163Leu 돌연변이체에 의한 gltA의 염색체 치환, 에스케리키아 콜라이 sucCD, 포르피로모나스 진지발리스 sucD, 포르피로모나스 진지발리스 4 hbd의 fimD 유전자 좌에서 염색체 삽입, 마이코박테리움 모비스 sucA, 클로스트리듐 클루이베리 4 hbd의 fimD 유전자 좌에서 염색체 삽입, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 buk1, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ptb의 fimD 유전자 좌에서 염색체 삽입; 클로스트리듐 베이제링키이 Ald, 제오바실러스 써모글루코시다시우스 adh1의 플라스미드 발현.
균주 19: 숙주 균주 ECKh-463, 내생적인 adhE , ldhA , pflB의 결실, 내생적인 lpdA의 결실, 및 lpdA 유전자 좌에서 Glu354Lys 돌연변이를 갖는 클렙시엘라 뉴모니아에 lpdA의 염색체 삽입, 내생적인 mdh 및 arcA의 결실, gltA Arg163Leu 돌연변이체에 의한 gltA의 염색체 치환, 에스케리키아 콜라이 sucCD, 포르피로모나스 진지발리스 sucD, 포르피로모나스 진지발리스 4 hbd의 fimD 유전자 좌에서 염색체 삽입, 마이코박테리움 모비스 sucA, 클로스트리듐 클루이베리 4 hbd의 fimD 유전자 좌에서 염색체 삽입, rrnC 유전자 좌에서 비-PTS 슈크로스 오페론 유전자 슈크로스 퍼미아제(cscB), D-프럭토키나제(cscK), 슈크로스 하이드롤라제(cscA), 및 LacI-관련된 슈크로스-특이적 억제인자(cscR)의 삽입; 포르피로모나스 진지발리스 Cat2, 클로스트리듐 베이제링키이 Ald의 플라스미드 발현; 균주는 균주 ECKh-432에 삽입된 비-PTS 슈크로스 유전자를 갖는다. 균주 20: 숙주 균주 ECKh-463, 내생적인 adhE, ldhA , pflB의 결실, 내생적인 lpdA의 결실, 및 lpdA 유전자 좌에서 Glu354Lys 돌연변이를 갖는 클렙시엘라 뉴모니아에 lpdA의 염색체 삽입, 내생적인 mdh 및 arcA의 결실, gltA Arg163Leu 돌연변이체에 의한 gltA의 염색체 치환, 에스케리키아 콜라이 sucCD, 포르피로모나스 진지발리스 sucD, 포르피로모나스 진지발리스 4 hbd의 fimD 유전자 좌에서 염색체 삽입, 마이코박테리움 모비스 sucA, 클로스트리듐 클루이베리 4 hbd의 fimD 유전자 좌에서 염색체 삽입, rrnC 유전자 좌에서 비-PTS 슈크로스 오페론의 삽입; 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 buk1, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ptb, 클로스트리듐 베이제링키이 Ald의 플라스미드 발현.
표 28에 개시된 것들을 포함하여 본 발명에 개시된 BDO 생산 균주들 이외에, BDO의 생산을 더욱 증가시키고/시키거나 바람직하지 못한 부산물을 감소시키는 추가의 변형들을 포함시킬 수 있는 것으로 생각된다. 예를 들어, BDO 생산 균주, 또는 표 28의 균주는 추가로 녹아웃을 포함하여 BDO의 생산을 더욱 증가시키거나 바람직하지 못한 부산물을 감소시킬 수 있다. 예시적인 녹아웃들은 앞서 개시되었다(미국 공보 2009/0047719 참조). 상기와 같은 녹아웃 균주들로는 비 제한적으로 하기와 같은 것들이 있다:
Figure pct00100
표 29는 에스케리키아 콜라이와 같은 숙주 유기체로부터 녹아웃되는 상응하는 유전자들의 반응을 나타낸다. 표 29의 약어들에 상응하는 대사 산물을 표 30에 나타낸다.
Figure pct00101
Figure pct00102
Figure pct00103
표 29에 사용된 약어들에 상응하는 대사 산물 명칭
대사 산물 약어 대사 산물 명칠
10fthf 10-폼일테트라하이드로폴레이트
1pyr5c 1-피롤린-5-카복실레이트
2ddg6p 2-데하이드로-3-데옥시-D-글루코네이트 6-포스페이트
2dmmq8 2-데메틸메나퀴논 8
2dmmq18 2-데메틸메나퀴놀 8
2pg D-글리세레이트 2-포스페이트
3pg 3-포스포-D-글리세레이트
6pgc 6-포스포-D-글루코네이트
6pgl 6-포스포-D-글루코노-1, 5-락톤
ac 아세테이트
acald 아세트알데하이드
accoa 아세틸-CoA
actp 아세틸 포스페이트
adp ADP
akg 2-옥소글루타레이트
amp AMP
asn-L L-아스파라진
asp-L L-아스파테이트
atp ATP
cbp 카바모일 포스페이트
co2 CO2
coa 조효소 A
dhap 다이하이드록시아세톤 포스페이트
e4p D-에리쓰로스 4-포스페이트
etoh 에탄올
f6p D-프럭토스 6-포스페이트
fad 산화된 플라빈 아데닌 다이뉴클레오타이드
fadh2 환원된 플라빈 아데닌 다이뉴클레오타이드
fdp D-프럭토스 1,6-비스포스페이트
for 포메이트
fum 퓨마레이트
g3p 글리세르알데하이드 3-포스페이트
g6p D-글루코스 6-포스페이트
glc-D D-글루코스
glu5p L-글루타메이트 5-포스페이트
glu5sa L-글루타메이트 5-세미알데하이드
glu-L L-글루타메이트
glx 글리옥실레이트
gly 글리신
h H+
h2o H2O
icit 아이소시트레이트
lac-D D-락테이트
mal-L L-말레이트
methf 5,10-메테닐테트라하이드로폴레이트
mlthf 5,10-메틸렌테트라하이드로폴레이트
mql8 메나퀴놀 8
mqn8 메나퀴논 8
nad 니코틴아미드 아레닌 다이뉴클레오타이드
nadh 환원된 니코틴아미드 아레닌 다이뉴클레오타이드
nadp 니코틴아미드 아레닌 다이뉴클레오타이드 포스페이트
nadph 환원된 니코틴아미드 아레닌 다이뉴클레오타이드 포스페이트
nh4 암모늄
oaa 옥살로아세테이트
pep 포스포에놀피루베이트
pi 포스페이트
ppi 다이포스페이트
pro-L L-프롤린
pyr 피루베이트
q8 유비퀴논-8
q8h2 유비퀴놀-8
ru5p-D D-리뷸로스 5-포스페이트
s7p 세도헵튤로스 7-포스페이트
so4 설페이트
succ 숙시네이트
succoa 숙시닐-CoA
thf 5,6,7,8-테트라하이드로폴레이트
xu5p-D D-자이룰로스 5-포스페이트
실시예 XX
BDO 생산을 위한 예시적인 경로
본 실시예는 BDO 경로 효소로서 카복실산 리덕타제를 사용하여 4-하이드록시부탄알(4-HBal) 및/또는 BDO를 생산하는 예시적인 경로를 예시한다.
BDO의 생산을 위한 예시적인 경로는 4-하이드록시부티레이트를 4-하이드록시부탄알로 전환시키는 NAD+ 또는 NADP+ 아릴-알데하이드 데하이드로게나제(E.C.: 1.2.1.29 및 1.2.1.30) 및 4-하이드록시부탄알을 1,4-부탄다이올로 전환시키는 알콜 데하이드로게나제의 사용을 포함한다. 4-하이드록시부티레이트는 도 58에 도시된 바와 같이 트라이카복실산 주기 중간체 숙시닐-CoA 및/또는 알파-케토글루타레이트로부터 유도될 수 있다.
아릴- 알데하이드 데하이드로게나제(또는 카복실산 리덕타제 )
아릴-알데하이드 데하이드로게나제, 또는 동등하게 카복실산 리덕타제는 노카르디아 이오웬시스(Nocardia iowensis)에서 발견될 수 있다. 카복실산 리덕타제는 카복실산의 그의 상응하는 알데하이드로의 마그네슘, ATP 및 NADPH-의존성 환원을 촉매화하며(문헌[Venkitasubramanian et al., J Biol. Chem. 282:478-485(2007)]) 4-하이드록시부티레이트의 4-하이드록시부탄알로의 전환을 촉매화할 수 있다. car에 의해 암호화된 상기 효소를 에스케리키아 콜라이에서 클로닝하고 작용상 발현시켰다(문헌[Venkitasubramanian et al., J Biol. Chem. 282:478-485(2007)]). 상기 npt 유전자 산물의 발현은 전사 후 변경을 통해 상기 효소의 활성을 개선시켰다. 상기 npt 유전자는 불활성 아포-효소를 활성 전효소로 전환시키는 특정한 포스포판테쎄인 트랜스퍼라제(PPTase)를 암호화한다. 상기 효소의 천연 기질은 바닐산이며 상기 효소는 방향족 및 지방족 기질의 광범위한 수용을 나타낸다(문헌[Venkitasubramanian et al., in Biocatalysis in the Pharmaceutical and Biotechnology Industries, ed. R.N. Patel, Chapter 15, pp.425-440, CRC Press LLC, Boca Raton, FL.(2006)]).
Figure pct00104
추가적인 car 및 npt 유전자를 서열 상동성을 근거로 동정할 수 있다.
Figure pct00105
스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus)에서 발견되는 추가적인 효소 후보는 griC 및 griD 유전자에 의해 암호화된다. 상기 효소는 griC 또는 griD의 결실로서 3-아미노-4-하이드록시벤조산을 3-아미노-4-하이드록시벤즈알데하이드로 전환시켜 3-아미노-4-하이드록시벤조산 대사의 단락 생성물인 세포 외 3-아세틸아미노-4-하이드록시벤조산이 축적되게 하는 것으로 여겨진다(문헌[Suzuki, et al., J. Antibiot. 60(6):380-387(2007)]). 노카르디아 이오웬시스 npt와 서열이 유사한 효소인 SGR_665와 griC 및 griD 의 동시 발현이 유리할 수도 있다.
유사한 특성을 갖는 효소인, 알파-아미노아디페이트 리덕타제(AAR, EC 1.2.1.31)는 일부 진균 종들에서 리신 생합성 경로에 관여한다. 상기 효소는 알파-아미노아디페이트를 알파-아미노아디페이트 세미알데하이드로 자연적으로 환원시킨다. 상기 카복실 그룹을 먼저 아데닐레이트의 ATP-의존적인 형성을 통해 활성화시키고 이어서 NAD(P)H에 의해 환원시켜 알데하이드 및 AMP를 제공한다. CAR과 같이, 상기 효소는 마그네슘을 사용하며 PPTase에 의한 활성화를 필요로 한다. AAR 및 그의 상응하는 PPTase에 대한 효소 후보는 사카로마이세스 세레비지아에(문헌[Morris et al., Gene 98:141-145(1991)]), 칸디다 알비칸스(문헌[Guo et al., Mol. Genet. Genomics 269:271-279(2003)]), 및 시조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)(문헌[Ford et al, Curr. Genet. 28:131-137(1995)])에서 발견된다. 상기 시조사카로마이세스 폼베로부터의 AAR은 에스케리키아 콜라이에서 발현 시 현저한 활성을 나타내었다(문헌[Guo et al., Yeast 21:1279-1288(2004)]). 페니실리움 크리소제눔으로부터의 AAR은 또 다른 기질로서 S-카복시메틸-L-시스테인을 수용하지만, 아디페이트, L-글루타메이트 또는 다이아미노피멜레이트와는 반응하지 않았다(문헌[Hijarrubia et al., J Biol. Chem 278:8250-8256(2003)]). 상기 페니실리움 크리소제눔 PPTase를 암호화하는 유전자는 지금까지 동정되지 않았다.
Figure pct00107
BDO 생산을 위해 카복실산 리덕타제를 사용하는 여러 가지 이점들이 존재한다. 아실-CoA 또는 아실-포스페이트 리덕타제를 통해 4-하이드록시부티레이트의 활성화된 버전(예를 들어 4-하이드록시부티릴-CoA, 4-하이드록시부티릴-Pi)로부터 4-하이드록시부탄알을 형성하는 것에 비해 카복실산 리덕타제를 통해 4-하이드록시부티레이트로부터 4-하이드록시부탄알을 형성하는 2 가지 이상의 이점이 존재한다. 먼저, 부산물로서 감마-부티로락톤(GBL)의 형성이 크게 감소된다. 4-하이드록시부티레이트의 활성화된 버전이 불활성화된 4-하이드록시부티레이트보다 더 쉽게 GBL로 환화되는 것으로 여겨진다. 상기 카복실산 리덕타제의 사용은 유리 활성화된 4-하이드록시부티레이트 중간체를 거쳐야하는 필요성을 제거하여, BDO 생산을 동반하는 부산물로서 GBL의 형성을 감소시킨다. 두 번째로, 부산물로서 에탄올의 형성이 크게 감소된다. 알데하이드- 또는 알콜-형성 4-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제를 사용하여 4-하이드록시부티릴-CoA를 각각 4-하이드록시부탄알 또는 1,4-부탄다이올로 전환시키는 경우 종종 에탄올이 다양한 양으로 형성된다. 이는 대부분, 전부는 아니지만, 알데하이드- 또는 알콜-형성 4-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제가 4-하이드록시부티릴-CoA 이외에 기질로서 아세틸-CoA를 수용할 수 있기 때문이다. 예를 들어, 알데하이드-형성 효소는 종종 아세틸-CoA의 아세트알데하이드로의 전환을 촉매화하며, 상기 아세트알데하이드는 후속적으로 고유 또는 비-고유 알콜 데하이드로게나제에 의해 에탄올로 환원된다. 기질로서 아세틸-CoA를 수용하는 알콜-형성 4-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제는 아세틸-CoA를 에탄올로 직접 전환시킬 것이다. 이는 카복실산 리덕타제 효소가 알데하이드- 또는 알콜-형성 아실-CoA 리덕타제 효소보다 아세틸-CoA에 대해 훨씬 적은 활성을 가지며, 따라서 BDO 생산에 대한 이의 적용은 최소의 에탄올 부산물 형성을 생성시키는 것으로 여겨진다(하기 참조).
실시예 XXI
카복실산 리덕타제 효소를 사용하는 1,4- 부탄다이올의 생합성
본 실시예는 카복실산 리덕타제 효소를 사용하여 1,4-부탄다이올을 생산하는 미생물 유기체의 생성을 개시한다.
에스케리키아 콜라이를 도 58에 개시된 1,4-부탄다이올 합성 경로를 조작하기 위한 표적 유기체로서 사용한다. 에스케리키아 콜라이는 1,4-부탄다이올을 생산할 수 있는 비-천연 미생물을 생성시키기에 양호한 숙주를 제공한다. 에스케리키아 콜라이는 유전자 조작이 쉽고 다양한 산소화 조건 하에서 유효하게 에탄올, 아세트산, 폼산, 락트산, 및 숙신산과 같은 다양한 생성물들을 생산할 수 있는 것으로 공지되어 있다.
4- 하이드록시부티레이트 경로 유전자의 염색체 내로의 통합: ECKh -432의 제작
카복실산 리덕타제 효소를 에스케리키아 콜라이 지정된 ECKh-432의 균주(그의 제작은 실시예 XVII에 개시되어 있다)에서 발현시켰다. 상기 균주는 fimD 유전자 좌에서 에스케리키아 콜라이의 염색체 내로 통합되는, 4HB에 이르는 상기 BDO 경로의 성분들을 함유하였다.
실시예 XVII에 개시된 바와 같이, 상부 경로의 숙시네이트 가지를 λ 레드 상동성 재조합 방법(문헌[Datsenko and Wanner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645(2000)])을 사용하여 에스케리키아 콜라이 염색체에 통합시켰다. 프로모터, 숙시닐-CoA 리가제를 암호화하는 에스케리키아 콜라이의 sucCD 유전자, 숙시닐-CoA 리덕타제를 암호화하는 포르피로모나스 진지발리스의 sucD 유전자(알데하이드 형성)(도 58의 단계 A), 4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제를 암호화하는 포르피로모나스 진지발리스의 4 hbd 유전자(도 58의 단계 C), 및 종결자 서열을 함유하는 다시스트론성 DNA 단편을 상기 pKD3 플라스미드의 AflIII 부위에 삽입하였다.
실시예 XVII에 개시된 바와 같이, 상부 경로의 알파-케토글루타레이트 가지를 상동성 재조합에 의해 염색체에 통합시켰다. 이 변형에 사용된 플라스미드는 가나마이신-내성 유전자, 레반슈크라제를 함유하는 유전자(sacB) 및 R6K 조건부 복제 기원을 함유하는 pRE118-V2(oriT 및 IS 서열이 결실된 pRE118(ATCC87693))이었다. 상기 통합 플라스미드는 또한 프로모터, 알파-케토글루타레이트 데카복실라제를 암호화하는 마이코박테리움 보비스로부터의 sucA 유전자(도 58의 단계 B), 4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제를 암호화하는 클로스트리듐 클루이베리 4 hbd 유전자(단계 58의 단계 C), 및 표적 삽입 부위의 측면 인접 영역들에 상동성인 2 개의 1.5-kb DNA 단편 사이에 삽입된 종결자를 갖는 다시스트론성 서열을 함유하였다. 상기 생성되는 플라스미드를 사용하여 에스케리키아 콜라이 균주를 형질전환시켰다. 상기 통합 후보를 가나마이신을 함유하는 플레이트 상에서 선택하였다. 정확한 통합 부위를 PCR에 의해 확인하였다. 상기 염색체로부터 항생물질 마커를 분석하기 위해서, 상기 세포를 슈크로스 함유 배지에서 생육에 대해 선택하였다. 최종 균주를 PCR 및 DNA 서열화에 의해 확인하였다.
수용체 에스케리키아 콜라이 균주는 ECKh-422(ΔadhE ΔldhA ΔpflB ΔlpdA::K.p.lpdA322 Δmdh ΔarcA gltAR 163L)이었으며, 이의 제작은 실시예 XV에 개시되어 있다. ECKh-422는 gltA에 의해 암호화된 시트레이트 신타제의 NADH-둔감성을 도출하는 돌연변이 gltAR163L을 함유한다. 상기는 하기 개시하는 바와 같이 염색체에 통합된 클렙시엘라 뉴모니아로부터의 lpdA 유전자의 NADH-둔감성 버전을 추가로 함유한다.
상기 고유 lpdA의 대체는 실시예 XIV에 개시되는 바와 같이, 클렙시엘라 뉴모니에로부터의 NADH-둔감성 lpdA로 대체되었다. 생성되는 벡터를 pRE118-V2로 나타내었다(도 34 참조).
카복실산 리덕타제 및 PPTase 의 클로닝 및 발현
1,4-부탄다이올을 생산하도록 조작된 에스케리키아 콜라이 균주를 생성시키기 위해서, 카복실산 리덕타제 및 포스포판테쎄인 트랜스퍼라제를 암호화하는 핵산을 널리 공지된 분자 생물학 기법을 사용하여 에스케리키아 콜라이에서 발현시킨다(예를 들어 상기 문헌[Sambrook, 2001]; [Ausubel, 1999] 참조). 특히, car(AAR91681.1) 및 npt(ABI83656.1) 유전자를 PA1/lacO 프로모터 하에서 pZS*13 벡터(Expressys, Ruelzheim, Germany) 내로 클로닝하였다. 상기 car 유전자(GNM_720)는 노카르디아 게놈 DNA로부터 PCR에 의해 클로닝되었다. 그의 핵산 및 단백질 서열을 각각 도 59a 및 59b에 나타낸다.
npt 유전자(GNM_721)의 코돈 최적화된 버전은 진아트(GeneArt)(Regensburg, Germany)에 의해 합성되었다. 그의 핵산 및 단백질 서열을 각각 도 60a 및 60b에 나타낸다. GNM_720 및 GNM_721을 pZS*13에 클로닝하여 생성되는 벡터를 도 61에 나타낸다.
상기 플라스미드를 1,4-부탄다이올 생산에 필요한 단백질 및 효소를 발현하도록 ECKh-432 내로 형질전환시켰다. 오직 GNM_720 및 오직 GNM_721만을 함유하는 플라스미드의 또 다른 버전을 또한 제작하였다.
카복실산 리덕타제를 사용하는 1,4- BDO 생산의 설명.
1,4-부탄다이올 경로의 작용성 발현을 에스케리키아 콜라이 전-세포 배양물을 사용하여 설명하였다. GNM_720 및 GNM_721을 모두 함유하는 pZS*13 플라스미드로 형질전환된 에스케리키아 콜라이 ECKh-432의 단일 콜라니를 적합한 항생물질을 함유하는 5 ㎖의 LB 배지에 접종하였다. 유사하게, GNM_720 또는 GNM_721을 함유하는 상기 pZS*13 플라스미드로 형질전환된 에스케리키아 콜라이 ECKh-432의 단일 콜로니를 적합한 항생물질을 함유하는 5 ㎖ 분액의 LB 배지에 접종하였다. 적합한 항생물질을 함유하는 신선한 최소 생체 내 전환 배지(하기 참조)를 1%의 최초 배양물로 접종함으로써 10 ㎖의 미세-호기성 배양을 시작하였다.
상기 최소 생체 내 전환 배지(1000 ㎖에 대한)의 처방전은 하기와 같다:
Figure pct00108
먼저 캡핑된 혐기성 병을 질소로 5 분간 초기에 플러싱시키고, 이어서 접종 후에 상기 격벽을 18G 바늘로 관통함으로써 미세호기성 조건을 확립시켰다. 상기 바늘을 소량의 공기가 상기 병 안으로 들어가도록 하기 위해서 생육 중 상기 병에 유지시켰다. 상기 배양물이 중간 대수 증식기에 도달하면 0.2 mM IPTG로 단백질 발현을 유도하였다. 이를 시간 = 0 시간으로 간주한다. 상기 배양 상등액을 상기 및 WO2008115840에 개시된 바와 같이 BDO, 4HB, 및 다른 부산물에 대해 분석하였다(표 31 참조).
Figure pct00109
상기 결과는 상기 카복실산 리덕타제 유전자, GNM_720이 ECKh-432에서 BDO 형성에 필요하고, 그의 유효성은 PPTase, GNM-721과 함께 발현 시 증가함을 입증한다. GBL 및 에탄올은, GNM_720을 단독으로 또는 GNM_721과 함께 발현하는 균주에서 BDO보다 훨씬 소량으로 생성되었다.
카복실산 리덕타제를 사용하는 BDO 로의 추가적인 경로
카복실산 리덕타제는 TCA 주기 대사 산물: 숙시네이트, 숙시닐-CoA, 및 알파-케토글루타레이트로부터 1,4-부탄다이올로의 많은 경로들 중 한 성분으로서 작용할 수 있음이 예상된다. 이들 경로들 중 다수가 도 62에 개시되어 있다. 모든 경로들은 글루코스를 탄소원으로서 가정할 때 1 mol/mol 이상의 이론적인 BDO 수율을 이끌어낼 수 있다. 유사한 높은 이론적인 수율이 많은 다른 것들 중에서도 슈크로스, 자일로스, 아라비노스, 합성 가스를 포함하는 추가적인 기질로부터 획득될 수 있다. 카복실산 리덕타제 단독 또는 PPTase와의 병행 발현(즉 도 62의 단계 F 및 D를 촉매화하기 위해)은, 충분한 내생적인 알콜 데하이드로게나제 활성이 도 62의 단계 C 및 E를 촉매화하기 위해 존재하는 한 숙시네이트로부터의 1,4-부탄다이올 생산에 충분한 것으로 예상된다. 도 62의 단계 A 내지 Z에 대한 후보 효소들을 섹션 XXIII에 개시한다.
실시예 XXII
카복실산 리덕타제를 사용하는 푸트레신으로의 경로
본 실시예는 카복실산 리덕타제를 사용하는 예시적인 푸트레신 경로를 개시한다.
푸트레신(또한 1,4-다이아미노부탄 또는 부탄다이아민으로서 공지됨)은 화학식 NH2(CH2)4NH2의 유기 화학 화합물이다. 이를 아디프산과 반응시켜 폴리아미드 나일론-4,6(이는 DSM(Heerlen, Netherland)에 의해 상표명 StanylTM으로서 판매된다)을 제공할 수 있다. 푸트레신은 예를 들어 살아있는 및 죽은 유기체에서 아미노산의 천연 붕괴에 의해 자연적으로 생산된다. 에스케리키아 콜라이를, 고유 오르니틴 생합성 기구뿐만 아니라 오르니틴 데카복실라제를 과발현시킴으로써 푸트레신을 생산하도록 조작하였다(문헌[Qian, et al., Biotechnol. Bioeng. 104(4):651-662(2009)]).
도 63은 숙시네이트, 숙시닐-CoA, 또는 알파-케토글루타레이트로부터 푸트레신의 생산을 유도하고 카복실산 리덕타제를 사용하는 다수의 추가적인 생합성 경로를 개시한다. 이들 경로 중 어느 것도 4-아미노부티레이트의 활성화된 버전, 예를 들어 4-아미노부티릴-CoA(아실-CoA 리덕타제에 의해 4-아미노부탄알로 환원될 수 있으나 그의 락탐, 2-피롤리디논으로 쉽게 환화될 수 있다(문헌[Ohsugi, et al., J. Biol. Chem. 256:7642-7651(1981)])의 형성에 필요하지 않음에 주목한다. 모든 경로는 글루코스를 탄소원으로서 가정할 때 1 mol/mol 이상의 이론적인 푸트레신 수율을 이끌어낼 수 있다. 유사한 높은 이론적인 수율이 많은 다른 것들 중에서도 슈크로스, 자일로스, 아라비노스, 합성 가스를 포함하는 추가적인 기질로부터 획득될 수 있다. 도 63의 단계 A 내지 U에 대한 후보 효소들을 섹션 XXIII에 개시한다.
실시예 XXIII
C4 화합물의 생산을 위한 예시적인 효소
본 실시예는 1,4-부탄다이올, 4-하이드록시부탄알 및 푸트레신과 같은 C4 화합물의 생산을 위한 예시적인 효소들을 개시한다.
효소 부류
도 58, 62 및 63에 도시된 모든 형질전환들은 표 32에 나타낸 형질전환들의 일반적인 범주 내에 있다. 본 실시예는 각 범주 중의 다수의 생화학적으로 특성화된 유전자들을 개시한다. 클로닝 및 발현 시 도 58, 62 및 63에서 적합한 형질전환들을 촉매화하는데 적용할 수 있는 유전자들을 구체적으로 나열한다. 각 표지의 처음 3 개 숫자는 기질 특이성과 무관하게 일반적인 형질전환 유형을 나타내는 상기 처음 3 개 효소 위원회 번호 숫자에 상응한다.
도 58, 62 및 63에 도시된 효소 형질전환들의 부류
표지 작용
1.1.1.a 옥시도리덕타제(옥소에서 알콜로)
1.1.1.c 옥시도리덕타제(2 단계, 아실-CoA에서 알콜로)
1.2.1.b 옥시도리덕타제(아실-CoA에서 알데하이드로)
1.2.1.c 옥시도리덕타제(2-옥소산에서 아실-CoA로, 탈카복실화)
1.2.1.d 옥시도리덕타제(포스포네이트 리덕타제)
1.2.1.e 산 리덕타제
1.4.1.a 옥시도리덕타제(아민화)
2.3.1.a 아실트랜스퍼라제(포스페이트 그룹을 CoA로 운반)
2.6.1.a 아미노트랜스퍼라제
2.7.2.a 포스포트랜스퍼라제(카복시 수용체)
2.8.3.a CoA 트랜스퍼라제
3.1.2.a CoA 하이드롤라제
4.1.1.a 카복시-라이아제
6.2.1.a CoA 신시타제
1.1.1.a 옥시도리덕타제(옥소에서 알콜로)
알데하이드에서 알콜로 .
도 58, 62 및 63에 개시된 3 개의 형질전환은 알데하이드에서 알콜로의 전환을 수반한다. 이들은 4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제(단계 C, 도 58 및 62), 1,4-부탄다이올 데하이드로게나제(단계 E, 도 58 및 62), 및 5-하이드록시-2-펜탄산(단계 Y, 도 62)이다. 알데하이드의 알콜로의 전환을 촉매화하는 효소, 즉 알콜 데하이드로게나제 또는 동등하게 알데하이드 리덕타제를 암호화하는 예시적인 유전자는 C2-C14의 경우 중간-쇄 알콜 데하이드로게나제를 암호화하는 alrA(문헌[Tani et al., Appl. Environ. Microbiol., 66:5231-5235(2000)]), 사카로마이세스 세레비지아에로부터 ADH2(문헌[Atsumi et al., Nature, 451:86-89(2008)]), C(3)보다 긴 분자를 선호하는 에스케리키아 콜라이로부터의 yqhD(문헌[Sulzenbacher et al., J. of Molecular Biology, 342:489-502(2004)]), 및 부티르알데하이드를 부탄올로 전환시키는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰으로부터의 bdhI 및 bdhII(문헌[Walter et al., J. of Bacteriology, 174:7149-7158(1992)])를 포함한다. 이들 예시적인 유전자 산물들 각각에 대한 단백질 서열을, 입수할 수 있는 경우, 하기 젠뱅크(GenBank) 수납 번호를 사용하여 찾을 수 있다:
Figure pct00110
4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제 활성을 나타내는 효소들(EC 1.1.1.61)이 또한 상기 범주 내에 있다. 상기와 같은 효소들은 랄스토니아 유트로파(문헌[Bravo et al., J. Forensic Sci., 49:379-387(2004)]), 클로스트리듐 클루이베리(문헌[Wolff et al., Protein Expr. Purif., 6:206-212(1995)]) 및 아라비도프시스 탈리아나(문헌[Breitkreuz et al., J. Biol. Chem., 278:41552-41556(2003)])에서 특성화되었다.
Figure pct00111
제오바실러스 써모글루코시다시우스 M10EXG로부터의 adh1 유전자(문헌[Jeon et al., J. Biotechnol. 135:127-133(2008)])는 4-하이드록시부탄알 및 부탄알 모두에 대해 높은 활성을 발휘하는 것으로 나타났다(상기 참조). 따라서 상기 효소는 1,4-부탄다이올 데하이드로게나제 활성을 발휘한다.
Figure pct00112
또 다른 예시적인 효소는 3-하이드록시아이소부티레이트의 메틸말로네이트 세미알데하이드로의 가역적인 산화를 촉매화하는 3-하이드록시아이소부티레이트 데하이드로게나제이다. 상기 효소는 발린, 류신 및 아이소류신 분해에 관여하며 세균, 진핵생물 및 포유동물에서 동정되었다. 써무스 써모필루스 HB8로부터 P84067에 의해 암호화된 효소가 구조적으로 특성화되었다(문헌[Lokanath et al., J. Mol. Biol., 352:905-917(2005)]). 상기 인간 3-하이드록시아이소부티레이트 데하이드로게나제의 가역성을 동위원소 표지된 기질을 사용하여 입증하였다(문헌[Manning et al., Biochem J., 231:481-484(1985)]). 상기 효소를 암호화하는 추가의 유전자들은 호모 사피엔스(문헌[Hawes et al., Methods Enzymol, 324:218-228(2000)]) 및 오릭토라구스 쿠니큘러스(문헌[Chowdhury et al., Biosci. Biotechnol Biochem., 60:2043-2047(1996); Hawes et al., Methods Enzymol. 324:218-228(2000)]) 중의 3 hidh, 슈도모나스 아에루기노사 중의 mmsb, 및 슈도모나스 푸티다 중의 dhat(문헌[Aberhart et al., J. Chem. Soc., [Perkin 1] 6:1404-1406(1979); Chowdhury et al., Biosci. Biotechnol Biochem., 67:438-441(2003); Chowdhury et al., Biosci. Biotechnol Biochem., 60:2043-2047(1996)])를 포함한다.
Figure pct00113
여러 3-하이드록시아이소부티레이트 데하이드로게나제 효소들이 또한 말로닉 세미알데하이드를 3-하이드록시프로피온산(3-HP)으로 전환시키는 것으로 나타났다. 상기 활성을 나타내는 3 개의 유전자 후보는 슈도모나스 아에루기노사 PAO1(62)으로부터의 mmsB, 슈도모나스 푸티다 KT2440(Liao et al., 미국 특허 공보 2005/0221466)으로부터의 mmsB 및 슈도모나스 푸티다 E23(문헌[Chowdhury et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 60:2043-2047(1996)])으로부터의 mmsB이다. 알칼리제네스 파에칼리스 M3A에서 3-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제 활성을 갖는 효소가 또한 동정되었다(Gokam et al., 미국 특허 제 7,393,676 호; Liao et al., 미국 특허 공보 2005/0221466). 로도박터 스파에로이데스를 포함한 다른 유기체로부터의 추가적인 유전자 후보들을 서열 유사성에 의해 추리할 수 있다.
Figure pct00114
말로닉 세미알데하이드의 3-HP로의 전환을 또한 2 개의 다른 효소, 즉 NADH-의존성 3-하이드록시프로피오네이트 데하이드로게나제 및 NADPH-의존성 말로네이트 세미알데하이드 리덕타제에 의해 수행할 수 있다. NADH-의존성 3-하이드록시프로피오네이트 데하이드로게나제는 세균 및 식물 중의 프로피오네이트로부터 베타-알라닌 생합성 경로에 관여하는 것으로 생각된다(문헌[Rathinasabapathi, B. Journal of Plant Pathology 159:671-674(2002); Stadtman, E.R. J. Am. Chem. Soc. 77:5765-5766(1955)]). 상기 효소는 지금까지 어떠한 유기체 중의 유전자와도 관련되지 않았다. NADPH-의존성 말로네이트 세미알데하이드 리덕타제는 독립영양 CO2-고정 세균에서의 역 반응을 촉매화한다. 상기 효소 활성이 메탈로스파에라 세둘라에서 검출되었지만, 상기 유전자의 정체는 알려지지 않고 있다(문헌[Alber et al., J. Bacteriol. 188:8551-8559(2006)]).
1.1.1.c - 옥시도리덕타제(2 단계, 아실- CoA 에서 알콜로 )
도 62의 단계 S 및 W는 각각 4-하이드록시부티레이트 및 1,4-부탄다이올을 형성할 수 있는 이작용성 리덕타제 효소를 도시한다. 아실-CoA를 알콜로 전환시키는 예시적인 2-단계 옥시도리덕타제는 기질을 형질전환시키는 것들, 예를 들어 아세틸-CoA를 에탄올로(예를 들어 에스케리키아 콜라이로부터 adhE(문헌[Kessler et al., FEBS. Lett., 281-59-63(1991)]) 및 부티릴-CoA를 부탄올로(예를 들어 클로스트리듐 아세토부틸리쿰으로부터 adhE2(문헌[Fontaine et al., J. Bacteriol., 184:821-830(2002))로 형질전환시키는 것들을 포함한다. 상기 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 adhE2 유전자는 4-하이드록시부티릴-CoA를 1,4-부탄다이올로 전환시키는 것으로 나타났다(상기 참조). 아세틸-CoA를 에탄올로 환원시키는 것 이외에, 류코노스톡 메센테로이데스 중의 adhE에 의해 암호화되는 효소는 분지쇄 화합물 아이소부티르알데하이드를 아이소부티릴-CoA로 산화시키는 것으로 입증되었다(문헌[Kazahaya et al., J. Gen. Appl. Microbiol., 18:43-55(1972); Koo et al.,, Biotechnol. Lett., 27:505-510(2005)]).
Figure pct00115
또 다른 예시적인 효소는 말로닐-CoA를 3-HP로 전환시킬 수 있다. 상기 활성을 갖는 NADPH-의존성 효소는 클로로플렉수스 아우란티아쿠스에서 특성화되었으며, 여기에서 3-하이드록시프로피오네이트 주기에 관여한다(문헌[Hugler et al., J. Bacteriol., 184:2404-2410(2002); Strauss and Fuchs, Eur. J. Biochem., 215:633-643(1993)]). 상기 효소는 300 kDa의 질량을 가지며, 매우 기질-특이성이고, 다른 공지된 옥시도리덕타제들과 서열 유사성을 거의 나타내지 않는다(문헌[Hugler et al., J. Bacteriol., 184:2404-2410(2002)]). 다른 유기체들 중에서 상기 특이적인 반응을 촉매화하는 것으로 입증된 효소들은 없으나; 다른 유기체들이 유사한 경로를 가질 수 있다는 생물정보학적 증거가 존재한다(문헌[Klatt et al., Environ. Microbiol., 9:2067-2078(2007)]). 로세이플렉수스 카스텐홀지이, 에리쓰로박터 스페시즈 NAP1 및 해양 감마 프로테오박테리움 HTCC2080을 포함한 다른 유기체들 중의 효소들이 서열 유사성에 의해 추리될 수 있다.
Figure pct00116
보다 긴 쇄 아실-CoA 분자들이 알콜-형성 지방 아실-CoA 리덕타제를 암호화하는 호호바(심몬드시아 키넨시스) FAR과 같은 효소들에 의해 환원될 수 있다. 에스케리키아 콜라이에서의 그의 과발현은 FAR 활성 및 지방 알콜의 축적을 생성시켰다(문헌[Metz et al., Plant Physiology, 122:635-644(2000)]).
Figure pct00117
1.2.1.b - 옥시도리덕타제(아실- CoA 에서 알데하이드로 )
도 58, 62 및 63의 단계 A는 알데하이드 형성 숙시닐-CoA 리덕타제에 의한 숙시닐-CoA의 숙시네이트 세미알데하이드로의 전환을 수반한다. 도 62의 단계 Q는 알데하이드-형성 4-하이드록시부티릴-CoA 리덕타제에 의한 4-하이드록시부티릴-CoA의 4-하이드록시부탄알로의 전환을 도시한다. 몇몇 아실-CoA 데하이드로게나제들이 아실-CoA를 그의 상응하는 알데하이드로 환원시킬 수 있다. 상기와 같은 효소를 암호화하는 예시적인 유전자는 지방 아실-CoA 리덕타제를 암호화하는 애시네토박터 칼코아세티쿠스 acr1(문헌[Reiser and Somerville, J. of Bacteriology, 179:2969-2975(1997)]), 애시네토박터 스페시즈 M-1 지방 아실-CoA 리덕타제(문헌[Ishige et al., Appl. Environ. Microbiol., 68:1192-1195(2002)]) 및 클로스트리듐 클루이베리 중의 sucD 유전자에 의해 암호화되는 CoA- 및 NADP-의존성 숙시네이트 세미알데하이드 데하이드로게나제(문헌[Sohling and Gottschalk, J. Bacteriol., 178:871-80(1996); Sohling and Gottschalk, J. Bacteriol., 178:871-880(1996)])를 포함한다. 포르피로모나스 진지발리스의 SucD는 또 다른 알데하이드-형성 숙시닐-CoA 리덕타제이다(문헌[Takahashi et al., J. Bacteriol., 182:4704-4710(2000)]). bphG에 의해 암호화되는, 슈도모나스 스페시즈 중의 아세트알데하이드 데하이드로게나제를 아실화하는 효소는 아세트알데하이드, 프로피온알데하이드, 부티르알데하이드, 아이소부티르알데하이드 및 폼알데하이드를 산화하고 아실화하는 것으로 입증된 더욱 또 다른 효소이다(문헌[Powlowski et al., J. Bacteriol., 175:377-385(1993)]). 아세틸-CoA의 에탄올로의 환원 이외에, 류코노스톡 메센테로이데스 중의 adhE에 의해 암호화된 효소는 상기 분지쇄 화합물 아이소부티르알데하이드를 아이소부티릴-CoA로 산화시키는 것으로 나타났다(문헌[Koo et al., Biotechnol. Lett. 27:505-510(2005)]). 부티르알데하이드 데하이드로게나제는 용매생성(solventogenic) 유기체, 예를 들어 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰 중에서, 유사한 반응인, 부티릴-CoA의 부티르알데하이드로의 전환을 촉매화한다(문헌[Kosaka et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 71:58-68(2007)]).
Figure pct00118
아실-CoA를 그의 상응하는 알데하이드로 전환시키는 추가의 효소 유형은 말로닐-CoA를 말로닉 세미알데하이드로 형질전환시키는 말로닐-CoA 리덕타제이다. 말로닐-CoA 리덕타제는 호열호산성 고세균에서 3-하이드록시프로피오네이트 주기를 통한 독립영양성 탄소 고정에 핵심 효소이다(문헌[Berg et al. Science 318:1782-1786(2007); Thauer, R.K., Science, 318:1732-1733(2007)]). 상기 효소는 보조인자로서 NADPH를 이용하며 메탈로스파에라 및 설포로부스 스페시즈에서 특성화되었다(문헌[Alber et al., J. Bacteriol., 188:8551-8559(2006); Hugler et al. J. Bacteriol. 184:2404-2410(2002)]). 상기 효소는 메탈로스파에라 세둘라에서 Msed_0709에 의해 암호화된다(문헌[Alber et al., J. Bacteriol., 188:8551-8559(2006); Berg et al. Science 318:1782-1786(2007)]). 설포로부스 토코다이이로부터의 말로닐-CoA 리덕타제를 암호화하는 유전자가 클로닝되었으며 에스케리키아 콜라이에서 이종 발현되었다(문헌[Alber et al., J. Bacteriol., 188:8551-8559(2006)]). 이들 효소의 알데하이드 데하이드로게나제 작용성이 클로로플렉수스 아우란티아쿠스로부터의 이작용성 데하이드로게나제와 유사하지만, 서열 유사성은 거의 없다. 상기 두 말로닐-CoA 리덕타제 효소들은 모두 아스파틸-4-포스페이트의 아스파테이트 세미알데하이드로의 환원 및 동시적인 탈인산화를 촉매화하는 효소인 아스파테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제와 높은 서열 유사성을 갖는다. 추가적인 유전자들을 설포로부스 솔파타리쿠스 및 설포로부스 애시도칼다리우스를 포함한 다른 유기체들 중의 단백질들에 대한 서열 상동성에 의해 발견할 수 있다. CoA-아실화 알데하이드 데하이드로게나제에 대한 더욱 또 다른 후보는 클로스트리듐 베이제링키이로부터의 ald 유전자이다(문헌[Toth et al., Appl. Environ. Microbiol. 65:4973-4980(1999)]). 상기 효소는 아세틸-CoA 및 부티릴-CoA를 그들의 상응하는 알데하이드로 환원시키는 것으로 보고되었다. 상기 유전자는 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium) 및 에스케리키아 콜라이의 아세트알데하이드 데하이드로게나제를 암호화하는 eutE와 매우 유사하다(문헌[Toth et al., Appl. Environ. Microbiol. 65:4973-4980(1999)]).
Figure pct00119
1.2.1.c 옥시도리덕타제(2- 옥소산에서 아실- CoA 로, 탈카복실화 )
도 62의 단계 AA는 5-하이드록시-2-옥소펜탄산의 4-하이드록시부티릴-CoA로의 전환을 도시한다. 상기 형질전환에 대한 후보 효소들은 1) 분지쇄 2-케토-산 데하이드로게나제, 2) 알파-케토글루타레이트 데하이드로게나제, 및 3) 피루베이트 데하이드로게나제 다중효소 복합체(PDHC)를 포함한다. 이들 효소는 2-케토산의 산화적 탈카복실화를 아실화하는 일련의 부분 반응들을 촉매화하는 다중 효소 복합체이다. 상기 2-케토산 데하이드로게나제 복합체는 각각 중간 대사의 핵심 위치들을 차지하며, 효소 활성은 전형적으로는 엄격히 조절된다(문헌[Fries et al. Biochemistry 42:6996-7002(2003)]). 상기 효소는 3 개의 촉매 성분, 즉 알파-케토산 데카복실라제(E1), 다이하이드로리포아미드 아실트랜스퍼라제(E2) 및 다이하이드로리포아미드 데하이드로게나제(E3)의 다중 사본들로 구성된 복잡하지만 공통의 구조를 공유한다. 상기 E3 성분은 유기체 중에서 모든 2-케토산 데하이드로게나제 복합체들 사이에 공유되는 반면, E1 및 E2 성분은 상이한 유전자들에 의해 암호화된다. 상기 효소 성분들은 상기 복합체 중에서 다수의 사본 수로 존재하며 다중의 보조 인자들을 사용하여 기질 채널링을 통해 반응들의 지정된 서열을 촉매화한다. 이들 데하이드로게나제 복합체의 전체 크기는 매우 크며, 이때 분자 질량은 4 백만 내지 천만 Da이다(즉, 리보솜보다 크다).
상기 2-케토산 데하이드록나제 계열 중 효소들의 활성은 에스케리키아 콜라이에서 혐기성 조건 하에서 통상적으로 낮거나 제한된다. NADH(또는 NADPH)의 증가된 생산은 산화환원 불균형을 도출할 수 있으며, NADH 자체는 효소 작용에 대한 억제제로서 작용한다. 공학 노력은 에스케리키아 콜라이 피루베이트 데하이드로게나제 복합체의 혐기성 활성을 증가시켰다(문헌[Kim et al. Appl. Environ. Microbiol. 73:1766-1771(2007); Kim et al. J. Bacteriol. 190:3851-3858(2008)); Zhou et al. Biotechnol. Lett. 30:335-342(2008)]). 예를 들어, NADH의 억제 효과는 E3 성분에서 H322Y 돌연변이를 조작함으로써 극복될 수 있다(문헌[Kim et al. J. Bacteriol. 190:3851-3858(2008)]). 개별적인 성분들의 구조 연구 및 상기 성분들이 복합체 중에서 함께 작용하는 방법은 상기 계열 효소들의 촉매 기전 및 구조에 대한 통찰력을 제공한다(문헌[Aevarsson et al. Nat. Struct. Biol. 6:785-792(1999); Zhou et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:14802-14807(2001)]). 상기 데하이드로게나제 복합체의 기질 특이성은 상이한 유기체들에서 다양하지만, 일반적으로 분지쇄 케토산 데하이드로게나제가 가장 넓은 기질 범위를 갖는다.
알파-케토글루타레이트 데하이드로게나제(AKGD)는 알파-케토글루타레이트를 숙시닐-CoA로 전환시키며 TCA 주기를 통한 대사 흐름의 조절에 주요 부위이다(문헌[Hansford, R.G. Curr. Top. Bioenerg. 10:217-278(1980)]). 에스케리키아 콜라이에서 유전자 sucA , sucB 및 lpd에 의해 암호화되는 경우, AKGD 유전자 발현은 글루코스 상에서 증식하는 동안 혐기성 조건 하에서 하향 조절된다(문헌[Park et al. Mol. Microbiol. 15:473-482(1995)]). AKGD의 기질 범위는 좁지만, E2 성분의 촉매 코어의 구조 연구는 기질 특이성을 맡고 있는 특정 잔기를 정확히 지적한다(문헌[Knapp et al. J. Mol. Biol. 280:655-668(1998)]). odhAB(E1 및 E2) 및 pdhD(E3, 공유된 도메인)에 의해 암호화된, 바실러스 서브틸리스 AKGD는 전사 수준에서 조절되며, 유기체의 탄소원 및 증식 단계에 의존한다(문헌[Resnekov et al. Mol. Gen. Genet. 234:285-296(1992)]). 효모에서, E3 성분을 암호화하는 LPD1 유전자는 글루코스에 의해 전사 수준에서 조절된다(문헌[Roy and Dawes J.Gen.Microbiol. 133:925-933(1987)]). KGD1에 의해 암호화된, E1 성분은 또한 글루코스에 의해 조절되고 HAP2 및 HAP3의 산물에 의해 활성화된다(문헌[Repetto and Tzagoloff Mol. Cell Biol. 9:2695-2705(1989)]). 생성물 NADH 및 숙시닐-CoA에 의해 억제된 AKGD 효소 복합체는 포유동물 계에서 잘 연구되고 있으며, 그의 손상된 기능은 여러 신경학적 질병들에 연루되어 왔다(문헌[Tretter and dam-Vizi Philos. Trans. R. Soc. Lond B Biol. Sci. 360:2335-2345(2005)]).
Figure pct00120
분지쇄 2-케토산 데하이드로게나제 복합체(BCKAD)(또한 2-옥소아이소발레레이트 데하이드로게나제로서 공지됨)는, 발린, 류신 및 아이소류신의 2-케토산 유도체를 그들의 아실-CoA 유도체 및 CO2로 전환시키는 분지쇄 아미노산 분해 경로에 관여한다. 상기 복합체는 바실러스 서브틸리스(문헌[Wang et al. Eur. J. Biochem. 213:1091-1099(1993)]), 라투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus)(문헌[Namba et al. J. Biol. Chem. 244:4437-4447(1969)]) 및 슈도모나스 푸티다(문헌[Sokatch J. Bacteriol. 148:647-652(1981)])를 포함한 다수의 유기체들에서 연구되었다. 바실러스 서브틸리스에서 상기 효소는 유전자 pdhD(E3 성분), bfmBB(E2 성분), bfmBAA 및 bfmBAB(E1 성분)에 의해 암호화된다(문헌[Wang et al. Eur. J. Biochem. 213:1091-1099(1993)]). 포유동물에서, 상기 복합체는 특정 포스파타제 및 단백질 키나제에 의한 인산화에 의해 조절된다. 상기 복합체는 래트 간세포에서 연구되었으며(문헌[Chicco et al. J. Biol. Chem. 269:19427-19434(1994)]) 유전자 Bckdha(E1 알파), Bckdhb(E1 베타), Dbt(E2), 및 Dld(E3)에 의해 암호화된다. 슈도모나스 푸티다 BCKAD 복합체의 E1 및 E3 성분들이 결정화되었으며(문헌[Aevarsson et al. Nat. Sturct. Biol. 6:785-792(1999); Mattevi Science 255:1544-1550(1992)]), 상기 효소 복합체가 연구되었다(문헌[Sokatch et al. J. Bacteriol. 148:647-652(1981)]). 슈도모나스 푸티다 BCKAD 유전자의 전사는 bkdR의 유전자 산물에 의해 활성화된다(문헌[Hester et al. Eur. J. Biochem. 233:828-836(1995)]). 라투스 노르베기쿠스(문헌[Paxton et al. Biochem. J. 234:295-303(1986)]) 및 사카로마이세스 세레비지아에(문헌[Sinclair et al. Biochem. Mol. Biol. Int. 31:911-922(1993)])를 포함한 일부 유기체에서. 상기 복합체는 분지쇄 아미노산 전구체들 이외에, 2-옥소부타노에이트 및 알파-케토글루타레이트와 같은 선형 옥소산을 포함한 광범위한 기질 범위를 갖는 것으로 나타났다. 소 BCKAD의 활성 부위가 또 다른 기질 아세틸-CoA에 유리하도록 조작되었다(문헌[Meng and Chuang, Biochemistry 33:12879-12885(1994)]).
Figure pct00121
피루베이트에서 아세틸-CoA로의 전환을 촉매화하는 피루베이트 데하이드로게나제가 또한 광범위하게 연구되어 왔다. 에스케리키아 콜라이 효소에서, 상기 E1 성분 중의 특정 잔기들이 기질 특이성을 맡고 있다(문헌[Bisswanger, H. J Biol Chem. 256:815-822(1981); Bremer, J. Eur. J Biochem. 8:535-540(1969); Gong et al. J Biol Chem. 275:13645-13653(2000)]). 앞서 언급한 바와 같이, 효소 공학 노력은 혐기성 조건 하에서 에스케리키아 콜라이 PDH 효소 활성을 개선시켰다(문헌[Kim et al. Appl. Environ. Microbiol. 73:1766-1771(2007); Kim J. Bacteriol. 190:3851-3858(2008); Zhou et al. Biotechnol. Lett. 30:335-342(2008)]). 상기 에스케리키아 콜라이 PDH와 대조적으로, 바실러스 서브틸리스 복합체는 혐기성 조건 하에서 활성이며 상기 조건 하에서의 증식을 요한다(문헌[Nakano J. Bacteriol. 179:6749-6755(1997)]). 글리세롤 상에서 증식하는 동안 특성화된, 클렙시엘라 뉴모니아에 PDH가 또한 혐기성 조건 하에서 활성이다(문헌[Menzel et al. J. Biotechnol. 56:135-142(1997)]). 소 신장으로부터의 상기 효소 복합체의 결정 구조(문헌[Zhou et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:14802-14807(2001)]) 및 아조토박터 비넬란디이로부터의 E2 촉매 도메인을 입수할 수 있다(문헌[Mattevi et al. Science 255:1544-1550(1992)]). 일부 포유동물 PDH 효소 복합체는 또 다른 기질, 예를 들어 2-옥소부타노에이트 상에서 반응할 수 있지만, 라투스 노르베기쿠스 PDH 및 BCKAD의 비교 동역학은 BCKAD가 기질로서 2-옥소부타노에이트 상에서 더 큰 활성을 가짐을 나타낸다(문헌[Paxton et al. Biochem. J. 234:295-303(1986)]).
