JP2009138174A - 高分子化合物の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 精製酵素や高価なＡＴＰを使用することなく、アセチルＣｏＡを連続的に生成・再生して、高収率かつ迅速かつ容易に、所望の組成を有する高分子化合物を製造する方法を提供する。
【解決手段】 アセチルチオエステルとＣｏＡとからアセチルＣｏＡを生成する化学的チオエステル交換反応と、少なくとも１つのモノマー前駆体と前記アセチルＣｏＡとからモノマー前駆体−ＣｏＡ誘導体に変換するモノマー生成反応と、記モノマー前駆体−ＣｏＡ誘導体を重合して前記モノマーユニットからなる前記高分子化合物を生成する重合反応と
を有している。
【選択図】 図１

Description

本発明は、高分子化合物の製造方法に関し、特に精製酵素と高価なＡＴＰとを使用することなく安価な酢酸を出発物質としてアセチルＣｏＡ（アセチルコエンザイムＡ）を生成し、モノマー生成を経て、生分解性を有する高分子化合物を工業的に利用可能に製造する高分子化合物の製造方法に関するものである。

様々な高分子化合物の中で、石油等の化石燃料由来の化学合成プラスチックは、自然環境中で分解されないため、環境中に半永久的に蓄積してしまい、様々な環境問題を引き起こしている。このような背景から、自然界に存在する微生物によって分解される高分子化合物である生分解性プラスチック（グリーンプラ）は、環境に負荷を与えない高分子材料として注目され、実用化に向けての開発が行われている。また、生体機能材料（バイオマテリアル）として、生物・医学領域への新たな展開も期待されている。

生分解性ポリエステルは、現在までに数多くの微生物において、糖や植物油等の再生可能な生物有機資源（バイオマス）を原料として生成され、菌体内に蓄積されることが知られている。その中でも、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）は化学合成プラスチックと同様に熱可塑性を示し、優れた生分解性と生体適合性を有することから注目を集めているポリエステルであり、ポリマー中において９０種類以上のモノマー構造が確認されている（非特許文献１）。

ＰＨＡの製造方法には、微生物発酵生産を利用して微生物体内で生成するｉｎ ｖｉｖｏ合成法と、精製ＰＨＡシンターゼ（ＰＨＡ合成酵素）とＰＨＡのモノマーとを用いて微生物体外で合成するｉｎ ｖｉｔｒｏ合成法がある。現在、ＰＨＡは、一般にｉｎ ｖｉｖｏ合成法によって製造されるが、微生物発酵生産では微生物体内にＰＨＡを蓄積するためにその生産量は限られ、また微生物を粉砕してＰＨＡを抽出して精製するのに高いコストがかかってしまう等の問題点が多い。さらにｉｎ ｖｉｖｏ合成法は、複雑な微生物代謝経路を経るため、必ずしも所望の性質を有するＰＨＡを生産できるということではなく、そのバリエーションも限定されてしまう。また、発酵生産の制御によっては、ＰＨＡが所望のホモポリマーとならずにコポリマーとなることもあり、また逆にコポリマーの生産を目的とする場合においても、必ずしも所望のモル比で均質なコポリマーを生産できるということではない（非特許文献２）。

このような問題を解決するため、ＰＨＡシンターゼの発現を増強することによって生産性の向上を図るという試みや、あるいはＰＨＡシンターゼ基質特異性を変換することによってＰＨＡの共重合組成を制御するという試み等がなされている（特許文献１〜３）。

一方、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成法は、遺伝子組換え技術によってＰＨＡシンターゼの大量調製が可能となったことから開発されたものであり（非特許文献３）、前述の通り、精製ＰＨＡシンターゼと基質となるモノマーとを用いてＰＨＡを製造する方法である。これにより、モノマーを化学的に調製してＰＨＡのモノマー構造を拡張し、生産量の調整を高い精度で行うことが可能となり、前述のようなｉｎ ｖｉｖｏ合成法による問題点を回避することができるようになった。ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成法を用いることにより、これまでｉｎ ｖｉｖｏ合成法では得ることのできなかった様々な物性や機能性を有するＰＨＡを製造することが期待されている。

しかしながら、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成法を用いてＰＨＡを製造する場合、基質となるモノマーとしてヒドロキシアシルＣｏＡ（ＨＡ−ＣｏＡ）を使用するため、この化合物を連続的に供給する必要があるが、ＨＡ−ＣｏＡは極めて高価で、その合成方法も非常に複雑である上、その合成にも高価なＣｏＡを用いなければならない。

これらの問題に対して、ＰＨＡの重合と共に反応系内に遊離したＣｏＡをリサイクルし、ＨＡ−ＣｏＡを連続的に供給するという試みがなされている。例えば、非特許文献４では、酢酸とアセチルＣｏＡシンセターゼとＡＴＰとを共存させることで遊離するＣｏＡがアセチルＣｏＡに変換され、続いてプロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼを共存させることで３−ヒドロキシブチルＣｏＡが得られ、さらに、これが重合されてポリ３−ヒドロキシブチレートが合成されるという、ＣｏＡをリサイクルする方法が示されている（非特許文献４）。

また、特許文献４では、出発物質であるチオエステルからＰＨＡを製造する一連の反応過程において、ＣｏＡをリサイクリングしながらＨＡ−ＣｏＡを連続的に供給する方法が開示されている。すなわち、出発物質であるチオエステルはチオエステル交換反応によりＣｏＡと反応してＨＡ−ＣｏＡに変換され、続いて、ＰＨＡシンターゼにより重合されてＰＨＡが合成される。この重合反応時にＣｏＡが遊離されるため、この遊離されたＣｏＡがエステル交換反応に再利用されて、ＨＡ−ＣｏＡが連続的に生成・再生される方法である（特許文献４）。

特開平７―２６５０６５号公報 特開平１０−１０８６８２号公報 特表２００１―５１６５７４号公報 再表２００４−０６５６０９号公報 ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ．，１９９５，１２８，２１９−２２８ ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ．，１９９２，１０３，２０７―２１４ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ｓｃｉ．，１９９５，９２，６２７９−６２８３ ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９８，１６８，３１９−３２４

しかしながら、非特許文献４に記載された製造方法では、精製の困難な３種類の酵素を使用しなければならず、さらに極めて高価なＡＴＰも必須であるため、工業的な生産に用いることは極めて難しい。

一方、特許文献４の発明では、原料であるヒドロキシアルカノエート（ＨＡ）をチオフェニルエステル化して出発物質であるチオフェニルエステルを生成しなければならないが、このチオフェニルエステル化反応では、ＨＡの水酸基を一度保護し、反応後に脱保護するという手順を要するため手間を要してしまい、やはり工業化が困難であるという問題がある。

さらに、特許文献４の発明では、チオエステル交換反応によってチオフェニルエステルからアシルＣｏＡに変換される際にチオフェノールが遊離する。このチオフェノールは物質毒性が非常に強く、重合反応が行われる水相溶液中に数パーセントが溶解してしまい、ＰＨＡシンターゼの活性を阻害してしまうといった問題がある。

本発明は、以上のような問題点を解決するためになされたものであって、精製酵素と高価なＡＴＰとを使用することなく、アセチルＣｏＡを連続的に生成・再生し、モノマー生成を経て高分子化合物を製造することにより生産効率や生産性が向上し、その結果、所望の組成を有する高分子化合物を製造することができ、かつ工業的に利用することができる高分子化合物の製造方法の提供を目的としている。

本発明に係る高分子化合物の製造方法は、アセチルチオエステルとＣｏＡとからアセチルＣｏＡを生成する化学的チオエステル交換反応と、少なくとも一のモノマー前駆体と前記アセチルＣｏＡとからモノマー前駆体−ＣｏＡ誘導体に変換するモノマー生成反応と、前記モノマー前駆体−ＣｏＡ誘導体を重合して前記モノマーのユニットからなる前記高分子化合物を生成する重合反応とを有する。

本発明において、前記モノマー前駆体がヒドロキシ酸であり、かつヒドロキシ酸のユニットからなる高分子化合物を生成する態様であってもよい。

また、本発明において、前記ヒドロキシ酸がヒドロキシアルカノエートおよびセリンの少なくともいずれかであってもよい。

また、本発明において、前記ヒドロキシアルカノエートが、乳酸、３−ヒドロキシプロピオネート、３−ヒドロキシブチレート、および４−ヒドロキシブチレートからなる群から少なくとも一つ選ばれるものであってもよい。

