KR20040014389A - 폴리올로부터 폴리하이드록시알칸노에이트를 제조하는 방법 - Google Patents

폴리올로부터 폴리하이드록시알칸노에이트를 제조하는 방법 Download PDF

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KR20040014389A
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Abstract

재조합 과정이 제공되는데, 여기서 추가적인 유전자는 PHA를 생산하게 위해 유전공학적으로 처리된 이. 콜라이로 유도되어 상기 향상된 균주가 디올로부터 직접적으로 PHA 단일중합체와 공중합체를 생산한다. 보다 바람직한 일실시예로서, 4-하이드록시부틸레이트(4HB) 함유 PHAs는 1,4-부탄디올로부터 직접적으로 제조되고; 5-하이드록시발레레이트(5HV) 함유 PHAs는 1,5-펜탄디올로부터 제조되고; 6-하이드록시헥산노에이트(6HH) 함유 PHAs는 1,6-헥산디올로부터 제조되며; 3-하이드록시프로피오네이트(3HP) 함유 PHAs는 1,3-프로판디올(또는 프로필렌 글리콜이라 함)로부터 제조되고; 2-하이드록시프로피오네이트(2HP, 락테이트) 함유 PHAs는 1,2-프로판디올(프로필렌 글리콜)로부터 제조되며; 2-하이드록시에탄노에이트(2HE, 글리콜레이트) 함유 PHAs는 1,2-에탄디올(에틸렌 글리콜)로부터 제조된다. 야생형 PHA 생산자에서, 디올 및 다른 알코올 공급원료로부터 직접적으로 PHA 단일중합체 및 공중합체의 생산을 향상시키기 위하여 동일한 효소 활성을 인코딩(incoding)한 유전자는 유도될 수 있거나 발현이 증폭될 수 있다. 상기 PHA 중합체는 화학적 매개체 범위용 중합체 또는 출발 물질로서 용이하게 회복되고 산업적으로 유용하다.

Description

폴리올로부터 폴리하이드록시알칸노에이트를 제조하는 방법{PRODUCTION OF POLYHYDROXYALKANOATES FROM POLYOLS}
폴리(3-하이드록시부틸레이트-코-4-하이드록시부틸레이트) (PHB4HB) (Doi, 1995, Macromol. ymp. 98:585-99)와 같은 모노머 4-하이드록시부틸레이트(4HB)를 포함하는 PHA 중합체의 합성 또는 PHA 중합체를 포함하는 4-하이드록시발레레이트 및 4-하이드록시헥산노에이트의 합성은 예를 들어 Valentin 등., 1992, Appl. Microbiol. Biotechnol. 36:507-14 및 Valentin 등., 1994, Appl. Microbiol. Biotechnol. 40:710-16 에 설명되어 있다. PHB4HB의 제조방법은 예를 들어 글루코스 및 4HB를 제공함으로서 이루어지고 또한 기질은 4-하이드록시부틸레이트를 라스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha)로 (Kunioka 등, 1988, polym. commun. 29:174; Doi 등, 1990, Int. J. Biol. Macromol. 12:106; Nakamura 등, 1992, Macromolecules 25:423), 알칼리진 라투스(Alcaligenes latus)로 (Hiramisu 등,1993, Biotechmol, Lett. 15:461), 수도모마스 아시도보란스(Pseudomomas acidovorans)로 (Kimura 등, 1992, Biotechnol. Lett. 14:445), 및 코마모나스 아시도보란스(Comamonas acidovorans)로 (Saito & Doi, 1994, Int. J. Biol. Macromol. 16:18) 개질된다. 4HB에서 개질되는 기질들은 1,4-부탄디올, 1,6-헥산디올, 1,8-옥탄디올, 1,10-데칸디올, 1,12-도데칸디올 및 감마-부티로락톤을 포함한다. 상기 PHB4HB 공중합체는 중합체 특성 범위를 제공하는 단량체 조성물의 범위에서 제조될 수 있다. 특히, 4HB의 함량이 15중량% 이상으로 증가함에 따라 융점(TM) 은 130℃ 이하로 감소되고 파단 신장은 400% 이상 증가한다 (Saito 등, 1996, Polym. Int. 39:169). 그러나, 4HB를 함유하는 PHAs를 보다 경제적으로 제조하는 개발은 매우 바람직하다. PHA의 경제적인 제조방법을 위해, 기질의 비용, 발효시간 및 하부 공정의 효율성을 포함한 다양한 요인들이 중요하다. 야생형 PHA-생성 박테리아의 일반적인 특성은 성장률이 더디며, 개방성(open)을 단절하기가 종종 어렵고, 유전공학에 아메니티(amenity)가 제한된다. 그러므로 PHA 제조의 향상된 경제성을 위해서는 유전자 도입 유기체의 개발이 바람직하다.
재조합 이. 콜라이(E. coli)로 공중합 PHB4HB를 제조하는 방법은 공개되어 있다(예, PCT WO00/011188 출원인 Huisman 등; PCT WO98/39453 출원인 Hein 등). 재조합 이. 콜라이에서 생산된 4HB 중합체의 신규한 생물학적인 범위는 스크라리(Skraly)와 그 직원들에 의해 공개되었다(예 PCT WO99/61624). 이러한 연구들에서, 휴이스맨(Huisman)만이 1,4-부탄디올로부터 4HB 공단량체의 소량 혼합을발표하였다. 4HB의 소스로서, 1,4-부탄디올을 사용하여 4HB 공중합체 및 폴리-4HB 단일중합체의 범위를 생산 가능토록 하는 유전공학적 시스템의 개발은 매우 큰 장점을 갖는다.
본 발명은 일반적으로 박테리아 유전공학에 의해 폴리하이드록시 알칸오에이트(polyhydroxyalkanoates, PHAs)의 제조방법에 관한 분야에 관한 것이다.
도 1은 일실시예에 의한 1,4-부탄디올부터 4-하이드록시부틸릴-CoA로의 반응 경로의 설명.
그러므로, 본 발명의 목적은 향상된 재조합 시스템과 기질로서 다양한 단순 당과 알코올을 사용하여 4HB를 함유하는 PHAs와 같은 PHAs를 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
재조합 과정이 제공되는데, 여기서 추가적인 유전자는 PHA를 생산하게 위해 유전공학적으로 처리된 이. 콜라이로 유도되어 상기 향상된 균주가 디올로부터 직접적으로 PHA 단일중합체와 공중합체를 생산한다. 보다 바람직한 일실시예로서, 4-하이드록시부틸레이트(4HB) 함유 PHAs는 1,4-부탄디올로부터 직접적으로 제조되고; 5-하이드록시발레레이트(5HV) 함유 PHAs는 1,5-펜탄디올로부터 제조되고; 6-하이드록시헥산노에이트(6HH) 함유 PHAs는 1,6-헥산디올로부터 제조되며; 3-하이드록시프로피오네이트(3HP) 함유 PHAs는 1,3-프로판디올(또는 프로필렌 글리콜이라 함)로부터 제조되고; 2-하이드록시프로피오네이트(2HP, 락테이트) 함유 PHAs는 1,2-프로판디올(프로필렌 글리콜)로부터 제조되며; 2-하이드록시에탄노에이트(2HE, 글리콜레이트) 함유 PHAs는 1,2-에탄디올(에틸렌 글리콜)로부터 제조된다. 야생형 PHA 생산자에서, 디올 및 다른 알코올 공급원료로부터 직접적으로 PHA 단일중합체 및 공중합체의 생산을 향상시키기 위하여 동일한 효소 활성을 인코딩(incoding)한 유전자는 유도될 수 있거나 발현이 증폭될 수 있다. 상기 PHA 중합체는 화학적 매개체 범위용 중합체 또는 출발 물질로서 용이하게 회복되고 산업적으로 유용하다.