Figure pct00122
상술한 큰 다중효소 2-케토산 데하이드로게나제 복합체에 대한 대안으로서, 일부 혐기성 유기체들은 2-케토산의 산화적 탈카복실화의 아실화를 촉매화하는 2-케토산 옥시도리덕타제 계열(OFOR)의 효소들을 사용한다. 데하이드로게나제 복합체와 달리, 이들 효소는 철-황 클러스터를 함유하며, 상이한 보조 인자들을 사용하고, NAD(P)H 대신에 전자 수용체로서 페레독신 또는 플라보딕신을 사용한다. 상기 계열의 대부분의 효소들은 기질로서 피루베이트에 특이적인 반면(POR), 일부 2-케토산:페레독신 옥시도리덕타제는 알파-케토글루타레이트 및 2-옥소부타노에이트를 포함하여 기질로서 광범위한 2-케토산들을 수용하는 것으로 나타났다(문헌[Fukuda and Wakagi Biochim. Biophys. Acta 1597:74-80(2002); Zhang et al. J. Biochem. 120:587-599(1996)]). 하나의 상기와 같은 효소는 호열호산성 고세균인 설포로부스 토코다이이(Sulfolobus tokodaii) 7로부터의 OFOR이며, 이는 유전자 ST2300에 의해 암호화되는 알파 및 베타 서브유닛을 함유한다(문헌[Fukuka and Wakagi Biochim. Biophys. Acta 1597:74-80(2002); Zhang et al. J. Biochem. 120:587-599(1996)]). 플라스미드 기재 발현 시스템이 에스케리키아 콜라이에서의 상기 단백질의 효율적인 발현을 위해 개발되었으며(문헌[Fukuka et al. Eur. J. Biochem. 268:5639-5646(2001)]) 기질 특이성에 관련된 잔기들이 결정되었다(문헌[Fukuda and Wakagi Biochim. Biophys. Acta 1597:74-80(2002)]). 아에로피룸 페르닉스 균주 K1으로부터 2 개의 OFOR이 또한 최근에 에스케리키아 콜라이 내로 클로닝되었으며, 특성화되었고, 광범위한 2-옥소산들과 반응하는 것으로 밝혀졌다(문헌[Nishizawa et al. FEBS Lett. 579:2319-2322(2005)]). 이들 OFOR 후보들의 유전자 서열을 입수할 수 있지만, 이들은 지금까지 지정된 젠뱅크 식별자를 갖고 있지 않다. 유사한 효소들이 모든 고세균, 일부 혐기성 세균 및 비미토콘드리아(amitochondrial) 진핵생물 중에 존재한다는 생물정보학적 증거가 존재한다(문헌[Fukuda and Wakagi Biochim. Biophys. Acta 1597:74-80(2005)]). 상기 부류의 효소는 또한, 환원된 페레독신을 사용하여 페레독신-NAD 리덕타제에 의해 NADH를 생성시킬 수 있으므로, 활력적인 견지에서 흥미롭다(문헌[Petitdemange et al. Biochim. Biophys. Acta 421:334-337(1976)]). 또한, 상기 효소들 중 대부분은 혐기성 조건 하에서 작용하도록 디자인되므로, 혐기성 환경에서 활성을 위해 상기 2-케토산 데하이드로게나제 복합체 계열의 효소들에 비해 적은 효소 조작을 필요로 할 수도 있다.
Figure pct00123
1.2.1.d 옥시도리덕타제( 포스포네이트 리덕타제 )
4-하이드록시부티릴-포스페이트에서 4-하이드록시부탄알로의 전환을 EC 부류 1.2.1 중의 옥시도리덕타제에 의해 촉매화할 수 있다. 아스파테이트 세미알데하이드 데하이드로게나제(ASD, EC 1.2.1.11)는 4-아스파틸 포스페이트에서 아스파테이트-4-세미알데하이드로의 NADPH-의존성 환원을 촉매화한다. ASD는 아미노산 생합성에 관여하며 최근에 항균 표적으로서 연구되었다(문헌[Hadfield et al., Biochemistry 40:14475-14483(2001)]). 상기 에스케리키아 콜라이 ASD 구조가 규명되었으며(문헌[Hadfield et al., J. Mol. Biol. 289:991-1002(1999)]) 상기 효소는 또 다른 기질인 베타-3-메틸아스파틸 포스페이트를 수용하는 것으로 나타났다(문헌[Shames et al., J. Biol. Chem. 259:15331-15339(1984)]). 상기 하에모필루스 인플루엔자에 효소는 활성 부위에서 기질 결합 친화성을 변경시키기 위한 효소 공학 연구의 주제였다(문헌[Blanco et al., Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 60:1388-1395(2004); Blanco et al., Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 60:1808-1815(2004)]). 다른 ASD 후보들이 마이코박테리움 튜베르큘로시스(문헌[Shafiani et al., J. Appl. Microbiol. 98:832-838(2005)]), 메타노코커스 잔나쉬이(Methanococcus jannaschii)(문헌[Faehnle et al., J. Mol. Biol. 353:1055-1068(2005)]), 및 감염성 미생물인 비브리오 콜레라 및 헬리오박터 파이로리(문헌[Moore et al., Protein Expr. Purif. 25:189-194(2002)])에서 발견된다. 관련된 효소 후보는 사카로마이세스 세레비지아에(문헌[Pauwels et al., Eur. J. Biochem. 270:1014-1024(2003)]), 바실러스 서브틸리스(문헌[O'Reilly and Devine, Microbiology 140(Pt 5):1023-1025(1994)]), 및 다른 유기체들에서 발견되는, 아세틸글루타밀포스페이트를 아세틸글루타메이트-5-세미알데하이드로 자연적으로 환원시키는 효소인 아세틸글루타밀포스페이트 리덕타제(EC 1.2.1.38)이다.
Figure pct00124
상기 부류의 다른 예시적인 효소들은 글리세르알데하이드-3-포스페이트를 D-글리세레이트 1,3-비스포스페이트로 전환시키는 글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제(예를 들어 에스케리키아 콜라이 gapA(문헌[Branlant and Branlant., Eur. J. Biochem. 150:61-66(1985)]), N-아세틸-L-글루타메이트-5-세미알데하이드를 N-아세틸-L-글루타밀-5-포스페이트로 전환시키는 N-아세틸-감마-글루타밀-포스페이트 리덕타제(예를 들어 에스케리키아 콜라이 argC(문헌[Parsot et al. Gene 68:275-283(1988)]), 및 L-글루타메이트-5-세미알데하이드를 L-글루타밀-5-포스페이트로 전환시키는 글루타메이트-5-세미알데하이드 데하이드로게나제(예를 들어 에스케리키아 콜라이 proA(문헌[Smith et al., J. Bacteriol. 157:545-551(1984)])를 포함한다. 살모넬라 티피뮤리움(문헌[Mahan and Csonka, J. Bacteriol. 156:1249-1262(1983)]) 및 캄필로박터 제주니(문헌[Louie and Chan, Mol. Gen. Genet. 240:29-35(1993)])로부터의 글루타메이트-5-세미알데하이드 데하이드로게나제 효소를 암호화하는 유전자들이 에스케리키아 콜라이 중에 클로닝되고 발현되었다.
Figure pct00125
1.2.1.e 산 리덕타제
도 58, 62 및 63의 여러 단계들은 산 리덕타제에 의한 불활성화된 산에서 알데하이드로의 전환을 도시한다. 이들은 각각 4-하이드록시부티레이트, 숙시네이트, 알파-케토글루타레이트, 및 4-아미노부티레이트에서 4-하이드록시부탄알, 숙시네이트 세미알데하이드, 2,5-다이옥소펜타노에이트, 및 4-아미노부탄알로의 전환을 포함한다. 하나의 주목할 만한 카복실산 리덕타제는 노카르디아 이오웬시스에서 발견될 수 있으며, 카복실산의 그의 상응하는 알데하이드로의 마그네슘, ATP 및 NADPH-의존성 환원을 촉매화한다(문헌[Venkitasubramanian et al., J Biol. Chem. 282:478-485(2007)]). 상기 효소는 car 유전자에 의해 암호화되며, 상기 효소를 에스케리키아 콜라이에서 클로닝하고 작용상 발현시켰다(문헌[Venkitasubramanian et al., J. Biol. Chem. 282:478-485(2007)]). 상기 npt 유전자 산물의 발현은 전사 후 변경을 통해 상기 효소의 활성을 개선시켰다. 상기 npt 유전자는 불활성 아포-효소를 활성 전효소로 전환시키는 특정한 포스포판테쎄인 트랜스퍼라제(PPTase)를 암호화한다. 상기 효소의 천연 기질은 바닐산이며 상기 효소는 방향족 및 지방족 기질의 광범위한 수용을 나타낸다(문헌[Venkitasubramanian et al., in Biocatalysis in the Pharmaceutical and Biotechnology Industries, ed. R.N. Patel, Chapter 15, pp.425-440, CRC Press LLC, Boca Raton, FL.(2006)]).
Figure pct00126
추가적인 car 및 npt 유전자를 서열 상동성을 근거로 동정할 수 있다.
Figure pct00127
스트렙토마이세스 그리세우스에서 발견되는 추가적인 효소 후보는 griC 및 griD 유전자에 의해 암호화된다. 상기 효소는 griC 또는 griD의 결실로서 3-아미노-4-하이드록시벤조산을 3-아미노-4-하이드록시벤즈알데하이드로 전환시켜 3-아미노-4-하이드록시벤조산 대사의 단락 생성물인 세포 외 3-아세틸아미노-4-하이드록시벤조산이 축적되게 하는 것으로 여겨진다(문헌[Suzuki, et al., J. Antibiot. 60(6):380-387(2007)]). 노카르디아 이오웬시스 npt와 서열이 유사한 효소인 SGR_665와 griC 및 griD 의 동시 발현이 유리할 수 있다.
Figure pct00128
유사한 특성을 갖는 효소인, 알파-아미노아디페이트 리덕타제(AAR, EC 1.2.1.31)는 일부 진균 종들에서 리신 생합성 경로에 관여한다. 상기 효소는 알파-아미노아디페이트를 알파-아미노아디페이트 세미알데하이드로 자연적으로 환원시킨다. 상기 카복실 그룹을 먼저 아데닐레이트의 ATP-의존적인 형성을 통해 활성화시키고 이어서 NAD(P)H에 의해 환원시켜 알데하이드 및 AMP를 제공한다. CAR과 같이, 상기 효소는 마그네슘을 사용하며 PPTase에 의한 활성화를 필요로 한다. AAR 및 그의 상응하는 PPTase에 대한 효소 후보는 사카로마이세스 세레비지아에(문헌[Morris et al., Gene 98:141-145(1991)]), 칸디다 알비칸스(문헌[Guo et al., Mol. Genet. Genomics 269:271-279(2003)]), 및 시조사카로마이세스 폼베(문헌[Schizosaccharomyces pombe)(Ford et al, Curr. Genet. 28:131-137(1995)])에서 발견된다. 상기 시조사카로마이세스 폼베로부터의 AAR은 에스케리키아 콜라이에서 발현 시 현저한 활성을 나타내었다(문헌[Guo et al., Yeast 21:1279-1288(2004)]). 페니실리움 크리소제눔으로부터의 AAR은 또 다른 기질로서 S-카복시메틸-L-시스테인을 수용하지만, 아디페이트, L-글루타메이트 또는 다이아미노피멜레이트와는 반응하지 않았다(문헌[Hijarrubia et al., J Biol. Chem 278:8250-8256(2003)]). 상기 페니실리움 크리소제눔 PPTase를 암호화하는 유전자는 지금까지 동정되지 않았다.
Figure pct00129
1.4.1.a 옥시도리덕타제( 아민화 )
글루타메이트 데하이드로게나제(단계 J, 도 62 및 63), 4-아미노부티레이트 데하이드로게나제(단계 M, 도 62 및 63), 푸트레신 데하이드로게나제(단계 D, 도 63), 5-아미노-2-옥소펜타노에이트 데하이드로게나제(단계 P, 도 63), 및 오르니틴 데하이드로게나제(단계 S, 도 63)는 아민화 옥시도리덕타제에 의해 촉매화될 수 있다. 상기 EC 부류 중의 효소들은 수용체로서 NAD+ 또는 NADP+를 갖는 알파-아미노산의 산화적 탈아민화를 촉매화하며, 상기 반응은 전형적으로는 가역적이다. 아미노산 상에서 작용하는 예시적인 옥시도리덕타제는 gdhA에 의해 암호화되는 글루타메이트 데하이드로게나제(탈아민화), ldh에 의해 암호화되는 류신 데하이드로게나제(탈아민화), 및 nadX에 의해 암호화되는 아스파테이트 데하이드로게나제(탈아민화)를 포함한다. 에스케리키아 콜라이로부터의 상기 gdhA 유전자 산물(문헌[McPherson et al., Nucleic. Acids Res. 11:5257-5266(1983); Korber et al., J. Mol. Biol. 234:1270-1273(1993)]), 써모토가 마리티마로부터의 gdh(문헌[Kort et al., Extremophiles 1:52-60(1997); Lebbink et al., J. Mol. Biol. 280:287-296(1998); Lebbink et al, J. Mol. Biol. 289:357-369(1999)]), 및 할로박테리움 살리나룸(Halobacterium salinarum)으로부터의 gdhA1(문헌[Ingoldsby et al, Gene. 349:237-244(2005)])은, 각각 NADP(H), NAD(H), 또는 이둘 모두를 촉진하면서, 글루타메이트의 2-옥소글루타레이트 및 암모니아로의 가역적인 상호전환을 촉매화한다. 바실러스 세레우스의 ldh 유전자는 류신, 아이소류신, 발린 및 2-아미노부타노에이트를 포함한 광범위한 기질을 수용하는 LeuDH 단백질을 암호화한다(문헌[Stoyan et al., J. Biotechnol 54:77-80(1997); Ansorge and Kula Biotechnol Bioeng. 68:557-562(2000)]). 상기 아스파테이트 데하이드로게나제를 암호화하는 써모토가 마리티마로부터의 nadX 유전자는 NAD의 생합성에 관련된다(문헌[Yang et al., J. Biol. Chem. 278:8804-8808(2003)]).
Figure pct00130
추가의 글루타메이트 데하이드로게나제 유전자 후보들은 바실러스 서브틸리스(문헌[Khan et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 69:1861-1870(2005)]), 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum)(문헌[Purnell et al., Planta 222:167-180(2005)]), 오리자 사티바(Oryza sativa)(문헌[Abiko et al., Plant Cell Physiol. 46:1724-1734(2005)]), 할로페락스 메디테라네이(Haloferax mediterranei)(문헌[Diaz et al., Extremophiles 10:105-115(2006)]) 및 할로박트레이움 살리나룸(Halobactreium salinarum)(문헌[Hayden et al., FEMS Microbiol. Lett. 211:37-41(2002)])에서 발견된다. 상기 니코티아나 타바쿰 효소는 gdh1 및 gdh2에 의해 암호화되는 알파 및 베타 서브유닛으로 구성된다(문헌[Purnell et al., Planta 222:167-180(2005)]). 상기 NADH-의존성 글루타메이트 데하이드로게나제의 과발현이 사카로마이세스 세레비지아에의 조작된 균주에서 에탄올 생산을 개선시키는 것으로 밝혀졌다(문헌[Roca et al., Appl. Environ. Microbiol. 69:4732-4736(2003)]).
Figure pct00131
알데하이드의 그의 상응하는 1차 아민으로의 전환을 촉매화하는 예시적인 효소는 lysDH 유전자에 의해 암호화된, 리신 6-데하이드로게나제(EC 1.4.1.18)이다. lysDH 유전자에 의해 암호화된, 리신 6-데하이드로게나제(탈아민화)는 L-리신의 ε-아미노 그룹의 산화적 탈아민화를 촉매화하여 2-아미노아디페이트-6-세미알데하이드를 형성하고, 이어서 이는 비 효소적으로 환화되어 Δ1-피페리딘-6-카복실레이트를 형성한다(문헌[Misono and Nagasaki, J. Bacteriol. 150:398-401(1982)]). 제오바실러스 스테아로써모필루스로부터의 lysDH 유전자는 호열성 NAD-의존성 리신 6-데하이드로게나제(문헌[Heydari et al., Appl. Environ. Microbiol 70:937-942(2004)])를 암호화한다. 아에로피룸 페르닉스 K1으로부터의 lysDH 유전자는 게놈 프로젝트로부터 상동성을 통해 동정된다. 추가의 효소들을 아그로박테리움 튜메파시엔스(문헌[Hashimoto et al., J. Biochem. 106:76-80(1989); Misono and Nagasaki, J. Bacteriol. 150:398-401(1982)]) 및 아크로모박터 데니트리피칸스(Achromobacter denitrificans)(문헌[Ruldeekulthamrong et al., BMB. Rep. 41:790-795(2008)])에서 발견할 수 있다.
Figure pct00132
3-옥소산을 3-아미노산으로 전환시키는 효소는, 리신을 발효하는 유기체에서 발견된 효소인 3,5-다이아미노헥사노에이트 데하이드로게나제(EC 1.4.1.11)이다. 상기 효소를 암호화하는 유전자, kdd는 푸소박테리움 누클레아툼에서 최근에 동정되었다(문헌[Kreimeyer et al., J. Biol. Chem. 282:7191-7197(2007)]). 상기 효소는 다른 유기체에서 정제되고 특성화되었으나(문헌[Baker et al., J. Biol. Chem. 247:7724-7734(1972); Baker and van der Drift, Biochemistry 13:292-299(1974)]), 상기 효소와 관련된 유전자들은 공지되어 있지 않다. 믹소코커스 잔투스(Myxococcus xanthus), 포르피로모나스 진지발리스 W83 및 다른 서열화된 유기체 중의 후보들을 서열 상동성에 의해 추론할 수 있다.
Figure pct00133
2.3.1.a 아실트랜스퍼라제 ( 포스페이트 그룹의 CoA 로의 운반)
도 62의 단계 P는 4-하이드록시부티릴-CoA의 4-하이드록시부티릴-Pi로의 형질전환을 도시한다. 예시적인 포스페이트 운반 아실트랜스퍼라제는 pta에 의해 암호화되는 포스포트랜스아세틸라제, 및 ptb에 의해 암호화되는 포스포트랜스부티릴라제를 포함한다. 에스케리키아 콜라이로부터의 pta 유전자는 아세틸-CoA를 아세틸-포스페이트로, 및 이와 역으로 전환할 수 있는 효소를 암호화한다(문헌[Suzuki, T. Biochim. Biophys. Acta 191:559-569(1969)]). 상기 효소는 또한 상기 과정에서 아세틸-CoA 대신에 프로피오닐-CoA를 사용하여 프로피오네이트를 형성할 수 있다(문헌[Hesslinger et al. Mol. Microbiol 27:477-492(1998)]). 유사하게, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰으로부터의 ptb 유전자는 부티릴-CoA를 부티릴-포스페이트로 전환할 수 있는 효소를 암호화한다(문헌[Walter et al. Gene 134(1):p. 107-11(1993)); Huang et al. J Mol Microbiol Biotechnol 2(1):p. 33-38(2000)]). 추가적인 ptb 유전자를 부티레이트-생산 세균 L2-50(Louis et al. J. Bacteriol. 186:2099-2106(2004)) 및 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium)에서 발견할 수 있다(문헌[Vazquez et al. Curr. Microbiol 42:345-349(2001)]).
Figure pct00134
2.6.1. 아미노트랜스퍼라제
아미노트랜스퍼라제는 알데하이드 또는 케톤을 아미노 그룹으로 가역적으로 전환한다. 통상적인 아미노 공여체/수용체 조합은 글루타메이트/알파-케토글루타레이트, 알라닌/피루베이트, 및 아스파테이트/옥살로아세테이트를 포함한다. 여러 효소들이 알데하이드를 1차 아민으로, 및 이와 역으로, 예를 들어 4-아미노부티레이트, 푸트레신, 및 5-아미노-2-옥소펜타노에이트로 전환시키는 것으로 나타났다. 이들 효소는 하기의 변환들을 수행하기에 특히 매우 적합하다: 도 62 및 63의 단계 N, 도 63의 단계 E 및 Q. 리신-6-아미노트랜스퍼라제(EC 2.6.1.36)는 1차 아민을 형성할 수 있는 하나의 예시적인 효소이다. 리신을 알파-아미노아디페이트 세미알데하이드로 전환하는 상기 효소의 작용은 효모 및 세균에서 입증되었다. 칸디다 유틸리스(Candida utilis)(문헌[Hammer and Bode, J. Basic Microbiol. 32:21-27(1992)]), 플라보박테리움 루테센스(Flavobacterium lutescens)(문헌[Fujii et al., J. Biochem. 128:391-397(2000)]) 및 스트렙토마이세스 클라불리제누스(Streptomyces clavuligenus)(문헌[Romero et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 18:241-246(1997)])가 특성화되었다. 스트렙토마이세스 클라불리제누스로부터의 재조합 리신-6-아미노트랜스퍼라제가 에스케리키아 콜라이에서 작용적으로 발현되었다(문헌[Tobin et al., J. Bacteriol. 173:6223-6229(1991)]). 상기 플라보박테리움 루테센스 효소는 아미노 수용체로서 알파-케토글루타레이트에 특이적이다(문헌[Soda and Misono, Biochemistry 7:4110-4119(1968)]). 알데하이드를 말단 아민으로 전환하는 다른 효소는 2,4-다이아미노부타노에이트:2-케토글루타레이트 4-트랜스아미나제를 암호화하는 애시네토박터 바우마니이(Acinetobacter baumanii) 중의 dat 유전자 산물을 포함한다(문헌[Ikai and Yamamoto, J. Bacteriol. 179:5118-5125(1997)]). 그의 천연 기질, 2,4-다이아미노부티레이트 이외에, DAT는 리신, 4-아미노부티레이트 및 오르니틴의 말단 아민을 트랜스아민화한다.
Figure pct00135
알데하이드의 말단 아민으로의 전환을 또한 감마-아미노부티레이트 트랜스아미나제(GABA 트랜스아미나제 또는 4-아미노부티레이트 트랜스아미나제)에 의해 촉매화할 수 있다. 상기 효소는 숙시닉 세미알데하이드 및 글루타메이트를 4-아미노부티레이트 및 알파-케토글루타레이트로 자연적으로 상호전환하며 광범위한 기질 범위를 갖는 것으로 공지되어 있다(문헌[Liu et al., Biochemistry 43:10896-10905 2004); Schulz et al., Appl. Environ. Microbiol. 56:1-6(1990)]). 에스케리키아 콜라이 중의 상기 두 GABA 트랜스아미나제는 gabT(문헌[Bartsch et al., J. Bacteriol. 172:7035-7042(1990)]) 및 puuE(문헌[Kurihara et al., J. Biol. Chem. 280:4602-4608(2005)])에 의해 암호화된다. 무스 무스쿨루스, 슈도모나스 플루오레센스 및 수스 스크로파 중의 GABA 트랜스아미나제가 6-아미노카프로산을 포함한 다수의 또 다른 기질들과 반응하는 것으로 나타났다(문헌[Cooper, Methods Enzymol. 113:80-82(1985); Scott and Jakoby, J. Biol. Chem. 234:932-936(1959)]).
Figure pct00136
알데하이드 및 1차 아민의 상호전환을 위한 추가적인 효소 후보들은 푸트레신 트랜스아미나제 또는 다른 다이아민 아미노트랜스퍼라제이다. 상기 에스케리키아 콜라이 푸트레신 아미노트랜스퍼라제는 ygiG 유전자에 의해 암호화되며, 상기 정제된 효소는 또한 카다베린 및 스페르미딘을 트랜스아민화할 수 있었다(문헌[Samsonova et al., BMC Microbiol. 3:2(2003)]). 또한, 1,7-다이아미노헵탄에 대한 상기 효소의 활성 및 2-옥소글루타레이트가 아닌 아미노 수용체들(예를 들어 피루베이트, 2-옥소부타노에이트)과의 활성이 보고되었다(문헌[Kim, J. Biol. Chem. 239:783-786(1964); Samsonova et al., BMC Microbiol. 3:2(2003)]). 알파-케토글루타레이트보다, 아미노 수용체로서 피루베이트와 더 큰 활성을 갖는 푸트레신 아미노트랜스퍼라제는 슈도모나스 아에루기노사의 spuC 유전자이다(문헌[Lu et al., J. Bacteriol. 184:3765-3773(2002)]).
Figure pct00137
3-옥소산을 트랜스아민화하는 효소는 GABA 아미노트랜스퍼라제(상기 개시됨), 베타-알라닌/알파-케토글루타레이트 아미노트랜스퍼라제 및 3-아미노-2-메틸프로피오네이트 아미노트랜스퍼라제를 포함한다. 베타-알라닌/알파-케토글루타레이트 아미노트랜스퍼라제(WO08027742)는 베타-알라닌과 반응하여 말로닉 세미알데하이드, 3-옥소산을 형성한다. 사카로마이세스 클루이베리 중의 SkPYD4의 유전자 산물이 또한 아미노 그룹 공여체로서 베타-알라닌을 우선적으로 사용하는 것으로서 입증되었다(문헌[Andersen and Hansen, Gene 124:105-109(1993)]). SkUGA1은 사카로마이세스 세레비지아에 GABA 아미노트랜스퍼라제의 동족체인 UGA1(문헌[Ramos et al. Eur. J. Biochem. 149:401-404(1985)])을 암호화하는 반면, SkPYD4는 베타-알라닌 및 GABA 트랜스아민화 모두에 관련된 효소를 암호화한다(문헌[Andersen and Hansen, Gene 124:105-109(2003)]). 3-아미노-2-메틸프로피오네이트 트랜스아미나제는 메틸말로네이트 세미알데하이드로부터 3-아미노-2-메틸프로피오네이트로의 변환을 촉매화한다. 상기 효소는 라투스 노르베기쿠스 및 수스 스크로파에서 특성화되었으며 Abat에 의해 암호화된다(문헌[Kakimoto et al. Biochim. Biophys. Acta 156:374-380(1968); Tamaki et al. Methods Enzymol 324:376-389(2000)]).
Figure pct00138
여러 아미노트랜스퍼라제들이 아미노산의 아미노 그룹을 트랜스아민화하여 2-옥소산을 형성시킨다. 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제는 옥소 그룹을 옥살로아세테이트로부터 글루타메이트로 운반하여, 알파-케토글루타레이트 및 아스파테이트를 형성시키는 효소이다. 아스파테이트는 구조면에서 OHED 및 2-AHD와 유사하다. 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제 활성은 예를 들어 에스케리키아 콜라이로부터의 aspC(문헌[Yagi et al., FEBS Lett., 100:81-84(1979); Yagi et al., Methods Enzymol., 113:83-89(1985)]), 사카로마이세스 세레비지아에로부터의 AAT2(문헌[Yagi et al., J. Biochem., 92:35-43(1982)]), 및 아라비도프시스 탈리아나로부터의 ASP5(문헌[de la Torre et al., Plant J. 46:414-425(2006); Kwok and Hanson J. Exp. Bot., 55:595-604(2004); Wilkie and Warren Protein Expr. Purif. 12:381-389(1998)])의 유전자 산물들에 의해 촉매화된다. 라투스 노르베기쿠스로부터의 효소는 또 다른 기질, 예를 들어 2-아미노헥산다이오산 및 2,4-다이아미노부티르산을 트랜스아민화하는 것으로 나타났다(문헌[Recasens et al., Biochemistry 19:4583-4589(1980)]). 다른 아미노산 기질 상에서 작용하는 아미노트랜스퍼라제들이 또한 상기 형질전환을 촉매화할 수 있다. 발린 아미노트랜스퍼라제는 발린 및 피루베이트의 2-케토아이소발레레이트 및 알라닌으로의 전환을 촉매화한다. 에스케리키아 콜라이 유전자 avtA는 하나의 상기와 같은 효소를 암호화한다(문헌[Whalen and Berg J. Bacteriol. 150:739-746(1982)]). 상기 유전자 산물은 또한 α-케토부티레이트의 트랜스아민화를 촉매화하여 α-아미노부티레이트를 생성시키지만, 상기 반응에서 아민 공여체는 동정되지 않았다(문헌[Whalen and Berg J. Bacteriol., 158:571-574(1984)]). 에스케리키아 콜라이 serC의 유전자 산물은 2 개의 반응, 즉 포스포세린 아미노트랜스퍼라제 및 포스포하이드록시쓰레오닌 아미노트랜스퍼라제를 촉매화하며(문헌[Lam and Winkler, J. Bacteriol. 172:6518-6528(1990)]), 비-인산화된 기질 상에서의 활성은 검출할 수 없었다(문헌[Drewke et al. FEBS. Lett. 390:179-182(1996)]).
Figure pct00139
또 다른 효소 후보는 일부 유기체에서 리신 생합성 및 분해에 관여하는 효소인 알파-아미노아디페이트 아미노트랜스퍼라제(EC 2.6.1.39)이다. 상기 효소는 아미노 수용체로서 알파-케토글루타레이트를 사용하여, 2-아미노아디페이트 및 2-옥소아디페이트를 상호전환시킨다. 유전자 후보들이 호모 사피엔스(문헌[Okuno et al., Enzyme Protein 47:136-148(1993)]) 및 써무스 써모필루스(문헌[Miyazaki et al., Microbiology 150:2327-2334(2004)])에서 발견된다. lysN에 의해 암호화되는, 상기 써무스 써모필루스 효소는 옥살로아세테이트, 2-옥소아이소카프로에이트, 2-옥소아이소발레레이트, 및 2-옥소-3-메틸발레레이트를 포함한 여러 가지 또 다른 기질들에 대해 활성이다.
Figure pct00140
2.7.2.a 포스포트랜스퍼라제 ( 카복시 수용체).
EC 부류 2.7.2의 포스포트랜스퍼라제 효소는 1 ATP의 동반 가수분해와 함께 카복실산을 포스폰산으로 형질전환시킨다. 도 62의 단계 O는 상기와 같은 효소에 의한 4-하이드록시부티레이트의 4-하이드록시부티릴-포스페이트로의 전환을 수반한다. 부티레이트 키나제(EC 2.7.2.7)는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰에서 산 발생 중 부티릴-포스페이트의 부티레이트로의 가역적인 전환을 수행한다(문헌[Cary et al., Appl. Environ. Microbiol. 56:1576-1583(1990)]). 상기 효소는 2 개의 buk 유전자 산물에 의해 암호화된다(문헌[Huang et al., J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2:33-38(2000)]). 다른 부티레이트 키나제 효소들이 클로스트리듐 부티리쿰 및 클로스트리듐 테타노몰품에서 발견된다(문헌[Twarog and Wolfe, J. Bacteriol. 86:112-117(1963)]). 써모토가 마리티마로부터의 관련 효소인 아이소부티레이트 키나제가 또한 에스케리키아 콜라이에서 발현되고 결정화되었다(문헌[Diao et al., Acta Crystallogr. 59:1100-1102(2003); Diao and Hasson, J. Bacteriol. 191:2521-2529(2009)]). 아스파토키나제는 아스파테이트의 ATP-의존성 인산화를 촉매화하고 여러 아미노산들의 합성에 관여한다. lysC에 의해 암호화된, 에스케리키아 콜라이 중의 아스파토키나제 III 효소는 넓은 기질 범위를 가지며, 기질 특이성에 관련된 촉매 잔기들이 추론되었다(문헌[Keng and Viola, Arch. Biochem. Biophys. 335:73-81(1996)]). 에스케리키아 콜라이 중의 2 개의 추가적인 키나제가 또한 양호한 후보이다: 아세테이트 키나제 및 감마-글루타밀 키나제. ackA에 의해 암호화된 에스케리키아 콜라이 아세테이트 키나제(문헌[Skarstedt and Silverstein, J. Biol. Chem. 251:6775-6783(1976)])는 아세테이트 이외에 프로피오네이트를 인산화한다(문헌[Hesslinger et al., Mol. Microbiol. 27:477-492(1998)]). proB에 의해 암호화된 에스케리키아 콜라이 감마-글루타밀 키나제(문헌[Smith et al., J. Bacteriol. 157:545-551(1984)])는 글루타메이트의 감마 카본산 그룹을 인산화한다.
Figure pct00141
아세틸글루타메이트 키나제는 아르기닌 생합성 중에 아세틸화된 글루타메이트를 인산화한다. 상기 효소는 또 다른 기질들을 수용하는 것이 공지되어 있지 않으나; 기질 결합 및 인산화에 관련된 에스케리키아 콜라이 효소의 여러 잔기들이 부위 지정 돌연변이에 의해 추론되었다(문헌[Marco-Marin et al., J. Mol. Biol. 334:459-476(2003); Ramon-Maiques et al, Structure 10:329-342(2002)]). 상기 효소는 바실러스 서브틸리스 및 에스케리키아 콜라이 중의 argB(문헌[Parsot et al., Gene 68:275-283(1988)]), 및 사카로마이세스 세레비지아에 중의 ARG5 ,6(문헌[Pauwels et al., Eur. J. Biochem. 270:1014-1024(2003)])에 의해 암호화된다. 상기 사카로마이세스 세레비지아에의 Arg5,6 유전자는 미토콘드리아 기질 중에서 성숙하여 아세틸글루타메이트 키나제 및 아세틸글루타밀포스페이트 리덕타제가 되는 폴리단백질 전구체를 암호화한다.
Figure pct00142
2.8.3.a CoA 트랜스퍼라제
클로스트리듐 클루이베리의 cat1 , cat2 및 cat3의 유전자 산물들이 각각 숙시닐-CoA(단계 G, 도 62 및 63), 4-하이드록시부티릴-CoA(단계 T, 도 62), 및 부티릴-CoA 아세틸트랜스퍼라제 활성을 나타내는 것으로 입증되었다(문헌[Seedorf et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105:2128-2133(2008); Sohling and Gottschalk, J Bacteriol 178:871-880(1996)]). 유사한 CoA 트랜스퍼라제 활성들이 또한 트리코모나스 바기날리스(문헌[van Grinsven et al., J. Biol. Chem. 283:1411-1418(2008)]) 및 트리파노소마 브루세이(문헌[Riviere et al., J. Biol. Chem. 279:45337-45346(2004)]) 중에 존재한다.
Figure pct00143
상기 유형의 형질전환에 추가로 유용한 효소는 아실-CoA:아세테이트-CoA 트랜스퍼라제(또한 아세테이트-CoA 트랜스퍼라제(EC 2.8.3.8)로서도 공지됨)이며, 이는 아이소부티레이트(문헌[Matthies and Schink, Appl. Environ. Microbiol. 58:1435-1439(1992)]), 발레레이트(문헌[Vanderwinkel et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 33:902-908(1968)]) 및 부타노에이트(상기 Vanderwinkel(1968))를 포함하여, 다양한 분지 및 선형 아실-CoA 기질로부터 상기 CoA 부분을 아세테이트로 운반하는 것으로 또한 입증되었다. 상기 효소는 에스케리키아 콜라이 스페시즈 K12(문헌[Korolev et al., Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 58:2116-2121(2002)]; 상기 Vanderwinkel(1968)) 중의 atoA(알파 서브유닛) 및 atoD(베타 서브유닛)에 의해 암호화된다. 유사한 효소들이 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032(문헌[Duncan et al. Appl. Environ. Microbiol. 68:5186-5190(2002)]), 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(문헌[Cary et al., Appl. Environ. Microbiol. 56:1576-1583(1990); Wiesenborn et al., Appl. Environ. Microbiol. 55:323-329(1989)]), 및 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰(문헌[Kosaka et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 71:58-68(2007)]) 중에 존재한다.
Figure pct00144
혐기성 세균 애시드아미노코커스 페르멘탄스로부터의 글루타코네이트-CoA-트랜스퍼라제(EC 2.8.3.12) 효소는 이산 글루타코닐-CoA 및 3-부테노일-CoA와 반응한다(문헌[Mack and Buckel, FEBS Lett. 405:209-212(1997)]). 상기 효소를 암호화하는 유전자는 gctA 및 gctB이다. 상기 효소는 글루타릴-CoA, 2-하이드록시글루타릴-CoA, 아디필-CoA 및 아크릴일-CoA를 포함한 다른 CoA 유도체들을 환원시키지만 이들에 의해 검출 가능한 활성을 갖는다(문헌[Buckel et al., Eur. J. Biochem. 118:315-321(1981)]). 상기 효소는 에스케리키아 콜라이에서 클로닝되고 발현되었다(문헌[Mac et al., Eur. J. Biochem. 226:41-51(1994)]).
Figure pct00145
3.1.2.a CoA 하이드롤라제
3.1.2 계열의 효소들은 아실-CoA 분자를 그의 상응하는 산으로 가수분해한다. 그러나, 양성자 펌프와 같은 에너지원 또는 직접적인 ATP 가수분해에 결합된 경우 상기와 같은 효소를 변형시켜 CoA-리가제 또는 신타제 작용성을 부여할 수 있다. 여러 진핵생물 아세틸-CoA 하이드롤라제(EC 3.1.2.1)는 넓은 기질 특이성을 갖는다. 예를 들어, 라투스 노르베기쿠스 뇌로부터의 효소(문헌[Robinson et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 71:959-965(1976)])는 부티릴-CoA, 헥사노일-CoA 및 말로닐-CoA와 반응할 수 있다. 완두콩 잎의 미토콘드리아로부터의 효소가 또한, 그의 서열이 보고되지는 않았지만, 넓은 기질 특이성을 가지며, 아세틸-CoA, 프로피오닐-CoA, 부티릴-CoA, 팔미토일-CoA, 올레일-CoA, 숙시닐-CoA, 및 크로토닐-CoA에 대한 활성이 입증되었다(문헌[Zeiher and Randall, Plant. Physiol. 94:20-27(1990)]). 사카로마이세스 세레비지아에로부터의 아세틸-CoA 하이드롤라제, ACH1은 또 다른 후보 하이드롤라제를 나타낸다(문헌[Buu et al., J. Biol. Chem. 278:17203-17209(2003)]).
Figure pct00146
또 다른 후보 하이드롤라제는, 글루타릴-CoA, 아디필-CoA, 수베릴-CoA, 세바실-CoA, 및 도데칸디오일-CoA에 대해 활성을 나타내는 인간 다이카복실산 티오에스테라제, acot8(문헌[Westin et al., J. Biol. Chem. 280:38125-38132(2005)]), 및 광범위한 CoA 티오에스터를 또한 가수분해할 수 있는 가장 가까운 에스케리키아 콜라이 상동체, tesB(문헌[Naggert et al., J. Biol. Chem. 266:11044-11050(1991)])이다. 유사한 효소가 또한 래트 간에서 특성화되었다(문헌[Deana, Biochem Int. 26:p.767-773(1992)]). 다른 잠재적인 에스케리키아 콜라이 티오에스터 하이드롤라제는 tesA(문헌[Bonner and Bloch, J. Biol. Chem. 247:3123-3133(1972)]), ybgC(문헌[Kuznetsova et al., FEMS Microbiol. Rev. 29:263-279(2005); Zhuang et al., FEBS Lett. 516:161-163(2002)]), paaI(문헌[Song et al., J. Biol. Chem. 281:11028-11038(2006)]) 및 ybdB(문헌[Leduc et al., J. Bacteriol. 189:7112-7126(2007)])의 유전자 산물을 포함한다.
Figure pct00147
더욱 또 다른 후보 하이드롤라제는 애시드아미노코커스 페르멘탄스로부터의 글루타코네이트 CoA-트랜스퍼라제이다. 상기 효소는 글루타릴-CoA, 아세틸-CoA 및 3-부테노일-CoA에 대한 활성을 갖는 아실-CoA 하이드롤라제로 부위 지정 돌연변이에 의해 형질전환되었다(문헌[Mack and Buckel, FEBS Lett. 405:209-212(1997)]). 이는 숙시닐-CoA:3-케토산-CoA 트랜스퍼라제 및 아세토아세틸-CoA:아세틸-CoA 트랜스퍼라제를 암호화하는 효소가 또한 상기 반응 단계에 대한 후보로서 작용할 수 있지만 그의 작용을 변화시키기 위해서 어떤 돌연변이를 필요로 하는 듯함을 가리킨다.
Figure pct00148
추가적인 하이드롤라제 효소는 3-하이드록시아이소부티릴-CoA 하이드롤라제를 포함하며, 이는 발린 분해 중에 3-하이드록시아이소부티릴-CoA의 3-하이드록시아이소부티레이트로의 전환을 효율적으로 촉매화하는 것으로 개시되었다(문헌[Shimomura et al., J. Biol. Chem. 269:14248-14253(1994)]). 상기 효소를 암호화하는 유전자는 라투스 노르베기쿠스(상기 Shimomura et al.(1994); 문헌[Shimomura et al., Methods Enzymol. 324:229-240(2000)]) 및 호모 사피엔스(상기 Shimomura et al.(1994))의 hibch를 포함한다. 서열 상동성에 의한 후보 유전자는 사카로마이세스 세레비지아에의 hibch 및 바실러스 세레우스의 BC _2292를 포함한다.
Figure pct00149
4.1.1.a 카복시 - 라이아제
알파- 케토산의 탈카복실화 .
알파-케토글루타레이트 데카복실라제(단계 B, 도 58, 62 및 63), 5-하이드록시-2-옥소펜탄산 데카복실라제(단계 Z, 도 62), 및 5-아미노-2-옥소펜타노에이트 데카복실라제(단계 R, 도 63)는 모두 알파-케토산의 탈카복실화를 수반한다. 케토산의 탈카복실화는 다양한 기질 특이성을 갖는 다양한 효소들, 예를 들어 피루베이트 데카복실라제(EC 4.1.1.1), 벤조일포메이트 데카복실라제(EC 4.1.1.7), 알파-케토글루타레이트 데카복실라제 및 분지쇄 알파-케토산 데카복실라제에 의해 촉매화된다.
피루베이트 데카복실라제(PDC)(또한 케토산 데카복실라제로 지칭됨)는 알콜 발효에 핵심 효소이며, 피루베이트의 아세트알데하이드로의 탈카복실화를 촉매화한다. 사카로마이세스 세레비지아에로부터의 상기 효소는 2-케토부티레이트, 2-케토발레레이트, 3-하이드록시피루베이트 및 2-페닐피루베이트를 포함한 지방족 2-케토산에 대해 광범위한 기질 범위를 갖는다(문헌[Davie et al., J. Biol. Chem. 267:16601-16606(1992)]). 상기 효소는 광범위하게 연구되었으며, 변경된 활성을 위해 조작되었고, 에스케리키아 콜라이에서 작용적으로 발현되었다(문헌[Killenberg-Jabs et al., Eur. J. Biochem. 268:1698-1704(2001); Li and Jordan, Biochemistry 38:10004-10012(1999); ter Schure et al., Appl. Environ. Microbiol. 64:1303-1307(1998)]). pdc에 의해 암호화되는, 자이모모나스 모빌루스로부터의 PDC는 또한 넓은 기질 범위를 가지며, 상이한 기질들에 대한 친화성 변경에 지정된 공학 연구의 주제였다(문헌[Siegert et al., Protein Eng. Des. Sel., 18:345-357(2005)]). 상기 효소의 결정 구조를 입수할 수 있다(문헌[Killenberg-Jabs et al. Eur. J. Biochem. 268:1698-1704(2001)]). 다른 잘-특성화된 PDC 후보는 아세토박터 파스퇴리안스(문헌[Chandra et al., Arch. Microbiol. 176:443-451(2001)]) 및 클루이베로마이세스 락티스(문헌[Krieger et al., Eur. J. Biochem., 269:3256-3263(2002)])로부터의 효소들을 포함한다.
Figure pct00150
PDC처럼, 벤조일포메이트 데카복실라제(EC 4.1.1.7)는 광범위한 기질 범위를 가지며 효소 공학 연구의 표적이었다. 슈도모나스 푸티다로부터의 효소가 광범위하게 연구되어 왔으며 상기 효소의 결정 구조를 입수할 수 있다(문헌[Hasson et al., Biochemistry, 37:9918-9930(1998); Polovnikova et al., Biochemistry 42:1820-1830(2003)]). 상기 슈도모나스 푸티다 효소의 활성 부위 중 2 개 잔기의 부위-지정된 돌연변이는 천연 및 비-천연 기질들의 친화성(Km)을 변경시켰다(문헌[Siegert et al., Protein Eng. Des. Sel. 18:345-357(2005)]). 상기 효소의 성질들은 지정된 공학에 의해 추가로 개질되었다(문헌[Lingen et al., Protein Eng., 15:585-593(2002); Lingen et al., Chembiochem. 4:721-726(2003)]). mdlC에 의해 암호화되는, 슈도모나스 아에루기노사로부터의 효소가 또한 실험적으로 특성화되었다(문헌[Barrowman et al., FEMS Microbiol. Lett, 34:57-60(1986)]). 슈도모나스 스투트제리, 슈도모나스 플루오레센스 및 다른 유기체들로부터의 추가의 유전자 후보들이 서열 상동성에 의해 추리되거나 또는 슈도모나스 푸티다에서 개발된 생육 선택 시스템을 사용하여 동정될 수 있다(문헌[Henning et al., Appl. Environ. Microbiol., 72:7510-7517(2006)]).
Figure pct00151
2-옥소산을 탈카복실화할 수 있는 세 번째 효소는 알파-케토글루타레이트 데카복실라제(KGD)이다. 상기 효소 부류의 기질 범위는 지금까지 연구되지 않았다. 마이코박테리움 튜베르큘로시스로부터의 KDC(문헌[Tian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:10670-10675(2005)])가 클로닝되고 작용적으로 발현되었다. 그러나, 상기 효소는 크고(약 130 kD) GC-풍부이기 때문에 균주 공학에 이상적인 후보는 아니다. KDC 효소 활성은 브라디리조븀 자포니쿰 및 메소리조븀 로티를 포함한 여러 리조비아 종들에서 검출되었다(문헌[Green et al., J. Bacteriol. 182:2838-2844(2000)]). 상기 KDC-암호화 유전자(들)는 이들 유기체에서 단리되지 않았지만, 게놈 서열을 입수할 수 있으며 각 게놈 중의 여러 유전자들이 추정적인 KDC로서 주석이 달린다. 유글레나 그리실리스로부터의 KDC가 또한 특성화되었지만, 상기 활성과 관련된 유전자는 지금까지 동정되지 않았다(문헌[Shigeoka and Nakano, Arch. Biochem. Biophys. 288:22-28(1991)]). N-말단으로부터 출발하여 처음 20 개 아미노산이 서열화되었다(MTYKAPVKDVKFLLDKVFKV; 서열번호)(문헌[Shigeoka and Nakano, Arch. Biochem. Biophys. 288:22-28(1991)]). 상기 유전자를 KDC 활성에 대해 상기 N-말단 서열을 함유하는 후보 유전자를 시험함으로써 동정할 수 있다.
Figure pct00152
상기 반응을 촉매화하는 네 번째 후보 효소는 분지쇄 알파-케토산 데카복실라제(BCKA)이다. 상기 부류의 효소는 탄소수 3 내지 6의 다양한 쇄 길이의 다양한 화합물들 상에서 작용하는 것으로 나타났다(문헌[Oku and Kaneda, J. Biol. Chem. 263:18386-18396(1998); Smit et al., B.A., J. E. Hylckama Vlieg, W.J. Engels, L. Meijer, J.T. Wouters, and G. Smit. Identification, cloning, and characterization of a Lactococcus lactis branched-chain alpha-keto acid decarboxylase involved in flavor formation. Appl. Environ. Microbiol. 71:303-311(2005)]). 락토코커스 락티스 중의 효소가 2-옥소부타노에이트, 2-옥소헥사노에이트, 2-옥소펜타노에이트, 3-메틸-2-옥소부타노에이트, 4-메틸-2-옥소부타노에이트 및 아이소카프로에이트를 포함한 다양한 분지 및 선형 기질들 상에서 특성화되었다(문헌[Smit et al., Appl Environ Microbiol 71:303-311(2005)]). 상기 효소는 구조적으로 특성화되었다(문헌[Berg et al., Science 318:1782-1786(2007)]). 락토코커스 락티스 효소와 자이모모나스 모빌리우스의 피루베이트 데카복실라제 간의 서열 정렬은 상기 촉매 및 기질 인식 잔기가 거의 동일하며(문헌[Siegert et al., Protein Eng. Des. Sel. 18:345-357(2005)]), 따라서 상기 효소가 지정된 공학에 유망한 후보일 수 있음을 가리킨다. BCKA에 의한 알파-케토글루타레이트의 탈카복실화가 바실러스 서브틸리스에서 검출되었으나; 상기 활성은 다른 분지쇄 기질에 대한 활성에 비해 낮았으며(5%)(문헌[Oku and Kaneda. Biosynthesis of branched-chain fatty acids in Bacillus subtilis. A decarboxylase is essential for branched-chain fatty acid synthetase. J. Biol. Chem. 263:18386-18396(1988)]), 상기 효소를 암호화하는 유전자는 지금까지 동정되지 않았다. 추가적인 BCKA 유전자 후보들을 락토코커스 락티스 단백질 서열에 대한 상동성에 의해 동정할 수 있다. 상기 효소에 대한 고 득점 BLASTp 적중 중 다수는 인돌피루베이트 데카복실라제(EC 4.1.1.74)로서 주석이 달린다. 인돌피루베이트 데카복실라제(IPDA)는 식물 및 식물 세균에서 인돌피루베이트의 인돌아세트알데하이드로의 탈카복실화를 촉매화하는 효소이다.
Figure pct00153
호모 사피엔스 및 보스 타우루스로부터의 미토콘드리아 분지쇄 케토산 데하이드로게나제 복합체의 E1 서브유닛으로부터 유래된 재조합 분지쇄 알파-케토산 데카복실라제 효소가 클로닝되었으며 에스케리키아 콜라이에서 작용적으로 발현되었다(문헌[Davie et al., J. Biol. Chem. 267:16601-16606(1992); Wynn et al., J. Biol. Chem. 267:1881-1887(1992); Wynn et al., J. Biol. Chem. 267:12400-12403(1992)]). 이들 연구에서, 저자들은 샤페로닌 GroEL 및 GroES의 공동 발현이 상기 데카복실라제의 비 활성을 500 배까지 증대시킴을 발견하였다(문헌[Wynn et al., J. Biol. Chem. 267:12400-12403(1992)]). 이들 효소는 2 개의 알파 및 2 개의 베타 서브유닛으로 구성된다.
Figure pct00154
알파- 케토산의 탈카복실화 .
여러 오르니틴 데카복실라제(단계 U, 도 63) 효소들이 또한 리신 및 다른 유사한 화합물들에 대한 활성을 나타낸다. 상기와 같은 효소들은 니코티아나 글루티노사(Nicotiana glutinosa)(문헌[Lee and Cho, Biochem. J. 360:657-665(2001)]), 락토바실러스 스페시즈 30a(문헌[Guirard and Snell, J. Biol. Chem. 255:5960-5964(1980)) 및 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus)(문헌[Lee et al., J. Biol. Chem. 282:27115-27125(2007)])에서 발견된다. 상기 락토바실러스 스페시즈 30a(문헌[Momany et al., J. Mol. Biol. 252:643-655(1995)]) 및 비브리오 불니피쿠스로부터의 효소들이 결정화되었다. 상기 비브리오 불니피쿠스 효소는 리신 탈카복실화를 효율적으로 촉매화하며, 기질 특이성에 관련된 잔기들이 추론되었다(ㅁLee무n나스 바기날리스에서 특성화되었으나, 상기 효소를 암호화하는 유전자는 공지되지 않았다(문헌[Yarlett et al., Biochem. J. 293(Pt2):487-493(1993)]).