さらに、本発明において、前記乳酸がＤ−乳酸であってもよい。

そして、本発明において、前記化学的チオエステル交換反応が、前記重合反応においてモノマー前駆体−ＣｏＡ誘導体から遊離するＣｏＡと前記アセチルチオエステルとからアセチルＣｏＡを生成する反応であってもよい。

また、本発明において、前記アセチルチオエステルがチオール化合物と酢酸とを用いたチオエステル化反応によって生成する態様であってもよい。

そして、本発明において、前記酢酸が、前記モノマー生成反応において遊離する酢酸であってもよい。

また、本発明において、前記チオール化合物がエチルチオグリコレート（ＥＴＧ）であってもよい。

そして、本発明において、前記モノマー生成反応に用いられる酵素がアセチルＣｏＡを基質とする酵素であってもよい。

また、本発明において、前記化学的チオエステル交換反応と前記モノマー生成反応と前記重合反応とが一の反応系内にあってもよい。

そして、本発明において、前記一の反応系が、前記アセチルチオエステルを含有する有機溶媒相と、前記ＣｏＡと前記モノマー前駆体と前記モノマー生成反応を触媒する酵素と前記重合反応を触媒する酵素とを含有する水相とからなってもよい。

また、本発明において、前記アセチルチオエステルと前記モノマー前駆体とのモル濃度の比が、１対１ないし１０対１であってもよい。

さらに、本発明において、前記高分子化合物の分子量分布が１ないし３であってもよい。

本発明によれば、精製酵素と高価なＡＴＰとを使用することなく、アセチルＣｏＡを連続的に生成・再生して、高収率かつ迅速かつ容易に高分子化合物を製造することができるため、所望の組成を有する高分子化合物を製造することができ、かつ工業化に好適な高分子化合物を製造することができる。また、選択できるモノマー成分の幅が広がるため、所望の組成を有する高分子化合物を製造することができる。

以下、本発明に係る高分子化合物の製造方法について図１から図３を参照しつつ説明する。図１に示すように、本発明に係る高分子化合物の製造方法は、化学的チオエステル交換反応、モノマー生成反応、および重合反応の各反応段階からなる。

化学的チオエステル交換反応は、アセチル基供与体であるアセチルチオエステルをＣｏＡと反応させてアセチルＣｏＡを生成する化学反応であり、同時にチオール化合物が遊離する。また、モノマー生成反応は、化学的チオエステル交換反応において生成されたアセチルＣｏＡを少なくとも一のモノマー前駆体と反応させ、モノマー前駆体の水酸基をＣｏＡに置換してモノマー前駆体−ＣｏＡ誘導体に変換する反応であり、同時に酢酸が遊離する。さらに、重合反応は、モノマー生成反応によって得られたモノマー前駆体−ＣｏＡ誘導体を重合させて高分子化合物を生成する反応であり、同時にＣｏＡが遊離する。

前記モノマー生成反応におけるモノマー前駆体としてカルボン酸を挙げることができ、好ましいカルボン酸としてはヒドロキシ酸または不飽和脂肪酸を挙げることができる。ヒドロキシ酸または不飽和脂肪酸はモノマー生成反応によってモノマー前駆体−ＣｏＡ誘導体を生成後、重合反応によって高分子化合物を製造することができれば特に限定されないが、例えば、タルトレート、グリセレート、アクリレート、クロトネート、アミノクロトネート、ヒドロキシクロトネート、ペンテネート、ヘキサノエート、オクタノエート、リンゴ酸、酒石酸、シトラマル酸、クエン酸、イソクエン酸、ロイシン酸、メバロン酸、パントイン酸、リシノール酸、リシネライジン酸、セレブロン酸、キナ酸、シキミ酸、セリン（Ｓｅｒ）、ＨＡ等の脂肪族ヒドロキシ酸、サリチル酸、ヒドロキシメチル安息香酸、バニリン酸、シリング酸、ピロカテク酸、レソルシル酸、プロトカテク酸ゲンチジン酸、オルセリン酸、没食子酸、マンデル酸、ベンジル酸、アトロラクチン酸、メリトロ酸、フロレト酸、クマル酸、ウンベル酸、コーヒー酸、フェルシラ酸シナピン酸等の芳香族ヒドロキシ酸を挙げることができるが、ＳｅｒまたはＨＡが好ましい。

次に、本発明におけるＨＡとしては、乳酸（２−ヒドロキシプロピオネート；ＬＡ）、グリコール酸、３−ヒドロキシプロピオネート（３ＨＰ）、３−ヒドロキシブチレート（３ＨＢ）、３−ヒドロキシバレレート（３ＨＶ）、３−ヒドロキシヘキサノエート、３−ヒドロキシヘプタノエート、３−ヒドロキシオクタノエート、３−ヒドロキシノナノエート、３−ヒドロキシデカノエート、３−ヒドロキシウンデカノエート、３−ヒドロキシドデカノエート、３−ヒドロキシドデセノエート、３−ヒドロキシテトラデカノエート、３−ヒドロキシヘキサデカノエート、３−ヒドロキシオクタデカノエート、４−ヒドロキシブチレート（４ＨＢ）、４−ヒドロキシバレレート、５−ヒドロキシバレレート、６−ヒドロキシヘキサノエート、ヒドロキシラウリレート等を挙げることができるが、好ましいＨＡとしては、ＬＡ、３ＨＰ、３ＨＢ、４ＨＢを挙げることができる。

また、ＬＡには二つのエナンチオマー、すなわちＤ体とＬ体とが存在する。本発明においては、Ｄ体、Ｌ体のいずれもモノマー前駆体として用いることができるが、本実施形態においてはＤ体（Ｄ−乳酸）を好適なＬＡとして用いている。

また、本発明に係る高分子化合物の製造方法により製造することができる高分子化合物にはポリエステルが含まれる。本発明におけるポリエステルとしては、前記ＨＡのホモポリマー、前記ＨＡから選択されてなるコポリマー、ランダムポリマー、ブロックポリマーであるＰＨＡを挙げることができるが、好ましいＰＨＡとしては、ポリＬＡ（ＰＬＡ）、ポリ３−ヒドロキシプロピオネート｛Ｐ（３ＨＰ）｝、ポリ３−ヒドロキシブチレート｛Ｐ（３ＨＢ）｝、ポリ４−ヒドロキシブチレート｛Ｐ（４ＨＢ）｝、ＬＡと３ＨＰとからなるポリマー｛Ｐ（ＬＡ−ｃｏ−３ＨＰ）｝、ＬＡと３ＨＢとからなるポリマー｛Ｐ（ＬＡ−ｃｏ−３ＨＢ）｝、ＬＡと４ＨＢとからなるポリマー｛Ｐ（ＬＡ−ｃｏ−４ＨＢ）｝、３ＨＰと３ＨＢとからなるポリマー｛Ｐ（３ＨＰ−ｃｏ−３ＨＢ）｝、３ＨＰと４ＨＢとからなるポリマー｛Ｐ（３ＨＰ−ｃｏ−４ＨＢ）｝、３ＨＢと４ＨＢとからなるポリマー｛Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−４ＨＢ）等を挙げることができる。さらに、前記ポリエステルにはセリンまたはＨＡから選択されるユニットからなるものが含まれ、好ましいＨＡのユニットとしてはＳｅｒのホモポリマー（ＰＳ）、３ＨＰ、３ＨＢ、４ＨＢ、のいずれかのＨＡとＳｅｒとからなるコポリマー、ランダムポリマー、ブロックポリマー、または他のユニットとともに構成するコポリマー、ランダムポリマー、ブロックポリマーを挙げることができる。なお、本発明における高分子化合物は生分解性を有するものが好適である。

