WO2019177371A1 - 미생물을 이용한 폴리(3-하이드록시프로피오네이트-b-락테이트) 블록공중합체 - Google Patents

미생물을 이용한 폴리(3-하이드록시프로피오네이트-b-락테이트) 블록공중합체 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 신규한 3-하이드록시프로피오네이트-락테이트의 블록공중합체[P(3HP-b-LA)]{Method for preparing poly(3-hydroxypropionate-b- lactate) block copolymer by using microorganisms} 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 락트산을 생합성하지 못하도록 개량한 재조합 대장균을 이용하여, 배양 초기에 글리세롤을 탄소원으로 하여 3-하이드록시프로피오네이트를 생산하는 유전자들과 개량된 PHA 신타아제를 통해 P(3HP)를 생합성하는 제1 배양단계; 및 탄소원으로 글리세롤과 글루코오스가 함께 공급시 글루코오스만 선택적으로 대장균 내로 유입시키는 탄소 이화대사억제 시스템(Carbon catabolic repression system)을 이용하여 P(3HP) 생산을 억제시키고, IPTG 유도 시스템을 통해 락테이트 생성 효소와 락틸-CoA 전환 효소가 발현되도록 하여 중단된 P(3HP) 말단에 폴리락테이트를 생합성시키는 제2 배양단계;를 포함하는 3-하이드록시프로피오네이트-락테이트의 블록 공중합체를 제조하는 방법 및 이에 의해 제조된 3-하이드록시프로피오네이트-락테이트의 블록 공중합체를 제공한다.

Description

【발명의 명칭】
미생물을 이용한 폴리 (3 -하이드록시프로피오네이트- 락테이트) 블록공중합체
【기술분야】
관련 출원 (들)과의 상호 인용
본 출원은 2018년 3월 15일자 한국특허출원 제 10-2018-0030522호 에 기초한우선권의 이익을주장하며， 해당 한국 특허 출원의 문헌에 개시된 모든 내용은본 명세서의 일부로서 포함된다.
본 발명은 폴리 (3 -하이드록시프로괴오네이트- 락테이트) 블록공중합체의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로， 재조합 미생물을 사용하여 폴리 (3 -하이드록시프로피오네이트- 락테이트) 블록공중합체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
【발명의 배경이 되는 기술】
락테이트를 단량체로 하는 중합체인 폴리락테이트 (PLA)는 대표적인 생분해성 고분자로서 범용고분자 혹은 의료용 고분자로서의 응용성이 높은 고분자아다. 현재 PLA는 미생물 발효메 의해 생산된 락테이트를 중합하여 제조되고 있으나， 락테이트의 직접중합에 의해서는 낮은 분자량 (1000-5000 달톤)의 PLA만이 생성된다. 100,000 달톤 이상의 를 합성하기 위해서는 락테이트의 직접중합으로 얻어진 낮은 분자량의 PLA로부터 사슬 커플링제 (chain coupl ing agent )를 이용하여 보다분자량이 큰 PLA로 중합하는 방법이 있으나 사슬 커플링제를 이용하기 때문에 고분자량의 를 제조하는 방법은 유기용제나 커플링제의 첨가로 인해 공정이 복잡해지고， 또한 이들을 제거가 쉽지 ·않다는 단점이 있다. 현재 상용화 되어있는 고분자량 PLA 생산공정은 락테이트를 락타이드 ( lact ide)로 전환한 다음， 락타이드 링의 개환축합반응을통해 PLA를 합성하는 화학합성 방법이 사용되고 있다.
그러나， 이러한 PLA는 취성 (br i tt leness)이 좋지 않기 때문에， 이를 개선하기 위하여 신율이 좋은 3 -하이드록시프로피오네이트 (3-HP)를 첨가하여 폴리 (3 -하이드록시프로피오네이트-广락테이트) (P(3HP-r-LA) ) 랜덤 공중합체를 개발하는 것이 보고된 바 있다. 그러나, 이러한 폴리 (3- 하이드록시프로피오네이트-/·-락테이트)는 결정화가 되지 않아 좋지 않은 물성을 갖는다는문제점을가지고 있었다.
이에， 본 발명자들은 종래 폴리락테이트 및 P(3HP-r-LA) 랜덤 공중합체의 문제점을 개선하기 위하여, 락트산을 생합성 하지 못하도록 개량되고 PHA합성효소의 유전자로 형질전환된 재조합 대장균을 배양하는 것에 의하여， PLA와 P(3HP)이 블럭공중합체 [Poly(3-hydroxypropionate_Zr lactate) ]를 생합성하였다. 또한， 이러한블록 공중합체가종래 폴리락테이트 및 P(3HP-r-LA) 랜덤 공중합체에서 문제된 취성 등의 문제점이 현저하게 개선된 것임을 확인하고본발명을완성하게 되었다.
【선행기술문헌】
【특허문헌】
(특허문헌 1) 국내특허등록 제 10-0957773호 (2010.05.06. )
【비특허문헌】
(비특허문헌 1) Park, S.J .， et al . , Metabol i c engineer ing of Ral stoni a eutropha for the biosynthesi s of 2-hydr oxyac id-containing polyhydroxyalkanoate , Metab. Eng. 20 , 20-28 (2013)
【발명의 내용】
【해결하고자하는과제】
본 발명은 락트산을 생합성하지 못하도록 개량된 재조합 미생물을 3 - 하이드록시프로피오닐- CoA(3-hydroxypropionyl_CoA) 생합성 유전자 및 폴리하이드록시알카노에트 (polyhydroxyalkanoate;PHA) 합성효소 유전자를 포함하는 벡터, 및 락테이트 생합성 유전자 및 락테이트 ( lactate)를 락틸- CoA( lactyl-CoA)로 전환하는 효소의 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환시켜 제조된 재조합미생물을 제공하는 것을목적으로 한다.
또한 본 발명은 상기 재조합 미생물을 2 단계의 배양을 수행하여 폴리 (3 -하이드록시프로피오네이트-/广락테이트) 블록공중합체를 제조하는 방법을 제공하는 것을목적으로 한다.
또한 본 발명은 상기 재조합 미생물을 포함하는， 폴리 (3 - 하이드록시프로피오네이트- b-락테이트) 블록공중합체 제조용 공중합체 제조용 조성물을 제공하는 것을목적으로 한다.
또한 본 발명은 상기 방법에 따라 제조된 폴리 (3 - 2019/177371 1»（：1^1{2019/002909
하이드록시프로피오네이트- 락테이트） 블록공중합체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
【과제의 해결 수단】
이하, 본 발명을더욱자세히 설명하고자 한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서， 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 3 -하이드록시프로피오네이트-락테이트 블록 공중합체 （3卵- 1 ）]의 제조방법 및 상기 제조방법에 의해 생산된 3 - 하이드록시프로피오네이트-락테이트블록공중합체에 관한 것이다:
（ 락트산을 생합성하지 못하도록 개량된 재조합 미생물을 3- 하이드록시프로피오닐-（ 쇼（3-117（110 5巾1'（¾^1171-（ \） 생합성 유전자 및 폴리하이드록시알카노에트（1）017]¾년1"¥0 11¾110 6 :? ） 합성효소 유전자를 포함하는 벡터, 및 락테이트 생합성 유전자 및 락테이트（比 를 락틸_ （：0 13 기-（：0시로 전환하는 효소의 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환시켜 재조합마생물을 제조하는 단계;
0）） 상기 단계 （3）에서 제조된 재조합 미생물을 글리세롤을 탄소원으로 사용하여 배양하여 해미를 합성하는 단계 ;
（ ） 1 및 글루코오스를 투입하여 3볘） 생산을 억제하고, 락테이트 생합성 효소 및 락테이트를 락틸-코에이（13 -（：0시 전환 효소가 발현되도록 하여 단계 （3）에서 합성된 해的 말단에 此요를 생합성 시키는 단계. 이하, 각단계를상세하게 설명한다. 단계 （3）에서는
Figure imgf000005_0001
블록 공중합체의 제조를 위하여， 락트산을 생합성하지 못하도록 개량된 재조합 미생물에 3- 하이드록시프로피오닐-◦0쇼（3-1¾년1'（光71）1'01^01171-0¾/\） 및 폴리하이드록시알카노에트（1）01：71¾선1（«： 11에10 6 :1¾\） 합성효소 유전자를 포함하는 벡터와， 락테이트 생합성 효소유전자 및 락테이트（ 를 락틸- （：0사13 -（：0시로 전환하는 효소의 유전자를 포함하는 벡터를 이용하여 형질전환하여 재조합미생물을 제조한다.