Figure pct00155
글루타메이트 데카복실라제 효소(단계 L, 도 62 및 63)가 또한 잘 특성화되어 있다. 예시적인 글루타메이트 데카복실라제들이 에스케리키아 콜라이(문헌[De Biase et al., Protein Expr. Purif. 8:430-438(1996)]), 사카로마이세스 세레비지아에(문헌[Coleman et al., J. Biol. Chem. 276:244-250(2001)]), 및 호모 사피엔스(문헌[Bu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2115-2119(1992); Bu and Tobin, Genomics 21:222-228(1994)])에서 발견될 수 있다.
Figure pct00156
리신 데카복실라제(EC 4.1.1.18)는 리신의 카다베린으로의 탈카복실화를 촉매화한다. 상기 효소의 2 개의 아이소자임이 유전자 cadA 및 ldcC에 의해 에스케리키아 콜라이에서 암호화된다. CadA는 내산성에 관련되며 cadC 유전자 산물에 의해 양의 조절이 가해진다(문헌[Lemonnier and Lane, Microbiology 144(Pt 3):751-760(1998)]). CadC는 또 다른 기질로서 하이드록시리신 및 S-아미노에틸시스테인을 수용하고, 2-아미노피멜레이트 및 6-ACA는 상기 효소에 대한 경쟁적인 억제제로서 작용한다(문헌[Sabo et al., Biochemistry 13:662-670(1974)]). 방향 진화 또는 다른 효소 공학 방법들을 사용하여 상기 효소가 2-아미노피멜레이트를 탈카복실화하는 활성을 증가시킬 수 있다. 구성적으로 발현된 ldc 유전자 산물은 CadA보다 덜 활성이다(문헌[Lemonnier and Lane, Microbiology 144(Pt 3):751-760(1998)]). CadA와 유사한 리신 데카복실라제가 최근에 비브리오 파라하에모리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus)에서 동정되었다(문헌[Tanaka et al., J. Appl. Microbiol. 104:1283-1293(2008)]). ldc에 의해 암호화되는, 셀레노모나스 루미난티움(Selenomonas ruminantium)으로부터의 리신 데카복실라제는 원핵생물 오르니틴 데카복실라제에 대한 서열 유사성을 가지며 기질로서 L-리신과 L-오르니틴을 모두 수용한다(문헌[Takatsuka et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 63:1843-1846(1999)]). 활성 부위 잔기들이 동정되었고 상기 효소의 기질 활성을 변경하도록 조작되었다(문헌[Takatsuka et al., J. Bacteriol. 182:6732-6741(2000)]).
Figure pct00157
6.2.1.a CoA 신시타제
CoA 신시타제 또는 리가제 반응은 도 62 및 63의 단계 I, 및 도 62의 단계 V에 의해 요구된다. 숙시네이트 또는 4-하이드록시부티레이트가 필요한 기질이다. 이들 형질전환을 수행할 것 같은 효소를 암호화하는 예시적인 유전자는, 숙시닐-CoA 신시타제 복합체를 자연적으로 형성하는, 에스케리키아 콜라이의 sucCD 유전자를 포함한다. 상기 효소는 1 ATP의 동반 소모(생체 내에서 가역적인 반응이다)로 숙시네이트로부터의 숙시닐-CoA의 형성을 자연적으로 촉매화한다(문헌[Buck et al., Biochem. 24:6245-6252(1985)]).
Figure pct00158
추가의 예시적인 CoA-리가제는, 아직 서열이 특성화되지 않은 래트 다이카복실레이트-CoA 리가제(문헌[Vamecq et al., Biochemical J. 230:683-693(1985)]), 페니실리움 크리소제눔(Penicillium chrysogenum)으로부터의 2 개의 특성화된 페닐아세테이트-CoA 리가제 중 어느 하나(문헌[Lamas-Maceiras et al., Biochem. J. 395:147-155(2005); Wang et al., Biochem Biophy Res Commun 360(2):453-458(2007)]), 슈도모나스 푸티다로부터의 페닐아세테이트-CoA 리가제(문헌[Martinez-Blanco et al., J. Biol. Chem. 265:7084-7090(1990)]), 및 바실러스 서브틸리스로부터의 6-카복시헥사노에이트-CoA 리가제(문헌[Bower et al., J. Bacteriol. 178(14):4122-4130(1996)])를 포함한다. 추가적인 후보 효소는 무스 무스쿨루스(문헌[Hasegawa et al., Biochim. Biophys. Acta. 1779:414-419(2008)]) 및 호모 사피엔스(문헌[Ohgami et al., Biochem. Pharmacol. 65:989-994(2003)])로부터의 아세토아세틸-CoA 신시타제이며, 상기 효소는 아세토아세테이트의 아세토아세틸-CoA로의 ATP-의존적인 전환을 자연적으로 촉매화한다. 4-하이드록시부티릴-CoA 신시타제 활성이 메탈로스파에라 세둘라에서 입증되었다(문헌[Berg et al., Science 318:1782-1786(2007)]). 상기 작용은 시험적으로 Msed_1422 유전자로 할당되었다.
Figure pct00159
ADP-형성 아세틸-CoA 신시타제(ACD, EC 6.2.1.13)는 ATP의 동반적인 합성과 아실-CoA 에스터의 그의 상응하는 산으로의 전환을 결합시키는 또 다른 후보 효소이다. 광범위한 기질 특이성을 갖는 여러 효소들이 문헌에 개시되었다. AF1211에 의해 암호화된, 알카에오글로부스 풀기두스(Archaeoglobus fulgidus)로부터의 ACD I은 아세틸-CoA, 프로피오닐-CoA, 부티릴-CoA, 아세테이트, 프로피오네이트, 부티레이트, 아이소부티리에이트, 아이소발레레이트, 숙시네이트, 퓨마레이트, 페닐아세테이트, 인돌아세테이트를 포함한 다양한 선형 및 분지쇄 기질들 상에서 작용하는 것으로 나타났다(문헌[Musfeldt et al., J. Bacteriol. 184:636-644(2002)]). 할로알큘라 마리스모르투이(Haroarcula marismortui)로부터의 효소(숙시닐-CoA 신시타제로서 주석이 달렸다)는 기질로서 프로피오네이트, 부티레이트, 및 분지쇄 산(아이소발레레이트 및 아이소부티레이트)을 수용하며, 순 방향 및 역방향으로 작용하는 것으로 나타났다(문헌[Brasen et al., Arch. Microbiol. 182:277-287(2004)]). 초고온성 크레나카에온인 파이로바큘룸 아에로필룸(Pyrobaculum aerophilum)으로부터의 PAE3250에 의해 암호화된 ACD는, 아세틸-CoA, 아이소부티릴-CoA(바람직한 기질) 및 페닐아세틸-CoA와 반응하는 모든 특성화된 ACD 중 가장 광범위한 기질 범위를 나타내었다(상기 Brasen et al.(2004)). 알카에오글로부스 풀기두스, 할로알큘라 마리스모르투이 및 피로바쿨룸 아에로필룸으로부터의 효소들은 모두 클로닝되었으며, 작용상 발현되었고, 에스케리키아 콜라이에서 특성화되었다(상기 Musfeldt et al.,; 상기 Brasen et al.(2004)).
Figure pct00160
실시예 XXIII
카복실산 리덕타제를 사용하는 BDO 의 생산
본 실시예는 카복실산 리덕타제 효소를 사용하여 1,4-부탄다이올을 생산하는 미생물 유기체의 생성을 개시한다.
에스케리키아 콜라이를 도 58에 개시된 1,4-부탄다이올 합성 경로를 조작하기 위한 표적 유기체로서 사용한다. 에스케리키아 콜라이는 1,4-부탄다이올을 생산할 수 있는 비-천연 미생물을 생성시키기에 양호한 숙주를 제공한다. 에스케리키아 콜라이는 유전자 조작이 쉽고 다양한 산소화 조건 하에서 유효하게 에탄올, 아세트산, 폼산, 락트산, 및 숙신산과 같은 다양한 생성물들을 생산할 수 있는 것으로 공지되어 있다.
4- 하이드록시부티레이트 경로 유전자의 염색체 내로의 통합: ECKh -432의 제작
카복실산 리덕타제 효소를 에스케리키아 콜라이 지정된 ECKh-761의 균주(숙시네이트 세미알데하이드 데하이드로게나제 효소를 암호화하는 sad 및 gabD 유전자가 추가로 결실된 ECKh-432의 자손이다)에서 발현시켰다. 상기 균주는 실시예 XXI에 개시된 바와 같이 fimD 유전자 좌에서 에스케리키아 콜라이의 염색체 내로 통합되는, 4HB에 이르는 상기 BDO 경로의 성분들을 함유하였다.
카복실산 리덕타제 및 PPTase 의 클로닝 및 발현
1,4-부탄다이올을 생산하도록 조작된 에스케리키아 콜라이 균주를 생성시키기 위해서, 카복실산 리덕타제 및 포스포판테쎄인 트랜스퍼라제를 암호화하는 핵산을 널리 공지된 분자 생물학 기법을 사용하여 에스케리키아 콜라이에서 발현시킨다(예를 들어 상기 문헌[Sambrook, 2001]; [Ausubel, 1999] 참조). 특히, 노카르디아 이오웬시스(720으로 표시됨), 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis) mc(2)155(890으로 표시됨), 마이코박테리움 아비움(Mycobacterium avium) 서브스페시즈 파라튜베르큘로시스(paratuberculosis) K-10(891로 표시됨) 및 마이코박테리움 마리눔(Mycobacterium marinum) M(892로 표시됨)으로부터의 car 유전자를 PA1/lacO 프로모터의 조절 하에서 pZS*13 벡터(Expressys, Ruelzheim, Germany) 내로 클로닝하였다. 상기 npt(ABI83656.1) 유전자(즉 721)를 pZS*13에 사용된 것들과 유사한 프로모터 및 리보솜 결합 부위의 조절 하에서 원래 미니-F 플라스미드 벡터 PML31의 유도체인 pKJL33S 벡터 내로 클로닝하였다.
상기 car 유전자(GNM_720)는 노카르디아 게놈 DNA로부터 PCR에 의해 클로닝되었다. 그의 핵산 및 단백질 서열을 각각 도 59a 및 59b에 나타낸다. npt 유전자(GNM_721)의 코돈 최적화된 버전은 진아트(GeneArt)(Regensburg, Germany)에 의해 합성되었다. 그의 핵산 및 단백질 서열을 각각 도 60a 및 60b에 나타낸다. 마이코박테리움 스메그마티스 mc(2)155(890으로 표시됨), 마이코박테리움 아비움 서브스페시즈 파라튜베르큘로시스 K-10(891로 표시됨) 및 마이코박테리움 마리눔 M(892로 표시됨) 유전자 및 효소에 대한 핵산 및 단백질 서열들을 각각 도 64, 65 및 66에서 찾을 수 있다. 상기 플라스미드들을 ECKh-761 내로 형질전환시켜 1,4-부탄다이올 생산에 필요한 단백질 및 효소를 발현시켰다.
카복실산 리덕타제를 사용하는 1,4- BDO 생산의 설명.
1,4-부탄다이올 경로의 작용성 발현을 에스케리키아 콜라이 전-세포 배양물을 사용하여 설명하였다. 각각 car 유전자 및 GNM_721을 함유하는 pZS*13 및 pKJL33S 플라스미드로 형질전환된 에스케리키아 콜라이 ECKh-761의 단일 콜로니를 적합한 항생물질을 함유하는 5 ㎖의 LB 배지에 접종하였다. 유사하게, 삽입물이 없는 car-함유 pZS*13 플라스미드 및 pKJL33S 플라스미드로 형질전환된 에스케리키아 콜라이 ECKh-761의 단일 콜로니를 적합한 항생물질을 함유하는 5 ㎖ 분액의 LB 배지에 접종하였다. 적합한 항생물질을 함유하는 신선한 최소 생체 내 전환 배지(하기 참조)를 1.5%의 최초 배양물로 접종함으로써 10 ㎖의 미세-호기성 배양을 시작하였다.
상기 최소 생체 내 전환 배지(1000 ㎖에 대한)의 처방전은 하기와 같다:
Figure pct00161
먼저 캡핑된 혐기성 병을 질소로 5 분간 초기에 플러싱시키고, 이어서 접종 후에 상기 격벽을 18G 바늘로 관통함으로써 미세호기성 조건을 확립시켰다. 상기 바늘을 소량의 공기가 상기 병 안으로 들어가도록 하기 위해서 생육 중 상기 병에 유지시켰다. 상기 배양물이 중간 대수 증식기에 도달하면 0.2 mM IPTG로 단백질 발현을 유도하였다. 이를 시간 = 0 시간으로 간주한다. 상기 배양 상등액을 상기 및 WO2008115840에 개시된 바와 같이 BDO, 4HB, 및 다른 부산물에 대해 분석하였다(표 31 참조).
표 33은 BDO의 생산을 포함하여, 다양한 카복실산 리덕타제를 발현하는 균주에서의 다양한 생성물들의 생산을 나타낸다.
Figure pct00162
상기 결과는 다양한 카복실산 리덕타제들이 BDO 경로에서 BDO를 생산하도록 작용할 수 있음을 나타낸다.
본 출원 전체를 통해 다양한 공보들을 참조하였다. 이들 공보는 본 발명이 속하는 분야의 기술의 발달 상태를 보다 충분히 개시하기 위해서 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다. 본 발명을 상기 제공된 실시예들을 참고로 개시하였지만, 본 발명의 진의로부터 이탈됨 없이 다양한 변경들을 수행할 수 있음은 물론이다.
SEQUENCE LISTING <110> GENOMATICA, INC. <120> MICROORGANISMS FOR THE PRODUCTION OF 1,4-BUTANEDIOL, 4-HYDROXYBUTANAL, 4-HYDROXYBUTYRYL-COA, PUTRESCINE AND RELATED COMPOUNDS, AND METHODS RELATED THERETO <130> 066662-0352 <140> PCT/US2010/052570 <141> 2010-10-13 <150> US61/251,287 <151> 2009-10-13 <160> 99 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 1 gacgaattcg ctagcaagag gagaagtcga catgtccaat tcactggccg tcgttttac 59 <210> 2 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 2 gaccctagga agctttctag agtcgaccta tgcggcatca gagcaga 47 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 3 atgtaccgca agttccgc 18 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 4 caatttgccg atgcccag 18 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 5 gctgaccact gaagactttg 20 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 6 gatcagggct tcggtgtag 19 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 7 ttggtgcggg ccaagcagga tctgctc 27 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 8 tcagccgaac gcctcgtcga ggatctcctg 30 <210> 9 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 9 tggccaacat aagttcacca ttcgggcaaa ac 32 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 10 tctcttcaac cagccattcg ttttgcccg 29 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Clostridium acetobutylicum <400> 11 attaaagtta agtggaggaa tgttaac 27 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 12 acacgcggat ccaacgtccc gg 22 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 13 agcggctccg ctagccgctt atg 23 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 14 aagccgttgc tgcagctctt gagc 24 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 15 atctccggcg gtcggatccg tcg 23 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 16 aaagcggcta gccacgccgc 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 17 attacacgag gtacccaacg 20 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 18 atgctggcgt acaaaggtgt cc 22 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 19 ggacaccttt gtacgccagc at 22 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 20 atcgcctaca ctaaaccaga agtgg 25 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 21 ccacttctgg tttagtgtag gcgat 25 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 22 aggcagttcc ataggatggc 20 <210> 23 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 23 tgacatgtaa cacctacctt ctgtgcctgt gccagtggtt gctgtgatat agaag 55 <210> 24 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 24 ataataatac atatgaacca tgcgagttac gggcctataa gccaggcg 48 <210> 25 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 25 agtttttcga tatctgcatc agacaccggc acattgaaac gg 42 <210> 26 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 26 ctggcacagg cacagaaggt aggtgttaca tgtcagaacg tttacacaat gacgtggatc 60 <210> 27 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 27 agacaaatcg gttgccgttt gttaagccag gcgagatatg atctatatc 49 <210> 28 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 28 gagttttgat ttcagtactc atcatgtaac acctaccttc ttgctgtgat atag 54 <210> 29 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 29 ctatatcaca gcaagaaggt aggtgttaca tgatgagtac tgaaatcaaa actc 54 <210> 30 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 30 gatatagatc atatctcgcc tggcttaaca aacggcaacc gatttgtct 49 <210> 31 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 31 tattgtgcat acagatgaat ttttatgcaa acagtcagcc ctgaagaagg gtgtaggctg 60 gagctgcttc 70 <210> 32 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 32 caaaaaaccg gagtctgtgc tccggttttt tattatccgc taatcaatta catatgaata 60 tcctccttag 70 <210> 33 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 33 ataataatag aattcgtttg ctacctaaat tgccaactaa atcgaaacag g 51 <210> 34 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 34 tattattatg gtaccaatat catgcagcaa acggtgcaac attgccg 47 <210> 35 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 35 tgatctggaa gaattcatcg gctttaccac cgtcaaaaaa aacggcg 47 <210> 36 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 36 ataaaaccct gcagcggaaa cgaagtttta tccatttttg gttacctg 48 <210> 37 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 37 ggaagagagg ctggtaccca gaagccacag cagga 35 <210> 38 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 38 gtaatcactg cgtaagcgcc atgccccggc gttaattc 38 <210> 39 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 39 attgccgcgt tcctcctgct gtcga 25 <210> 40 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 40 cgacagcagg aggaacgcgg caat 24 <210> 41 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 41 gtttgcacgc tatagctgag gttgttgtct tccagcaacg taccgtatac aataggcgta 60 tcacgaggcc ctttc 75 <210> 42 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 42 gctacagcat gtcacacgat ctcaacggtc ggatgaccaa tctggctggt atgggaatta 60 gccatggtcc 70 <210> 43 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 43 tgtgagtgaa agtcacctgc cttaatatct caaaactcat cttcgggtga cgaaatatgg 60 cgtgactcga tac 73 <210> 44 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 44 tctgtatcag gctgaaaatc ttctctcatc cgccaaaaca gcttcggcgt taagatgcgc 60 gctcaaggac 70 <210> 45 <211> 20 <212> PRT <213> Euglena gracilis <400> 45 Met Thr Tyr Lys Ala Pro Val Lys Asp Val Lys Phe Leu Leu Asp Lys 1 5 10 15 Val Phe Lys Val 20 <210> 46 <211> 2036 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 46 atgaacttac atgaatatca ggcaaaacaa ctttttgccc gctatggctt accagcaccg 60 gtgggttatg cctgtactac tccgcgcgaa gcagaagaag ccgcttcaaa aatcggtgcc 120 ggtccgtggg tagtgaaatg tcaggttcac gctggtggcc gcggtaaagc gggcggtgtg 180 aaagttgtaa acagcaaaga agacatccgt gcttttgcag aaaactggct gggcaagcgt 240 ctggtaacgt atcaaacaga tgccaatggc caaccggtta accagattct ggttgaagca 300 gcgaccgata tcgctaaaga gctgtatctc ggtgccgttg ttgaccgtag ttcccgtcgt 360 gtggtcttta tggcctccac cgaaggcggc gtggaaatcg aaaaagtggc ggaagaaact 420 ccgcacctga tccataaagt tgcgcttgat ccgctgactg gcccgatgcc gtatcaggga 480 cgcgagctgg cgttcaaact gggtctggaa ggtaaactgg ttcagcagtt caccaaaatc 540 ttcatgggcc tggcgaccat tttcctggag cgcgacctgg cgttgatcga aatcaacccg 600 ctggtcatca ccaaacaggg cgatctgatt tgcctcgacg gcaaactggg cgctgacggc 660 aacgcactgt tccgccagcc tgatctgcgc gaaatgcgtg accagtcgca ggaagatccg 720 cgtgaagcac aggctgcaca gtgggaactg aactacgttg cgctggacgg taacatcggt 780 tgtatggtta acggcgcagg tctggcgatg ggtacgatgg acatcgttaa actgcacggc 840 ggcgaaccgg ctaacttcct tgacgttggc ggcggcgcaa ccaaagaacg tgtaaccgaa 900 gcgttcaaaa tcatcctctc tgacgacaaa gtgaaagccg ttctggttaa catcttcggc 960 ggtatcgttc gttgcgacct gatcgctgac ggtatcatcg gcgcggtagc agaagtgggt 1020 gttaacgtac cggtcgtggt acgtctggaa ggtaacaacg ccgaactcgg cgcgaagaaa 1080 ctggctgaca gcggcctgaa tattattgca gcaaaaggtc tgacggatgc agctcagcag 1140 gttgttgccg cagtggaggg gaaataatgt ccattttaat cgataaaaac accaaggtta 1200 tctgccaggg ctttaccggt agccagggga ctttccactc agaacaggcc attgcatacg 1260 gcactaaaat ggttggcggc gtaaccccag gtaaaggcgg caccacccac ctcggcctgc 1320 cggtgttcaa caccgtgcgt gaagccgttg ctgccactgg cgctaccgct tctgttatct 1380 acgtaccagc accgttctgc aaagactcca ttctggaagc catcgacgca ggcatcaaac 1440 tgattatcac catcactgaa ggcatcccga cgctggatat gctgaccgtg aaagtgaagc 1500 tggatgaagc aggcgttcgt atgatcggcc cgaactgccc aggcgttatc actccgggtg 1560 aatgcaaaat cggtatccag cctggtcaca ttcacaaacc gggtaaagtg ggtatcgttt 1620 cccgttccgg tacactgacc tatgaagcgg ttaaacagac cacggattac ggtttcggtc 1680 agtcgacctg tgtcggtatc ggcggtgacc cgatcccggg ctctaacttt atcgacattc 1740 tcgaaatgtt cgaaaaagat ccgcagaccg aagcgatcgt gatgatcggt gagatcggcg 1800 gtagcgctga agaagaagca gctgcgtaca tcaaagagca cgttaccaag ccagttgtgg 1860 gttacatcgc tggtgtgact gcgccgaaag gcaaacgtat gggccacgcg ggtgccatca 1920 ttgccggtgg gaaagggact gcggatgaga aattcgctgc tctggaagcc gcaggcgtga 1980 aaaccgttcg cagcctggcg gatatcggtg aagcactgaa aactgttctg aaataa 2036 <210> 47 <211> 388 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 47 Met Asn Leu His Glu Tyr Gln Ala Lys Gln Leu Phe Ala Arg Tyr Gly 1 5 10 15 Leu Pro Ala Pro Val Gly Tyr Ala Cys Thr Thr Pro Arg Glu Ala Glu 20 25 30 Glu Ala Ala Ser Lys Ile Gly Ala Gly Pro Trp Val Val Lys Cys Gln 35 40 45 Val His Ala Gly Gly Arg Gly Lys Ala Gly Gly Val Lys Val Val Asn 50 55 60 Ser Lys Glu Asp Ile Arg Ala Phe Ala Glu Asn Trp Leu Gly Lys Arg 65 70 75 80 Leu Val Thr Tyr Gln Thr Asp Ala Asn Gly Gln Pro Val Asn Gln Ile 85 90 95 Leu Val Glu Ala Ala Thr Asp Ile Ala Lys Glu Leu Tyr Leu Gly Ala 100 105 110 Val Val Asp Arg Ser Ser Arg Arg Val Val Phe Met Ala Ser Thr Glu 115 120 125 Gly Gly Val Glu Ile Glu Lys Val Ala Glu Glu Thr Pro His Leu Ile 130 135 140 His Lys Val Ala Leu Asp Pro Leu Thr Gly Pro Met Pro Tyr Gln Gly 145 150 155 160 Arg Glu Leu Ala Phe Lys Leu Gly Leu Glu Gly Lys Leu Val Gln Gln 165 170 175 Phe Thr Lys Ile Phe Met Gly Leu Ala Thr Ile Phe Leu Glu Arg Asp 180 185 190 Leu Ala Leu Ile Glu Ile Asn Pro Leu Val Ile Thr Lys Gln Gly Asp 195 200 205 Leu Ile Cys Leu Asp Gly Lys Leu Gly Ala Asp Gly Asn Ala Leu Phe 210 215 220 Arg Gln Pro Asp Leu Arg Glu Met Arg Asp Gln Ser Gln Glu Asp Pro 225 230 235 240 Arg Glu Ala Gln Ala Ala Gln Trp Glu Leu Asn Tyr Val Ala Leu Asp 245 250 255 Gly Asn Ile Gly Cys Met Val Asn Gly Ala Gly Leu Ala Met Gly Thr 260 265 270 Met Asp Ile Val Lys Leu His Gly Gly Glu Pro Ala Asn Phe Leu Asp 275 280 285 Val Gly Gly Gly Ala Thr Lys Glu Arg Val Thr Glu Ala Phe Lys Ile 290 295 300 Ile Leu Ser Asp Asp Lys Val Lys Ala Val Leu Val Asn Ile Phe Gly 305 310 315 320 Gly Ile Val Arg Cys Asp Leu Ile Ala Asp Gly Ile Ile Gly Ala Val 325 330 335 Ala Glu Val Gly Val Asn Val Pro Val Val Val Arg Leu Glu Gly Asn 340 345 350 Asn Ala Glu Leu Gly Ala Lys Lys Leu Ala Asp Ser Gly Leu Asn Ile 355 360 365 Ile Ala Ala Lys Gly Leu Thr Asp Ala Ala Gln Gln Val Val Ala Ala 370 375 380 Val Glu Gly Lys 385 <210> 48 <211> 289 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 48 Met Ser Ile Leu Ile Asp Lys Asn Thr Lys Val Ile Cys Gln Gly Phe 1 5 10 15 Thr Gly Ser Gln Gly Thr Phe His Ser Glu Gln Ala Ile Ala Tyr Gly 20 25 30 Thr Lys Met Val Gly Gly Val Thr Pro Gly Lys Gly Gly Thr Thr His 35 40 45 Leu Gly Leu Pro Val Phe Asn Thr Val Arg Glu Ala Val Ala Ala Thr 50 55 60 Gly Ala Thr Ala Ser Val Ile Tyr Val Pro Ala Pro Phe Cys Lys Asp 65 70 75 80 Ser Ile Leu Glu Ala Ile Asp Ala Gly Ile Lys Leu Ile Ile Thr Ile 85 90 95 Thr Glu Gly Ile Pro Thr Leu Asp Met Leu Thr Val Lys Val Lys Leu 100 105 110 Asp Glu Ala Gly Val Arg Met Ile Gly Pro Asn Cys Pro Gly Val Ile 115 120 125 Thr Pro Gly Glu Cys Lys Ile Gly Ile Gln Pro Gly His Ile His Lys 130 135 140 Pro Gly Lys Val Gly Ile Val Ser Arg Ser Gly Thr Leu Thr Tyr Glu 145 150 155 160 Ala Val Lys Gln Thr Thr Asp Tyr Gly Phe Gly Gln Ser Thr Cys Val 165 170 175 Gly Ile Gly Gly Asp Pro Ile Pro Gly Ser Asn Phe Ile Asp Ile Leu 180 185 190 Glu Met Phe Glu Lys Asp Pro Gln Thr Glu Ala Ile Val Met Ile Gly 195 200 205 Glu Ile Gly Gly Ser Ala Glu Glu Glu Ala Ala Ala Tyr Ile Lys Glu 210 215 220 His Val Thr Lys Pro Val Val Gly Tyr Ile Ala Gly Val Thr Ala Pro 225 230 235 240 Lys Gly Lys Arg Met Gly His Ala Gly Ala Ile Ile Ala Gly Gly Lys 245 250 255 Gly Thr Ala Asp Glu Lys Phe Ala Ala Leu Glu Ala Ala Gly Val Lys 260 265 270 Thr Val Arg Ser Leu Ala Asp Ile Gly Glu Ala Leu Lys Thr Val Leu 275 280 285 Lys <210> 49 <211> 3696 <212> DNA <213> Mycobacterium bovis <400> 49 atggccaaca taagttcacc attcgggcaa aacgaatggc tggttgaaga gatgtaccgc 60 aagttccgcg acgacccctc ctcggtcgat cccagctggc acgagttcct ggttgactac 120 agccccgaac ccacctccca accagctgcc gaaccaaccc gggttacctc gccactcgtt 180 gccgagcggg ccgctgcggc cgccccgcag gcacccccca agccggccga caccgcggcc 240 gcgggcaacg gcgtggtcgc cgcactggcc gccaaaactg ccgttccccc gccagccgaa 300 ggtgacgagg tagcggtgct gcgcggcgcc gccgcggccg tcgtcaagaa catgtccgcg 360 tcgttggagg tgccgacggc gaccagcgtc cgggcggtcc cggccaagct actgatcgac 420 aaccggatcg tcatcaacaa ccagttgaag cggacccgcg gcggcaagat ctcgttcacg 480 catttgctgg gctacgccct ggtgcaggcg gtgaagaaat tcccgaacat gaaccggcac 540 tacaccgaag tcgacggcaa gcccaccgcg gtcacgccgg cgcacaccaa tctcggcctg 600 gcgatcgacc tgcaaggcaa ggacgggaag cgttccctgg tggtggccgg catcaagcgg 660 tgcgagacca tgcgattcgc gcagttcgtc acggcctacg aagacatcgt acgccgggcc 720 cgcgacggca agctgaccac tgaagacttt gccggcgtga cgatttcgct gaccaatccc 780 ggaaccatcg gcaccgtgca ttcggtgccg cggctgatgc ccggccaggg cgccatcatc 840 ggcgtgggcg ccatggaata ccccgccgag tttcaaggcg ccagcgagga acgcatcgcc 900 gagctgggca tcggcaaatt gatcactttg acctccacct acgaccaccg catcatccag 960 ggcgcggaat cgggcgactt cctgcgcacc atccacgagt tgctgctctc ggatggcttc 1020 tgggacgagg tcttccgcga actgagcatc ccatatctgc cggtgcgctg gagcaccgac 1080 aaccccgact cgatcgtcga caagaacgct cgcgtcatga acttgatcgc ggcctaccgc 1140 aaccgcggcc atctgatggc cgataccgac ccgctgcggt tggacaaagc tcggttccgc 1200 agtcaccccg acctcgaagt gctgacccac ggcctgacgc tgtgggatct cgatcgggtg 1260 ttcaaggtcg acggctttgc cggtgcgcag tacaagaaac tgcgcgacgt gctgggcttg 1320 ctgcgcgatg cctactgccg ccacatcggc gtggagtacg cccatatcct cgaccccgaa 1380 caaaaggagt ggctcgaaca acgggtcgag accaagcacg tcaaacccac tgtggcccaa 1440 cagaaataca tcctcagcaa gctcaacgcc gccgaggcct ttgaaacgtt cctacagacc 1500 aagtacgtcg gccagaagcg gttctcgctg gaaggcgccg aaagcgtgat cccgatgatg 1560 gacgcggcga tcgaccagtg cgctgagcac ggcctcgacg aggtggtcat cgggatgccg 1620 caccggggcc ggctcaacgt gctggccaac atcgtcggca agccgtactc gcagatcttc 1680 accgagttcg agggcaacct gaatccgtcg caggcgcacg gctccggtga cgtcaagtac 1740 cacctgggcg ccaccgggct gtacctgcag atgttcggcg acaacgacat tcaggtgtcg 1800 ctgaccgcca acccgtcgca tctggaggcc gtcgacccgg tgctggaggg attggtgcgg 1860 gccaagcagg atctgctcga ccacggaagc atcgacagcg acggccaacg ggcgttctcg 1920 gtggtgccgc tgatgttgca tggcgatgcc gcgttcgccg gtcagggtgt ggtcgccgag 1980 acgctgaacc tggcgaatct gccgggctac cgcgtcggcg gcaccatcca catcatcgtc 2040 aacaaccaga tcggcttcac caccgcgccc gagtattcca ggtccagcga gtactgcacc 2100 gacgtcgcaa agatgatcgg ggcaccgatc tttcacgtca acggcgacga cccggaggcg 2160 tgtgtctggg tggcgcggtt ggcggtggac ttccgacaac ggttcaagaa ggacgtcgtc 2220 atcgacatgc tgtgctaccg ccgccgcggg cacaacgagg gtgacgaccc gtcgatgacc 2280 aacccctaca tgtacgacgt cgtcgacacc aagcgcgggg cccgcaaaag ctacaccgaa 2340 gccctgatcg gacgtggcga catctcgatg aaggaggccg aggacgcgct gcgcgactac 2400 cagggccagc tggaacgggt gttcaacgaa gtgcgcgagc tggagaagca cggtgtgcag 2460 ccgagcgagt cggtcgagtc cgaccagatg attcccgcgg ggctggccac tgcggtggac 2520 aagtcgctgc tggcccggat cggcgatgcg ttcctcgcct tgccgaacgg cttcaccgcg 2580 cacccgcgag tccaaccggt gctggagaag cgccgggaga tggcctatga aggcaagatc 2640 gactgggcct ttggcgagct gctggcgctg ggctcgctgg tggccgaagg caagctggtg 2700 cgcttgtcgg ggcaggacag ccgccgcggc accttctccc agcggcattc ggttctcatc 2760 gaccgccaca ctggcgagga gttcacacca ctgcagctgc tggcgaccaa ctccgacggc 2820 agcccgaccg gcggaaagtt cctggtctac gactcgccac tgtcggagta cgccgccgtc 2880 ggcttcgagt acggctacac tgtgggcaat ccggacgccg tggtgctctg ggaggcgcag 2940 ttcggcgact tcgtcaacgg cgcacagtcg atcatcgacg agttcatcag ctccggtgag 3000 gccaagtggg gccaattgtc caacgtcgtg ctgctgttac cgcacgggca cgaggggcag 3060 ggacccgacc acacttctgc ccggatcgaa cgcttcttgc agttgtgggc ggaaggttcg 3120 atgaccatcg cgatgccgtc gactccgtcg aactacttcc acctgctacg ccggcatgcc 3180 ctggacggca tccaacgccc gctgatcgtg ttcacgccca agtcgatgtt gcgtcacaag 3240 gccgccgtca gcgaaatcaa ggacttcacc gagatcaagt tccgctcagt gctggaggaa 3300 cccacctatg aggacggcat cggagaccgc aacaaggtca gccggatcct gctgaccagt 3360 ggcaagctgt attacgagct ggccgcccgc aaggccaagg acaaccgcaa tgacctcgcg 3420 atcgtgcggc ttgaacagct cgccccgctg cccaggcgtc gactgcgtga aacgctggac 3480 cgctacgaga acgtcaagga gttcttctgg gtccaagagg aaccggccaa ccagggtgcg 3540 tggccgcgat tcgggctcga actacccgag ctgctgcctg acaagttggc cgggatcaag 3600 cgaatctcgc gccgggcgat gtcagccccg tcgtcaggct cgtcgaaggt gcacgccgtc 3660 gaacagcagg agatcctcga cgaggcgttc ggctaa 3696 <210> 50 <211> 1231 <212> PRT <213> Mycobacterium bovis <400> 50 Met Ala Asn Ile Ser Ser Pro Phe Gly Gln Asn Glu Trp Leu Val Glu 1 5 10 15 Glu Met Tyr Arg Lys Phe Arg Asp Asp Pro Ser Ser Val Asp Pro Ser 20 25 30 Trp His Glu Phe Leu Val Asp Tyr Ser Pro Glu Pro Thr Ser Gln Pro 35 40 45 Ala Ala Glu Pro Thr Arg Val Thr Ser Pro Leu Val Ala Glu Arg Ala 50 55 60 Ala Ala Ala Ala Pro Gln Ala Pro Pro Lys Pro Ala Asp Thr Ala Ala 65 70 75 80 Ala Gly Asn Gly Val Val Ala Ala Leu Ala Ala Lys Thr Ala Val Pro 85 90 95 Pro Pro Ala Glu Gly Asp Glu Val Ala Val Leu Arg Gly Ala Ala Ala 100 105 110 Ala Val Val Lys Asn Met Ser Ala Ser Leu Glu Val Pro Thr Ala Thr 115 120 125 Ser Val Arg Ala Val Pro Ala Lys Leu Leu Ile Asp Asn Arg Ile Val 130 135 140 Ile Asn Asn Gln Leu Lys Arg Thr Arg Gly Gly Lys Ile Ser Phe Thr 145 150 155 160 His Leu Leu Gly Tyr Ala Leu Val Gln Ala Val Lys Lys Phe Pro Asn 165 170 175 Met Asn Arg His Tyr Thr Glu Val Asp Gly Lys Pro Thr Ala Val Thr 180 185 190 Pro Ala His Thr Asn Leu Gly Leu Ala Ile Asp Leu Gln Gly Lys Asp 195 200 205 Gly Lys Arg Ser Leu Val Val Ala Gly Ile Lys Arg Cys Glu Thr Met 210 215 220 Arg Phe Ala Gln Phe Val Thr Ala Tyr Glu Asp Ile Val Arg Arg Ala 225 230 235 240 Arg Asp Gly Lys Leu Thr Thr Glu Asp Phe Ala Gly Val Thr Ile Ser 245 250 255 Leu Thr Asn Pro Gly Thr Ile Gly Thr Val His Ser Val Pro Arg Leu 260 265 270 Met Pro Gly Gln Gly Ala Ile Ile Gly Val Gly Ala Met Glu Tyr Pro 275 280 285 Ala Glu Phe Gln Gly Ala Ser Glu Glu Arg Ile Ala Glu Leu Gly Ile 290 295 300 Gly Lys Leu Ile Thr Leu Thr Ser Thr Tyr Asp His Arg Ile Ile Gln 305 310 315 320 Gly Ala Glu Ser Gly Asp Phe Leu Arg Thr Ile His Glu Leu Leu Leu 325 330 335 Ser Asp Gly Phe Trp Asp Glu Val Phe Arg Glu Leu Ser Ile Pro Tyr 340 345 350 Leu Pro Val Arg Trp Ser Thr Asp Asn Pro Asp Ser Ile Val Asp Lys 355 360 365 Asn Ala Arg Val Met Asn Leu Ile Ala Ala Tyr Arg Asn Arg Gly His 370 375 380 Leu Met Ala Asp Thr Asp Pro Leu Arg Leu Asp Lys Ala Arg Phe Arg 385 390 395 400 Ser His Pro Asp Leu Glu Val Leu Thr His Gly Leu Thr Leu Trp Asp 405 410 415 Leu Asp Arg Val Phe Lys Val Asp Gly Phe Ala Gly Ala Gln Tyr Lys 420 425 430 Lys Leu Arg Asp Val Leu Gly Leu Leu Arg Asp Ala Tyr Cys Arg His 435 440 445 Ile Gly Val Glu Tyr Ala His Ile Leu Asp Pro Glu Gln Lys Glu Trp 450 455 460 Leu Glu Gln Arg Val Glu Thr Lys His Val Lys Pro Thr Val Ala Gln 465 470 475 480 Gln Lys Tyr Ile Leu Ser Lys Leu Asn Ala Ala Glu Ala Phe Glu Thr 485 490 495 Phe Leu Gln Thr Lys Tyr Val Gly Gln Lys Arg Phe Ser Leu Glu Gly 500 505 510 Ala Glu Ser Val Ile Pro Met Met Asp Ala Ala Ile Asp Gln Cys Ala 515 520 525 Glu His Gly Leu Asp Glu Val Val Ile Gly Met Pro His Arg Gly Arg 530 535 540 Leu Asn Val Leu Ala Asn Ile Val Gly Lys Pro Tyr Ser Gln Ile Phe 545 550 555 560 Thr Glu Phe Glu Gly Asn Leu Asn Pro Ser Gln Ala His Gly Ser Gly 565 570 575 Asp Val Lys Tyr His Leu Gly Ala Thr Gly Leu Tyr Leu Gln Met Phe 580 585 590 Gly Asp Asn Asp Ile Gln Val Ser Leu Thr Ala Asn Pro Ser His Leu 595 600 605 Glu Ala Val Asp Pro Val Leu Glu Gly Leu Val Arg Ala Lys Gln Asp 610 615 620 Leu Leu Asp His Gly Ser Ile Asp Ser Asp Gly Gln Arg Ala Phe Ser 625 630 635 640 Val Val Pro Leu Met Leu His Gly Asp Ala Ala Phe Ala Gly Gln Gly 645 650 655 Val Val Ala Glu Thr Leu Asn Leu Ala Asn Leu Pro Gly Tyr Arg Val 660 665 670 Gly Gly Thr Ile His Ile Ile Val Asn Asn Gln Ile Gly Phe Thr Thr 675 680 685 Ala Pro Glu Tyr Ser Arg Ser Ser Glu Tyr Cys Thr Asp Val Ala Lys 690 695 700 Met Ile Gly Ala Pro Ile Phe His Val Asn Gly Asp Asp Pro Glu Ala 705 710 715 720 Cys Val Trp Val Ala Arg Leu Ala Val Asp Phe Arg Gln Arg Phe Lys 725 730 735 Lys Asp Val Val Ile Asp Met Leu Cys Tyr Arg Arg Arg Gly His Asn 740 745 750 Glu Gly Asp Asp Pro Ser Met Thr Asn Pro Tyr Met Tyr Asp Val Val 755 760 765 Asp Thr Lys Arg Gly Ala Arg Lys Ser Tyr Thr Glu Ala Leu Ile Gly 770 775 780 Arg Gly Asp Ile Ser Met Lys Glu Ala Glu Asp Ala Leu Arg Asp Tyr 785 790 795 800 Gln Gly Gln Leu Glu Arg Val Phe Asn Glu Val Arg Glu Leu Glu Lys 805 810 815 His Gly Val Gln Pro Ser Glu Ser Val Glu Ser Asp Gln Met Ile Pro 820 825 830 Ala Gly Leu Ala Thr Ala Val Asp Lys Ser Leu Leu Ala Arg Ile Gly 835 840 845 Asp Ala Phe Leu Ala Leu Pro Asn Gly Phe Thr Ala His Pro Arg Val 850 855 860 Gln Pro Val Leu Glu Lys Arg Arg Glu Met Ala Tyr Glu Gly Lys Ile 865 870 875 880 Asp Trp Ala Phe Gly Glu Leu Leu Ala Leu Gly Ser Leu Val Ala Glu 885 890 895 Gly Lys Leu Val Arg Leu Ser Gly Gln Asp Ser Arg Arg Gly Thr Phe 900 905 910 Ser Gln Arg His Ser Val Leu Ile Asp Arg His Thr Gly Glu Glu Phe 915 920 925 Thr Pro Leu Gln Leu Leu Ala Thr Asn Ser Asp Gly Ser Pro Thr Gly 930 935 940 Gly Lys Phe Leu Val Tyr Asp Ser Pro Leu Ser Glu Tyr Ala Ala Val 945 950 955 960 Gly Phe Glu Tyr Gly Tyr Thr Val Gly Asn Pro Asp Ala Val Val Leu 965 970 975 Trp Glu Ala Gln Phe Gly Asp Phe Val Asn Gly Ala Gln Ser Ile Ile 980 985 990 Asp Glu Phe Ile Ser Ser Gly Glu Ala Lys Trp Gly Gln Leu Ser Asn 995 1000 1005 Val Val Leu Leu Leu Pro His Gly His Glu Gly Gln Gly Pro Asp 1010 1015 1020 His Thr Ser Ala Arg Ile Glu Arg Phe Leu Gln Leu Trp Ala Glu 1025 1030 1035 Gly Ser Met Thr Ile Ala Met Pro Ser Thr Pro Ser Asn Tyr Phe 1040 1045 1050 His Leu Leu Arg Arg His Ala Leu Asp Gly Ile Gln Arg Pro Leu 1055 1060 1065 Ile Val Phe Thr Pro Lys Ser Met Leu Arg His Lys Ala Ala Val 1070 1075 1080 Ser Glu Ile Lys Asp Phe Thr Glu Ile Lys Phe Arg Ser Val Leu 1085 1090 1095 Glu Glu Pro Thr Tyr Glu Asp Gly Ile Gly Asp Arg Asn Lys Val 1100 1105 1110 Ser Arg Ile Leu Leu Thr Ser Gly Lys Leu Tyr Tyr Glu Leu Ala 1115 1120 1125 Ala Arg Lys Ala Lys Asp Asn Arg Asn Asp Leu Ala Ile Val Arg 1130 1135 1140 Leu Glu Gln Leu Ala Pro Leu Pro Arg Arg Arg Leu Arg Glu Thr 1145 1150 1155 Leu Asp Arg Tyr Glu Asn Val Lys Glu Phe Phe Trp Val Gln Glu 1160 1165 1170 Glu Pro Ala Asn Gln Gly Ala Trp Pro Arg Phe Gly Leu Glu Leu 1175 1180 1185 Pro Glu Leu Leu Pro Asp Lys Leu Ala Gly Ile Lys Arg Ile Ser 1190 1195 1200 Arg Arg Ala Met Ser Ala Pro Ser Ser Gly Ser Ser Lys Val His 1205 1210 1215 Ala Val Glu Gln Gln Glu Ile Leu Asp Glu Ala Phe Gly 1220 1225 1230 <210> 51 <211> 1356 <212> DNA <213> Porphyromonas gingivalis <400> 51 atggaaatca aagaaatggt gagccttgca cgcaaggctc agaaggagta tcaagctacc 60 cataaccaag aagcagttga caacatttgc cgagctgcag caaaagttat ttatgaaaat 120 gcagctattc tggctcgcga agcagtagac gaaaccggca tgggcgttta cgaacacaaa 180 gtggccaaga atcaaggcaa atccaaaggt gtttggtaca acctccacaa taaaaaatcg 240 attggtatcc tcaatataga cgagcgtacc ggtatgatcg agattgcaaa gcctatcgga 300 gttgtaggag ccgtaacgcc gacgaccaac ccgatcgtta ctccgatgag caatatcatc 360 tttgctctta agacctgcaa tgccatcatt attgcccccc accccagatc caaaaaatgc 420 tctgcacacg cagttcgtct gatcaaagaa gctatcgctc cgttcaacgt accggaaggt 480 atggttcaga tcatcgaaga acccagcatc gagaagacgc aggaactcat gggcgccgta 540 gacgtagtag ttgctacggg tggtatgggc atggtgaagt ctgcatattc ttcaggaaag 600 ccttctttcg gtgttggagc cggtaacgtt caggtgatcg tggatagcaa catcgatttc 660 gaagctgctg cagaaaaaat catcaccggt cgtgctttcg acaacggtat catctgctca 720 ggcgaacaga gcatcatcta caacgaggct gacaaggaag cagttttcac agcattccgc 780 aaccacggtg catatttctg tgacgaagcc gaaggagatc gggctcgtgc agctatcttc 840 gaaaatggag ccatcgcgaa agatgtagta ggtcagagcg ttgccttcat tgccaagaaa 900 gcaaacatca atatccccga gggtacccgt attctcgttg ttgaagctcg cggcgtagga 960 gcagaagacg ttatctgtaa ggaaaagatg tgtcccgtaa tgtgcgccct cagctacaag 1020 cacttcgaag aaggtgtaga aatcgcacgt acgaacctcg ccaacgaagg taacggccac 1080 acctgtgcta tccactccaa caatcaggca cacatcatcc tcgcaggatc agagctgacg 1140 gtatctcgta tcgtagtgaa tgctccgagt gccactacag caggcggtca catccaaaac 1200 ggtcttgccg taaccaatac gctcggatgc ggatcatggg gtaataactc tatctccgag 1260 aacttcactt acaagcacct cctcaacatt tcacgcatcg caccgttgaa ttcaagcatt 1320 cacatccccg atgacaaaga aatctgggaa ctctaa 1356 <210> 52 <211> 451 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 52 Met Glu Ile Lys Glu Met Val Ser Leu Ala Arg Lys Ala Gln Lys Glu 1 5 10 15 Tyr Gln Ala Thr His Asn Gln Glu Ala Val Asp Asn Ile Cys Arg Ala 20 25 30 Ala Ala Lys Val Ile Tyr Glu Asn Ala Ala Ile Leu Ala Arg Glu Ala 35 40 45 Val Asp Glu Thr Gly Met Gly Val Tyr Glu His Lys Val Ala Lys Asn 50 55 60 Gln Gly Lys Ser Lys Gly Val Trp Tyr Asn Leu His Asn Lys Lys Ser 65 70 75 80 Ile Gly Ile Leu Asn Ile Asp Glu Arg Thr Gly Met Ile Glu Ile Ala 85 90 95 Lys Pro Ile Gly Val Val Gly Ala Val Thr Pro Thr Thr Asn Pro Ile 100 105 110 Val Thr Pro Met Ser Asn Ile Ile Phe Ala Leu Lys Thr Cys Asn Ala 115 120 125 Ile Ile Ile Ala Pro His Pro Arg Ser Lys Lys Cys Ser Ala His Ala 130 135 140 Val Arg Leu Ile Lys Glu Ala Ile Ala Pro Phe Asn Val Pro Glu Gly 145 150 155 160 Met Val Gln Ile Ile Glu Glu Pro Ser Ile Glu Lys Thr Gln Glu Leu 165 170 175 Met Gly Ala Val Asp Val Val Val Ala Thr Gly Gly Met Gly Met Val 180 185 190 Lys Ser Ala Tyr Ser Ser Gly Lys Pro Ser Phe Gly Val Gly Ala Gly 195 200 205 Asn Val Gln Val Ile Val Asp Ser Asn Ile Asp Phe Glu Ala Ala Ala 210 215 220 Glu Lys Ile Ile Thr Gly Arg Ala Phe Asp Asn Gly Ile Ile Cys Ser 225 230 235 240 Gly Glu Gln Ser Ile Ile Tyr Asn Glu Ala Asp Lys Glu Ala Val Phe 245 250 255 Thr Ala Phe Arg Asn His Gly Ala Tyr Phe Cys Asp Glu Ala Glu Gly 260 265 270 Asp Arg Ala Arg Ala Ala Ile Phe Glu Asn Gly Ala Ile Ala Lys Asp 275 280 285 Val Val Gly Gln Ser Val Ala Phe Ile Ala Lys Lys Ala Asn Ile Asn 290 295 300 Ile Pro Glu Gly Thr Arg Ile Leu Val Val Glu Ala Arg Gly Val Gly 305 310 315 320 Ala Glu Asp Val Ile Cys Lys Glu Lys Met Cys Pro Val Met Cys Ala 325 330 335 Leu Ser Tyr Lys His Phe Glu Glu Gly Val Glu Ile Ala Arg Thr Asn 340 345 350 Leu Ala Asn Glu Gly Asn Gly His Thr Cys Ala Ile His Ser Asn Asn 355 360 365 Gln Ala His Ile Ile Leu Ala Gly Ser Glu Leu Thr Val Ser Arg Ile 370 375 380 Val Val Asn Ala Pro Ser Ala Thr Thr Ala Gly Gly His Ile Gln Asn 385 390 395 400 Gly Leu Ala Val Thr Asn Thr Leu Gly Cys Gly Ser Trp Gly Asn Asn 405 410 415 Ser Ile Ser Glu Asn Phe Thr Tyr Lys His Leu Leu Asn Ile Ser Arg 420 425 430 Ile Ala Pro Leu Asn Ser Ser Ile His Ile Pro Asp Asp Lys Glu Ile 435 440 445 Trp Glu Leu 450 <210> 53 <211> 1116 <212> DNA <213> Porphyromonas gingivalis <400> 53 atgcaacttt tcaaactcaa gagtgtaaca catcactttg acacttttgc agaatttgcc 60 aaggaattct gtcttggaga acgcgacttg gtaattacca acgagttcat ctatgaaccg 120 tatatgaagg catgccagct cccctgccat tttgttatgc aggagaaata tgggcaaggc 180 gagccttctg acgaaatgat gaataacatc ttggcagaca tccgtaatat ccagttcgac 240 cgcgtaatcg gtatcggagg aggtacggtt attgacatct ctaaactttt cgttctgaaa 300 ggattaaatg atgtactcga tgcattcgac cgcaaaatac ctcttatcaa agagaaagaa 360 ctgatcattg tgcccacaac atgcggaacg ggtagcgagg tgacgaacat ttctatcgca 420 gaaatcaaaa gccgtcacac caaaatggga ttggctgacg atgccattgt tgcagaccat 480 gccatcatca tacctgaact tctgaagagc ttgcctttcc acttctacgc atgcagtgca 540 atcgatgctc ttatccatgc catcgagtca tacgtatctc ctaaagccag tccatattct 600 cgtctgttca gtgaggcggc ttgggacatt atcctggaag tattcaagaa aatcgccgaa 660 cacggccctg aataccgctt cgaaaagctg ggagaaatga tcatggccag caactatgcc 720 ggtatagcct tcggaaatgc aggagtagga gccgtccacg cactatccta