また、本発明に係る高分子化合物の製造方法においては、重合反応において遊離したＣｏＡをさらに、化学的チオエステル交換反応にてアセチルチオエステルと反応させてアセチルＣｏＡを生成することができる。すなわち、化学的チオエステル交換反応においてアセチルＣｏＡの生成に用いるＣｏＡとして、重合反応でモノマー前駆体−ＣｏＡ誘導体から遊離したＣｏＡを再利用することができる。なお、再利用せずにＣｏＡを別途添加することにより、化学的チオエステル交換反応においてアセチルＣｏＡを生成することもできる。

また、化学的チオエステル交換反応の出発物質であるアセチルチオエステルの生成方法は、安価な化合物等を用いて生成することができれば特に限定されないが、高価な化合物等を用いることなく一段階で簡便に生成することができるという点から、図３に示すように、原料物質である酢酸とチオール化合物とを反応させるチオエステル化反応により生成することが好ましい。

一方、モノマー生成反応において遊離した酢酸は、チオエステル化反応にてチオール化合物と反応させてアセチルチオエステルを生成することができる。すなわち、チオエステル化反応においてアセチルチオエステルの生成に用いる酢酸は、モノマー生成反応で遊離した酢酸を再利用することができる。なお、再利用せずに酢酸を別途添加することにより、チオエステル化反応においてアセチルチオエステルを生成することもできる。

ここで、本発明におけるチオール化合物は、チオール基を有し、かつアセチル基をＣｏＡに供与することによってアセチルＣｏＡを生成することができる化合物であれば特に限定されないが、好ましいチオールとしては、脂肪族チオールや芳香族チオールが挙げられ、具体的には、エタンチオール、プロパンチオール、ベンジルメルカプタン、２−メルカプトエチルエーテル、およびシクロヘキシルチオール等のＣ１〜Ｃ１８のアルキルチオールないしシクロアルキルチオール、メルカプトエタノールおよびｐ−メルカプトフェノール等の水酸基を含有するチオール、メルカプト酢酸メチルおよびメルカプトプロピオン酸エチル等のカルボン酸エステルを含有するチオール、チオフェノール（ＴＰ）、トルエンチオール、およびナフタレンチオールなどの芳香族チオール、２−メルカプト−１−メチルイミダゾール、メルカプトピリジン、メルカプトチアゾリン、メルカプトベンズチアゾリン、メルカプトベンズオキサゾール、およびメルカプトピリミジン等の含窒素芳香族チオール、メチルチオグリコレート、エチルチオグリコレート（ＥＴＧ）、プロピルチオグリコレート、イソプロピルチオグリコレート、ブチルチオグリコレート、ｎ−アミルチオグリコレート、イソアミルチオグリコレート、ヘキシルチオグリコレート、オクチルチオグリコレート、ｎ−デシルチオグリコレート、ラウリルチオグリコレート、トリデシルチオグリコレート、ステアリルチオグリコレート、チオナリド、フルフリルメルカプタン、シクロヘキシルチオグリコレート、およびヒドロキシエチルチオグリコレート等のチオグリコレートを挙げることができるが、ＴＰ、チオグリコレートが好ましく、特にチオグリコレートがより好ましい。なお、本実施形態においては、酢酸からアセチルチオエステルを安定して生成することができること、物質毒性が低くシンターゼの活性を阻害しないこと、および高分子化合物の生成速度ならびに生成収率が大きくなることから、ＥＴＧを好適なチオール化合物として用いている。

一方、前記モノマー生成反応で用いる酵素は、前記モノマー生成反応がアセチルＣｏＡと前記ヒドロキシ酸とを基質としてモノマー前駆体−ＣｏＡ誘導体に変換する反応であることから、アセチルＣｏＡを基質とする酵素であることが好ましい。アセチルＣｏＡを基質とする酵素としては、例えば、ＣｏＡトランスフェラーゼを挙げることができる。ＣｏＡランスフェラーゼとしては、例えば、アセトアセチルＣｏＡトランスフェラーゼ、カフェオイルＣｏＡトランスフェラーゼ、クマロイルＣｏＡトランスフェラーゼ、グルタリルＣｏＡトランスフェラーゼ、クロトニルＣｏＡトランスフェラーゼ、シナポイルＣｏＡトランスフェラーゼ、シンナモイルＣｏＡトランスフェラーゼ、スクシニルＣｏＡトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシブタノイルＣｏＡトランスフェラーゼ、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡトランスフェラーゼ、フェルロイルＣｏＡトランスフェラーゼ、プロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼ（ＰＣＴ）、マロニルＣｏＡトランスフェラーゼ等を挙げることができ、さらに、基質であるヒドロキシ酸に応じて好適なＣｏＡトランスフェラーゼを選択することができる。例えば、ヒドロキシ酸が３ＨＢ、３ＨＰ、４ＨＢ、ＬＡ、セリンである場合はＰＣＴを用いることができる。

前記ＣｏＡトランスフェラーゼの由来微生物としては、アセチルＣｏＡからＣｏＡ基をモノマー前駆体に転移することができる酵素を有するものであれば特に限定されないが、例えばプロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼを用いる場合は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ属、Ａｌｋａｌｉｐｈｉｌｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｎｕｓ属、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ属、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｂａｃｔｅｒ属、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｕｓ属、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｄｅｃｈｌｏｒｏｍｏｎａｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｒｈｏｄｏｆｅｒａｘ属、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｂａｃｔｅｒ属、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｏｃｅａｎｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属、Ｖｉｂｒｉｏ属、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ属、大腸菌、等を挙げることができ、詳細にはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｅｌｓｄｅｎｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ、Ａｌｋａｌｉｐｈｉｌｕｓ ｍｅｔａｌｌｉｒｅｄｉｇｅｎｓ、Ａｌｋａｌｉｐｈｉｌｕｓ ｏｒｅｍｌａｎｄｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｎｕｓ ｃａｒｂｏｘｙｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｂａｃｔｅｒ ｆｕｍａｒｏｘｉｄａｎｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｕｓ ａｃｉｄｉｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｄｅｃｈｌｏｒｏｍｏｎａｓ ａｒｏｍａｔｉｃａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ、Ｒｈｏｄｏｆｅｒａｘ ｆｅｒｒｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｏｌｉｃｈｕｍ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ、Ｏｃｅａｎｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｐ．、Ｖｉｂｒｉｏ ｓｈｉｌｏｎｉｉ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｎｄｏｃｉｎａ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｓｅｄｉｍｉｎｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ等を挙げることができる。

次に、本発明に係る高分子化合物の製造方法は、前記化学的チオエステル交換反応、モノマー生成反応、および重合反応の各反応段階を包含していれば、他の反応段階を有してもよく、例えば、ヒドラターゼによる水和反応等の反応段階を有する場合を挙げることができる。また、前記化学的チオエステル交換反応、モノマー生成反応、および重合反応は各々分離して行うことも、または図２に示すように一の反応系内で同時に行うこともでき、前記一の反応系は前記チオエステル化反応を包含することができる。さらに、前記一の反応系は有機溶媒相と水相とを包含することができる。

そして、有機溶媒相と水相とを包含する一の反応系内において高分子化合物を製造する場合には、前記有機溶媒相はアセチルチオエステルを含み、かつ前記水相はＣｏＡ、モノマー前駆体、ＣｏＡトランスフェラーゼ、およびシンターゼを、各々含んでいることが好ましい。すなわち、図２に示すように、有機溶媒相と水相との界面において有機溶媒相に存在するアセチルチオエステルと水相に存在するＣｏＡとが化学的チオエステル交換反応をしてチオール化合物とアセチルＣｏＡとを生成し、水相においてアセチルＣｏＡとモノマー前駆体とがアセチルＣｏＡを基質とする酵素の触媒作用によりモノマー生成反応して酢酸とモノマー前駆体−ＣｏＡ誘導体とを生成し、続いて水相においてモノマー前駆体−ＣｏＡ誘導体が重合反応に係る酵素の触媒作用により重合反応して高分子化合物を生成する。

ここで、前記重合反応に係る酵素としてＰＨＡシンターゼを挙げることができるが、本発明におけるＰＨＡシンターゼは、ＨＡを重合してＰＨＡを生成する酵素のみならず、ＬＡを重合してＰＬＡを生成する酵素や、ＨＡとＬＡとを重合してコポリマー、ランダムポリマー、ブロックポリマーを生成する酵素が含まれる。また、基質であるモノマー前駆体−ＣｏＡ誘導体に応じて好適なＰＨＡシンターゼを選択することができ、例えば、モノマー前駆体−ＣｏＡ誘導体が３ＨＢ−ＣｏＡ、３ＨＰ−ＣｏＡ、４ＨＢ−ＣｏＡ、ＬＡ−ＣｏＡから選択されるいずれかのモノマー前駆体−ＣｏＡ誘導体を含む場合は、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属由来ＰＨＡ合成酵素、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属由来ＰＨＡ合成酵素、またはこれらＰＨＡ合成酵素のアミノ酸の一部を他のアミノ酸に置換したＰＨＡ合成酵素等を用いることができる。

前記ＰＨＡシンターゼの由来微生物としては、ＨＡ−ＣｏＡを基質としてＰＨＡを合成することができる酵素を有するものであれば特に限定されないが、例えばＲａｌｓｔｏｎｉａ属、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属、Ｍｅｔｈｙｌｉｂｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ａｚｏｈｙｄｒｏｍｏｎａｓ属、Ｒｈｏｄｏｆｅｒａｘ属、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ属、Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｂａｃｔｅｒ属、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属、Ｚｏｏｇｌｏｅａ属、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属、Ｈｅｒｍｉｎｉｉｍｏｎａｓ属、Ｌｉｍｎｏｂａｃｔｅｒ属、Ｄｅｃｈｌｏｒｏｍｏｎａｓ属、Ａｚｏａｒｃｕｓ属、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｏｃｅａｎｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｎｉｔｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ａｌｋａｌｉｌｉｍｎｉｃｏｌａ属、Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属、Ｈａｌｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａ属、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属、Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属、Ｒｕｂｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｄｅｃｈｌｏｒｏｍｏｎａｓ属、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ属、Ａｃｉｄｉｐｈｉｌｉｕｍ属、Ａｚｏａｒｃｕｓ属、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ属、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｈｒｏｍｏｈａｌｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｖｉｂｒｉｏ属、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｒｕｂｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ属、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ属、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ属、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属、Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ属、Ｈａｌｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａ属、Ｃｅｎａｒｃｈａｅｕｍ属、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ属、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ属、Ｃｈｌｏｒｏｇｌｏｅｏｐｓｉｓ属、Ｅｃｔｏｔｈｉｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａ属、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属、Ｎｉｔｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍｏｂｉｌｉｓ属、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ属、Ｈａｈｅｌｌａ属、Ｌｉｍｎｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属、Ｌｉｍｎｏｂａｃｔｅｒ属、Ｐａｒｖｕｌａｒｃｕｌａ属、等を挙げることができ、詳細にはＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｐｉｃｋｅｔｔｉｉ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｄｏｌｏｓａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍａｌｌｅｉ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ａｍｂｉｆａｒｉａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｈｙｍａｔｕｍ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｖｉｅｔｎａｍｉｅｎｓｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌｉｂｉｕｍ ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．、Ａｚｏｈｙｄｒｏｍｏｎａｓ ｌａｔａ、Ｒｈｏｄｏｆｅｒａｘ ｆｅｒｒｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ａｖｅｎａｅ、Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅ、Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｚｏｏｇｌｏｅａ ｒａｍｉｇｅｒａ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ａｖｉｕｍ、Ｈｅｒｍｉｎｉｉｍｏｎａｓ ａｒｓｅｎｉｃｏｘｙｄａｎｓ、Ｌｉｍｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｄｅｃｈｌｏｒｏｍｏｎａｓ ａｒｏｍａｔｉｃａ、Ａｚｏａｒｃｕｓ ｓｐ．、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ、Ｏｃｅａｎｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｐ．、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ、Ｎｉｔｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ａｌｋａｌｉｌｉｍｎｉｃｏｌａ ｅｈｒｌｉｃｈｅｉ、Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ、Ｈａｌｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａ ｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ、Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｇｒｙｐｈｉｓｗａｌｄｅｎｓｅ、Ｒｕｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌａｎｏｐｈｉｌｕｓ、Ｄｅｃｈｌｏｒｏｍｏｎａｓ ａｒｏｍａｔｉｃａ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ａｃｉｄｉｐｈｉｌｉｕｍ ｃｒｙｐｔｕｍ、Ａｚｏａｒｃｕｓ ｓｐ．、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ ｄｅｇｒａｄａｎｓ、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒｏｆｕｎｄｕｍ、Ｃｈｒｏｍｏｈａｌｏｂａｃｔｅｒ ｓａｌｅｘｉｇｅｎｓ、Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｃａｕｌｉｎｏｄａｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｖｉｂｒｉｏ ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｒｕｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌａｎｏｐｈｉｌｕｓ、Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘｕｓ ｃａｓｔｅｎｈｏｌｚｉｉ、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｗｏｌｆｅｉ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｇｇｒｅｇａｎｓ、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ ｘａｎｔｈｕｓ、Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ、Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ、Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ ｈｉｓｐａｎｉｃａ、Ｈａｌｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａ ｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｃｅｎａｒｃｈａｅｕｍ ｓｙｍｂｉｏｓｕｍ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｃｈｌｏｒｏｇｌｏｅｏｐｓｉｓ ｆｒｉｔｓｃｈｉｉ、Ｅｃｔｏｔｈｉｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａ ｓｈａｐｏｓｈｎｉｋｏｖｉｉ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ、Ｎｉｔｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ａｑｕａｅｏｌｅｉ、Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ、Ｈａｈｅｌｌａ ｃｈｅｊｕｅｎｓｉｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ、Ｐａｒｖｕｌａｒｃｕｌａ ｂｅｒｍｕｄｅｎｓｉｓ等が挙げられる。

また、本発明に係る高分子化合物の製造方法は、前記化学的チオエステル交換反応とモノマー生成反応と重合反応とを前記一の反応系内で同時に行う場合には、生成速度および生成収率の観点から、有機溶媒相における前記アセチルチオエステルと水相における前記モノマー前駆体とのモル濃度（ｍｍｏｌ／Ｌ）の比が１対１ないし１０対１であることが好ましい。

また、本発明に係る高分子化合物の製造方法により製造することができる高分子化合物の分子量分布は、上述した製造方法により製造されるものであれば特に限定されないが、高分子化合物の品質および製造の再現性の点から分子量分布が１ないし３が好ましい。

以上のように、本実施形態における、酢酸からアセチルチオエステルを生成するアセチルＣｏＡの生成方法は、ＡＴＰ等の高価な材料や、精製に手間を要し、あるいは扱いに注意を必要とする酵素等を利用することなく、酢酸のように安価な物質を原料としており、工業的にも有用である。また、前記モノマー生成反応では、遊離のモノマー前駆体をそのまま使用することができる。例えば、生成が簡易で安価である乳酸発酵で得られたＬＡ等を用いることができる。すなわち、本発明に係る高分子化合物の製造方法により所望のモノマーを選択して所望の組成を有する高分子化合物を簡便に製造することが可能となる。

次に、本発明に係る高分子化合物の製造方法の一実施形態について説明する。本実施形態においては、酢酸とＥＴＧとからチオエステル化反応によってアセチルＥＴＧを生成し、ヘキサンからなる有機溶媒相にアセチルＥＴＧを加え、さらに、水相にＣｏＡ、ＨＡ、ＣｏＡトランスフェラーゼ、およびＰＨＡシンターゼを加えることにより、前記化学的チオエステル交換反応とモノマー生成反応と重合反応とが段階的に進み、高分子化合物が製造される。

具体的には、まず、ヘキサン相と水相との界面でアセチルＥＴＧとＣｏＡとが化学的チオエステル交換反応し、ヘキサン相中にＥＴＧが遊離するとともに水相にアセチルＣｏＡが生成する。続いて、水相において、アセチルＣｏＡとＨＡとがＣｏＡトランスフェラーゼによってモノマー生成反応し、水相中に酢酸が遊離するとともにＨＡにＣｏＡが付加してＨＡ−ＣｏＡ誘導体が生成する。最後に、水相において、ＨＡ−ＣｏＡがＰＨＡシンターゼによって重合反応し、ＣｏＡが水相中に遊離するとともに高分子化合物が製造される。

重合反応時に水相中に遊離したＣｏＡは再び化学的チオエステル交換反応において再利用するため、ＣｏＡのリサイクリングが生じて連続的にアセチルＣｏＡを供給する。また、モノマー生成反応時に水相中に遊離した酢酸を抽出して、アセチルＥＴＧの原料物質として再利用することもできる。

次に、本実施形態において、酢酸とＥＴＧとを用いてアセチルＣｏＡを生成し、３ＨＢ−ＣｏＡ誘導体の生成を経てＰ（３ＨＢ）を製造する場合について図４、図６（２）、および図７（２）を参照しつつ説明する。

まず、酢酸からチオエステル化反応によって、一段階でアセチルＥＴＧを生成する方法について説明する。図６（２）に示すように、この反応段階では、酢酸をジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）が存在するジクロロメタン（ＣＨ_２Ｃｌ_２）中でＥＴＧと反応させることにより、一段階でアセチルＥＴＧを生成する。

次に、本実施形態において、アセチルＥＴＧおよび３ＨＢからＰ（３ＨＢ）を同一反応系内において製造する製造方法について説明する。つまり、これは、図４に示すように、化学的チオエステル交換反応と、モノマー成分である３ＨＢを３ＨＢ−ＣｏＡ誘導体に変換するモノマー生成反応と、重合反応によりＰ（３ＨＢ）を生成する重合反応とを組み合わせて、同一反応系内において同時に行う製造方法である。

この製造方法では、ヘキサンを用いた有機溶媒相にアセチルＥＴＧを溶解し、水相であるリン酸水素ナトリウム水溶液にＣｏＡと、３ＨＢと、ＰＣＴと、ＰＨＡシンターゼ（ＰｈａＣ）とを加えて、有機溶媒相と水相との界面で化学的チオエステル交換反応をさせ、かつ水相でモノマー生成反応および重合反応をさせることにより、Ｐ（３ＨＢ）を製造する。この時の反応経路を図７（２）に示す。

続いて、本実施形態において、酢酸とＥＴＧとを用いてアセチルＣｏＡを生成し、３ＨＢ−ＣｏＡ誘導体とＬＡ−ＣｏＡ誘導体との生成を経てＰ（３ＨＢ−ｃｏ−ＬＡ）を製造する場合について図５、図６（２）、および図１４を参照しつつ説明する。

まず、酢酸からチオエステル化反応によって、一段階でアセチルＥＴＧを生成する方法について説明する。図６（２）に示すように、この反応段階では、酢酸をジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）が存在するジクロロメタン（ＣＨ_２Ｃｌ_２）中でＥＴＧと反応させることにより、一段階でアセチルＥＴＧを生成する。

次に、本実施形態において、アセチルＥＴＧ、３ＨＢ、およびＬＡからＰ（３ＨＢ−ｃｏ−ＬＡ）を同一反応系内において製造する製造方法について説明する。つまり、これは、図５に示すように、化学的チオエステル交換反応と、モノマー成分である３ＨＢとＬＡとを各々３ＨＢ−ＣｏＡ誘導体とＬＡ−ＣｏＡ誘導体に変換するモノマー生成反応と、重合反応によりＰ（３ＨＢ−ｃｏ−ＬＡ）を生成する重合反応とを組み合わせて、同一反応系内において同時に行う製造方法である。

この製造方法では、ヘキサンを用いた有機溶媒相にアセチルＥＴＧを溶解し、水相であるリン酸水素ナトリウム水溶液にＣｏＡと、３ＨＢと、ＬＡと、ＰＣＴと、ＰｈａＣとを加えて、有機溶媒相と水相との界面で化学的チオエステル交換反応をさせ、水相でモノマー生成反応および重合反応をさせることにより、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−ＬＡ）を製造する。このときの反応経路を図１４に示す。

なお、本実施形態において、有機溶媒相と水相との用量の比率は、有機溶媒相中のアセチルＥＴＧから目的産物であるＰ（３ＨＢ）、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＰ）、またはＰ（３ＨＢ−ｃｏ−ＬＡ）を製造できれば特に限定されないが、より迅速かつ高生産できるという点から、有機溶媒相に存在する前記アセチルＥＴＧと水相に存在するモノマー成分とが濃度（ｍｍｏｌ／ｍＬ）比１対１ないし１０対１であることが好ましい。

また、本実施形態において、ＰＣＴは、アセチルＣｏＡからＣｏＡ基を３ＨＰ、３ＨＢ、またはＬＡに転移することができる酵素を有する微生物由来であれば特に限定されないが、本実施形態では、クロストリジウム・プロピオニカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）、特にクロストリジウム・プロピオニカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）ＪＣＭ１４３０を用いている。

本実施形態において、ＰＨＡシンターゼは、３ＨＢ−ＣｏＡ誘導体、３ＨＰ−ＣｏＡ誘導体、またはＬＡ−ＣｏＡ誘導体のいずれかを重合してＰ（３ＨＢ）、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＰ）、またはＰ（３ＨＢ−ｃｏ−ＬＡ）を合成することのできる酵素を有する微生物由来であれば特に限定されないが、例えば、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属に属する微生物由来やＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属由来のＰＨＡ合成酵素を挙げることができ、詳細には、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）由来やＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．６１−３由来のＰＨＡ合成酵素を挙げることができる。なお、本実施形態においては、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）ＡＴＣＣ１７６９９由来のＰＨＡ合成酵素、および配列番号２で示されるＰＨＡ合成酵素を好適な酵素として用いている。

次に、本実施形態における高分子化合物の製造方法について具体的な実施例を説明する。

実施例１では、酢酸を出発原料としてアセチルチオエステルを生成し、Ｐ（３ＨＢ）を製造する方法を示す。

（１）アセチルチオエステルの生成
まず、酢酸を原料として、アセチルＴＰとアセチルＥＴＧの２種類のアセチルチオエステルを生成した（Yuan, W; Jia, Y.; Tian, J.; Snell, K. D.; Muh, U.; Sinskey, A. J.; Lambalot, R. H.; Walsh, C. T.; Stubbe, J. Arch. Biochem, Biophys. 2001, 394, 87-98.）。アセチルＴＰの生成過程を図６（１）に、アセチルＥＴＧの生成過程を図６（２）に示す。

得られた各物質を薄層クロマトグラフィー｛ＴＬＣ、メルク（Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ Ｆ２５４）｝を用いてエステル化されていることを確認した。また、全体構造に関しては、核磁気共鳴法（ＮＭＲ）を用いた１Ｈ−ＮＭＲスペクトルによって確認した。ＮＭＲ測定は、Ｂｒｕｋｅｒ社製のＭＳＬ４００分光器を用い、周波数４００ＭＨｚにて行った。

（２）ＰＨＡシンターゼ（ＰｈａＣ）
次に、ＰｈａＣの過剰発現系を構築して精製し、精製ＰｈａＣを得た（Satoh, Y.; Tajima, K.; Tannai, H.; Munekata, M. J. Biosci. Bioeng. 2003, 95, 335-341.）。

まず、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）ＡＴＣＣ１７６９９のゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩとＳｍａＩ（いずれもＴＡＫＡＲＡ）によって処理し、ｐＵＣ１８（ＴＡＫＡＲＡ）を用いてＰｈａＣ遺伝子を含む約５ｋｂｐの遺伝子断片をクローニングし、プラスミドｐＴＩ３０５を取得した。

次に、ｐＴＩ３０５における約１．６ｋｂｐのＮｏｔＩ／ＳｔｕＩ断片と、ｐＴＩ３０５をテンプレートして下記条件にてＰＣＲにより増幅した１４０ｂｐのＢａｍＨＩサイトとＳｍａＩサイトを有する断片と、ＢａｍＨＩとＳｍａＩで処理したベクターｐＱＥ３０（キアゲン）との３つを混合してライゲーションした。この反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、形質転換体からＰｈａＣ遺伝子を有するプラスミドｐＱＥＲＥＣを得た。このプラスミドを大腸菌ＢＬ２１に導入し、ＰｈａＣ調製用の大腸菌を作製した。

前記ＰＣＲは、プライマーとして、
センスプライマーaaggatccatggcgaccggcaaaggcgcgg（配列番号３）
アンチセンスプライマーtgcagcggaccggtggcctcggcc（配列番号４）
を用いて、９４℃で４５秒、５８℃で３０秒、７２℃で６０秒の反応を１サイクルとして３０サイクル行った。

得られたＰｈａＣ調製用の大腸菌を、アンピシリンを含む１０００ｍＬのＬＢ培地中において、３０℃で１６時間培養し、菌体内にＰｈａＣを蓄積させ、超音波破砕によって菌体を破壊した後、菌体内の可溶性タンパク質を回収した。この回収したタンパク質をＮｉ−ＮＴＡアガロースゲルカラム（キアゲン）に供し、（６×Ｈｉｓ）−ＰｈａＣをワンステップで精製した。

（３）ＰＣＴ
次に、プラスミドｐＣＣＰＰを大腸菌ＢＬ２１に導入して得られた形質転換体を用いて、クロストリジウム・プロピオニカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）由来のＰＣＴを生産し、ＰｈａＣと同様な手法により精製ＰＣＴを得た。

精製ＰＣＴの活性測定を、モノマー生成反応とＰ（３ＨＢ）重合反応とを組み合わせて行った。つまり、１００ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）、２ｍＭのアセチルＣｏＡ、２００ｍＭの３ＨＢ、ＰｈａＣ、ＰＣＴを含む溶液０．５ｍＬを調製し、Ｐ（３ＨＢ）の生成に伴うＣｏＡ濃度の上昇を観測することで、ＰＣＴの活性を確認した。

（４）Ｐ（３ＨＢ）の製造
そして、前記にて得られたアセチルＴＰまたはアセチルＥＴＧのいずれかと、ＰｈａＣと、ＰＣＴとを用いて、Ｐ（３ＨＢ）を製造した。アセチルＴＰを用いた場合の反応過程を図７（１）に、アセチルＥＴＧを用いた場合の反応過程を図７（２）に示す。

まず、水相反応溶液として、１００ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）と、２．０ｍＭのＣｏＡと、１０ｍＭの（Ｒ）−３ＨＢと、２５Ｕ（１ｍｇ）のＰＣＴとを含む溶液５ｍＬを調製した。次に、有機溶媒相反応溶液として、１０ｍＭのアセチルＴＰまたは１０ｍＭのアセチルＥＴＧを含むヘキサン溶液５ｍＬを調製した。そして、スクリューキャップ付き試験管に水相反応溶液を注ぎ込んだ後、有機溶媒相反応溶液を重相し、最後に５．４Ｕ（０．２ｍｇ）のＰｈａＣを水相に添加して３０℃で４８時間反応させた。反応終了後に有機溶媒相を除去し、５ｍＬのクロロホルムを加え、７０℃で３時間生成物の抽出を行った。抽出液をフィルター（アドバンテック東洋；０．２μｍＰＴＦＥメンブラン）にてろ過し、５０ｍＬのメタノールを加えて４℃で一晩放置した後、生成した沈殿物をフィルター（同前）にてろ過して回収した。真空乾燥後収量を測定し、アセチルＴＰにおいて０．２ｍｇ、およびアセチルＥＴＧにおいて２．９ｍｇの生成物を得た。

得られた各生成物の構造確認をＮＭＲ（同前）によって行い、生成物がＰ（３ＨＢ）であることを確認した。アセチルＥＴＧを用いた場合の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図８に示す。

次に、有機溶媒相反応溶液５００μＬ中のアセチルＥＴＧ濃度を１Ｍ、水相反応溶液５ｍL中の（Ｒ）−３ＨＢ濃度を１００ｍＭとして前記同様に実験を行い、６．６ｍｇの生成物を得た。得られた生成物の構造確認をＮＭＲ測定によって行い、生成物がＰ（３ＨＢ）であることを確認した。その１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図９に示す。

また、得られた化合物の分子量をゲルパミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって測定した。ＧＰＣ測定方法は、ｔａｎｄｅｍ ＴＳＫｇｅｌ ＳｕｐｅｒＨＺＭ−Ｈカラム（東ソー；６．０ｎｍＩ．Ｄ．×１５０ｍｍ）を用い、移動相はクロロホルムを用いて流速０．３ｍＬ／分にて測定し、純正のポリスチレンを用いて検量線を作成した。算出された重量平均分子量（Ｍｗ）は８．５×１０^４、分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）は１．７であった。

本実施例において、最終的に得られたＰ（３ＨＢ）が６．６ｍｇであったのに対し、特許文献４（再表２００４−０６５６０９号公報）においては、最終的に得られるＰ（３ＨＢ）が１．８ｍｇであることから、本実施例では、特許文献４に比べて収率が約４倍であることが分かった。

この結果から、酢酸からアセチルチオエステルを生成する段階と、アセチルチオエステルと遊離のヒドロキシ酸からＰ（３ＨＢ）を合成する段階との、わずか２つの反応工程によって最終目的物質であるＰ（３ＨＢ）を高収率で得ることができることが明らかとなった。

また、酢酸からアセチルＣｏＡを生成するまでの過程において、ＴＰにより生成したアセチルＴＰを用いることも可能ではあるが、ＴＰは毒性が高いため、ＥＴＧにより生成したアセチルＥＴＧを用いてアセチルＣｏＡを生成することが好適であるといえる。さらに、精製酵素や高価なＡＴＰを用いることなく、安価な酢酸からアセチルＣｏＡを生成することができる点においても、工業化に優れているといえる。

実施例２では、アセチルチオエステルの種類によるＰ（３ＨＢ）の重合反応速度および製造量の検討を行った。

アセチルチオエステルは、アセチルＴＰとアセチルＥＴＧとを用いて行った。ここで、Ｐ（３ＨＢ）の製造過程では、Ｐ（３ＨＢ）の重合反応により反応溶液が白濁して沈殿が生じ、重合反応終了時には反応溶液が透明になり白沈が残る。このため、肉眼および反応溶液の濁度測定によって、Ｐ（３ＨＢ）の製造進度を知ることができる。そこで、Ｐ（３ＨＢ）の製造進度を、吸光光度計にて反応溶液の濁度を測定することにより行った。

具体的には、１００ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）と、１０ｍＭの（Ｒ）−３ＨＢと、２．０ｍＭのＣｏＡと、７．５Ｕ（０．３ｍｇ）のＰＣＴとを含む水相反応溶液１．５ｍＬを調製し、これに１０ｍＭのアセチルＴＰまたはアセチルＥＴＧを含むヘキサン溶液である有機溶媒相反応溶液１．５ｍＬを重相した。最後に１．６Ｕ（０．０６ｍｇ）のＰｈａＣを水相反応溶液に添加して３０℃で反応させて、波長６００ｎｍで吸光光度計（日立ハイテクノロジーズ）にて反応溶液の濁度を測定した。その結果を図１０に示す。

図１０に示すように、アセチルＥＴＧ（図１０中の●）を用いた場合は反応溶液の吸光度が上昇し、３２０分で０．７８に達した後、低下していくことが示された。肉眼では、６０分後には白濁し始めて、１２０分後には白沈殿が観察された。一方、アセチルＴＰ（図１０中の○）を用いた場合は、５００分経過した後でもピークに達することなく、反応溶液の吸光度は０．２以下であった。よって、アセチルＴＰに比べてアセチルＥＴＧは、反応が速く進み、生成産物の収量が高いことが明らかとなった。

ＴＰはＰｈａＣの活性阻害を有する等、毒性の高いことが知られている。アセチルＥＴＧはアセチルＴＰと異なり、ＴＰを使用することなく生成されるだけでなく、Ｐ（３ＨＢ）を迅速かつ高収率に合成することができ、工業化に好適であることが本実施例により明らかとなった。

実施例３では、有機溶媒相中のアセチルＥＴＧと水相中の（Ｒ）−３ＨＢとの濃度比率を変化させてＰ（３ＨＢ）の合成反応速度の検討を行った。

まず、有機溶媒相反応溶液として、０．５ｍモルのアセチルＥＴＧを含むヘキサン溶液を調製し、水相反応溶液として、０．５ｍモルの（Ｒ）−３ＨＢと、１００ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）と、２．０ｍＭのＣｏＡと、７．５Ｕ（０．３ｍｇ）のＰＣＴとを含む溶液１．５ｍＬを調製した。この有機溶媒相反応溶液中のアセチルＥＴＧ量と、水相反応溶中の（Ｒ）−３ＨＢ量とを一定にしたまま、有機溶媒相反応溶液の溶量を変化させ、有機溶媒と水相の反応溶液を容量比率０．１対１（図１１の□）、０．５対１（図１１の▲）、１対１（図１１の●）で重相した系を作製した。そして、１．６Ｕ（０．０６ｍｇ）のＰｈａＣを水相に添加して３０℃で反応させた。各系の反応溶液の濁度を波長６００ｎｍで吸光光度計にて測定した。

その結果、図１１に示すように、吸光度がピークに到達する時間とピークの吸光度は、有機溶媒相の容量比率が高くなるにつれて、長くまたは低くなることが示された。そして、有機溶媒相と水相の比率が０．１対１（図１１の□）の系では、反応開始１０分後には白濁し始めて６０分後には吸光度がピークに到達しており、他の系に比べて吸光度がピークに到達する時間が最も短く、吸光度も最も高い値が示された。

この結果から、有機溶媒相と水相との容量比率が１対１ないし０．１対１である場合、つまり、アセチルＥＴＧと（Ｒ）−３ＨＢとの濃度（ｍｍｏｌ／Ｌ）比が１対１ないし１０対１である場合において、Ｐ（３ＨＢ）を迅速かつ高収率に合成することができ、工業化に非常に優れていることが示され、特にモル濃度比が１０対１である場合がもっとも好適であることが明らかとなった。

実施例４では、実施例１の（１）〜（３）で得られたアセチルＥＴＧと、ＰｈａＣと、ＰＣＴとを用いて、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＰ）を製造した。この反応過程を図１２に示す。

まず、水相反応溶液として、１００ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）と、２．０ｍＭのＣｏＡと、５０ｍＭの３ＨＰまたは５０ｍＭの（Ｒ）−３ＨＢと、４．３Ｕ（２．５ｍｇ）のＰＣＴとを含む溶液５ｍＬを調製した。次に、有機溶媒相反応溶液として、１．０ＭのアセチルＥＴＧを含むヘキサン溶液５００μＬを調製した。そして、スクリューキャップ付き試験管に水相反応溶液を注ぎ込んだ後、有機溶媒相反応溶液を重相し、最後に５Ｕ（２．５ｍｇ）のＰｈａＣを水相に添加して、３０℃で２４時間反応させた。反応終了後に有機溶媒相を除去し、５ｍＬのクロロホルムを加え、７０℃で３時間生成物の抽出を行った。抽出液をフィルター（アドバンテック東洋；０．２μｍＰＴＦＥメンブラン）にてろ過し、５０ｍＬのメタノールを加えて４℃で一晩放置した後、生成した沈殿物をフィルター（同前）にてろ過して回収した。真空乾燥の収量を測定し、生成物３．２ｍｇを得た。

得られた各生成物の構造確認をＮＭＲによって行い、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＰ）であることを確認した。その１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１３に示す。

この結果から、本実施形態に係る製造方法は、Ｐ（３ＨＢ）のみならずＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＰ）の製造が可能であることが明らかとなった。

実施例５では、実施例１の（１）、（３）で得られたアセチルＥＴＧとＰＣＴ、および以下の方法で調製したＰｈａＣとを用いて、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−ＬＡ）を製造した。この反応過程を図１４に示す。

（１）ＰｈａＣ
ＰｈａＣの過剰発現系を構築して精製し、精製ＰｈａＣを得た（Satoh, Y.; Tajima, K.; Tannai, H.; Munekata, M. J. Biosci. Bioeng. 2003, 95, 335-341.）。

まず、特許文献ＷＯ２００３−１０００５５号公報に開示されているシュードモナスｓｐ．（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）６１−３由来のＰｈａＣを示す配列番号２のアミノ酸配列について、これをコードするＤＮＡ断片（配列番号１）を化学的に合成した。このＤＮＡ断片を、制限酵素ＳａｃＩ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて処理したｐＵＣ１９（ＴＡＫＡＲＡ）に挿入し、プラスミドｐＵＣ１ｄｍを取得した。

次に、ｐＵＣ１ｄｍをテンプレートとし、下記条件にてＰＣＲにより増幅した１．６ｋｂｐのＢａｍＨＩサイトとＨｉｎｄＩＩＩサイトとを有する断片を、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで処理したベクターｐＱＥ３０（キアゲン）にライゲーションした。この反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、形質転換体から前記ＰｈａＣ遺伝子を有するプラスミドｐＱＣ１ｄｍを得た。このプラスミドを大腸菌ＢＬ２１に導入し、ＰｈａＣ調製用の大腸菌を作製した。

前記ＰＣＲは、プライマーとして、
センスプライマーccggatccagtaacaagaatagcgatgacttga（配列番号５）
アンチセンスプライマーtttaagcttaacgttcatgcacatacgtg（配列番号６）
を用いて、９４℃で６０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１００秒の各反応を１サイクルとして３０サイクル行った。

得られたＰｈａＣ調製用の大腸菌を、アンピシリンを含む１０００ｍＬのＬＢ培地中において３０℃で３時間培養後、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオ-ガラクトピレノシド）を終濃度０．２５ｍＭになるように添加し、さらに３０℃で１６時間培養した。菌体内にＰｈａＣを蓄積させ、超音波破砕によって菌体を破壊した後、菌体内の可溶性タンパク質を回収した。この回収したタンパク質をＮｉ−ＮＴＡアガロースゲルカラム（キアゲン）に供し、（６×Ｈｉｓ）−ＰｈａＣをワンステップで精製した。

（２）Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−ＬＡ）の製造
まず、水相反応溶液として、１００ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）と、１．０ｍＭのＣｏＡと、５０ｍＭのＬＡ（Ｄ−乳酸）と、５０ｍＭの（Ｒ）−３ＨＢと、５０Ｕ（２．５ｍｇ）のＰＣＴとを含む溶液５ｍＬを調製した。次に、有機溶媒相反応溶液として、１００ｍＭのアセチルＥＴＧを含むヘキサン溶液５ｍＬを調製した。そして、スクリューキャップ付き試験管に水相反応溶液を注ぎ込んだ後、有機溶媒相反応溶液を重相し、０．０５Ｕ（２．５ｍｇ）のＰｈａＣを水相に添加して、３０℃で７２時間反応させた。反応終了後に有機溶媒相を除去し、５ｍＬのクロロホルムを加え、７０℃で３時間生成物の抽出を行った。抽出液をフィルター（アドバンテック東洋；０．２μｍＰＴＦＥメンブラン）にてろ過し、５０ｍＬのメタノールを加えて４℃で一晩放置した後、生成した沈殿物をフィルター（同前）にてろ過して回収した。真空乾燥の収量を測定し、生成物０．１ｍｇを得た。

得られた各生成物の構造確認をＮＭＲによって行い、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−ＬＡ）であることを確認した。その１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１５に示す。

この結果から、本実施形態に係る製造方法は、Ｐ（３ＨＢ）およびＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＰ）のみならずＰ（３ＨＢ−ｃｏ−ＬＡ）の製造が可能であることが明らかとなった。

実施例６では、前記実施例１〜４で実施されている、水相−有機溶媒相である二相系を用いた高分子化合物の製造方法が、（Ｒ）−３ＨＢや３ＨＰ以外のヒドロキシ酸または不飽和脂肪酸についても適応可能であることをさらに調べるために、ＰＣＴの基質特異性の検討を行った。ＰＣＴは実施例１（３）で得られたクロストリジウム・プロピオニカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）由来のものを使用した。