락트산을 생합성하지 못하도록 개량된 재조합 미생물은 재조합 미생물이 내재하는 락테이트 탈수소효소（Ldh）, 예를 들어 락테이트 탈수소효소 A （LdhA）가불활성화되도록 넉아웃된 것일 수 있다.
상기 3 -하이드록시프로피오닐- CoA（3-hydroxypropionyl_CoA） 생합성 관련 효소 및 PHA 합성효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터， 및 락테이트 생합성 관련 효소 유전자 및 락테이트（lactate）를 락틸- CoA（lactyl_
CoA）로 전환하는 효소의 유전자를 포함하는 벡터를 통상적인 유전자 재조합 벡터 제조방법에 의해 제조될 수 있고， 공지의 형질전환 미생물의 제조방법（예를들아전기천공 등）에 의해 미생물 세포 내에 도입될 수 있다. 상기 3 -하이드록시프로피오닐- CoA（3-hydroxypropionyl_CoA） 생합성 관련 효소를 암호화하는 유전자는 바람직하게， 글리세롤 디하이드라테이즈（DhaBl（서열번호 1）， DhaB2（서열번호 3）， DhaB3（서열번호 5）의 서브유닛으로 이루어짐） 글리세롤 디하이드라테이즈 액티베이즈（GdrA（서열번호 7） 및 GdrB의 서브유닛（서열번호 9）으로 이루어짐）, CoA-의존 프로피온알데히드 디하이드로게네이즈 및 알데히드 디하이드로게네이즈를 암호화하는 유전자일 수 있다. 바람직하게， 글리세롤 디하이드라테이즈（Accession No . : EC 4.2.1.30）를 암호화하는 유전자는 油 aB123（o½aBl（서열번호 2）， 油 aB2（서열번호 4）, 油 aB3（서열번호 6））, 글리세롤 디하이드라테이즈 액티베이즈（Accession No . : EC 4.2.1.30）를 암호화하는 유전자는 / rAB（ / rA（서열번호 8） 및 / rB（서열번호 10）의 서브 유닛으로 이루어짐）， CoA-의존 프로피온알데히드 디하이드로게네이즈（Accession No. : EC 1.2.1.3； 서열번호 11）를 암호화하는 유전자는 ¾P（서열번호 12）일 수 있다.
상기 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 （ po 1 yhydr oxya 1 kanoat e （PHA） synthase）는 CoA와 hydroxy fatty acid의 티오에스테르를 기질로 사용하여 폴리하이드록시알카노에이트를 생합성하는 효소로서， 탄소수 3-5의 지방산을 사용하는 type（예컨대， Cupr i avidus necator , A leal i genes latus 등의 다양한박테리아유래）과탄소수 6-14의 지방산을사용하는 type （예컨대， Pseudomonas 속유래）의 것일 수 있다.
예컨대, 상기 PHA 합성효소 및 이를 암호화하는 유전자는 큐브리아비두스 네카터（Cupr i avidus necator （Ral stoni a eutropha H16））에서 유래한 PHA 합성효소 ReC (서열번호: 13 ; Accession No .： EC 2.3.1.B2, 유전자 reC, Genebank accession No . J05003.1 , 서열번호 14)의 변이체 암호화 유전자의 S506G 및 A510K 아미노산 치환 변이체 및 이를 암호화하는 유전자 (reCO)일 수 있다.
상기 락테이트 생합성 효소는 글루코오스로부터 락트산을 생합성하는 효소로서， 예를 들어 페디오코쿠스 애시딜락티시 (Pediococcus acidi lact i ci )로부터 유래한 락테이트 탈수소효소 (Ldh) , 예를 들어 락테이트 탈수소효소 A (LdhA) 또는 락테이트 탈수소효소 D (LdhD) (Accession No . : EC 1.1.1.28 (서열번호 15)를 암호화하는 유전자 ( AM, 1· (996 bp , Gene Accession No . : X70925.1 , 서열번호 16) )일 수 있다.
상기 락테이트를 락틸- CoA로 전환시 효소는, 예컨대， 프로피오닐- CoA 전이효소 )일 수 있다. 프로피오닐- CoA 전이효소는 다음의 반응식 1의 화학 반응을촉매하는 효소이다: [반응식 1]
아세틸-코에이 (acetyl-CoA) + 프로피노에이트 (propinoate) o 아세테이트 (acetate) +프로피오닐-코에이 (propionyl-CoA) . 상기 효소 및 이를 암호화하는 유전자는 클로스트리디움 프로피오니쿰 (C7osir/ / prop ionic·)6사 유래한 것일 수 있다.
예를들어， 상기 프로피오닐- CoA전이효소 암호화유전자는，
(a) 서열번호 17의 염기서열;
(b) 서열번호 17의 염기서열에서 A1200G (1200번째 염기인 A가 G로 치환된 변이를 의미함; 이하 기재되는 염기서열 변이 표현에 동일하게 적용됨)의 변이를 포함하는 염기서열;
(c) 서열번호 17의 염기서열에서 T78C, T669C, A1125G 및 T1158C의 변이를포함하는 염기서열;
(d) 서열번호 17의 염기서열에서 A1200G의 변이를 포함하고, 서열번호 · 17과 대응하는 아미노산 서열에서 G335A (335번째 아미노산 ( 이 Ala로 치환된 변이를 의미함， 이하 기재되는 아미노산 서열 변0ᅵ 표현에 동일하게 2019/177371 1»（：1^1{2019/002909
적용됨）의 변이를 포함하는 아미노산서열을 암호화하는 염기서열;
（ 서열번호 17의 염기서열에서 ^200（｝의 변이를 포함하고， 서열번호 17과 대응하는 아미노산 서열에서 쇼2431：의 변이가 포함된 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열;
行） 서열번호 17의 염기서열에서 16690, 1250 및 11158（：의 변이를 포함하고， 서열번호 17과 대응하는 아미노산서열에서 예5（；의 변이를 포함하는 아미노산서열을 암호화하는 염기서열;
（요） 서열번호 17의 염기서열에서 200（｝의 변이를 포함하고, 서열번호 17과 대응하는 아미노산 서열에서 敗5 의 변이를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열;
（10 서열번호 17의 염기서열에서 16690, 쇼11256 및 158（：의 변이를 포함하고, 서열번호 17과 대응하는 아미노산서열에서 065의 변이를 포함하는 아미노산서열을 암호화하는 염기서열;
0） 서열번호 17의 염기서열에서 16690, 1256 및 11158（：의 변이를 포함하고， 서열번호 17과 대응하는 아미노산 서열에서 11991의 변이를 포함하는 아미노산서열을 암호화하는 염기서열; 및
（0 서열번호 17의 염기서열에서 1780, 16690 , 사125& 및 打158（：의 변이를 포함하고, 서열번호 17과 대응하는 아미노산 서열에서 93쇼의 변이를 포함하는 아미노산서열을 암호화하는 염기서열
로 이루어진 군으로부터 선택된 염기서열을 포함하는 것일 수 있으며， 상기 상기 프로피오닐-（：0쇼 전이효소는 상기 염기서열에 의하여 암호화되는 아미노산서열을포함하는 것일 수 있다.
바람직하게， 상기 유전자는 서열번호 17의 염기서열에서 ^78（：, 16690, 쇼11250 및 158（：의 변이를 포함하고, 서열번호 17과 대응하는 아미노산 서열에서 193쇼의 변이를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 포함하는 cppct540일· 수 있다.
상기 효소들은 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 범위 내에서 추가적인 변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어， 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser , Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser , Ala/Gly, Ala/Thr , Ser/Asn, .Ala/Val , Ser/Gly, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val , Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환을 들 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다. 경우에 따라서/ 상기 단백질은， 인산화 (phosphorylation)， 황화 (sulfation) , 아크릴화 (acrylation)， 당화(glycosylat ion)， 메틸화(methylation)， 파네실화 (farnesylation) 등으로 수삭 (modification) 될 수도 있다. 또한， 아미노산 서열 상의 변이 또는 수식에 의해서 단백질의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 단백질 활성이 증가한 효소 단백질을 포함할 수 있다.
또한， 상기 효소를 코딩하는 유전자는， 기능적으로 균등한 코돈 또는
(코돈의 축퇴성에 의해) 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈, 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 핵산분자를 포함할 수 있다. 상기 핵산 분자는 표준 분자 생물학 기술， 예를 들어 화학적 합성 방법 또는 재조합 방법을 이용하여 분리 또는 제조하거나， 시판되는 것을사용할수 있다.
"벡터”는 개체의 세포 내에서 목적 단백질을 코딩하는 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말하며， 목적 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 숙주세포로 도입되기 위한 수단이 된다. 상기 벡터는 플라스미드, 아데노바이러스 벡터， 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터 등의 바이러스 벡터, 박테리오파지 벡터, 코즈미드 벡터, YAC(Yeast Artificial Chromosome) 벡터 등 다양한 벡터들로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 일 예에서, 상기 플라스미드 벡터는 pBlue (예컨대， pBlueseript II KS(+) ) , pSClOl, PGV1106, pACYC177, ColEl, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9 , pUC6, pBD9, pHC79 , pIJ61 , pLAFRl, pHV14, pGEX 시리즈， pET 시리즈， pUC19 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고， 상기 박테리오파지 벡터는 lambda gt 4 lambda B, lambda-Charon, lambda Azl, 및 M13 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 상기 바이러스 벡터는 SV40 등일 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다.
11재조합 벡터1’는 외래의 목적 유전자를 포함하는 클로닝 벡터 및 발현 벡터를포함한다. 클로닝 벡터는 복제기점， 예를 들어 플라스미드， 파지 또는 2019/177371 1»（：1^1{2019/002909
코스미드의 복제 기점을 포함하며， 다른 0 절편이 부착되어 부착된 절편이 복제될 수 있는 레플리콘이다. 발현 벡터는 단백질을 합성하는데 사용되도록 개발되었다.
본 명세서에서 벡터는 원핵세포 또는 진핵세포 등 각종 숙주세포에서 목적하는 효소 유전자를 발현하고 이를 생산하는 기능을 할 수 있도록 하면 특별히 한정되지 않지만， 벡터 내로 삽입되어 전달된 유전자가 숙주세포의 게놈 내로 비가역적으로 융합되어 세포 내에서 유전자 발현이 장기간 안정적으로지속되도록 하는 것이 좋다.
이러한 벡터는, 목적 유전자가 선택된 숙주 내에서 발현될 수 있도록 하는 전사 및 해독 발현 조절 서열을 포함한다. 발현 조절 서열로는， 전사를 실시하기 위한 프로모터， 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열， 적합한
Figure imgf000010_0001
리보좀 결합부위를 코딩하는서열 및/또는 전사 및 해독의 종결을조절하는서열을포함할수 있다. 예를 들면， 원핵생물에 적합한조절 서열은프로모터， 임의로오퍼레이터 서열 및/또는 리보좀 결합부위를포함할 수 있다. 진핵세포에 적합한 조절 서열은 프로모터, 터미네이터 및/또는 폴리아데닐화 시그날을포함할수 있다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로목적 단백질을 코당하는 핵산 서열의 일부로 간주되며， 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임（比 6）에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함할 수 있다. 그 외에， 인핸서， 목적하는 유전자의 5 ' 말단 및 3 ' 말단의 비해독영역， 선별 마커（예컨대, 항생제 내성 마커）, 또는 복제가능단위 등을 적절하게 포함할 수도 있다. 벡터는자가복제하거나숙주 게놈 에 통합될 수 있다.
유용한 발현 조절 서열와 예로는, 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, 원숭이 바이러스 40（^40）， 마우스 유방 종양 바이러스（■! ） 프로모터, 의 긴 말단 반복부（1그¾） 프로모터， 몰로니 바이러스， 시토메갈로바이러스ᄄ ） 프로모터, 엠스타인 바 바이러스犯別） 프로모터, 로우스 사코마 바이러스（1¾\0 프로모터， ^ 폴리머라제 II 프로모터, 액틴 프로모터， 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터， 1 시스템，
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시스템， 13 및 17프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역， fd 코드 단백질의 조절 영역， 포스포글리세레이트 키나아제 (phosphoglycerate kinase, PGK) 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한프로모터， 포스파타제의 프로모터들， 예를 들어 Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을조절하는 것으로 알려진 구성과유도의 기타다른 서열 및 이들의 여러 조합을포함할수 있다.
세포에서 형질전환 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는 목적하는 유전자와 전사 및 해독 발현 조절 서열이 서로 작동가능하도록 연결되어야 한다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 예를 들면, 전서열 (pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 쇼가 단백질의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 ■쇼에 작동가능하게 연결될 수 있고, 프로모터 또는 인핸서가 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결될 수 있고, 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결될 수 있고, 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결 ¾수 있다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션 (연결)에 의해 수행될 수 있고， 그러한 부위가 존재하지 않는 경우， 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커 (linker)를 사용하여 수행될 수 있다.
당업자는 숙주세포의 성질, 벡터의 복제 수， 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현 등을 고려하여, 본발명에 적합한각종 벡터， 발현 조절 서열， 숙주등을 선정할수 있다.
본 명세서에서 제공되는 재조합 미생물은 상기 재조합 벡터를 사용하며 숙주 미생물 세포를 형질전환시켜서 얻어질 수 있다.
용어， ”형질전환"은 목적 유전자를 숙주 미생물로 도입시켜 목절 유전자가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 숙주 미생물로 사용 가능한 미생물은 원핵세포와 진핵세포로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며， 통상적으로， DNA의 도입효율이 높고， 도입된 의 발현효율이 높은 미생물이 숙주 미생물로서 사용될 수 있다. 숙주 미생물이 구체 예로, 대장균 (예를 들어， E.coli DH5a, E.coli JM101 , E. coll K12, E. coli W3110, E.coli X1776, E.coli B 및 E. coli XLl-Blue)을 포함하는 에스케리키아 속， 슈도모나스 속， 바실러스 속， 스트렙토마이세스 속, 어위니아 속， 세라티아 속， 프로비덴시아 속， 코리네박테리움 속， 렙토스피라 속， 살모넬라 속， 브레비박테리아 속, 하이포모나스 속, 크로모박테리움 속， 노카디아 속， 진균 또는 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주 등을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다: 적당한숙주로 형질전환되면， 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
또한， 본 발명의 목적상, 상기 숙주세포는 탄소원으로부터 하이드록시아실-CoA를 생합성하는 경로를 가지고 있는 미생물일 수 있다.
형질전환 방법으로는, 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술， 예들 들어， 전기천공법 (electroporation)， 전기주입법 (electroinjection)， 미세주입법 (microinjection) , 인산칼슘공동-침전법 (calci· phosphate co precipitation) , 염화캄슘/염화루비듐법， 레트로바이러스 감염 (retroviral infection) , DEAE-덱스트란 (DEAE_dextran) , 양이온 리포좀(cationic liposome)법, 폴리에틸렌 글리콜 침전법 (polyethylene glycol-mediated uptake) , 유전자총(gene gun) 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이 때 원형의 벡터를 적절한제한효소로 절단하여 선형의 벡터 형태로 도입할수 있다. 단계 (비에서는 상기 재조합 미생물을 배양하여 P(3HP)를 생합성하는 단계로서， 구체적으로， 탄소원으로 글리세롤을포함하는 배지에서 상기 재조합 미생물을 배양하여 P(3HP)만을 생합성하는 것을 특징으로 한다. 이 때 사용되는 배지와 배양조건은 재조합 미생물의 종류에 따라 통상적으로 사용되는 것을 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 배양 시 세포의 생육과 공중합체의 생산에 적합하도록 온도， 배지의 pH 및 배양시간 등의 조건들을 적절하게 조절할 수 있다. 상기 배양 방법의 예에는, 회분식, 연속식 및 유가식 배양이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이 외에， 배양에 사용되는 배지는 특정한 균주와 요구조건을 적절하게 만족시켜야 한다. 상기 배지는 다양한 탄소원， 질소원, 인원 및 미량원소 성분을 포함할 수 있다. 다만， 제 1단계 배양 단계에서는 배지 내 탄소원으로 K3HP)의 생산을 위해 글리세롤을 탄소원으로 포함하고， 글루코오스를 포함하지 않는 것을특징 A로 한다.
배지 내 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물， 육즙， 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소또는무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄， 염화암모늄, 인산암모늄， 탄산암모늄 및 질산암모늄을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다. 배지 내 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨- 함유 염을 예시할 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함하거나， 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기된 원료들은 배양 과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
또한， 필요에 따라， 수산화나트륨， 수산화칼륨， 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한， 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 의제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입할 수 있으며， 배양물의 온도는 보통 20 °C 내지 45°C , 바람직하게는 25°C 내지 40 °C 일 수 있다. 배양은 원하는 고분자의 생산량이 최대로 얻어질 때까지 계속될 수 있다. 또한, 상기 단계 ( 는 제 1단계 배양 이후, IPTG 유도 ( IPTG induct ion)을 통해 락테이트 생성 효소 및 락틸- coA 전환 효소를 발현시킨 후 탄소원으로 글루코오스를 더 포함하여 PLA가 생합성될 수 있도록 하는 것을 특징으로 한다. IPTG 유도 ( IPTG induct ion)는 이소프로필 베타- D-1- 티오갈락토피라노사이드 ( Isopropyl |3 -D-1-thiogalactopyranoside, IPTG, 또는 lacY라고도 함)로 lac 오페론의 전사를 개사하도록 하여 lac 오페론의 통제 하에 있는 유전자의 단백질 발현을 유도하는 것을 의미한다. 바람직하게, IPTG는 O . r내지 l .OmM, 더욱 바람직하게는 0.5mM을 사용하고， 바람직하게는 배양 개시로부터 8내지 24시간 (1일) 후 정도에 유도를수행시킬 수 있다.
이와 같이 IPTG 유도 ( IPTG induct ion)를 통해 락테이트 생성 효소 및 락틸- coA 전환 효소을 발현시킨 후, 탄소원으로 글루코오소를 배양액에 더 투입하는 경우， 대장균이 글루코오스만 선택적으로 세포 내 유입하여 이용하는 탄소 이화대사억제 (Carbon catabol ic repression) 시스템에 의해 글리세롤 이용이 중단되고, 생합성이 중단된 P(3HP) 말단에 PLA가 생합성되어 P(3HP-b- LA) 블록 공중합체가 생산된다. 상기 단계 (c)의 배양 조건은 단계 ( 와 마찬가지로 적절히 조절할 수 있다. 바람직하게， 단계 (b) 및 (c)의 제 1단계 및 제 2단계 배양은 2 내지 7일， 더욱 바람직하게는 약 4일 .동안 수행될 수 있다.
상기 단계 (b) 및 (c)를 통해， 상기 단계 (a)에서 제조된 재조합 미생물은 본 발명께 따른 초기 배양시부터 락테이트를 생합성하는 효소를 암호화하는 유전자 및 락틸- CoA로 전환시키는 효소를 암호화하는 유전자는 발현되지 않고， 글리세롤을 탄소원으로 3 -하이드록시프로피오닐- CoA(3- hydr oxyp r op i ony 1 -CoA ) 생합에 관련한 효소를 암호화하는 유전자 및 PHA 합성효소 유전자가 발현되어 P(3HP)가 제 1단계 배양에서 생합성된다， 이후 탄소원으로 글루코즈를 공급하면 탄소 이화대사억제 시스템 (Carbon catabol ic repression system)에 의해 글리세롤 이용이 중단되어 P(3HP) 생산이 억제되고, 글루코즈와 함께 IPTG를 첨가하면， IPTG 유도 시스템 ( IPTG induct ion system)에 의해 락테이트 생합성 효소를 암호화하는 유전자 및 락틸- CoA로 전환시켜주는 효소를 암호화하는 유전자가 제 2단계의 배양에서 발현되는 것을 특징으로 한다. 따라서， P(3HP) 말단에， PLA가 생합성되어， P(3HP-ZrLA)가 생합성된다.
본 발명에서 제공되는 P(3HP-ZrLA) 블록 공중합체 제조 방법은 재조합 미생물을 배양하는 단계 이후에， 생산된 P(3HP-ZrLA) 블록 공중합체를 배양물로부터 회수 (또는분리 또는 정제)하는 단계를추가로포함할수 있다. 재조합 미생물로부터 생산된 P(3HP-ZrLA) 블록 공중합체는， 당업계에 널리 알려져 있는 방법으로 세포 또는 배양 배지로부터 분리해낼 수 있다. P(3HP-ZrLA) 블록 공중합체의 회수 방법의 예로서， 원심분리， 초음파파쇄， 여과， 이온교환 크로마토그래피， 고성능 액체 크로마토그래피 (high performance l iquid chromatography： HPLC) , 가스 크로마토그래피 (gas chromatography： GC) 등의 방법이 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 상기와 같은 제조방법에 의해 생산된 K3HP- LA) 블록 공중합체는 lOmol% 이상의 락테이트를 포함할수 있다 (상한값은 특별한 한정이 없으나， 약 90몰%이하일 수 있으며， 이에 제한되지 않음) .
【도면의 간단한설명】
도 1은 pCDFJ23 벡터의 제작 방법 및 개열지도를 나타낸 도면이다. 도 2는 pCDF J23 - dhaB123 gdrAB pduP reC_GK 벡터의 제작 방법 및 개열지도를 나타낸 도면이다.