cccgttggga 780 ggcaactatc acgtgccgca tggagaagca aactatcagt tcttcacaga ggtattcaaa 840 gtataccaaa agaagaatcc tttcggctat atagtcgaac tcaactggaa gctctccaag 900 atactgaact gccagcccga atacgtatat ccgaagctgg atgaacttct cggatgcctt 960 cttaccaaga aacctttgca cgaatacggc atgaaggacg aagaggtaag aggctttgcg 1020 gaatcagtgc ttaagacaca gcaaagattg ctcgccaaca actacgtaga gcttactgta 1080 gatgagatcg aaggtatcta cagaagactc tactaa 1116 <210> 54 <211> 371 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 54 Met Gln Leu Phe Lys Leu Lys Ser Val Thr His His Phe Asp Thr Phe 1 5 10 15 Ala Glu Phe Ala Lys Glu Phe Cys Leu Gly Glu Arg Asp Leu Val Ile 20 25 30 Thr Asn Glu Phe Ile Tyr Glu Pro Tyr Met Lys Ala Cys Gln Leu Pro 35 40 45 Cys His Phe Val Met Gln Glu Lys Tyr Gly Gln Gly Glu Pro Ser Asp 50 55 60 Glu Met Met Asn Asn Ile Leu Ala Asp Ile Arg Asn Ile Gln Phe Asp 65 70 75 80 Arg Val Ile Gly Ile Gly Gly Gly Thr Val Ile Asp Ile Ser Lys Leu 85 90 95 Phe Val Leu Lys Gly Leu Asn Asp Val Leu Asp Ala Phe Asp Arg Lys 100 105 110 Ile Pro Leu Ile Lys Glu Lys Glu Leu Ile Ile Val Pro Thr Thr Cys 115 120 125 Gly Thr Gly Ser Glu Val Thr Asn Ile Ser Ile Ala Glu Ile Lys Ser 130 135 140 Arg His Thr Lys Met Gly Leu Ala Asp Asp Ala Ile Val Ala Asp His 145 150 155 160 Ala Ile Ile Ile Pro Glu Leu Leu Lys Ser Leu Pro Phe His Phe Tyr 165 170 175 Ala Cys Ser Ala Ile Asp Ala Leu Ile His Ala Ile Glu Ser Tyr Val 180 185 190 Ser Pro Lys Ala Ser Pro Tyr Ser Arg Leu Phe Ser Glu Ala Ala Trp 195 200 205 Asp Ile Ile Leu Glu Val Phe Lys Lys Ile Ala Glu His Gly Pro Glu 210 215 220 Tyr Arg Phe Glu Lys Leu Gly Glu Met Ile Met Ala Ser Asn Tyr Ala 225 230 235 240 Gly Ile Ala Phe Gly Asn Ala Gly Val Gly Ala Val His Ala Leu Ser 245 250 255 Tyr Pro Leu Gly Gly Asn Tyr His Val Pro His Gly Glu Ala Asn Tyr 260 265 270 Gln Phe Phe Thr Glu Val Phe Lys Val Tyr Gln Lys Lys Asn Pro Phe 275 280 285 Gly Tyr Ile Val Glu Leu Asn Trp Lys Leu Ser Lys Ile Leu Asn Cys 290 295 300 Gln Pro Glu Tyr Val Tyr Pro Lys Leu Asp Glu Leu Leu Gly Cys Leu 305 310 315 320 Leu Thr Lys Lys Pro Leu His Glu Tyr Gly Met Lys Asp Glu Glu Val 325 330 335 Arg Gly Phe Ala Glu Ser Val Leu Lys Thr Gln Gln Arg Leu Leu Ala 340 345 350 Asn Asn Tyr Val Glu Leu Thr Val Asp Glu Ile Glu Gly Ile Tyr Arg 355 360 365 Arg Leu Tyr 370 <210> 55 <211> 1296 <212> DNA <213> Porphyromonas gingivalis <400> 55 atgaaagacg tattagcgga atatgcctcc cgaattgttt cggccgaaga agccgtaaaa 60 catatcaaaa atggagaacg ggtagctttg tcacatgctg ccggagttcc tcagagttgt 120 gttgatgcac tggtacaaca ggccgacctt ttccagaatg tcgaaattta tcacatgctt 180 tgtctcggcg aaggaaaata tatggcacct gaaatggccc ctcacttccg acacataacc 240 aattttgtag gtggtaattc tcgtaaagca gttgaggaaa atagagccga cttcattccg 300 gtattctttt atgaagtgcc atcaatgatt cgcaaagaca tccttcacat agatgtcgcc 360 atcgttcagc tttcaatgcc tgatgagaat ggttactgta gttttggagt atcttgcgat 420 tatagcaaac cggcagcaga aagcgctcat ttagttatag gggaaatcaa ccgtcaaatg 480 ccatatgtac atggcgacaa cttgattcac atatcgaagt tggattacat cgtgatggca 540 gactacccta tctattctct tgcaaagccc aaaatcggag aagtagaaga agctatcggg 600 cgtaattgtg ccgagcttat tgaagatggt gccacactcc aactcggtat cggcgcgatt 660 cctgatgcag ccctgttatt cctcaaggac aaaaaagatc tggggatcca taccgagatg 720 ttctccgatg gtgttgtcga attagttcgc agtggagtaa ttacaggaaa gaaaaagaca 780 cttcaccccg gaaagatggt cgcaaccttc ttaatgggaa gcgaagacgt atatcatttc 840 atcgacaaaa atcccgatgt agaactttat ccggtagatt acgtcaatga tccgcgagta 900 atcgctcaaa atgataatat ggtcagcatc aatagctgta tcgaaatcga tcttatggga 960 caagtcgtgt ccgaatgtat aggaagcaag caattcagcg gaaccggcgg tcaagtagat 1020 tatgttcgtg gagcagcatg gtctaaaaac ggcaaaagca tcatggcaat tccctcaaca 1080 gccaaaaacg gtactgcatc tcgaattgta cctataattg cagagggagc tgctgtaaca 1140 accctccgca acgaagtcga ttacgttgta accgaatacg gtatagcaca actcaaagga 1200 aagagtttgc gccagcgagc agaagctctt attgccatag cccacccgga tttcagagag 1260 gaactaacga aacatctccg caaacgtttc ggataa 1296 <210> 56 <211> 431 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 56 Met Lys Asp Val Leu Ala Glu Tyr Ala Ser Arg Ile Val Ser Ala Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Lys His Ile Lys Asn Gly Glu Arg Val Ala Leu Ser His 20 25 30 Ala Ala Gly Val Pro Gln Ser Cys Val Asp Ala Leu Val Gln Gln Ala 35 40 45 Asp Leu Phe Gln Asn Val Glu Ile Tyr His Met Leu Cys Leu Gly Glu 50 55 60 Gly Lys Tyr Met Ala Pro Glu Met Ala Pro His Phe Arg His Ile Thr 65 70 75 80 Asn Phe Val Gly Gly Asn Ser Arg Lys Ala Val Glu Glu Asn Arg Ala 85 90 95 Asp Phe Ile Pro Val Phe Phe Tyr Glu Val Pro Ser Met Ile Arg Lys 100 105 110 Asp Ile Leu His Ile Asp Val Ala Ile Val Gln Leu Ser Met Pro Asp 115 120 125 Glu Asn Gly Tyr Cys Ser Phe Gly Val Ser Cys Asp Tyr Ser Lys Pro 130 135 140 Ala Ala Glu Ser Ala His Leu Val Ile Gly Glu Ile Asn Arg Gln Met 145 150 155 160 Pro Tyr Val His Gly Asp Asn Leu Ile His Ile Ser Lys Leu Asp Tyr 165 170 175 Ile Val Met Ala Asp Tyr Pro Ile Tyr Ser Leu Ala Lys Pro Lys Ile 180 185 190 Gly Glu Val Glu Glu Ala Ile Gly Arg Asn Cys Ala Glu Leu Ile Glu 195 200 205 Asp Gly Ala Thr Leu Gln Leu Gly Ile Gly Ala Ile Pro Asp Ala Ala 210 215 220 Leu Leu Phe Leu Lys Asp Lys Lys Asp Leu Gly Ile His Thr Glu Met 225 230 235 240 Phe Ser Asp Gly Val Val Glu Leu Val Arg Ser Gly Val Ile Thr Gly 245 250 255 Lys Lys Lys Thr Leu His Pro Gly Lys Met Val Ala Thr Phe Leu Met 260 265 270 Gly Ser Glu Asp Val Tyr His Phe Ile Asp Lys Asn Pro Asp Val Glu 275 280 285 Leu Tyr Pro Val Asp Tyr Val Asn Asp Pro Arg Val Ile Ala Gln Asn 290 295 300 Asp Asn Met Val Ser Ile Asn Ser Cys Ile Glu Ile Asp Leu Met Gly 305 310 315 320 Gln Val Val Ser Glu Cys Ile Gly Ser Lys Gln Phe Ser Gly Thr Gly 325 330 335 Gly Gln Val Asp Tyr Val Arg Gly Ala Ala Trp Ser Lys Asn Gly Lys 340 345 350 Ser Ile Met Ala Ile Pro Ser Thr Ala Lys Asn Gly Thr Ala Ser Arg 355 360 365 Ile Val Pro Ile Ile Ala Glu Gly Ala Ala Val Thr Thr Leu Arg Asn 370 375 380 Glu Val Asp Tyr Val Val Thr Glu Tyr Gly Ile Ala Gln Leu Lys Gly 385 390 395 400 Lys Ser Leu Arg Gln Arg Ala Glu Ala Leu Ile Ala Ile Ala His Pro 405 410 415 Asp Phe Arg Glu Glu Leu Thr Lys His Leu Arg Lys Arg Phe Gly 420 425 430 <210> 57 <211> 906 <212> DNA <213> Clostridium acetobutylicum <400> 57 atgattaaga gttttaatga aattatcatg aaggtaaaga gcaaagaaat gaaaaaagtt 60 gctgttgctg tagcacaaga cgagccagta cttgaagcag taagagatgc taagaaaaat 120 ggtattgcag atgctattct tgttggagac catgacgaaa tcgtgtcaat cgcgcttaaa 180 ataggaatgg atgtaaatga ttttgaaata gtaaacgagc ctaacgttaa gaaagctgct 240 ttaaaggcag tagagcttgt atcaactgga aaagctgata tggtaatgaa gggacttgta 300 aatacagcaa ctttcttaag atctgtatta aacaaagaag ttggacttag aacaggaaaa 360 actatgtctc acgttgcagt atttgaaact gagaaatttg atagactatt atttttaaca 420 gatgttgctt tcaatactta tcctgaatta aaggaaaaaa ttgatatagt aaacaattca 480 gttaaggttg cacatgcaat aggaattgaa aatccaaagg ttgctccaat ttgtgcagtt 540 gaggttataa accctaaaat gccatcaaca cttgatgcag caatgctttc aaaaatgagt 600 gacagaggac aaattaaagg ttgtgtagtt gacggacctt tagcacttga tatagcttta 660 tcagaagaag cagcacatca taagggagta acaggagaag ttgctggaaa agctgatatc 720 ttcttaatgc caaacataga aacaggaaat gtaatgtata agactttaac atatacaact 780 gattcaaaaa atggaggaat cttagttgga acttctgcac cagttgtttt aacttcaaga 840 gctgacagcc atgaaacaaa aatgaactct atagcacttg cagctttagt tgcaggcaat 900 aaataa 906 <210> 58 <211> 301 <212> PRT <213> Clostridium acetobutylicum <400> 58 Met Ile Lys Ser Phe Asn Glu Ile Ile Met Lys Val Lys Ser Lys Glu 1 5 10 15 Met Lys Lys Val Ala Val Ala Val Ala Gln Asp Glu Pro Val Leu Glu 20 25 30 Ala Val Arg Asp Ala Lys Lys Asn Gly Ile Ala Asp Ala Ile Leu Val 35 40 45 Gly Asp His Asp Glu Ile Val Ser Ile Ala Leu Lys Ile Gly Met Asp 50 55 60 Val Asn Asp Phe Glu Ile Val Asn Glu Pro Asn Val Lys Lys Ala Ala 65 70 75 80 Leu Lys Ala Val Glu Leu Val Ser Thr Gly Lys Ala Asp Met Val Met 85 90 95 Lys Gly Leu Val Asn Thr Ala Thr Phe Leu Arg Ser Val Leu Asn Lys 100 105 110 Glu Val Gly Leu Arg Thr Gly Lys Thr Met Ser His Val Ala Val Phe 115 120 125 Glu Thr Glu Lys Phe Asp Arg Leu Leu Phe Leu Thr Asp Val Ala Phe 130 135 140 Asn Thr Tyr Pro Glu Leu Lys Glu Lys Ile Asp Ile Val Asn Asn Ser 145 150 155 160 Val Lys Val Ala His Ala Ile Gly Ile Glu Asn Pro Lys Val Ala Pro 165 170 175 Ile Cys Ala Val Glu Val Ile Asn Pro Lys Met Pro Ser Thr Leu Asp 180 185 190 Ala Ala Met Leu Ser Lys Met Ser Asp Arg Gly Gln Ile Lys Gly Cys 195 200 205 Val Val Asp Gly Pro Leu Ala Leu Asp Ile Ala Leu Ser Glu Glu Ala 210 215 220 Ala His His Lys Gly Val Thr Gly Glu Val Ala Gly Lys Ala Asp Ile 225 230 235 240 Phe Leu Met Pro Asn Ile Glu Thr Gly Asn Val Met Tyr Lys Thr Leu 245 250 255 Thr Tyr Thr Thr Asp Ser Lys Asn Gly Gly Ile Leu Val Gly Thr Ser 260 265 270 Ala Pro Val Val Leu Thr Ser Arg Ala Asp Ser His Glu Thr Lys Met 275 280 285 Asn Ser Ile Ala Leu Ala Ala Leu Val Ala Gly Asn Lys 290 295 300 <210> 59 <211> 1068 <212> DNA <213> Clostridium acetobutylicum <400> 59 atgtatagat tactaataat caatcctggc tcgacctcaa ctaaaattgg tatttatgac 60 gatgaaaaag agatatttga gaagacttta agacattcag ctgaagagat agaaaaatat 120 aacactatat ttgatcaatt tcaattcaga aagaatgtaa ttttagatgc gttaaaagaa 180 gcaaacatag aagtaagttc tttaaatgct gtagttggaa gaggcggact cttaaagcca 240 atagtaagtg gaacttatgc agtaaatcaa aaaatgcttg aagaccttaa agtaggagtt 300 caaggtcagc atgcgtcaaa tcttggtgga attattgcaa atgaaatagc aaaagaaata 360 aatgttccag catacatagt tgatccagtt gttgtggatg agcttgatga agtttcaaga 420 atatcaggaa tggctgacat tccaagaaaa agtatattcc atgcattaaa tcaaaaagca 480 gttgctagaa gatatgcaaa agaagttgga aaaaaatacg aagatcttaa tttaatcgta 540 gtccacatgg gtggaggtac ttcagtaggt actcataaag atggtagagt aatagaagtt 600 aataatacac ttgatggaga aggtccattc tcaccagaaa gaagtggtgg agttccaata 660 ggagatcttg taagattgtg cttcagcaac aaatatactt atgaagaagt aatgaaaaag 720 ataaacggca aaggcggagt tgttagttac ttaaatacta tcgattttaa ggctgtagtt 780 gataaagctc ttgaaggaga taagaaatgt gcacttatat atgaagcttt cacattccag 840 gtagcaaaag agataggaaa atgttcaacc gttttaaaag gaaatgtaga tgcaataatc 900 ttaacaggcg gaattgcgta caacgagcat gtatgtaatg ccatagagga tagagtaaaa 960 ttcatagcac ctgtagttag atatggtgga gaagatgaac ttcttgcact tgcagaaggt 1020 ggacttagag ttttaagagg agaagaaaaa gctaaggaat acaaataa 1068 <210> 60 <211> 355 <212> PRT <213> Clostridium acetobutylicum <400> 60 Met Tyr Arg Leu Leu Ile Ile Asn Pro Gly Ser Thr Ser Thr Lys Ile 1 5 10 15 Gly Ile Tyr Asp Asp Glu Lys Glu Ile Phe Glu Lys Thr Leu Arg His 20 25 30 Ser Ala Glu Glu Ile Glu Lys Tyr Asn Thr Ile Phe Asp Gln Phe Gln 35 40 45 Phe Arg Lys Asn Val Ile Leu Asp Ala Leu Lys Glu Ala Asn Ile Glu 50 55 60 Val Ser Ser Leu Asn Ala Val Val Gly Arg Gly Gly Leu Leu Lys Pro 65 70 75 80 Ile Val Ser Gly Thr Tyr Ala Val Asn Gln Lys Met Leu Glu Asp Leu 85 90 95 Lys Val Gly Val Gln Gly Gln His Ala Ser Asn Leu Gly Gly Ile Ile 100 105 110 Ala Asn Glu Ile Ala Lys Glu Ile Asn Val Pro Ala Tyr Ile Val Asp 115 120 125 Pro Val Val Val Asp Glu Leu Asp Glu Val Ser Arg Ile Ser Gly Met 130 135 140 Ala Asp Ile Pro Arg Lys Ser Ile Phe His Ala Leu Asn Gln Lys Ala 145 150 155 160 Val Ala Arg Arg Tyr Ala Lys Glu Val Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Leu 165 170 175 Asn Leu Ile Val Val His Met Gly Gly Gly Thr Ser Val Gly Thr His 180 185 190 Lys Asp Gly Arg Val Ile Glu Val Asn Asn Thr Leu Asp Gly Glu Gly 195 200 205 Pro Phe Ser Pro Glu Arg Ser Gly Gly Val Pro Ile Gly Asp Leu Val 210 215 220 Arg Leu Cys Phe Ser Asn Lys Tyr Thr Tyr Glu Glu Val Met Lys Lys 225 230 235 240 Ile Asn Gly Lys Gly Gly Val Val Ser Tyr Leu Asn Thr Ile Asp Phe 245 250 255 Lys Ala Val Val Asp Lys Ala Leu Glu Gly Asp Lys Lys Cys Ala Leu 260 265 270 Ile Tyr Glu Ala Phe Thr Phe Gln Val Ala Lys Glu Ile Gly Lys Cys 275 280 285 Ser Thr Val Leu Lys Gly Asn Val Asp Ala Ile Ile Leu Thr Gly Gly 290 295 300 Ile Ala Tyr Asn Glu His Val Cys Asn Ala Ile Glu Asp Arg Val Lys 305 310 315 320 Phe Ile Ala Pro Val Val Arg Tyr Gly Gly Glu Asp Glu Leu Leu Ala 325 330 335 Leu Ala Glu Gly Gly Leu Arg Val Leu Arg Gly Glu Glu Lys Ala Lys 340 345 350 Glu Tyr Lys 355 <210> 61 <211> 906 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 61 atgattaaga gttttaatga aattatcatg aaggtaaaga gcaaagaaat gaaaaaagtt 60 gctgttgctg tagcacaaga cgagccagta cttgaagcag tacgcgatgc taagaaaaat 120 ggtattgcag atgctattct tgttggcgac catgacgaaa tcgtgtcaat cgcgcttaaa 180 ataggcatgg atgtaaatga ttttgaaata gtaaacgagc ctaacgttaa gaaagctgct 240 ttaaaggcag tagagctggt atcaactgga aaagctgata tggtaatgaa gggacttgta 300 aatacagcaa ctttcttacg ctctgtatta aacaaagaag ttggactgag aacaggaaaa 360 actatgtctc acgttgcagt atttgaaact gagaaatttg atcgtctgtt atttttaaca 420 gatgttgctt tcaatactta tcctgaatta aaggaaaaaa ttgatatcgt aaacaattca 480 gttaaggttg cacatgcaat aggtattgaa aatccaaagg ttgctccaat ttgtgcagtt 540 gaggttataa accctaaaat gccatcaaca cttgatgcag caatgctttc aaaaatgagt 600 gacagaggac aaattaaagg ttgtgtagtt gacggaccgt tagcacttga tatcgcttta 660 tcagaagaag cagcacatca taagggcgta acaggagaag ttgctggaaa agctgatatc 720 ttcttaatgc caaacattga aacaggaaat gtaatgtata agactttaac atatacaact 780 gatagcaaaa atggcggaat cttagttgga acttctgcac cagttgtttt aacttcacgc 840 gctgacagcc atgaaacaaa aatgaactct attgcacttg cagctttagt tgcaggcaat 900 aaataa 906 <210> 62 <211> 906 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 62 atgattaaga gttttaatga aattatcatg aaggtaaaga gcaaagaaat gaaaaaagtt 60 gctgttgctg tagcacaaga cgagccagta cttgaagcag tacgcgatgc taagaaaaat 120 ggtattgccg atgctattct ggttggcgac catgacgaaa tcgtgtctat cgcgctgaaa 180 ataggcatgg atgtaaatga ttttgaaatt gttaacgagc ctaacgttaa gaaagctgcg 240 ttaaaggcag tagagctggt atcaactgga aaagctgata tggtaatgaa gggactggta 300 aataccgcaa ctttcttacg ctctgtatta aacaaagaag ttggtctgcg tacaggaaaa 360 accatgtctc acgttgcagt atttgaaact gagaaatttg atcgtctgtt atttttaaca 420 gatgttgctt tcaatactta tcctgaatta aaggaaaaaa ttgatatcgt taacaatagc 480 gttaaggttg cacatgccat tggtattgaa aatccaaagg ttgctccaat ttgtgcagtt 540 gaggttatta acccgaaaat gccatcaaca cttgatgcag caatgctttc aaaaatgagt 600 gaccgcggac aaattaaagg ttgtgtagtt gacggaccgc tggcacttga tatcgcttta 660 tcagaagaag cagcacatca taaaggcgta acaggagaag ttgctggaaa agctgatatc 720 ttcttaatgc caaacattga aacaggaaat gtaatgtata agacgttaac ctataccact 780 gatagcaaaa atggcggcat cctggttgga acttctgcac cagttgtttt aacttcacgc 840 gctgacagcc atgaaacaaa aatgaactct attgcactgg cagcgctggt tgcaggcaat 900 aaataa 906 <210> 63 <211> 906 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 63 atgattaaga gttttaatga aattatcatg aaggtaaaga gcaaagaaat gaaaaaagtt 60 gctgttgctg ttgcacaaga cgagccggta ctggaagcgg tacgcgatgc taagaaaaat 120 ggtattgccg atgctattct ggttggcgac catgacgaaa tcgtctctat cgcgctgaaa 180 attggcatgg atgttaatga ttttgaaatt gttaacgagc ctaacgttaa gaaagctgcg 240 ctgaaggcgg tagagctggt ttccaccgga aaagctgata tggtaatgaa agggctggtg 300 aataccgcaa ctttcttacg cagcgtactg aacaaagaag ttggtctgcg taccggaaaa 360 accatgagtc acgttgcggt atttgaaact gagaaatttg atcgtctgct gtttctgacc 420 gatgttgctt tcaatactta tcctgaatta aaagaaaaaa ttgatatcgt taacaatagc 480 gttaaggttg cgcatgccat tggtattgaa aatccaaagg ttgctccaat ttgtgcagtt 540 gaggttatta acccgaaaat gccatcaaca cttgatgccg caatgcttag caaaatgagt 600 gaccgcggac aaattaaagg ttgtgtggtt gacggcccgc tggcactgga tatcgcgtta 660 agcgaagaag cggcacatca taaaggcgta accggcgaag ttgctggaaa agctgatatc 720 ttcctgatgc caaacattga aacaggcaat gtaatgtata aaacgttaac ctataccact 780 gatagcaaaa atggcggcat cctggttgga acttctgcac cagttgtttt aacctcacgc 840 gctgacagcc atgaaaccaa aatgaacagc attgcactgg cagcgctggt tgcaggcaat 900 aaataa 906 <210> 64 <211> 906 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 64 atgattaaaa gttttaacga aattatcatg aaagtgaaaa gcaaagagat gaaaaaagtg 60 gcggttgcgg ttgcgcagga tgaaccggtg ctggaagcgg tgcgcgatgc caaaaaaaac 120 ggtattgccg atgccattct ggtgggcgat cacgatgaaa ttgtctctat tgcgctgaaa 180 attggcatgg atgttaacga ttttgaaatt gttaatgaac cgaacgtgaa aaaagcggcg 240 ctgaaagcgg ttgaactggt ttccaccggt aaagccgata tggtgatgaa agggctggtg 300 aataccgcaa ccttcctgcg cagcgtgctg aataaagaag tgggtctgcg taccggtaaa 360 accatgagtc atgttgcggt gtttgaaacc gaaaaatttg accgtctgct gtttctgacc 420 gatgttgcgt ttaataccta tccggaactg aaagagaaaa ttgatatcgt taataacagc 480 gtgaaagtgg cgcatgccat tggtattgaa aacccgaaag tggcgccgat ttgcgcggtt 540 gaagtgatta acccgaaaat gccgtcaacg ctggatgccg cgatgctcag caaaatgagc 600 gatcgcggtc aaatcaaagg ctgtgtggtt gatggcccgc tggcgctgga tatcgcgctt 660 agcgaagaag cggcgcatca taaaggcgtg accggcgaag tggccggtaa agccgatatt 720 ttcctgatgc cgaatattga aaccggcaac gtgatgtata aaacgctgac ctataccacc 780 gacagcaaaa acggcggcat tctggtgggt accagcgcgc cggtggtgct gacctcgcgc 840 gccgacagcc atgaaaccaa aatgaacagc attgcgctgg cggcgctggt ggccggtaat 900 aaataa 906 <210> 65 <211> 1068 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 65 atgtatcgtt tactgattat caatcctggc tcgacctcaa ctaaaattgg tatttatgac 60 gatgaaaaag agatatttga gaagacttta cgtcattcag ctgaagagat agaaaaatat 120 aacactatat ttgatcaatt tcagttcaga aagaatgtaa ttctcgatgc gttaaaagaa 180 gcaaacattg aagtaagttc tttaaatgct gtagttggac gcggcggact gttaaagcca 240 atagtaagtg gaacttatgc agtaaatcaa aaaatgcttg aagaccttaa agtaggcgtt 300 caaggtcagc atgcgtcaaa tcttggtgga attattgcaa atgaaatagc aaaagaaata 360 aatgttccag catacatcgt tgatccagtt gttgtggatg agcttgatga agtttcacgt 420 atatcaggaa tggctgacat tccacgtaaa agtatattcc atgcattaaa tcaaaaagca 480 gttgctagac gctatgcaaa agaagttgga aaaaaatacg aagatcttaa tttaatcgtg 540 gtccacatgg gtggcggtac ttcagtaggt actcataaag atggtagagt aattgaagtt 600 aataatacac ttgatggaga aggtccattc tcaccagaaa gaagtggtgg cgttccaata 660 ggcgatcttg tacgtttgtg cttcagcaac aaatatactt atgaagaagt aatgaaaaag 720 ataaacggca aaggcggcgt tgttagttac ttaaatacta tcgattttaa ggctgtagtt 780 gataaagctc ttgaaggcga taagaaatgt gcacttatat atgaagcttt cacattccag 840 gtagcaaaag agataggaaa atgttcaacc gttttaaaag gaaatgtaga tgcaataatc 900 ttaacaggcg gaattgcgta caacgagcat gtatgtaatg ccatagagga tagagtaaaa 960 ttcattgcac ctgtagttcg ttatggtgga gaagatgaac ttcttgcact tgcagaaggt 1020 ggactgcgcg ttttacgcgg agaagaaaaa gctaaggaat acaaataa 1068 <210> 66 <211> 1068 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 66 atgtatcgtt tactgattat caatcctggc tcgacctcaa ctaaaattgg tatttatgac 60 gatgaaaaag agatatttga gaagacgtta cgtcattcag ctgaagagat tgaaaaatat 120 aacactatat ttgatcaatt tcagttccgc aagaatgtga ttctcgatgc gttaaaagaa 180 gcaaacattg aagtcagttc tttaaatgct gtagttggac gcggcggact gttaaagcca 240 attgtcagtg gaacttatgc agtaaatcaa aaaatgcttg aagaccttaa agtgggcgtt 300 caaggtcagc atgccagcaa tcttggtggc attattgcca atgaaatcgc aaaagaaatc 360 aatgttccag catacatcgt tgatccggtt gttgtggatg agcttgatga agttagccgt 420 ataagcggaa tggctgacat tccacgtaaa agtatattcc atgcattaaa tcaaaaagca 480 gttgctcgtc gctatgcaaa agaagttggt aaaaaatacg aagatcttaa tttaatcgtg 540 gtccacatgg gtggcggtac ttcagtaggt actcataaag atggtcgcgt gattgaagtt 600 aataatacac ttgatggcga aggtccattc tcaccagaac gtagtggtgg cgttccaatt 660 ggcgatctgg tacgtttgtg cttcagcaac aaatatactt atgaagaagt gatgaaaaag 720 ataaacggca aaggcggcgt tgttagttac ctgaatacta tcgattttaa ggctgtagtt 780 gataaagcgc ttgaaggcga taagaaatgt gcactgattt atgaagcttt caccttccag 840 gtagcaaaag agattggtaa atgttcaacc gttttaaaag gaaatgttga tgccattatc 900 ttaacaggcg gcattgctta caacgagcat gtatgtaatg ccattgagga tcgcgtaaaa 960 ttcattgcac ctgtagttcg ttatggtggc gaagatgaac tgctggcact ggcagaaggt 1020 ggactgcgcg ttttacgcgg cgaagaaaaa gcgaaggaat acaaataa 1068 <210> 67 <211> 1068 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 67 atgtatcgtc tgctgattat caatcctggc tcgacctcaa ctaaaattgg tatttatgac 60 gatgaaaaag agatatttga gaaaacgtta cgtcatagcg ctgaagagat tgaaaaatat 120 aacactattt ttgatcaatt tcagttccgc aagaatgtga ttctcgatgc gctgaaagaa 180 gcaaacattg aagtcagttc gctgaatgcg gtagttggtc gcggcggtct gctgaagcca 240 attgtcagcg gcacttatgc ggtaaatcaa aaaatgctgg aagacctgaa agtgggcgtt 300 caggggcagc atgccagcaa tcttggtggc attattgcca atgaaatcgc caaagaaatc 360 aatgttccgg catacatcgt tgatccggtt gttgtggatg agctggatga agttagccgt 420 atcagcggaa tggctgacat tccacgtaaa agtattttcc atgcactgaa tcaaaaagcg 480 gttgcgcgtc gctatgcaaa agaagttggt aaaaaatacg aagatcttaa tctgatcgtg 540 gtgcatatgg gtggcggtac tagcgtcggt actcataaag atggtcgcgt gattgaagtt 600 aataatacac ttgatggcga aggtccattc tcaccagaac gtagcggtgg cgttccaatt 660 ggcgatctgg tacgtttgtg cttcagcaac aaatatacct atgaagaagt gatgaaaaag 720 ataaacggca aaggcggcgt tgttagttac ctgaatacta tcgattttaa ggcggtagtt 780 gataaagcgc tggaaggcga taagaaatgt gcactgattt atgaagcgtt caccttccag 840 gtggcaaaag agattggtaa atgttcaacc gttctgaaag gcaatgttga tgccattatc 900 ctgaccggcg gcattgctta caacgagcat gtttgtaatg ccattgagga tcgcgtaaaa 960 ttcattgcac ctgtggttcg ttatggtggc gaagatgaac tgctggcact ggcagaaggt 1020 ggtctgcgcg ttttacgcgg cgaagaaaaa gcgaaagaat acaaataa 1068 <210> 68 <211> 1068 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 68 atgtatcgtc tgctgattat caacccgggc agcacctcaa ccaaaattgg tatttacgac 60 gatgaaaaag agatttttga aaaaacgctg cgtcacagcg cagaagagat tgaaaaatac 120 aacaccattt tcgatcagtt ccagttccgc aaaaacgtga ttctcgatgc gctgaaagaa 180 gccaatattg aagtctcctc gctgaatgcg gtggtcggtc gcggcggtct gctgaaaccg 240 attgtcagcg gcacttatgc ggttaatcag aaaatgctgg aagatctgaa agtgggcgtg 300 caggggcagc atgccagcaa tctcggcggc attatcgcca atgaaatcgc caaagagatc 360 aacgtgccgg cttatatcgt cgatccggtg gtggttgatg aactggatga agtcagccgt 420 atcagcggca tggcggatat tccgcgtaaa agcattttcc atgcgctgaa tcagaaagcg 480 gttgcgcgtc gctatgccaa agaagtgggt aaaaaatatg aagatctcaa tctgattgtg 540 gtgcatatgg gcggcggcac cagcgtcggt acgcataaag atggtcgcgt gattgaagtg 600 aataacacgc tggatggcga agggccgttc tcgccggaac gtagcggcgg cgtgccgatt 660 ggcgatctgg tgcgtctgtg tttcagcaat aaatacacct acgaagaagt gatgaaaaaa 720 atcaacggca aaggcggcgt ggttagctat ctgaatacca tcgattttaa agcggtggtt 780 gataaagcgc tggaaggcga taaaaaatgc gcgctgattt atgaagcgtt taccttccag 840 gtggcgaaag agattggtaa atgttcaacc gtgctgaaag gcaacgttga tgccattatt 900 ctgaccggcg gcattgctta taacgaacat gtttgtaatg ccattgaaga tcgcgtgaaa 960 tttattgcgc cggtggtgcg ttacggcggc gaagatgaac tgctggcgct ggcggaaggc 1020 ggtctgcgcg tgctgcgcgg cgaagaaaaa gcgaaagagt acaaataa 1068 <210> 69 <211> 1407 <212> DNA <213> Clostridium biejerinckii <400> 69 atgaataaag acacactaat acctacaact aaagatttaa aagtaaaaac aaatggtgaa 60 aacattaatt taaagaacta caaggataat tcttcatgtt tcggagtatt cgaaaatgtt 120 gaaaatgcta taagcagcgc tgtacacgca caaaagatat tatcccttca ttatacaaaa 180 gagcaaagag aaaaaatcat aactgagata agaaaggccg cattacaaaa taaagaggtc 240 ttggctacaa tgattctaga agaaacacat atgggaagat atgaggataa aatattaaaa 300 catgaattgg tagctaaata tactcctggt acagaagatt taactactac tgcttggtca 360 ggtgataatg gtcttacagt tgtagaaatg tctccatatg gtgttatagg tgcaataact 420 ccttctacga atccaactga aactgtaata tgtaatagca taggcatgat agctgctgga 480 aatgctgtag tatttaacgg acacccatgc gctaaaaaat gtgttgcctt tgctgttgaa 540 atgataaata aggcaattat ttcatgtggc ggtcctgaaa atctagtaac aactataaaa 600 aatccaacta tggagtctct agatgcaatt attaagcatc cttcaataaa acttctttgc 660 ggaactgggg gtccaggaat ggtaaaaacc ctcttaaatt ctggtaagaa agctataggt 720 gctggtgctg gaaatccacc agttattgta gatgatactg ctgatataga aaaggctggt 780 aggagcatca ttgaaggctg ttcttttgat aataatttac cttgtattgc agaaaaagaa 840 gtatttgttt ttgagaatgt tgcagatgat ttaatatcta acatgctaaa aaataatgct 900 gtaattataa atgaagatca agtatcaaaa ttaatagatt tagtattaca aaaaaataat 960 gaaactcaag aatactttat aaacaaaaaa tgggtaggaa aagatgcaaa attattctta 1020 gatgaaatag atgttgagtc tccttcaaat gttaaatgca taatctgcga agtaaatgca 1080 aatcatccat ttgttatgac agaactcatg atgccaatat tgccaattgt aagagttaaa 1140 gatatagatg aagctattaa atatgcaaag atagcagaac aaaatagaaa acatagtgcc 1200 tatatttatt ctaaaaatat agacaaccta aatagatttg aaagagaaat agatactact 1260 atttttgtaa agaatgctaa atcttttgct ggtgttggtt atgaagcaga aggatttaca 1320 actttcacta ttgctggatc tactggtgag ggaataacct ctgcaaggaa ttttacaaga 1380 caaagaagat gtgtacttgc cggctaa 1407 <210> 70 <211> 468 <212> PRT <213> Clostridium biejerinckii <400> 70 Met Asn Lys Asp Thr Leu Ile Pro Thr Thr Lys Asp Leu Lys Val Lys 1 5 10 15 Thr Asn Gly Glu Asn Ile Asn Leu Lys Asn Tyr Lys Asp Asn Ser Ser 20 25 30 Cys Phe Gly Val Phe Glu Asn Val Glu Asn Ala Ile Ser Ser Ala Val 35 40 45 His Ala Gln Lys Ile Leu Ser Leu His Tyr Thr Lys Glu Gln Arg Glu 50 55 60 Lys Ile Ile Thr Glu Ile Arg Lys Ala Ala Leu Gln Asn Lys Glu Val 65 70 75 80 Leu Ala Thr Met Ile Leu Glu Glu Thr His Met Gly Arg Tyr Glu Asp 85 90 95 Lys Ile Leu Lys His Glu Leu Val Ala Lys Tyr Thr Pro Gly Thr Glu 100 105 110 Asp Leu Thr Thr Thr Ala Trp Ser Gly Asp Asn Gly Leu Thr Val Val 115 120 125 Glu Met Ser Pro Tyr Gly Val Ile Gly Ala Ile Thr Pro Ser Thr Asn 130 135 140 Pro Thr Glu Thr Val Ile Cys Asn Ser Ile Gly Met Ile Ala Ala Gly 145 150 155 160 Asn Ala Val Val Phe Asn Gly His Pro Cys Ala Lys Lys Cys Val Ala 165 170 175 Phe Ala Val Glu Met Ile Asn Lys Ala Ile Ile Ser Cys Gly Gly Pro 180 185 190 Glu Asn Leu Val Thr Thr Ile Lys Asn Pro Thr Met Glu Ser Leu Asp 195 200 205 Ala Ile Ile Lys His Pro Ser Ile Lys Leu Leu Cys Gly Thr Gly Gly 210 215 220 Pro Gly Met Val Lys Thr Leu Leu Asn Ser Gly Lys Lys Ala Ile Gly 225 230 235 240 Ala Gly Ala Gly Asn Pro Pro Val Ile Val Asp Asp Thr Ala Asp Ile 245 250 255 Glu Lys Ala Gly Arg Ser Ile Ile Glu Gly Cys Ser Phe Asp Asn Asn 260 265 270 Leu Pro Cys Ile Ala Glu Lys Glu Val Phe Val Phe Glu Asn Val Ala 275 280 285 Asp Asp Leu Ile Ser Asn Met Leu Lys Asn Asn Ala Val Ile Ile Asn 290 295 300 Glu Asp Gln Val Ser Lys Leu Ile Asp Leu Val Leu Gln Lys Asn Asn 305 310 315 320 Glu Thr Gln Glu Tyr Phe Ile Asn Lys Lys Trp Val Gly Lys Asp Ala 325 330 335 Lys Leu Phe Leu Asp Glu Ile Asp Val Glu Ser Pro Ser Asn Val Lys 340 345 350 Cys Ile Ile Cys Glu Val Asn Ala Asn His Pro Phe Val Met Thr Glu 355 360 365 Leu Met Met Pro Ile Leu Pro Ile Val Arg Val Lys Asp Ile Asp Glu 370 375 380 Ala Ile Lys Tyr Ala Lys Ile Ala Glu Gln Asn Arg Lys His Ser Ala 385 390 395 400 Tyr Ile Tyr Ser Lys Asn Ile Asp Asn Leu Asn Arg Phe Glu Arg Glu 405 410 415 Ile Asp Thr Thr Ile Phe Val Lys Asn Ala Lys Ser Phe Ala Gly Val 420 425 430 Gly Tyr Glu Ala Glu Gly Phe Thr Thr Phe Thr Ile Ala Gly Ser Thr 435 440 445 Gly Glu Gly Ile Thr Ser Ala Arg Asn Phe Thr Arg Gln Arg Arg Cys 450 455 460 Val Leu Ala Gly 465 <210> 71 <211> 1407 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 71 atgaataaag acacactaat acctacaact aaagatttaa aagtaaaaac aaatggtgaa 60 aacattaatt taaagaacta caaggataat tcttcatgtt tcggcgtatt cgaaaatgtt 120 gaaaatgcta taagcagcgc tgtacacgca caaaagatat tatcccttca ttatacaaaa 180 gagcaacgtg aaaaaatcat aactgagata agaaaggccg cattacaaaa taaagaggtc 240 ttggctacaa tgattctgga agaaacacat atgggacgtt atgaggataa aatattaaaa 300 catgaattgg tagctaaata tactcctggt acagaagatt taactactac tgcctggtca 360 ggtgataatg gtctgacagt tgtagaaatg tctccatatg gtgttattgg tgcaataact 420 ccttctacga atccaactga aactgtaata tgtaatagca taggcatgat tgctgctgga 480 aatgctgtag tatttaacgg acacccatgc gctaaaaaat gtgttgcctt tgctgttgaa 540 atgataaata aggcaattat ttcatgtggc ggtcctgaaa atctggtaac aactataaaa 600 aatccaacca tggagtctct ggatgcaatt attaagcatc cttcaataaa acttctttgc 660 ggaactgggg gtccaggaat ggtaaaaacc ctgttaaatt ctggtaagaa agctataggt 720 gctggtgctg gaaatccacc agttattgtc gatgatactg ctgatataga aaaggctggt 780 cgtagcatca ttgaaggctg ttcttttgat aataatttac cttgtattgc agaaaaagaa 840 gtatttgttt ttgagaatgt tgcagatgat ttaatatcta acatgctaaa aaataatgct 900 gtaattataa atgaagatca agtatcaaaa ttaatcgatt tagtattaca aaaaaataat 960 gaaactcaag aatactttat aaacaaaaaa tgggtaggaa aagatgcaaa attattcctc 1020 gatgaaatag atgttgagtc tccttcaaat gttaaatgca taatctgcga agtaaatgca 1080 aatcatccat ttgttatgac agaactgatg atgccaatat tgccaattgt acgcgttaaa 1140 gatatcgatg aagctattaa atatgcaaag atagcagaac aaaatagaaa acatagtgcc 1200 tatatttatt ctaaaaatat cgacaacctg aatcgctttg aacgtgaaat agatactact 1260 atttttgtaa agaatgctaa atcttttgct ggtgttggtt atgaagcaga aggatttaca 1320 actttcacta ttgctggatc tactggtgag ggaataacct ctgcacgtaa ttttacacgc 1380 caacgtcgct gtgtacttgc cggctaa 1407 <210> 72 <211> 1407 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 72 atgaataaag acacactgat ccctacaact aaagatttaa aagtaaaaac aaatggtgaa 60 aacattaatt taaagaacta caaagataat agcagttgtt tcggcgtatt cgaaaatgtt 120 gaaaatgcta tcagcagcgc tgtacacgca caaaagatat tatcgctgca ttatacaaaa 180 gagcaacgtg aaaaaatcat cactgagata cgtaaggccg cattacaaaa taaagaggtg 240 ctggctacaa tgattctgga agaaacacat atgggacgtt atgaggataa aatattaaaa 300 catgaactgg tagctaaata tactcctggt acagaagatt taactactac tgcctggagc 360 ggtgataatg gtctgacagt tgtagaaatg tctccatatg gtgttattgg tgcaataact 420 ccttctacca atccaactga aactgtaatt tgtaatagca ttggcatgat tgctgctgga 480 aatgctgtag tatttaacgg acacccatgc gctaaaaaat gtgttgcctt tgctgttgaa 540 atgatcaata aggcaattat tagctgtggc ggtccggaaa atctggtaac aactataaaa 600 aatccaacca tggagtctct ggatgccatt attaagcatc cttcaataaa actgctttgc 660 ggaactggcg gtccaggaat ggtaaaaacc ctgttaaatt ctggtaagaa agctattggt 720 gctggtgctg gaaatccacc agttattgtc gatgatactg ctgatattga aaaggctggt 780 cgtagcatca ttgaaggctg ttcttttgat aataatttac cttgtattgc agaaaaagaa 840 gtatttgttt ttgagaatgt tgcagatgat ttaatatcta acatgctgaa aaataatgct 900 gtaattatca atgaagatca ggtatcaaaa ttaatcgatt tagtattaca aaaaaataat 960 gaaactcaag aatactttat caacaaaaaa tgggtaggta aagatgcaaa attattcctc 1020 gatgaaatcg atgttgagtc tccttcaaat gttaaatgca ttatctgcga agtgaatgcc 1080 aatcatccat ttgttatgac agaactgatg atgccaatat tgccaattgt gcgcgttaaa 1140 gatatcgatg aagctattaa atatgcaaag attgcagaac aaaatagaaa acatagtgcc 1200 tatatttata gcaaaaatat cgacaacctg aatcgctttg aacgtgaaat cgatactact 1260 atttttgtaa agaatgctaa atcttttgct ggtgttggtt atgaagcaga aggatttacc 1320 actttcacta ttgctggatc tactggtgag ggcataacct ctgcacgtaa ttttacccgc 1380 caacgtcgct gtgtactggc cggctaa 1407 <210> 73 <211> 1407 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 73 atgaataaag acacgctgat cccgacaact aaagatctga aagtaaaaac caatggtgaa 60 aacattaatc tgaagaacta caaagataat agcagttgtt tcggcgtatt cgaaaatgtt 120 gaaaatgcta tcagcagcgc ggtacacgca caaaagatac tctcgctgca ttataccaaa 180 gagcaacgtg aaaaaatcat cactgagatc cgtaaggccg cattacaaaa taaagaggtg 240 ctggcaacaa tgattctgga agaaacacat atgggacgtt atgaggataa aatactgaaa 300 catgaactgg tggcgaaata tacgcctggt actgaagatt taaccaccac tgcctggagc 360 ggtgataatg gtctgaccgt tgtggaaatg tcgccttatg gtgttattgg tgcaattacg 420 ccttcaacca atccaactga aacggtaatt tgtaatagca ttggcatgat tgctgctgga 480 aatgcggtag tatttaacgg tcacccctgc gctaaaaaat gtgttgcctt tgctgttgaa 540 atgatcaata aagcgattat tagctgtggc ggtccggaaa atctggtaac cactataaaa 600 aatccaacca tggagtcgct ggatgccatt attaagcatc cttcaatcaa actgctgtgc 660 ggcactggcg gtccaggaat ggtgaaaacc ctgctgaata gcggtaagaa agcgattggt 720 gctggtgctg gaaatccacc agttattgtc gatgatactg ctgatattga aaaagcgggt 780 cgtagcatca ttgaaggctg ttcttttgat aataatttac cttgtattgc agaaaaagaa 840 gtatttgttt ttgagaatgt tgccgatgat ctgatctcta acatgctgaa aaataatgcg 900 gtgattatca atgaagatca ggttagcaaa ctgatcgatc tggtattaca aaaaaataat 960 gaaactcaag aatactttat caacaaaaaa tgggtaggta aagatgcaaa actgttcctc 1020 gatgaaatcg atgttgagtc gccttcaaat gttaaatgca ttatctgcga agtgaatgcc 1080 aatcatccat ttgtgatgac cgaactgatg atgccaattt tgccgattgt gcgcgttaaa 1140 gatatcgatg aagcgattaa atatgcaaag attgcagaac aaaatcgtaa acatagtgcc 1200 tatatttata gcaaaaatat cgacaacctg aatcgctttg aacgtgaaat cgataccact 1260 atttttgtga agaatgctaa atcttttgct ggtgttggtt atgaagcaga aggttttacc 1320 actttcacta ttgctggaag caccggtgaa ggcattacct ctgcacgtaa ttttacccgc 1380 caacgtcgct gtgtactggc cggctaa 1407 <210> 74 <211> 1407 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 74 atgaataaag atacgctgat cccgaccacc aaagatctga aagtgaaaac caacggcgaa 60 aatatcaacc tgaaaaacta taaagataac agcagttgct ttggcgtgtt tgaaaacgtt 120 gaaaacgcca tctccagcgc ggtgcatgcg caaaaaattc tctcgctgca ttacaccaaa 180 gagcagcgtg aaaaaattat caccgaaatc cgtaaagcgg cgctgcaaaa caaagaagtg 240 ctggcaacca tgatcctgga agaaacgcat atggggcgtt atgaagataa aattctgaaa 300 catgaactgg tggcgaaata cacgccgggc actgaagatc tgaccaccac cgcctggagc 360 ggcgataacg gcctgaccgt ggtggagatg tcgccttatg gcgtgattgg cgcgattacg 420 ccgtcaacca acccgaccga aacggtgatt tgtaacagca ttggcatgat tgccgcgggt 480 aatgcggtgg tgtttaacgg tcatccctgc gcgaaaaaat gtgtggcgtt tgccgttgag 540 atgatcaaca aagcgattat cagctgcggc ggcccggaaa atctggtgac caccatcaaa 600 aatccgacca tggaatcgct ggatgccatt atcaaacatc cttccatcaa actgctgtgc 660 ggcaccggcg gcccgggcat ggtgaaaacg ctgctgaaca gcggtaaaaa agcgattggc 720 gcgggcgcgg gtaacccgcc ggtgattgtc gatgacaccg ccgatattga aaaagcgggg 780 cgtagcatta ttgaaggctg ttcttttgat aacaacctgc cctgcattgc cgaaaaagaa 840 gtgtttgtct ttgaaaacgt cgccgatgat ctgatcagca atatgctgaa aaacaacgcg 900 gtgattatca atgaagatca ggttagcaaa ctgatcgatc tggtgctgca aaaaaacaac 960 gaaacgcagg aatattttat caacaaaaaa tgggttggta aagatgccaa actgtttctc 1020 gatgaaatcg atgttgaatc gccgtctaac gtgaaatgta ttatctgcga agtgaacgcc 1080 aaccatccgt ttgtgatgac cgaactgatg atgccgattc tgccgattgt gcgcgtgaaa 1140 gatatcgatg aagcgattaa atatgccaaa attgccgaac aaaaccgtaa acacagcgcc 1200 tatatttaca gcaaaaatat cgataacctg aaccgctttg aacgtgaaat cgataccacc 1260 atttttgtga aaaatgccaa aagttttgcc ggcgttggtt atgaagcgga aggttttacc 1320 acctttacca ttgccggtag caccggcgaa ggcattacca gcgcccgtaa ttttacccgc 1380 cagcgtcgct gcgtgctggc gggctaa 1407 <210> 75 <211> 1023 <212> DNA <213> Geobacillus thermoglucosidasius <400> 75 atgaaagctg cagtagtaga gcaatttaag gaaccattaa aaattaaaga agtggaaaag 60 ccatctattt catatggcga agtattagtc cgcattaaag catgcggtgt atgccatacg 120 gacttgcacg ccgctcatgg cgattggcca gtaaaaccaa