実施例１（３）の方法において、（Ｒ）−３ＨＢに代えて種々のヒドロキシ酸または不飽和脂肪酸を添加し、ＰｈａＣを添加しない状態で２４時間反応を行った。得られた化合物をＨＰＬＣ（島津製作所）によって確認した。ＨＰＬＣ測定方法は、Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８ ＧＰ Ａｑｕａカラム（関東化学；４．６ｎｍＩ．Ｄ．×１５０ｍｍ）を用い、移動相は、Ａ液：１０ｗｔ％メタノール含有５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４溶液、Ｂ液：４０ｗｔ％メタノール含有５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４溶液とし、Ｂ液の割合を、０％（０〜５分）、０→２０％（５〜１０分）、２０→１００％（１５〜１７．５分）、１００％（１７．５〜２２．５分）、１００→０％（２２．５〜２５分）、０％（２５〜３０分）とした。流速は０．７ｍＬ／分で、検出器は紫外可視分光光度計を使用した。

その結果、ＰＣＴの基質、つまりモノマー成分となるヒドロキシ酸または不飽和脂肪酸として、ＬＡ、３ＨＰ、３ＨＢ、４ＨＢ、クロトネート、ペンテネート、セリン、グリコレート、アクリレートが適応可能であることが示された。

なお、本実施例においてはクロストリジウム・プロピオニカム由来のＰＣＴを使用したが、他菌種由来のＰＣＴを使用した場合には、本実施例以外のヒドロキシ酸も適応可能となると考えられる。つまり、ヒドロキシ酸、ＰＣＴの由来菌種、およびＰＨＡシンターゼの由来菌種を適宜選択することにより、所望のモノマー組成を有する高分子化合物を製造することが可能である。

以上のように、本実施形態によれば、
１．従来の合成法に比べて、迅速かつ高収率で高分子化合物を製造することができる、
２．酢酸からアセチルチオエステルを生成する段階と、アセチルチオエステルと遊離のヒドロキシ酸とから高分子化合物を合成する段階との、わずか２つの簡便な反応工程によって高分子化合物を得ることができる、
３．安価な酢酸から精製酵素や高価なＡＴＰ、毒性の高いチオフェノールを使用することなくアセチルＣｏＡを生成するとともに、高分子化合物を迅速かつ高収率に合成することができる、
４．選択できるモノマー成分の幅が広く、所望の組成を有する高分子化合物を製造することができる
等、工業化に非常に優れた製造方法で生分解性を有する高分子化合物を製造することができる。

なお、本発明に係る高分子化合物の製造方法は、前述した実施形態に限定されるものではなく、適宜変更することができる。

アセチルチオエステルからアセチルＣｏＡを生成し、モノマー前駆体−ＣｏＡ誘導体の生成を経て高分子化合物を製造する反応経路を示す図である。 アセチルチオエステルからアセチルＣｏＡを生成し、モノマー前駆体−ＣｏＡ誘導体の生成を経て高分子化合物を同一系内で製造する反応経路を示す図である。 酢酸からアセチルチオエステルを生成するチオエステル反応を示す図である。 アセチルＥＴＧからアセチルＣｏＡを生成し、モノマー前駆体−ＣｏＡ誘導体の生成を経てＰ（３ＨＢ）を同一系内で製造する反応経路を示す図である。 アセチルＥＴＧからアセチルＣｏＡを生成し、モノマー前駆体−ＣｏＡ誘導体の生成を経てＰ（３ＨＢ−ｃｏ−ＬＡ）を同一系内で製造する反応経路を示す図である。 実施例１において、（１）酢酸からアセチルＴＰを生成する反応と、（２）酢酸からアセチルＥＴＧを生成する反応とを示す図である。 実施例１において、（１）アセチルＴＰからアセチルＣｏＡを生成し（Ｒ）−３ＨＢ−ＣｏＡの生成を経てＰ（３ＨＢ）を製造する反応経路と、（２）アセチルＥＴＧからアセチルＣｏＡを生成し（Ｒ）−３ＨＢ−ＣｏＡの生成を経てＰ（３ＨＢ）を製造する反応経路とを示す図である。図中のｎは、１以上の整数である。 実施例１において、モノマー前駆体と等濃度のアセチルＥＴＧを用いることによって得られた化合物のＮＭＲ測定結果を示す図である。 実施例１において、モノマー前駆体の１０倍濃度のアセチルＥＴＧを用いることによって得られた化合物のＮＭＲ測定結果を示す図である。 実施例２における、アセチルチオエステルの種類によるＰ（３ＨＢ）の合成反応速度および合成量の測定結果を示す図である。 実施例３において、アセチルＥＴＧを含む有機溶媒相と（Ｒ）−３ＨＢを含む水相との容量比率の違いによるＰ（３ＨＢ）の製造反応速度および製造量の測定結果である。 実施例４において、アセチルＥＴＧからアセチルＣｏＡを生成し（Ｒ）−３ＨＢ−ＣｏＡまたは３ＨＰ−ＣｏＡの生成を経てＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＰ）を製造する反応経路を示す図である。図中のｘおよびｙは、１以上の整数である。 実施例４において得られた化合物のＮＭＲ測定結果を示す図である。 実施例５において、アセチルＥＴＧからアセチルＣｏＡを生成し（Ｒ）−３ＨＢ−ＣｏＡまたはＬＡ−ＣｏＡの生成を経てＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＬＡ）を製造する反応経路を示す図である。図中のｘおよびｙは、１以上の整数である。 実施例５において得られた化合物のＮＭＲ測定結果を示す図である。

Claims (14)

1. 高分子化合物を製造する方法であって、
   アセチルチオエステルとＣｏＡとからアセチルＣｏＡを生成する化学的チオエステル交換反応と、
   少なくとも一のモノマー前駆体と前記アセチルＣｏＡとからモノマー前駆体−ＣｏＡ誘導体に変換するモノマー生成反応と、
   前記モノマー前駆体−ＣｏＡ誘導体を重合して前記モノマーユニットからなる前記高分子化合物を生成する重合反応と
   を有する高分子化合物の製造方法。
2. 請求項１において、前記モノマー前駆体がヒドロキシ酸であり、かつヒドロキシ酸のユニットからなる高分子化合物を生成する高分子化合物の製造方法。
3. 請求項２において、前記ヒドロキシ酸がヒドロキシアルカノエートおよびセリンの少なくともいずれかである高分子化合物の製造方法。
4. 請求項３において、前記ヒドロキシアルカノエートが、乳酸、３−ヒドロキシプロピオネート、３−ヒドロキシブチレート、および４−ヒドロキシブチレートからなる群から少なくとも一つ選ばれる高分子化合物の製造方法。
5. 請求項３または請求項４において、前記乳酸がＤ−乳酸である高分子化合物の製造方法。
6. 請求項１から請求項５のいずれかにおいて、前記化学的チオエステル交換反応が、前記重合反応においてモノマー前駆体−ＣｏＡ誘導体から遊離するＣｏＡと前記アセチルチオエステルとからアセチルＣｏＡを生成する反応である高分子化合物の製造方法。
7. 請求項１から請求項６のいずれかにおいて、前記アセチルチオエステルがチオール化合物と酢酸とを用いたチオエステル化反応によって生成する高分子化合物の製造方法。
8. 請求項７において、前記酢酸が、前記モノマー生成反応において遊離する酢酸である高分子化合物の製造方法。
9. 請求項７または請求項８において、前記チオール化合物がエチルチオグリコレート（ＥＴＧ）である高分子化合物の製造方法。
10. 請求項１から請求項９のいずれかにおいて、前記モノマー生成反応に用いられる酵素がアセチルＣｏＡを基質とする酵素であることを特徴とする高分子化合物の製造方法。
11. 請求項１から請求項１０のいずれかにおいて、前記化学的チオエステル交換反応と前記モノマー生成反応と前記重合反応とが一の反応系内にある高分子化合物の製造方法。
12. 請求項１１において、前記一の反応系が、前記アセチルチオエステルを含有する有機溶媒相と、前記ＣｏＡと前記モノマー前駆体と前記モノマー生成反応を触媒する酵素と前記重合反応を触媒する酵素とを含有する水相とからなる高分子化合物の製造方法。
13. 請求項１２において、前記アセチルチオエステルと前記モノマー前駆体とのモル濃度の比が、１対１ないし１０対１である高分子化合物の製造方法。
14. 請求項１から請求項１３のいずれかにおいて、前記高分子化合物の分子量分布が１ないし３である高分子化合物の製造方法。