PHA를 생산하기 위해 추가적인 유전자는 유전 공학적으로 설계된 미생물에 의해 유도되는 과정이 제공되어 상기 향상된 균주는 단순 알코올 및 당 기질에서 직접적으로 PHA 단일중합체 및 공중합체를 생성한다. 상기 과정들은 재조합 박테리아 예를 들어 생성 유기체로서에스체리치아 콜라이(Escherichia coli) 및라르스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha) 또는알칼리진 라투스(Alcaligenes latus) 와 같은 PHA-생성 미생물로부터 PHA 생합성 유전자에 기반을 두고 있으나, 기타 PHA 유전자 원료도 공지되어 있다 (Madison & Huisman, 1999, Microbiol. & Molecular Biology Reviews, 63: 21-53). 재조합 이. 콜라이는 유전자 조작의 용이성, 게놈 서열의 완전한 유용성, 빠른 성장률, 성장 기질의 유연성 및 완만한 라이시스(lysis)를 포함하여 야생형 PHA 생산 유기물 이상의 많은 장점을 가지고 있다.
처리되는 유기물
일실시예에 있어서, 도 1에서 설명된 전체 경로용 유전자는 상기 생산 유기물에서 유도된다. 대장균과 같은 자연적으로 PHAs를 생성하지 못하는 유기물이 사용될 수 있다. 다양한 재조합 이. 콜라이 PHA 생산 시스템이 알려져 있다 (Madison & Huisman, 1999, Microbiology & Molecular Biology Reviews, 63: 21-53). 디올 산화환원효소 및 알데히드 탈수소효소를 엔코딩한 유전자가 이러한 호스트(host)로 유도된다. 1,4-부탄디올의 경우, 디올 산화환원효소는 기질을 4-하이드록시부틸랄알데히드로 변환시키고 상기 알데히드 탈수소효소로서 4-하이드록시부틸레이트로 변환된다. 1,3-프로판디올의 경우, 상기 디올 산화환원효소는 기질을 3-하이드록시프로피온알데히드로 변환시키고 알데히드 탈수소효소에 의해 3-하이드록시프로피오네이트로 변환된다. 다른 디올도 유사한 방식으로 처리될 수 있다. 다른 경우에는 디올 공급원료보다 짧은 2개의 탄소가 있는 하이드록시에시드의 PHA와 혼합이 이루어질 수 있다. 이는 지방산 분해작용의 베타-산화 경로와 유사한 내인성 분해작용에 기인한다. 예를 들어 4HB 또는 4HB 및 6HB 모두 1,6-헥산디올의 공급의 결과로서 중합체 내에서 생산될 수 있다. 선택적으로 외인성 아실-CoA 전이효소 또는 아실-CoA 합성효소는 조효소 A와 하이드록시에시드의 활성을 촉진시키기 위해 포함될 수 있다. 상기 활성화된 단량체는 그 후 생산 호스트에서 적절합 PHA 합성효소의 작용에 의해 PHA와 혼합될 수 있다. 상기 효소 활성은 일 이상의 단량체 타입을 함유하고 상기 디올 공급원료에 의존하는 중합체의 생산 호스트에서 합성을 위한 시스템을 제공한다.
상기 언급된 것과 3HB와 같은 단량체를 포함하는 공중합체를 합성하는 것은 때로는 매우 유용하다. 상기의 경우에, 생산 호스트는β-케토티올라제(kotothiolase) 및 아세토아세틸-CoA 환원 효소 유전자를 포함할 수 있고 이의 생산물은 아세틸-CoA를 3HB-CoA로 변환한다. 아세틸-CoA는 디올 또는 당과 같은 다른 탄소 원료로부터 유도될 수 있다. 상기와 같은 3HB-CoA 및 하이드록시아실-CoAs는 상기 재조합 호스트로 언급된 것과 같은 다양한 PHA 합성 효소에 의해 수용되어 PHB 공중합체는 재조합 호스트에 의해 합성된다. 바람직한 PHA가 무엇이든지, 성장 동안이나 성장 분리된 후에, 단독이나 당과 같은 다른 일 이사의 공급 원료와 함께 상기 디올은 세포에 공급될 수 있고 PHA는 세포내에서 축적된다.
또 다른 일실시예로서, 도 1에서 도시된 경로의 일부분을 본래 포함하는 재조합 유기물이 사용될 수 있다. 본 일실시예에서, 상기에서 언급된 일 이상의 활정제(디올 산화환원효소, 알데히드 탈수소효소, 아실-CoA 전이효소, 또는 아실CoA 합성효소, β-케토티오라세, PHA 합성효소 및 아세토아세틸-CoA 환원효소)들은 상기 호스트의 내인성 방법으로 유도될 수 있다. 예를 들어, 디올 산화환원효소 및 알데히드 탈수소효소만이알. 유트로파(R. eutropha)에서 발면되고 1,4-부탄디올을 4HB로 변환시키는 능력을 증가시키기 위해 천연 PHA-생산 유기물 및 상기 호스트의 본래 능력이 필수 물질대사 단계의 나머지를 이룸에 있어 의존적이다. 많은 천연 PHA-생산 유기물은 당업계이 이미 알려져 있다 (Braunegg et al. 1998, J Biotechnology 65: 127-61). 만일 상기 호스트가 PHA 생산을 할 수 없다면 PHA 합성효소 또는 전체 PHB 생합성 경로와 선책적으로 외인성 아실-CoA 전이효소 또는 아실-CoA 합성효소는 PHA 생산이 가능토록 본 유기체로 유도된다. 상기 기술도 당업계에 공지되었다 (예를 들어, Dennis et al., 1998, J. Biotechnology 64: 177-86). 또한, 여기서 상기 디올은 성장 동안이나 성장 분리 후에, 단독으로 당과 같은 일 이상의 다른 공급원과 함께 상기 세포에 공급될 수있고 PHA는 세포내에 축적된다.
디올 공급원으로 PHAs를 생산하는 구체적인 예는 본 실시예에서 설명된 박테리아에 한정되지 않는다. 동일한 유전자가 효모 세포 및 배양된 식물세포(이에 한정되는 것은 아님)를 포함하는 진핵세포에서 유도된다.
기질 이용용 유전자
여기서 설명된 용도에 적합한 재조합 PHA 생산자를 개발하기 위한 유전자와 기술은 일반적으로 당업계에 알려져 있다 (Madison & Huisman, 1999, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 63: 21-53; PCT WO 99/14313). 디올 및 당과 같은 공급원으로부터 PHAs의 생산에 필수적인 모든 유전자는 복제되어야 하고 유전공학적으로 조절가능한 형태이여야 하기 때문에 플라스미드 형성 및 구성된 유전자의 여하한 조합이 사용되므로 이러한 경로의 실행은 제한되지 않는다. 많은 다른 실행방법이 당업게에서 알려져 있다.
1,3-프로판디얼 산화환원효소(EC 1.1.1.202)가 다수의 박테리아 종에서 발견되었다. 이는 종종 글리세롤 하에서 혐기성 조건에서 유도된다 (Forage & Foster, 1982, R Bacteriol. 149: 413-419). 이러한 효소는 대응하는 디올로부터 3-하이드록시프로피온알데히드 및 다른 하이드록시 알데히드의 가역적인 형성을 촉진한다. 생리학적으로 상기 알데히드가 NADH를 소비할 때 전자수용자로서 필요한 경우 상기 효소는 디올 형성에서 가장 먼저 사용된다고 생각됐다 (Johnson & Lin, JBacteriol. 169: 2050-54). 비록 유사한 활성체가 다른 유기물에서 발견되기는 하나 1,3-프로판디올 산화환원효소를 함유한 유기체는 일반적으로 글리세롤을 1,3-프로판디올로 변환할 수 있다. 많은 다른 실시예들이 일반적으로 아려져 있기는 하나, 글리세롤을 1,3-프로판디올로의 변환 능력이 있다고 보고된 박테리아 종들은클렙시에라 네모니아(Klebsiellapneumoniae, Streekstra 등., 1987, Arch.Microbiol. 147: 268-75),클렙시에라 옥시토카(Klebsiella oxytoca, Homann 등., 1990, Appl.Microbiol. Biotechnol. 33: 121-26),클렙시에라 플란티콜라(Klebsiella planticola(Id.)) , 및시트로박텔 프레운디(Citrobacter fteundii, Boenigk 등., 1993, Appl. Microbiol. Biotechnol. 38: 453-57)를 포함한다.
알데히드 탈수소효소는 특히 생물학적 시스템에서는 일반적이다. 상동관계용 이. 콜라이 게놈 데이터베이스의 연구는 이러한 유기체 단독으로 적어도 7개의 상기 형태의 추정 효소를 포함함을 보인다. 이들은 너무 다양하고 수가 많아 이들을 분류하는 시도조차 복잡한 것이다 (예, Vasiliou et al., 1999, Pharmacogenetics 9: 421-34). 이러한 형태의 모든 논의와 상기 효소들의 생물학적 역할은 본 논의의 범위를 넘어선 것이다. 신진대사 처리에 사용될 적절한 알데히드 탈수소효소의 선택이 다양한 후보군에서 기질 특이성을 평가한 후에 이루어져야 한다. 효소들은 발도마 & 아규일라(Baldom & Aguilar)에 설명된 것이 이러한 진단용으로 유용하다 (1987, J BioL Chem. 262: 13991-6).
아실-CoA 전이효소 (EC 2.8.3. x) 및 아실-CoA 합성효소 (EC 6.2.1. x) 양자는 조효소 A로 유기산의 티오에스테르의 형성을 촉진한다. OrfZ (HbcT라고도 함, Sohling and Gottschalk, 1996, J Bacteriol 178 : 871-80))와 같은 아실-CoA는 아세틸-CoA와 같은 공여자로부터 지방산과 같은 자유 유기산에 이르기까지 CoA 일부분을 변환시킨다. AlkK (van Beilen 등., 1992, Mol. Microbiol. 6: 3121-36)와 같은 아실-CoA 합성효소는 ATP로부터 반응된 에너지에 기인하고 부산물로서 AMP 및 피로포스페이트(pyrophosphate)를 잔류시켜 자유 유기산과 자유 조효소 A를 결찰시킨다.
경로에서 효소들의 향상
여기서 설명된 디올-PHA 경로에서 효소의 기질특이성과 특이 활성을 향상시키는 것은 장점이 된다. 예를 들어 특이성 디올은 특별한 유기체에서는 수용가능한 비율로 PHA를 전활할 수 없다. 이러한 본성의 향상은 일반적으로 돌연변이 유발과 스크린닝과 관련될 것이다; 향상시킬 DNA 서열은 진행된 향상의 평가에 의해 후속되는 일 이상의 돌연변이 유발의 순환을 받는다.
돌연변이 유발은 당업계에서 알려진 다양한 방법이 사용되어 이루어질 수 있다.(예, 에러-프론 PCR, 카세트 돌연변이 유발, 박테이라 돌연변이 인자 균주를 통한 처리, 화학적 돌연변이 유전자 처리 등) (Cadwell 등., 1992, PCR Methods and Applications 2: 28-33; Erickson 등., 1993, Appl. Environ. Microbiol. 59: 3858-62; Hermes 등., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 696-700; Ho 등., 1989, Gene 77: 51-59; Kellog 등., 1981, Science 214: 1133-35; Reidhaar-Olson 등., 1988, Science 241 : 53-57; Stemmer, 1994, Nature 370: 389-91; andStemmer, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747-51.)
디올-PHA 경로 향상용 스크린닝은 상기 설명대로 생성된 다수의 돌연변이체를 배양하는 것에 관련되어 이러한 방식에서 상기 경로와 관련된 몇몇이 특성이 향상된 세포들은 쉽게 선택될 수 있다. 일실시예는 이로운 디올 상에 향상된 성장을 위해 선택되는 것이다. 특별한 디올의 선택 또는 사용시에 유기체는 단독 탄소원로서 디올과 함께 성장할 수 없는 단점이 있다. 돌연변이체 풀은 단독 탄소원으로 디올을 포함하고 문제의 유기체의 성장에 필수적인 다른 모든 영양소와 함께 포함하는 액체매에서 또는 배지판 상에 배양될 수 있고 성장한 세포들은 용이하게 분리된다. 다른 실시예는 상기 디올의 존재하에서 배양될 때, 중합체를 생성할 수 있는 세포의 선택이다. 유기체가 상기 디올을 현저한 비율로 연속적으로 중합되는 단량 전구체로 변환되지 못한다면 단독 탄소원(효모 추출물과 같이 첨가되는 복합 공급물질 상에 포함된 탄소외의)으로서 디올을 포함하는 배지상의 유기체의 이식은 세포를 생산할 수 없거나 PHA 함량을 생산할 수 없다. 상기 판상에 돌연변이체의 풀을 배양하는 것은 상기 디올을 중합매로의 변환 능력을 구비한 균주를 동정할 수 있게 한다. 상기 세포들은 비-PHA-생성 세포보다 불투명하고 하얀색으로 나타날 것이다. 선택적으로 글루코스와 같은 다른 탄소원은 스크린닝되는 상기 세포가 탄소원으로부터 중합체를 합성할 수 없는 경우에 첨가될 수 있다. 판은 현 배지 조건에서 성장할 수 없는 균주를 제거하기 위해 또한 제거된다; 예를 들어 디올에서 PHA를 생성할 수 있는 돌연변이 유발을 통하여 수득되지만 최소 글루코스 매질상에서 성장할 수 있는 것과 같은 산업적인 중요 특성을 유실한 세포는 특히 단독 탄소원에서 설장할 수 없다면 디올 및 글루코스를 함유한 찬에서 성장할 수 없다. 상기 경우에 디올에서 PHA를 생성할 수 있고 최소 글루코스를 성장할 수 있는 세포들만이 불투명한 집단으로 나타날 수 있다.PHA는 세포내에서 특히 판상에서 가지화 될 수 있는데 닐 레드(Nile red)와 같은 비처리 집단의 가시적 스크린닝보다 민감한 방법에 의한다 (예., Spiekermann 등, 1999, Arch Microbiol. 171: 73-80.). 상기 방법들은 디올-PHA 경로를 보다 적정화하기 위해 수차례 반복된다. 스크린닝 방법은 상기 언급된 측면에 제한되는 것은 아니며 다른 유용한 스크린닝 과정이 당업자에게 명백하다.
발현의 조절
상기 일실시예 중 하나에 있어서, 상기 디올 산화환원효소 및 알데히드 탈수소효소의 발현을 제어하거나 상기 디올의 유효수을 제어함으로서 생성된 중합체의 조성물을 제어할 수 있다.디올 산화환원효소 및 알데히드 탈수소효소의 반응성이 높을수록, 기질 유효수 또는 하부과정에서 효소의 반응성과 같은 다른 요인이 제한되는 지점까지 더 많은 반응 단량체가 상기 반응성의 결과로 얻어진다. 유전자 발현 조절(효소 활성)을 위한 방법은 다양하게 당업계에 알려져 있다. 배양 세포에 공급되는 디올의 비율은 발효 및 세포배양의 당업계에서 알려진 다양한 기술에 의해 제어될 수 있다.
일부 미생물의 경우에, 유전자의 전부 또는 일부는 호스트 염색체 또는 플라스미드 상에 제공된 전부 또는 일부와 합쳐질 수 있다. 때로는 예를 들어 제1플라스미드로 엔코드된 경로의 다수 단계와 제2플라스미드에 의해 엔코드된 다른 단계로 된 경쟁적 플라스미드 시스템이 사용될 수 있다. 또한 상기 2가지 조합이 사용될 수 있다.
기질
상기와 같이 설명된, 상기 시스템 조합에서 PHAs를 제조할 수 있는 기질은 알코올, 바람직하게는 디올을 포함한다. 바람직한 디올로는 1,6-헥산디올, 1,5-프로판디올, 1,4-부탄디올, 1,3-프로판디올, 1,2-에탄디올 및 1,2-프로판디올이다.
상기 디올들은 많은 미생물에 비독성이고, 다수의 경우에 고농도이다. 이들은 많은 미생물에서 종종 저농도로 독성이 되는 유기산과 비교하여 발효용으로 우수한 공급원료가 될 수 있다. 많은 디올들은 쉽게 이용할 수 있고 상대적으로 저가이다. 예를 들어 1,4-부탄디올은 세계적으로 1995년에 10억 파운드의 수요가 있었고 합성 중합체 생산에 범용적으로 사용된다 (Morgan, Chemistry & Industry, 3 March 1997, pp. 166-8).
본 발명은 다음의 제한되지 않는 일실시예에 의해 보다 자세히 이해될 수 있다.
실시예 1 : 에스체리치아 콜라이(( Escherichia coli ) AldH의 효소 검정 분석
다른 알데히드 탈수소효소와 동질체의 기초하에서,aldH유전자는 이. 콜라이 게놈으로부터 PCR에 의해 복제된다. 플라스미드 pMS33은 trc 프로모터의 제어하에서aldH을 포함한다.이. 콜라이 DH5a는 네거티브 제어로 pMS33 또는 pFS14로 변형된다. 플라스미드 pFS14는 Soling 및 Gottschalk (1996, J ; Bacteriol. 178: 871-80)에서 설명된클로스트리디움 클루이버리 3hbD(Clostridium kluyveri 4hbD,4HB 탈수소효소) 유전자를 포함한다.
DHSa/pMS33 및 DH5a/pFS14 는 37℃에서 0.5의 적합한 밀도(600nm)의 Luria-Bertani (LB ; Difco ; Detroit, Mich.) 배양액로 성장하고 연속적으로 1mM의 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(isopropyl-β- D - thiogalactopyranoside, IPTG)에서 유도된다. 상기 배양은 3시간동안 지속되며, 그 후 상기 세포들은 원심분리(2000g, 10분)에 의해 매질에서 제거되고, 0.1M Tris(Ph 8.0)에서 세척되고, 재 원심분리되며, 대략 세포 펠렛과 동일한 크기의 용적 0.1M Tris(pH 8.0)에서 회복된다. 각각의 샘플은 일초 간격으로 70% 주기로, 2분 동안 3-mL의 냉동 분취량(aliquot)에서 마이크로팁으로 초음파 처리된다 (XL sonicator, Heat Systems-Ultrasonics, Inc., Farmingdale, NY). 리세이트(lysate)는 10분당 14,000g의 미세 원심분리하에서 회전하고, 상층액은 수집되며 예정된 미정 세포는 추출된다.
상기 효소 검정 분석(assay)은 100 mM 소디움 글리신 (pH 9.5), 1 mM 3-하이드록시프로피온알데히드 (3HPA), 1 mM NAD+또는 NADP+, 6 mM 디티오트레이톨 (DTT)을 함유하는 전체 1mL 부피내에서 수행되고, 전체 20 내지 100㎍ 의 단백질을 함유하는 미정 세포 추출물의 부피내에서 이루어진다. 베이스라인은 3HPA를 첨가하기 전에 이루어지고 반응이 시작된다. DH5a/pFS14 추출물에 의해 주어지는 반응성은 NAD+가 사용될 때 0.00 U/mg이고 NADP+가 사용될 때 0.03 U/mg이다. DH5cc/pMS33 추출물에 의해 주어지는 반응성은 NAD+가 사용될 때 1.89 U/mg이고 NADP+가 사용될 때0.32 U/mg이다. 그러므로 이. 콜라이 AldH 발현 세포는 공동인자 NAD+또는 NADP+로 3HPA을 3-하이드록시프로피온산으로 전환하기 위한 능력을 구비한다.
pFS14의 구조
4hbD유전자는 주형으로서 플라스미드 pCK3 (Sohling & Gottschalk, 1996, J Bacteriol. 178: 871-80)을 사용하여 PCR에 의해 복제된다. 다음의 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 사용된다:
5'-CTCTGAATTCAAGGAGGAAAAAATATGAAGTTATTAAAATTGGC-3'
(SEQ ID NO : 1)
(4hbD 5'EcoRI)
5'-TTTCTCTGAGCTCGGGATATTTAATGATTGTAGG-3' (SEQ ID NO : 2)
(4hbD 3'SacI)
상기 결과 PCR 생성물은EcoRI및SacI로 절단되고 동일한 효소에 의해 절단된 플라스미드 pTrcN과 접합된다. pTrcN은 pTrc99a (Pharmacia ; Uppsala, Sweden)의 유도체이다; pTrcN을 구별하는 변형법은NcoI로 절단함으로서NcoI절단좌의 제거, T4 움 폴리머라아제로 처리 및 자기 접합이다.
pMS33의 구조
다른 알데히드 탈수소효소와 동일 물질을 기초로,aldH유전자는 다음의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 이. 콜라이 게놈으로부터 PCR에 의해 복제된다.
5'-GGTGGTACCTTAAGAGGAGGTTTTTATGAATTTTCATCACCTGGCTT -3' (SEQ ID NO : 3)
(aldH5'Acc65I)
5'-GGTGCGGCCGCTCAGGCCTCCAGGCTTATCCA-3' (SEQ ID NO : 4)
(aldH3'NotI)
상기 결과된 PCR 생성물은Acc65I및NotI으로 절단되고 pMS33을 형성하는 동일한 효소로 절단된 pSE380 (Invitrogen; Carlsbad, CA)으로 접합된다.
실시예 2 : 단일 탄소원으로 1,4-부탄디올로 이. 콜라이의 성장
이. 콜라이 균주 LS5218 (the Yale E. coli Genetic Stock Center, New Haven, Conn., as strain CGSC 6966에서 수득) 두 개의 플라스미드 pFS76 또는 pFS77를 변형한다. pFS76는 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha)로부터 4HB 탈수소효소(gbd) 유전자를 포함한다 (Valentin 등. 1995, Eur. J. Biochem. 227: 43-60). 플라스미드 pFS77은 단일 오페론으로 배열된 이. 콜라이 알데히드 탈수소효소(dhaT) 유전자 및클랩시에라 뉴몬니아(Klebsiella pneumoniae) 1,3 프로판디올 산화환원효소 뿐만 아니라 상기gbd유전자를 포함한다. 양 플라스미드는 상기 유전자의 전사를 위해 trc 프로모터를 포함한다.
LS5218/pFS76 및 LS5218/pFS77 5 g/L의 4HB (나트륨염으로 4-하이드록시부틸레이트) 또는 1,4-부탄디올을 함유하는 최소 매질판 상에 획선(streak)된다. 상기 매질판은 또한 리터당 다음을 함유한다 : 15 g 배지; 1 mmol MgS04 ; 10 mg 티아민; 25.5 mmol Na2HP04; 33. 3 mmol K2HP04; 27.2 mmol KH2P04; 2.78 mg FeS04-7H20 ; 1.98 mg MnCl24H2O ; 2.81 mg CoS04-7H20 ; 0.17 mg CuCl2-2H20 ; 1.67 mg CaCl22H20 ; 0.29 mg ZnS04-7H20 ; 100㎍ 앰피실린(ampicillin); 및 0.1 mmol IPTG.
상기 판은 37℃에서 밤새 배양된다. 양 균주는 4HB에서 배양되나 LS5218/pFS77만은 1,4-부탄디올 판에서 성장된다. 그러므로gbd, aldH, 및dhaT유전자로 구성된 경로는 단일 탄소원으로서 1,4-부탄디올로된 이. 콜라이 LS5218 의 성장에 현저한 함을 보인다.
pFS76의 구조
gbd유전자는 다음의 올리고뉴클레이티드 프라이머를 사용한 알. 유트로파 H16(R. eutropha H16)의 게놈으로부터 PCR로 증폭된다.
5'-CCTGAATTCAGGAGGTTTTTATGGCGTTTA TCTACTATCTGACCCAC-3' (SEQ ID NO : 5)
(gbd 5'EcoRI)
5'-CCTGAGCTCCTACCTGCAAGTGCTCGCCGCTC-3' (SEQ ID NO : 6)
(gbd 3'SacI)
상기 결과 PCR 생성물은 EcoRI 및 SacI으로 절단되고 pFS76을 형성하는 동일한 효소로 절단된 pSE380 (Invitrogen; Carlsbad, CA)과 접합된다.
pFS77의 구조
aldH-dhaT영역은 NheI 및 HindIII로 절단된 pMS59로부터 제거된다. 플라스미드 pFS76은 SpeI 및 HindIII으로 절단된다. NheI 및 SpeI은 친화성스틱키(sticky) 말단부를 형성한다. pFS59로부터의aldH-dhaT단편 및 pFS76의 큰 단편은gbd, aldH, 및dhaT유전자를 포함하는 pFS77에 함께 주어지는 trc 프로모터의 제어 하에서 접합된다.
실시예 3 : 1,4-부탄디올로부터 폴리(4HB)의 생성
대장균 균주 LS5218 (CGSC 6966)은 2개의 프라스미드 pFS30 또는 pMS60의 하나로 변환된다. pFS30은라르스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha) PHA 신타아제(synthase, phaC) 유전자 및클로스트리디움 클루이베리(Clostridium kluyveri) 4HB-CoA 전이효소(transferase, hbcT) 유전자를 trc 프로모터의 제어하에서 포함한다. trc 프로모터의 조건 하에서, pMS60은 pFS30내의 2개의 유전자에 따라aldH및dhaT유전자를 포함한다. 실험의 목적은 aldH 및 옴T 유전자의 첨가가 PHA 중합체에서 1,4-부탄디올에서 4HB로의 변환이 이로운가 여부를 결정하는 것이다.
각각의 균주는 250rpm의 흔들림으로 37℃에서 100㎍/mL로 공급되는 LB 브로드(broth)에서 성장한다. 상기 세포는 원심분리(2000g, 10분)로 매질에서 제거되고 리터당 2.5g의 LB 분말; 50mmol의 인산칼륨, pH 7.0; 2g의 글루코스; 5g의 1,4-부탄디올; 10㎍ 암피실린 및 0.1 mmol의 IPTG를 포함하는 100mL의 매질에서 회복된다. 이러한 배양은 30℃에서 25시간 동안 250rpm으로 흔들림이 있다. 플라스크의 1/4 부피에서 상기 세포들은 상기와 같이 원심분리되고, 물로 세척되고, 재 원심분리되어 동결 건조된다. 각각의 플라스크에서 동결 건조된 약 20mg의 세포는110℃에서 3시간 동안 90% 1-부탄올 및 10% 농축 하이드로클로르산을 함유하는 2mL의 혼합물에서 내부 표준으로서 첨가되는 2mg/mL의 벤조산으로 동시 추출물 및 부탄노리시스(butanolysis)을 처리한다. 상기 결과 혼합물의 수용성 요소는 3mL의 수용액으로 추출에 의해 제거된다. 유기상(2 mL/분의 흐름 비율에 1:50의 분열률에서 1μL)은 80℃, 2분; 250℃에서 분당 10℃; 250℃ 2분의 온도 프로파일로 실리카 모세관 GC 컬럼에 융합된 SPB-1에서 분석된다. 중합체에서 4-하이드록시부틸레이트의 존재를 테스트하는 하는데 사용되는 기준은 감마-부틸로락톤이다 (Aldrich Chemical Co.; Milwaukee, WI).
균주 LS5218/pFS30은, 균주 LS5218/pMS60이 6.5의 가시 밀도(600nm)에 도달하고 건조 세포 중량이 12.3%의 폴리-4HB를 축척하는 동안 3.9의 가시밀도(600nm)에 도달하고 3.3%의 건조 세포 중량에 폴리-4HB를 축적한다. 그러므로aldH및dhaT유전자의 발현은 1,4-부탄디올로부터 폴리-4HB를 합성하기 위해 이. 콜라이 LS5218 능력을 증가시키기에 충분하다.
pFS16의 구조
플라스미드 pFS16는 클로스트리디움 클루이베리 오르프즈(Clostridium kluyveri orfZ, 소위hbcT) PCR 생성물을 pTrcN에 접합함으로서 이루어진다. 상기orfZ유전자는 다음의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용한 플라스미드 pCK3(Sohling and Gottschalk, 1996, J Bacteriol 178 : 871 80)으로부터 PCR에 의해 증폭된다.
5'-TCCCCTAGGATTCAGGAGGTTTTTATGGAGTGGGAAGAGATATATAAAG-3' (SEQ ID NO : 7)
(orfZ 5'AvrII)
5'-CCTTAAGTCGACAAATTCTAAAATCTCTTTTTAAATTC-3' (SEQ ID NO : 8)
(orfZ 3'Sall)
상기 결과 PCR 생성물은AvrII및SalI으로 절단되고 pFS16을 형성하기 위해XbaI(AvrII와 경쟁적인) 및Sall로 절단된 pTrcN으로 접합된다.
pFS30의 구조
상기 플라스미드 pFS30는 pFS16에서 유래하는데 라르스토니아 유트로파 (Ralstonia eutropha) PHA 생성효소 (phaC) 유전자를 첨가함으로서 이루어진다. 플라스미드 pAeT414는XmaI및StuI로 절단되어알. 유트로파(R. eutropha) 프로모터 및 구조적 phaC 유전자가 하나의 분획에서 존재한다. pFS16은BamHI로 절단되고, 둔한 말단부를 형성하기 위해 T4 DNA 중합효소로 처리하고 그후XmaI로 접합한다. 그러므로 수득되는 2개의 DNA의 분획은 pFS30을 형성하기 위해 함께 접합된다.
pMS59의 구조
aldH 유전자는SpeI및BglII으로 절단됨으로서 pMS33으로부터 제거된다. trc 프로모터의 제어하에클레브시에라 뉴모니아 dhaT(Klebsiella pneumoniae dhaT) 유전자를 포함하는 플라스미드 pTC42 (Skraly et al., 1998, Xppl. Environ. Microbiol. 64: 98105)는NheI및BgIII으로 절단된다.SpeI및NheI은 친화성 스틱키(sticky) 말단부를 형성한다. pMS33의 aldH-함유 분획 및 pTC42의 큰 분획은 pMS59을 형성하기 위해 함께 접합된다.
pMS60의 구조
aldH-dhaT영역은 DNA 중합효소 I의 Klenow 분획으로 처리되고 연속적으로Mfel로 절단된 후Dpel로 절단됨으로서 pMS59에서 분리된다. 이러한 분획은 하나의 무딘 말단부 및EcoRI-생성 스틱키 말단부와 친화성이 있는 일 스틱키 말단부를 구비한다. pFS30은 DNA 중합효소 I의 Klenow 분획으로 처리되고 연속적으로EcoRI로 절단된 후XmaI로 절단된다. pFS30의 대형 분획 및 pMS59의aldH-dhaT-함유 분획은 pMS60을 형성하기 위해 함께 접합된다.
실시예 4: 글루코스 및 1,4-부탄디올로부터 폴리(3HB-코-4HB)의 합성
이. 콜라이 균주 MBX1493은 염색체내에 융합된C. kluyveri orfZ(소위hic7)유전자 (Sohling & Gottschalk, 1996, J. Bacteriol. 178: 871-80)를 구비한 폴리(3HB-코-4HB)생성 규주이다. 이는 균주 MBX1335로부터 유래되며 이의 염색체에 융합된phaA, phaB, 및phaC유전자로된 PHB-생성 균주를 구비한다. MBX1335 자체는 균주 LS5218내에phaA, phaB및phaC유전자의 박테리아파지 P1 형질도입에 의해 MBX820으로부터 유래된다 (PCT WO 00/011188, Metabolix 참조).
균주 MBX1493은 분리된 절차로 4개의 플라스미드로 변환된다: pTrcN, pTC42, pMS33 및 pMS59. 상기 플라스미드는 trc 프로모터의 제어하에 다음 유전자를 각각 포함한다: 없음,dhaT단독,aldH단독,aldH및dhaT. 상기 각각의 균주들은 37℃에서 하룻밤동안 흔들어서 100㎍/mL으로 공급된 3mL LB내에서 성장된다. 1mL의 부피의 각각의 배양균에는 리터당 1 mmol MgS04; 10mg 티아민; 25.5mmol Na2HP04; 33.3mmol K2HP04; 27.2mmol KH2P04; 2.78mg FeS04-7H20 ; 1.98mg MnC12-4H20 ; 2.81mg CoS04-7H20 ; 0.17mg CuCl2-2H20 ; 1.67mg CaCl2-2H20 ; 0.29mg ZnS04-7H20 ;10g 글루코스; 5g 4-하이드록시부틸레이트 또는 10g 1,4-부탄디올; 100㎍ 암피실린; 25㎍ 클로암페니콜(chloramphenicol) ; 및 0.01mmol IPTG을 포함하는 50mL의 매질에 접종원으로서 사용된다. 이러한 배양균은 30℃에서 88시간동안 250rpm에서 흔들림으로 배양된다. 상기 세포들은 원심분리(2000g, 10분)에 의해 이러한 매질로부터 제거되고, 이들은 동결 건조되고 GC로 PHA 함량과 조성물을 분석한다. 표 1은 상기 균주들에 의해 제조된 중합체 조성물 및 상기 배양균들의 최종 시각밀도(600nm)이다.
표 1과 같이, 모든 균주는 4HB를 공급할 때 현저한 4HB의 퍼센트로서 공중합체를 생산한다. 그러나, 1,4-부탄디올, pMS59-함유 세포를 공급할 때, 즉 adlH 및 dhaT를 발현하는 세포는 현저한 수준으로 4HB를 상기 중합체에 혼합시킨다. 그러므로, 상기 adlH-dhaT 경로는 1,4-부탄디올을 4HB로 변환할 수 있음과 세포의 건강성이나 4HB가 PHA로의 현저한 혼합을 방해하지 않음을 나타낸다.
표 1. 1,4-부탄디올에서 4HB로의 변환
기질 플라스미드 OD(600nm) PHA% dcwa 4HB중합체b%
4HB pTrcN 19.2 53.0 36.6
4HB pTC42 18.8 62.7 16.0
4HB pMS33 14.8 49.8 21.4
4HB pMS59 22.8 43.5 32.2
1,4-BD pTreN 16.0 41.0 1.1
1,4-BD pTC42 10.4 38.7 0.7
1,4-BD pMS33 10.8 40.6 2.9
1,4-BD pMS59 10.4 34.6 25.3
a 전체 건조세포 중량 퍼센트
b전체 중합체 중량 퍼센트
실시 예 5 : 1,3-프로판디올로부터 폴리(3HP)의 생산
에스체리치아 콜라이(escherichia coil) 균주 LS5218(CGSC 6966)이 두 개의 플라스미드 pFS30 또는 pMS60 둘 중의 어느 하나로부터 변환되었다. 실험의 목적은aldH및dhaT유전자의 첨가가 1,3-프로판디올을 3HP로 전환하는데 유리한 것인지 여부를 결정하는 것이었다.
각각의 스트레인을 LB 육즙(broth) 내에서 상장시켰으며 250rpm으로 교반시키면서 하룻밤 동안 37℃에서 100㎍ /ml 암피실린(ampicillin)으로 보충시켰다. 그 다음 단계로 세포가 원심 분리(2000 g, 10min)에 의하여 매질로부터 제거되었고 어떤 매질 50ml 내에서 다시 서스펜션 되었으며 이 매개체는 리터 당 2.5 g LB 분말(power); 50 mmol, pH 7.0 포타슘 포스페이트(potassium phosphate); 5g 글루코스; 0 또는 10g 1,3-프로판디올; 100㎍ 암피실린; 및 0.1 mmol IPTG를 포함하였다. 이러한 인큐베이션을 25시간 동안 250 rmp으로 교반시키면서 30℃로 유지시켰다. 세포가 위에서 언급된 것과 같은 방법으로 원심 분리에 의하여 매개체로부터 제거되고, 물로 세척되었으며, 다시 원심 분리되고, 동결 건조되었고, PHA 용량(content)과 조성물을 위하여 분석되었고 이는 GC에 의하여 행하여졌다. 중합체 내에서 3-하이드록시프로피오네이트 유니트(3-hydroxypropionate units)의 존재 여부를 시험하기 위하여 사용된 표준은 베타-프로피오락톤(beta-propiolactone)(Aldrich Chemical Co.; Miwaukee, WI)이 되었다.
첨가된 1,3-프로판디올이 없는 플라스크 내에서, PHP 형성은 탐지되지 않았다; 스트레인 LS5218/pFS30 및 LS5218/pMS60은 각각 4.6 및 8.2의 광학적 밀도(optical densities)(600nm)에 도달하였다. 첨가된 1,3-프로판디올이 존재하는 플라스크 내부에서, 스트레인 LS5218/pFS30은 5.2의 광학적 밀도(600nm)에 도달하였고 탐지될 수 있는 수준의 폴리-3PH를 축척하지 않은 반면, 스트레인 LS5218/pMS60은 6.6의 광학적 밀도(600nm)에 도달하였고 건조 세포 중량의 5%에 해당하는 폴리-3PH를 축척시켰다. 이러한 실험의 결과 aldH 및 dhaT 유전자의 발현은 1,3-프로판디올로부터 폴리-3PH를 합성할 수 있는 E. coli LS5218의 능력을 증가시키기에 충분한 것으로 나타났다.
실시 예 6 : 글루코스 및 1,3-프로판디올로부터 폴리(3HB-co-3HP)의 합성
균주 MBX1493이 독립적인 과정을 통하여 4개의 플라스미드를 이용하여 변환되었다: pTrcN, pTC42, pMS33 및 pMS59. 이러한 스트레인 각각을 37 ℃에서 하룻밤 동안 교반시키면서 100㎍/mL 암피실린으로 보충시킨 100mL LB에서 성장시켰다. 세포가 각각의 플라스크로부터 윗물을 따르는 방법(decant)으로 분리되고, 잔여 액체를 그대로 유지시켰다. 다음 단계로 각각의 플라스크에 80ml의 어떤 매개체를 첨가시켰으며 이 매개체는 리터당 6.25g LB 분말; 1mmol MgSO4; 10mg 티아민(thiamine); 25.5mmol Na2HPO4; 33.3mmol K2HPO4; 27.2mmol KH2PO4; 2.78mg FeSO4·7H2O; 1.98 mg MnCl2·4H2O; 2.81 mg CoSO4·7H2O; 0.17 mg CuCl2·2H2O; 1.67 mg CaCl22H2O; 0.29 mg ZnSO4·7H2O; 10g 글루코스; 100 ㎍ 암피실린; 25㎍ 클로람페니콜(chloramphenicol); 및 0.01 mmol IPTG를 포함하였다. 이러한배양물(cultures)이 7시간 동안 250 rmp에서 교반시키면서 37℃에서 배양시켰다. 다음 단계로 위에서 주어진 것과 동일한 매개체 20ml를 추가하였으며 추가되는 매개체가 위의 매개체와 다른 점은 이 매개체에서는 LB가 12.5 g/L까지 증가하였으며, 글루코스가 100g/L까지 증가하였고, IPTG가 0.25mM까지 증가하였고, 1,3-프로판디올이 50 g/L에서 첨가되었다는 점이다. 이리하여 이 실험에서 첨가된 최후의 농도는 2.5 g/L LB, 20 g/L 글루코스, 10 g/L 1,3-프로판디올, 및 0.05 mM IPTG가 되었다. 이러한 플라스크를 250 rmp에서 교반시키면서 24시간 동안 30℃에서 배양시켰다. 다음 단계로 세포가 이 매개체로부터 원심 분리(2000 g, 10 min)에 의하여 제거되고, 제거된 세포가 동결 건조되고 PHA 용량 및 조성물을 위하여 분석되고 이는 GC에 의하여 이루어졌다. 표 2는 이 스트레인에 의하여 만들어진 중합체의 조성물 및 배양물의 최후의 광학적 밀도(600nm)를 나타낸 것이다.
1,3-프로판디올이 존재하지 않는 상태에서, 각각의 스트레인은 단지 PHB 만을 합성하였다. 1,3-프로판디올이 주입되었을 때, 단지 pMS59-함유 세포, 즉 aldH 및 dhaT를 모두 발현하는 세포, 만이 현저한 수준의 중합체 내부로의 3HP의 결합을 만들었다. pMS33을 포함하는 세포 또는 단지 aldH 단독으로 3HP 결합을 이루었지만, 매우 작은 범위로 결합이 이루어졌다. 이러한 방법으로 aldH-dhaT 경로는 1,3-프로판디올을 3HP로 전환하는 것이 가능하도록 한다는 것을 보여주었다. dhaT 유전자(pTC42 및 pMS59)를 포함하는 세포는 1,3-프로판디올이 존재하는 경우 보다 작은 전체량의 3HP를 만들었고, 이러한 결과는 3-하이록시프로피오날데하이드(3-hydroxypropionaldehyde)의 독성으로 인한 결과인 것으로 강하게 추정된다. dhaT의 발현에 대한 aldH 발현 비의 증가 및/또는 1,3-프로판디올 농도의 감소는 이러한 현상을 잠식하여야 한다.
표 2. 다양한 플라스미드를 함유하는 MBX1493에 의한 PHA 내부로의 3HP의 결합
1,3-프로판디올 g/L 플라스미드 dcw의 PHA % 중합체의 3HP %
0 pTrcN 35.2 0.0
0 pTC42 46.0 0.0
0 pMS33 31.2 0.0
0 pMS59 37.7 0.0
10 pTrcN 36.6 0.0
10 pTC42 23.9 0.0
10 pMS33 39.6 0.3
10 pMS59 20.0 3.8
dcw(dry cell weight)는 총 건조 세포 중량을 나타낸다.
중합체 중량은 전체 중합체 중량을 나타낸다.
실시 예 7 : 1,4-부탄디올로부터 폴리(4HB) 합성을 위한 아실-CoA 신세타제의 사용
Tn 10으로부터 테트라시실린(tetracycline) 저항 마커(marker)와 함께 오페론으로 염색체 내부로 합쳐진 aldH 및 dhaT 유전자를 가지는 스트레인 MBX1668이 두 개의 플라스미드 pFS73 또는 pMS92 중의 어느 하나를 이용하여 변환되었다. 플라스미드 pFS73은 위에서 언급된 여러 실시 예에서 기술된 pFS30과 동일하며 차이점은 암피실린 저항 마커가 pACYC177(GenBank Accession No. X06402)로부터 카나미신 저항 마커(kanamycin resistance marker)로 대체되었다는 점이다. 플라스미드 pMS92가 pFS73으로부터 유도되는 한편, orfZ 유전자는 수도모나스 올레오보란스(Pseudomonas oleovorans)(van Beilen et al, 1992, Mol. Microbiol.6:3121-36)으로부터 alkK 유전자로 대체되었다. 이러한 스트레인 각각을 하루 밤 동안 교반시키면서 37℃에서 50 ㎍/ml 카나미신 및 10 ㎍/mL 테트라시실린으로 보충된 3 mL LB 내에서 성장시켰다. 각각의 배양물 1 밀리리터가 접종물(inoculum)로서 200-mL 사각 병(square bottle)에 첨가되었다. 각각의 병은 50 mL의 어떤 매개체를 유지하였고 이 매개체는 리터당 0.1 g 카사미노 산(casamino acids); 5 mmol MgSO4; 10 mg 티아민; 25.5 mmol Na2HPO4; 33.3 mmol K2HPO4; 27.2 mmol KH2PO4; 2.78 mg FeSO4·7H2O; 1.98 mg MnCl2·4H2O; 2.81 mg CoSO4·7H2O; 0.17 mg CuCl2·2H2O; 1.67 mg CaCl2·2H2O; 0.29 mg ZnSO4·7H2O; 10 g 글루코스; 10 g 1.4-부탄디올; 50 μg 카나미신; 및 10 μg 테트라시실린을 포함한다. 이 배양물을 48 시간 동안 교반시키면서 30℃에서 배양시켰다. 다음 단계로 세포가 원심 분리(2000g, 10min)에 의하여 이 매개체로부터 제거되었고, 제거된 세포는 동결 건조되고 PHA 용적 및 조성물을 위하여 분석되었고 이는 GC에 의하여 이루어졌다. pFS73을 잠복시키고 있는(harboring) 스트레인 MBX1668은 건조 중량 5.8% 폴리(4HB)를 포함하고 있는 반면, pMS92를 잠복시키고 있는 MBX1668은 건조 중량 27.7% 폴리(4HB)를 포함하고 있었다. 이러한 결과로 인하여 alkK 유전자는 수용 가능성을 가지며, 이 경우에는 더욱 유리하게 디올(diols)로부터 PHAs의 합성에서 orfZ 유전자를 위한 대체물(substitute)이 된다.

Claims (21)

  1. 디올 산화환원효소, 알데히드 탈수소효소, 아실-CoA 전이효소, 아실-CoA 합성효소, β-케토티오라제(β-ketothiolase), 아세토아세틸-CoA 환원효소 및 PHA 신타아제(synthase)로 구성된 군으로부터 선택된 효소들을 발현하는 유기체를 유전공학적으로 처리 제공하는 단계,
    상기 유기체에 의해 발현된 효소로 하이드록시알칸노에이트(hydroxyalkanoate) 단량체를 변화할 수 있는 디올(diol)을 제공하는 단계,
    상기 하이드록시알칸노에이트 단량체가 폴리하이드록시알칸노에이트를 형성하기 위해 중합하는 조건하에서 상기 유기체를 배양하는 단계를 포함하는 폴리하이드록시알칸노에이트의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 디올은 1,6-헥산디올이고, 상기 하이드록시알칸노에이트 단량체는 6-하이드록시헥산노에이트인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 디올은 1,5-펜탄디올이고, 상기 하이드록시알칸노에이트 단량체는 5-하이드록시발레레이트(hydrixyvalerate)인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 디올은 1,4-부탄디올이고, 상기 하이드록시알칸노에이트는 4-하이드록시부틸레이트인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 디올은 1,3-프로판디올이고, 상기 하이드록시알칸노에이트 단량체는 3-하이드록시프로피오네이트인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 디올은 1,2-에탄디올이고, 상기 하이드록시알칸노에이트는 2-하이드록시에탄노에이트인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 디올은 1,2-프로판디올이고, 상기 하이드록시알칸노네이트는 2-하이드록시프로피오네이트인 방법.
  8. aldH및dhaT유전자를 발현하는 유기체를 포함하는, 제1항에 의한 방법에서 이용되기 위한 유전공학적으로 처리된 유기체.
  9. 제8항에 있어서, 상기 유기체는에스체리치아 콜라이(Escherichia coli),랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha),클렙시에라 에스피피(Klebsiella spp.),알카리진 라투스(Alcaligenes latus),아조토박테르 에스피피(Azotobacter spp.) 및코맘모나스 에스피피(Comamonas spp.)로 구성된 군에서 선택된 유기체.
  10. 디올 산화환원효소, 알데히드 탈수소효소, 아실-CoA 전이효소, 아실-CoA 합성효소, β-케토티오라제(β-ketothiolase), 아세토아세틸-CoA 환원효소 및 PHA 신타아제(synthase)로 구성된 군으로부터 선택된 효소들을 발현하기 위해 유전공학적으로 유기물을 포함하며,
    상기 유기체는 디올을 폴리하이드록시알칸노에이트를 형성하기 위해 중합되는 하이드록시알칸노에이트 단량체로 변환할 수 있는 폴리하이드록시알칸노에이트의 제조용 시스템.
  11. 적어도 300,000의 중량 평균 분자량(Mw)을 구비한 2-하이드록시프로피오네이트 또는 2-하이드록시에틴노에이트 또는 양자를 포함하고, 3-하이드록시부틸레이트, 4-하이드록시부틸레이트, 3-하이드록시프로피오네이트, 2-하이드록시부틸레이트, 4-하이드록시발레레이트, 5-하이드록시발레레이트, 6- 하이드록시헥산노에이트 및 3-하이드록시헥산노에이트로 구성된 군으로부터 선택된 일 이상의 공단량체를 포함하는 폴리하이드록시알칸노에이트 공중합체 포함 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 공단량체는 3-하이드록시부틸레이트인 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 상기 공단량체는 4-하이드록시부틸레이트인 조성물.
  14. 제11항에 있어서, 상기 공단량체는 3-하이드록시프로피오네이트인 조성물.
  15. 제11항에 있어서, 상기 공단량체는 2-하이드록시부틸레이트인 조성물.
  16. 제11항에 있어서, 상기 공단량체는 4-하이드록시발레레이트인 조성물.
  17. 제11항에 있어서, 상기 공단량체는 5-하이드록시발레레이트인 조성물.
  18. 제11항에 있어서, 상기 공단량체는 6-하이드록시헥산노에이트인 조성물.
  19. 제11항에 있어서, 상기 공단량체는 3-하이드록시헥산노에이트인 조성물.
  20. 디올 산화환원효소, 알데히드 탈수소효소, 아실-CoA 전이효소, 아실-CoA 합성효소, β-케토티오라제(β-ketothiolase), 아세토아세틸-CoA 환원효소 및 PHA 신타아제(synthase)로 구성된 군으로부터 선택된 효소들을 발현하기 위해 유전공학적으로 처리된 유기체로 폴리하이드록시알칸노에이트를 제조하는 생물학적 시스템을 향상시기기 위한 방법으로,
    여기서 상기 유기체는 디올을 폴리하이드록시알칸노에이트를 형성하기 위해 중합되는 하이드록시알칸노에이트 단량체로 변환시킬 수 있고,
    상기 방법은 선택된 디올 또는 디올들로부터 PHA를 합성할 수 있는
    i) 특이성 호스트 내에 돌연변이를 유도하는 단계, 및
    ii) 점증하여 생성되는 돌연변이체의 풀(pool)을 스크린닝(screening)하는 단계에 의하여 효소 반응성의 증가로 돌연변이체를 선택하는 단계를 포함하는 방법.
  21. 발현 효소가 디올로부터 3-하이드록시부틸레이트, 4-하이드록시부틸레이트, 3-하이드록시프로피오네이트, 2-하이드록시부틸레이트, 4-하이드록시발레레이트, 5-하이드록시발레레이트, 6-하이드록시헥산노에이트, 3-하이드록시헥산노에이트, 2-하이드록시프로피오네이트 및 2-하이드록시에틴노에이트로 구성된 군으로부터 선택된 하이드록시알칸노에이트 단량체를 생산할 수 있는, 디올 산화환원효소 및 알데히드 탈수소효소를 엔코딩(encoding)한 DNA 분절.
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