aacttccttt aatccctggc 180 catgaaggag tcggaattgt tgaagaagtc ggtccggggg taacccattt aaaagtggga 240 gaccgcgttg gaattccttg gttatattct gcgtgcggcc attgcgaata ttgtttaagc 300 ggacaagaag cattatgtga acatcaacaa aacgccggct actcagtcga cgggggttat 360 gcagaatatt gcagagctgc gccagattat gtggtgaaaa ttcctgacaa cttatcgttt 420 gaagaagctg ctcctatttt ctgcgccgga gttactactt ataaagcgtt aaaagtcaca 480 ggtacaaaac cgggagaatg ggtagcgatc tatggcatcg gcggccttgg acatgttgcc 540 gtccagtatg cgaaagcgat ggggcttcat gttgttgcag tggatatcgg cgatgagaaa 600 ctggaacttg caaaagagct tggcgccgat cttgttgtaa atcctgcaaa agaaaatgcg 660 gcccaattta tgaaagagaa agtcggcgga gtacacgcgg ctgttgtgac agctgtatct 720 aaacctgctt ttcaatctgc gtacaattct atccgcagag gcggcacgtg cgtgcttgtc 780 ggattaccgc cggaagaaat gcctattcca atctttgata cggtattaaa cggaattaaa 840 attatcggtt ccattgtcgg cacgcggaaa gacttgcaag aagcgcttca gttcgctgca 900 gaaggtaaag taaaaaccat tattgaagtg caacctcttg aaaaaattaa cgaagtattt 960 gacagaatgc taaaaggaga aattaacgga cgggttgttt taacgttaga aaataataat 1020 taa 1023 <210> 76 <211> 340 <212> PRT <213> Geobacillus thermoglucosidasius <400> 76 Met Lys Ala Ala Val Val Glu Gln Phe Lys Glu Pro Leu Lys Ile Lys 1 5 10 15 Glu Val Glu Lys Pro Ser Ile Ser Tyr Gly Glu Val Leu Val Arg Ile 20 25 30 Lys Ala Cys Gly Val Cys His Thr Asp Leu His Ala Ala His Gly Asp 35 40 45 Trp Pro Val Lys Pro Lys Leu Pro Leu Ile Pro Gly His Glu Gly Val 50 55 60 Gly Ile Val Glu Glu Val Gly Pro Gly Val Thr His Leu Lys Val Gly 65 70 75 80 Asp Arg Val Gly Ile Pro Trp Leu Tyr Ser Ala Cys Gly His Cys Glu 85 90 95 Tyr Cys Leu Ser Gly Gln Glu Ala Leu Cys Glu His Gln Gln Asn Ala 100 105 110 Gly Tyr Ser Val Asp Gly Gly Tyr Ala Glu Tyr Cys Arg Ala Ala Pro 115 120 125 Asp Tyr Val Val Lys Ile Pro Asp Asn Leu Ser Phe Glu Glu Ala Ala 130 135 140 Pro Ile Phe Cys Ala Gly Val Thr Thr Tyr Lys Ala Leu Lys Val Thr 145 150 155 160 Gly Thr Lys Pro Gly Glu Trp Val Ala Ile Tyr Gly Ile Gly Gly Leu 165 170 175 Gly His Val Ala Val Gln Tyr Ala Lys Ala Met Gly Leu His Val Val 180 185 190 Ala Val Asp Ile Gly Asp Glu Lys Leu Glu Leu Ala Lys Glu Leu Gly 195 200 205 Ala Asp Leu Val Val Asn Pro Ala Lys Glu Asn Ala Ala Gln Phe Met 210 215 220 Lys Glu Lys Val Gly Gly Val His Ala Ala Val Val Thr Ala Val Ser 225 230 235 240 Lys Pro Ala Phe Gln Ser Ala Tyr Asn Ser Ile Arg Arg Gly Gly Thr 245 250 255 Cys Val Leu Val Gly Leu Pro Pro Glu Glu Met Pro Ile Pro Ile Phe 260 265 270 Asp Thr Val Leu Asn Gly Ile Lys Ile Ile Gly Ser Ile Val Gly Thr 275 280 285 Arg Lys Asp Leu Gln Glu Ala Leu Gln Phe Ala Ala Glu Gly Lys Val 290 295 300 Lys Thr Ile Ile Glu Val Gln Pro Leu Glu Lys Ile Asn Glu Val Phe 305 310 315 320 Asp Arg Met Leu Lys Gly Glu Ile Asn Gly Arg Val Val Leu Thr Leu 325 330 335 Glu Asn Asn Asn 340 <210> 77 <211> 4090 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 77 atggctatcg aaatcaaagt accggacatc ggggctgatg aagttgaaat caccgagatc 60 ctggtcaaag tgggcgacaa agttgaagcc gaacagtcgc tgatcaccgt agaaggcgac 120 aaagcctcta tggaagttcc gtctccgcag gcgggtatcg ttaaagagat caaagtctct 180 gttggcgata aaacccagac cggcgcactg attatgattt tcgattccgc cgacggtgca 240 gcagacgctg cacctgctca ggcagaagag aagaaagaag cagctccggc agcagcacca 300 gcggctgcgg cggcaaaaga cgttaacgtt ccggatatcg gcagcgacga agttgaagtg 360 accgaaatcc tggtgaaagt tggcgataaa gttgaagctg aacagtcgct gatcaccgta 420 gaaggcgaca aggcttctat ggaagttccg gctccgtttg ctggcaccgt gaaagagatc 480 aaagtgaacg tgggtgacaa agtgtctacc ggctcgctga ttatggtctt cgaagtcgcg 540 ggtgaagcag gcgcggcagc tccggccgct aaacaggaag cagctccggc agcggcccct 600 gcaccagcgg ctggcgtgaa agaagttaac gttccggata tcggcggtga cgaagttgaa 660 gtgactgaag tgatggtgaa agtgggcgac aaagttgccg ctgaacagtc actgatcacc 720 gtagaaggcg acaaagcttc tatggaagtt ccggcgccgt ttgcaggcgt cgtgaaggaa 780 ctgaaagtca acgttggcga taaagtgaaa actggctcgc tgattatgat cttcgaagtt 840 gaaggcgcag cgcctgcggc agctcctgcg aaacaggaag cggcagcgcc ggcaccggca 900 gcaaaagctg aagccccggc agcagcacca gctgcgaaag cggaaggcaa atctgaattt 960 gctgaaaacg acgcttatgt tcacgcgact ccgctgatcc gccgtctggc acgcgagttt 1020 ggtgttaacc ttgcgaaagt gaagggcact ggccgtaaag gtcgtatcct gcgcgaagac 1080 gttcaggctt acgtgaaaga agctatcaaa cgtgcagaag cagctccggc agcgactggc 1140 ggtggtatcc ctggcatgct gccgtggccg aaggtggact tcagcaagtt tggtgaaatc 1200 gaagaagtgg aactgggccg catccagaaa atctctggtg cgaacctgag ccgtaactgg 1260 gtaatgatcc cgcatgttac tcacttcgac aaaaccgata tcaccgagtt ggaagcgttc 1320 cgtaaacagc agaacgaaga agcggcgaaa cgtaagctgg atgtgaagat caccccggtt 1380 gtcttcatca tgaaagccgt tgctgcagct cttgagcaga tgcctcgctt caatagttcg 1440 ctgtcggaag acggtcagcg tctgaccctg aagaaataca tcaacatcgg tgtggcggtg 1500 gataccccga acggtctggt tgttccggta ttcaaagacg tcaacaagaa aggcatcatc 1560 gagctgtctc gcgagctgat gactatttct aagaaagcgc gtgacggtaa gctgactgcg 1620 ggcgaaatgc agggcggttg cttcaccatc tccagcatcg gcggcctggg tactacccac 1680 ttcgcgccga ttgtgaacgc gccggaagtg gctatcctcg gcgtttccaa gtccgcgatg 1740 gagccggtgt ggaatggtaa agagttcgtg ccgcgtctga tgctgccgat ttctctctcc 1800 ttcgaccacc gcgtgatcga cggtgctgat ggtgcccgtt tcattaccat cattaacaac 1860 acgctgtctg acattcgccg tctggtgatg taagtaaaag agccggccca acggccggct 1920 tttttctggt aatctcatga atgtattgag gttattagcg aatagacaaa tcggttgccg 1980 tttgttgttt aaaaattgtt aacaattttg taaaataccg acggatagaa cgacccggtg 2040 gtggttaggg tattacttca cataccctat ggatttctgg gtgcagcaag gtagcaagcg 2100 ccagaatccc caggagctta cataagtaag tgactggggt gagggcgtga agctaacgcc 2160 gctgcggcct gaaagacgac gggtatgacc gccggagata aatatataga ggtcatgatg 2220 agtactgaaa tcaaaactca ggtcgtggta cttggggcag gccccgcagg ttactccgct 2280 gccttccgtt gcgctgattt aggtctggaa accgtaatcg tagaacgtta caacaccctt 2340 ggcggtgttt gtctgaacgt gggttgtatc ccttctaaag cgctgctgca cgtggcaaaa 2400 gttatcgaag aagcgaaagc gctggccgaa cacggcatcg ttttcggcga accgaaaact 2460 gacattgaca agatccgcac ctggaaagaa aaagtcatca ctcagctgac cggtggtctg 2520 gctggcatgg ccaaaggtcg taaagtgaag gtggttaacg gtctgggtaa atttaccggc 2580 gctaacaccc tggaagtgga aggcgaaaac ggcaaaaccg tgatcaactt cgacaacgcc 2640 atcatcgcgg cgggttcccg tccgattcag ctgccgttta tcccgcatga agatccgcgc 2700 gtatgggact ccaccgacgc gctggaactg aaatctgtac cgaaacgcat gctggtgatg 2760 ggcggcggta tcatcggtct ggaaatgggt accgtatacc atgcgctggg ttcagagatt 2820 gacgtggtgg aaatgttcga ccaggttatc ccggctgccg acaaagacgt ggtgaaagtc 2880 ttcaccaaac gcatcagcaa gaaatttaac ctgatgctgg aagccaaagt gactgccgtt 2940 gaagcgaaag aagacggtat ttacgtttcc atggaaggta aaaaagcacc ggcggaagcg 3000 cagcgttacg acgcagtgct ggtcgctatc ggccgcgtac cgaatggtaa aaacctcgat 3060 gcaggtaaag ctggcgtgga agttgacgat cgcggcttca tccgcgttga caaacaaatg 3120 cgcaccaacg tgccgcacat ctttgctatc ggcgatatcg tcggtcagcc gatgctggcg 3180 cacaaaggtg tccatgaagg ccacgttgcc gcagaagtta tctccggtct gaaacactac 3240 ttcgatccga aagtgatccc atccatcgcc tacactaaac cagaagtggc atgggtcggt 3300 ctgaccgaga aagaagcgaa agagaaaggc atcagctacg aaaccgccac cttcccgtgg 3360 gctgcttccg gccgtgctat cgcttctgac tgcgcagatg gtatgaccaa actgatcttc 3420 gacaaagaga cccaccgtgt tatcggcggc gcgattgtcg gcaccaacgg cggcgagctg 3480 ctgggtgaga tcggcctggc tatcgagatg ggctgtgacg ctgaagacat cgccctgacc 3540 atccacgctc acccgactct gcacgagtcc gttggcctgg cggcggaagt gttcgaaggc 3600 agcatcaccg acctgccaaa cgccaaagcg aagaaaaagt aactttttct ttcaggaaaa 3660 aagcataagc ggctccggga gccgcttttt ttatgcctga tgtttagaac tatgtcactg 3720 ttcataaacc gctacacctc atacatactt taagggcgaa ttctgcagat atccatcaca 3780 ctggcggccg ctcgagcatg catctagcac atccggcaat taaaaaagcg gctaaccacg 3840 ccgctttttt tacgtctgca atttaccttt ccagtcttct tgctccacgt tcagagagac 3900 gttcgcatac tgctgaccgt tgctcgttat tcagcctgac agtatggtta ctgtcgttta 3960 gacgttgtgg gcggctctcc tgaactttct cccgaaaaac ctgacgttgt tcaggtgatg 4020 ccgattgaac acgctggcgg gcgttatcac gttgctgttg attcagtggg cgctgctgta 4080 ctttttcctt 4090 <210> 78 <211> 475 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 78 Met Met Ser Thr Glu Ile Lys Thr Gln Val Val Val Leu Gly Ala Gly 1 5 10 15 Pro Ala Gly Tyr Ser Ala Ala Phe Arg Cys Ala Asp Leu Gly Leu Glu 20 25 30 Thr Val Ile Val Glu Arg Tyr Asn Thr Leu Gly Gly Val Cys Leu Asn 35 40 45 Val Gly Cys Ile Pro Ser Lys Ala Leu Leu His Val Ala Lys Val Ile 50 55 60 Glu Glu Ala Lys Ala Leu Ala Glu His Gly Ile Val Phe Gly Glu Pro 65 70 75 80 Lys Thr Asp Ile Asp Lys Ile Arg Thr Trp Lys Glu Lys Val Ile Asn 85 90 95 Gln Leu Thr Gly Gly Leu Ala Gly Met Ala Lys Gly Arg Lys Val Lys 100 105 110 Val Val Asn Gly Leu Gly Lys Phe Thr Gly Ala Asn Thr Leu Glu Val 115 120 125 Glu Gly Glu Asn Gly Lys Thr Val Ile Asn Phe Asp Asn Ala Ile Ile 130 135 140 Ala Ala Gly Ser Arg Pro Ile Gln Leu Pro Phe Ile Pro His Glu Asp 145 150 155 160 Pro Arg Ile Trp Asp Ser Thr Asp Ala Leu Glu Leu Lys Glu Val Pro 165 170 175 Glu Arg Leu Leu Val Met Gly Gly Gly Ile Ile Gly Leu Glu Met Gly 180 185 190 Thr Val Tyr His Ala Leu Gly Ser Gln Ile Asp Val Val Glu Met Phe 195 200 205 Asp Gln Val Ile Pro Ala Ala Asp Lys Asp Ile Val Lys Val Phe Thr 210 215 220 Lys Arg Ile Ser Lys Lys Phe Asn Leu Met Leu Glu Thr Lys Val Thr 225 230 235 240 Ala Val Glu Ala Lys Glu Asp Gly Ile Tyr Val Thr Met Glu Gly Lys 245 250 255 Lys Ala Pro Ala Glu Pro Gln Arg Tyr Asp Ala Val Leu Val Ala Ile 260 265 270 Gly Arg Val Pro Asn Gly Lys Asn Leu Asp Ala Gly Lys Ala Gly Val 275 280 285 Glu Val Asp Asp Arg Gly Phe Ile Arg Val Asp Lys Gln Leu Arg Thr 290 295 300 Asn Val Pro His Ile Phe Ala Ile Gly Asp Ile Val Gly Gln Pro Met 305 310 315 320 Leu Ala His Lys Gly Val His Glu Gly His Val Ala Ala Glu Val Ile 325 330 335 Ala Gly Lys Lys His Tyr Phe Asp Pro Lys Val Ile Pro Ser Ile Ala 340 345 350 Tyr Thr Glu Pro Glu Val Ala Trp Val Gly Leu Thr Glu Lys Glu Ala 355 360 365 Lys Glu Lys Gly Ile Ser Tyr Glu Thr Ala Thr Phe Pro Trp Ala Ala 370 375 380 Ser Gly Arg Ala Ile Ala Ser Asp Cys Ala Asp Gly Met Thr Lys Leu 385 390 395 400 Ile Phe Asp Lys Glu Ser His Arg Val Ile Gly Gly Ala Ile Val Gly 405 410 415 Thr Asn Gly Gly Glu Leu Leu Gly Glu Ile Gly Leu Ala Ile Glu Met 420 425 430 Gly Cys Asp Ala Glu Asp Ile Ala Leu Thr Ile His Ala His Pro Thr 435 440 445 Leu His Glu Ser Val Gly Leu Ala Ala Glu Val Phe Glu Gly Ser Ile 450 455 460 Thr Asp Leu Pro Asn Pro Lys Ala Lys Lys Lys 465 470 475 <210> 79 <211> 475 <212> PRT <213> Klebsiella pneumoniae <400> 79 Met Met Ser Thr Glu Ile Lys Thr Gln Val Val Val Leu Gly Ala Gly 1 5 10 15 Pro Ala Gly Tyr Ser Ala Ala Phe Arg Cys Ala Asp Leu Gly Leu Glu 20 25 30 Thr Val Ile Val Glu Arg Tyr Ser Thr Leu Gly Gly Val Cys Leu Asn 35 40 45 Val Gly Cys Ile Pro Ser Lys Ala Leu Leu His Val Ala Lys Val Ile 50 55 60 Glu Glu Ala Lys Ala Leu Ala Glu His Gly Ile Val Phe Gly Glu Pro 65 70 75 80 Lys Thr Asp Ile Asp Lys Ile Arg Thr Trp Lys Glu Lys Val Ile Thr 85 90 95 Gln Leu Thr Gly Gly Leu Ala Gly Met Ala Lys Gly Arg Lys Val Lys 100 105 110 Val Val Asn Gly Leu Gly Lys Phe Thr Gly Ala Asn Thr Leu Glu Val 115 120 125 Glu Gly Glu Asn Gly Lys Thr Val Ile Asn Phe Asp Asn Ala Ile Ile 130 135 140 Ala Ala Gly Ser Arg Pro Ile Gln Leu Pro Phe Ile Pro His Glu Asp 145 150 155 160 Pro Arg Val Trp Asp Ser Thr Asp Ala Leu Glu Leu Lys Ser Val Pro 165 170 175 Lys Arg Met Leu Val Met Gly Gly Gly Ile Ile Gly Leu Glu Met Gly 180 185 190 Thr Val Tyr His Ala Leu Gly Ser Glu Ile Asp Val Val Glu Met Phe 195 200 205 Asp Gln Val Ile Pro Ala Ala Asp Lys Asp Val Val Lys Val Phe Thr 210 215 220 Lys Arg Ile Ser Lys Lys Phe Asn Leu Met Leu Glu Ala Lys Val Thr 225 230 235 240 Ala Val Glu Ala Lys Glu Asp Gly Ile Tyr Val Ser Met Glu Gly Lys 245 250 255 Lys Ala Pro Ala Glu Ala Gln Arg Tyr Asp Ala Val Leu Val Ala Ile 260 265 270 Gly Arg Val Pro Asn Gly Lys Asn Leu Asp Ala Gly Lys Ala Gly Val 275 280 285 Glu Val Asp Asp Arg Gly Phe Ile Arg Val Asp Lys Gln Met Arg Thr 290 295 300 Asn Val Pro His Ile Phe Ala Ile Gly Asp Ile Val Gly Gln Pro Met 305 310 315 320 Leu Ala His Lys Gly Val His Glu Gly His Val Ala Ala Glu Val Ile 325 330 335 Ser Gly Leu Lys His Tyr Phe Asp Pro Lys Val Ile Pro Ser Ile Ala 340 345 350 Tyr Thr Lys Pro Glu Val Ala Trp Val Gly Leu Thr Glu Lys Glu Ala 355 360 365 Lys Glu Lys Gly Ile Ser Tyr Glu Thr Ala Thr Phe Pro Trp Ala Ala 370 375 380 Ser Gly Arg Ala Ile Ala Ser Asp Cys Ala Asp Gly Met Thr Lys Leu 385 390 395 400 Ile Phe Asp Lys Glu Thr His Arg Val Ile Gly Gly Ala Ile Val Gly 405 410 415 Thr Asn Gly Gly Glu Leu Leu Gly Glu Ile Gly Leu Ala Ile Glu Met 420 425 430 Gly Cys Asp Ala Glu Asp Ile Ala Leu Thr Ile His Ala His Pro Thr 435 440 445 Leu His Glu Ser Val Gly Leu Ala Ala Glu Val Phe Glu Gly Ser Ile 450 455 460 Thr Asp Leu Pro Asn Ala Lys Ala Lys Lys Lys 465 470 475 <210> 80 <211> 347 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 80 ataataatac atatgaacca tgcgagttac gggcctataa gccaggcgag atatgatcta 60 tatcaatttc tcatctataa tgctttgtta gtatctcgtc gccgacttaa taaagagaga 120 gttagtgtga aagctgacaa cccttttgat cttttacttc ctgctgcaat ggccaaagtg 180 gccgaagagg cgggtgtcta taaagcaacg aaacatccgc ttaagacttt ctatctggcg 240 attaccgccg gtgttttcat ctcaatcgca ttcaccactg gcacaggcac agaaggtagg 300 tgttacatgt cagaacgttt acacaatgac gtggatccta ttattat 347 <210> 81 <211> 4678 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 81 aagaggtaaa agaataatgg ctatcgaaat caaagtaccg gacatcgggg ctgatgaagt 60 tgaaatcacc gagatcctgg tcaaagtggg cgacaaagtt gaagccgaac agtcgctgat 120 caccgtagaa ggcgacaaag cctctatgga agttccgtct ccgcaggcgg gtatcgttaa 180 agagatcaaa gtctctgttg gcgataaaac ccagaccggc gcactgatta tgattttcga 240 ttccgccgac ggtgcagcag acgctgcacc tgctcaggca gaagagaaga aagaagcagc 300 tccggcagca gcaccagcgg ctgcggcggc aaaagacgtt aacgttccgg atatcggcag 360 cgacgaagtt gaagtgaccg aaatcctggt gaaagttggc gataaagttg aagctgaaca 420 gtcgctgatc accgtagaag gcgacaaggc ttctatggaa gttccggctc cgtttgctgg 480 caccgtgaaa gagatcaaag tgaacgtggg tgacaaagtg tctaccggct cgctgattat 540 ggtcttcgaa gtcgcgggtg aagcaggcgc ggcagctccg gccgctaaac aggaagcagc 600 tccggcagcg gcccctgcac cagcggctgg cgtgaaagaa gttaacgttc cggatatcgg 660 cggtgacgaa gttgaagtga ctgaagtgat ggtgaaagtg ggcgacaaag ttgccgctga 720 acagtcactg atcaccgtag aaggcgacaa agcttctatg gaagttccgg cgccgtttgc 780 aggcgtcgtg aaggaactga aagtcaacgt tggcgataaa gtgaaaactg gctcgctgat 840 tatgatcttc gaagttgaag gcgcagcgcc tgcggcagct cctgcgaaac aggaagcggc 900 agcgccggca ccggcagcaa aagctgaagc cccggcagca gcaccagctg cgaaagcgga 960 aggcaaatct gaatttgctg aaaacgacgc ttatgttcac gcgactccgc tgatccgccg 1020 tctggcacgc gagtttggtg ttaaccttgc gaaagtgaag ggcactggcc gtaaaggtcg 1080 tatcctgcgc gaagacgttc aggcttacgt gaaagaagct atcaaacgtg cagaagcagc 1140 tccggcagcg actggcggtg gtatccctgg catgctgccg tggccgaagg tggacttcag 1200 caagtttggt gaaatcgaag aagtggaact gggccgcatc cagaaaatct ctggtgcgaa 1260 cctgagccgt aactgggtaa tgatcccgca tgttactcac ttcgacaaaa ccgatatcac 1320 cgagttggaa gcgttccgta aacagcagaa cgaagaagcg gcgaaacgta agctggatgt 1380 gaagatcacc ccggttgtct tcatcatgaa agccgttgct gcagctcttg agcagatgcc 1440 tcgcttcaat agttcgctgt cggaagacgg tcagcgtctg accctgaaga aatacatcaa 1500 catcggtgtg gcggtggata ccccgaacgg tctggttgtt ccggtattca aagacgtcaa 1560 caagaaaggc atcatcgagc tgtctcgcga gctgatgact atttctaaga aagcgcgtga 1620 cggtaagctg actgcgggcg aaatgcaggg cggttgcttc accatctcca gcatcggcgg 1680 cctgggtact acccacttcg cgccgattgt gaacgcgccg gaagtggcta tcctcggcgt 1740 ttccaagtcc gcgatggagc cggtgtggaa tggtaaagag ttcgtgccgc gtctgatgct 1800 gccgatttct ctctccttcg accaccgcgt gatcgacggt gctgatggtg cccgtttcat 1860 taccatcatt aacaacacgc tgtctgacat tcgccgtctg gtgatgtaag taaaagagcc 1920 ggcccaacgg ccggcttttt tctggtaatc tcatgaatgt attgaggtta ttagcgaata 1980 gacaaatcgg ttgccgtttg ttaagccagg cgagatatga tctatatcaa tttctcatct 2040 ataatgcttt gttagtatct cgtcgccgac ttaataaaga gagagttagt cttctatatc 2100 acagcaagaa ggtaggtgtt acatgatgag tactgaaatc aaaactcagg tcgtggtact 2160 tggggcaggc cccgcaggtt actctgcagc cttccgttgc gctgatttag gtctggaaac 2220 cgtcatcgta gaacgttaca gcaccctcgg tggtgtttgt ctgaacgtgg gttgtatccc 2280 ttctaaagcg ctgctgcacg tggcaaaagt tatcgaagaa gcgaaagcgc tggccgaaca 2340 cggcatcgtt ttcggcgaac cgaaaactga cattgacaag atccgcacct ggaaagaaaa 2400 agtcatcact cagctgaccg gtggtctggc tggcatggcc aaaggtcgta aagtgaaggt 2460 ggttaacggt ctgggtaaat ttaccggcgc taacaccctg gaagtggaag gcgaaaacgg 2520 caaaaccgtg atcaacttcg acaacgccat catcgcggcg ggttcccgtc cgattcagct 2580 gccgtttatc ccgcatgaag atccgcgcgt atgggactcc accgacgcgc tggaactgaa 2640 atctgtaccg aaacgcatgc tggtgatggg cggcggtatc atcggtctgg aaatgggtac 2700 cgtataccat gcgctgggtt cagagattga cgtggtggaa atgttcgacc aggttatccc 2760 ggctgccgac aaagacgtgg tgaaagtctt caccaaacgc atcagcaaga aatttaacct 2820 gatgctggaa gccaaagtga ctgccgttga agcgaaagaa gacggtattt acgtttccat 2880 ggaaggtaaa aaagcaccgg cggaagcgca gcgttacgac gcagtgctgg tcgctatcgg 2940 ccgcgtaccg aatggtaaaa acctcgatgc aggtaaagct ggcgtggaag ttgacgatcg 3000 cggcttcatc cgcgttgaca aacaaatgcg caccaacgtg ccgcacatct ttgctatcgg 3060 cgatatcgtc ggtcagccga tgctggcgca caaaggtgtc catgaaggcc acgttgccgc 3120 agaagttatc tccggtctga aacactactt cgatccgaaa gtgatcccat ccatcgccta 3180 cactaaacca gaagtggcat gggtcggtct gaccgagaaa gaagcgaaag agaaaggcat 3240 cagctacgaa accgccacct tcccgtgggc tgcttccggc cgtgctatcg cttctgactg 3300 cgcagatggt atgaccaaac tgatcttcga caaagagacc caccgtgtta tcggcggcgc 3360 gattgtcggc accaacggcg gcgagctgct gggtgagatc ggcctggcta tcgagatggg 3420 ctgtgacgct gaagacatcg ccctgaccat ccacgctcac ccgactctgc acgagtccgt 3480 tggcctggcg gcggaagtgt tcgaaggcag catcaccgac ctgccaaacg ccaaagcgaa 3540 gaaaaagtaa ctttttcttt caggaaaaaa gcataagcgg ctccgggagc cgcttttttt 3600 atgcctgatg tttagaacta tgtcactgtt cataaaccgc tacacctcat acatacttta 3660 agggcgaatt ctgcagatat ccatcacact ggcggccgct cgagcatgca tctagcacat 3720 ccggcaatta aaaaagcggc taaccacgcc gcttttttta cgtctgcaat ttacctttcc 3780 agtcttcttg ctccacgttc agagagacgt tcgcatactg ctgaccgttg ctcgttattc 3840 agcctgacag tatggttact gtcgtttaga cgttgtgggc ggctctcctg aactttctcc 3900 cgaaaaacct gacgttgttc aggtgatgcc gattgaacac gctggcgggc gttatcacgt 3960 tgctgttgat tcagtgggcg ctgctgtact ttttccttaa acacctggcg ctgctctggt 4020 gatgcggact gaatacgctc acgcgctgcg tctcttcgct gctggttctg cgggttagtc 4080 tgcattttct cgcgaaccgc ctggcgctgc tcaggcgagg cggactgaat gcgctcacgc 4140 gctgcctctc ttcgctgctg gatcttcggg ttagtctgca ttctctcgcg aactgcctgg 4200 cgctgctcag gcgaggcgga ctgataacgc tgacgagcgg cgtccttttg ttgctgggtc 4260 agtggttggc gacggctgaa gtcgtggaag tcgtcatagc tcccatagtg ttcagcttca 4320 ttaaaccgct gtgccgctgc ctgacgttgg gtacctcgtg taatgactgg tgcggcgtgt 4380 gttcgttgct gaaactgatt tgctgccgcc tgacgctggc tgtcgcgcgt tggggcaggt 4440 aattgcgtgg cgctcattcc gccgttgaca tcggtttgat gaaaccgctt tgccatatcc 4500 tgatcatgat agggcacacc attacggtag tttggattgt gccgccatgc catattctta 4560 tcagtaagat gctcaccggt gatacggttg aaattgttga cgtcgatatt gatgttgtcg 4620 ccgttgtgtt gccagccatt accgtcacga tgaccgccat cgtggtgatg ataatcat 4678 <210> 82 <211> 1114 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> CDS <222> (323)..(958) <400> 82 caaaaaaccg gagtctgtgc tccggttttt tattatccgc taatcaatta catatgaata 60 tcctccttag ttcctattcc gaagttccta ttctctagaa agtataggaa cttcggcgcg 120 cctacctgtg acggaagatc acttcgcaga ataaataaat cctggtgtcc ctgttgatac 180 cgggaagccc tgggccaact tttggcgaaa atgagacgtt gatcggcacg taagaggttc 240 caactttcac cataatgaaa taagatcact accgggcgta ttttttgagt tgtcgagatt 300 ttcaggagct aaggaagcta aa atg gag aaa aaa atc act gga tat acc acc 352 Met Glu Lys Lys Ile Thr Gly Tyr Thr Thr 1 5 10 gtt gat ata tcc caa tgg cat cgt aaa gaa cat ttt gag gca ttt cag 400 Val Asp Ile Ser Gln Trp His Arg Lys Glu His Phe Glu Ala Phe Gln 15 20 25 tca gtt gct caa tgt acc tat aac cag acc gtt cag ctg gat att acg 448 Ser Val Ala Gln Cys Thr Tyr Asn Gln Thr Val Gln Leu Asp Ile Thr 30 35 40 gcc ttt tta aag acc gta aag aaa aat aag cac aag ttt tat ccg gcc 496 Ala Phe Leu Lys Thr Val Lys Lys Asn Lys His Lys Phe Tyr Pro Ala 45 50 55 ttt att cac att ctt gcc cgc ctg atg aat gct cat ccg gaa tta cgt 544 Phe Ile His Ile Leu Ala Arg Leu Met Asn Ala His Pro Glu Leu Arg 60 65 70 atg gca atg aaa gac ggt gag ctg gtg ata tgg gat agt gtt cac cct 592 Met Ala Met Lys Asp Gly Glu Leu Val Ile Trp Asp Ser Val His Pro 75 80 85 90 tgt tac acc gtt ttc cat gag caa act gaa acg ttt tca tcg ctc tgg 640 Cys Tyr Thr Val Phe His Glu Gln Thr Glu Thr Phe Ser Ser Leu Trp 95 100 105 agt gaa tac cac gac gat ttc cgg cag ttt cta cac ata tat tcg caa 688 Ser Glu Tyr His Asp Asp Phe Arg Gln Phe Leu His Ile Tyr Ser Gln 110 115 120 gat gtg gcg tgt tac ggt gaa aac ctg gcc tat ttc cct aaa ggg ttt 736 Asp Val Ala Cys Tyr Gly Glu Asn Leu Ala Tyr Phe Pro Lys Gly Phe 125 130 135 att gag aat atg ttt ttc gtc tca gcc aat ccc tgg gtg agt ttc acc 784 Ile Glu Asn Met Phe Phe Val Ser Ala Asn Pro Trp Val Ser Phe Thr 140 145 150 agt ttt gat tta aac gtg gcc aat atg gac aac ttc ttc gcc ccc gtt 832 Ser Phe Asp Leu Asn Val Ala Asn Met Asp Asn Phe Phe Ala Pro Val 155 160 165 170 ttc acc atg ggc aaa tat tat acg caa ggc gac aag gtg ctg atg ccg 880 Phe Thr Met Gly Lys Tyr Tyr Thr Gln Gly Asp Lys Val Leu Met Pro 175 180 185 ctg gcg att cag gtt cat cat gcc gtt tgt gat ggc ttc cat gtc ggc 928 Leu Ala Ile Gln Val His His Ala Val Cys Asp Gly Phe His Val Gly 190 195 200 aga tgc tta atg aat aca aca gta ctg cga tgagtggcag ggcggggcgt 978 Arg Cys Leu Met Asn Thr Thr Val Leu Arg 205 210 aaggcgcgcc atttaaatga agttcctatt ccgaagttcc tattctctag aaagtatagg 1038 aacttcgaag cagctccagc ctacaccctt cttcagggct gactgtttgc ataaaaattc 1098 atctgtatgc acaata 1114 <210> 83 <211> 212 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 83 Met Glu Lys Lys Ile Thr Gly Tyr Thr Thr Val Asp Ile Ser Gln Trp 1 5 10 15 His Arg Lys Glu His Phe Glu Ala Phe Gln Ser Val Ala Gln Cys Thr 20 25 30 Tyr Asn Gln Thr Val Gln Leu Asp Ile Thr Ala Phe Leu Lys Thr Val 35 40 45 Lys Lys Asn Lys His Lys Phe Tyr Pro Ala Phe Ile His Ile Leu Ala 50 55 60 Arg Leu Met Asn Ala His Pro Glu Leu Arg Met Ala Met Lys Asp Gly 65 70 75 80 Glu Leu Val Ile Trp Asp Ser Val His Pro Cys Tyr Thr Val Phe His 85 90 95 Glu Gln Thr Glu Thr Phe Ser Ser Leu Trp Ser Glu Tyr His Asp Asp 100 105 110 Phe Arg Gln Phe Leu His Ile Tyr Ser Gln Asp Val Ala Cys Tyr Gly 115 120 125 Glu Asn Leu Ala Tyr Phe Pro Lys Gly Phe Ile Glu Asn Met Phe Phe 130 135 140 Val Ser Ala Asn Pro Trp Val Ser Phe Thr Ser Phe Asp Leu Asn Val 145 150 155 160 Ala Asn Met Asp Asn Phe Phe Ala Pro Val Phe Thr Met Gly Lys Tyr 165 170 175 Tyr Thr Gln Gly Asp Lys Val Leu Met Pro Leu Ala Ile Gln Val His 180 185 190 His Ala Val Cys Asp Gly Phe His Val Gly Arg Cys Leu Met Asn Thr 195 200 205 Thr Val Leu Arg 210 <210> 84 <211> 2521 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 84 ttatttggtg atattggtac caatatcatg cagcaaacgg tgcaacattg ccgtgtctcg 60 ttgctctaaa agccccaggc gttgttgtaa ccagtcgacc agttttatgt catctgccac 120 tgccagagtc gtcagcaatg tcatggctcg ttcgcgtaaa gcttgcagtt gatgttggtc 180 tgccgttgca tcacttttcg ccggttgttg tattaatgtt gctaattgat agcaatagac 240 catcaccgcc tgccccagat tgagcgaagg ataatccgcc accatcggca caccagtaag 300 aacgtcagcc aacgctaact cttcgttagt caacccggaa tcttcgcgac caaacaccag 360 cgcggcatgg ctcatccatg aagatttttc ctctaacagc ggcaccagtt caactggcgt 420 ggcgtagtaa tgatatttcg cccgactgcg cgcagtggtg gcgacagtga aatcgacatc 480 gtgtaacgat tcagccaatg tcgggaaaac tttaatatta tcaataatat caccagatcc 540 atgtgcgacc cagcgggtgg ctggctccag gtgtgcctga ctatcgacaa tccgcagatc 600 gctaaacccc atcgttttca ttgcccgcgc cgctgcccca atattttctg ctctggcggg 660 tgcgaccaga ataatcgtta tacgcatatt gccactcttc ttgatcaaat aaccgcgaac 720 cgggtgatca ctgtcaactt attacgcggt gcgaatttac aaattcttaa cgtaagtcgc 780 agaaaaagcc ctttacttag cttaaaaaag gctaaactat ttcctgactg tactaacggt 840 tgagttgtta aaaaatgcta catatccttc tgtttactta ggataatttt ataaaaaata 900 aatctcgaca attggattca ccacgtttat tagttgtatg atgcaactag ttggattatt 960 aaaataatgt gacgaaagct agcatttaga tacgatgatt tcatcaaact gttaacgtgc 1020 tacaattgaa cttgatatat gtcaacgaag cgtagtttta ttgggtgtcc ggcccctctt 1080 agcctgttat gttgctgtta aaatggttag gatgacagcc gtttttgaca ctgtcgggtc 1140 ctgagggaaa gtacccacga ccaagctaat gatgttgttg acgttgatgg aaagtgcatc 1200 aagaacgcaa ttacgtactt tagtcatgtt acgccgatca tgttaatttg cagcatgcat 1260 caggcaggtc agggactttt gtacttcctg tttcgattta gttggcaatt taggtagcaa 1320 acgaattcat cggctttacc accgtcaaaa aaaacggcgc tttttagcgc cgtttttatt 1380 tttcaacctt atttccagat acgtaactca tcgtccgttg taacttcttt actggctttc 1440 attttcggca gtgaaaacgc ataccagtcg atattacggg tcacaaacat catgccggcc 1500 agcgccacca ccagcacact ggttcccaac aacagcgcgc tatcggcaga gttgagcagt 1560 ccccacatca caccatccag caacaacagc gcgagggtaa acaacatgct gttgcaccaa 1620 cctttcaata ccgcttgcaa ataaataccg ttcattatcg ccccaatcag actggcgatt 1680 atccatgcca cggtaaaacc ggtatgttca gaaagcgcca gcaagagcaa ataaaacatc 1740 accaatgaaa gccccaccag caaatattgc attgggtgta aacgttgcgc ggtgagcgtt 1800 tcaaaaacaa agaacgccat aaaagtcagt gcaatcagca gaatggcgta cttagtcgcc 1860 cggtcagtta attggtattg atcggctggc gtcgttactg cgacgctaaa cgccgggaag 1920 ttttcccagc cggtatcatt gcctgaagca aaacgctcac cgagattatt agcaaaccag 1980 ctgctttgcc agtgcgcctg aaaacctgac tcgctaactt cccgtttggc tggtagaaaa 2040 tcacctaaaa aactgggatg cggccagttg ctggttaagg tcatttcgct attacgcccg 2100 ccaggcacca cagaaagatc gccggtaccg cttaaattca gggccatatt cagcttcagg 2160 ttctgcttcc gccagtcccc ttcaggtaaa gggatatgca cgccctgccc gccttgctct 2220 aacccggtgc cgggttcaat ggtcagcgcc gttccgttaa cttcaggcgc tttcaccaca 2280 ccaataccac gcgcatcccc gacgctaatc acaataaatg gcttgcctaa ggtgatattt 2340 ggcgcgttga gttcgctaag acgcgaaaca tcgaaatcgg cttttaacgt taaatcactg 2400 tgccagacct gaccggtata aatccctatc ttgcgttctt ccacgttctg attgccatca 2460 accatcaatg actcaggtaa ccaaaaatgg ataaaacttc gtttccgctg cagggtttta 2520 t 2521 <210> 85 <211> 3010 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 85 aagccacagc aggatgccca ctgcaacaaa ggtgatcaca ccggaaacgc gatggagaat 60 ggacgctatc gccgtgatgg ggaaccggat ggtctgtagg tccagattaa caggtctttg 120 ttttttcaca tttcttatca tgaataacgc ccacatgctg ttcttattat tccctgggga 180 ctacgggcac agaggttaac tttctgttac ctggagacgt cgggatttcc ttcctccggt 240 ctgcttgcgg gtcagacagc gtcctttcta taactgcgcg tcatgcaaaa cactgcttcc 300 agatgcgaaa acgacacgtt acaacgctgg gtggctcggg attgcagggt gttccggaga 360 cctggcggca gtataggctg ttcacaaaat cattacaatt aacctacata tagtttgtcg 420 ggttttatcc tgaacagtga tccaggtcac gataacaaca tttatttaat ttttaatcat 480 ctaatttgac aatcattcaa caaagttgtt acaaacatta ccaggaaaag catataatgc 540 gtaaaagtta tgaagtcggt atttcaccta agattaactt atgtaacagt gtggaagtat 600 tgaccaattc attcgggaca gttattagtg gtagacaagt ttaataattc ggattgctaa 660 gtacttgatt cgccatttat tcgtcatcaa tggatccttt acctgcaagc gcccagagct 720 ctgtacccag gttttcccct ctttcacaga gcggcgagcc aaataaaaaa cgggtaaagc 780 caggttgatg tgcgaaggca aatttaagtt ccggcagtct tacgcaataa ggcgctaagg 840 agaccttaaa tggctgatac aaaagcaaaa ctcaccctca acggggatac agctgttgaa 900 ctggatgtgc tgaaaggcac gctgggtcaa gatgttattg atatccgtac tctcggttca 960 aaaggtgtgt tcacctttga cccaggcttc acttcaaccg catcctgcga atctaaaatt 1020 acttttattg atggtgatga aggtattttg ctgcaccgcg gtttcccgat cgatcagctg 1080 gcgaccgatt ctaactacct ggaagtttgt tacatcctgc tgaatggtga aaaaccgact 1140 caggaacagt atgacgaatt taaaactacg gtgacccgtc ataccatgat ccacgagcag 1200 attacccgtc tgttccatgc tttccgtcgc gactcgcatc caatggcagt catgtgtggt 1260 attaccggcg cgctggcggc gttctatcac gactcgctgg atgttaacaa tcctcgtcac 1320 cgtgaaattg ccgcgttcct cctgctgtcg aaaatgccga ccatggccgc gatgtgttac 1380 aagtattcca ttggtcagcc atttgtttac ccgcgcaacg atctctccta cgccggtaac 1440 ttcctgaata tgatgttctc cacgccgtgc gaaccgtatg aagttaatcc gattctggaa 1500 cgtgctatgg accgtattct gatcctgcac gctgaccatg aacagaacgc ctctacctcc 1560 accgtgcgta ccgctggctc ttcgggtgcg aacccgtttg cctgtatcgc agcaggtatt 1620 gcttcactgt ggggacctgc gcacggcggt gctaacgaag cggcgctgaa aatgctggaa 1680 gaaatcagct ccgttaaaca cattccggaa tttgttcgtc gtgcgaaaga caaaaatgat 1740 tctttccgcc tgatgggctt cggtcaccgc gtgtacaaaa attacgaccc gcgcgccacc 1800 gtaatgcgtg aaacctgcca tgaagtgctg aaagagctgg gcacgaagga tgacctgctg 1860 gaagtggcta tggagctgga aaacatcgcg ctgaacgacc cgtactttat cgagaagaaa 1920 ctgtacccga acgtcgattt ctactctggt atcatcctga aagcgatggg tattccgtct 1980 tccatgttca ccgtcatttt cgcaatggca cgtaccgttg gctggatcgc ccactggagc 2040 gaaatgcaca gtgacggtat gaagattgcc cgtccgcgtc agctgtatac aggatatgaa 2100 aaacgcgact ttaaaagcga tatcaagcgt taatggttga ttgctaagtt gtaaatattt 2160 taacccgccg ttcatatggc gggttgattt ttatatgcct aaacacaaaa aattgtaaaa 2220 ataaaatcca ttaacagacc tatatagata tttaaaaaga atagaacagc tcaaattatc 2280 agcaacccaa tactttcaat taaaaacttc atggtagtcg catttataac cctatgaaaa 2340 tgacgtctat ctataccccc ctatatttta ttcatcatac aacaaattca tgataccaat 2400 aatttagttt tgcatttaat aaaactaaca atatttttaa gcaaaactaa aaactagcaa 2460 taatcaaata cgatattctg gcgtagctat acccctattc tatatcctta aaggactctg 2520 ttatgtttaa aggacaaaaa acattggccg cactggccgt atctctgctg ttcactgcac 2580 ctgtttatgc tgctgatgaa ggttctggcg aaattcactt taagggggag gttattgaag 2640 caccttgtga aattcatcca gaagatattg ataaaaacat agatcttgga caagtcacga 2700 caacccatat aaaccgggag catcatagca ataaagtggc cgtcgacatt cgcttgatca 2760 actgtgatct gcctgcttct gacaacggta gcggaatgcc ggtatccaaa gttggcgtaa 2820 ccttcgatag cacggctaag acaactggtg ctacgccttt gttgagcaac accagtgcag 2880 gcgaagcaac tggggtcggt gtacgactga tggacaaaaa tgacggtaac atcgtattag 2940 gttcagccgc gccagatctt gacctggatg caagctcatc agaacagacg ctgaactttt 3000 tcgcctggat 3010 <210> 86 <211> 4180 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 86 cgcgatgtcg acgtcacgaa actgaaaaaa ccgctctaca ttctggcgac tgctgatgaa 60 gaaaccagta tggccggagc gcgttatttt gccgaaacta ccgccctgcg cccggattgc 120 gccatcattg gcgaaccgac gtcactacaa ccggtacgcg cacataaagg tcatatctct 180 aacgccatcc gtattcaggg ccagtcgggg cactccagcg atccagcacg cggagttaac 240 gctatcgaac taatgcacga cgccatcggg catattttgc aattgcgcga taacctgaaa 300 gaacgttatc actacgaagc gtttaccgtg ccatacccta cgctcaacct cgggcatatt 360 cacggtggcg acgcttctaa ccgtatttgc gcttgctgtg agttgcatat ggatattcgt 420 ccgctgcctg gcatgacact caatgaactt aatggtttgc tcaacgatgc attggctccg 480 gtgagcgaac gctggccggg tcgtctgacg gtcgacgagc tgcatccgcc gatccctggc 540 tatgaatgcc caccgaatca tcaactggtt gaagtggttg agaaattgct cggagcaaaa 600 accgaagtgg tgaactactg taccgaagcg ccgtttattc aaacgttatg cccgacgctg 660 gtgttggggc ctggctcaat taatcaggct catcaacctg atgaatatct ggaaacacgg 720 tttatcaagc ccacccgcga actgataacc caggtaattc accatttttg ctggcattaa 780 aacgtaggcc ggataaggcg ctcgcgccgc atccggcgct gttgccaaac tccagtgccg 840 caataatgtc ggatgcgatg cttgcgcatc ttatccgacc tacagtgact caaacgatgc 900 ccaaccgtag gccggataag gcgctcgcgc cgcatccggc actgttgcca aactccagtg 960 ccgcaataat gtcggatgcg atacttgcgc atcttatccg accgacagtg actcaaacga 1020 tgcccaactg taggccggat aaggcgctcg cgccgcatcc ggcactgttg ccaaactcca 1080 gtgccgcaat aatgtcggat gcgatacttg cgcatcttat ccgacctaca cctttggtgt 1140 tacttggggc gattttttaa catttccata agttacgctt atttaaagcg tcgtgaattt 1200 aatgacgtaa attcctgcta tttattcgtt tgctgaagcg atttcgcagc atttgacgtc 1260 accgctttta cgtggcttta taaaagacga cgaaaagcaa agcccgagca tattcgcgcc 1320 aatgctagca agaggagaag tcgacatgac agacttaaat aaagtggtaa aagaacttga 1380 agctcttggt atttatgacg taaaagaagt tgtttacaat ccaagctacg agcaattgtt 1440 cgaagaagaa actaaaccag gtttagaagg ctttgaaaaa ggtactttaa ctacgactgg 1500 tgcagtggca gtagatacag gtatcttcac aggtcgttct ccaaaagata aatatatcgt 1560 gttagatgaa aaaaccaaag atactgtttg gtggacatct gaaacagcaa aaaacgacaa 1620 caagccaatg aaccaagcta catggcaaag cttaaaagac ttggtaacca accagctttc 1680 tcgtaaacgc ttatttgtag ttgatggttt ctgtggtgcg agcgaacacg accgtattgc 1740 agtacgtatt gtcactgaag tagcgtggca agcacatttt gtaaaaaata tgtttattcg 1800 cccaactgaa gaacaactca aaaattttga accagatttc gttgtaatga atggttctaa 1860 agtaaccaat ccaaactgga aagaacaagg tttaaattca gaaaactttg ttgctttcaa 1920 cttgactgaa cgcattcaat taatcggtgg tacttggtac ggcggtgaaa tgaaaaaagg 1980 tatgttctca atcatgaact acttcctacc acttaaaggt gttggtgcaa tgcactgctc 2040 agctaacgtt ggtaaagatg gcgatgtagc aatcttcttc ggcttatctg gcacaggtaa 2100 aacaaccctt tcaacggatc caaaacgtga attaatcggt gacgatgaac acggctggga 2160 tgatgtgggt atctttaact ttgaaggtgg ttgctatgcg aaaaccattc acctttcaga 2220 agaaaatgaa ccagatattt accgcgctat ccgtcgcgac gcattattag aaaacgtggt 2280 tgttcgtgca gatggttctg ttgatttcga tgatggttca aaaacagaaa atactcgcgt 2340 gtcttaccca atttatcaca ttgataacat tgtaaaacca gtttctcgtg caggtcacgc 2400 aactaaagtg attttcttaa ctgcagatgc atttggcgta ttaccaccag tatctaaatt 2460 gacaccagaa caaactaaat actacttctt atctggtttc acagcaaaat tagcaggtac 2520 tgaacgtggt attactgaac caactccaac tttctcagca tgtttcggtg ctgcgttctt 2580 aacccttcac ccaactcaat atgcagaagt gttagtaaaa cgtatgcaag cagtgggtgc 2640 tgaagcttac ttagtaaata ctggttggaa tggcacaggc aaacgtatct caatcaaaga 2700 tactcgcgga atcattgatg caatcttaga tggctcaatt gaaaaagctg aaatgggcga 2760 attaccaatc tttaacttag ccattcctaa agcattacca ggtgtagatt ctgcaatctt 2820 agatcctcgc gatacttacg cagataaagc acaatggcaa tcaaaagctg aagacttagc 2880 aggtcgtttt gtgaaaaact ttgttaaata tgcaactaac gaagaaggca aagctttaat 2940 tgcagctggt cctaaagctt aatctagaaa gcttcctaga ggcatcaaat aaaacgaaag 3000 gctcagtcga aagactgggc ctttcgtttt atctgttgtt tgtcggtgaa cgctctcctg 3060 agtaggacga attcacttct gttctaacac cctcgttttc aatatatttc tgtctgcatt 3120 ttattcaaat tctgaatata ccttcagata tccttaagga attgtcgtta cattcggcga 3180 tattttttca agacaggttc ttactatgca ttccacagaa gtccaggcta aacctctttt 3240 tagctggaaa gccctgggtt gggcactgct ctacttttgg tttttctcta ctctgctaca 3300 ggccattatt tacatcagtg gttatagtgg cactaacggc attcgcgact cgctgttatt 3360 cagttcgctg tggttgatcc cggtattcct