도 3은 PTrcHi sB-/_-GTCT5^의 제작 방법 및 개열지도를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명에 따른 P(3HP-ZrLA) 블록 공중합체의 DSC 분석 결과를 나타낸 그래프이다,
도 5는 P(3HP-r-LA) 랜덤 공중합체의 DSC 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 P(3HP-r-LA) 랜덤 공중합체의 제조를 위한 pBlue-reCST- CPPCT540 벡터의 제작 방법 및 개열지도를 나타낸 도면이다.
【발명을실시하기 위한구체적인 내용】
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 더욱 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐， 실시예에 의하여 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다. 실시예 1. 3 -하이드록시프로피오네이트-락테이트 블록 공중합체 제조용 재조합벡터의 제조
모든 DNA 클로닝 실험들은 표준 방법 (참고문헌: J . Sambrook, E.F. Fr i tsch， T. Mani at i s , Molecular Cloning. A laboratory Manual , 2 nd Ed. Cold Spr ing Harbor Laboratory Press , Cold Spr ing Harbor , New York, 1989.）에 따라수행하였다.
1-1. pCDFJ23-d¾B123-供//·AB-供¾P-reC_GK재조합 벡터의 제조
pCDFduetä-l（Novagen, USA, 3.7此）에는 IPTG에 의해 발현이 유도되는 T7프로모터를두 개 함유하고 있다. 본실험에서는 이를 제거하고 항시적으로 발현되는 프로모터 두 개를 삽입하였다. pCDFduet™-l 의 DNA 절편을 Xbal/Xhol으로 절단하고， 항시적으로 발현되는 J2310 서열번호 19）과 J23108 프로모터（서열번호 20）의 서열을 포함하는 DNA 절편을 Xbal/Xhol 인식부위에 삽입하여 제작하였다. J231（）l과 J 23108 프로모터의 서열을 포함하는 삽입한 DNA 절편（프로모터）의 크기는 328bp （서열 번호 21）이다. J23101과 J23108 프로모터 삽입을 위해, Xbal/Xhol 인식 부위가 첨가된 프라이머 [51 - TACTGMCCGCTCTAGATTTACAGCTAGC-K서열번호 22） 및 5’-
CTTTACCAGACTCGAGTTCGMGACGTCA-3’（서열번호 23）]을 이용하였다. 이러한 PCDFJ23 벡터의 제작방법을도 1에 도시하였다.
한편， Glycerol dehydratase （DhaB） , Glycerol dehydratase reactivase
（GdrAB） , CoA-dependent propionaldehyde （PduP） 유전자를 분리하기 위하여 Klebsiella pneumoniae DSM 2026의 전체 DNA를 추출하고, 프라이머 [5'-cagcca gaattcatgaaaagatcaaaacgatttgca-3’（서열번호 24） 및 5'-ccctct aagctt gatctcccactgaccaaagctggccccg-31（서열번호 25）]를 제작하고， 상기 추출한 전체 DNA를 주형으로 하여 한번에 PCR을 수행한 후, dhaBl, dhaB2, dhaB3, gdrA 유전자에 해당하는 4.7kb 크기의 유전자 절편을 확인하고 이 PCR 결과물인 유전자 절편을 1% 아가로스 겔을 이용하여 분리하였고, Wizard DNA 정제 키트를 이용하여 정제하였다. 정제된 유전자 절편을 EcoRI과
Hindlll으로 제한효소 처리를 한다음， 상기 pCDFJ23벡터 절편과혼합하여 T4 DNA 라이게이즈 （입수처: Takara）를 넣고 4°C에서 반응시켜， EcoRI/Hindi II 인식부위에 삽입함으로써 7此의 pCDFJ23-o¾aB123 -모rfrA 재조합 플라스미드를 제조하였다.
또한， Glycerol dehydratase react ivase （GdrB） 유전자를 분리하기 위하여 Klebsiella pneumoniae DSM 2026의 전체 DNA를 추출하고 , 프라이머 [51 - gagatc aagctt agagggggccgtcatgtcgctttcaccgccaggcgta-3’（서열번호 26） 및 5 ' - gttcga cttaag tcagtttctctcacttaacggcaggac-3’（서열번호 27）］를 제작하고， 상기 추출한 전체 쇼를 주형으로 하여 PCR을 수행하여 증폭한 후， gdrB 유전자에 해당하는 0.3kb 크기의 유전자 절편을 확인하고 이 PCR 결과물인 유전자 절편을 1% 아가로스 겔을 이용하여 분리하였고, Wizard DNA 정제 키트를 이용하여 정제하였다. 정제된 유전자 절편을 Hindl l l과 Af l l l로 제한효소 처리를 한 다음, 상기 PCDFJ23-o½aB123-^rA 재조합 플라스미드 절편과 혼합하여 T4 DNA 라이게이즈 （입수처: Takara）를 넣고 4°C에서 반응시켜， Hindl l l/Af l l l 인식부위에 삽입함으로써 7.3此와 pCDFJ23-c½aB123- gdrm재조합플라스미드를 제조하였다. '
나아가, CoA-dependent propionaldehyde （PduP） 유전자를 분리하기 위하여 Klebsiella pneumoniae DSM 2026의 전체 DNA를 추출하고, 프라이머 ［（5 ' - get age ggtacc t gt t aaaggageat c t gacaat gaat acageagaac t ggaaacc -3 ' （서열번호 28） 및 5 ' - ttaaca catatg 11 agegaat ggaaaaaccgt t ggt -3 ' （서열번호 29））］를 제작하고， 상기 주줄한 전체 DNA를 주형으로 하여 한번에 PCR을 증폭하여， /¾¾戶유전자에 해당하는 1.4kb 크기의 유전자 절편을 확인하고 이 PCR 결과물인 유전자 절편을 1% 아가로스 겔을 이용하여 분리하였고， Wi zard DNA 정제 키트를 이용하여 정제하였다. 정제된 유전자 절편을 Kpnl과 Ndel로 제한효소 처리를 한 다음， 상기 pCDFJ23-i*aB123-^rAB 재조합 플라스미드 절편과 혼합하여 T4 DNA 라이게이즈 （입수처: Takara）를 넣고 4°C에서 반응시켜, 8.7此의 pCWJ23-dhaBm-gdm-pduP 재조합 플라스미드를 제조하였다. 그리고， Cupriavidus necator（Ralstonia eutropha）^\ PHA synthase의 변이체（S506G. A510K） 유전자인 reC_Gm］ 해당하는 유전자 절편을 증폭하기 위해， 프라이머 ［（5’_cgctaa catatg t gt t aaaggageat ctgacat ggcgaccgat aaagge- 3’ （서열번호 30） 및 5 ' -caattg agate t tcatgccttggctttgacgtatcgccc-3 ' （서열번호 31）］를 이용하여 PCR를 수행하여 증폭된 1.8kb의 유전자 절편을 Ndel/Bgl l l 제한효소 처리를 한 다음, 상기
Figure imgf000017_0001
재조합 플라스미드 절편과 혼합하여 T4 DNA 라이게이즈 （입수처: Takara）를 넣고 4°C에서 반응시켜, Ndel/Bgl l l 인식부위에 삽입함으로써 최종적으로 10.5kb의 pCDFJ23-a¾aB123 -伊 ZrAB-;¾¾P-reC_GK 재조합 벡터를 제조하였다. 이러한 pCDFJ23-i*aB123-^rAB-Joi/iP-reC_GK 재조합 벡터의 제조방법 및 개열지도를 도 2에 나타내었다. 1-2. pTrcHisB-/湖) -g 540재조합벡터의 제조
프로피오닐- CoA 트랜스퍼라아제 유전자 )는 클로스트리듐 프로피오니
Figure imgf000018_0001
prop i on i cum) 유래의 프로피오닐- CoA 트랜스퍼라아제 (CP-PCT)의 변이체를사용하였고， 락테이트 디하이드로게네이즈 유전자는 페디오코커스
Figure imgf000018_0002
cais acidi lactici) 유래의 유전자를 사용하였다. 이 때 사용된 벡터는 IPTG induct ion 시스템인 Trc 프로모터를 함유하는 pTr icHi sB ( Invi trogen Co . , USA)이다.
우선, 락테이트 디하이드로게네이즈 유전자를 분리하기 위하여, 페디오코커스 애시딜락티시의 전체 DNA를 추출하고， 프라이메 5 ' -aataaa ccatgg atgaaaattattgcttat-3’ (서열번호 32) 및 5 ' -caagat ctcgag ttaatcaaatttgacctc-31 (서열번호 33)］를 제작하고, 상기 추출한 전체 요를 주형으로 하여, PCR을 수행하였다. 얻어진 PCR 산물을 전기영동하여， 1· 유전자에 해당하는 1此크기의 유전자 절편을 확인하고， 유전자를 수득하였다. 이 PCR 결과물인 유전자 절편을 1% 아가로스 겔을 이용하여 분리하였고， Wizard DNA 정제 키트를 이용하여 정제하였다. 정제된 유전자 절편을 이과 Xhol로로 제한효소 처리를 한 다음， 상기 pTr icHi sB와 혼합하여 T4 DNA 라이게이즈 (입수처: Takara)를 넣고 4°C에서 반응시켜， 5.4kb의 pTrcHisB- ldm 재조합플라스미드를 제조하였다.
이후， 여기에 프로피오닐- CoA 트랜스퍼라아제가 Trc 프로모터의 영향 아래 같이 발현되도록， 오페론 형태의 시스템을 구축하기 위하여 클로스트리듐 프로피오니쿰 C67osir/i// propionicum) 유래의 프로피오닐- CoA 트랜스퍼라아제 (CP-PCT)의 변이체 (CP-PCT Var i ant 540； Val l93Ala 및 침묵돌연변이 T78C, T669C, A1125G, T1158C 포함)사용하였다. CP-PCT 540의 선별방법은 대한민국 특허출원 제 10-2018-002497호에 상세하게 기재되어 있으며， 상기 문헌은 본 발명에 대한 참고문헌으로 포함된다. 이와 같이 선별된 CP-PCT Var i ant 540 (Val l93Ala 및 침묵돌연변이 T78C, T669C, A1125G, 0 2019/177371 1»（：1^1{2019/002909
T1158C 포함)을 프라이머 [5 ' - aactcg agatct t gt t aaaggagcat ct gac atgagaaaggttcccattatt-3’ (서열번호 34) ，및 5 ' - ccatat ggtacc ttaggacttcatttcctt-31 (서열번호 35) ]를 이용하여 PCR를 수행하여 1.5kb의 증폭된 유전자 절편을 수득하였다. 이를 Bgl l l/Kpnl로 제한효소 처리를 한 다음, 상기 pTrcHi sBᅳ /c¾D 재조합 플라스미드와 혼합하여 T4 DNA 라이게이즈 (입수처·· Takara)를 넣고 4°C에서 반응시켜， 6.9kb의 pTrcHi sB-/o¾D_CPPCT 540 재조합 플라스미드를 제조하였다. 이러한 pTrcHi sB-7i¾D-CPPCT 540 재조합 벡터의 제조방법 및 개열지도를 도 3에 나타내었다. 실시예 2. 3 -하이드록시프로피오네이트-락테이트 블록 공중합체 제조용 재조합균주의 제조
2.1. ldhA유전자가넉아웃 (knock-out)된 변이체 제작
Escherichia col i XLl-Blue (Stratagene , USA)를 바탕으로 하여 락테이트가 포함되지 않는 중합체를 생산하기 위하여 대장균의 대사과정 중 락테이트 생산에 관여하는 Escherichia coli XLl-blue 유래 D- 락테이트디하이드로게나제 유전자 ( ldhA； fermentat ive D- lactate dehydrogenase , NAD— dependent [Escherichia coli str . K_12 substr . ] Gene accession number : NC_000913.3, 효소 access ion number : EC_ 1. 1. 1.28)를 genomic DNA에서 knock-out 시켜, ldhA7\ 결실된 대장균 변이체 E. coli XL1- Blue( zl IdM)를 제작하였다. 유전자의 결실은 업계에 잘 알려져 있는 red- recomb iiiat ion 방법을 이용하였다. ldhA를 결실시키기 위해 사용된 올리고머는 서열번호 36 (5 ' - atcagcgtacccgtgatgctaacttctctctggaaggtctgaccggctttaattaaccctcactaaagggcg- 3’) 및 서열번호 37 (5 ' - acaccgat ttt accggt accgat aacgcct gccgt 111 gccat acat agt t aat acgactcactat agggctc
-31 )의 염기서열로 합성하였다.
2.2. 3 -하이드록시프로피오네이트-락테이트 블록 공중합체 제조용 재조합균주 제작
상기 실시예 2. 1에서 제작된 ldhA 걸실 대장균 변이체 E. coli XL1- Blue(zl / )에 실시예 1. 1 및 1.2에서 제작된 재조합 벡터 pCDFJ23-o½aB123- gdrkB pdiP reC_GK 및 pTrcHisB-7o¾D-CPPCT 540을 이용하여， 전기천공법 (electroporat ion)으로 형질전환 시켜 , P(LA_分· 3HP) 블록 공중합체 체조용 재조합 균주를 제작하였다. 실시예 3. IPTG 유도(Induction)를 이용한 3- 하이드록시프로피오네이트-락테이트블록공중합체 제조
상기 실시예 2.2에서 준비된 재조합 균주를 하기와 같이 2 단계 배양하여 3 -하이드록시프로피오네이트-락테이트 블록 공중합체를 수득하였다· 먼저, 제 1단계 배양을 위해， 실시예 2.2에서 준비된 형질전환 재조합 대장균을 100mg/L의 앰피실린， 25mg/L의 스트렙토마이신， 글리세롤 20g/L, Vitamin B12 0.5mM 및 thiamine 10mg/L이 추가로 함유된 100ml MR배지 (배자 1L 당 KH2PO4 6.67g, (NH4)2HP04 4g, MgS04 · 7¾0 0.8g, citric acid 0.8g, 및 trace metal solution 5mL； 여기에서， Trace metal solution은 1L 당 5M HC1 5mL, FeS04 - 7¾0 10g, CaCl2 2g, ZnS04 · 7¾0 2.2g, MnS04 · 4¾0 0.5g, CuS04 - 5H20 lg, (NH4)6Mo702 · 4¾0 O.lg, 및 Na2B402 · 10¾ 0 0.02g 함유)에 접종하여 30°C에서 250 rpm으로 교반하며 배양을 수행하였다.
배양 시작으로부터 1일 경과 후， 배양중인 100ml에 IPTG induction system을 이용하도록 Isopropyl p-D-l-thiogalactopyranoside(IPTG)를 0.5mM이 되도록 첨가하고 10g/L의 글루코오스를 첨가하여 IPTG induct ion이 이루어지도록 하여， LA 생합성 효소 및 LA-CoA로 전환해주는 효소가 발현되도록 하고 글리세롤 이용이 중단되고 P(3HP) 생산이 억제되도록 하여 중단된 P(3HP) 말단에 PLA가 생합성 되도록 하였다. 이후, 상기 유도 (induction) 된 배양액을 추가로 3일간 더 배양 (제 2단계 배양)을 수행하였다. 비교예 1. IPTG. 유도를 이용하지 않는(No induction) 3- 하이드록시프로피오네이트중합체 제조
본 발명에 따른 제조방법과 비교하기 위하여， IPTG induction을 이용하지 않고 1 단계의 배양으로 3 -하아드록시프로피오네이트 중합체를 제조하였다. 구체적으로 별도의 플라스크에 실시예 2.2에서 준비된 형질전환 재조합 대장균을 100mg/L의 엠피실린, 25mg/L의 스트렙토마이신， 글리세롤 20g/L, 맟 Vi tamin B12 0.5mM이 추가로 함유된 100ml ■ 배지 (배지 1L 당 KH2PO4 6.67g, (NH4)2HP04 4g, MgS04 . 7¾0 0.8g, ci tr i c acid 0.8g, 및 trace metal solut ion 5mL； 여기에서, Trace metal solut ion은 1L 당 5M HC1 5mL, FeS04 - 7H20 lOg, CaCl2 2g, ZnS04 · 7¾0 2.2g, MnS04 · 4H20 0.5g, CuS04 · 5¾0 lg, (NH4)6MO702 · 4¾0 O . lg, 및 Na2B402 - 10H2 0 0.02g 함유)에 접종하여 30°C에서 250 rpm으로교반하며 총 4일 배양하였다. 실험예 1. 제조된 중합체의 분자량및 조성 분석
상기 실시예 3.에 따른 IPTG 유도를 거친 배양액 및 비교예 1의 IPTG 유도를 거치지 않은 배양액을 각각 4°C , 4000 rpm에서 10분간 원심분리하여 균체를 회수하고 충분한 양의 증류수로 2회 씻어준 후 80 °C 에서 12시간 건조하였다. 건조된 균체내의 고분자함량 및 조성을 확인하기 위해 GC분석을 수행하였다. 이를 위해 습기가 제거된 균체를 정량한 후 10CTC에서 클로로포름을 용매로 사용하여 황산 촉매 하에서 메탄올과 반응시켜 주었다. 이를 상온에서 클로로포름의 절반에 해당하는 부피의 증류수를 첨가하여 혼합한 후 두 개의 층으로 분리될 째까지 정치시켰다. .두 개의 층 중에서 메틸화된 고분자의 단량체들이 녹아 있는 클로로포름층을 채취하여 가스크로마토그래피 (GC)로 고분자의 성분을 분석하였다. 내부 표준물질로는 벤조에이트 (benzoate)를 사용하였다. 이 때 사용된 GC 조건은 하기의 표 1과 같다 고분자의 분자량을 측정하기 위해 GPC 분석을 수행하였다. 이를 위해 다음과 같이 고분자 추출 및 정제를 하였다. 습기가 제거된 균체를 원통 여과지에 수집 후 속슬렛 추출기 (Soxhl et )를 이용하여 60 °C의 클로로포름 용매에 4시간 이상 추출하였다. 추출 후 용매인 클로로포름은 증발기 (evaporator )를 이용하여 제거하여 필름 타입의 고분자를 얻었다. 이를 정제하기 위해서 필름형 고분자를 5m 1 클로로포름에 녹인 후， 4°C 메탄올 100ml에 소량씩 낙하 (dropping)하여 불순물을 제거하였다. 이렇게 정제된 고분자는 GPC 분석을 통해 분자량을 확인 하였다. 구체적으로， 정제된 고분자를 클로로포름 (Chloroform)에 1~2 mg/mL의 농도로 녹인 투, 0.45 m 시린지 필터 (Syringe Filter)로 여과하여 클로로포름용 GPCCWaters E08BX) 장비를 이용하여 분석하였다. 이동상으로 클로로포름 (Chloroform)을 1 mL/min의 속도로 흘려 주었고， 컬럼 온도는 35°C로 맞추었으며, RI 굴절률 검출기 (Reflective Index Detector)를 이용하여 검출하여, 본 발명의 바이오 폴리머 조성물의 수평균 분자량 (Mn)， 중량평균분자량 (Mw) , 최대피크 (peak) 분자량 (Mp) 및 다분자지수(polydispersity index, PDI)를 각각측정하였다.
【표 11
분석조건
Figure imgf000022_0001
분석에서 얻어진 결과를 하기의 표 2에 나타내었다. 【표 2]
Figure imgf000023_0001
표 2에 나타난 바와 같이， 본 발명에 따른 형질전환 재조합 균주를 이용하고 IPTG induction 을 수행한 경우에는 3 -하이드록시프로피오네이트_ 락테이트의 블록 공중합체가 생성된 것을 확인할 수 있으나， induction을 거치지 않은 경우에는 해 만이 생성되었을 뿐， LA는 거의 생성되지 않은 것을 알수 있었다. 실험예 2. 본 발명에 따른 공중합체의 블록 공중합체 여부 확인
상기와 같이 제조된 중합체가 P(3HP-ZrLA) 블록 공중합체인지 확인하기 위하여 P(3HP-r-LA) 랜덤 공중합체와 함께 시차주사열량계 (DSC Q100, TAInstrument )를사용하여 시험하여 결과를 비교하였다. 비교예로서， 다음과 같은 방법에 의해 P(3HP-r-LA) 랜덤 공중합체를 제조하였다. 우선 비교예를 위한 벡터는 IPTG induction 벡터가 아닌 pBluescript 기반 벡터에 rec_GK와 CPPT-540을 넣고 제작된 pBhie_reC_GK- CPPCT540을사용하였다.
구체적으로, pBlue-reC_GK-CPPCT540의 제조를 위한 PHA 합성효소 유전자는 Cupriavidus necator(Ralstonia eutropha) ] 유래의 PHA 합성효소의 변이체를 (S506G. A510K)를 사용하였다 (reC_GK) . 이 때 사용된 벡터는 pBluescript II (Stratagene Co. , USA)이다.
PHA 합성효소인 ReC_GK 를 발현시키기 위하여， pSYL105 벡터 (Lee et al . , Biotech. Bioeng. , 1994, 44: 1337-1347)에서 Ralstonia eutropha H16 유래의 PHB 생산 오페론이 함유된 DNA 절편을 BamHI/EcoRI으로 절단하여， pBluescript II （Stratagene Co . , USA）의 BamHI/EcoRI 인식부위에 삽입함으로써 pReCAB 재조합 벡터를 제조하였다. pReCAB 벡터는 PHA 합성효소（phaCRE）와 단량체 공급효소（phaA則: 및 phaBRE）7> PHB 오페론 프로모터에 의해 항시적으로 발현된다. pReCAB 벡터의 ReC합성 효소유전자는 BstBI/Sbfl 제한 효소에 의해 완전히 제거하고， 이 위치에 변이체인 ReC_GK 합성 효소 유전자를 삽입하였다. 이 ReC_GK 합성 효소 유전자 절편 증폭을 위해, 프라이머 ［（5'-cgctaa TTCGAA t agt gacggcagagagacaat caaat c atggcgaccggcaaaggc-3 ' （서열번호 38） 및 5'-caattg CCTGCAGG tcatgccttggctttgacgtatcgccc-3' （서열번호 39）］을 이용하여 PCR를 수행하여 증폭된 1.8此의 유전자 절편을 얻었다. 이를 BstBI/Sbfl 제한효소 처리를 한 다음， 상기 플라스미드 절편과 혼합하여 T4 DNA 라이게이즈 （입수처: Takara）를 넣고 4°C에서 반응시켜， BstBI/Sbfl 인식부위에 삽입함으로써 pBlue-reC_GK재조합 벡터를 제조하였다.
여기에 프로피오닐- CoA 트랜스퍼라아제가 같이 발현되는 오페론 형태의 항시적 발현되는 시스템을 :구죽하기 위하아 줄·로스트리듐 프로피오니쿰（Clostridi· propionicum） 유래의 프로피오닐- CoA 트랜스퍼라아제 변이체（CPPCT540）를 사용하였다. CPPCT540 유전자 절편을 증폭하기위해, 프라이꺼 ［5'- c aat t gCCTGCAGGcggat aacaat 11 cacacaggaaacagaat t cat gagaaaggt tcccat tatt-3'
（서열번호 40） , 5'- ccatat catatg ttaggacttcatttcctt-31（서열번호 41）］를 이용하여 PCR하여 얻어진 1.5kb 단편을 사용하였다. 이 PCR절편을 Sbfl/Ndel 제한효소 처리를 한 다음， 상기 PBlue-reC_GK 재조합 플라스미드 절편과 혼합하여 T4 DNA라이게이즈를 넣고 4°C에서 반응시켜， Sbfl/Ndel 인식부위에 삽입함으로써 pBlue-reC_GK-CPPCT540 재조합 벡터를 제조하였다. 이러한 pBlue-reC_GK-CPPCT540 재조합 벡터의 제조방법 및 개열지도를 도 6에 나타내었다.
고분자 생성 미생물은 ldhA가 제거되지 않은 E.coli XL 1-Blue 야생형 균주를 사용하여 배양시 락테이트 모노머가 공급될 수 있게 하였다. 배양에 사용된 탄소원은 글루코오스를 이용하였으며， 3HPC3 - 하이드록시프로피오네이트) 모노머를 0.5g/L로 첨가해 주어 P(3HP-r-LA) 랜덤 공중합체를 생합성 하였다. ■ 배지 및 배양시간 온도는 실시.예 3에 기재된 블록고분자합성과동일한조건으로 진행하였다. 실시예 3에서 제조된 본 발명에 따른 공중합체와 상기와 같이 제조된 랜덤 공중합체를 시차주사열량계 (DSC Q100, TA Instrument)를 사용하여 시험하여 승온속도를 10 °C/min로 하여 -40°C에서 220°C까지 승온시켜 측정하였다.
그 결과를 하기 도 4 및 5에 나타내었다. 도 4 및 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 P(3HP-ZrLA) 블록 공중합체는 P(3HP)와 PLA의 유리전이온도 (Tg) 및 용융온도 (Tm)이 모두 특정되는데 반해， 비교예의 P(3HP- r-LA) 랜덤 공중합체의 경우 Tg는 P(3HP)와 PLA의 중간위치에서 확인되었으며, Tm은 측정되지 않았다. 따라서， 본 발명에 따라 제조된 공중합체는 P(3HP-/r LA) 블록공중합체임을 명확하게 확인할수 있었다.

Claims

2019/177371 1»（：1^1{2019/002909 【청구범위】
【청구항 1]
(a) 락트산을 생합성하지 못하도록 개량된 재조합 미생물을 3- 하이드록시프로피오닐- 0 (3 -느山：(«71)1 (¾^01171-0企) 생합성 유전자 및 폴리하이드록시알카노에트 (1>0171 (110\7311¾]10 6 :1¾\) 합성효소 유전자를 포함하는 벡터, 및 락테이트 생합성 유전자 및 락테이트 ( 13 6)를 락틸_ (：0사13 _(：0/0로 전환하는 효소의 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환시켜 재조합 미생물을 제조하는 단계 ;
( 상기 단계 (3)에서 제조된 재조합 미생물을 글리세롤을 탄소원으로 사용하여 배양하여 해미를 합성하는 단계 ;
(0) 1 및 글루코오스를 투입하여 3卵) 생산을 억제하고， 락테이트 생합성 효소 및 락테이트를 락틸-코에이 ( 18 ：71-(：0시 전환 효소가 발현되도록 하여 단계 (3)에서 합성된 3敗) 말단에
Figure imgf000026_0001
생합성 시키는 단계;
를 포함하는 3 -하이드록시프로피오네이트-락테이트 블록 공중합체 [ 3卵- 1 ) ]의 제조방법.
【청구항 2]
제 1항에 있어서, 상기 락트산을 생합성하지 못하는 재조합 미생물은 락테이트 탈수소효소쇼 암호화유전자 ( / )가 불활성화된 것인， 제조방법.
【청구항 3】
제 1항에 있어서, 상기 3 -하이드록시프로피오닐- 0 (3 -
1¾년1'¥( 1)1'01八01171-(]0/1) 생합성 유전자는 글리세롤 디하이드라테이즈, 글리세롤 디하이드라테이즈 액티베이즈, 어 의존 프로피온알데히드 디하이드로게네이즈 및 알데히드 디하이드로게네이즈를 암호화하는 유전자인 것인， 제조방법.
【청구항 4】
제 1항에 있어서， 상기 유전자는
Figure imgf000026_0002
합성효소 변이체의 암호화 유전자 / 將인， 제조방법 .
【청구항 5]
제 1항에 있어서， 상기 락테이트 생합성 유전자는 페디오코쿠스 2019/177371 1»（：1^1{2019/002909
애시딜락티시（/¾（//00¾：0/5 3（：/（九 73 /（：/）로부터 유래한 락테이트 탈수소효소此此）를 암호화하는유전자인 것인， 제조방법.
【청구항 6］
제 1항에 있어서, 상기 락테이트（13 6）를 락틸-（：0 13 -（：0시로 전환하는 효소는 클로스트리디움 프로피오니쿰（6705（// 1）1'0 0111<:·）6시 유래한 것인’ 제조방법.
【청구항 7】
제 1항에 있어서, 상기 미생물은 대장균인 것인, 제조방법.
【청구항 8】
제 1항에 있어서， 상기 단계 （ 에서 0.1 내지 1.0 의 117（；를 투입하는 것인， 제조방법.
【청구항 9】
락트산을 생합성하지 못하도록 개량된 재조합 미생물에 3 - 하이드록시프로피오닐- 0 （3 - 1¾년1"（ 71）1'（ 101171-（ ¾） 생합성 유전자 및 폴리하이드록시알카노에트（1301 ；八11'0：> 11¾110 6:? ） 합성효소 유전자를 포함하는 벡터, 및 락테이트 생합성 유전자 및 락테이트（ 를 락틸_ （30쇼（13 71-00쇼）로 전환하는 효소의 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된, 재조합미생물.
【청구항 10】
락테이트와 3 -하이드록시프로피오네이트를 반복단위로 함유하는 3 - 하이드록시프로피오네이트-락테이트블록공중합체 （3卵 -/ ）］ .
【청구항 11】
제 10항에 있어서， 상기 3 -하이드록시프로피오네이트-락테이트 블록 공중합체 ^（3^- 1 ）］는 락테이트 모노머 함량이 10몰% 이상인 것인， 3- 하이드록시프로피오네이트-락테이트블록 공중합체.
【청구항 12】
제 9항에 따른 재조합미생물을포함하는, 3 -하이드록시프로피오네이트_ 락테이트블록 공중합체 제조용조성물.
PCT/KR2019/002909 2018-03-15 2019-03-13 미생물을 이용한 폴리(3-하이드록시프로피오네이트-b-락테이트) 블록공중합체 WO2019177371A1 (ko)

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