CN111194353A - 使用微生物的聚(3-羟基丙酸酯-b-乳酸酯)嵌段共聚物 - Google Patents

使用微生物的聚(3-羟基丙酸酯-b-乳酸酯)嵌段共聚物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种新型3‑羟基丙酸酯‑乳酸酯嵌段共聚物[P(3HP‑b‑LA)]，以及它的制备方法，更具体地，提供了一种3‑羟基丙酸酯‑乳酸酯嵌段共聚物的制备方法，以及由此制备的3‑羟基丙酸酯‑乳酸酯嵌段共聚物，所述制备方法包括：第一培养步骤，在该第一培养步骤中，利用经改良以便不能生物合成乳酸的重组大肠杆菌，通过以甘油作为碳源并且通过3‑羟基丙酸酯生成基因和增强PHA合酶，在培养的早期阶段生物合成P(3HP)；第二培养步骤，在该第二培养步骤中，通过利用当甘油和葡萄糖被一起供应作为碳源时用于选择性地仅将葡萄糖引入到大肠杆菌中的碳分解代谢抑制系统，来抑制P(3HP)生成，并且，在该第二培养步骤中，通过IPTG诱导系统实现乳酸酯合酶和乳酰辅酶A转化酶的表达，来将聚乳酸酯生物合成到中断的P(3HP)末端。

Description

使用微生物的聚(3-羟基丙酸酯-B-乳酸酯)嵌段共聚物
技术领域
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年03月15日在韩国知识产权局提交的韩国专利申请No.10-2018-0030522的优先权或权益，该专利申请的全部公开内容通过引用并入本说明书中。
本发明涉及一种聚(3-羟基丙酸酯-b-乳酸酯)嵌段共聚物的制备方法，更具体地，涉及一种使用重组微生物制备聚(3-羟基丙酸酯-b-乳酸酯)嵌段共聚物的方法。
背景技术
聚乳酸酯(PLA)是一种代表性的以乳酸酯作为单体的可生物降解的聚合物，是一种对通用聚合物或医学聚合物具有高适用性的聚合物。目前，由微生物发酵产生的乳酸酯的聚合来生产PLA，但是乳酸酯的直接聚合仅产生具有低分子量(1000道尔顿至5000道尔顿)的PLA。为了合成具有至少100,000道尔顿的PLA，有一种使用链偶联剂由乳酸酯的直接聚合得到的具有低分子量的PLA来聚合得到具有较高分子量的PLA的方法。然而，由于该方法使用链偶联剂，因此，制备具有高分子量的PLA的方法会由于加入有机溶剂或链偶联剂而变得复杂，并且会难以除去该有机溶剂或链偶联剂。目前，在生产具有高分子量的PLA的商业化方法中，已经使用将乳酸酯转化为丙交酯，然后通过丙交酯环的开环缩合反应合成PLA的化学合成方法。
然而，这种PLA的脆性差，因此，为了改善该脆性，据报道，通过加入具有好的伸长性的3-羟基丙酸酯(3HP)来开发聚(3-羟基丙酸酯-r-乳酸酯)(P(3HP-r-LA))无规共聚物。然而，这种聚(3-羟基丙酸酯-r-乳酸酯)具有不结晶从而具有差的物理性能的问题。
因此，为了改善常规聚乳酸酯和P(3HP-r-LA)无规共聚物的问题，本发明人已经通过培养经改良以便不能生物合成乳酸并且用PHA合酶基因转化的重组大肠杆菌，由PLA和P(3HP)生物合成嵌段共聚物[聚(3-羟基丙酸酯-b-乳酸酯)]。另外，可以确认，这种嵌段共聚物显著改善了常规聚乳酸酯和P(3HP-r-LA)无规共聚物中存在的诸如脆性的问题，从而完成了本发明。
[现有技术文献]
[专利文献]
(专利文献1)韩国专利No.10-0957773(2010.05.06)
[非专利文献]
(非专利文献1)Park，S.J.，et al.，Metabolic engineering of Ralstoniaeutropha for the biosynthesis of 2-hydroxyacid-containingpolyhydroxyalkanoate，Metab.Eng.20，20-28(2013)
发明内容
技术问题
本发明的一个目的是提供一种重组微生物，该重组微生物通过用包含3-羟基丙酰辅酶A生物合成基因和聚羟基脂肪酸酯(PHA)合成酶基因的载体与包含乳酸酯生物合成基因和将乳酸酯转化为乳酰辅酶A(lactyl-CoA)的酶的基因的载体转化经改良以便不能生物合成乳酸的重组微生物的方法来制备。
本发明的另一目的是提供一种通过对所述重组微生物进行两步培养来制备聚(3-羟基丙酸酯-b-乳酸酯)嵌段共聚物的方法。
本发明的另一目的是提供一种包含所述重组微生物的用于制备聚(3-羟基丙酸酯-b-乳酸酯)嵌段共聚物的组合物。
本发明的又一目的是提供一种根据上述制备方法制备的聚(3-羟基丙酸酯-b-乳酸酯)嵌段共聚物。
技术方案
在下文中，将更详细地描述本发明。
为了实现上述目的，本发明的一个方面提供了一种包括以下步骤的制备3-羟基丙酸酯-乳酸酯嵌段共聚物[P(3HP-b-LA)]的方法，以及通过所述制备方法制备的3-羟基丙酸酯-乳酸酯嵌段共聚物：
(a)通过用包含3-羟基丙酰辅酶A生物合成基因和聚羟基脂肪酸酯(PHA)合成酶基因的载体与包含乳酸酯生物合成基因和将乳酸酯转化为乳酰辅酶A(lactyl-CoA)的酶的基因的载体转化经改良以便不能生物合成乳酸的重组微生物来制备重组微生物的步骤；
(b)通过使用甘油作为碳源培养在步骤(a)中制备的重组微生物来合成P(3HP)的步骤；和
(c)通过加入IPTG和葡萄糖来抑制P(3HP)生成，并且通过实现乳酸酯合酶和将乳酸酯转化为乳酰辅酶A(lactyl-CoA)的酶的表达来在步骤(a)中合成的P(3HP)的末端生物合成PLA的步骤。
在下文中，将详细描述各个步骤。
在步骤(a)中，首先，为了制备P(3HP-b-LA)嵌段共聚物，用包含3-羟基丙酰辅酶A和聚羟基脂肪酸酯(PHA)合成酶的基因的载体与包含乳酸酯生物合成基因和将乳酸酯转化为乳酰辅酶A(lactyl-CoA)的酶的基因的载体转化经改良以便不能生物合成乳酸的重组微生物，从而制备重组微生物。
所述经改良以便不能生物合成乳酸的重组微生物可以进行敲除，使得重组微生物固有的乳酸脱氢酶(Ldh)，例如，乳酸脱氢酶A(LdhA)被灭活。
包含编码3-羟基丙酰辅酶A生物合成相关的酶和PHA合成酶的基因的载体与包含乳酸酯生物合成基因相关的酶的基因和将乳酸酯转化为乳酰辅酶A(lactyl-CoA)的酶的基因的载体可以通过常规的用于制备基因重组载体的方法来制备，并且可以通过用于制备转化微生物的已知方法(例如，电穿孔等)导入到微生物细胞中。
编码3-羟基丙酰辅酶A生物合成相关的酶的基因可以优选是编码甘油脱水酶(由DhaB1(SEQ ID NO：1)、DhaB2(SEQ ID NO：3)和DhaB3(SEQ ID NO：5)的子单位构成)；甘油脱水酶活化酶(由GdrA(SEQ ID NO：7)和GdrB(SEQ ID NO：9)的子单位构成)；辅酶A依赖性丙醛脱氢酶和醛脱氢酶的基因。优选地，编码甘油脱水酶(登录号：EC 4.2.1.30)的基因可以是dhaB123(dhaB1(SEQ ID NO：2)、dhaB2(SEQ ID NO：4)、dhaB3(SEQ ID NO：6)；甘油脱水酶活化酶(登录号：EC 4.2.1.30)可以是gdrAB(由gdrA(SEQ ID NO：8)和gdrB(SEQ ID NO：10)的子单位构成)；编码辅酶A依赖性丙醛脱氢酶(登录号：EC 1.2.1.3；SEQ ID NO：11)的基因可以是pduP(SEQ ID NO：12)。
聚羟基脂肪酸酯(PHA)合酶是一种使用辅酶A和羟基脂肪酸硫酯作为底物生物合成聚羟基脂肪酸酯的酶，并且可以是使用具有3至5个碳原子的脂肪酸的酶的类型(例如，来自各种细菌，如钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)、产碱杆菌(Alcaligenes latus))，和使用具有6至14个碳原子的脂肪酸的酶的类型(例如，来自假单胞菌属(Pseudomonassp.))。
例如，所述PHA合酶及其编码基因可以是来自钩虫贪铜菌(真氧产碱杆菌H16)的PHA合酶ReC的S506G和A510K氨基酸取代变体的变体编码基因(SEQ ID NO：13；登录号：EC2.3.1.B2，基因reC；基因库登录号J05003.1，SEQ ID NO：14)，以及编码它的基因(reC_GK)。
乳酸酯生物合成酶是由葡萄糖生物合成乳酸酯的酶，并且其实例可以是来自乳酸片球菌的编码乳酸脱氢酶(Ldh)，例如，乳酸脱氢酶A(LdhA)或乳酸脱氢酶D(LdhD)(登录号：EC 1.1.1.28(SEQ ID NO：15)的基因(ldhA、ldhD(996bp，基因登录号：X70925.1，SEQ IDNO：16))。
当将乳酸酯转化为乳酰辅酶A时，所述酶可以是，例如，丙酰辅酶A转移酶(pct)。丙酰辅酶A转移酶是一种催化以下化学反应的酶：
化学方案1：
[化学方案1]
Figure BPA0000285961570000041
所述酶和编码该酶的基因可以来自丙酸梭菌(Clostridium propionicum)。
例如，所述丙酰辅酶A转移酶编码基因可以包含选自以下中的碱基序列：
(a)碱基序列SEQ ID NO：17；
(b)在碱基序列SEQ ID NO：17中包含A1200G突变(是指第1200个碱基A被G取代的突变；该术语也适用于后面描述的碱基序列突变的表述)的碱基序列。
(c)在碱基序列SEQ ID NO：17中包含T78C、T669C、A1125G和T1158C突变的碱基序列；
(d)编码在碱基序列SEQ ID NO：17中包含A1200G突变并且在对应于SEQ ID NO：17的氨基酸序列中包含G335A突变(是指第355个氨基酸Gly被Ala取代的突变；该术语也适用于后面描述的氨基酸序列突变的表述)的氨基酸序列的碱基序列；
(e)编码在碱基序列SEQ ID NO：17中包含A1200G突变并且在对应于SEQ ID NO：17的氨基酸序列中包含A243T突变的氨基酸序列的碱基序列；
(f)编码在碱基序列SEQ ID NO：17中包含T669C、A1125G和T1158C突变并且在对应于SEQ ID NO：17的氨基酸序列中包含D65G突变的氨基酸序列的碱基序列；
(g)编码在碱基序列SEQ ID NO：17中包含A1200G突变并且在对应于SEQ ID NO：17的氨基酸序列中包含D257N突变的氨基酸序列的碱基序列；
(h)编码在碱基序列SEQ ID NO：17中包含T669C、A1125G和T1158C突变并且在对应于SEQ ID NO：17的氨基酸序列中包含D65N突变的氨基酸序列的碱基序列；
(i)编码在碱基序列SEQ ID NO：17中包含T669C、A1125G和T1158C突变并且在对应于SEQ ID NO：17的氨基酸序列中包含T119I突变的氨基酸序列的碱基序列；和
(j)编码在碱基序列SEQ ID NO：17中包含T78C、T669C、A1125G和T1158C突变并且在对应于SEQ ID NO：17的氨基酸序列中包含V193A突变的氨基酸序列的碱基序列。
丙酰辅酶A转移酶可以包含由所述碱基序列编码的氨基酸序列。
优选地，所述基因可以是cppct540，其包含编码在碱基序列SEQ ID NO：17中包含T78C、T669C、A1125G和T1158C突变并且在对应于SEQ ID NO：17的氨基酸序列中包含V193A突变的氨基酸序列的碱基序列。
所述酶可以在不改变分子整体活性的范围内包含另外的突变。例如，本领域已知，不改变分子整体活性的蛋白质和肽中的氨基酸交换。例如，常见的交换包括，但是不限于，氨基酸残基Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu或Asp/Gly之间的交换。在一些情况下，可以通过磷酸化、硫酸化、丙烯酰化、糖基化、甲基化、法尼基化等来对蛋白质进行修饰。另外，它可以包含酶蛋白质，其由于氨基酸序列上的突变或修饰而具有提高的蛋白质对热、pH等的结构上的稳定性或者提高的蛋白质活性。
另外，编码酶的基因可以包含核酸分子，该核酸分子包含功能上等同的密码子，或编码相同氨基酸的密码子(通过密码子的简并)，或编码生物学上等同的氨基酸的密码子。核酸分子可以使用标准分子生物学技术例如化学合成方法或重组方法来分离或制备，或者可以使用市售的核酸分子。
“载体”是指基因构建体，其包含可操作地连接以在个体细胞中表达编码靶蛋白的基因插入体的必需调节成分，并且是用于将编码靶蛋白的核酸序列导入到宿主细胞中的工具。所述载体可以是选自包括以下各种类型的载体中的至少一种：病毒载体，例如质粒、腺病毒载体、逆转录病毒载体和腺相关病毒载体；噬菌体载体；粘粒载体和YAC(酵母人工染色体)载体。在一个实例中，质粒载体可以是选自pBlue(例如，pBluescript II KS(+))、pSC101、pGV1106、pACYC177、ColE1、pKT230、pME290、pBR322、pUC8/9、pUC6、pBD9、pHC79、pIJ61、pLAFR1、pHV14、pGEX系列、pET系列、pUC19等中的至少一种；噬菌体载体可以是选自λgt4λB、λ-Charon、λΔz1、M13等中的至少一种；病毒载体可以是SV40等，但是本发明不限于此。
术语“重组载体”包括含有外源靶基因的克隆载体和表达载体。克隆载体是复制子，其包含复制起点，例如质粒、噬菌体或粘粒的复制起点，另一DNA片段可以连接至复制起点以产生连接片段的复制。已经开发了表达载体以便用于合成蛋白质。
在本说明书中，对载体没有特别限制，只要其可以在各种宿主细胞例如原核细胞或真核细胞中表达期望的酶的基因并且起到制备基因的功能即可。然而，理想的是，插入并转移到载体中的基因不可逆地融合到宿主细胞的基因组中从而使细胞中的基因表达稳定地保持较长时间。
这种载体包含允许靶基因在选择的宿主内表达的转录和翻译的表达控制序列。表达控制序列可以包含用于进行转录的启动子、用于控制这种转录的任何操纵子序列、用于编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列，和用于控制转录和翻译的终止的序列。例如，适合于原核生物的控制序列包含启动子、任何操纵子序列，和/或核糖体结合位点。适用于真核细胞的控制序列包含启动子、终止子，和/或聚腺苷酸化信号。起始密码子和终止密码子通常被认为是编码靶蛋白的核苷酸序列的一部分，并且需要当施用基因构建体时在受试者中具有作用并且与编码序列在框架内。载体的启动子可以是组成型或诱导型。此外，在载体是可复制表达载体的情况下，载体可以包含复制起点。另外，可以适当包含增强子、目的基因的5′和3′末端的非翻译区、选择性标记(例如，抗生素抗性标记)或可复制的单元。载体可以自我复制或整合到宿主基因组DNA中。
可用的表达控制序列的实例可以包括腺病毒的早期和晚期启动子、猴病毒40(SV40)启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒(HIV)例如HIV的长末端重复(LTR)的启动子、莫洛尼病毒、巨细胞病毒(CMV)启动子、EB病毒(EBV)启动子和劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、RNA聚合酶II启动子、β-肌动蛋白启动子、人珠蛋白(humanheroglobin)启动子和人肌肉肌酸启动子、lac系统、trp系统、TAC或TRC系统、T3和T7启动子、噬菌体λ的主要操纵子和启动子位点、fd外壳蛋白的调节位点、磷酸甘油酸激酶(PGK)或其它乙二醇降解酶的启动子、磷酸酶启动子例如酵母酸性磷酸酶启动子如Pho5、酵母α-交配因子的启动子，和其它已知可调节原核或真核细胞和它们的病毒及其组合的基因表达的序列。
为了提高细胞中转化基因的表达水平，靶基因与转录和翻译表达控制序列应该可操作地彼此连接。通常，术语“可操作地连接”是指连接的DNA序列是连续的，并且，在分泌前导的情况下，是连续的并且存在于读码框架中。例如，当表达为参与蛋白质分泌的前蛋白时，用于前序列或分泌前导的DNA可操作地连接至编码多肽的DNA；当影响序列的转录时，启动子或增强子可操作地连接至编码序列；或者，当影响序列的转录时，核糖体结合位点可操作地连接至编码序列，或当配置以便于翻译时，核糖体结合位点可操作地连接至编码序列。这些序列之间的连接通过在方便的限制酶位点处的连接体来进行。然而，当所述位点不存在时，可以根据常规方法使用合成的寡核苷酸衔接子或连接体来进行连接。
考虑到宿主细胞的性质、载体的拷贝数、调节拷贝数的能力和由相应载体编码的其它蛋白质的表达(例如，抗生素标记的表达)，本领域技术人员可以从适合本发明的各种载体、表达控制序列、宿主等中适当进行选择。
本说明书中提供的重组微生物可以通过使用上述重组载体转化宿主微生物细胞来得到。
如本说明书中所使用的，术语“转化”是指将靶基因导入到宿主微生物中，从而靶基因可以以染色体外部的因子或者通过全部染色体的完成来复制。
可以用作宿主微生物的微生物可以选自原核细胞和真核细胞。通常，具有高DNA导入效率和导入的DNA的高表达效率的微生物可以用作宿主微生物。宿主微生物的具体实例包括已知的原核和真核宿主，例如埃希氏菌属(Escherichia sp.)，包括大肠杆菌(例如，大肠杆菌DH5a、大肠杆菌JM101、大肠杆菌K12、大肠杆菌W3110、大肠杆菌X1776、大肠杆菌B和大肠杆菌XL1-Blue)；假单胞菌属(Pseudomonas sp.)；杆状菌属(Bacilus sp.)；链霉菌属(Streptomyces sp.)；欧文氏菌属(Erwinia sp.)；沙雷氏菌属(Serratia sp.)；普罗维登斯菌属(Providencia sp.)；棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)；钩端螺旋体属(Leptospira sp.)；沙门氏菌属(Salmonella sp.)；短杆菌属(Brevibacterium sp.)；生丝单胞菌属(Hypomonas sp.)；色杆菌属(Chromobacterium sp.)；诺卡氏菌属(Nocadiasp.)；真菌或酵母，但是不限于此。一旦转化到合适的宿主中，载体就可以独立于宿主基因组来复制和作用，或者在某些情况下可以整合到基因组本身中。
另外，对于本发明的目的，所述宿主细胞可以是具有从碳源生物合成羟酰辅酶A的路径的微生物。
作为转化方法，可以使用本领域已知的合适的标准技术，例如电穿孔、电注射、微注射、磷酸钙共沉淀、氯化钙/氯化铷方法、逆转录病毒感染、DEAE-葡聚糖、阳离子脂质体方法、聚乙二醇介导摄取、基因枪等，但是不限于此。此时，所述载体可以通过用合适的限制酶酶切环状载体以线性化的载体的形式来导入。
步骤(b)是通过培养重组微生物来合成P(3HP)的步骤。具体地，其特征在于，将重组微生物在包含甘油作为碳源的培养基中培养以仅生物合成P(3HP)。此时使用的培养基和培养条件可以根据重组微生物的种类从常规使用的培养基和培养条件来适当选择。在培养时，可以适当地调节诸如温度、培养基的pH和培养时间等条件，以便使其与细胞的生长和共聚物的制备相匹配。培养方法的实例包括，但是不限于，间歇模式、连续模式和流加模式。
另外，用于培养的培养基必须充分满足用于培养特定菌株的要求。培养基可以包含各种碳源、氮源、磷源和微量元素组分。然而，第一步培养的特征在于，在培养基中包含甘油作为碳源而不包含葡萄糖作为碳源来制备P(3HP)。
培养基中的氮源可以包括，但是不限于，蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、玉米浆液、大豆粉和尿素，或无机化合物，例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。氮源也可以单独使用或作为混合物使用。培养基中的磷源可以包括，但是不限于，磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐。此外，培养基可以包含，但是不限于，生长必需的金属盐，例如硫酸镁或硫酸铁，或生长必需物质，例如氨基酸和维生素。在培养过程中，可以通过分批培养或连续培养以适当的方式将上述物质加入到培养基中。
另外，根据需要，培养基的pH可以以适当的方式使用碱性化合物如氢氧化钠、氢氧化钾和氨，或酸性化合物如磷酸和硫酸来调节。此外，可以使用消泡剂例如脂肪酸聚乙二醇酯来防止气泡的产生。为了维持有氧条件，将氧气或含氧气体(例如，空气)注入到培养基中。培养基的温度通常可以在20℃至45℃的范围内，优选在25℃至40℃的范围内。可以继续培养直到聚合物产量达到其最大水平。
此外，步骤(c)的特征在于，在第一步培养后，通过IPTG诱导表达乳酸酯生成酶和乳酰辅酶A转化酶，然后可以通过还包含葡萄糖作为碳源来生物合成PLA。IPTG诱导是指异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(也称为IPTG或lacY)触发lac操纵子的转录，从而诱导在lac操纵子控制下的基因的蛋白质表达。优选地，IPTG以0.1mM至1.0mM，更优选以0.5mM的量使用，并且诱导可以优选在培养开始之后约8小时至24小时(1天)进行。
以此方式，当通过IPTG诱导表达乳酸酯生成酶和乳酰辅酶A转化酶，然后将葡萄糖作为碳源进一步加入到培养液中时，甘油的使用被其中大肠杆菌选择性地仅将葡萄糖引入到细胞中的碳分解代谢抑制系统中断，并且在生物合成中断的P(3HP)末端生物合成PLA，从而制备P(3HP-b-LA)嵌段共聚物。步骤(c)中的培养条件可以类似于步骤(b)来适当地调节。优选地，步骤(b)和步骤(c)的第一步和第二步培养可以进行2天至7天，更优选地进行约4天。
根据本发明，通过步骤(b)和步骤(c)，在步骤(a)中制备的重组微生物不从初始培养开始表达编码乳酸酯生物合成酶的基因和编码乳酰辅酶A转化酶的基因，而是通过使用甘油作为碳源和P(3HP)合酶基因表达编码与3-羟基丙酰辅酶A生物合成相关的酶的基因和PHA合酶基因，从而在第一步培养中生物合成P(3HP)。随后，当提供葡萄糖作为碳源时，甘油的使用被碳分解代谢抑制系统中断，从而抑制P(3HP)的产生。当IPTG与葡萄糖一起加入时，在第二步培养中通过IPTG诱导系统表达编码乳酸酯生物合成酶的基因和编码乳酰辅酶A转化酶的基因。因此，在P(3HP)末端生物合成PLA，从而生物合成P(3HP-b-LA)。
本发明提供的P(3HP-b-LA)嵌段共聚物的制备方法在培养重组微生物之后，还可以包括从所述培养物收集(或分离或纯化)生成的P(3HP-b-LA)嵌段共聚物。
由重组微生物生成的P(3HP-b-LA)嵌段共聚物可以通过本领域众所周知的方法从细胞或培养物中分离。回收P(3HP-b-LA)嵌段共聚物的方法的实例包括诸如离心、超声破碎、过滤、离子交换色谱、高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)等方法，但是不限于此。
通过上述制备方法制备的P(3HP-b-LA)嵌段共聚物可以包含10摩尔％以上的乳酸酯(对上限没有特别限制，但是可以为约90摩尔％以下，但是不限于此)。
附图说明
图1是示出pCDFJ23载体的制备方法和切割图的图；
图2是示出pCDFJ23-dhaB123-gdrAB-pduP-reC_GK的制备方法和切割图的图；
图3是示出pTrcHisB-ldhD-CPPCT540的制备方法和切割图的图；
图4是示出根据本发明的P(3HP-b-LA)嵌段共聚物的DSC分析结果的图；
图5是示出P(3HP-r-LA)无规共聚物的DSC分析结果的图；
图6是示出用于制备P(3HP-r-LA)无规共聚物的pBlue-reC_GK-CPPCT540载体的制备方法和切割图的图。
具体实施方式
在下文中，将更详细地描述本发明的优选实施方案以帮助理解本发明。然而，给出这些实施例仅用于示意性目的，而不旨在限制本发明的范围。
实施例1.用于制备3-羟基丙酸酯-乳酸酯嵌段共聚物的重组载体的制备
所有DNA克隆实验均根据标准方法(参见J.Sambrook，E.F.Fritsch，T.Maniatis，Molecular Cloning.A laboratory Manual，2nd ED.Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，纽约，1989)进行。
1-1.pCDFJ23-dhaB123-gdrAB-pduP-reC GK重组载体的制备
pCDFduetTM-1(Novagen，USA，3.7kb)包含两个T7启动子，它们的表达由IPTG诱导。在该实验中，将其删除并且插入两个恒定表达的启动子。用XbaI/XhoI酶切pCDFduetTM-1的DNA片段，并且将包含恒定表达的J23101(SEQ ID NO：19)和J23108启动子(SEQ ID NO：20)的序列的DNA片段插入到XbaI/XhoI识别位点中。包含J23101和J23108启动子的序列的插入的DNA片段(启动子)的大小为328bp(SEQ ID NO：21)。为了插入J23101和J23108启动子，使用具有XbaI/XhoI识别位点的引物[5′-TACTGAACCGCTCTAGATTTACAGCTAGC-3′(SEQ ID NO：22)和5′-CTTTACCAGACTCGAGTTCGAAGACGTCA-3′(SEQ ID NO：23)]。pCDFJ23载体的制备方法示于图1中。
同时，为了分离甘油脱水酶(DhaB)、甘油脱水酶活化酶(GdrAB)和辅酶A依赖性丙醛(PduP)基因，提取肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)DSM2026的总DNA，制备引物[5′-cagcca gaattcatgaaaagatcaaa-3′(SEQ ID NO：24)和5′-ccctct aagcttgatctcccactgaccaaagctggccccg-3′(SEQ ID NO：25)]。使用提取的总DNA作为模板一次性进行PCR，然后识别对应于dhaB1、dhaB2、dhaB3和gdrA基因的4.7kb基因片段。使用1％琼脂糖胶凝胶分离由PCR形成的基因片段，并且使用Wizard DNA纯化试剂盒进行纯化。将纯化的基因片段用限制酶EcoRI和HindIII处理，然后与pCDFJ23载体片段混合，向其中加入T4DNA连接酶(可购自Takara)，使其在4℃下反应，并且插入到EcoRI/HindIII识别位点中。由此，制备7kb的pCDFJ23-dhaB123-gdrA重组质粒。
此外，为了分离甘油脱水酶活化酶(GdrB)基因，提取肺炎克雷伯氏菌DSM2026的总DNA，并且制备引物[5′-gagatc aagctt agagggggccgtcatgtcgctttcaccgccaggcgta-3′(SEQ ID NO：26)和5′-gttcga cttaag tcagtttctctcacttaacggcaggac-3′(SEQ ID NO：27)]。使用提取的总DNA作为模板进行PCR，然后识别出对应于gdrB基因的0.3kb基因片段。使用1％琼脂糖胶凝胶分离由PCR形成的基因片段，并且使用Wizard DNA纯化试剂盒进行纯化。纯化的基因片段用限制酶HindIII和AflII处理，然后与pCDFJ23-dhaB123-gdrA重组质粒片段混合，向其中加入T4 DNA连接酶(可购自Takara)，使其在4℃下反应，并且插入到HindIII/AflII识别位点中。由此，制备7.3kb的pCDFJ23-dhaB123-gdrAB重组质粒。
此外，为了分离辅酶A依赖性丙醛(PduP)基因，提取肺炎克雷伯氏菌DSM 2026的总DNA，并且制备引物[(5′-gctagc ggtacc tgttaaaggagcatctgacaatgaatacagcagaactggaaacc-3′(SEQ ID NO：28)和5′-ttaaca catatg ttagcgaatggaaaaaccgttggt-3′(SEQ ID NO：29))]。使用提取的总DNA作为模板一次性进行PCR，并且识别对应于pduP基因的1.4kb基因片段。使用1％琼脂糖胶凝胶分离由PCR形成的基因片段，并且使用Wizard DNA纯化试剂盒进行纯化。将纯化的基因片段用限制酶KpnI和NdeI处理，然后与pCDFJ23-dhaB123-gdrAB重组质粒片段混合，向其中加入T4 DNA连接酶(可购自Takara)并且使其在4℃下反应。由此，制备8.7kb的pCDFJ23-dhaB123-gdrAB-pduP重组质粒。
并且，为了扩增对应于reC_GK的基因片段，所述reC_GK是钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)(真氧产碱杆菌(Ralstonia eutropha))PHA合酶的变体(S506G.A510K)基因，使用引物[(5′-cgctaa catatg tgttaaaggagcatctgacatggcgaccgataaaggc-3′(SEQ ID NO：30)和5′-caattg agatct tcatgccttggctttgacgtatcgccc-3′(SEQID NO：31)]进行PCR，将扩增的1.8kb基因片段用NdeI/BglII限制酶处理，然后与pCDFJ23-dhaB123-gdrAB-pduP重组质粒片段混合，向其中加入T4 DNA连接酶(可购自Takara)，使其在4℃反应并且插入到NdeI/BglII识别位点中。由此，最终得到10.5kb的pCDFJ23-dhaB123-gdrAB-pduP-reC_GK重组载体。这种pCDFJ23-dhaB123-gdrAB-pduP-reC_GK重组载体的制备方法和切割图示于图2中。
1-2.pTrcHisB-ldhD-cppct540重组载体的制备
来自丙酸梭菌的丙酰辅酶A转移酶(CP-PCT)变体被用作丙酰辅酶A转移酶基因(pct)，并且来自乳酸片球菌的基因被用作乳酸脱氢酶基因。此处使用的载体是包含是IPTG诱导系统的Trc启动子的pTricHisB(Invitrogen Co.，USA)。
首先，为了分离乳酸脱氢酶基因，提取乳酸片球菌的总DNA，制备引物[5′-aataaaccatgg atgaaaattattgcttat-3′(SEQ ID NO：32)和5′-caagat ctcgagttaatcaaatttgacctc-3′(SEQ ID NO：33)]，并且使用提取的总DNA作为模板进行PCR。对得到的PCR产物进行电泳以确认对应于ldhD基因的1kb基因片段，并且得到所述基因。使用1％琼脂糖胶凝胶分离由PCR形成的基因片段，并且使用Wizard DNA纯化试剂盒进行纯化。将纯化的基因片段用限制酶NcoI和XhoI处理，然后与pTricHisB混合，向其中加入T4 DNA连接酶(可购自Takara)，并且使其在4℃下反应。由此，制备5.4kb的pTrcHisB-ldhD重组质粒。
然后，为了构建操纵子型系统从而在Trc启动子的影响下在此处表达丙酰辅酶A转移酶，使用来自丙酸梭菌的丙酰辅酶A转移酶(CP-PCT)变体(CP-PCT变体540；包含Val193Ala和沉默突变T78C、T669C、A1125G、T1158C)。在韩国专利申请No.10-2018-002497中详细描述了CP-PCT 540的选择方法，该申请通过引用并入本说明书中。使用引物[5′-aactcg agatct tgttaaaggagctctgac atgagaaaggttcccattatt-3′(SEQ ID NO：34)和5′-ccatat ggtacc ttaggacttcatttcctt-3′(SEQ ID NO：35)]对以这种方式选择的CP-PCT变体540(包含Val193Ala和沉默突变T78C、T669C、A1125G、T1158C)进行PCR以得到1.5kb的扩增基因片段。将其用限制酶BglII/KpnI处理，然后与pTrcHisB-ldhD重组质粒混合，向其中加入T4 DNA连接酶(可购自Takara)，并且使其在4℃下反应，以制备6.9kb的pTrcHisB-ldhD-CPPCT 540重组质粒。pTrcHisB-ldhD-CPPCT 540重组载体的制备方法和切割图示于图3中。
实施例2.用于制备3-羟基丙酸酯-乳酸酯嵌段共聚物的重组菌株的制备
2.1.ldhA基因敲除变体的制备
为了制备基于大肠杆菌XL1-Blue(Stratagene，USA)的无乳酸酯聚合物，将在大肠杆菌的代谢过程中制备乳酸酯所涉及的来自大肠杆菌XL1-blue的D-乳酸脱氢酶基因(ldhA；发酵D-乳酸脱氢酶、NAD依赖性[大肠杆菌菌株K-12亚株]基因登录号：NC_000913.3，酶登录号：EC_1.1.1.28)从基因组DNA中敲除以制备大肠杆菌变体，制备具有ldhA缺失的大肠杆菌XL1-Blue(ΔldhA)。使用本领域公知的red重组方法进行基因的删除。用于删除ldhA的低聚物由碱基序列SEQ ID NO：36(5′-atcagcgtacccgtgatgctaacttctctctggaaggtctgaccggctttaattaaccctcactaaagggcg-3′)和SEQ ID NO：37(5′-acaccgattttaccggtaccgataacgcctgccgttttgccatacatagttaatacgactcactatagggctc-3′)来合成。
2.2.制备用于制备3-羟基丙酸酯-乳酸酯嵌段共聚物的重组菌株
使用在实施例1.1和实施例1.2中制备的重组载体pCDFJ23-dhaB123-gdrAB-pduP-reC_GK和pTrcHisB-ldhD-CPPCT 540通过电穿孔转化在实施例2.1中制备的具有ldhA缺失的大肠杆菌突变体大肠杆菌XL1-Blue(ΔldhA)，以制备用于制备P(LA-b-3HP)嵌段共聚物的重组菌株。
实施例3.使用IPTG诱导制备3-羟基丙酸酯-乳酸酯嵌段共聚物
如下分两步培养在实施例2.2中制备的重组菌株以得到3-羟基丙酸酯-乳酸酯嵌段共聚物。
首先，对于第一步培养，将在实施例2.2中制备的经转化的重组大肠杆菌接种到还包含100mg/L的氨苄青霉素、25mg/L的链霉素、20g/L的甘油、0.5mM的维生素B12和10mg/L的硫胺素的100ml MR培养基中(每1L培养基含有KH2PO4 6.67g，(NH4)2HPO4 4g，MgSO4·7H2O0.8g，柠檬酸0.8g和痕量金属溶液5mL；其中，每1L所述痕量金属溶液包含5M HCl 5mL，FeSO4·7H2O 10g，CaCl2 2g，ZnSO4·7H2O 2.2g，MnSO4·4H2O 0.5g，CuSO4·5H2O 1g，(NH4)6Mo7O2·4H2O 0.1g，Na2B4O2·10H2O 0.02g)，并且在30℃和250rpm下搅拌的同时进行培养。
从培养开始1天后，以0.5mM加入异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，以便在100ml培养物中使用IPTG诱导系统，并且加入10g/L葡萄糖以进行IPTG诱导。因此，LA生物合成酶和LA辅酶A转化酶表达，并且甘油的使用被中断，P(3HP)的制备受到抑制，从而在中断的P(3HP)末端进行PLA生物合成。
随后，将诱导的培养液进一步培养(第二步培养)3天。
比较例1.在没有IPTG诱导的情况下制备3-羟基丙酸酯聚合物
为了与根据本发明的制备方法比较，在不使用IPTG诱导的情况下，一步培养制备3-羟基丙酸酯聚合物。具体地，在单独的烧瓶中，将在实施例2.2中制备的经转化的重组大肠杆菌接种在还包含100mg/L的氨苄青霉素、25mg/L的链霉素、20g/L的甘油和0.5mM的维生素B12的100ml MR培养基中(每1L培养基含有KH2PO4 6.67g，(NH4)2HPO4 4g，MgSO4·7H2O0.8g，柠檬酸0.8g，痕量金属溶液5mL；其中，每1L所述痕量金属溶液包含5M HCl 5mL，FeSO4·7H2O 10g，CaCl2 2g，ZnSO4·7H2O 2.2g，MnSO4·4H2O 0.5g，CuSO4·5H2O 1g，(NH4)6Mo7O2·4H2O 0.1g和Na2B4O2·10H2O 0.02g)并且在30℃下在250rpm下搅拌的同时总共培养4天。
实验例1.制备的聚合物的分子量和组成的分析
将根据实施例3的进行了IPTG诱导的培养液和根据比较例1的未进行IPTG诱导的培养液分别在4℃且在4000rpm下离心10分钟以收集微生物细胞，用足量的蒸馏水洗涤两次，然后在80℃下干燥12小时。为了确认干燥的微生物细胞中的聚合物含量和组成，进行GC分析。为此，对除去水分的微生物细胞进行定量，然后在100℃下使用氯仿作为溶剂在硫酸催化剂下与甲醇反应。这通过在室温下加入相当于氯仿的一半的量的蒸馏水来混合，然后静置直至其分成两层。在这两层中，收集其中溶解了甲基化聚合物的单体的氯仿层，并且通过气相色谱法(GC)分析聚合物的组分。苯甲酸酯用作内标物。这次使用的GC条件示于下面表1中。
为了确定聚合物的分子量，进行GPC分析。为此，如下进行聚合物提取和纯化。将除去水分的微生物细胞收集在圆筒状滤纸中，然后使用索格利特萃取器在60℃下用氯仿溶剂萃取4小时以上。萃取之后，使用蒸发器除去作为溶剂的氯仿以得到膜型聚合物。为了纯化它，将膜型聚合物溶解在5ml氯仿中，然后在4℃下逐渐滴加入100ml甲醇中以除去杂质。通过GPC分析确认由此纯化的聚合物的分子量。具体地，将纯化的聚合物以1mg/mL至2mg/mL的浓度溶解在氯仿中，然后通过0.45μm注射器式过滤器来过滤，并且使用GPC(Waters E08BX)设备对氯仿进行分析。氯仿以1mL/min的流速作为流动相流动，将柱温调节至35℃，并且使用RI折射率检测仪进行检测。因此，分别测量本发明的生物聚合物组成的数均分子量(Mn)、重均分子量(Mw)、最大峰分子量(Mp)和多分散指数(PDI)。
[表1]
GC分析条件
项目 特性
型号 Hewlett Packard 6890N
检测器 火焰离子化检测器(FID)
柱 Alltech Capillary AT<sup>TM</sup>-WAX，30m，0.53mm
液相 100％聚乙二醇
进样口温度/出样口温度 250℃/250℃
载气 He
总流量 3ml/min
隔垫吹扫速度 1ml/min
柱头压力 29kPa
进样口模式 不分流
进样体积/溶剂 1μl/氯仿
初始温度/时间 80℃/5min
最终温度/时间 230℃/5min
温度升高 7.5℃/min
在GC分析中得到的结果示于下面表2中。
[表2]
Figure BPA0000285961570000161
如表2所示，当使用根据本发明的经转化的重组菌株进行IPTG诱导时，可以确认，生成3-羟基丙酸酯-乳酸嵌段共聚物。然而，当不进行IPTG诱导时，可以看出仅生成P(3HP)，而基本上不生成LA。
实验例2.确认本发明的共聚物是否为嵌段共聚物
为了确认如上所述制备的聚合物是否为P(3HP-b-LA)嵌段共聚物，使用差示扫描量热仪(DSC Q100，TA仪器)与P(3HP-r-LA)无规共聚物一起进行实验，并且比较结果。
作为比较例，通过以下方法制备P(3HP-r-LA)无规共聚物。首先，作为比较例的载体，将rec-GK和CPPT-540置于pBluescript基载体而不是IPTG诱导载体中，并且使用制备的pBlue-reC_GK-CPPCT540。
具体地，作为用于制备pBlue-reC_GK-CPPCT540的PHA合酶基因，使用来自钩虫贪铜菌(真氧产碱杆菌)的PHA合酶变体(S506G.A510K)(reC_GK)。这次使用的载体是pBluescript II(Stratagene Co.，USA)。
为了表达ReC_GK，在pSYL105载体中(Lee等，Biotech.Bioeng.，1994，44：1337-1347)，将包含来自真氧产碱杆菌H16的PHB产生操纵子的DNA片段用BamHI/EcoRI酶切，并且插入到pBluescript II(Stratagene Co.，USA)的BamHI/EcoRI识别位点中。由此，制备pReCAB重组载体。在pReCAB载体中，PHA合酶(phaCRE)和单体供应酶(phaARE和phaBRE)被PHB操纵子启动子不断表达。通过BstBI/SbfI限制酶完全除去pReCAB载体的ReC合酶基因，并且在该位置插入一个变体ReC_GK合酶基因。为了扩增该ReC_GK合酶基因片段，使用引物[(5′-cgctaa TTCGAA tagtgacggcagagagacaatcaaatc atggcgaccggcaaaggc-3′(SEQ IDNO：38)和5′-caattg CCTGCAGG tcatgccttggctttgacgtatcgccc-3′(SEQ ID NO：39)]进行PCR以得到扩增的1.8kb基因片段。将其用限制酶BstBI/SbfI处理，与质粒片段混合，向其中加入T4 DNA连接酶(可购自Takara)，使其在4℃下反应，并且插入到BstBI/SbfI识别位点中以制备pBlue-reC_GK重组载体。
为了构建其中此处一起表达丙酰辅酶A转移酶的操纵子的恒定表达系统，使用来自丙酸梭菌的丙酰辅酶A转移酶变体(CPPCT540)。为了扩增CPPCT540基因片段，使用引物[5′-caattgCCTGCAGGcggataacaatttcacacaggaaacagaattcatgagaaaggttcccattatt-3′(SEQ ID NO：40)、5′-ccatat catatg ttaggacttcatttcctt-3′(SEQ ID NO：41)]进行PCR。使用得到的1.5kb片段。将该PCR片段用限制酶SbfI/NdeI处理，然后与pBlue-reC_GK重组质粒片段混合，向其中加入T4 DNA连接酶，使其在4℃下反应，并且插入到SbfI/NdeI识别位点中，以制备pBlue-reC_GK-CPPCT540重组载体。pBlue-reC_GK-CPPCT540重组载体的制备方法和切割图示于图6中。
使用ldhA不缺失的大肠杆菌XL1-Blue野生型菌株，制备产生聚合物的微生物以便在培养过程中供应乳酸酯单体。培养所使用的碳源是葡萄糖。以0.5g/L加入3HP(3-羟基丙酸酯)单体以生物合成P(3HP-r-LA)无规共聚物。以与实施例3中描述的嵌段聚合物合成相同的条件应用MR培养基、培养时间和温度。
使用差示扫描量热计(DSC Q100，TA仪器)测试在实施例3中制备的根据本发明的共聚物和如上所述制备的无规共聚物，并且通过10℃/min的升温速度将温度从-40℃升高至220℃来进行测量。结果示于图4和图5中。
从图4和图5中可以看出，对于本发明的P(3HP-b-LA)嵌段共聚物，P(3HP)和PLA的玻璃化转变温度(Tg)和熔融温度(Tm)两者都符合标准，而对于比较例的P(3HP-r-LA)无规共聚物，发现Tg在P(3HP)和PLA之间的中间位置，并且未测量到Tm。因此，可以清楚地确认，根据本发明制备的共聚物是P(3HP-b-LA)嵌段共聚物。
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Claims (12)

1.一种3-羟基丙酸酯-乳酸酯嵌段共聚物[P(3HP-b-LA)]的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
(a)通过用包含3-羟基丙酰辅酶A生物合成基因和聚羟基脂肪酸酯(PHA)合成酶基因的载体与包含乳酸酯生物合成基因和将乳酸酯转化为乳酰辅酶A(lactyl-CoA)的酶的基因的载体转化经改良以便不能生物合成乳酸的重组微生物来制备重组微生物的步骤；
(b)通过使用甘油作为碳源培养在步骤(a)中制备的重组微生物来合成P(3HP)的步骤；和
(c)通过加入IPTG和葡萄糖来抑制P(3HP)生成，并且通过实现乳酸酯合酶和将乳酸酯转化为乳酰辅酶A(lactyl-CoA)的酶的表达来在步骤(a)中合成的P(3HP)的末端生物合成PLA的步骤。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，
在所述不能生物合成乳酸的重组微生物中，乳酸脱氢酶A编码基因(ldhA)被灭活。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其中，
所述3-羟基丙酰辅酶A生物合成基因是编码甘油脱水酶、甘油脱水酶活化酶和辅酶A依赖性丙醛脱氢酶和醛脱氢酶的基因。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其中，
所述聚羟基脂肪酸酯(PHA)合成酶基因是编码来自钩虫贪铜菌(Cupriavidusnecator)的PHA合成酶变体的基因reC_GK。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其中，
所述乳酸酯合酶基因是编码来自乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)的乳酸脱氢酶(Ldh)的基因。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其中，
所述将乳酸转化为乳酰辅酶A(lactyl-CoA)的酶是来自丙酸梭菌(Clostridiumpropionicum)的酶。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其中，
所述微生物是大肠杆菌(E.coli)。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其中，
在步骤(c)中，所述IPTG以0.1mM至1.0mM的量加入。
9.一种重组微生物，该重组微生物通过用包含3-羟基丙酰辅酶A生物合成基因和聚羟基脂肪酸酯(PHA)合成酶基因的载体与包含乳酸酯生物合成基因和将乳酸酯转化为乳酰辅酶A(lactyl-CoA)的酶的基因的载体转化经改良以便不能生物合成乳酸的重组微生物来制备。
10.一种3-羟基丙酸酯-乳酸酯嵌段共聚物[P(3HP-b-LA)]，包含乳酸酯和3-羟基丙酸酯作为重复单元。
11.根据权利要求10所述的3-羟基丙酸酯-乳酸酯嵌段共聚物，其中，所述3-羟基丙酸酯-乳酸酯嵌段共聚物[P(3HP-b-LA)]的乳酸酯单体含量为10摩尔％以上。
12.一种用于制备3-羟基丙酸酯-乳酸酯嵌段共聚物的组合物，该组合物包含权利要求9所述的重组微生物。
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