ctttccgaag cggattaaaa ttattgccgc 3420 agtaatcggc gtggtgctat gggcggcctc tctggcggcg ctgtgctact acgtcatcta 3480 cggtcaggag ttctcgcaga gcgttctgtt tgtgatgttc gaaaccaaca ccaacgaagc 3540 cagcgagtat ttaagccagt atttcagcct gaaaattgtg cttatcgcgc tggcctatac 3600 ggcggtggca gttctgctgt ggacacgcct gcgcccggtc tatattccaa agccgtggcg 3660 ttatgttgtc tcttttgccc tgctttatgg cttgattctg catccgatcg ccatgaatac 3720 gtttatcaaa aacaagccgt ttgagaaaac gttggataac ctggcctcgc gtatggagcc 3780 tgccgcaccg tggcaattcc tgaccggcta ttatcagtat cgtcagcaac taaactcgct 3840 aacaaagtta ctgaatgaaa ataatgcctt gccgccactg gctaatttca aagatgaatc 3900 gggtaacgaa ccgcgcactt tagtgctggt gattggcgag tcgacccagc gcggacgcat 3960 gagtctgtac ggttatccgc gtgaaaccac gccggagctg gatgcgctgc ataaaaccga 4020 tccgaatctg accgtgttta ataacgtagt tacgtctcgt ccgtacacca ttgaaatcct 4080 gcaacaggcg ctgacctttg ccaatgaaaa gaacccggat ctgtatctga cgcagccgtc 4140 gctgatgaac atgatgaaac aggcgggtta taaaaccttc 4180 <210> 87 <211> 4960 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 87 aataggcgta tcacgaggcc ctttcgtctt cacctcgaga attgtgagcg gataacaatt 60 gacattgtga gcggataaca agatactgag cacatcagca ggacgcactg accgaattca 120 attaagctag caagaggaga agtcgagatg aacttacatg aatatcaggc aaaacaactt 180 tttgcccgct atggcttacc agcaccggtg ggttatgcct gtactactcc gcgcgaagca 240 gaagaagccg cttcaaaaat cggtgccggt ccgtgggtag tgaaatgtca ggttcacgct 300 ggtggccgcg gtaaagcggg cggtgtgaaa gttgtaaaca gcaaagaaga catccgtgct 360 tttgcagaaa actggctggg caagcgtctg gtaacgtatc aaacagatgc caatggccaa 420 ccggttaacc agattctggt tgaagcagcg accgatatcg ctaaagagct gtatctcggt 480 gccgttgttg accgtagttc ccgtcgtgtg gtctttatgg cctccaccga aggcggcgtg 540 gaaatcgaaa aagtggcgga agaaactccg cacctgatcc ataaagttgc gcttgatccg 600 ctgactggcc cgatgccgta tcagggacgc gagctggcgt tcaaactggg tctggaaggt 660 aaactggttc agcagttcac caaaatcttc atgggcctgg cgaccatttt cctggagcgc 720 gacctggcgt tgatcgaaat caacccgctg gtcatcacca aacagggcga tctgatttgc 780 ctcgacggca aactgggcgc tgacggcaac gcactgttcc gccagcctga tctgcgcgaa 840 atgcgtgacc agtcgcagga agatccgcgt gaagcacagg ctgcacagtg ggaactgaac 900 tacgttgcgc tggacggtaa catcggttgt atggttaacg gcgcaggtct ggcgatgggt 960 acgatggaca tcgttaaact gcacggcggc gaaccggcta acttccttga cgttggcggc 1020 ggcgcaacca aagaacgtgt aaccgaagcg ttcaaaatca tcctctctga cgacaaagtg 1080 aaagccgttc tggttaacat cttcggcggt atcgttcgtt gcgacctgat cgctgacggt 1140 atcatcggcg cggtagcaga agtgggtgtt aacgtaccgg tcgtggtacg tctggaaggt 1200 aacaacgccg aactcggcgc gaagaaactg gctgacagcg gcctgaatat tattgcagca 1260 aaaggtctga cggatgcagc tcagcaggtt gttgccgcag tggaggggaa ataatgtcca 1320 ttttaatcga taaaaacacc aaggttatct gccagggctt taccggtagc caggggactt 1380 tccactcaga acaggccatt gcatacggca ctaaaatggt tggcggcgta accccaggta 1440 aaggcggcac cacccacctc ggcctgccgg tgttcaacac cgtgcgtgaa gccgttgctg 1500 ccactggcgc taccgcttct gttatctacg taccagcacc gttctgcaaa gactccattc 1560 tggaagccat cgacgcaggc atcaaactga ttatcaccat cactgaaggc atcccgacgc 1620 tggatatgct gaccgtgaaa gtgaagctgg atgaagcagg cgttcgtatg atcggcccga 1680 actgcccagg cgttatcact ccgggtgaat gcaaaatcgg tatccagcct ggtcacattc 1740 acaaaccggg taaagtgggt atcgtttccc gttccggtac actgacctat gaagcggtta 1800 aacagaccac ggattacggt ttcggtcagt cgacctgtgt cggtatcggc ggtgacccga 1860 tcccgggctc taactttatc gacattctcg aaatgttcga aaaagatccg cagaccgaag 1920 cgatcgtgat gatcggtgag atcggcggta gcgctgaaga agaagcagct gcgtacatca 1980 aagagcacgt taccaagcca gttgtgggtt acatcgctgg tgtgactgcg ccgaaaggca 2040 aacgtatggg ccacgcgggt gccatcattg ccggtgggaa agggactgcg gatgagaaat 2100 tcgctgctct ggaagccgca ggcgtgaaaa ccgttcgcag cctggcggat atcggtgaag 2160 cactgaaaac tgttctgaaa taatctagca agaggagaag tcgacatgga aatcaaagaa 2220 atggtgagcc ttgcacgcaa ggctcagaag gagtatcaag ctacccataa ccaagaagca 2280 gttgacaaca tttgccgagc tgcagcaaaa gttatttatg aaaatgcagc tattctggct 2340 cgcgaagcag tagacgaaac cggcatgggc gtttacgaac acaaagtggc caagaatcaa 2400 ggcaaatcca aaggtgtttg gtacaacctc cacaataaaa aatcgattgg tatcctcaat 2460 atagacgagc gtaccggtat gatcgagatt gcaaagccta tcggagttgt aggagccgta 2520 acgccgacga ccaacccgat cgttactccg atgagcaata tcatctttgc tcttaagacc 2580 tgcaatgcca tcattattgc cccccacccc agatccaaaa aatgctctgc acacgcagtt 2640 cgtctgatca aagaagctat cgctccgttc aacgtaccgg aaggtatggt tcagatcatc 2700 gaagaaccca gcatcgagaa gacgcaggaa ctcatgggcg ccgtagacgt agtagttgct 2760 acgggtggta tgggcatggt gaagtctgca tattcttcag gaaagccttc tttcggtgtt 2820 ggagccggta acgttcaggt gatcgtggat agcaacatcg atttcgaagc tgctgcagaa 2880 aaaatcatca ccggtcgtgc tttcgacaac ggtatcatct gctcaggcga acagagcatc 2940 atctacaacg aggctgacaa ggaagcagtt ttcacagcat tccgcaacca cggtgcatat 3000 ttctgtgacg aagccgaagg agatcgggct cgtgcagcta tcttcgaaaa tggagccatc 3060 gcgaaagatg tagtaggtca gagcgttgcc ttcattgcca agaaagcaaa catcaatatc 3120 cccgagggta cccgtattct cgttgttgaa gctcgcggcg taggagcaga agacgttatc 3180 tgtaaggaaa agatgtgtcc cgtaatgtgc gccctcagct acaagcactt cgaagaaggt 3240 gtagaaatcg cacgtacgaa cctcgccaac gaaggtaacg gccacacctg tgctatccac 3300 tccaacaatc aggcacacat catcctcgca ggatcagagc tgacggtatc tcgtatcgta 3360 gtgaatgctc cgagtgccac tacagcaggc ggtcacatcc aaaacggtct tgccgtaacc 3420 aatacgctcg gatgcggatc atggggtaat aactctatct ccgagaactt cacttacaag 3480 cacctcctca acatttcacg catcgcaccg ttgaattcaa gcattcacat ccccgatgac 3540 aaagaaatct gggaactcta atctagcaag aggagaagtc gacatgcaac ttttcaaact 3600 caagagtgta acacatcact ttgacacttt tgcagaattt gccaaggaat tctgtcttgg 3660 agaacgcgac ttggtaatta ccaacgagtt catctatgaa ccgtatatga aggcatgcca 3720 gctcccctgc cattttgtta tgcaggagaa atatgggcaa ggcgagcctt ctgacgaaat 3780 gatgaataac atcttggcag acatccgtaa tatccagttc gaccgcgtaa tcggtatcgg 3840 aggaggtacg gttattgaca tctctaaact tttcgttctg aaaggattaa atgatgtact 3900 cgatgcattc gaccgcaaaa tacctcttat caaagagaaa gaactgatca ttgtgcccac 3960 aacatgcgga acgggtagcg aggtgacgaa catttctatc gcagaaatca aaagccgtca 4020 caccaaaatg ggattggctg acgatgccat tgttgcagac catgccatca tcatacctga 4080 acttctgaag agcttgcctt tccacttcta cgcatgcagt gcaatcgatg ctcttatcca 4140 tgccatcgag tcatacgtat ctcctaaagc cagtccatat tctcgtctgt tcagtgaggc 4200 ggcttgggac attatcctgg aagtattcaa gaaaatcgcc gaacacggcc ctgaataccg 4260 cttcgaaaag ctgggagaaa tgatcatggc cagcaactat gccggtatag ccttcggaaa 4320 tgcaggagta ggagccgtcc acgcactatc ctacccgttg ggaggcaact atcacgtgcc 4380 gcatggagaa gcaaactatc agttcttcac agaggtattc aaagtatacc aaaagaagaa 4440 tcctttcggc tatatagtcg aactcaactg gaagctctcc aagatactga actgccagcc 4500 cgaatacgta tatccgaagc tggatgaact tctcggatgc cttcttacca agaaaccttt 4560 gcacgaatac ggcatgaagg acgaagaggt aagaggcttt gcggaatcag tgcttaagac 4620 acagcaaaga ttgctcgcca acaactacgt agagcttact gtagatgaga tcgaaggtat 4680 ctacagaaga ctctactaat ctagaaagct tcctagaggc atcaaataaa acgaaaggct 4740 cagtcgaaag actgggcctt tcgttttatc tgttgtttgt cggtgaacgc tctcctgagt 4800 aggacaaatc cgccgcccta gacctaggcg ttcggctgcg acacgtcttg agcgattgtg 4860 taggctggag ctgcttcgaa gttcctatac tttctagaga ataggaactt cggaatagga 4920 actaaggagg atattcatat ggaccatggc taattcccat 4960 <210> 88 <211> 5083 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 88 tcgagaaatt tatcaaaaag agtgttgact tgtgagcgga taacaatgat acttagattc 60 aattgtgagc ggataacaat ttcacacaga attcaattaa gctagcaaga ggagaagtcg 120 acatggccaa cataagttca ccattcgggc aaaacgaatg gctggttgaa gagatgtacc 180 gcaagttccg cgacgacccc tcctcggtcg atcccagctg gcacgagttc ctggttgact 240 acagccccga acccacctcc caaccagctg ccgaaccaac ccgggttacc tcgccactcg 300 ttgccgagcg ggccgctgcg gccgccccgc aggcaccccc caagccggcc gacaccgcgg 360 ccgcgggcaa cggcgtggtc gccgcactgg ccgccaaaac tgccgttccc ccgccagccg 420 aaggtgacga ggtagcggtg ctgcgcggcg ccgccgcggc cgtcgtcaag aacatgtccg 480 cgtcgttgga ggtgccgacg gcgaccagcg tccgggcggt cccggccaag ctactgatcg 540 acaaccggat cgtcatcaac aaccagttga agcggacccg cggcggcaag atctcgttca 600 cgcatttgct gggctacgcc ctggtgcagg cggtgaagaa attcccgaac atgaaccggc 660 actacaccga agtcgacggc aagcccaccg cggtcacgcc ggcgcacacc aatctcggcc 720 tggcgatcga cctgcaaggc aaggacggga agcgttccct ggtggtggcc ggcatcaagc 780 ggtgcgagac catgcgattc gcgcagttcg tcacggccta cgaagacatc gtacgccggg 840 cccgcgacgg caagctgacc actgaagact ttgccggcgt gacgatttcg ctgaccaatc 900 ccggaaccat cggcaccgtg cattcggtgc cgcggctgat gcccggccag ggcgccatca 960 tcggcgtggg cgccatggaa taccccgccg agtttcaagg cgccagcgag gaacgcatcg 1020 ccgagctggg catcggcaaa ttgatcactt tgacctccac ctacgaccac cgcatcatcc 1080 agggcgcgga atcgggcgac ttcctgcgca ccatccacga gttgctgctc tcggatggct 1140 tctgggacga ggtcttccgc gaactgagca tcccatatct gccggtgcgc tggagcaccg 1200 acaaccccga ctcgatcgtc gacaagaacg ctcgcgtcat gaacttgatc gcggcctacc 1260 gcaaccgcgg ccatctgatg gccgataccg acccgctgcg gttggacaaa gctcggttcc 1320 gcagtcaccc cgacctcgaa gtgctgaccc acggcctgac gctgtgggat ctcgatcggg 1380 tgttcaaggt cgacggcttt gccggtgcgc agtacaagaa actgcgcgac gtgctgggct 1440 tgctgcgcga tgcctactgc cgccacatcg gcgtggagta cgcccatatc ctcgaccccg 1500 aacaaaagga gtggctcgaa caacgggtcg agaccaagca cgtcaaaccc actgtggccc 1560 aacagaaata catcctcagc aagctcaacg ccgccgaggc ctttgaaacg ttcctacaga 1620 ccaagtacgt cggccagaag cggttctcgc tggaaggcgc cgaaagcgtg atcccgatga 1680 tggacgcggc gatcgaccag tgcgctgagc acggcctcga cgaggtggtc atcgggatgc 1740 cgcaccgggg ccggctcaac gtgctggcca acatcgtcgg caagccgtac tcgcagatct 1800 tcaccgagtt cgagggcaac ctgaatccgt cgcaggcgca cggctccggt gacgtcaagt 1860 accacctggg cgccaccggg ctgtacctgc agatgttcgg cgacaacgac attcaggtgt 1920 cgctgaccgc caacccgtcg catctggagg ccgtcgaccc ggtgctggag ggattggtgc 1980 gggccaagca ggatctgctc gaccacggaa gcatcgacag cgacggccaa cgggcgttct 2040 cggtggtgcc gctgatgttg catggcgatg ccgcgttcgc cggtcagggt gtggtcgccg 2100 agacgctgaa cctggcgaat ctgccgggct accgcgtcgg cggcaccatc cacatcatcg 2160 tcaacaacca gatcggcttc accaccgcgc ccgagtattc caggtccagc gagtactgca 2220 ccgacgtcgc aaagatgatc ggggcaccga tctttcacgt caacggcgac gacccggagg 2280 cgtgtgtctg ggtggcgcgg ttggcggtgg acttccgaca acggttcaag aaggacgtcg 2340 tcatcgacat gctgtgctac cgccgccgcg ggcacaacga gggtgacgac ccgtcgatga 2400 ccaaccccta catgtacgac gtcgtcgaca ccaagcgcgg ggcccgcaaa agctacaccg 2460 aagccctgat cggacgtggc gacatctcga tgaaggaggc cgaggacgcg ctgcgcgact 2520 accagggcca gctggaacgg gtgttcaacg aagtgcgcga gctggagaag cacggtgtgc 2580 agccgagcga gtcggtcgag tccgaccaga tgattcccgc ggggctggcc actgcggtgg 2640 acaagtcgct gctggcccgg atcggcgatg cgttcctcgc cttgccgaac ggcttcaccg 2700 cgcacccgcg agtccaaccg gtgctggaga agcgccggga gatggcctat gaaggcaaga 2760 tcgactgggc ctttggcgag ctgctggcgc tgggctcgct ggtggccgaa ggcaagctgg 2820 tgcgcttgtc ggggcaggac agccgccgcg gcaccttctc ccagcggcat tcggttctca 2880 tcgaccgcca cactggcgag gagttcacac cactgcagct gctggcgacc aactccgacg 2940 gcagcccgac cggcggaaag ttcctggtct acgactcgcc actgtcggag tacgccgccg 3000 tcggcttcga gtacggctac actgtgggca atccggacgc cgtggtgctc tgggaggcgc 3060 agttcggcga cttcgtcaac ggcgcacagt cgatcatcga cgagttcatc agctccggtg 3120 aggccaagtg gggccaattg tccaacgtcg tgctgctgtt accgcacggg cacgaggggc 3180 agggacccga ccacacttct gcccggatcg aacgcttctt gcagttgtgg gcggaaggtt 3240 cgatgaccat cgcgatgccg tcgactccgt cgaactactt ccacctgcta cgccggcatg 3300 ccctggacgg catccaacgc ccgctgatcg tgttcacgcc caagtcgatg ttgcgtcaca 3360 aggccgccgt cagcgaaatc aaggacttca ccgagatcaa gttccgctca gtgctggagg 3420 aacccaccta tgaggacggc atcggagacc gcaacaaggt cagccggatc ctgctgacca 3480 gtggcaagct gtattacgag ctggccgccc gcaaggccaa ggacaaccgc aatgacctcg 3540 cgatcgtgcg gcttgaacag ctcgccccgc tgcccaggcg tcgactgcgt gaaacgctgg 3600 accgctacga gaacgtcaag gagttcttct gggtccaaga ggaaccggcc aaccagggtg 3660 cgtggccgcg attcgggctc gaactacccg agctgctgcc tgacaagttg gccgggatca 3720 agcgaatctc gcgccgggcg atgtcagccc cgtcgtcagg ctcgtcgaag gtgcacgccg 3780 tcgaacagca ggagatcctc gacgaggcgt tcggctaatc tagcaagagg agaagtcgac 3840 atgaagttat taaaattggc acctgatgtt tataaatttg atactgcaga ggagtttatg 3900 aaatacttta aggttggaaa aggtgacttt atacttacta atgaattttt atataaacct 3960 ttccttgaga aattcaatga tggtgcagat gctgtatttc aggagaaata tggactcggt 4020 gaaccttctg atgaaatgat aaacaatata attaaggata ttggagataa acaatataat 4080 agaattattg ctgtaggggg aggatctgta atagatatag ccaaaatcct cagtcttaag 4140 tatactgatg attcattgga tttgtttgag ggaaaagtac ctcttgtaaa aaacaaagaa 4200 ttaattatag ttccaactac atgtggaaca ggttcagaag ttacaaatgt atcagttgca 4260 gaattaaaga gaagacatac taaaaaagga attgcttcag acgaattata tgcaacttat 4320 gcagtacttg taccagaatt tataaaagga cttccatata agttttttgt aaccagctcc 4380 gtagatgcct taatacatgc aacagaagct tatgtatctc caaatgcaaa tccttatact 4440 gatatgttta gtgtaaaagc tatggagtta attttaaatg gatacatgca aatggtagag 4500 aaaggaaatg attacagagt tgaaataatt gaggattttg ttataggcag caattatgca 4560 ggtatagctt ttggaaatgc aggagtggga gcggttcacg cactctcata tccaataggc 4620 ggaaattatc atgtgcctca tggagaagca aattatctgt tttttacaga aatatttaaa 4680 acttattatg agaaaaatcc aaatggcaag attaaagatg taaataaact attagcaggc 4740 atactaaaat gtgatgaaag tgaagcttat gacagtttat cacaactttt agataaatta 4800 ttgtcaagaa aaccattaag agaatatgga atgaaagagg aagaaattga aacttttgct 4860 gattcagtaa tagaaggaca gcagagactg ttggtaaaca attatgaacc tttttcaaga 4920 gaagacatag taaacacata taaaaagtta tattaatcta gaaagcttcc tagaggcatc 4980 aaataaaacg aaaggctcag tcgaaagact gggcctttcg ttttatctgt tgtttgtcgg 5040 tgaacgctct cctgagtagg acaaatccgc cgccctagac cta 5083 <210> 89 <211> 5097 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 89 tctgtatcag gctgaaaatc ttctctcatc cgccaaaaca gcttcggcgt taagatgcgc 60 gctcaaggac gtaagccgtc gactctcgcc gtgctggcgc aggacacggc taccactcct 120 ttctctgttg atattctgct tgccattgag caaaccgcca gcgagttcgg ctggaatagt 180 tttttaatca atattttttc tgaagatgac gctgcccgcg cggcacgtca gctgcttgcc 240 caccgtccgg atggcattat ctatactaca atggggctgc gacatatcac gctgcctgag 300 tctctgtatg gtgaaaatat tgtattggcg aactgtgtgg cggatgaccc agcgttaccc 360 agttatatcc ctgatgatta cactgcacaa tatgaatcaa cacagcattt gctcgcggcg 420 ggctatcgtc aaccgttatg cttctggcta ccggaaagtg cgttggcaac agggtatcgt 480 cggcagggat ttgagcaggc ctggcgtgat gctggacgag atctggctga ggtgaaacaa 540 tttcacatgg caacaggtga tgatcactac accgatctcg caagtttact caatgcccac 600 ttcaaaccgg gcaaaccaga ttttgatgtt ctgatatgtg gtaacgatcg cgcagccttt 660 gtggcttatc aggttcttct ggcgaagggg gtacgaatcc cgcaggatgt cgccgtaatg 720 ggctttgata atctggttgg cgtcgggcat ctgtttttac cgccgctgac cacaattcag 780 cttccacatg acattatcgg gcgggaagct gcattgcata ttattgaagg tcgtgaaggg 840 ggaagagtga cgcggatccc ttgcccgctg ttgatccgtt gttccacctg atattatgtt 900 aacccagtag ccagagtgct ccatgttgca gcacagccac tccgtgggag gcataaagcg 960 acagttcccg ttcttctggc tgcggataga ttcgactact catcaccgct tccccgtcgt 1020 taataaatac ttccacggat gatgtatcga taaatatcct tagggcgagc gtgtcacgct 1080 gcgggagggg aatactacgg tagccgtcta aattctcgtg tgggtaatac cgccacaaaa 1140 caagtcgctc agattggtta tcaatataca gccgcattcc agtgccgagc tgtaatccgt 1200 aatgttcggc atcactgttc ttcagcgccc actgcaactg aatctcaact gcttgcgcgt 1260 tttcctgcaa aacatattta ttgctgattg tgcggggaga gacagattga tgctgctggc 1320 gtaacgactc agcttcgtgt accgggcgtt gtagaagttt gccattgctc tctgatagct 1380 cgcgcgccag cgtcatgcag cctgcccatc cttcacgttt tgagggcatt ggcgattccc 1440 acatatccat ccagccgata acaatacgcc gaccatcctt cgctaaaaag ctttgtggtg 1500 cataaaagtc atgcccgtta tcaagttcag taaaatgccc ggattgtgca aaaagtcgtc 1560 ctggcgacca cattccgggt attacgccac tttgaaagcg atttcggtaa ctgtatccct 1620 cggcattcat tccctgcggg gaaaacatca gataatgctg atcgccaagg ctgaaaaagt 1680 ccggacattc ccacatatag ctttcacccg catcagcgtg ggccagtacg cgatcgaagg 1740 tccattcacg caacgaactg ccgcgataaa gcaggatctg ccccgtgttg cctggatctt 1800 tcgccccgac taccatccac catgtgtcgg cttcacgcca cactttagga tcgcggaagt 1860 gcatgattcc ttctggtgga gtgaggatca caccctgttt ctcgaaatga ataccatccc 1920 gactggtagc cagacattgt acttcgcgaa ttgcatcgtc attacctgca ccatcgagcc 1980 agacgtgtcc ggtgtagata agtgagagga caccattgtc atcgacagca ctacctgaaa 2040 aacacccgtc tttgtcatta tcgtctcctg gcgctagcgc aataggctca tgctgccagt 2100 ggatcatatc gtcgctggtg gcatgtcccc agtgcattgg cccccagtgt tcgctcatcg 2160 gatgatgttg ataaaacgcg tgataacgat cgttaaacca gatcaggccg tttggatcgt 2220 tcatccaccc ggcaggaggc gcgaggtgaa aatggggata gaaagtgtta ccccggtgct 2280 catgaagttt tgctagggcg ttttgcgccg catgcaatcg agattgcgtc attttaatca 2340 tcctggttaa gcaaatttgg tgaattgtta acgttaactt ttataaaaat aaagtccctt 2400 actttcataa atgcgatgaa tatcacaaat gttaacgtta actatgacgt tttgtgatcg 2460 aatatgcatg ttttagtaaa tccatgacga ttttgcgaaa aagaggttta tcactatgcg 2520 taactcagat gaatttaagg gaaaaaaatg tcagccaaag tatgggtttt aggggatgcg 2580 gtcgtagatc tcttgccaga atcagacggg cgcctactgc cttgtcctgg cggcgcgcca 2640 gctaacgttg cggtgggaat cgccagatta ggcggaacaa gtgggtttat aggtcgggtg 2700 ggggatgatc cttttggtgc gttaatgcaa agaacgctgc taactgaggg agtcgatatc 2760 acgtatctga agcaagatga atggcaccgg acatccacgg tgcttgtcga tctgaacgat 2820 caaggggaac gttcatttac gtttatggtc cgccccagtg ccgatctttt tttagagacg 2880 acagacttgc cctgctggcg acatggcgaa tggttacatc tctgttcaat tgcgttgtct 2940 gccgagcctt cgcgtaccag cgcatttact gcgatgacgg cgatccggca tgccggaggt 3000 tttgtcagct tcgatcctaa tattcgtgaa gatctatggc aagacgagca tttgctccgc 3060 ttgtgtttgc ggcaggcgct acaactggcg gatgtcgtca agctctcgga agaagaatgg 3120 cgacttatca gtggaaaaac acagaacgat caggatatat gcgccctggc aaaagagtat 3180 gagatcgcca tgctgttggt gactaaaggt gcagaagggg tggtggtctg ttatcgagga 3240 caagttcacc attttgctgg aatgtctgtg aattgtgtcg atagcacggg ggcgggagat 3300 gcgttcgttg ccgggttact cacaggtctg tcctctacgg gattatctac agatgagaga 3360 gaaatgcgac gaattatcga tctcgctcaa cgttgcggag cgcttgcagt aacggcgaaa 3420 ggggcaatga cagcgctgcc atgtcgacaa gaactggaat agtgagaagt aaacggcgaa 3480 gtcgctctta tctctaaata ggacgtgaat tttttaacga caggcaggta attatggcac 3540 tgaatattcc attcagaaat gcgtactatc gttttgcatc cagttactca tttctctttt 3600 ttatttcctg gtcgctgtgg tggtcgttat acgctatttg gctgaaagga catctagggt 3660 tgacagggac ggaattaggt acactttatt cggtcaacca gtttaccagc attctattta 3720 tgatgttcta cggcatcgtt caggataaac tcggtctgaa gaaaccgctc atctggtgta 3780 tgagtttcat cctggtcttg accggaccgt ttatgattta cgtttatgaa ccgttactgc 3840 aaagcaattt ttctgtaggt ctaattctgg gggcgctatt ttttggcttg gggtatctgg 3900 cgggatgcgg tttgcttgat agcttcaccg aaaaaatggc gcgaaatttt catttcgaat 3960 atggaacagc gcgcgcctgg ggatcttttg gctatgctat tggcgcgttc tttgccggca 4020 tattttttag tatcagtccc catatcaact tctggttggt ctcgctattt ggcgctgtat 4080 ttatgatgat caacatgcgt tttaaagata aggatcacca gtgcgtagcg gcagatgcgg 4140 gaggggtaaa aaaagaggat tttatcgcag ttttcaagga tcgaaacttc tgggttttcg 4200 tcatatttat tgtggggacg tggtctttct ataacatttt tgatcaacaa ctttttcctg 4260 tcttttattc aggtttattc gaatcacacg atgtaggaac gcgcctgtat ggttatctca 4320 actcattcca ggtggtactc gaagcgctgt gcatggcgat tattcctttc tttgtgaatc 4380 gggtagggcc aaaaaatgca ttacttatcg gagttgtgat tatggcgttg cgtatccttt 4440 cctgcgcgct gttcgttaac ccctggatta tttcattagt gaagttgtta catgccattg 4500 aggttccact ttgtgtcata tccgtcttca aatacagcgt ggcaaacttt gataagcgcc 4560 tgtcgtcgac gatctttctg attggttttc aaattgccag ttcgcttggg attgtgctgc 4620 tttcaacgcc gactgggata ctctttgacc acgcaggcta ccagacagtt ttcttcgcaa 4680 tttcgggtat tgtctgcctg atgttgctat ttggcatttt cttcttgagt aaaaaacgcg 4740 agcaaatagt tatggaaacg cctgtacctt cagcaatata gacgtaaact ttttccggtt 4800 gttgtcgata gctctatatc cctcaaccgg aaaataataa tagtaaaatg cttagccctg 4860 ctaataatcg cctaatccaa acgcctcatt catgttctgg tacagtcgct caaatgtact 4920 tcagatgcgc ggttcgctga tttccaggac attgtcgtca ttcagtgacc tgtcccgtgt 4980 atcacggtcc tgcgaattca tcaaggaatg cattgcggag tgaagtatcg agtcacgcca 5040 tatttcgtca cccgaagatg agttttgaga tattaaggca ggtgactttc actcaca 5097 <210> 90 <211> 3525 <212> DNA <213> Nocardia iowensis <400> 90 atggcagtgg attcaccgga tgagcggcta cagcgccgca ttgcacagtt gtttgcagaa 60 gatgagcagg tcaaggccgc acgtccgctc gaagcggtga gcgcggcggt gagcgcgccc 120 ggtatgcggc tggcgcagat cgccgccact gttatggcgg gttacgccga ccgcccggcc 180 gccgggcagc gtgcgttcga actgaacacc gacgacgcga cgggccgcac ctcgctgcgg 240 ttacttcccc gattcgagac catcacctat cgcgaactgt ggcagcgagt cggcgaggtt 300 gccgcggcct ggcatcatga tcccgagaac cccttgcgcg caggtgattt cgtcgccctg 360 ctcggcttca ccagcatcga ctacgccacc ctcgacctgg ccgatatcca cctcggcgcg 420 gttaccgtgc cgttgcaggc cagcgcggcg gtgtcccagc tgatcgctat cctcaccgag 480 acttcgccgc ggctgctcgc ctcgaccccg gagcacctcg atgcggcggt cgagtgccta 540 ctcgcgggca ccacaccgga acgactggtg gtcttcgact accaccccga ggacgacgac 600 cagcgtgcgg ccttcgaatc cgcccgccgc cgccttgccg acgcgggcag cttggtgatc 660 gtcgaaacgc tcgatgccgt gcgtgcccgg ggccgcgact taccggccgc gccactgttc 720 gttcccgaca ccgacgacga cccgctggcc ctgctgatct acacctccgg cagcaccgga 780 acgccgaagg gcgcgatgta caccaatcgg ttggccgcca cgatgtggca ggggaactcg 840 atgctgcagg ggaactcgca acgggtcggg atcaatctca actacatgcc gatgagccac 900 atcgccggtc gcatatcgct gttcggcgtg ctcgctcgcg gtggcaccgc atacttcgcg 960 gccaagagcg acatgtcgac actgttcgaa gacatcggct tggtacgtcc caccgagatc 1020 ttcttcgtcc cgcgcgtgtg cgacatggtc ttccagcgct atcagagcga gctggaccgg 1080 cgctcggtgg cgggcgccga cctggacacg ctcgatcggg aagtgaaagc cgacctccgg 1140 cagaactacc tcggtgggcg cttcctggtg gcggtcgtcg gcagcgcgcc gctggccgcg 1200 gagatgaaga cgttcatgga gtccgtcctc gatctgccac tgcacgacgg gtacgggtcg 1260 accgaggcgg gcgcaagcgt gctgctcgac aaccagatcc agcggccgcc ggtgctcgat 1320 tacaagctcg tcgacgtgcc cgaactgggt tacttccgca ccgaccggcc gcatccgcgc 1380 ggtgagctgt tgttgaaggc ggagaccacg attccgggct actacaagcg gcccgaggtc 1440 accgcggaga tcttcgacga ggacggcttc tacaagaccg gcgatatcgt ggccgagctc 1500 gagcacgatc ggctggtcta tgtcgaccgt cgcaacaatg tgctcaaact gtcgcagggc 1560 gagttcgtga ccgtcgccca tctcgaggcc gtgttcgcca gcagcccgct gatccggcag 1620 atcttcatct acggcagcag cgaacgttcc tatctgctcg cggtgatcgt ccccaccgac 1680 gacgcgctgc gcggccgcga caccgccacc ttgaaatcgg cactggccga atcgattcag 1740 cgcatcgcca aggacgcgaa cctgcagccc tacgagattc cgcgcgattt cctgatcgag 1800 accgagccgt tcaccatcgc caacggactg ctctccggca tcgcgaagct gctgcgcccc 1860 aatctgaagg aacgctacgg cgctcagctg gagcagatgt acaccgatct cgcgacaggc 1920 caggccgatg agctgctcgc cctgcgccgc gaagccgccg acctgccggt gctcgaaacc 1980 gtcagccggg cagcgaaagc gatgctcggc gtcgcctccg ccgatatgcg tcccgacgcg 2040 cacttcaccg acctgggcgg cgattccctt tccgcgctgt cgttctcgaa cctgctgcac 2100 gagatcttcg gggtcgaggt gccggtgggt gtcgtcgtca gcccggcgaa cgagctgcgc 2160 gatctggcga attacattga ggcggaacgc aactcgggcg cgaagcgtcc caccttcacc 2220 tcggtgcacg gcggcggttc cgagatccgc gccgccgatc tgaccctcga caagttcatc 2280 gatgcccgca ccctggccgc cgccgacagc attccgcacg cgccggtgcc agcgcagacg 2340 gtgctgctga ccggcgcgaa cggctacctc ggccggttcc tgtgcctgga atggctggag 2400 cggctggaca agacgggtgg cacgctgatc tgcgtcgtgc gcggtagtga cgcggccgcg 2460 gcccgtaaac ggctggactc ggcgttcgac agcggcgatc ccggcctgct cgagcactac 2520 cagcaactgg ccgcacggac cctggaagtc ctcgccggtg atatcggcga cccgaatctc 2580 ggtctggacg acgcgacttg gcagcggttg gccgaaaccg tcgacctgat cgtccatccc 2640 gccgcgttgg tcaaccacgt ccttccctac acccagctgt tcggccccaa tgtcgtcggc 2700 accgccgaaa tcgtccggtt ggcgatcacg gcgcggcgca agccggtcac ctacctgtcg 2760 accgtcggag tggccgacca ggtcgacccg gcggagtatc aggaggacag cgacgtccgc 2820 gagatgagcg cggtgcgcgt cgtgcgcgag agttacgcca acggctacgg caacagcaag 2880 tgggcggggg aggtcctgct gcgcgaagca cacgatctgt gtggcttgcc ggtcgcggtg 2940 ttccgttcgg acatgatcct ggcgcacagc cggtacgcgg gtcagctcaa cgtccaggac 3000 gtgttcaccc ggctgatcct cagcctggtc gccaccggca tcgcgccgta ctcgttctac 3060 cgaaccgacg cggacggcaa ccggcagcgg gcccactatg acggcttgcc ggcggacttc 3120 acggcggcgg cgatcaccgc gctcggcatc caagccaccg aaggcttccg gacctacgac 3180 gtgctcaatc cgtacgacga tggcatctcc ctcgatgaat tcgtcgactg gctcgtcgaa 3240 tccggccacc cgatccagcg catcaccgac tacagcgact ggttccaccg tttcgagacg 3300 gcgatccgcg cgctgccgga aaagcaacgc caggcctcgg tgctgccgtt gctggacgcc 3360 taccgcaacc cctgcccggc ggtccgcggc gcgatactcc cggccaagga gttccaagcg 3420 gcggtgcaaa cagccaaaat cggtccggaa caggacatcc cgcatttgtc cgcgccactg 3480 atcgataagt acgtcagcga tctggaactg cttcagctgc tctaa 3525 <210> 91 <211> 1174 <212> PRT <213> Nocardia iowensis <400> 91 Met Ala Val Asp Ser Pro Asp Glu Arg Leu Gln Arg Arg Ile Ala Gln 1 5 10 15 Leu Phe Ala Glu Asp Glu Gln Val Lys Ala Ala Arg Pro Leu Glu Ala 20 25 30 Val Ser Ala Ala Val Ser Ala Pro Gly Met Arg Leu Ala Gln Ile Ala 35 40 45 Ala Thr Val Met Ala Gly Tyr Ala Asp Arg Pro Ala Ala Gly Gln Arg 50 55 60 Ala Phe Glu Leu Asn Thr Asp Asp Ala Thr Gly Arg Thr Ser Leu Arg 65 70 75 80 Leu Leu Pro Arg Phe Glu Thr Ile Thr Tyr Arg Glu Leu Trp Gln Arg 85 90 95 Val Gly Glu Val Ala Ala Ala Trp His His Asp Pro Glu Asn Pro Leu 100 105 110 Arg Ala Gly Asp Phe Val Ala Leu Leu Gly Phe Thr Ser Ile Asp Tyr 115 120 125 Ala Thr Leu Asp Leu Ala Asp Ile His Leu Gly Ala Val Thr Val Pro 130 135 140 Leu Gln Ala Ser Ala Ala Val Ser Gln Leu Ile Ala Ile Leu Thr Glu 145 150 155 160 Thr Ser Pro Arg Leu Leu Ala Ser Thr Pro Glu His Leu Asp Ala Ala 165 170 175 Val Glu Cys Leu Leu Ala Gly Thr Thr Pro Glu Arg Leu Val Val Phe 180 185 190 Asp Tyr His Pro Glu Asp Asp Asp Gln Arg Ala Ala Phe Glu Ser Ala 195 200 205 Arg Arg Arg Leu Ala Asp Ala Gly Ser Leu Val Ile Val Glu Thr Leu 210 215 220 Asp Ala Val Arg Ala Arg Gly Arg Asp Leu Pro Ala Ala Pro Leu Phe 225 230 235 240 Val Pro Asp Thr Asp Asp Asp Pro Leu Ala Leu Leu Ile Tyr Thr Ser 245 250 255 Gly Ser Thr Gly Thr Pro Lys Gly Ala Met Tyr Thr Asn Arg Leu Ala 260 265 270 Ala Thr Met Trp Gln Gly Asn Ser Met Leu Gln Gly Asn Ser Gln Arg 275 280 285 Val Gly Ile Asn Leu Asn Tyr Met Pro Met Ser His Ile Ala Gly Arg 290 295 300 Ile Ser Leu Phe Gly Val Leu Ala Arg Gly Gly Thr Ala Tyr Phe Ala 305 310 315 320 Ala Lys Ser Asp Met Ser Thr Leu Phe Glu Asp Ile Gly Leu Val Arg 325 330 335 Pro Thr Glu Ile Phe Phe Val Pro Arg Val Cys Asp Met Val Phe Gln 340 345 350 Arg Tyr Gln Ser Glu Leu Asp Arg Arg Ser Val Ala Gly Ala Asp Leu 355 360 365 Asp Thr Leu Asp Arg Glu Val Lys Ala Asp Leu Arg Gln Asn Tyr Leu 370 375 380 Gly Gly Arg Phe Leu Val Ala Val Val Gly Ser Ala Pro Leu Ala Ala 385 390 395 400 Glu Met Lys Thr Phe Met Glu Ser Val Leu Asp Leu Pro Leu His Asp 405 410 415 Gly Tyr Gly Ser Thr Glu Ala Gly Ala Ser Val Leu Leu Asp Asn Gln 420 425 430 Ile Gln Arg Pro Pro Val Leu Asp Tyr Lys Leu Val Asp Val Pro Glu 435 440 445 Leu Gly Tyr Phe Arg Thr Asp Arg Pro His Pro Arg Gly Glu Leu Leu 450 455 460 Leu Lys Ala Glu Thr Thr Ile Pro Gly Tyr Tyr Lys Arg Pro Glu Val 465 470 475 480 Thr Ala Glu Ile Phe Asp Glu Asp Gly Phe Tyr Lys Thr Gly Asp Ile 485 490 495 Val Ala Glu Leu Glu His Asp Arg Leu Val Tyr Val Asp Arg Arg Asn 500 505 510 Asn Val Leu Lys Leu Ser Gln Gly Glu Phe Val Thr Val Ala His Leu 515 520 525 Glu Ala Val Phe Ala Ser Ser Pro Leu Ile Arg Gln Ile Phe Ile Tyr 530 535 540 Gly Ser Ser Glu Arg Ser Tyr Leu Leu Ala Val Ile Val Pro Thr Asp 545 550 555 560 Asp Ala Leu Arg Gly Arg Asp Thr Ala Thr Leu Lys Ser Ala Leu Ala 565 570 575 Glu Ser Ile Gln Arg Ile Ala Lys Asp Ala Asn Leu Gln Pro Tyr Glu 580 585 590 Ile Pro Arg Asp Phe Leu Ile Glu Thr Glu Pro Phe Thr Ile Ala Asn 595 600 605 Gly Leu Leu Ser Gly Ile Ala Lys Leu Leu Arg Pro Asn Leu Lys Glu 610 615 620 Arg Tyr Gly Ala Gln Leu Glu Gln Met Tyr Thr Asp Leu Ala Thr Gly 625 630 635 640 Gln Ala Asp Glu Leu Leu Ala Leu Arg Arg Glu Ala Ala Asp Leu Pro 645 650 655 Val Leu Glu Thr Val Ser Arg Ala Ala Lys Ala Met Leu Gly Val Ala 660 665 670 Ser Ala Asp Met Arg Pro Asp Ala His Phe Thr Asp Leu Gly Gly Asp 675 680 685 Ser Leu Ser Ala Leu Ser Phe Ser Asn Leu Leu His Glu Ile Phe Gly 690 695 700 Val Glu Val Pro Val Gly Val Val Val Ser Pro Ala Asn Glu Leu Arg 705 710 715 720 Asp Leu Ala Asn Tyr Ile Glu Ala Glu Arg Asn Ser Gly Ala Lys Arg 725 730 735 Pro Thr Phe Thr Ser Val His Gly Gly Gly Ser Glu Ile Arg Ala Ala 740 745 750 Asp Leu Thr Leu Asp Lys Phe Ile Asp Ala Arg Thr Leu Ala Ala Ala 755 760 765 Asp Ser Ile Pro His Ala Pro Val Pro Ala Gln Thr Val Leu Leu Thr 770 775 780 Gly Ala Asn Gly Tyr Leu Gly Arg Phe Leu Cys Leu Glu Trp Leu Glu 785 790 795 800 Arg Leu Asp Lys Thr Gly Gly Thr Leu Ile Cys Val Val Arg Gly Ser 805 810 815 Asp Ala Ala Ala Ala Arg Lys Arg Leu Asp Ser Ala Phe Asp Ser Gly 820 825 830 Asp Pro Gly Leu Leu Glu His Tyr Gln Gln Leu Ala Ala Arg Thr Leu 835 840 845 Glu Val Leu Ala Gly Asp Ile Gly Asp Pro Asn Leu Gly Leu Asp Asp 850 855 860 Ala Thr Trp Gln Arg Leu Ala Glu Thr Val Asp Leu Ile Val His Pro 865 870 875 880 Ala Ala Leu Val Asn His Val Leu Pro Tyr Thr Gln Leu Phe Gly Pro 885 890 895 Asn Val Val Gly Thr Ala Glu Ile Val Arg Leu Ala Ile Thr Ala Arg 900 905 910 Arg Lys Pro Val Thr Tyr Leu Ser Thr Val Gly Val Ala Asp Gln Val 915 920 925 Asp Pro Ala Glu Tyr Gln Glu Asp Ser Asp Val Arg Glu Met Ser Ala 930 935 940 Val Arg Val Val Arg Glu Ser Tyr Ala Asn Gly Tyr Gly Asn Ser Lys 945 950 955 960 Trp Ala Gly Glu Val Leu Leu Arg Glu Ala His Asp Leu Cys Gly Leu 965 970 975 Pro Val Ala Val Phe Arg Ser Asp Met Ile Leu Ala His Ser Arg Tyr 980 985 990 Ala Gly Gln Leu Asn Val Gln Asp Val Phe Thr Arg Leu Ile Leu Ser 995 1000 1005 Leu Val Ala Thr Gly Ile Ala Pro Tyr Ser Phe Tyr Arg Thr Asp 1010 1015 1020 Ala Asp Gly Asn Arg Gln Arg Ala His Tyr Asp Gly Leu Pro Ala 1025 1030 1035 Asp Phe Thr Ala Ala Ala Ile Thr Ala Leu Gly Ile Gln Ala Thr 1040 1045 1050 Glu Gly Phe Arg Thr Tyr Asp Val Leu Asn Pro Tyr Asp Asp Gly 1055 1060 1065 Ile Ser Leu Asp Glu Phe Val Asp Trp Leu Val Glu Ser Gly His 1070 1075 1080 Pro Ile Gln Arg Ile Thr Asp Tyr Ser Asp Trp Phe His Arg Phe 1085 1090 1095 Glu Thr Ala Ile Arg Ala Leu Pro Glu Lys Gln Arg Gln Ala Ser 1100 1105 1110 Val Leu Pro Leu Leu Asp Ala Tyr Arg Asn Pro Cys Pro Ala Val 1115 1120 1125 Arg Gly Ala Ile Leu Pro Ala Lys Glu Phe Gln Ala Ala Val Gln 1130 1135 1140 Thr Ala Lys Ile Gly Pro Glu Gln Asp Ile Pro His Leu Ser Ala 1145 1150 1155 Pro Leu Ile Asp Lys Tyr Val Ser Asp Leu Glu Leu Leu Gln Leu 1160 1165 1170 Leu <210> 92 <211> 669 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 92 atgattgaaa ccattctgcc tgcaggcgtt gaaagcgcag aactgctgga atatccggaa 60 gatctgaaag cacatccggc agaagaacat ctgattgcca aaagcgttga aaaacgtcgt 120 cgtgatttta ttggtgcacg tcattgtgca cgtctggcac tggcagaact gggtgaacct 180 ccggttgcaa ttggtaaagg tgaacgtggt gcaccgattt ggcctcgtgg tgttgttggt 240 agcctgaccc attgtgatgg ttatcgtgca gcagcagttg cacataaaat gcgctttcgc 300 agcattggta ttgatgcaga accgcatgca accctgccgg aaggtgttct ggatagcgtt 360 agcctgccgc cggaacgtga atggctgaaa accaccgata gcgcactgca tctggatcgt 420 ctgctgtttt gtgcaaaaga agccacctat aaagcctggt ggccgctgac agcacgttgg 480 ctgggttttg aagaagccca tattaccttt gaaattgaag atggtagcgc agatagcggt 540 aatggcacct ttcatagcga actgctggtt ccgggtcaga ccaatgatgg tggtacaccg 600 ctgctgagct ttgatggtcg ttggctgatt gcagatggtt ttattctgac cgcaattgcc 660 tatgcctaa 669 <210> 93 <211> 222 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 93 Met Ile Glu Thr Ile Leu Pro Ala Gly Val Glu Ser Ala Glu Leu Leu 1 5 10 15 Glu Tyr Pro Glu Asp Leu Lys Ala His Pro Ala Glu Glu His Leu Ile 20 25 30 Ala Lys Ser Val Glu Lys Arg Arg Arg Asp Phe Ile Gly Ala Arg His 35 40 45 Cys Ala Arg Leu Ala Leu Ala Glu Leu Gly Glu Pro Pro Val Ala Ile 50 55 60 Gly Lys Gly Glu Arg Gly Ala Pro Ile Trp Pro Arg Gly Val Val Gly 65 70 75 80 Ser Leu Thr His Cys Asp Gly Tyr Arg Ala Ala Ala Val Ala His Lys 85 90 95 Met Arg Phe Arg Ser Ile Gly Ile Asp Ala Glu Pro His Ala Thr Leu 100 105 110 Pro Glu Gly Val Leu Asp Ser Val Ser Leu Pro Pro Glu Arg Glu Trp 115 120 125 Leu Lys Thr Thr Asp Ser Ala Leu His Leu Asp Arg Leu Leu Phe Cys 130 135 140 Ala Lys Glu Ala Thr Tyr Lys Ala Trp Trp Pro Leu Thr Ala Arg Trp 145 150 155 160 Leu Gly Phe Glu Glu Ala His Ile Thr Phe Glu Ile Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Ala Asp Ser Gly Asn Gly Thr Phe His Ser Glu Leu Leu Val Pro Gly 180 185 190 Gln Thr Asn Asp Gly Gly Thr Pro Leu Leu Ser Phe Asp Gly Arg Trp 195 200 205 Leu Ile Ala Asp Gly Phe Ile Leu Thr Ala Ile Ala Tyr Ala 210 215 220 <210> 94 <211> 3522 <212> DNA <213> Mycobacterium smegmatis <400> 94 atgaccagcg atgttcacga cgccacagac ggcgtcaccg aaaccgcact cgacgacgag 60 cagtcgaccc gccgcatcgc cgagctgtac gccaccgatc ccgagttcgc cgccgccgca 120 ccgttgcccg ccgtggtcga cgcggcgcac aaacccgggc tgcggctggc agagatcctg 180 cagaccctgt tcaccggcta cggtgaccgc ccggcgctgg gataccgcgc ccgtgaactg 240 gccaccgacg agggcgggcg caccgtgacg cgtctgctgc cgcggttcga caccctcacc 300 tacgcccagg tgtggtcgcg cgtgcaagcg gtcgccgcgg ccctgcgcca caacttcgcg 360 cagccgatct accccggcga cgccgtcgcg acgatcggtt tcgcgagtcc cgattacctg 420 acgctggatc tcgtatgcgc ctacctgggc ctcgtgagtg ttccgctgca gcacaacgca 480 ccggtcagcc ggctcgcccc gatcctggcc gaggtcgaac cgcggatcct caccgtgagc 540 gccgaatacc tcgacctcgc agtcgaatcc gtgcgggacg tcaactcggt gtcgcagctc 600 gtggtgttcg accatcaccc cgaggtcgac gaccaccgcg acgcactggc ccgcgcgcgt 660 gaacaactcg ccggcaaggg catcgccgtc accaccctgg acgcgatcgc cgacgagggc 720 gccgggctgc cggccgaacc gatctacacc gccgaccatg atcagcgcct cgcgatgatc 780 ctgtacacct cgggttccac cggcgcaccc aagggtgcga tgtacaccga ggcgatggtg 840 gcgcggctgt ggaccatgtc gttcatcacg ggtgacccca cgccggtcat caacgtcaac 900 ttcatgccgc tcaaccacct gggcgggcgc atccccattt ccaccgccgt gcagaacggt 960 ggaaccagtt acttcgtacc ggaatccgac atgtccacgc tgttcgagga tctcgcgctg 1020 gtgcgcccga ccgaactcgg cctggttccg cgcgtcgccg acatgctcta ccagcaccac 1080 ctcgccaccg tcgaccgcct ggtcacgcag ggcgccgacg aactgaccgc cgagaagcag 1140 gccggtgccg aactgcgtga gcaggtgctc ggcggacgcg tgatcaccgg attcgtcagc 1200 accgcaccgc tggccgcgga gatgagggcg ttcctcgaca tcaccctggg cgcacacatc 1260 gtcgacggct acgggctcac cgagaccggc gccgtgacac gcgacggtgt gatcgtgcgg 1320 ccaccggtga tcgactacaa gctgatcgac gttcccgaac tcggctactt cagcaccgac 1380 aagccctacc cgcgtggcga actgctggtc aggtcgcaaa cgctgactcc cgggtactac 1440 aagcgccccg aggtcaccgc gagcgtcttc gaccgggacg gctactacca caccggcgac 1500 gtcatggccg agaccgcacc cgaccacctg gtgtacgtgg accgtcgcaa caacgtcctc 1560 aaactcgcgc agggcgagtt cgtggcggtc gccaacctgg aggcggtgtt ctccggcgcg 1620 gcgctggtgc gccagatctt cgtgtacggc aacagcgagc gcagtttcct tctggccgtg 1680 gtggtcccga cgccggaggc gctcgagcag tacgatccgg ccgcgctcaa ggccgcgctg 1740 gccgactcgc tgcagcgcac cgcacgcgac gccgaactgc aatcctacga ggtgccggcc 1800 gatttcatcg tcgagaccga gccgttcagc gccgccaacg ggctgctgtc gggtgtcgga 1860 aaactgctgc ggcccaacct caaagaccgc tacgggcagc gcctggagca gatgtacgcc 1920 gatatcgcgg ccacgcaggc caaccagttg cgcgaactgc ggcgcgcggc cgccacacaa 1980 ccggtgatcg acaccctcac ccaggccgct gccacgatcc tcggcaccgg gagcgaggtg 2040 gcatccgacg cccacttcac cgacctgggc ggggattccc tgtcggcgct gacactttcg 2100 aacctgctga gcgatttctt cggtttcgaa gttcccgtcg gcaccatcgt gaacccggcc 2160 accaacctcg cccaactcgc ccagcacatc gaggcgcagc gcaccgcggg tgaccgcagg 2220 ccgagtttca ccaccgtgca cggcgcggac gccaccgaga tccgggcgag tgagctgacc 2280 ctggacaagt tcatcgacgc cgaaacgctc cgggccgcac cgggtctgcc caaggtcacc 2340 accgagccac ggacggtgtt gctctcgggc gccaacggct ggctgggccg gttcctcacg 2400 ttgcagtggc tggaacgcct ggcacctgtc ggcggcaccc tcatcacgat cgtgcggggc 2460 cgcgacgacg ccgcggcccg cgcacggctg acccaggcct acgacaccga tcccgagttg 2520 tcccgccgct tcgccgagct ggccgaccgc cacctgcggg tggtcgccgg tgacatcggc 2580 gacccgaatc tgggcctcac acccgagatc tggcaccggc tcgccgccga ggtcgacctg 2640 gtggtgcatc cggcagcgct ggtcaaccac gtgctcccct accggcagct gttcggcccc 2700 aacgtcgtgg gcacggccga ggtgatcaag ctggccctca ccgaacggat caagcccgtc 2760 acgtacctgt ccaccgtgtc ggtggccatg gggatccccg acttcgagga ggacggcgac 2820 atccggaccg tgagcccggt gcgcccgctc gacggcggat acgccaacgg ctacggcaac 2880 agcaagtggg ccggcgaggt gctgctgcgg gaggcccacg atctgtgcgg gctgcccgtg 2940 gcgacgttcc gctcggacat gatcctggcg catccgcgct accgcggtca ggtcaacgtg 3000 ccagacatgt tcacgcgact cctgttgagc ctcttgatca ccggcgtcgc gccgcggtcg 3060 ttctacatcg gagacggtga gcgcccgcgg gcgcactacc ccggcctgac ggtcgatttc 3120 gtggccgagg cggtcacgac gctcggcgcg cagcagcgcg agggatacgt gtcctacgac 3180 gtgatgaacc cgcacgacga cgggatctcc ctggatgtgt tcgtggactg gctgatccgg 3240 gcgggccatc cgatcgaccg ggtcgacgac tacgacgact gggtgcgtcg gttcgagacc 3300 gcgttgaccg cgcttcccga gaagcgccgc gcacagaccg tactgccgct gctgcacgcg 3360 ttccgcgctc cgcaggcacc gttgcgcggc gcacccgaac ccacggaggt gttccacgcc 3420 gcggtgcgca ccgcgaaggt gggcccggga gacatcccgc acctcgacga ggcgctgatc 3480 gacaagtaca tacgcgatct gcgtgagttc ggtctgatct aa 3522 <210> 95 <211> 1173 <212> PRT <213> Mycobacterium smegmatis <400> 95 Met Thr Ser Asp Val His Asp Ala Thr Asp Gly Val Thr Glu Thr Ala 1 5 10 15 Leu Asp Asp Glu Gln Ser Thr Arg Arg Ile Ala Glu Leu Tyr Ala Thr 20 25 30 Asp Pro Glu Phe Ala Ala Ala Ala Pro Leu Pro Ala Val Val Asp Ala 35 40 45 Ala His Lys Pro Gly Leu Arg Leu Ala Glu Ile Leu Gln Thr Leu Phe 50 55 60 Thr Gly Tyr Gly Asp Arg Pro Ala Leu Gly Tyr Arg Ala Arg Glu Leu 65 70 75 80 Ala Thr Asp Glu Gly Gly Arg Thr Val Thr Arg Leu Leu Pro Arg Phe 85 90 95 Asp Thr Leu Thr Tyr Ala Gln Val Trp Ser Arg Val Gln Ala Val Ala 100 105 110 Ala Ala Leu Arg His Asn Phe Ala Gln Pro Ile Tyr Pro Gly Asp Ala 115 120 125 Val Ala Thr Ile Gly Phe Ala Ser Pro Asp Tyr Leu Thr Leu Asp Leu 130 135 140 Val Cys Ala Tyr Leu Gly Leu Val Ser Val Pro Leu Gln His Asn Ala 145 150 155 160 Pro Val Ser Arg Leu Ala Pro Ile Leu Ala Glu Val Glu Pro Arg Ile 165 170 175 Leu Thr Val Ser Ala Glu Tyr Leu Asp Leu Ala Val Glu Ser Val Arg 180 185 190 Asp Val Asn Ser Val Ser Gln Leu Val Val Phe Asp His His Pro Glu 195 200 205 Val Asp Asp His Arg Asp Ala Leu Ala Arg Ala Arg Glu Gln Leu Ala 210 215 220 Gly Lys Gly Ile Ala Val Thr Thr Leu Asp Ala Ile Ala Asp Glu Gly 225 230 235 240 Ala Gly Leu Pro Ala Glu Pro Ile Tyr Thr Ala Asp His Asp Gln Arg 245 250 255 Leu Ala Met Ile Leu Tyr Thr Ser Gly Ser Thr Gly Ala Pro Lys Gly 260 265 270 Ala Met Tyr Thr Glu Ala Met Val Ala Arg Leu Trp Thr Met Ser Phe 275 280 285 Ile Thr Gly Asp Pro Thr Pro Val Ile Asn Val Asn Phe Met Pro Leu 290 295 300 Asn His Leu Gly Gly Arg Ile Pro Ile Ser Thr Ala Val Gln Asn Gly 305 310 315 320 Gly Thr Ser Tyr Phe Val Pro Glu Ser Asp Met Ser Thr Leu Phe Glu 325 330 335 Asp Leu Ala Leu Val Arg Pro Thr Glu Leu Gly Leu Val Pro Arg Val 340 345 350 Ala Asp Met Leu Tyr Gln His His Leu Ala Thr Val Asp Arg Leu Val 355 360 365 Thr Gln Gly Ala Asp Glu Leu Thr Ala Glu Lys Gln Ala Gly Ala Glu 370 375 380 Leu Arg Glu Gln Val Leu Gly Gly Arg Val Ile Thr Gly Phe Val Ser 385 390 395 400 Thr Ala Pro Leu Ala Ala Glu Met Arg Ala Phe Leu Asp Ile Thr Leu 405 410 415 Gly Ala His Ile Val Asp Gly Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Gly Ala Val 420 425 430 Thr Arg Asp Gly Val Ile Val Arg Pro Pro Val Ile Asp Tyr Lys Leu 435 440 445 Ile Asp Val Pro Glu Leu Gly Tyr Phe Ser Thr Asp Lys Pro Tyr Pro 450 455 460 Arg Gly Glu Leu Leu Val Arg Ser Gln Thr Leu Thr Pro Gly Tyr Tyr 465 470 475 480 Lys Arg Pro Glu Val Thr Ala Ser Val Phe Asp Arg Asp Gly Tyr Tyr 485 490 495 His Thr Gly Asp Val Met Ala Glu Thr Ala Pro Asp His Leu Val Tyr 500 505 510 Val Asp Arg Arg Asn Asn Val Leu Lys Leu Ala Gln Gly Glu Phe Val 515 520 525 Ala Val Ala Asn Leu Glu Ala Val Phe Ser Gly Ala Ala Leu Val Arg 530 535 540 Gln Ile Phe Val Tyr Gly Asn Ser Glu Arg Ser Phe Leu Leu Ala Val 545 550 555 560 Val Val Pro Thr Pro Glu Ala Leu Glu Gln Tyr Asp Pro Ala Ala Leu 565 570 575 Lys Ala Ala Leu Ala Asp Ser Leu Gln Arg Thr Ala Arg Asp Ala Glu 580 585 590 Leu Gln Ser Tyr Glu Val Pro Ala Asp Phe Ile Val Glu Thr Glu Pro 595 600 605 Phe Ser Ala Ala Asn Gly Leu Leu Ser Gly Val Gly Lys Leu Leu Arg 610 615 620 Pro Asn Leu Lys Asp Arg Tyr Gly Gln Arg Leu Glu Gln Met Tyr Ala 625 630 635 640 Asp Ile Ala Ala Thr Gln Ala Asn Gln Leu Arg Glu Leu Arg Arg Ala 645 650 655 Ala Ala Thr Gln Pro Val Ile Asp Thr Leu Thr Gln Ala Ala Ala Thr 660 665 670 Ile Leu Gly Thr Gly Ser Glu Val Ala Ser Asp Ala His Phe Thr Asp 675 680 685 Leu Gly Gly Asp Ser Leu Ser Ala Leu Thr Leu Ser Asn Leu Leu Ser 690 695 700 Asp Phe Phe Gly Phe Glu Val Pro Val Gly Thr Ile Val Asn Pro Ala 705 710 715 720 Thr Asn Leu Ala Gln Leu Ala Gln His Ile Glu Ala Gln Arg Thr Ala 725 730 735 Gly Asp Arg Arg Pro Ser Phe Thr Thr Val His Gly Ala Asp Ala Thr 740 745 750 Glu Ile Arg Ala Ser Glu Leu Thr Leu Asp Lys Phe Ile Asp Ala Glu 755 760 765 Thr Leu Arg Ala Ala Pro Gly Leu Pro Lys Val Thr Thr Glu Pro Arg 770 775 780 Thr Val Leu Leu Ser Gly Ala Asn Gly Trp Leu Gly Arg Phe Leu Thr 785 790 795 800 Leu Gln Trp Leu Glu Arg Leu Ala Pro Val Gly Gly Thr Leu Ile Thr 805 810 815 Ile Val Arg Gly Arg Asp Asp Ala Ala Ala Arg Ala Arg Leu Thr Gln 820 825 830 Ala Tyr Asp Thr Asp Pro Glu Leu Ser Arg Arg Phe Ala Glu Leu Ala 835 840 845 Asp Arg His Leu Arg Val Val Ala Gly Asp Ile Gly Asp Pro Asn Leu 850 855 860 Gly Leu Thr Pro Glu Ile Trp His Arg Leu Ala Ala Glu Val Asp Leu 865 870 875 880 Val Val His Pro Ala Ala Leu Val Asn His Val Leu Pro Tyr Arg Gln 885 890 895 Leu Phe Gly Pro Asn Val Val Gly Thr Ala Glu Val Ile Lys Leu Ala 900 905 910 Leu Thr Glu Arg Ile Lys Pro Val Thr Tyr Leu Ser Thr Val Ser Val 915 920 925 Ala Met Gly Ile Pro Asp Phe Glu Glu Asp Gly Asp Ile Arg Thr Val 930 935 940 Ser Pro Val Arg Pro Leu Asp Gly Gly Tyr Ala Asn Gly Tyr Gly Asn 945 950 955 960 Ser Lys Trp Ala Gly Glu Val Leu Leu Arg Glu Ala His Asp Leu Cys 965 970 975 Gly Leu Pro Val Ala Thr Phe Arg Ser Asp Met Ile Leu Ala His Pro 980 985 990 Arg Tyr Arg Gly Gln Val Asn Val Pro Asp Met Phe Thr Arg Leu Leu 995 1000 1005 Leu Ser Leu Leu Ile Thr Gly Val Ala Pro Arg Ser Phe Tyr Ile 1010 1015 1020 Gly Asp Gly Glu Arg Pro Arg Ala His Tyr Pro Gly Leu Thr Val 1025 1030 1035 Asp Phe Val Ala Glu Ala Val Thr Thr Leu Gly Ala Gln Gln Arg 1040 1045 1050 Glu Gly Tyr Val Ser Tyr Asp Val Met Asn Pro His Asp Asp Gly 1055 1060 1065 Ile Ser Leu Asp Val Phe Val Asp Trp Leu Ile Arg Ala Gly His 1070 1075 1080 Pro Ile Asp Arg Val Asp Asp Tyr Asp Asp Trp Val Arg Arg Phe 1085 1090 1095 Glu Thr Ala Leu Thr Ala Leu Pro Glu Lys Arg Arg Ala Gln Thr 1100 1105 1110 Val Leu Pro Leu Leu His Ala Phe Arg Ala Pro Gln Ala Pro Leu 1115 1120 1125 Arg Gly Ala Pro Glu Pro Thr Glu Val Phe His Ala Ala Val Arg 1130 1135 1140 Thr Ala Lys Val Gly Pro Gly Asp Ile Pro His Leu Asp Glu Ala 1145 1150 1155 Leu Ile Asp Lys Tyr Ile Arg Asp Leu Arg Glu Phe Gly Leu Ile 1160 1165 1170 <210> 96 <211> 3522 <212> DNA <213> Mycobacterium avium <400> 96 atgtcgactg ccacccatga cgaacgactc gaccgtcgcg tccacgaact catcgccacc 60 gacccgcaat tcgccgccgc ccaacccgac ccggcgatca ccgccgccct cgaacagccc 120 gggctgcggc tgccgcagat catccgcacc gtgctcgacg gctacgccga ccggccggcg 180 ctgggacagc gcgtggtgga gttcgtcacg gacgccaaga ccgggcgcac gtcggcgcag 240 ctgctccccc gcttcgagac catcacgtac agcgaagtag cgcagcgtgt ttcggcgctg 300 ggccgcgccc tgtccgacga cgcggtgcac cccggcgacc gggtgtgcgt gctgggcttc 360 aacagcgtcg actacgccac catcgacatg gcgctgggcg ccatcggcgc cgtctcggtg 420 ccgctgcaga ccagcgcggc aatcagctcg ctgcagccga tcgtggccga gaccgagccc 480 accctgatcg cgtccagcgt gaaccagctg tccgacgcgg tgcagctgat caccggcgcc 540 gagcaggcgc ccacccggct ggtggtgttc gactaccacc cgcaggtcga cgaccagcgc 600 gaggccgtcc aggacgccgc ggcgcggctg tccagcaccg gcgtggccgt ccagacgctg 660 gccgagctgc tggagcgcgg caaggacctg cccgccgtcg cggagccgcc cgccgacgag 720 gactcgctgg ccctgctgat ctacacctcc gggtccaccg gcgcccccaa gggcgcgatg 780 tacccacaga gcaacgtcgg caagatgtgg cgccgcggca gcaagaactg gttcggcgag 840 agcgccgcgt cgatcaccct gaacttcatg ccgatgagcc acgtgatggg ccgaagcatc 900 ctctacggca cgctgggcaa cggcggcacc gcctacttcg ccgcccgcag cgacctgtcc 960 accctgcttg aggacctcga gctggtgcgg cccaccgagc tcaacttcgt cccgcggatc 1020 tgggagacgc tgtacggcga attccagcgt caggtcgagc ggcggctctc cgaggccggg 1080 gacgccggcg aacgtcgcgc cgtcgaggcc gaggtgctgg ccgagcagcg ccagtacctg 1140 ctgggcgggc ggttcacctt cgcgatgacg ggctcggcgc ccatctcgcc ggagctgcgc 1200 aactgggtcg agtcgctgct cgaaatgcac ctgatggacg gctacggctc caccgaggcc 1260 ggaatggtgt tgttcgacgg ggagattcag cgcccgccgg tgatcgacta caagctggtc 1320 gacgtgccgg acctgggcta cttcagcacc gaccggccgc atccgcgcgg cgagctgctg 1380 ctgcgcaccg agaacatgtt cccgggctac tacaagcggg ccgaaaccac cgcgggcgtc 1440 ttcgacgagg acggctacta ccgcaccggc gacgtgttcg ccgagatcgc cccggaccgg 1500 ctggtctacg tcgaccgccg caacaacgtg ctcaagctgg cgcagggcga attcgtcacg 1560 ctggccaagc tggaggcggt gttcggcaac agcccgctga tccgccagat ctacgtctac 1620 ggcaacagcg cccagcccta cctgctggcg gtcgtggtgc ccaccgagga ggcgctggcc 1680 tcgggtgacc ccgagacgct caagcccaag atcgccgact cgctgcagca ggtcgccaag 1740 gaggccggcc tgcagtccta cgaggtgccg cgcgacttca tcatcgagac caccccgttc 1800 agcctggaaa acggtctgct gaccgggatc cggaagctgg cgtggccgaa actgaagcag 1860 cactacgggg aacggctgga gcagatgtac gccgacctgg ccgccggaca ggccaacgag 1920 ctggccgagc tgcgccgcaa cggtgcccag gcgccggtgt tgcagaccgt gagccgcgcc 1980 gcgggcgcca tgctgggttc ggccgcctcc gacctgtccc ccgacgccca cttcaccgat 2040 ctgggcggag actcgttgtc ggcgttgaca ttcggcaacc tgctgcgcga gatcttcgac 2100 gtcgacgtgc cggtaggcgt gatcgtcagc ccggccaacg acctggcggc catcgcgagc 2160 tacatcgagg ccgagcggca gggcagcaag cgcccgacgt tcgcctcggt gcacggccgg 2220 gacgcgaccg tggtgcgcgc cgccgacctg acgctggaca agttcctcga cgccgagacg 2280 ctggccgccg cgccgaacct gcccaagccg gccaccgagg tgcgcaccgt gctgctgacc 2340 ggcgccaccg gcttcctggg ccgctacctg gccctggaat ggctggagcg gatggacatg 2400 gtggacggca aggtcatcgc cctggtccgg gcccgctccg acgaggaggc acgcgcccgg 2460 ctggacaaga ccttcgacag cggcgacccg aaactgctcg cgcactacca gcagctggcc 2520 gccgatcacc tggaggtcat cgccggcgac aagggcgagg ccaatctggg cctgggccaa 2580 gacgtttggc aacgactggc cgacacggtc gacgtgatcg tcgaccccgc cgcgctggtc 2640 aaccacgtgt tgccgtacag cgagctgttc gggcccaacg ccctgggcac cgcggagctg 2700 atccggctgg cgctgacgtc caagcagaag ccgtacacct acgtgtccac catcggcgtg 2760 ggcgaccaga tcgagccggg caagttcgtc gagaacgccg acatccggca gatgagcgcc 2820 acccgggcga tcaacgacag ctacgccaac ggctatggca acagcaagtg ggccggcgag 2880 gtgctgctgc gcgaggcgca cgacctgtgc gggctgcccg tcgcggtgtt ccgctgcgac 2940 atgatcctgg ccgacaccac gtatgccggg cagctcaacc tgccggacat gttcacccgg 3000 ctgatgctga gcctggtggc caccgggatc gcgcccggct cgttctacga gctcgacgcc 3060 gacggcaacc ggcagcgggc gcactacgac ggcctgccgg tcgagttcat cgccgcggcg 3120 atctcgacgc tgggttcgca gatcaccgac agcgacaccg gcttccagac ctaccacgtg 3180 atgaacccct acgatgacgg cgtcggtctg gacgagtacg tcgattggct ggtggacgcc 3240 ggctattcga tcgagcggat cgccgactac tccgaatggc tgcggcggtt cgagacctcg 3300 ctgcgggccc tgccggaccg gcagcgccag tactcgctgc tgccgctgct gcacaactac 3360 cgcacgccgg agaagccgat caacgggtcg atagctccca ccgacgtgtt ccgggcagcg 3420 gtgcaggagg cgaaaatcgg ccccgacaaa gacattccgc acgtgtcgcc gccggtcatc 3480 gtcaagtaca tcaccgacct gcagctgctc gggctgctct aa 3522 <210> 97 <211> 1173 <212> PRT <213> Mycobacterium avium <400> 97 Met Ser Thr Ala Thr His Asp Glu Arg Leu Asp Arg Arg Val His Glu 1 5 10 15 Leu Ile Ala Thr Asp Pro Gln Phe Ala Ala Ala Gln Pro Asp Pro Ala 20 25 30 Ile Thr Ala Ala Leu Glu Gln Pro Gly Leu Arg Leu Pro Gln Ile Ile 35 40 45 Arg Thr Val Leu Asp Gly Tyr Ala Asp Arg Pro Ala Leu Gly Gln Arg 50 55 60 Val Val Glu Phe Val Thr Asp Ala Lys Thr Gly Arg Thr Ser Ala Gln 65 70 75 80 Leu Leu Pro Arg Phe Glu Thr Ile Thr Tyr Ser Glu Val Ala Gln Arg 85 90 95 Val Ser Ala Leu Gly Arg Ala Leu Ser Asp Asp Ala Val His Pro Gly 100 105 110 Asp Arg Val Cys Val Leu Gly Phe Asn Ser Val Asp Tyr Ala Thr Ile 115 120 125 Asp Met Ala Leu Gly Ala Ile Gly Ala Val Ser Val Pro Leu Gln Thr 130 135 140 Ser Ala Ala Ile Ser Ser Leu Gln Pro Ile Val Ala Glu Thr Glu Pro 145 150 155 160 Thr Leu Ile Ala Ser Ser Val Asn Gln Leu Ser Asp Ala Val Gln Leu 165 170 175 Ile Thr Gly Ala Glu Gln Ala Pro Thr Arg Leu Val Val Phe Asp Tyr 180 185 190 His Pro Gln Val Asp Asp Gln Arg Glu Ala Val Gln Asp Ala Ala Ala 195 200 205 Arg Leu Ser Ser Thr Gly Val Ala Val Gln Thr Leu Ala Glu Leu Leu 210 215 220 Glu Arg Gly Lys Asp Leu Pro Ala Val Ala Glu Pro Pro Ala Asp Glu 225 230 235 240 Asp Ser Leu Ala Leu Leu Ile Tyr Thr Ser Gly Ser Thr Gly Ala Pro 245 250 255 Lys Gly Ala Met Tyr Pro Gln Ser Asn Val Gly Lys Met Trp Arg Arg 260 265 270 Gly Ser Lys Asn Trp Phe Gly Glu Ser Ala Ala Ser Ile Thr Leu Asn 275 280 285 Phe Met Pro Met Ser His Val Met Gly Arg Ser Ile Leu Tyr Gly Thr 290 295 300 Leu Gly Asn Gly Gly Thr Ala Tyr Phe Ala Ala Arg Ser Asp Leu Ser 305 310 315 320 Thr Leu Leu Glu Asp Leu Glu Leu Val Arg Pro Thr Glu Leu Asn Phe 325 330 335 Val Pro Arg Ile Trp Glu Thr Leu Tyr Gly Glu Phe Gln Arg Gln Val 340 345 350 Glu Arg Arg Leu Ser Glu Ala Gly Asp Ala Gly Glu Arg Arg Ala Val 355 360 365 Glu Ala Glu Val Leu Ala Glu Gln Arg Gln Tyr Leu Leu Gly Gly Arg 370 375 380 Phe Thr Phe Ala Met Thr Gly Ser Ala Pro Ile Ser Pro Glu Leu Arg 385 390 395 400 Asn Trp Val Glu Ser Leu Leu Glu Met His Leu Met Asp Gly Tyr Gly 405 410 415 Ser Thr Glu Ala Gly Met Val Leu Phe Asp Gly Glu Ile Gln Arg Pro 420 425 430 Pro Val Ile Asp Tyr Lys Leu Val Asp Val Pro Asp Leu Gly Tyr Phe 435 440 445 Ser Thr Asp Arg Pro His Pro Arg Gly Glu Leu Leu Leu Arg Thr Glu 450 455 460 Asn Met Phe Pro Gly Tyr Tyr Lys Arg Ala Glu Thr Thr Ala Gly Val 465 470 475 480 Phe Asp Glu Asp Gly Tyr Tyr Arg Thr Gly Asp Val Phe Ala Glu Ile 485 490 495 Ala Pro Asp Arg Leu Val Tyr Val Asp Arg Arg Asn Asn Val Leu Lys 500 505 510 Leu Ala Gln Gly Glu Phe Val Thr Leu Ala Lys Leu Glu Ala Val Phe 515 520 525 Gly Asn Ser Pro Leu Ile Arg Gln Ile Tyr Val Tyr Gly Asn Ser Ala 530 535 540 Gln Pro Tyr Leu Leu Ala Val Val Val Pro Thr Glu Glu Ala Leu Ala 545 550 555 560 Ser Gly Asp Pro Glu Thr Leu Lys Pro Lys Ile Ala Asp Ser Leu Gln 565 570 575 Gln Val Ala Lys Glu Ala Gly Leu Gln Ser Tyr Glu Val Pro Arg Asp 580 585 590 Phe Ile Ile Glu Thr Thr Pro Phe Ser Leu Glu Asn Gly Leu Leu Thr 595 600 605 Gly Ile Arg Lys Leu Ala Trp Pro Lys Leu Lys Gln His Tyr Gly Glu 610 615 620 Arg Leu Glu Gln Met Tyr Ala Asp Leu Ala Ala Gly Gln Ala Asn Glu 625 630 635 640 Leu Ala Glu Leu Arg Arg Asn Gly Ala Gln Ala Pro Val Leu Gln Thr 645 650 655 Val Ser Arg Ala Ala Gly Ala Met Leu Gly Ser Ala Ala Ser Asp Leu 660 665 670 Ser Pro Asp Ala His Phe Thr Asp Leu Gly Gly Asp Ser Leu Ser Ala 675 680 685 Leu Thr Phe Gly Asn Leu Leu Arg Glu Ile Phe Asp Val Asp Val Pro 690 695 700 Val Gly Val Ile Val Ser Pro Ala Asn Asp Leu Ala Ala Ile Ala Ser 705 710 715 720 Tyr Ile Glu Ala Glu Arg Gln Gly Ser Lys Arg Pro Thr Phe Ala Ser 725 730 735 Val His Gly Arg Asp Ala Thr Val Val Arg Ala Ala Asp Leu Thr Leu 740 745 750 Asp Lys Phe Leu Asp Ala Glu Thr Leu Ala Ala Ala Pro Asn Leu Pro 755 760 765 Lys Pro Ala Thr Glu Val Arg Thr Val Leu Leu Thr Gly Ala Thr Gly 770 775 780 Phe Leu Gly Arg Tyr Leu Ala Leu Glu Trp Leu Glu Arg Met Asp Met 785 790 795 800 Val Asp Gly Lys Val Ile Ala Leu Val Arg Ala Arg Ser Asp Glu Glu 805 810 815 Ala Arg Ala Arg Leu Asp Lys Thr Phe Asp Ser Gly Asp Pro Lys Leu 820 825 830 Leu Ala His Tyr Gln Gln Leu Ala Ala Asp His Leu Glu Val Ile Ala 835 840 845 Gly Asp Lys Gly Glu Ala Asn Leu Gly Leu Gly Gln Asp Val Trp Gln 850 855 860 Arg Leu Ala Asp Thr Val Asp Val Ile Val Asp Pro Ala Ala Leu Val 865 870 875 880 Asn His Val Leu Pro Tyr Ser Glu Leu Phe Gly Pro Asn Ala Leu Gly 885 890 895 Thr Ala Glu Leu Ile Arg Leu Ala Leu Thr Ser Lys Gln Lys Pro Tyr 900 905 910 Thr Tyr Val Ser Thr Ile Gly Val Gly Asp Gln Ile Glu Pro Gly Lys 915 920 925 Phe Val Glu Asn Ala Asp Ile Arg Gln Met Ser Ala Thr Arg Ala Ile 930 935 940 Asn Asp Ser Tyr Ala Asn Gly Tyr Gly Asn Ser Lys Trp Ala Gly Glu 945 950 955 960 Val Leu Leu Arg Glu Ala His Asp Leu Cys Gly Leu Pro Val Ala Val 965 970 975 Phe Arg Cys Asp Met Ile Leu Ala Asp Thr Thr Tyr Ala Gly Gln Leu 980 985 990 Asn Leu Pro Asp Met Phe Thr Arg Leu Met Leu Ser Leu Val Ala Thr 995 1000 1005 Gly Ile Ala Pro Gly Ser Phe Tyr Glu Leu Asp Ala Asp Gly Asn 1010 1015 1020 Arg Gln Arg Ala His Tyr Asp Gly Leu Pro Val Glu Phe Ile Ala 1025 1030 1035 Ala Ala Ile Ser Thr Leu Gly Ser Gln Ile Thr Asp Ser Asp Thr 1040 1045 1050 Gly Phe Gln Thr Tyr His Val Met Asn Pro Tyr Asp Asp Gly Val 1055 1060 1065 Gly Leu Asp Glu Tyr Val Asp Trp Leu Val Asp Ala Gly Tyr Ser 1070 1075 1080 Ile Glu Arg Ile Ala Asp Tyr Ser Glu Trp Leu Arg Arg Phe Glu 1085 1090 1095 Thr Ser Leu Arg Ala Leu Pro Asp Arg Gln Arg Gln Tyr Ser Leu 1100 1105 1110 Leu Pro Leu Leu His Asn Tyr Arg Thr Pro Glu Lys Pro Ile Asn 1115 1120 1125 Gly Ser Ile Ala Pro Thr Asp Val Phe Arg Ala Ala Val Gln Glu 1130 1135 1140 Ala Lys Ile Gly Pro Asp Lys Asp Ile Pro His Val Ser Pro Pro 1145 1150 1155 Val Ile Val Lys Tyr Ile Thr Asp Leu Gln Leu Leu Gly Leu Leu 1160 1165 1170 <210> 98 <211> 3525 <212> DNA <213> Mycobacterium marinum <400> 98 atgtcgccaa tcacgcgtga agagcggctc gagcgccgca tccaggacct ctacgccaac 60 gacccgcagt tcgccgccgc caaacccgcc acggcgatca ccgcagcaat cgagcggccg 120 ggtctaccgc taccccagat catcgagacc gtcatgaccg gatacgccga tcggccggct 180 ctcgctcagc gctcggtcga attcgtgacc gacgccggca ccggccacac cacgctgcga 240 ctgctccccc acttcgaaac catcagctac ggcgagcttt gggaccgcat cagcgcactg 300 gccgacgtgc tcagcaccga acagacggtg aaaccgggcg accgggtctg cttgttgggc 360 ttcaacagcg tcgactacgc cacgatcgac atgactttgg cgcggctggg cgcggtggcc 420 gtaccactgc agaccagcgc ggcgataacc cagctgcagc cgatcgtcgc cgagacccag 480 cccaccatga tcgcggccag cgtcgacgca ctcgctgacg ccaccgaatt ggctctgtcc 540 ggtcagaccg ctacccgagt cctggtgttc gaccaccacc ggcaggttga cgcacaccgc 600 gcagcggtcg aatccgcccg ggagcgcctg gccggctcgg cggtcgtcga aaccctggcc 660 gaggccatcg cgcgcggcga cgtgccccgc ggtgcgtccg ccggctcggc gcccggcacc 720 gatgtgtccg acgactcgct cgcgctactg atctacacct cgggcagcac gggtgcgccc 780 aagggcgcga tgtacccccg acgcaacgtt gcgaccttct ggcgcaagcg cacctggttc 840 gaaggcggct acgagccgtc gatcacgctg aacttcatgc caatgagcca cgtcatgggc 900 cgccaaatcc tgtacggcac gctgtgcaat ggcggcaccg cctacttcgt ggcgaaaagc 960 gatctctcca ccttgttcga agacctggcg ctggtgcggc ccaccgagct gaccttcgtg 1020 ccgcgcgtgt gggacatggt gttcgacgag tttcagagtg aggtcgaccg ccgcctggtc 1080 gacggcgccg accgggtcgc gctcgaagcc caggtcaagg ccgagatacg caacgacgtg 1140 ctcggtggac ggtataccag cgcactgacc ggctccgccc ctatctccga cgagatgaag 1200 gcgtgggtcg aggagctgct cgacatgcat ctggtcgagg gctacggctc caccgaggcc 1260 gggatgatcc tgatcgacgg agccattcgg cgcccggcgg tactcgacta caagctggtc 1320 gatgttcccg acctgggtta cttcctgacc gaccggccac atccgcgggg cgagttgctg 1380 gtcaagaccg atagtttgtt cccgggctac taccagcgag ccgaagtcac cgccgacgtg 1440 ttcgatgctg acggcttcta ccggaccggc gacatcatgg ccgaggtcgg ccccgaacag 1500 ttcgtgtacc tcgaccgccg caacaacgtg ttgaagctgt cgcagggcga gttcgtcacc 1560 gtctccaaac tcgaagcggt gtttggcgac agcccactgg tacggcagat ctacatctac 1620 ggcaacagcg cccgtgccta cctgttggcg gtgatcgtcc ccacccagga ggcgctggac 1680 gccgtgcctg tcgaggagct caaggcgcgg ctgggcgact cgctgcaaga ggtcgcaaag 1740 gccgccggcc tgcagtccta cgagatcccg cgcgacttca tcatcgaaac aacaccatgg 1800 acgctggaga acggcctgct caccggcatc cgcaagttgg ccaggccgca gctgaaaaag 1860 cattacggcg agcttctcga gcagatctac acggacctgg cacacggcca ggccgacgaa 1920 ctgcgctcgc tgcgccaaag cggtgccgat gcgccggtgc tggtgacggt gtgccgtgcg 1980 gcggccgcgc tgttgggcgg cagcgcctct gacgtccagc ccgatgcgca cttcaccgat 2040 ttgggcggcg actcgctgtc ggcgctgtcg ttcaccaacc tgctgcacga gatcttcgac 2100 atcgaagtgc cggtgggcgt catcgtcagc cccgccaacg acttgcaggc cctggccgac 2160 tacgtcgagg cggctcgcaa acccggctcg tcacggccga ccttcgcctc ggtccacggc 2220 gcctcgaatg ggcaggtcac cgaggtgcat gccggtgacc tgtccctgga caaattcatc 2280 gatgccgcaa ccctggccga agctccccgg ctgcccgccg caaacaccca agtgcgcacc 2340 gtgctgctga ccggcgccac cggcttcctc gggcgctacc tggccctgga atggctggag 2400 cggatggacc tggtcgacgg caaactgatc tgcctggtcc gggccaagtc cgacaccgaa 2460 gcacgggcgc ggctggacaa gacgttcgac agcggcgacc ccgaactgct ggcccactac 2520 cgcgcactgg ccggcgacca cctcgaggtg ctcgccggtg acaagggcga agccgacctc 2580 ggactggacc ggcagacctg gcaacgcctg gccgacacgg tcgacctgat cgtcgacccc 2640 gcggccctgg tcaaccacgt actgccatac agccagctgt tcgggcccaa cgcgctgggc 2700 accgccgagc tgctgcggct ggcgctcacc tccaagatca agccctacag ctacacctcg 2760 acaatcggtg tcgccgacca gatcccgccg tcggcgttca ccgaggacgc cgacatccgg 2820 gtcatcagcg ccacccgcgc ggtcgacgac agctacgcca atggctactc gaacagcaag 2880 tgggccggcg aggtgctgtt gcgcgaggcg catgacctgt gtggcctgcc ggttgcggtg 2940 ttccgctgcg acatgatcct ggccgacacc acatgggcgg gacagctcaa tgtgccggac 3000 atgttcaccc ggatgatcct gagcctggcg gccaccggta tcgcgccggg ttcgttctat 3060 gagcttgcgg ccgacggcgc ccggcaacgc gcccactatg acggtctgcc cgtcgagttc 3120 atcgccgagg cgatttcgac tttgggtgcg cagagccagg atggtttcca cacgtatcac 3180 gtgatgaacc cctacgacga cggcatcgga ctcgacgagt tcgtcgactg gctcaacgag 3240 tccggttgcc ccatccagcg catcgctgac tatggcgact ggctgcagcg cttcgaaacc 3300 gcactgcgcg cactgcccga tcggcagcgg cacagctcac tgctgccgct gttgcacaac 3360 tatcggcagc cggagcggcc cgtccgcggg tcgatcgccc ctaccgatcg cttccgggca 3420 gcggtgcaag aggccaagat cggccccgac aaagacattc cgcacgtcgg cgcgccgatc 3480 atcgtgaagt acgtcagcga cctgcgccta ctcggcctgc tctaa 3525 <210> 99 <211> 1174 <212> PRT <213> Mycobacterium marinum <400> 99 Met Ser Pro Ile Thr Arg Glu Glu Arg Leu Glu Arg Arg Ile Gln Asp 1 5 10 15 Leu Tyr Ala Asn Asp Pro Gln Phe Ala Ala Ala Lys Pro Ala Thr Ala 20 25 30 Ile Thr Ala Ala Ile Glu Arg Pro Gly Leu Pro Leu Pro Gln Ile Ile 35 40 45 Glu Thr Val Met Thr Gly Tyr Ala Asp Arg Pro Ala Leu Ala Gln Arg 50 55 60 Ser Val Glu Phe Val Thr Asp Ala Gly Thr Gly His Thr Thr Leu Arg 65 70 75 80 Leu Leu Pro His Phe Glu Thr Ile Ser Tyr Gly Glu Leu Trp Asp Arg 85 90 95 Ile Ser Ala Leu Ala Asp Val Leu Ser Thr Glu Gln Thr Val Lys Pro 100 105 110 Gly Asp Arg Val Cys Leu Leu Gly Phe Asn Ser Val Asp Tyr Ala Thr 115 120 125 Ile Asp Met Thr Leu Ala Arg Leu Gly Ala Val Ala Val Pro Leu Gln 130 135 140 Thr Ser Ala Ala Ile Thr Gln Leu Gln Pro Ile Val Ala Glu Thr Gln 145 150 155 160 Pro Thr Met Ile Ala Ala Ser Val Asp Ala Leu Ala Asp Ala Thr Glu 165 170 175 Leu Ala Leu Ser Gly Gln Thr Ala Thr Arg Val Leu Val Phe Asp His 180 185 190 His Arg Gln Val Asp Ala His Arg Ala Ala Val Glu Ser Ala Arg Glu 195 200 205 Arg Leu Ala Gly Ser Ala Val Val Glu Thr Leu Ala Glu Ala Ile Ala 210 215 220 Arg Gly Asp Val Pro Arg Gly Ala Ser Ala Gly Ser Ala Pro Gly Thr 225 230 235 240 Asp Val Ser Asp Asp Ser Leu Ala Leu Leu Ile Tyr Thr Ser Gly Ser 245 250 255 Thr Gly Ala Pro Lys Gly Ala Met Tyr Pro Arg Arg Asn Val Ala Thr 260 265 270 Phe Trp Arg Lys Arg Thr Trp Phe Glu Gly Gly Tyr Glu Pro Ser Ile 275 280 285 Thr Leu Asn Phe Met Pro Met Ser His Val Met Gly Arg Gln Ile Leu 290 295 300 Tyr Gly Thr Leu Cys Asn Gly Gly Thr Ala Tyr Phe Val Ala Lys Ser 305 310 315 320 Asp Leu Ser Thr Leu Phe Glu Asp Leu Ala Leu Val Arg Pro Thr Glu 325 330 335 Leu Thr Phe Val Pro Arg Val Trp Asp Met Val Phe Asp Glu Phe Gln 340 345 350 Ser Glu Val Asp Arg Arg Leu Val Asp Gly Ala Asp Arg Val Ala Leu 355 360 365 Glu Ala Gln Val Lys Ala Glu Ile Arg Asn Asp Val Leu Gly Gly Arg 370 375 380 Tyr Thr Ser Ala Leu Thr Gly Ser Ala Pro Ile Ser Asp Glu Met Lys 385 390 395 400 Ala Trp Val Glu Glu Leu Leu Asp Met His Leu Val Glu Gly Tyr Gly 405 410 415 Ser Thr Glu Ala Gly Met Ile Leu Ile Asp Gly Ala Ile Arg Arg Pro 420 425 430 Ala Val Leu Asp Tyr Lys Leu Val Asp Val Pro Asp Leu Gly Tyr Phe 435 440 445 Leu Thr Asp Arg Pro His Pro Arg Gly Glu Leu Leu Val Lys Thr Asp 450 455 460 Ser Leu Phe Pro Gly Tyr Tyr Gln Arg Ala Glu Val Thr Ala Asp Val 465 470 475 480 Phe Asp Ala Asp Gly Phe Tyr Arg Thr Gly Asp Ile Met Ala Glu Val 485 490 495 Gly Pro Glu Gln Phe Val Tyr Leu Asp Arg Arg Asn Asn Val Leu Lys 500 505 510 Leu Ser Gln Gly Glu Phe Val Thr Val Ser Lys Leu Glu Ala Val Phe 515 520 525 Gly Asp Ser Pro Leu Val Arg Gln Ile Tyr Ile Tyr Gly Asn Ser Ala 530 535 540 Arg Ala Tyr Leu Leu Ala Val Ile Val Pro Thr Gln Glu Ala Leu Asp 545 550 555 560 Ala Val Pro Val Glu Glu Leu Lys Ala Arg Leu Gly Asp Ser Leu Gln 565 570 575 Glu Val Ala Lys Ala Ala Gly Leu Gln Ser Tyr Glu Ile Pro Arg Asp 580 585 590 Phe Ile Ile Glu Thr Thr Pro Trp Thr Leu Glu Asn Gly Leu Leu Thr 595 600 605 Gly Ile Arg Lys Leu Ala Arg Pro Gln Leu Lys Lys His Tyr Gly Glu 610 615 620 Leu Leu Glu Gln Ile Tyr Thr Asp Leu Ala His Gly Gln Ala Asp Glu 625 630 635 640 Leu Arg Ser Leu Arg Gln Ser Gly Ala Asp Ala Pro Val Leu Val Thr 645 650 655 Val Cys Arg Ala Ala Ala Ala Leu Leu Gly Gly Ser Ala Ser Asp Val 660 665 670 Gln Pro Asp Ala His Phe Thr Asp Leu Gly Gly Asp Ser Leu Ser Ala 675 680 685 Leu Ser Phe Thr Asn Leu Leu His Glu Ile Phe Asp Ile Glu Val Pro 690 695 700 Val Gly Val Ile Val Ser Pro Ala Asn Asp Leu Gln Ala Leu Ala Asp 705 710 715 720 Tyr Val Glu Ala Ala Arg Lys Pro Gly Ser Ser Arg Pro Thr Phe Ala 725 730 735 Ser Val His Gly Ala Ser Asn Gly Gln Val Thr Glu Val His Ala Gly 740 745 750 Asp Leu Ser Leu Asp Lys Phe Ile Asp Ala Ala Thr Leu Ala Glu Ala 755 760 765 Pro Arg Leu Pro Ala Ala Asn Thr Gln Val Arg Thr Val Leu Leu Thr 770 775 780 Gly Ala Thr Gly Phe Leu Gly Arg Tyr Leu Ala Leu Glu Trp Leu Glu 785 790 795 800 Arg Met Asp Leu Val Asp Gly Lys Leu Ile Cys Leu Val Arg Ala Lys 805 810 815 Ser Asp Thr Glu Ala Arg Ala Arg Leu Asp Lys Thr Phe Asp Ser Gly 820 825 830 Asp Pro Glu Leu Leu Ala His Tyr Arg Ala Leu Ala Gly Asp His Leu 835 840 845 Glu Val Leu Ala Gly Asp Lys Gly Glu Ala Asp Leu Gly Leu Asp Arg 850 855 860 Gln Thr Trp Gln Arg Leu Ala Asp Thr Val Asp Leu Ile Val Asp Pro 865 870 875 880 Ala Ala Leu Val Asn His Val Leu Pro Tyr Ser Gln Leu Phe Gly Pro 885 890 895 Asn Ala Leu Gly Thr Ala Glu Leu Leu Arg Leu Ala Leu Thr Ser Lys 900 905 910 Ile Lys Pro Tyr Ser Tyr Thr Ser Thr Ile Gly Val Ala Asp Gln Ile 915 920 925 Pro Pro Ser Ala Phe Thr Glu Asp Ala Asp Ile Arg Val Ile Ser Ala 930 935 940 Thr Arg Ala Val Asp Asp Ser Tyr Ala Asn Gly Tyr Ser Asn Ser Lys 945 950 955 960 Trp Ala Gly Glu Val Leu Leu Arg Glu Ala His Asp Leu Cys Gly Leu 965 970 975 Pro Val Ala Val Phe Arg Cys Asp Met Ile Leu Ala Asp Thr Thr Trp 980 985 990 Ala Gly Gln Leu Asn Val Pro Asp Met Phe Thr Arg Met Ile Leu Ser 995 1000 1005 Leu Ala Ala Thr Gly Ile Ala Pro Gly Ser Phe Tyr Glu Leu Ala 1010 1015 1020 Ala Asp Gly Ala Arg Gln Arg Ala His Tyr Asp Gly Leu Pro Val 1025 1030 1035 Glu Phe Ile Ala Glu Ala Ile Ser Thr Leu Gly Ala Gln Ser Gln 1040 1045 1050 Asp Gly Phe His Thr Tyr His Val Met Asn Pro Tyr Asp Asp Gly 1055 1060 1065 Ile Gly Leu Asp Glu Phe Val Asp Trp Leu Asn Glu Ser Gly Cys 1070 1075 1080 Pro Ile Gln Arg Ile Ala Asp Tyr Gly Asp Trp Leu Gln Arg Phe 1085 1090 1095 Glu Thr Ala Leu Arg Ala Leu Pro Asp Arg Gln Arg His Ser Ser 1100 1105 1110 Leu Leu Pro Leu Leu His Asn Tyr Arg Gln Pro Glu Arg Pro Val 1115 1120 1125 Arg Gly Ser Ile Ala Pro Thr Asp Arg Phe Arg Ala Ala Val Gln 1130 1135 1140 Glu Ala Lys Ile Gly Pro Asp Lys Asp Ile Pro His Val Gly Ala 1145 1150 1155 Pro Ile Ile Val Lys Tyr Val Ser Asp Leu Arg Leu Leu Gly Leu 1160 1165 1170 Leu

Claims (55)

  1. 4-하이드록시부탄알을 생산하기에 충분한 양으로 발현된 4-하이드록시부탄알 경로 효소를 암호화하는 외래 핵산을 포함하는 4-하이드록시부탄알 경로를 갖는 미생물 유기체를 포함하는 비-천연 미생물 유기체로서, 상기 4-하이드록시부탄알 경로가 4-하이드록시부티레이트 리덕타제; 숙시닐-CoA 리덕타제(알데하이드 형성); 및 4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제를 포함하는 비-천연 미생물 유기체.
  2. 4-하이드록시부탄알을 생산하기에 충분한 양으로 발현된 4-하이드록시부탄알 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 4-하이드록시부탄알 경로를 갖는 미생물 유기체를 포함하는 비-천연 미생물 유기체로서, 상기 4-하이드록시부탄알 경로가 숙시닐-CoA 리덕타제(알데하이드 형성); 4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제; 및 4-하이드록시부티레이트 리덕타제를 포함하는 비-천연 미생물 유기체.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    하나 이상의 외래 핵산이 이종 핵산인 비-천연 미생물 유기체.
  4. 4-하이드록시부탄알을 생산하는 조건 하에서 상기 생산에 충분한 기간 동안 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 비-천연 미생물 유기체를 배양함을 포함하는, 4-하이드록시부탄알의 생산 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    비-천연 미생물 유기체가 실질적으로 혐기성인 배양 배지 중에 있는 생산 방법.
  6. 4-하이드록시부탄알을 생산하기에 충분한 양으로 발현된 4-하이드록시부탄알 경로 효소를 암호화하는 외래 핵산을 포함하는 4-하이드록시부탄알 경로를 갖는 미생물 유기체를 포함하는 비-천연 미생물 유기체로서, 상기 4-하이드록시부탄알 경로가 4-하이드록시부티레이트 리덕타제; 알파-케토글루타레이트 데카복실라제; 및 4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제를 포함하는 비-천연 미생물 유기체.
  7. 4-하이드록시부탄알을 생산하기에 충분한 양으로 발현된 4-하이드록시부탄알 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 4-하이드록시부탄알 경로를 갖는 미생물 유기체를 포함하는 비-천연 미생물 유기체로서, 상기 4-하이드록시부탄알 경로가 알파-케토글루타레이트 데카복실라제; 4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제; 및 4-하이드록시부티레이트 리덕타제를 포함하는 비-천연 미생물 유기체.
  8. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서,
    하나 이상의 외래 핵산이 이종 핵산인 비-천연 미생물 유기체.
  9. 4-하이드록시부탄알을 생산하는 조건 하에서 상기 생산에 충분한 기간 동안 제 6 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 비-천연 미생물 유기체를 배양함을 포함하는, 4-하이드록시부탄알의 생산 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    비-천연 미생물 유기체가 실질적으로 혐기성인 배양 배지 중에 있는 생산 방법.
  11. 4-하이드록시부탄알을 생산하기에 충분한 양으로 발현된 4-하이드록시부탄알 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 4-하이드록시부탄알 경로를 갖는 미생물 유기체를 포함하는 비-천연 미생물 유기체로서, 상기 4-하이드록시부탄알 경로가 숙시네이트 리덕타제; 4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제; 및 4-하이드록시부티레이트 리덕타제를 포함하는 비-천연 미생물 유기체.
  12. 제 11 항에 있어서,
    숙시네이트 리덕타제; 4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제; 및 4-하이드록시부티레이트 리덕타제를 암호화하는 3 개의 외래 핵산을 포함하는 비-천연 미생물 유기체.
  13. 제 11 항에 있어서,
    하나 이상의 외래 핵산이 이종 핵산인 비-천연 미생물 유기체.
  14. 4-하이드록시부탄알을 생산하는 조건 하에서 상기 생산에 충분한 기간 동안 제 11 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 비-천연 미생물 유기체를 배양함을 포함하는, 4-하이드록시부탄알의 생산 방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    비-천연 미생물 유기체가 실질적으로 혐기성인 배양 배지 중에 있는 생산 방법.
  16. 4-하이드록시부탄알을 생산하기에 충분한 양으로 발현된 4-하이드록시부탄알 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 4-하이드록시부탄알 경로를 갖는 미생물 유기체를 포함하는 비-천연 미생물 유기체로서, 상기 4-하이드록시부탄알 경로가 알파-케토글루타레이트 데카복실라제, 또는 글루타메이트 데하이드로게나제 또는 글루타메이트 트랜스아미나제 및 글루타메이트 데카복실라제 및 4-아미노부티레이트 데하이드로게나제 또는 4-아미노부티레이트 트랜스아미나제; 4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제; 및 4-하이드록시부티레이트 리덕타제를 포함하는 비-천연 미생물 유기체.
  17. 제 16 항에 있어서,
    알파-케토글루타레이트 데카복실라제, 또는 글루타메이트 데하이드로게나제 또는 글루타메이트 트랜스아미나제 및 글루타메이트 데카복실라제 및 4-아미노부티레이트 데하이드로게나제 또는 4-아미노부티레이트 트랜스아미나제; 4-하이드록시부티레이트 데하이드로게나제; 및 4-하이드록시부티레이트 리덕타제를 암호화하는 3 개 이상의 외래 핵산을 포함하는 비-천연 미생물 유기체.
  18. 제 16 항에 있어서,
    하나 이상의 외래 핵산이 이종 핵산인 비-천연 미생물 유기체.
  19. 4-하이드록시부탄알을 생산하는 조건 하에서 상기 생산에 충분한 기간 동안 제 16 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 따른 비-천연 미생물 유기체를 배양함을 포함하는, 4-하이드록시부탄알의 생산 방법.
  20. 제 19 항에 있어서,
    비-천연 미생물 유기체가 실질적으로 혐기성인 배양 배지 중에 있는 생산 방법.
  21. 4-하이드록시부탄알을 생산하기에 충분한 양으로 발현된 4-하이드록시부탄알 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 4-하이드록시부탄알 경로를 갖는 미생물 유기체를 포함하는 비-천연 미생물 유기체로서, 상기 4-하이드록시부탄알 경로가 알파-케토글루타레이트 리덕타제; 5-하이드록시-2-옥소펜타노에이트 데하이드로게나제; 및 5-하이드록시-2-옥소펜타노에이트 데카복실라제를 포함하는 비-천연 미생물 유기체.
  22. 제 21 항에 있어서,
    알파-케토글루타레이트 리덕타제; 5-하이드록시-2-옥소펜타노에이트 데하이드로게나제; 및 5-하이드록시-2-옥소펜타노에이트 데카복실라제를 암호화하는 3 개의 외래 핵산을 포함하는 비-천연 미생물 유기체.
  23. 제 21 항에 있어서,
    하나 이상의 외래 핵산이 이종 핵산인 비-천연 미생물 유기체.
  24. 4-하이드록시부탄알을 생산하는 조건 하에서 상기 생산에 충분한 기간 동안 제 21 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 따른 비-천연 미생물 유기체를 배양함을 포함하는, 4-하이드록시부탄알의 생산 방법.
  25. 제 24 항에 있어서,
    비-천연 미생물 유기체가 실질적으로 혐기성인 배양 배지 중에 있는 생산 방법.
  26. 푸트레신을 생산하기에 충분한 양으로 발현된 푸트레신 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 푸트레신 경로를 갖는 미생물 유기체를 포함하는 비-천연 미생물 유기체로서, 상기 푸트레신 경로가 숙시네이트 리덕타제; 4-아미노부티레이트 데하이드로게나제 또는 4-아미노부티레이트 트랜스아미나제; 4-아미노부티레이트 리덕타제; 및 푸트레신 데하이드로게나제 또는 푸트레신 트랜스아미나제를 포함하는 비-천연 미생물 유기체.
  27. 제 26 항에 있어서,
    숙시네이트 리덕타제; 4-아미노부티레이트 데하이드로게나제 또는 4-아미노부티레이트 트랜스아미나제; 4-아미노부티레이트 리덕타제; 및 푸트레신 데하이드로게나제 또는 푸트레신 트랜스아미나제를 암호화하는 4 개의 외래 핵산을 포함하는 비-천연 미생물 유기체.
  28. 제 26 항에 있어서,
    하나 이상의 외래 핵산이 이종 핵산인 비-천연 미생물 유기체.
  29. 푸트레신을 생산하는 조건 하에서 상기 생산에 충분한 기간 동안 제 26 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 따른 비-천연 미생물 유기체를 배양함을 포함하는, 푸트레신의 생산 방법.
  30. 제 29 항에 있어서,
    비-천연 미생물 유기체가 실질적으로 혐기성인 배양 배지 중에 있는 생산 방법.
  31. 푸트레신을 생산하기에 충분한 양으로 발현된 푸트레신 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 푸트레신 경로를 갖는 미생물 유기체를 포함하는 비-천연 미생물 유기체로서, 상기 푸트레신 경로가 알파-케토글루타레이트 데카복실라제; 4-아미노부티레이트 데하이드로게나제 또는 4-아미노부티레이트 트랜스아미나제; 4-아미노부티레이트 리덕타제; 및 푸트레신 데하이드로게나제 또는 푸트레신 트랜스아미나제를 포함하는 비-천연 미생물 유기체.
  32. 제 31 항에 있어서,
    알파-케토글루타레이트 데카복실라제; 4-아미노부티레이트 데하이드로게나제 또는 4-아미노부티레이트 트랜스아미나제; 4-아미노부티레이트 리덕타제; 및 푸트레신 데하이드로게나제 또는 푸트레신 트랜스아미나제를 암호화하는 4 개의 외래 핵산을 포함하는 비-천연 미생물 유기체.
  33. 제 31 항에 있어서,
    하나 이상의 외래 핵산이 이종 핵산인 비-천연 미생물 유기체.
  34. 푸트레신을 생산하는 조건 하에서 상기 생산에 충분한 기간 동안 제 31 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 따른 비-천연 미생물 유기체를 배양함을 포함하는, 푸트레신의 생산 방법.
  35. 제 34 항에 있어서,
    비-천연 미생물 유기체가 실질적으로 혐기성인 배양 배지 중에 있는 생산 방법.
  36. 푸트레신을 생산하기에 충분한 양으로 발현된 푸트레신 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 푸트레신 경로를 갖는 미생물 유기체를 포함하는 비-천연 미생물 유기체로서, 상기 푸트레신 경로가 글루타메이트 데하이드로게나제 또는 글루타메이트 트랜스아미나제; 글루타메이트 데카복실라제; 4-아미노부티레이트 리덕타제; 및 푸트레신 데하이드로게나제 또는 푸트레신 트랜스아미나제를 포함하는 비-천연 미생물 유기체.
  37. 제 36 항에 있어서,
    글루타메이트 데하이드로게나제 또는 글루타메이트 트랜스아미나제; 글루타메이트 데카복실라제; 4-아미노부티레이트 리덕타제; 및 푸트레신 데하이드로게나제 또는 푸트레신 트랜스아미나제를 암호화하는 4 개의 외래 핵산을 포함하는 비-천연 미생물 유기체.
  38. 제 36 항에 있어서,
    하나 이상의 외래 핵산이 이종 핵산인 비-천연 미생물 유기체.
  39. 푸트레신을 생산하는 조건 하에서 상기 생산에 충분한 기간 동안 제 36 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 따른 비-천연 미생물 유기체를 배양함을 포함하는, 푸트레신의 생산 방법.
  40. 제 39 항에 있어서,
    비-천연 미생물 유기체가 실질적으로 혐기성인 배양 배지 중에 있는 생산 방법.
  41. 푸트레신을 생산하기에 충분한 양으로 발현된 푸트레신 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 푸트레신 경로를 갖는 미생물 유기체를 포함하는 비-천연 미생물 유기체로서, 상기 푸트레신 경로가 알파-케토글루타레이트 리덕타제; 5-아미노-2-옥소펜타노에이트 데하이드로게나제 또는 5-아미노-2-옥소펜타노에이트 트랜스아미나제; 5-아미노-2-옥소펜타노에이트 데카복실라제; 및 푸트레신 데하이드로게나제 또는 푸트레신 트랜스아미나제를 포함하는 비-천연 미생물 유기체.
  42. 제 41 항에 있어서,
    알파-케토글루타레이트 리덕타제; 5-아미노-2-옥소펜타노에이트 데하이드로게나제 또는 5-아미노-2-옥소펜타노에이트 트랜스아미나제; 5-아미노-2-옥소펜타노에이트 데카복실라제; 및 푸트레신 데하이드로게나제 또는 푸트레신 트랜스아미나제를 암호화하는 4 개의 외래 핵산을 포함하는 비-천연 미생물 유기체.
  43. 제 41 항에 있어서,
    하나 이상의 외래 핵산이 이종 핵산인 비-천연 미생물 유기체.
  44. 푸트레신을 생산하는 조건 하에서 상기 생산에 충분한 기간 동안 제 41 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 따른 비-천연 미생물 유기체를 배양함을 포함하는, 푸트레신의 생산 방법.
  45. 제 44 항에 있어서,
    비-천연 미생물 유기체가 실질적으로 혐기성인 배양 배지 중에 있는 생산 방법.
  46. 푸트레신을 생산하기에 충분한 양으로 발현된 푸트레신 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 푸트레신 경로를 갖는 미생물 유기체를 포함하는 비-천연 미생물 유기체로서, 상기 푸트레신 경로가 알파-케토글루타레이트 리덕타제; 5-아미노-2-옥소펜타노에이트 데하이드로게나제 또는 5-아미노-2-옥소펜타노에이트 트랜스아미나제; 오르니틴 데하이드로게나제 또는 오르니틴 트랜스아미나제; 및 오르니틴 데카복실라제를 포함하는 비-천연 미생물 유기체.
  47. 제 46 항에 있어서,
    알파-케토글루타레이트 리덕타제; 5-아미노-2-옥소펜타노에이트 데하이드로게나제 또는 5-아미노-2-옥소펜타노에이트 트랜스아미나제; 오르니틴 데하이드로게나제 또는 오르니틴 트랜스아미나제; 및 오르니틴 데카복실라제를 암호화하는 4 개의 외래 핵산을 포함하는 비-천연 미생물 유기체.
  48. 제 46 항에 있어서,
    하나 이상의 외래 핵산이 이종 핵산인 비-천연 미생물 유기체.
  49. 푸트레신을 생산하는 조건 하에서 상기 생산에 충분한 기간 동안 제 46 항 내지 제 48 항 중 어느 한 항에 따른 비-천연 미생물 유기체를 배양함을 포함하는, 푸트레신의 생산 방법.
  50. 제 49 항에 있어서,
    비-천연 미생물 유기체가 실질적으로 혐기성인 배양 배지 중에 있는 생산 방법.
  51. 4-하이드록시부티릴-CoA를 생산하기에 충분한 양으로 발현된 4-하이드록시부티릴-CoA(4-HBCoA) 경로 효소를 암호화하는 하나 이상의 외래 핵산을 포함하는 4-하이드록시부티릴-CoA 경로를 갖는 미생물 유기체를 포함하는 비-천연 미생물 유기체로서, 상기 4-하이드록시부티릴-CoA 경로가 알파-케토글루타레이트 리덕타제; 5-하이드록시-2-옥소펜타노에이트 데하이드로게나제; 및 5-하이드록시-2-옥소펜타노에이트 데하이드로게나제(탈카복실화)를 포함하는 비-천연 미생물 유기체.
  52. 제 51 항에 있어서,
    알파-케토글루타레이트 리덕타제; 5-하이드록시-2-옥소펜타노에이트 데하이드로게나제; 및 5-하이드록시-2-옥소펜타노에이트 데하이드로게나제(탈카복실화)를 암호화하는 3 개의 외래 핵산을 포함하는 비-천연 미생물 유기체.
  53. 제 51 항에 있어서,
    하나 이상의 외래 핵산이 이종 핵산인 비-천연 미생물 유기체.
  54. 4-하이드록시부티릴-CoA를 생산하는 조건 하에서 상기 생산에 충분한 기간 동안 제 51 항 내지 제 53 항 중 어느 한 항에 따른 비-천연 미생물 유기체를 배양함을 포함하는, 4-하이드록시부티릴-CoA의 생산 방법.
  55. 제 54 항에 있어서,
    비-천연 미생물 유기체가 실질적으로 혐기성인 배양 배지 중에 있는 생산 방법.
KR1020127012122A 2009-10-13 2010-10-13 1,4-부탄다이올, 4-하이드록시부탄알, 4-하이드록시부티릴-ｃｏａ, 푸트레신 및 관련 화합물의 제조를 위한 미생물 및 관련 방법 KR20120083908A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US25128709P 2009-10-13 2009-10-13
US61/251,287 2009-10-13

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20120083908A true KR20120083908A (ko) 2012-07-26

Family

ID=43876524

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020127012122A KR20120083908A (ko) 2009-10-13 2010-10-13 1,4-부탄다이올, 4-하이드록시부탄알, 4-하이드록시부티릴-ｃｏａ, 푸트레신 및 관련 화합물의 제조를 위한 미생물 및 관련 방법

Country Status (10)

Country Link
US (6) US8377666B2 (ko)
EP (1) EP2488652A4 (ko)
JP (1) JP2013507145A (ko)
KR (1) KR20120083908A (ko)
CN (2) CN102762735B (ko)
AU (1) AU2010306785B2 (ko)
CA (1) CA2777459A1 (ko)
CO (1) CO6541567A2 (ko)
MX (1) MX2012004291A (ko)
WO (1) WO2011047101A1 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160095053A (ko) * 2013-12-05 2016-08-10 알이지 라이프 사이언시스, 엘엘씨 지방족 아민의 미생물 생성
WO2023140687A1 (ko) * 2022-01-21 2023-07-27 대상 주식회사 1,4-부탄디올을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 1,4-부탄디올의 생산 방법

Families Citing this family (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8129154B2 (en) 2008-06-17 2012-03-06 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for the biosynthesis of fumarate, malate, and acrylate
BRPI0915749A2 (pt) * 2008-07-08 2018-07-10 Opx Biotechnologies Inc métodos, composições e sistemas para produção biossintética de 1,4-butanodiol
CA2735883C (en) 2008-09-10 2020-05-05 Genomatica, Inc. Microorganisms for the production of 1,4-butanediol
CA2746952A1 (en) 2008-12-16 2010-06-24 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for conversion of syngas and other carbon sources to useful products
KR102176554B1 (ko) 2009-06-04 2020-11-09 게노마티카 인코포레이티드 발효액 성분들의 분리 방법
JP2012529889A (ja) * 2009-06-10 2012-11-29 ゲノマチカ， インク． Ｍｅｋ及び２−ブタノールの炭素効率のよい生合成のための微生物及び方法
US8377666B2 (en) 2009-10-13 2013-02-19 Genomatica, Inc. Microorganisms for the production of 1,4-butanediol, 4-hydroxybutanal, 4-hydroxybutyryl-coa, putrescine and related compounds, and methods related thereto
MX2012006602A (es) 2009-12-10 2012-08-01 Genomatica Inc Metodos y organismos para convertir el gas de sintesis u otras fuentes de carbono gaseoso y metanol a 1, 3 - butanodiol.
US8445244B2 (en) 2010-02-23 2013-05-21 Genomatica, Inc. Methods for increasing product yields
AU2012273177A1 (en) * 2011-06-22 2013-05-02 Genomatica, Inc. Microorganisms for producing 1,3-butanediol and methods related thereto
WO2012177601A2 (en) * 2011-06-22 2012-12-27 Genomatica, Inc. Microorganisms for producing isobutanol and methods related thereto
AU2012273093A1 (en) * 2011-06-22 2013-05-02 Genomatica, Inc. Microorganisms for producing 6-aminocaproic acid
AU2012272856A1 (en) 2011-06-22 2013-05-02 Genomatica, Inc. Microorganisms for producing 1,4-butanediol and methods related thereto
PE20141569A1 (es) 2011-11-11 2014-11-08 Ajinomoto Kk Metodo para producir una sustancia diana mediante fermentacion
WO2013152052A2 (en) * 2012-04-02 2013-10-10 Ls9, Inc. Novel car enzymes and improved production of fatty alcohols
EP2850180A1 (en) 2012-05-18 2015-03-25 Novozymes A/S Bacterial mutants with improved transformation efficiency
SI2855687T1 (sl) * 2012-06-04 2020-09-30 Genomatica, Inc. Mikroorganizmi in metode za proizvodnjo 4-hidroksibutirat, 1,4-butandiola in sorodne spojine
KR102023618B1 (ko) 2012-07-27 2019-09-20 삼성전자주식회사 1,4-ｂｄｏ 생성능이 개선된 변이 미생물 및 이를 이용한 1,4-ｂｄｏ의 제조방법
KR20150040359A (ko) 2012-08-10 2015-04-14 오피엑스 바이오테크놀로지스, 인크. 지방산 및 지방산 유도된 산물의 생산을 위한 미생물 및 방법
EP2898082B1 (en) 2012-09-20 2019-09-04 LCY Bioscience Inc. Pathways to adipate semialdehyde and other organic products
CN104619721A (zh) 2012-09-27 2015-05-13 诺维信股份有限公司 具有改进的转化效率的细菌突变体
US9932611B2 (en) * 2012-10-22 2018-04-03 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for enhancing the availability of reducing equivalents in the presence of methanol, and for producing succinate related thereto
JPWO2014080683A1 (ja) * 2012-11-26 2017-01-05 昭和電工株式会社 １，４−ブタンジオールの製造方法及び微生物
WO2014083920A1 (ja) * 2012-11-27 2014-06-05 昭和電工株式会社 １，４－ブタンジオールの製造方法及び微生物
US9677096B2 (en) 2012-12-05 2017-06-13 Showa Denko K.K. Manufacturing method for 1,4-butanediol, microbe, and gene
US10202623B2 (en) * 2013-01-21 2019-02-12 Sekisui Chemical Co., Ltd. Recombinant cell, and method for producing 1,4-butanediol
WO2014146026A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Opx Biotechnologies, Inc. Bioproduction of chemicals
WO2014145332A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Opx Biotechnologies, Inc. Monfunctional mcr + 3-hp dehydrogenase
EP3964493B1 (en) 2013-03-15 2024-03-27 Genomatica, Inc. Process and systems for obtaining 1,4-butanediol from fermentation broths
US20140371417A1 (en) * 2013-04-26 2014-12-18 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for production of 4-hydroxybutyrate, 1,4-butanediol and related compounds
CN103451123B (zh) * 2013-06-08 2015-10-21 江苏省农业科学院 溶酪大球菌及其制备方法和应用
EP3022310B1 (en) 2013-07-19 2019-10-16 Cargill, Incorporated Microorganisms and methods for the production of fatty acids and fatty acid derived products
US11408013B2 (en) 2013-07-19 2022-08-09 Cargill, Incorporated Microorganisms and methods for the production of fatty acids and fatty acid derived products
KR101849339B1 (ko) * 2013-09-30 2018-04-17 삼성디스플레이 주식회사 플렉서블 표시장치
SI3077501T1 (sl) 2013-12-03 2022-02-28 Genomatica, Inc. Mikroorganizmi in metode za izboljšanje donosa izdelkov z uporabo sinteze acetil-coa
US10597684B2 (en) 2013-12-27 2020-03-24 Genomatica, Inc. Methods and organisms with increased carbon flux efficiencies
WO2015108777A1 (en) 2014-01-16 2015-07-23 Papoutsakis Eleftherios T Synthetic methylotrophy to liquid fuels and chemicals
WO2015158716A1 (en) 2014-04-16 2015-10-22 Novamont S.P.A. Process for the production of 1,4-butanediol
WO2015167043A1 (ko) 2014-04-30 2015-11-05 삼성전자 주식회사 증가된 알파-케토글루타레이트 데카르복실라제 활성을 갖는 미생물 및 이를 이용한 1,4-부탄디올 생산방법
EP2993228B1 (en) 2014-09-02 2019-10-09 Cargill, Incorporated Production of fatty acid esters
US20170298363A1 (en) 2014-09-18 2017-10-19 Genomatica, Inc Non-natural microbial organisms with improved energetic efficiency
EP3026118A1 (de) * 2014-11-25 2016-06-01 LANXESS Deutschland GmbH Enzymatisches Verfahren zur Herstellung von 3-Butenal und 3-Buten-1-ol
US10072150B2 (en) * 2014-12-22 2018-09-11 INVISTA North America S.à r.l. Methods and materials for the production of monomers for nylon-4/polyester production
AU2016222565A1 (en) 2015-02-27 2017-09-28 White Dog Labs, Inc. Mixotrophic fermentation method for making acetone, isopropanol, butyric acid and other bioproducts, and mixtures thereof
CN105441372A (zh) * 2015-10-30 2016-03-30 清华大学 一种重组谷氨酸棒杆菌与应用
EP3374505A4 (en) * 2015-11-12 2019-05-01 Lygos, Inc. RECOMBINANT HOST CELLS AND METHODS OF ANAEROBIC PRODUCTION OF L-ASPARTATE AND BETA-ALANINE
CN106222122A (zh) * 2016-07-20 2016-12-14 江南大学 大肠杆菌工程菌及其催化马来酸合成富马酸的方法
EP3577227A4 (en) 2017-02-02 2020-12-30 Cargill Inc. GENETICALLY MODIFIED CELLS PRODUCING C6-C10 FATTY ACID DERIVATIVES
WO2018183664A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Genomatica, Inc. Aldehyde dehydrogenase variants and methods of use
US11898172B2 (en) * 2017-03-31 2024-02-13 Genomatica, Inc. 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase variants and methods of use
CN107099558B (zh) * 2017-04-25 2021-06-11 华东理工大学 一种同时生物合成1，3-丙二醇和乙偶姻的新方法
EP3486324B1 (en) * 2017-11-17 2020-06-10 Enzymicals AG Method for preparing amines from carbonyl compounds by transaminase reaction under salt precipitation
MX2020005449A (es) 2017-11-27 2020-08-27 Novamont Spa Procedimiento para la produccion de 1,4-butanodiol a partir de fuentes renovables y poliesteres obtenidos del mismo.
US20210079334A1 (en) 2018-01-30 2021-03-18 Genomatica, Inc. Fermentation systems and methods with substantially uniform volumetric uptake rate of a reactive gaseous component
US11541105B2 (en) 2018-06-01 2023-01-03 The Research Foundation For The State University Of New York Compositions and methods for disrupting biofilm formation and maintenance
US20220119821A1 (en) * 2018-06-25 2022-04-21 Lygos, Inc. Recombinant host cells and methods for the production of aspartic acid and b-alanine
US11634692B2 (en) 2018-09-26 2023-04-25 Genomatica, Inc. Aldehyde dehydrogenase variants and methods of using same
IT202000013243A1 (it) 2020-06-04 2021-12-04 Novamont Spa Processo per la purificazione di una miscela di dioli
WO2023069957A1 (en) * 2021-10-20 2023-04-27 Genomatica, Inc. Aldehyde dehydrogenase variants and methods of use
IT202100030572A1 (it) 2021-12-02 2023-06-02 Novamont Spa 1,3-butandiolo purificato da una miscela di dioli
CN116083329A (zh) * 2022-09-26 2023-05-09 北京绿色康成生物技术有限公司 发酵生产γ-丁内酯或1,4-丁二醇的方法

Family Cites Families (209)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4076948A (en) 1968-10-10 1978-02-28 El Paso Products Company Process for treatment of adipic acid mother liquor
US3513209A (en) 1968-08-19 1970-05-19 Du Pont Method of making 1,4-cyclohexadiene
GB1230276A (ko) 1968-12-09 1971-04-28
US3965182A (en) 1969-10-02 1976-06-22 Ethyl Corporation Preparation of aniline from phenol and ammonia
JPS4831084B1 (ko) 1970-09-04 1973-09-26
GB1344557A (en) 1972-06-23 1974-01-23 Mitsubishi Petrochemical Co Process for preparing 1,4-butanediol
JPS5543759B2 (ko) 1972-06-28 1980-11-07
DE2455617C3 (de) 1974-11-23 1982-03-18 Basf Ag, 6700 Ludwigshafen Verfahren zur Herstellung von Butandiol und/oder Tetrahydrofuran über die Zwischenstufe des &gamma;-Butyrolactons
DE2501499A1 (de) 1975-01-16 1976-07-22 Hoechst Ag Verfahren zur herstellung von butandiol-(1.4)
US4190495A (en) 1976-09-27 1980-02-26 Research Corporation Modified microorganisms and method of preparing and using same
GB1583517A (en) 1977-05-04 1981-01-28 Jackson J F Solid bowl decanter centrifuges of the scroll discharge type
DE2842575A1 (de) 1977-10-04 1979-04-12 Broadbent & Sons Ltd Thomas Vollmantel-abklaerzentrifuge
JPS575693A (en) 1980-06-13 1982-01-12 Ajinomoto Co Inc Production of l-arginine through fermentation process
US4301077A (en) 1980-12-22 1981-11-17 Standard Oil Company Process for the manufacture of 1-4-butanediol and tetrahydrofuran
JPS60114197A (ja) 1983-11-25 1985-06-20 Agency Of Ind Science & Technol 微生物によるジカルボン酸の製造法
US4871667A (en) 1984-11-26 1989-10-03 Agency Of Industrial Science & Technology Process for preparing muconic acid
US4652685A (en) 1985-11-15 1987-03-24 General Electric Company Hydrogenation of lactones to glycols
US5168055A (en) 1986-06-11 1992-12-01 Rathin Datta Fermentation and purification process for succinic acid
US5143834A (en) 1986-06-11 1992-09-01 Glassner David A Process for the production and purification of succinic acid
EP0249773B1 (en) 1986-06-11 1992-12-16 Michigan Biotechnology Institute A process for the production of succinic acid by anaerobic fermentation
US5182199A (en) 1987-05-27 1993-01-26 Hartley Brian S Thermophilic ethanol production in a two-stage closed system
US5250430A (en) 1987-06-29 1993-10-05 Massachusetts Institute Of Technology Polyhydroxyalkanoate polymerase
US5245023A (en) 1987-06-29 1993-09-14 Massachusetts Institute Of Technology Method for producing novel polyester biopolymers
US4876331A (en) 1987-08-18 1989-10-24 Mitsubishi Kasei Corporation Copolyester and process for producing the same
WO1989010410A1 (en) 1988-04-27 1989-11-02 Daicel Chemical Industries, Ltd. Process for preparing optically active 1,3-butanediol
US4879420A (en) * 1988-05-06 1989-11-07 E.I. Du Pont De Nemours And Company Preparation of mixtures of butanediols
ATE85813T1 (de) 1988-12-12 1993-03-15 Unilever Nv Verfahren zur mikrobiologischen herstellung von 1,3-propandiol aus glycerin.
EP0470172B1 (en) 1989-04-27 1995-06-28 BioControl Systems, Incorporated Precipitate test for microorganisms
US5192673A (en) 1990-04-30 1993-03-09 Michigan Biotechnology Institute Mutant strain of C. acetobutylicum and process for making butanol
US5079143A (en) 1990-05-02 1992-01-07 The Upjohn Company Method of indentifying compounds useful as antiparasitic drugs
GB9011777D0 (en) 1990-05-25 1990-07-18 Ici Plc Hv/hb copolymer production
US6682906B1 (en) 1990-09-21 2004-01-27 The Regents Of The University Of California Cloned glutamic acid decarboxylase
US5475086A (en) 1990-09-21 1995-12-12 The Regents Of The University Of California Cloned glutamic acid decarboxylase peptides
US5674978A (en) 1990-09-21 1997-10-07 The Regents Of The University Of California Peptides derived from glutamic acid decarboxylase
US5998366A (en) 1990-09-21 1999-12-07 The Regents Of The University Of California Method for ameliorating glutamic acid decarboxylase associated autoimmune disorders
US5173429A (en) 1990-11-09 1992-12-22 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Clostridiumm ljungdahlii, an anaerobic ethanol and acetate producing microorganism
IL100572A (en) 1991-01-03 1997-01-10 Lepetit Spa Amides of antibiotic ge 2270 factors their preparation and pharmaceutical compositions containing them
GB9108756D0 (en) 1991-04-24 1991-06-12 Ici Plc Production of polyalkanoate in plants
US5286842A (en) 1991-07-01 1994-02-15 Mitsubishi Kasei Corporation Process for producing a biodegradable polymer
GB9115245D0 (en) 1991-07-16 1991-08-28 Ici Plc Production of polyalkanoate
ATE295891T1 (de) 1991-07-19 2005-06-15 Univ Michigan State Transgene pflanzen die polyhydroxyalkanoate produzieren
US5610041A (en) 1991-07-19 1997-03-11 Board Of Trustees Operating Michigan State University Processes for producing polyhydroxybutyrate and related polyhydroxyalkanoates in the plastids of higher plants
BR9203053A (pt) 1991-08-07 1993-03-30 Ajinomoto Kk Processo para produzir acido l-glutamico pro fermentacao
JP2777757B2 (ja) 1991-09-17 1998-07-23 鐘淵化学工業株式会社 共重合体およびその製造方法
DE4220759A1 (de) 1992-06-24 1994-01-05 Inst Genbiologische Forschung DNA-Sequenzen für Oligosaccharid-Transporter, Plasmide, Bakterien und Pflanzen enthaltend einen Transporter sowie Verfahren zur Herstellung und Transformation von Hefestämmen zur Identifikation des Transporteers
US5416020A (en) 1992-09-29 1995-05-16 Bio-Technical Resources Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus strain and fermentation process for producing L-(+)-lactic acid
US6136577A (en) 1992-10-30 2000-10-24 Bioengineering Resources, Inc. Biological production of ethanol from waste gases with Clostridium ljungdahlii
US5807722A (en) 1992-10-30 1998-09-15 Bioengineering Resources, Inc. Biological production of acetic acid from waste gases with Clostridium ljungdahlii
EP0625006A4 (en) 1992-11-20 1996-04-24 Agracetus Transgenic cotton plants producing heterologous bioplastic.
JP3263710B2 (ja) 1992-12-11 2002-03-11 高砂香料工業株式会社 生分解性光学活性ポリマー及びその製造方法
FR2702492B1 (fr) 1993-03-12 1995-05-24 Rhone Poulenc Chimie Procédé de production par fermentation d'acide itaconique.
JP3241505B2 (ja) 1993-08-11 2001-12-25 高砂香料工業株式会社 生分解性光学活性コポリマー及びその製造方法
US5487987A (en) 1993-09-16 1996-01-30 Purdue Research Foundation Synthesis of adipic acid from biomass-derived carbon sources
HU221120B1 (en) 1993-10-28 2002-08-28 Ajinomoto Kk Process for producing different substances with use of microorganism
GB9414506D0 (en) 1994-07-18 1994-09-07 Zeneca Ltd Improved production of polyhydroxyalkanoate
DE4433134A1 (de) 1994-09-16 1996-03-21 Buck Chem Tech Werke Verfahren zur Herstellung von Polyhydroxyfettsäuren sowie rekombinanter Bakterienstämme zur Durchführung des Verfahrens
US5563239A (en) 1994-11-09 1996-10-08 Eastman Chemical Company Composition and process for the production of poly(3-hydroxyalkanoates)
US5521075A (en) 1994-12-19 1996-05-28 Michigan Biotechnology Institute Method for making succinic acid, anaerobiospirillum succiniciproducens variants for use in process and methods for obtaining variants
US5504004A (en) 1994-12-20 1996-04-02 Michigan Biotechnology Institute Process for making succinic acid, microorganisms for use in the process and methods of obtaining the microorganisms
US5700934A (en) 1995-03-01 1997-12-23 Dsm N.V. Process for the preparation of epsilon-caprolactam and epsilon-caprolactam precursors
US5478952A (en) 1995-03-03 1995-12-26 E. I. Du Pont De Nemours And Company Ru,Re/carbon catalyst for hydrogenation in aqueous solution
US5863782A (en) 1995-04-19 1999-01-26 Women's And Children's Hospital Synthetic mammalian sulphamidase and genetic sequences encoding same
US5686276A (en) 1995-05-12 1997-11-11 E. I. Du Pont De Nemours And Company Bioconversion of a fermentable carbon source to 1,3-propanediol by a single microorganism
FR2736927B1 (fr) 1995-07-18 1997-10-17 Rhone Poulenc Fibres & Polymer Enzymes a activite amidase, outils genetiques et microorganismes hotes permettant leur obtention et procede d'hydrolyse mettant en oeuvre lesdites enzymes
US5747311A (en) 1995-08-22 1998-05-05 Microgen Corporation Process for chemical modification of reactants by microbes
US5573931A (en) 1995-08-28 1996-11-12 Michigan Biotechnology Institute Method for making succinic acid, bacterial variants for use in the process, and methods for obtaining variants
US5770435A (en) 1995-11-02 1998-06-23 University Of Chicago Mutant E. coli strain with increased succinic acid production
US5869301A (en) 1995-11-02 1999-02-09 Lockhead Martin Energy Research Corporation Method for the production of dicarboxylic acids
DE19543635A1 (de) 1995-11-23 1997-05-28 Hp Chemie Pelzer Res & Dev Verbundwerkstoffe aus Polyhydroxyfettsäuren und Fasermaterialien
US5849894A (en) 1995-11-29 1998-12-15 Monsanto Company Rhodospirillum rubrum poly-β-hydroxyalkanoate synthase
CA2247038A1 (en) 1996-02-27 1997-09-04 Michigan State University Cloning and expression of the gene encoding thermoanaerobacter ethanolicus 39e secondary-alcohol dehydrogenase and enzyme biochemical characterization
US5959179A (en) 1996-03-13 1999-09-28 Monsanto Company Method for transforming soybeans
US6091002A (en) 1996-03-13 2000-07-18 Monsanto Company Polyhydroxyalkanoates of narrow molecular weight distribution prepared in transgenic plants
US5958745A (en) 1996-03-13 1999-09-28 Monsanto Company Methods of optimizing substrate pools and biosynthesis of poly-β-hydroxybutyrate-co-poly-β-hydroxyvalerate in bacteria and plants
DE69638265D1 (de) 1996-07-01 2010-11-11 Emmaus Foundation Inc BIOLOGISCHE HESTELLUNG VON ESSIGSäURE AUS ABGASEN
US5750848A (en) 1996-08-13 1998-05-12 Monsanto Company DNA sequence useful for the production of polyhydroxyalkanoates
KR100459818B1 (ko) 1996-09-02 2004-12-03 이. 아이. 두퐁 드 느무르 앤드 컴퍼니 ε-카프로락탐의 제조방법
US6730503B1 (en) 1996-09-19 2004-05-04 Roche Vitamins Inc. Alcohol/aldehyde dehydrogenase
JPH10166664A (ja) 1996-12-12 1998-06-23 Casio Electron Mfg Co Ltd カラー印刷装置
EP0977865A1 (en) 1997-02-13 2000-02-09 James Madison University Methods of making polyhydroxyalkanoates comprising 4-hydroxybutyrate monomer units
KR100516986B1 (ko) 1997-02-19 2005-09-26 코닌클리즈케 디에스엠 엔.브이. 6-아미노카프론산 유도체를 과열 수증기와 접촉시킴으로써 촉매 없이 카프로락탐을 제조하는 방법
US6759219B2 (en) 1997-03-03 2004-07-06 Metabolix, Inc. Methods for the biosynthesis of polyesters
US6274790B1 (en) 1997-04-14 2001-08-14 The University Of British Columbia Nucleic acids encoding a plant enzyme involved in very long chain fatty acid synthesis
DE69837917T2 (de) 1997-04-21 2008-02-21 Metabolix, Inc., Cambridge Endstellige hydroxyl aufweisende polyhydroxyalkanoate
US6156852A (en) 1997-04-21 2000-12-05 Monsanto Company Hydroxy-terminated polyhydroxyalkanoates
KR19990013007A (ko) 1997-07-31 1999-02-25 박원훈 형질전환된 대장균 ｓｓ373(ｋｃｔｃ 8818ｐ)과 이를 이용한숙신산의 생산방법
WO1999014313A2 (en) 1997-09-19 1999-03-25 Metabolix, Inc. Biological systems for manufacture of polyhydroxylalkanoate polymers containing 4-hydroxyacids
JPH11103863A (ja) 1997-10-08 1999-04-20 Nippon Shokubai Co Ltd マレイン酸異性化酵素遺伝子
US6228579B1 (en) 1997-11-14 2001-05-08 San Diego State University Foundation Method for identifying microbial proliferation genes
US6280986B1 (en) 1997-12-01 2001-08-28 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Stabilization of pet operon plasmids and ethanol production in bacterial strains lacking lactate dehydrogenase and pyruvate formate lyase activities
US20030087381A1 (en) 1998-04-13 2003-05-08 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Metabolically engineered organisms for enhanced production of oxaloacetate-derived biochemicals
EP2194122B1 (en) 1998-04-13 2015-12-02 The University Of Georgia Research Foundation, Inc. Pyruvate carboxylase overexpression for enhanced production of oxaloacetate-derived biochemicals in microbial cells
US6159738A (en) 1998-04-28 2000-12-12 University Of Chicago Method for construction of bacterial strains with increased succinic acid production
US6432686B1 (en) 1998-05-12 2002-08-13 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method for the production of 1,3-propanediol by recombinant organisms comprising genes for vitamin B12 transport
US6444784B1 (en) 1998-05-29 2002-09-03 Exxonmobil Research & Engineering Company Wax crystal modifiers (LAW657)
WO2000004163A1 (en) 1998-07-15 2000-01-27 E.I. Du Pont De Nemours And Company Tetrahydrofolate metabolism enzymes
DE69938105T2 (de) 1998-08-04 2009-01-29 Metabolix, Inc., Cambridge Herstellung von polyhydroxyalkanoaten aus polyolen
MXPA01001750A (es) 1998-08-18 2002-04-08 Metabolix Inc Productos microbianos transgenicos de polihidroxialcanoato.
DE19856136C2 (de) 1998-12-04 2002-10-24 Pasteur Institut Verfahren und Vorrichtung zur Selektion beschleunigter Proliferation lebender Zellen in Suspension
US6835820B2 (en) 1999-01-07 2004-12-28 The University Of Massachusetts Polyhydroxyalkanoate biosynthesis associated proteins and coding region in bacillus megaterium
EP1147229A2 (en) 1999-02-02 2001-10-24 Bernhard O. Palsson Methods for identifying drug targets based on genomic sequence data
US6686310B1 (en) 1999-02-09 2004-02-03 E. I. Du Pont De Nemours And Company High surface area sol-gel route prepared hydrogenation catalysts
US6365376B1 (en) 1999-02-19 2002-04-02 E. I. Du Pont De Nemours And Company Genes and enzymes for the production of adipic acid intermediates
AU3516100A (en) 1999-03-05 2000-09-21 Monsanto Technology Llc Multigene expression vectors for the biosynthesis of products via multienzyme biological pathways
KR100329019B1 (ko) 1999-04-13 2002-03-18 윤덕용 유기산의 고효율 생산방법
US6485947B1 (en) 1999-05-21 2002-11-26 Cargill Dow Polymers, Llc Production of lactate using crabtree negative organisms in varying culture conditions
ATE335823T1 (de) 1999-08-18 2006-09-15 Du Pont Verfahren zur biologischen herstellung von 1,3- propandiol
US6852517B1 (en) 1999-08-30 2005-02-08 Wisconsin Alumni Research Foundation Production of 3-hydroxypropionic acid in recombinant organisms
US6361983B1 (en) 1999-09-30 2002-03-26 E. I. Du Pont De Nemours And Company Process for the isolation of 1,3-propanediol from fermentation broth
DE19956686A1 (de) 1999-11-25 2001-05-31 Degussa Neue für die Gene sucC und sucD codierende Nukleotidsequenzen
US6897055B2 (en) 1999-11-25 2005-05-24 Degussa Ag Nucleotide sequences coding for the genes sucC and sucD
US6660857B2 (en) 2000-02-03 2003-12-09 Dsm N.V. Process for the preparation of ε-caprolactam
US6878861B2 (en) 2000-07-21 2005-04-12 Washington State University Research Foundation Acyl coenzyme A thioesterases
KR20040014389A (ko) 2000-07-21 2004-02-14 메타볼릭스 인코포레이티드 폴리올로부터 폴리하이드록시알칸노에이트를 제조하는 방법
NZ523484A (en) 2000-07-25 2005-01-28 Emmaus Foundation Inc Methods for increasing the production of ethanol from microbial fermentation
WO2002016627A2 (en) 2000-08-18 2002-02-28 Tepha, Inc. Sulfur containing polyhydroxyalkanoate compositions and method of production
US6916637B2 (en) 2000-09-30 2005-07-12 Degussa Ag Fermentation process for the preparation of L-amino acids using strains of the family Enterobacteriaceae
JP4490628B2 (ja) 2000-11-20 2010-06-30 カーギル インコーポレイテッド ３−ヒドロキシプロピオン酸および他の有機化合物
CA2430270A1 (en) 2000-11-22 2002-05-30 Cargill Dow Polymers, Llc Methods and materials for the synthesis of organic products
CN1358841A (zh) 2000-12-11 2002-07-17 云南省微生物研究所 云南链霉菌
CA2433529A1 (en) 2000-12-28 2002-07-11 Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha Process for producing prenyl alcohol
US7711490B2 (en) 2001-01-10 2010-05-04 The Penn State Research Foundation Method and system for modeling cellular metabolism
US7127379B2 (en) 2001-01-31 2006-10-24 The Regents Of The University Of California Method for the evolutionary design of biochemical reaction networks
JP2004533037A (ja) 2001-03-01 2004-10-28 ザ・レジェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・カリフォルニア 調節された反応ネットワークの全体的特性を決定するためのモデルおよび方法
US6743610B2 (en) 2001-03-30 2004-06-01 The University Of Chicago Method to produce succinic acid from raw hydrolysates
US7052883B2 (en) 2001-04-03 2006-05-30 Degussa Ag Process for the production of L-amino acids using strains of the family Enterobacteriaceae that contain an attenuated fruR gene
EP1407035B1 (en) 2001-07-18 2006-04-12 Degussa AG Process for the preparation of l-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family which contain an attenuated aspa gene
CA2356540A1 (en) 2001-08-30 2003-02-28 Emory University Expressed dna sequences involved in mitochondrial functions
US7256016B2 (en) 2001-11-02 2007-08-14 Rice University Recycling system for manipulation of intracellular NADH availability
US20090158452A1 (en) 2001-12-04 2009-06-18 Johnson Richard G Transgenic plants with enhanced agronomic traits
US20090100536A1 (en) 2001-12-04 2009-04-16 Monsanto Company Transgenic plants with enhanced agronomic traits
CN1217001C (zh) 2002-01-04 2005-08-31 清华大学 一种生产d－(－)－3－羟基丁酸的方法
WO2003062173A2 (en) 2002-01-18 2003-07-31 Cargill, Incorporated Alanine 2,3- aminomutase
EP1473368A4 (en) 2002-02-06 2006-01-25 Showa Denko Kk REDUCTASE GENE OF ALPHA SUBSTITUTED ALPHA, BETA-UNSATURATED CARBONYL COMPOUND
US7314974B2 (en) 2002-02-21 2008-01-01 Monsanto Technology, Llc Expression of microbial proteins in plants for production of plants with improved properties
US20030224363A1 (en) 2002-03-19 2003-12-04 Park Sung M. Compositions and methods for modeling bacillus subtilis metabolism
AU2003222128A1 (en) 2002-03-29 2003-10-13 Genomatica, Inc. Human metabolic models and methods
US20050287655A1 (en) 2002-05-10 2005-12-29 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for producing mevalonic acid
US7856317B2 (en) 2002-06-14 2010-12-21 Genomatica, Inc. Systems and methods for constructing genomic-based phenotypic models
CA2491753A1 (en) 2002-07-10 2004-03-04 The Penn State Research Foundation Method for determining gene knockout strategies
US7826975B2 (en) 2002-07-10 2010-11-02 The Penn State Research Foundation Method for redesign of microbial production systems
AU2003253949A1 (en) 2002-07-15 2004-02-02 Kosan Biosciences, Inc. Metabolic pathways for starter units in polyketide biosynthesis
AU2003258187A1 (en) 2002-08-09 2004-02-25 Codexis, Inc. Enzymatic processes for the production of 4-substituted 3-hydroxybutyric acid derivatives
DE60336757D1 (de) 2002-09-12 2011-05-26 Metabolix Inc Produktion von polyhydroxyalkanoat mittels coenzym-a-abhängiger aldehyd-dehydrogenase-wege
EP1543114B1 (en) 2002-09-27 2008-08-13 DSM IP Assets B.V. Aldehyde dehydrogenase gene
BRPI0314498B1 (pt) 2002-10-04 2019-08-20 E.I. Du Pont De Nemours And Company Escherichia coli transgênica e método para a bioprodução de 1,3-propanodiol
WO2004035009A2 (en) 2002-10-15 2004-04-29 The Regents Of The University Of California Methods and systems to identify operational reaction pathways
US20040152159A1 (en) 2002-11-06 2004-08-05 Causey Thomas B. Materials and methods for the efficient production of acetate and other products
US7432091B2 (en) 2003-02-24 2008-10-07 Research Institute Of Innovative Technology For The Earth Highly efficient hydrogen production method using microorganism
US7056714B2 (en) * 2003-03-11 2006-06-06 University Of Iowa Research Foundation, Inc. Carboxylic acid reductase polypeptide, nucleotide sequence encoding same and methods of use
RU2268300C2 (ru) 2003-04-07 2006-01-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИЙ, ОБЛАДАЮЩИХ ПОВЫШЕННОЙ ЭКСПРЕССИЕЙ ГЕНА pckA
AU2004266100A1 (en) 2003-08-11 2005-03-03 Codexis, Inc. Enzymatic processes for the production of 4-substituted 3-hydroxybutyric acid derivatives and vicinal cyano, hydroxy substituted carboxylic acid esters
US7927859B2 (en) 2003-08-22 2011-04-19 Rice University High molar succinate yield bacteria by increasing the intracellular NADH availability
BRPI0414300A (pt) 2003-09-17 2006-11-07 Mitsubishi Chem Corp método para produzir ácido orgánico não amino
US7244610B2 (en) 2003-11-14 2007-07-17 Rice University Aerobic succinate production in bacteria
FR2864967B1 (fr) 2004-01-12 2006-05-19 Metabolic Explorer Sa Microorganisme evolue pour la production de 1,2-propanediol
EP2194139A1 (en) 2004-01-19 2010-06-09 DSM IP Assets B.V. Biochemical synthesis of 6 amino caproic acid
US7608700B2 (en) 2004-03-08 2009-10-27 North Carolina State University Lactobacillus acidophilus nucleic acid sequences encoding stress-related proteins and uses therefor
DE102004031177A1 (de) 2004-06-29 2006-01-19 Henkel Kgaa Neue Geruchsstoffe bildende Genprodukte von Bacillus licheniformis und darauf aufbauende verbesserte biotechnologische Produktionsverfahren
EP2949755B1 (en) * 2004-07-15 2018-03-28 DSM IP Assets B.V. Biochemical synthesis of 1,4-butanediamine
US7262046B2 (en) 2004-08-09 2007-08-28 Rice University Aerobic succinate production in bacteria
US7601858B2 (en) 2004-08-17 2009-10-13 Gs Cleantech Corporation Method of processing ethanol byproducts and related subsystems
BRPI0514734B1 (pt) 2004-08-27 2018-02-06 Rice University VARIEDADE BACTERIANA DE E. Coli MODIFICADA
GB0419424D0 (en) 2004-09-02 2004-10-06 Viragen Scotland Ltd Transgene optimisation
ES2444785T3 (es) 2004-09-09 2014-02-26 Research Institute Of Innovative Technology For The Earth Fragmento de ADN que tiene función promotora
KR20070065870A (ko) 2004-09-17 2007-06-25 라이스 유니버시티 다량의 숙신산염을 생산하는 세균
US7569380B2 (en) 2004-12-22 2009-08-04 Rice University Simultaneous anaerobic production of isoamyl acetate and succinic acid
JP2006204255A (ja) 2005-01-31 2006-08-10 Canon Inc アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ遺伝子破壊ポリヒドロキシアルカノエート生産菌、またこれを利用したポリヒドロキシアルカノエート生産方法
WO2006109312A2 (en) 2005-04-15 2006-10-19 Vascular Biogenics Ltd. Compositions containing beta 2-glycoprotein i-derived peptides for the prevention and/or treatment of vascular disease
KR100676160B1 (ko) 2005-08-19 2007-02-01 한국과학기술원 말릭효소를 코딩하는 유전자로 형질전환된 재조합 미생물 및 이를 이용한 숙신산의 제조방법
KR100679638B1 (ko) 2005-08-19 2007-02-06 한국과학기술원 포메이트 디하이드로게나제 ｄ 또는 ｅ를 코딩하는 유전자로 형질전환된 미생물 및 이를 이용한 숙신산의 제조방법
AU2006287257A1 (en) 2005-09-09 2007-03-15 Genomatica, Inc. Methods and organisms for the growth-coupled production of succinate
US9297028B2 (en) 2005-09-29 2016-03-29 Butamax Advanced Biofuels Llc Fermentive production of four carbon alcohols
US20080274526A1 (en) 2007-05-02 2008-11-06 Bramucci Michael G Method for the production of isobutanol
ZA200803755B (en) 2005-10-26 2009-12-30 Du Pont Fermentive production of four carbon alcohols
US8465953B2 (en) 2006-05-01 2013-06-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. Ethanol production in non-recombinant hosts
US8962298B2 (en) 2006-05-02 2015-02-24 Butamax Advanced Biofuels Llc Recombinant host cell comprising a diol dehydratase
US8017364B2 (en) 2006-12-12 2011-09-13 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Solvent tolerant microorganisms
PL2821494T3 (pl) * 2007-03-16 2017-07-31 Genomatica, Inc. Kompozycje i sposoby biosyntezy 1,4-butanodiolu i jego prekursorów
AU2008228948B2 (en) 2007-03-20 2014-04-24 University Of Florida Research Foundation, Inc. Materials and methods for efficient succinate and malate production
US20090111154A1 (en) 2007-04-04 2009-04-30 The Regents Of The University Of California Butanol production by recombinant microorganisms
CN101680007A (zh) 2007-04-18 2010-03-24 纳幕尔杜邦公司 使用高活性酮醇酸还原异构酶来发酵生产异丁醇
WO2008131286A1 (en) 2007-04-18 2008-10-30 Gevo, Inc. Engineered microorganisms for producing isopropanol
US8426173B2 (en) 2007-05-02 2013-04-23 Butamax (Tm) Advanced Biofuels Llc Method for the production of 1-butanol
US20080274522A1 (en) 2007-05-02 2008-11-06 Bramucci Michael G Method for the production of 2-butanone
US8426174B2 (en) 2007-05-02 2013-04-23 Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc Method for the production of 2-butanol
AU2008254423C1 (en) 2007-05-17 2016-06-02 Eastman Renewable Materials, Llc Methods and compositions for producing solvents
US20090023182A1 (en) 2007-07-18 2009-01-22 Schilling Christophe H Complementary metabolizing organisms and methods of making same
EP2017344A1 (en) 2007-07-20 2009-01-21 Nederlandse Organisatie voor toegepast- natuurwetenschappelijk onderzoek TNO Production of itaconic acid
US7947483B2 (en) * 2007-08-10 2011-05-24 Genomatica, Inc. Methods and organisms for the growth-coupled production of 1,4-butanediol
CN101903530A (zh) 2007-10-12 2010-12-01 加利福尼亚大学董事会 被改造以产生异丙醇的微生物
EP2245137B1 (en) 2008-01-22 2017-08-16 Genomatica, Inc. Methods and organisms for utilizing synthesis gas or other gaseous carbon sources and methanol
US20090246842A1 (en) 2008-02-15 2009-10-01 Gevo, Inc. Engineered microorganisms for producing propanol
CA2728285A1 (en) * 2008-03-03 2009-09-11 Joule Unlimited, Inc. Engineered co2 fixing microorganisms producing carbon-based products of interest
CA3175935A1 (en) 2008-03-27 2009-12-17 Genomatica, Inc. Microorganisms for the production of adipic acid and other compounds
CA2722680A1 (en) 2008-05-01 2009-11-05 Genomatica, Inc. Microorganisms for the production of methacrylic acid
US8129154B2 (en) 2008-06-17 2012-03-06 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for the biosynthesis of fumarate, malate, and acrylate
BRPI0915749A2 (pt) 2008-07-08 2018-07-10 Opx Biotechnologies Inc métodos, composições e sistemas para produção biossintética de 1,4-butanodiol
CA2735883C (en) 2008-09-10 2020-05-05 Genomatica, Inc. Microorganisms for the production of 1,4-butanediol
US8357826B2 (en) 2008-10-16 2013-01-22 Karl Kharas Methods and apparatus for synthesis of alcohols from syngas
CA2746952A1 (en) 2008-12-16 2010-06-24 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for conversion of syngas and other carbon sources to useful products
KR102176554B1 (ko) 2009-06-04 2020-11-09 게노마티카 인코포레이티드 발효액 성분들의 분리 방법
ES2680905T3 (es) 2009-06-04 2018-09-11 Genomatica, Inc. Microorganismos para la producción de 1,4-butanodiol y métodos relacionados
US8715971B2 (en) 2009-09-09 2014-05-06 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for the co-production of isopropanol and 1,4-butanediol
US8377666B2 (en) 2009-10-13 2013-02-19 Genomatica, Inc. Microorganisms for the production of 1,4-butanediol, 4-hydroxybutanal, 4-hydroxybutyryl-coa, putrescine and related compounds, and methods related thereto
WO2011066076A1 (en) 2009-11-25 2011-06-03 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for the coproduction of 1,4-butanediol and gamma-butyrolactone
MX2012006602A (es) 2009-12-10 2012-08-01 Genomatica Inc Metodos y organismos para convertir el gas de sintesis u otras fuentes de carbono gaseoso y metanol a 1, 3 - butanodiol.
US8048661B2 (en) 2010-02-23 2011-11-01 Genomatica, Inc. Microbial organisms comprising exogenous nucleic acids encoding reductive TCA pathway enzymes
US8445244B2 (en) 2010-02-23 2013-05-21 Genomatica, Inc. Methods for increasing product yields

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160095053A (ko) * 2013-12-05 2016-08-10 알이지 라이프 사이언시스, 엘엘씨 지방족 아민의 미생물 생성
WO2023140687A1 (ko) * 2022-01-21 2023-07-27 대상 주식회사 1,4-부탄디올을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 1,4-부탄디올의 생산 방법

Also Published As

Publication number Publication date
CO6541567A2 (es) 2012-10-16
US20110129899A1 (en) 2011-06-02
CN102762735B (zh) 2016-08-03
EP2488652A1 (en) 2012-08-22
WO2011047101A1 (en) 2011-04-21
CA2777459A1 (en) 2011-04-21
EP2488652A4 (en) 2014-04-09
US8377667B2 (en) 2013-02-19
AU2010306785A1 (en) 2012-04-26
US20130189751A1 (en) 2013-07-25
AU2010306785B2 (en) 2016-01-14
CN105441374A (zh) 2016-03-30
CN102762735A (zh) 2012-10-31
MX2012004291A (es) 2012-08-17
US20190264240A1 (en) 2019-08-29
US20130029381A1 (en) 2013-01-31
US20110229946A1 (en) 2011-09-22
US8377666B2 (en) 2013-02-19
US20160376614A1 (en) 2016-12-29
JP2013507145A (ja) 2013-03-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230065295A1 (en) Microorganisms and methods for production of 4-hydroxybutyrate, 1,4-butanediol and related compounds
KR102041627B1 (ko) 1,4-부탄다이올 생산용 미생물 및 관련 방법
US20190264240A1 (en) Microorganisms for the production of 1,4-butanediol, 4-hydroxybutanal, 4-hydroxybutyryl-coa, putrescine and related compounds, and methods related thereto
US11572564B2 (en) Microorganisms for producing 1,4-butanediol and methods related thereto
US9988656B2 (en) Microorganisms and methods for the coproduction 1,4-butanediol and gamma-butyrolactone
US20170183694A1 (en) Microorganisms and methods for production of 4-hydroxybutyrate, 1,4-butanediol and related compounds
AU2018200160A1 (en) Microorganisms for producing 1,4-butanediol and methods related thereto
AU2013203176A1 (en) Microorganisms for the production of 1,4-butanediol,4-hydroxybutanal, 4-hydroxy-butyryl-coa, putrescine and related compounds, and methods related thereto
AU2022205243A1 (en) Microorganisms for producing 1,4-butanediol and methods related thereto

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid