JP7102514B2 - 微生物を用いたポリ（３－ヒドロキシプロピオネート－ｂ－ラクテート）ブロック共重合体 - Google Patents
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- C12Y102/01—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.2.1)
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- C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
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Description
関連出願との相互引用
本出願は２０１８年３月１５日付韓国特許出願第１０－２０１８－００３０５２２号に基づいた優先権の利益を主張し、当該韓国特許出願の文献に開示された全ての内容は本明細書の一部として含まれる。
本出願は２０１８年３月１５日付韓国特許出願第１０－２０１８－００３０５２２号に基づいた優先権の利益を主張し、当該韓国特許出願の文献に開示された全ての内容は本明細書の一部として含まれる。
本発明は、ポリ（３－ヒドロキシプロピオネート－ｂ－ラクテート）ブロック共重合体の製造方法に関し、具体的に、組換え微生物を使用してポリ（３－ヒドロキシプロピオネート－ｂ－ラクテート）ブロック共重合体を製造する方法に関するものである。
ラクテートを単量体とする重合体であるポリラクテート（ＰＬＡ）は、代表的な生分解性高分子であって汎用高分子あるいは医療用高分子としての応用性が高い高分子である。現在ＰＬＡは微生物発酵によって生産されたラクテートを重合して製造されているが、ラクテートの直接重合によっては低い分子量（１０００－５０００ダルトン）のＰＬＡのみが生成される。１００，０００ダルトン以上のＰＬＡを合成するためにはラクテートの直接重合で得られた低い分子量のＰＬＡから鎖カップリング剤（ｃｈａｉｎ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ａｇｅｎｔ）を用いて、より分子量の大きいＰＬＡに重合する方法があるが、鎖カップリング剤を用いるため高分子量のＰＬＡを製造する方法は有機溶剤やカップリング剤の添加によって工程が複雑になり、またこれらの除去が容易でないという短所がある。現在商用化されている高分子量ＰＬＡ生産工程では、ラクテートをラクチド（ｌａｃｔｉｄｅ）に転換した後、ラクチド環の開環縮合反応を通じてＰＬＡを合成する化学合成方法が使用されている。
しかし、このようなＰＬＡは脆性（ｂｒｉｔｔｌｅｎｅｓｓ）が良くないため、これを改善するために伸びの良い３－ヒドロキシプロピオネート（３－ＨＰ）を添加してポリ（３－ヒドロキシプロピオネート－ｒ－ラクテート）（Ｐ（３ＨＰ－ｒ－ＬＡ））ランダム共重合体を開発することが報告されたことがある。しかし、このようなポリ（３－ヒドロキシプロピオネート－ｒ－ラクテート）は結晶化されず良くない物性を有するという問題点を有していた。
よって、本発明者らは従来のポリラクテートおよびＰ（３ＨＰ－ｒ－ＬＡ）ランダム共重合体の問題点を改善するために、乳酸を生合成しないように改良されＰＨＡ合成酵素の遺伝子で形質転換された組換え大腸菌を培養することによって、ＰＬＡとＰ（３ＨＰ）がブロック共重合体［ポリ（３－ヒドロキシプロピオネート－ｂ－ラクテート）（Ｐｏｌｙ（３－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ－ｂ－ｌａｃｔａｔｅ））］を生合成した。また、このようなブロック共重合体が従来のポリラクテートおよびＰ（３ＨＰ－ｒ－ＬＡ）ランダム共重合体で問題になった脆性などの問題点が顕著に改善されたものであるのを確認して本発明を完成するようになった。
Ｐａｒｋ、Ｓ．Ｊ．、ｅｔ ａｌ．、Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ ｆｏｒ ｔｈｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ２－ｈｙｄｒｏｘｙａｃｉｄ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ、Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．２０、２０－２８（２０１３）
本発明は、乳酸を生合成しないように改良された組換え微生物を３－ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ（３－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎｙｌ－ＣｏＡ）生合成遺伝子およびポリヒドロキシアルカノエート（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ：ＰＨＡ）合成酵素遺伝子を含むベクター、およびラクテート生合成遺伝子およびラクテート（ｌａｃｔａｔｅ）をラクチルＣｏＡ（ｌａｃｔｙｌ－ＣｏＡ）に転換する酵素の遺伝子を含むベクターで形質転換させて製造された組換え微生物を提供することを目的とする。
また、本発明は、前記組換え微生物を２段階の培養を行ってポリ（３－ヒドロキシプロピオネート－ｂ－ラクテート）ブロック共重合体を製造する方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、前記組換え微生物を含む、ポリ（３－ヒドロキシプロピオネート－ｂ－ラクテート）ブロック共重合体製造用組成物を提供することを目的とする。
また、本発明は、前記方法によって製造されたポリ（３－ヒドロキシプロピオネート－ｂ－ラクテート）ブロック共重合体を提供することを目的とする。
以下、本発明をさらに詳しく説明する。
前記のような目的を達成するための一つの様態として、本発明は、下記の段階を含む３－ヒドロキシプロピオネート－ラクテートブロック共重合体［Ｐ（３ＨＰ－ｂ－ＬＡ）］の製造方法および前記製造方法によって生産された３－ヒドロキシプロピオネート－ラクテートブロック共重合体に関するものである：
（ａ）乳酸を生合成しないように改良された組換え微生物を３－ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ（３－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎｙｌ－ＣｏＡ）生合成遺伝子およびポリヒドロキシアルカノエート（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ：ＰＨＡ）合成酵素遺伝子を含むベクター、およびラクテート生合成遺伝子およびラクテート（ｌａｃｔａｔｅ）をラクチルＣｏＡ（ｌａｃｔｙｌ－ＣｏＡ）に転換する酵素の遺伝子を含むベクターで形質転換させて組換え微生物を製造する段階；
（ｂ）前記段階（ａ）で製造された組換え微生物をグリセロールを炭素源として使用して培養してＰ（３ＨＰ）を合成する段階；
（ｃ）ＩＰＴＧおよびグルコースを投入してＰ（３ＨＰ）生産を抑制し、ラクテート生合成酵素および乳酸をラクチルＣｏＡ（ｌａｃｔｙｌ－ＣｏＡ）転換酵素が発現されるようにして段階（ａ）で合成されたＰ（３ＨＰ）末端にＰＬＡを生合成させる段階。
（ａ）乳酸を生合成しないように改良された組換え微生物を３－ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ（３－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎｙｌ－ＣｏＡ）生合成遺伝子およびポリヒドロキシアルカノエート（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ：ＰＨＡ）合成酵素遺伝子を含むベクター、およびラクテート生合成遺伝子およびラクテート（ｌａｃｔａｔｅ）をラクチルＣｏＡ（ｌａｃｔｙｌ－ＣｏＡ）に転換する酵素の遺伝子を含むベクターで形質転換させて組換え微生物を製造する段階；
（ｂ）前記段階（ａ）で製造された組換え微生物をグリセロールを炭素源として使用して培養してＰ（３ＨＰ）を合成する段階；
（ｃ）ＩＰＴＧおよびグルコースを投入してＰ（３ＨＰ）生産を抑制し、ラクテート生合成酵素および乳酸をラクチルＣｏＡ（ｌａｃｔｙｌ－ＣｏＡ）転換酵素が発現されるようにして段階（ａ）で合成されたＰ（３ＨＰ）末端にＰＬＡを生合成させる段階。
以下、各段階を詳細に説明する。
段階（ａ）では、まずＰ（３ＨＰ－ｂ－ＬＡ）ブロック共重合体の製造のために、乳酸を生合成しないように改良された組換え微生物に３－ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ（３－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎｙｌ－ＣｏＡ）およびポリヒドロキシアルカノエート（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ：ＰＨＡ）合成酵素遺伝子を含むベクターと、ラクテート生合成酵素遺伝子およびラクテート（ｌａｃｔａｔｅ）をラクチルＣｏＡ（ｌａｃｔｙｌ－ＣｏＡ）に転換する酵素の遺伝子を含むベクターを用いて形質転換して組換え微生物を製造する。
乳酸を生合成しないように改良された組換え微生物は、組換え微生物が内在するラクテート脱水素酵素（Ｌｄｈ）、例えば、ラクテート脱水素酵素Ａ（ＬｄｈＡ）が不活性化されるようにノックアウトされたものであってもよい。
前記３－ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ（３－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎｙｌ－ＣｏＡ）生合成関連酵素およびＰＨＡ合成酵素をコーディングする遺伝子を含むベクター、およびラクテート生合成関連酵素遺伝子およびラクテート（ｌａｃｔａｔｅ）をラクチルＣｏＡ（ｌａｃｔｙｌ－ＣｏＡ）に転換する酵素の遺伝子を含むベクターを通常の遺伝子組換えベクター製造方法によって製造することができ、公知の形質転換微生物の製造方法（例えば、電気穿孔など）によって微生物細胞内に導入することができる。
前記３－ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ（３－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎｙｌ－ＣｏＡ）生合成関連酵素をコーディングする遺伝子は好ましくは、グリセロールデヒドラターゼ（ＤｈａＢ１（配列番号１）、ＤｈａＢ２（配列番号３）、ＤｈａＢ３（配列番号５）のサブユニットからなる）グリセロールデヒドラターゼアクチバーゼ（ＧｄｒＡ（配列番号７）およびＧｄｒＢのサブユニット（配列番号９）からなる）、ＣｏＡ－依存プロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼおよびアルデヒドデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子であってもよい。好ましくは、グリセロールデヒドラターゼ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＥＣ ４．２．１．３０）をコーディングする遺伝子はｄｈａＢ１２３（ｄｈａＢ１（配列番号２）、ｄｈａＢ２（配列番号４）、ｄｈａＢ３（配列番号６））、グリセロールデヒドラターゼアクチバーゼ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＥＣ ４．２．１．３０）をコーディングする遺伝子はｇｄｒＡＢ（ｇｄｒＡ（配列番号８）およびｇｄｒＢ（配列番号１０）のサブユニットからなる）、ＣｏＡ－依存プロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＥＣ １．２．１．３；配列番号１１）をコーディングする遺伝子はｐｄｕＰ（配列番号１２）であってもよい。
前記ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ（ＰＨＡ） ｓｙｎｔｈａｓｅ）はＣｏＡとヒドロキシ脂肪酸（ｈｙｄｒｏｘｙ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ）のチオエステルを基質として使用してポリヒドロキシアルカノエートを生合成する酵素であって、炭素数３－５の脂肪酸を使用するタイプ（例えば、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｌａｔｕｓなどの多様なバクテリア由来）と炭素数６－１４の脂肪酸を使用するタイプ（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属由来）のものであってもよい。
例えば、前記ＰＨＡ合成酵素およびこれをコーディングする遺伝子は、キュープリアビダスネカター（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６）に由来したＰＨＡ合成酵素ＲｅＣ（配列番号：１３；Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＥＣ２．３．１．Ｂ２、遺伝子ｒｅＣ；Ｇｅｎｅｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｊ０５００３．１、配列番号１４）の変異体コーディング遺伝子のＳ５０６ＧおよびＡ５１０Ｋアミノ酸置換変異体およびこれをコーディングする遺伝子（ｒｅＣ＿ＧＫ）であってもよい。
前記ラクテート生合成酵素はグルコースから乳酸を生合成する酵素であって、例えばペディオコッカスアシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉに由来したラクテート脱水素酵素（Ｌｄｈ）、例えばラクテート脱水素酵素Ａ（ＬｄｈＡ）またはラクテート脱水素酵素Ｄ（ＬｄｈＤ）（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＥＣ １．１．１．２８（配列番号１５）をコーディングする遺伝子（ｌｄｈＡ、ｌｄｈＤ（９９６ｂｐ、Ｇｅｎｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：Ｘ７０９２５．１、配列番号１６）であってもよい。
前記ラクテートをラクチルＣｏＡに転換する時、酵素は、例えば、プロピオニルＣｏＡ転移酵素（ｐｃｔ）であってもよい。プロピオニルＣｏＡ転移酵素は、次の反応式１の化学反応を触媒する酵素である：
［反応式１］
アセチルＣｏＡ（ａｃｅｔｙｌ－ＣｏＡ）＋プロピノエート（ｐｒｏｐｉｎｏａｔｅ）⇔アセテート（ａｃｅｔａｔｅ）＋プロピオニルＣｏＡ（ｐｒｏｐｉｏｎｙｌ－ＣｏＡ）。
［反応式１］
アセチルＣｏＡ（ａｃｅｔｙｌ－ＣｏＡ）＋プロピノエート（ｐｒｏｐｉｎｏａｔｅ）⇔アセテート（ａｃｅｔａｔｅ）＋プロピオニルＣｏＡ（ｐｒｏｐｉｏｎｙｌ－ＣｏＡ）。
前記酵素およびこれをコーディングする遺伝子は、クロストリジウムプロピオニクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）に由来したものであってもよい。
例えば、前記プロピオニルＣｏＡ転移酵素コーディング遺伝子は、
（ａ）配列番号１７の塩基配列；
（ｂ）配列番号１７の塩基配列でＡ１２００Ｇ（１２００番目塩基であるＡがＧで置換された変異を意味する；以下記載される塩基配列変異表現に同様に適用される）の変異を含む塩基配列；
（ｃ）配列番号１７の塩基配列でＴ７８Ｃ、Ｔ６６９Ｃ、Ａ１１２５ＧおよびＴ１１５８Ｃの変異を含む塩基配列；
（ｄ）配列番号１７の塩基配列でＡ１２００Ｇの変異を含み、配列番号１７と対応するアミノ酸配列でＧ３３５Ａ（３３５番目アミノ酸ＧｌｙがＡｌａで置換された変異を意味する、以下記載されるアミノ酸配列変異表現に同様に適用される）の変異を含むアミノ酸配列をコーディングする塩基配列；
（ｅ）配列番号１７の塩基配列でＡ１２００Ｇの変異を含み、配列番号１７と対応するアミノ酸配列でＡ２４３Ｔの変異が含まれているアミノ酸配列をコーディングする塩基配列；
（ｆ）配列番号１７の塩基配列でＴ６６９Ｃ、Ａ１１２５ＧおよびＴ１１５８Ｃの変異を含み、配列番号１７と対応するアミノ酸配列でＤ６５Ｇの変異を含むアミノ酸配列をコーディングする塩基配列；
（ｇ）配列番号１７の塩基配列でＡ１２００Ｇの変異を含み、配列番号１７と対応するアミノ酸配列でＤ２５７Ｎの変異を含むアミノ酸配列をコーディングする塩基配列；
（ｈ）配列番号１７の塩基配列でＴ６６９Ｃ、Ａ１１２５ＧおよびＴ１１５８Ｃの変異を含み、配列番号１７と対応するアミノ酸配列でＤ６５Ｎの変異を含むアミノ酸配列をコーディングする塩基配列；
（ｉ）配列番号１７の塩基配列でＴ６６９Ｃ、Ａ１１２５ＧおよびＴ１１５８Ｃの変異を含み、配列番号１７と対応するアミノ酸配列でＴ１９９Ｉの変異を含むアミノ酸配列をコーディングする塩基配列；および
（ｊ）配列番号１７の塩基配列でＴ７８Ｃ、Ｔ６６９Ｃ、Ａ１１２５ＧおよびＴ１１５８Ｃの変異を含み、配列番号１７と対応するアミノ酸配列でＶ１９３Ａの変異を含むアミノ酸配列をコーディングする塩基配列
からなる群より選択された塩基配列を含むものであってもよく、前記プロピオニルＣｏＡ転移酵素は前記塩基配列によってコーディングされるアミノ酸配列を含むものであってもよい。
（ａ）配列番号１７の塩基配列；
（ｂ）配列番号１７の塩基配列でＡ１２００Ｇ（１２００番目塩基であるＡがＧで置換された変異を意味する；以下記載される塩基配列変異表現に同様に適用される）の変異を含む塩基配列；
（ｃ）配列番号１７の塩基配列でＴ７８Ｃ、Ｔ６６９Ｃ、Ａ１１２５ＧおよびＴ１１５８Ｃの変異を含む塩基配列；
（ｄ）配列番号１７の塩基配列でＡ１２００Ｇの変異を含み、配列番号１７と対応するアミノ酸配列でＧ３３５Ａ（３３５番目アミノ酸ＧｌｙがＡｌａで置換された変異を意味する、以下記載されるアミノ酸配列変異表現に同様に適用される）の変異を含むアミノ酸配列をコーディングする塩基配列；
（ｅ）配列番号１７の塩基配列でＡ１２００Ｇの変異を含み、配列番号１７と対応するアミノ酸配列でＡ２４３Ｔの変異が含まれているアミノ酸配列をコーディングする塩基配列；
（ｆ）配列番号１７の塩基配列でＴ６６９Ｃ、Ａ１１２５ＧおよびＴ１１５８Ｃの変異を含み、配列番号１７と対応するアミノ酸配列でＤ６５Ｇの変異を含むアミノ酸配列をコーディングする塩基配列；
（ｇ）配列番号１７の塩基配列でＡ１２００Ｇの変異を含み、配列番号１７と対応するアミノ酸配列でＤ２５７Ｎの変異を含むアミノ酸配列をコーディングする塩基配列；
（ｈ）配列番号１７の塩基配列でＴ６６９Ｃ、Ａ１１２５ＧおよびＴ１１５８Ｃの変異を含み、配列番号１７と対応するアミノ酸配列でＤ６５Ｎの変異を含むアミノ酸配列をコーディングする塩基配列；
（ｉ）配列番号１７の塩基配列でＴ６６９Ｃ、Ａ１１２５ＧおよびＴ１１５８Ｃの変異を含み、配列番号１７と対応するアミノ酸配列でＴ１９９Ｉの変異を含むアミノ酸配列をコーディングする塩基配列；および
（ｊ）配列番号１７の塩基配列でＴ７８Ｃ、Ｔ６６９Ｃ、Ａ１１２５ＧおよびＴ１１５８Ｃの変異を含み、配列番号１７と対応するアミノ酸配列でＶ１９３Ａの変異を含むアミノ酸配列をコーディングする塩基配列
からなる群より選択された塩基配列を含むものであってもよく、前記プロピオニルＣｏＡ転移酵素は前記塩基配列によってコーディングされるアミノ酸配列を含むものであってもよい。
好ましくは、前記遺伝子は、配列番号１７の塩基配列でＴ７８Ｃ、Ｔ６６９Ｃ、Ａ１１２５ＧおよびＴ１１５８Ｃの変異を含み、配列番号１７と対応するアミノ酸配列でＶ１９３Ａの変異を含むアミノ酸配列をコーディングする塩基配列を含むｃｐｐｃｔ５４０であってもよい。
前記酵素は、分子の活性を全体的に変更させない範囲内で追加的な変異を含むことができる。例えば、分子の活性を全体的に変更させない蛋白質およびペプチドでのアミノ酸交換は当該分野に公知されている。例えば、通常起こる交換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ間の交換が挙げられるが、これに制限されるわけではない。場合によって、前記蛋白質は、リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）、 硫酸化（ｓｕｌｆａｔｉｏｎ）、アクリル化（ａｃｒｙｌａｔｉｏｎ）、糖化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）、メチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）、ファルネシル化（ｆａｒｎｅｓｙｌａｔｉｏｎ）などで修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）されてもよい。また、アミノ酸配列上の変異または修飾によって蛋白質の熱、ｐＨなどに対する構造的安定性が増加するか蛋白質活性が増加した酵素蛋白質を含むことができる。
また、前記酵素をコーディングする遺伝子は、機能的に均等なコドンまたは（コドンの縮退性によって）同一なアミノ酸をコーディングするコドン、または生物学的に均等なアミノ酸をコーディングするコドンを含む核酸分子を含むことができる。前記核酸分子は、標準分子生物学技術、例えば化学的合成方法または組換え方法を用いて分離または製造するか、市販されるものを使用することができる。
“ベクター”は、個体の細胞内で目的蛋白質をコーディングする遺伝子挿入物が発現されるように作動可能に連結された必須の調節要素を含む遺伝子作製物を言い、目的蛋白質をコーディングする核酸配列を宿主細胞に導入されるための手段になる。前記ベクターは、プラスミド、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクター、バクテリオファージベクター、コスミドベクター、ＹＡＣ（Ｙｅａｓｔ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ベクターなど多様なベクターからなる群より選択された１種以上であってもよい。一例で、前記プラスミドベクターはｐＢｌｕｅ（例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（＋））、ｐＳＣ１０１、ｐＧＶ１１０６、ｐＡＣＹＣ１７７、ＣｏｌＥ１、ｐＫＴ２３０、ｐＭＥ２９０、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ８／９、ｐＵＣ６、ｐＢＤ９、ｐＨＣ７９、ｐＩＪ６１、ｐＬＡＦＲ１、ｐＨＶ１４、ｐＧＥＸシリーズ、ｐＥＴシリーズ、ｐＵＣ１９などからなる群より選択された１種以上であってもよく、前記バクテリオファージベクターはｌａｍｂｄａ ｇｔ４ ｌａｍｂｄａ Ｂ、ｌａｍｂｄａ－Ｃｈａｒｏｎ、ｌａｍｂｄａ Δｚ１、およびＭ１３などからなる群より選択された１種以上であってもよく、前記ウイルスベクターはＳＶ４０などであってもよいが、これに制限されるわけではない。
“組換えベクター”は、外来の目的遺伝子を含むクローニングベクターおよび発現ベクターを含む。クローニングベクターは複製起点、例えばプラスミド、ファージまたはコスミドの複製起点を含み、他のＤＮＡ断片が付着されて付着された断片が複製できるレプリコンである。発現ベクターは、蛋白質を合成するのに使用されるように開発された。
本明細書でベクターは、原核細胞または真核細胞など各種宿主細胞で目的とする酵素遺伝子を発現しこれを生産する機能を果たすことができるようにすれば特に限定されないが、ベクター内に挿入されて送達された遺伝子が宿主細胞のゲノム内に非可逆的に融合されて細胞内で遺伝子発現が長期間安定的に持続されるようにするものが良い。
このようなベクターは、目的遺伝子が選択された宿主内で発現できるようにする転写および翻訳発現調節配列を含む。発現調節配列としては、転写を実施するためのプロモーター、そのような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適したｍＲＮＡリボソーム結合部位をコーディングする配列および／または転写および解読の終結を調節する配列を含むことができる。例えば、原核生物に適した調節配列は、プロモーター、任意にオペレーター配列および／またはリボソーム結合部位を含むことができる。真核細胞に適した調節配列は、プロモーター、ターミネーターおよび／またはポリアデニル化シグナルを含むことができる。開始コドンおよび終結コドンは、一般に目的蛋白質をコーディングする核酸配列の一部と見なされ、遺伝子作製物が投与された時、個体で作用を示さなければならなく、コーディング配列とインフレーム（ｉｎ ｆｒａｍｅ）になければならない。ベクターのプロモーターは、構成的または誘導性であってもよい。また、複製可能な発現ベクターの場合、複製起源を含むことができる。その外、エンハンサー、目的とする遺伝子の５’末端および３’末端の非解読領域、選別マーカー（例えば、抗生剤耐性マーカー）、または複製可能単位などを適切に含むこともできる。ベクターは、自己複製するか宿主ゲノムＤＮＡに統合されてもよい。
有用な発現調節配列の例としては、アデノウイルスの初期および後期プロモーター、猿ウイルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶの長い末端繰り返し部（ＬＴＲ）プロモーター、モロニーウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、ラウスサルコーマウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、β－アクチンプロモーター、ヒトヘモグロビンプロモーターおよびヒト筋肉クレアチンプロモーター、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ＴＡＣまたはＴＲＣシステム、Ｔ３およびＴ７プロモーター、ファージラムダの主要オペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコード蛋白質の調節領域、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｋｉｎａｓｅ、ＰＧＫ）または他のグリコール分解酵素に対するプロモーター、ホスファターゼのプロモーター、例えばＰｈｏ５、酵母アルファ－交配システムのプロモーターおよび原核細胞または真核細胞またはこれらのウイルスの遺伝子の発現を調節すると知られた構成と誘導のその他の配列およびこれらの様々な組み合わせを含むことができる。
細胞で形質転換遺伝子の発現水準を高めるためには、目的とする遺伝子と転写および翻訳発現調節配列が互いに作動可能に連結されなければならない。一般に、“作動可能に連結された”は、連結されたＤＮＡ配列が接触し、また分泌リーダーの場合、接触してリーディングフレーム内に存在することを意味する。例えば、プレ配列（ｐｒｅ－ｓｅｑｕｅｎｃｅ）または分泌リーダー（ｌｅａｄｅｒ）に対するＤＮＡが蛋白質の分泌に参加するプレ蛋白質として発現される場合、ポリペプチドに対するＤＮＡに作動可能に連結されてもよく、プロモーターまたはエンハンサーが配列の転写に影響を与える場合、コーディング配列に作動可能に連結されてもよく、またはリボソーム結合部位は配列の転写に影響を与える場合、コーディング配列に作動可能に連結されてもよく、またはリボソーム結合部位は翻訳を容易にするように配置される場合、コーディング配列に作動可能に連結されてもよい。これら配列の連結は便利な制限酵素部位でライゲーション（連結）によって行われてもよく、そのような部位が存在しない場合、通常の方法による合成オリゴヌクレオチドアダプター（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｄａｐｔｏｒ）またはリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を使用して行われてもよい。
当業者は、宿主細胞の性質、ベクターの複製数、複製数を調節できる能力および当該ベクターによってコーディングされる他の蛋白質、例えば抗生剤マーカーの発現などを考慮して、本発明に適した各種ベクター、発現調節配列、宿主などを選定することができる。
本明細書で提供される組換え微生物は、前記組換えベクターを使用して宿主微生物細胞を形質転換させて得ることができる。
用語、“形質転換”は、目的遺伝子を宿主微生物に導入させて目的遺伝子が染色体外因子としてまたは染色体統合完成によって複製可能になることを意味する。
宿主微生物として使用可能な微生物は原核細胞と真核細胞からなる群より選択でき、通常、ＤＮＡの導入効率が高く、導入されたＤＮＡの発現効率の高い微生物が宿主微生物として使用できる。宿主微生物の具体例として、大腸菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０１、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｘ１７７６、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢおよびＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１－Ｂｌｕｅ）を含むエスケリキア属、シュードモナス属、バシラス属、ストレプトミセス属、エルウィニア属、セラチア属、プロビデンシア属、コリネバクテリウム属、レプトスピラ属、サルモネラ属、ブレビバクテリア属、ヒホモナス属、クロモバクテリウム属、ノカルジア属、真菌または酵母のような周知の真核および原核宿主などを例示することができるが、これに制限されるわけではない。適当な宿主に形質転換されれば、ベクターは宿主ゲノムと関係なく複製し機能できるか、または一部の場合にゲノムそれ自体に統合できる。
また、本発明の目的上、前記宿主細胞は、炭素源からヒドロキシアシルＣｏＡを生合成する経路を有している微生物であってもよい。
形質転換方法としては、当分野で公知されたように適した標準技術、例えば、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、電気注入法（ｅｌｅｃｔｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、微細注入法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、リン酸カルシウム共沈法（ｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｃｏ－ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、レトロウイルス感染（ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）、ＤＥＡＥ－デキストラン（ＤＥＡＥ－ｄｅｘｔｒａｎ）、陽イオンリポソーム（ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｏｓｏｍｅ）法、ポリエチレングリコール沈殿法（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｕｐｔａｋｅ）、遺伝子銃（ｇｅｎｅｇｕｎ）などを用いることができるが、これに制限されるわけではない。この時、環形のベクターを適切な制限酵素で切断して線状のベクター形態で導入することができる。
段階（ｂ）では前記組換え微生物を培養してＰ（３ＨＰ）を生合成する段階であって、具体的に、炭素源としてグリセロールを含む培地で前記組換え微生物を培養してＰ（３ＨＰ）のみを生合成することを特徴とする。この時、使用される培地と培養条件は組換え微生物の種類によって通常使用されるものを適切に選択して使用することができる。培養時、細胞の生育と共重合体の生産に適するように温度、培地のｐＨおよび培養時間などの条件を適切に調節することができる。前記培養方法の例には、回分式、連続式および流加式培養が含まれるが、これに制限されるわけではない。
この他に、培養に使用される培地は特定の菌株の要求条件を適切に満足させなければならない。前記培地は、多様な炭素源、窒素源、リン源および微量元素成分を含むことができる。但し、第１段階培養段階では培地内炭素源としてＰ（３ＨＰ）の生産のためにグリセロールを炭素源として含み、グルコースを含まないことを特徴とする。
培地内窒素源としては、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、とうもろこし浸漬液、大豆ミールおよび尿素または無機化合物、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウムを例示することができるが、これに制限されるわけではない。窒素源も個別的にまたは混合物として使用することができる。培地内リン源としては、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウムまたは相応するナトリウム－含有塩を例示することができるが、これに制限されるわけではない。また、培養培地は、成長に必要な硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含むか、アミノ酸およびビタミンのような必須成長物質を含むことができるが、これに制限されるわけではない。前記原料は、培養過程で培養物に適切な方式によって回分式で、または連続式で添加できる。
また、必要によって、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアのような塩基化合物またはリン酸または硫酸のような酸化合物を適切な方式で使用して培養物のｐＨを調節することができる。また、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を使用して気泡生成を抑制することができる。好気状態を維持するために培養物内に酸素または酸素－含有気体（例、空気）を注入することができ、培養物の温度は通常２０℃～４５℃、好ましくは２５℃～４０℃であってもよい。培養は、所望の高分子の生産量が最大に得られるまで続けて行うことができる。
また、前記段階（ｃ）は、第１段階培養以後、ＩＰＴＧ誘導（ＩＰＴＧ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）を通じてラクテート生成酵素およびラクチルｃｏＡ転換酵素を発現させた後、炭素源としてグルコースをさらに含んでＰＬＡが生合成されるようにすることを特徴とする。ＩＰＴＧ誘導（ＩＰＴＧ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）は、イソプロピルベータ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β－Ｄ－１－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ、ＩＰＴＧ、またはｌａｃＹとも言う）でｌａｃオペロンの転写を開始するようにしてｌａｃオペロンの統制下にある遺伝子の蛋白質発現を誘導することを意味する。好ましくは、ＩＰＴＧは０．１～１．０ｍＭ、さらに好ましくは０．５ｍＭで使用し、好ましくは培養開始から８～２４時間（１日）後程度に誘導を遂行させることができる。
このようにＩＰＴＧ誘導（ＩＰＴＧ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）を通じてラクテート生成酵素およびラクチルｃｏＡ転換酵素を発現させた後、炭素源としてグルコースを培養液にさらに投入する場合、大腸菌がグルコースのみ選択的に細胞内流入して利用する炭素異化代謝抑制（Ｃａｒｂｏｎ ｃａｔａｂｏｌｉｃ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）システムによってグリセロール利用が中断され、生合成が中断されたＰ（３ＨＰ）末端にＰＬＡが生合成されてＰ（３ＨＰ－ｂ－ＬＡ）ブロック共重合体が生産される。前記段階（ｃ）の培養条件は、段階（ｂ）と同様に適切に調節することができる。好ましくは、段階（ｂ）および（ｃ）の第１段階および第２段階培養は、２～７日、さらに好ましくは約４日間行うことができる。
前記段階（ｂ）および（ｃ）を通じて、前記段階（ａ）で製造された組換え微生物は本発明による初期培養時からラクテートを生合成する酵素をコーディングする遺伝子およびラクチルＣｏＡに転換させる酵素をコーディングする遺伝子は発現されず、グリセロールを炭素源にして３－ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ（３－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎｙｌ－ＣｏＡ）生合成に関連した酵素をコーディングする遺伝子およびＰＨＡ合成酵素遺伝子が発現されてＰ（３ＨＰ）が第１段階培養で生合成される。その後、炭素源としてグルコースを供給すれば炭素異化代謝抑制システム（Ｃａｒｂｏｎ ｃａｔａｂｏｌｉｃ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）によってグリセロール利用が中断されてＰ（３ＨＰ）生産が抑制され、グルコースと共にＩＰＴＧを添加すれば、ＩＰＴＧ誘導システム（ＩＰＴＧ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）によってラクテート生合成酵素をコーディングする遺伝子およびラクチルＣｏＡに転換させる酵素をコーディングする遺伝子が第２段階の培養で発現されることを特徴とする。したがって、Ｐ（３ＨＰ）末端に、ＰＬＡが生合成されて、Ｐ（３ＨＰ－ｂ－ＬＡ）が生合成される。
本発明で提供されるＰ（３ＨＰ－ｂ－ＬＡ）ブロック共重合体製造方法は、組換え微生物を培養する段階以後に、生産されたＰ（３ＨＰ－ｂ－ＬＡ）ブロック共重合体を培養物から回収（または分離または精製）する段階を追加的に含むことができる。
組換え微生物から生産されたＰ（３ＨＰ－ｂ－ＬＡ）ブロック共重合体は、当業界に広く知られている方法で細胞または培養培地から分離することができる。Ｐ（３ＨＰ－ｂ－ＬＡ）ブロック共重合体の回収方法の例として、遠心分離、超音波破砕、ろ過、イオン交換クロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー（ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（ｇａｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＧＣ）などの方法があるが、これら例に限定されるのではない。
前記のような製造方法によって生産されたＰ（３ＨＰ－ｂ－ＬＡ）ブロック共重合体は、１０ｍｏｌ％以上のラクテートを含むことができる（上限値は特別な限定がないが、約９０モル％以下であってもよく、これに制限されない）。
以下、本発明の理解のために好ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は本発明をさらに簡単に理解するために提供されるものに過ぎず、実施例によって本発明の内容が限定されるのではない。
実施例１．３－ヒドロキシプロピオネート－ラクテートブロック共重合体製造用組換えベクターの製造
全てのＤＮＡクローニング実験は、標準方法（参考文献：Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ Ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９）によって行った。
全てのＤＮＡクローニング実験は、標準方法（参考文献：Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ Ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９）によって行った。
１－１．ｐＣＤＦＪ２３－ｄｈａＢ１２３－ｇｄｒＡＢ－ｐｄｕＰ－ｒｅＣ＿ＧＫ組換えベクターの製造
ｐＣＤＦｄｕｅｔＴＭ－１（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＵＳＡ、３．７ｋｂ）にはＩＰＴＧによって発現が誘導されるＴ７プロモーターを二つ含有している。本実験ではこれを除去して恒常的に発現されるプロモーター二つを挿入した。ｐＣＤＦｄｕｅｔＴＭ－１のＤＮＡ断片をＸｂａＩ／ＸｈｏＩで切断し、恒常的に発現されるＪ２３１０１（配列番号１９）とＪ２３１０８プロモーター（配列番号２０）の配列を含むＤＮＡ断片をＸｂａＩ／ＸｈｏＩ認識部位に挿入して製作した。Ｊ２３１０１とＪ２３１０８プロモーターの配列を含む挿入したＤＮＡ断片（プロモーター）の大きさは３２８ｂｐ（配列番号２１）である。Ｊ２３１０１とＪ２３１０８プロモーター挿入のために、ＸｂａＩ／ＸｈｏＩ認識部位が添加されたプライマー［５’－ＴＡＣＴＧＡＡＣＣＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴＴＡＣＡＧＣＴＡＧＣ－３’（配列番号２２）および５’－ＣＴＴＴＡＣＣＡＧＡＣＴＣＧＡＧＴＴＣＧＡＡＧＡＣＧＴＣＡ－３’（配列番号２３）］を用いた。このようなｐＣＤＦＪ２３ベクターの製作方法を図１に示した。
ｐＣＤＦｄｕｅｔＴＭ－１（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＵＳＡ、３．７ｋｂ）にはＩＰＴＧによって発現が誘導されるＴ７プロモーターを二つ含有している。本実験ではこれを除去して恒常的に発現されるプロモーター二つを挿入した。ｐＣＤＦｄｕｅｔＴＭ－１のＤＮＡ断片をＸｂａＩ／ＸｈｏＩで切断し、恒常的に発現されるＪ２３１０１（配列番号１９）とＪ２３１０８プロモーター（配列番号２０）の配列を含むＤＮＡ断片をＸｂａＩ／ＸｈｏＩ認識部位に挿入して製作した。Ｊ２３１０１とＪ２３１０８プロモーターの配列を含む挿入したＤＮＡ断片（プロモーター）の大きさは３２８ｂｐ（配列番号２１）である。Ｊ２３１０１とＪ２３１０８プロモーター挿入のために、ＸｂａＩ／ＸｈｏＩ認識部位が添加されたプライマー［５’－ＴＡＣＴＧＡＡＣＣＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴＴＡＣＡＧＣＴＡＧＣ－３’（配列番号２２）および５’－ＣＴＴＴＡＣＣＡＧＡＣＴＣＧＡＧＴＴＣＧＡＡＧＡＣＧＴＣＡ－３’（配列番号２３）］を用いた。このようなｐＣＤＦＪ２３ベクターの製作方法を図１に示した。
一方、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ（ＤｈａＢ）、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ ｒｅａｃｔｉｖａｓｅ（ＧｄｒＡＢ）、ＣｏＡ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｐｉｏｎａｌｄｅｈｙｄｅ（ＰｄｕＰ）遺伝子を分離するためにＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＤＳＭ２０２６の全体ＤＮＡを抽出し、プライマー［５’－ｃａｇｃｃａ ｇａａｔｔｃａｔｇａａａａｇａｔｃａａａａｃｇａｔｔｔｇｃａ－３’（配列番号２４）および５’－ｃｃｃｔｃｔ ａａｇｃｔｔ ｇａｔｃｔｃｃｃａｃｔｇａｃｃａａａｇｃｔｇｇｃｃｃｃｇ－３’（配列番号２５）］を製作し、前記抽出した全体ＤＮＡを鋳型にして一度にＰＣＲを行った後、ｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２、ｄｈａＢ３、ｇｄｒＡ遺伝子に該当する４．７ｋｂ大きさの遺伝子断片を確認し、このＰＣＲ結果物である遺伝子断片を１％アガロースゲルを用いて分離し、Ｗｉｚａｒｄ ＤＮＡ精製キットを用いて精製した。精製された遺伝子断片をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素処理を行った後、前記ｐＣＤＦＪ２３ベクター断片と混合してＴ４ ＤＮＡリガーゼ（入手先：Ｔａｋａｒａ）を入れ４℃で反応させて、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ認識部位に挿入することによって７ｋｂのｐＣＤＦＪ２３－ｄｈａＢ１２３－ｇｄｒＡ組換えプラスミドを製造した。
また、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ ｒｅａｃｔｉｖａｓｅ（ＧｄｒＢ）遺伝子を分離するためにＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＤＳＭ２０２６の全ＤＮＡを抽出し、プライマー［５’－ｇａｇａｔｃ ａａｇｃｔｔ ａｇａｇｇｇｇｇｃｃｇｔｃａｔｇｔｃｇｃｔｔｔｃａｃｃｇｃｃａｇｇｃｇｔａ－３’（配列番号２６）および５’－ｇｔｔｃｇａ ｃｔｔａａｇ ｔｃａｇｔｔｔｃｔｃｔｃａｃｔｔａａｃｇｇｃａｇｇａｃ－３’（配列番号２７）］を製作し、前記抽出した全ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行って増幅した後、ｇｄｒＢ遺伝子に該当する０．３ｋｂ大きさの遺伝子断片を確認し、このＰＣＲ結果物である遺伝子断片を１％アガロースゲルを用いて分離し、Ｗｉｚａｒｄ ＤＮＡ精製キットを用いて精製した。精製された遺伝子断片をＨｉｎｄＩＩＩとＡｆｌＩＩで制限酵素処理した後、前記ｐＣＤＦＪ２３－ｄｈａＢ１２３－ｇｄｒＡ組換えプラスミド断片と混合してＴ４ ＤＮＡリガーゼ（入手先：Ｔａｋａｒａ）を入れ４℃で反応させて、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＡｆｌＩＩ認識部位に挿入することによって７．３ｋｂのｐＣＤＦＪ２３－ｄｈａＢ１２３－ｇｄｒＡＢ組換えプラスミドを製造した。
さらに、ＣｏＡ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｐｉｏｎａｌｄｅｈｙｄｅ（ＰｄｕＰ）遺伝子を分離するためにＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＤＳＭ２０２６の全ＤＮＡを抽出し、プライマー［５’－ｇｃｔａｇｃ ｇｇｔａｃｃ ｔｇｔｔａａａｇｇａｇｃａｔｃｔｇａｃａａｔｇａａｔａｃａｇｃａｇａａｃｔｇｇａａａｃｃ－３’（配列番号２８）および５’－ｔｔａａｃａ ｃａｔａｔｇ ｔｔａｇｃｇａａｔｇｇａａａａａｃｃｇｔｔｇｇｔ－３’（配列番号２９）］を製作し、前記抽出した全ＤＮＡを鋳型にして一度にＰＣＲ増幅して、ｐｄｕＰ遺伝子に該当する１．４ｋｂ大きさの遺伝子断片を確認し、このＰＣＲ結果物である遺伝子断片を１％アガロースゲルを用いて分離し、Ｗｉｚａｒｄ ＤＮＡ精製キットを用いて精製した。精製された遺伝子断片をＫｐｎＩとＮｄｅＩで制限酵素処理した後、前記ｐＣＤＦＪ２３－ｄｈａＢ１２３－ｇｄｒＡＢ組換えプラスミド断片と混合してＴ４ ＤＮＡリガーゼ（入手先：Ｔａｋａｒａ）を入れ４℃で反応させて、８．７ｋｂのｐＣＤＦＪ２３－ｄｈａＢ１２３－ｇｄｒＡＢ－ｐｄｕＰ組換えプラスミドを製造した。
そして、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）のＰＨＡ ｓｙｎｔｈａｓｅの変異体（Ｓ５０６Ｇ．Ａ５１０Ｋ）遺伝子であるｒｅＣ＿ＧＫに該当する遺伝子断片を増幅するために、プライマー［５’－ｃｇｃｔａａ ｃａｔａｔｇ ｔｇｔｔａａａｇｇａｇｃａｔｃｔｇａｃａｔｇｇｃｇａｃｃｇａｔａａａｇｇｃ－３’（配列番号３０）および５’－ｃａａｔｔｇ ａｇａｔｃｔ ｔｃａｔｇｃｃｔｔｇｇｃｔｔｔｇａｃｇｔａｔｃｇｃｃｃ－３’（配列番号３１）］を用いてＰＣＲを行って増幅された１．８ｋｂの遺伝子断片をＮｄｅＩ／ＢｇｌＩＩで制限酵素処理した後、前記ｐＣＤＦＪ２３－ｄｈａＢ１２３－ｇｄｒＡＢ－ｐｄｕＰ組換えプラスミド断片と混合してＴ４ ＤＮＡリガーゼ（入手先：Ｔａｋａｒａ）を入れ４℃で反応させて、ＮｄｅＩ／ＢｇｌＩＩ認識部位に挿入することによって最終的に１０．５ｋｂのｐＣＤＦＪ２３－ｄｈａＢ１２３－ｇｄｒＡＢ－ｐｄｕＰ－ｒｅＣ＿ＧＫ組換えベクターを製造した。このようなｐＣＤＦＪ２３－ｄｈａＢ１２３－ｇｄｒＡＢ－ｐｄｕＰ－ｒｅＣ＿ＧＫ組換えベクターの製造方法および切断地図を図２に示した。
１－２．ｐＴｒｃＨｉｓＢ－ｌｄｈＤ－ｃｐｐｃｔ５４０組換えベクターの製造
プロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子（ｐｃｔ）は、クロストリジウムプロピオニクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）由来のプロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼ（ＣＰ－ＰＣＴ）の変異体を使用し、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子はペディオコッカスアシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）由来の遺伝子を使用した。この時使用されたベクターは、ＩＰＴＧ誘導（ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）システムであるＴｒｃプロモーターを含有するｐＴｒｉｃＨｉｓＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏ．、ＵＳＡ）である。
プロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子（ｐｃｔ）は、クロストリジウムプロピオニクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）由来のプロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼ（ＣＰ－ＰＣＴ）の変異体を使用し、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子はペディオコッカスアシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）由来の遺伝子を使用した。この時使用されたベクターは、ＩＰＴＧ誘導（ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）システムであるＴｒｃプロモーターを含有するｐＴｒｉｃＨｉｓＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏ．、ＵＳＡ）である。
まず、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子を分離するために、ペディオコッカスアシディラクティシの全ＤＮＡを抽出し、プライマー［５’－ａａｔａａａ ｃｃａｔｇｇ ａｔｇａａａａｔｔａｔｔｇｃｔｔａｔ－３’（配列番号３２）および５’－ｃａａｇａｔ ｃｔｃｇａｇ ｔｔａａｔｃａａａｔｔｔｇａｃｃｔｃ－３’（配列番号３３）］を製作し、前記抽出した全ＤＮＡを鋳型にして、ＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物を電気泳動して、ｌｄｈＤ遺伝子に該当する１ｋｂ大きさの遺伝子断片を確認し、遺伝子を得た。このＰＣＲ結果物である遺伝子断片を１％アガロースゲルを用いて分離し、Ｗｉｚａｒｄ ＤＮＡ精製キットを用いて精製した。精製された遺伝子断片をＮｃｏＩとＸｈｏＩロで制限酵素処理した後、前記ｐＴｒｉｃＨｉｓＢと混合してＴ４ ＤＮＡリガーゼ（入手先：Ｔａｋａｒａ）を入れ４℃で反応させて、５．４ｋｂのｐＴｒｃＨｉｓＢ－ｌｄｈＤ組換えプラスミドを製造した。
その後、ここにプロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼがＴｒｃプロモーターの影響下で共に発現されるように、オペロン形態のシステムを構築するためにクロストリジウムプロピオニクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）由来のプロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼ（ＣＰ－ＰＣＴ）の変異体（ＣＰ－ＰＣＴ Ｖａｒｉａｎｔ ５４０；Ｖａｌ１９３Ａｌａおよび沈黙突然変異 Ｔ７８Ｃ、Ｔ６６９Ｃ、Ａ１１２５Ｇ、Ｔ１１５８Ｃ含む）使用した。ＣＰ－ＰＣＴ５４０の選別方法は大韓民国特許出願第１０－２０１８－００２４９７号に詳細に記載されており、前記文献は本発明に対する参考文献として含まれる。このように選別されたＣＰ－ＰＣＴ Ｖａｒｉａｎｔ ５４０（Ｖａｌ１９３Ａｌａおよび沈黙突然変異 Ｔ７８Ｃ、Ｔ６６９Ｃ、Ａ１１２５Ｇ、Ｔ１１５８Ｃ含む）をプライマー［５’－ａａｃｔｃｇ ａｇａｔｃｔ ｔｇｔｔａａａｇｇａｇｃａｔｃｔｇａｃ ａｔｇａｇａａａｇｇｔｔｃｃｃａｔｔａｔｔ－３’（配列番号３４）および５’－ｃｃａｔａｔ ｇｇｔａｃｃ ｔｔａｇｇａｃｔｔｃａｔｔｔｃｃｔｔ－３’（配列番号３５）］を用いてＰＣＲを行って１．５ｋｂの増幅された遺伝子断片を得た。これをＢｇｌＩＩ／ＫｐｎＩで制限酵素処理した後、前記ｐＴｒｃＨｉｓＢ－ｌｄｈＤ組換えプラスミドと混合してＴ４ ＤＮＡリガーゼ（入手先：Ｔａｋａｒａ）を入れ４℃で反応させて、６．９ｋｂのｐＴｒｃＨｉｓＢ－ｌｄｈＤ－ＣＰＰＣＴ５４０組換えプラスミドを製造した。このようなｐＴｒｃＨｉｓＢ－ｌｄｈＤ－ＣＰＰＣＴ ５４０組換えベクターの製造方法および切断地図を図３に示した。
実施例２．３－ヒドロキシプロピオネート－ラクテートブロック共重合体製造用組換え菌株の製造
２．１．ｌｄｈＡ遺伝子がノックアウト（ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ）された変異体製作
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１－Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＵＳＡ）を基にしてラクテートが含まれていない重合体を生産するために大腸菌の代謝過程中にラクテート生産に関与するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１－ｂｌｕｅ由来Ｄ－ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｄｈＡ；ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｖｅ Ｄ－ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＮＡＤ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｔｒ．Ｋ－１２ ｓｕｂｓｔｒ．］Ｇｅｎｅ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＮＣ＿０００９１３．３、酵素ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＥＣ＿１．１．１．２８）をゲノムＤＮＡからノックアウト（ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ）させて、ｌｄｈＡが欠失された大腸菌変異体Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１－Ｂｌｕｅ（ΔｌｄｈＡ）を製作した。遺伝子の欠失は業界によく知られているｒｅｄ－ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ方法を用いた。ｌｄｈＡを欠失させるために使用されたオリゴマーは、配列番号３６（５’－ａｔｃａｇｃｇｔａｃｃｃｇｔｇａｔｇｃｔａａｃｔｔｃｔｃｔｃｔｇｇａａｇｇｔｃｔｇａｃｃｇｇｃｔｔｔａａｔｔａａｃｃｃｔｃａｃｔａａａｇｇｇｃｇ－３’）および配列番号３７（５’－ａｃａｃｃｇａｔｔｔｔａｃｃｇｇｔａｃｃｇａｔａａｃｇｃｃｔｇｃｃｇｔｔｔｔｇｃｃａｔａｃａｔａｇｔｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇｃｔｃ－３’）の塩基配列で合成した。
２．１．ｌｄｈＡ遺伝子がノックアウト（ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ）された変異体製作
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１－Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＵＳＡ）を基にしてラクテートが含まれていない重合体を生産するために大腸菌の代謝過程中にラクテート生産に関与するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１－ｂｌｕｅ由来Ｄ－ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｄｈＡ；ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｖｅ Ｄ－ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＮＡＤ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｔｒ．Ｋ－１２ ｓｕｂｓｔｒ．］Ｇｅｎｅ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＮＣ＿０００９１３．３、酵素ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＥＣ＿１．１．１．２８）をゲノムＤＮＡからノックアウト（ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ）させて、ｌｄｈＡが欠失された大腸菌変異体Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１－Ｂｌｕｅ（ΔｌｄｈＡ）を製作した。遺伝子の欠失は業界によく知られているｒｅｄ－ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ方法を用いた。ｌｄｈＡを欠失させるために使用されたオリゴマーは、配列番号３６（５’－ａｔｃａｇｃｇｔａｃｃｃｇｔｇａｔｇｃｔａａｃｔｔｃｔｃｔｃｔｇｇａａｇｇｔｃｔｇａｃｃｇｇｃｔｔｔａａｔｔａａｃｃｃｔｃａｃｔａａａｇｇｇｃｇ－３’）および配列番号３７（５’－ａｃａｃｃｇａｔｔｔｔａｃｃｇｇｔａｃｃｇａｔａａｃｇｃｃｔｇｃｃｇｔｔｔｔｇｃｃａｔａｃａｔａｇｔｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇｃｔｃ－３’）の塩基配列で合成した。
２．２．３－ヒドロキシプロピオネート－ラクテートブロック共重合体製造用組換え菌株製作
前記実施例２．１で製作されたｌｄｈＡ欠失大腸菌変異体Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１－Ｂｌｕｅ（ΔｌｄｈＡ）に実施例１．１および１．２で製作された組換えベクターｐＣＤＦＪ２３－ｄｈａＢ１２３－ｇｄｒＡＢ－ｐｄｕＰ－ｒｅＣ＿ＧＫおよびｐＴｒｃＨｉｓＢ－ｌｄｈＤ－ＣＰＰＣＴ５４０を用いて、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）で形質転換させて、Ｐ（ＬＡ－ｂ－３ＨＰ）ブロック共重合体製造用組換え菌株を製作した。
前記実施例２．１で製作されたｌｄｈＡ欠失大腸菌変異体Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１－Ｂｌｕｅ（ΔｌｄｈＡ）に実施例１．１および１．２で製作された組換えベクターｐＣＤＦＪ２３－ｄｈａＢ１２３－ｇｄｒＡＢ－ｐｄｕＰ－ｒｅＣ＿ＧＫおよびｐＴｒｃＨｉｓＢ－ｌｄｈＤ－ＣＰＰＣＴ５４０を用いて、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）で形質転換させて、Ｐ（ＬＡ－ｂ－３ＨＰ）ブロック共重合体製造用組換え菌株を製作した。
実施例３．ＩＰＴＧ誘導（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）を用いた３－ヒドロキシプロピオネート－ラクテートブロック共重合体製造
前記実施例２．２で準備された組換え菌株を下記のように２段階培養して３－ヒドロキシプロピオネート－ラクテートブロック共重合体を得た。
前記実施例２．２で準備された組換え菌株を下記のように２段階培養して３－ヒドロキシプロピオネート－ラクテートブロック共重合体を得た。
まず、第１段階培養のために、実施例２．２で準備された形質転換組換え大腸菌を１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン、２５ｍｇ／Ｌのストレプトマイシン、グリセロール２０ｇ／Ｌ、Ｖｉｔａｍｉｎ Ｂ１２ ０．５ｍΜおよびｔｈｉａｍｉｎｅ １０ｍｇ／Ｌが追加的に含まれている１００ｍｌ ＭＲ培地（培地１Ｌ当りＫＨ２ＰＯ４ ６．６７ｇ、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４ ４ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．８ｇ、ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ ０．８ｇ、およびｔｒａｃｅ ｍｅｔａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ５ｍＬ；ここで、Ｔｒａｃｅ ｍｅｔａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎは１Ｌ当り５Ｍ ＨＣｌ ５ｍＬ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １０ｇ、ＣａＣｌ２ ２ｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２．２ｇ、ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ １ｇ、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２・４Ｈ２Ｏ ０．１ｇ、およびＮａ２Ｂ４Ｏ２・１０Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ含有）に接種して３０℃で２５０ｒｐｍで攪拌しながら培養を行った。
培養開始から１日経過後、培養中の１００ｍｌにＩＰＴＧ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍを用いるようにＩｓｏｐｒｏｐｙｌ β－Ｄ－１－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を０．５ｍＭになるように添加し１０ｇ／Ｌのグルコースを添加してＩＰＴＧ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎが行われるようにし、ＬＡ生合成酵素およびＬＡ－ＣｏＡに転換する酵素が発現されるようにし、グリセロール利用が中断されＰ（３ＨＰ）生産が抑制されるようにして、中断されたＰ（３ＨＰ）末端にＰＬＡが生合成されるようにした。
その後、前記誘導（ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）された培養液を追加的に３日間さらに培養（第２段階培養）した。
比較例１．ＩＰＴＧ誘導を用いない（Ｎｏ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）３－ヒドロキシプロピオネート重合体製造
本発明による製造方法と比較するために、ＩＰＴＧ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎを用いずに１段階の培養で３－ヒドロキシプロピオネート重合体を製造した。具体的に、別途のフラスコに実施例２．２で準備された形質転換組換え大腸菌を１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン、２５ｍｇ／Ｌのストレプトマイシン、グリセロール２０ｇ／Ｌ、およびＶｉｔａｍｉｎ Ｂ１２ ０．５ｍΜが追加的に含まれている１００ｍｌ ＭＲ培地（培地１Ｌ当りＫＨ２ＰＯ４ ６．６７ｇ、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４ ４ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．８ｇ、ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ ０．８ｇ、およびｔｒａｃｅ ｍｅｔａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ５ｍＬ；ここで、Ｔｒａｃｅ ｍｅｔａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎは１Ｌ当り５Ｍ ＨＣｌ ５ｍＬ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １０ｇ、ＣａＣｌ２ ２ｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２．２ｇ、ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ １ｇ、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２・４Ｈ２Ｏ ０．１ｇ、およびＮａ２Ｂ４Ｏ２・１０Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ含有）に接種して３０℃で２５０ｒｐｍで攪拌しながら総計４日間培養した。
本発明による製造方法と比較するために、ＩＰＴＧ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎを用いずに１段階の培養で３－ヒドロキシプロピオネート重合体を製造した。具体的に、別途のフラスコに実施例２．２で準備された形質転換組換え大腸菌を１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン、２５ｍｇ／Ｌのストレプトマイシン、グリセロール２０ｇ／Ｌ、およびＶｉｔａｍｉｎ Ｂ１２ ０．５ｍΜが追加的に含まれている１００ｍｌ ＭＲ培地（培地１Ｌ当りＫＨ２ＰＯ４ ６．６７ｇ、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４ ４ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．８ｇ、ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ ０．８ｇ、およびｔｒａｃｅ ｍｅｔａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ５ｍＬ；ここで、Ｔｒａｃｅ ｍｅｔａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎは１Ｌ当り５Ｍ ＨＣｌ ５ｍＬ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １０ｇ、ＣａＣｌ２ ２ｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２．２ｇ、ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ １ｇ、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２・４Ｈ２Ｏ ０．１ｇ、およびＮａ２Ｂ４Ｏ２・１０Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ含有）に接種して３０℃で２５０ｒｐｍで攪拌しながら総計４日間培養した。
実験例１．製造された重合体の分子量および組成分析
前記実施例３．によるＩＰＴＧ誘導を経た培養液および比較例１のＩＰＴＧ誘導を経なかった培養液をそれぞれ４℃、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して菌体を回収し十分な量の蒸留水で２回洗浄した後、８０℃で１２時間乾燥した。乾燥された菌体内の高分子含量および組成を確認するためにＧＣ分析を行った。このために、湿気が除去された菌体を定量した後、１００℃でクロロホルムを溶媒として使用して硫酸触媒下でメタノールと反応させた。これを常温でクロロホルムの半分に該当する体積の蒸留水を添加して混合した後、二つの層に分離されるまで静置させた。二つの層のうちのメチル化された高分子の単量体が溶けているクロロホルム層を採取してガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で高分子の成分を分析した。内部標準物質としてはベンゾエート（ｂｅｎｚｏａｔｅ）を使用した。この時使用されたＧＣ条件は下記の表１のとおりである。
前記実施例３．によるＩＰＴＧ誘導を経た培養液および比較例１のＩＰＴＧ誘導を経なかった培養液をそれぞれ４℃、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して菌体を回収し十分な量の蒸留水で２回洗浄した後、８０℃で１２時間乾燥した。乾燥された菌体内の高分子含量および組成を確認するためにＧＣ分析を行った。このために、湿気が除去された菌体を定量した後、１００℃でクロロホルムを溶媒として使用して硫酸触媒下でメタノールと反応させた。これを常温でクロロホルムの半分に該当する体積の蒸留水を添加して混合した後、二つの層に分離されるまで静置させた。二つの層のうちのメチル化された高分子の単量体が溶けているクロロホルム層を採取してガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で高分子の成分を分析した。内部標準物質としてはベンゾエート（ｂｅｎｚｏａｔｅ）を使用した。この時使用されたＧＣ条件は下記の表１のとおりである。
高分子の分子量を測定するためにＧＰＣ分析を行った。このために、次のように高分子抽出および精製を行った。湿気が除去された菌体を円筒ろ過紙に収集後、ソックスレー抽出機（Ｓｏｘｈｌｅｔ）を用いて６０℃のクロロホルム溶媒に４時間以上抽出した。抽出後、溶媒であるクロロホルムは蒸発器（ｅｖａｐｏｒａｔｏｒ）を用いて除去してフィルムタイプの高分子を得た。これを精製するために、フィルム型高分子を５ｍｌクロロホルムに溶かした後、４℃メタノール１００ｍｌに少量ずつ落下（ｄｒｏｐｐｉｎｇ）して不純物を除去した。このように精製された高分子でＧＰＣ分析を通じて分子量を確認した。具体的には、精製された高分子をクロロホルム（Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）に１～２ｍｇ／ｍＬの濃度で溶かした後、０．４５μｍシリンジフィルター（Ｓｙｒｉｎｇｅ Ｆｉｌｔｅｒ）でろ過してクロロホルム用ＧＰＣ（Ｗａｔｅｒｓ Ｅ０８ＢＸ）装置を用いて分析した。移動相としてクロロホルム（Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）を１ｍＬ／ｍｉｎの速度で流し、カラム温度は３５℃に合わせ、ＲＩ屈折率検出器（Ｒｅｆｌｅｃｔｉｖｅ Ｉｎｄｅｘ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）を用いて検出して、本発明のバイオポリマー組成物の数平均分子量（Ｍｎ）、重量平均分子量（Ｍｗ）、最大ピーク（ｐｅａｋ）分子量（Ｍｐ）および 多分散指数（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ ｉｎｄｅｘ、ＰＤＩ）をそれぞれ測定した。
ＧＣ分析で得られた結果を下記の表２に示した。
表２に示されているように、本発明による形質転換組換え菌株を用いてＩＰＴＧ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎを行った場合には３－ヒドロキシプロピオネート－ラクテートのブロック共重合体が生成されたのを確認することができるが、ｉｎｄｕｃｔｉｏｎを経なかった場合にはＰ（３ＨＰ）のみが生成されただけであり、ＬＡはほとんど生成されないことが分かった。
実験例２．本発明による共重合体のブロック共重合体なのか確認
前記のように製造された重合体がＰ（３ＨＰ－ｂ－ＬＡ）ブロック共重合体なのかを確認するために、Ｐ（３ＨＰ－ｒ－ＬＡ）ランダム共重合体と共に示差走査熱量計（ＤＳＣ Ｑ１００、ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を使用して試験して結果を比較した。
前記のように製造された重合体がＰ（３ＨＰ－ｂ－ＬＡ）ブロック共重合体なのかを確認するために、Ｐ（３ＨＰ－ｒ－ＬＡ）ランダム共重合体と共に示差走査熱量計（ＤＳＣ Ｑ１００、ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を使用して試験して結果を比較した。
比較例として、次のような方法によってＰ（３ＨＰ－ｒ－ＬＡ）ランダム共重合体を製造した。まず、比較例のためのベクターは、ＩＰＴＧ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎベクターでないｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベースのベクターにｒｅｃ－ＧＫとＣＰＰＴ－５４０を入れて製作されたｐＢｌｕｅ－ｒｅＣ＿ＧＫ－ＣＰＰＣＴ５４０を使用した。
具体的に、ｐＢｌｕｅ－ｒｅＣ＿ＧＫ－ＣＰＰＣＴ５４０の製造のためのＰＨＡ合成酵素遺伝子はＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）の由来のＰＨＡ合成酵素の変異体を（Ｓ５０６Ｇ．Ａ５１０Ｋ）を使用した（ｒｅＣ＿ＧＫ）。この時使用されたベクターは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｏ．、ＵＳＡ）である。
ＰＨＡ合成酵素であるＲｅＣ＿ＧＫを発現させるために、ｐＳＹＬ１０５ベクター（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．、１９９４、４４：１３３７－１３４７）でＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６由来のＰＨＢ生産オペロンが含まれているＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで切断して、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｏ．、ＵＳＡ）のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ認識部位に挿入することによってｐＲｅＣＡＢ組換えベクターを製造した。ｐＲｅＣＡＢベクターは、ＰＨＡ合成酵素（ｐｈａＣＲＥ）と単量体供給酵素（ｐｈａＡＲＥおよびｐｈａＢＲＥ）がＰＨＢオペロンプロモーターによって常時的に発現される。ｐＲｅＣＡＢベクターのＲｅＣ合成酵素遺伝子をＢｓｔＢＩ／ＳｂｆＩ制限酵素によって完全に除去し、この位置に変異体であるＲｅＣ＿ＧＫ合成酵素遺伝子を挿入した。このＲｅＣ＿ＧＫ合成酵素遺伝子断片増幅のために、プライマー［５’－ｃｇｃｔａａ ＴＴＣＧＡＡ ｔａｇｔｇａｃｇｇｃａｇａｇａｇａｃａａｔｃａａａｔｃ ａｔｇｇｃｇａｃｃｇｇｃａａａｇｇｃ－３’（配列番号３８）および５’－ｃａａｔｔｇ ＣＣＴＧＣＡＧＧ ｔｃａｔｇｃｃｔｔｇｇｃｔｔｔｇａｃｇｔａｔｃｇｃｃｃ－３’（配列番号３９）］を用いてＰＣＲを行って増幅された１．８ｋｂの遺伝子断片を得た。これをＢｓｔＢＩ／ＳｂｆＩで制限酵素処理した後、前記プラスミド断片と混合してＴ４ ＤＮＡリガーゼ（入手先：Ｔａｋａｒａ）を入れ４℃で反応させて、ＢｓｔＢＩ／ＳｂｆＩ認識部位に挿入することによってｐＢｌｕｅ－ｒｅＣ＿ＧＫ組換えベクターを製造した。
ここにプロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼが共に発現されるオペロン形態の恒常的発現されるシステムを構築するためにクロストリジウムプロピオニクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）由来のプロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼ変異体（ＣＰＰＣＴ５４０）を使用した。ＣＰＰＣＴ５４０遺伝子断片を増幅するため、プライマー［５’－ｃａａｔｔｇＣＣＴＧＣＡＧＧｃｇｇａｔａａｃａａｔｔｔｃａｃａｃａｇｇａａａｃａｇａａｔｔｃａｔｇａｇａａａｇｇｔｔｃｃｃａｔｔａｔｔ－３’（配列番号４０）、５’－ｃｃａｔａｔ ｃａｔａｔｇ ｔｔａｇｇａｃｔｔｃａｔｔｔｃｃｔｔ－３’（配列番号４１）］を用いてＰＣＲして得られた１．５ｋｂ断片を使用した。このＰＣＲ断片をＳｂｆＩ／ＮｄｅＩで制限酵素処理した後、前記ｐＢｌｕｅ－ｒｅＣ＿ＧＫ組換えプラスミド断片と混合してＴ４ ＤＮＡリガーゼを入れ４℃で反応させて、ＳｂｆＩ／ＮｄｅＩ認識部位に挿入することによってｐＢｌｕｅ－ｒｅＣ＿ＧＫ－ＣＰＰＣＴ５４０組換えベクターを製造した。このようなｐＢｌｕｅ－ｒｅＣ＿ＧＫ－ＣＰＰＣＴ５４０組換えベクターの製造方法および切断地図を図６に示した。
高分子生成微生物は、ｌｄｈＡが除去されていないＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１－Ｂｌｕｅ野生型菌株を使用して培養時、ラクテートモノマーが供給されるようにした。培養に使用された炭素源はグルコースを用い、３ＨＰ（３－ヒドロキシプロピオネート）モノマーを０．５ｇ／Ｌで添加してＰ（３ＨＰ－ｒ－ＬＡ）ランダム共重合体を生合成した。ＭＲ培地および培養時間温度は実施例３に記載されたブロック高分子合成と同様な条件で行った。
実施例３で製造された本発明による共重合体と前記のように製造されたランダム共重合体を示差走査熱量計（ＤＳＣ Ｑ１００、ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を使用して試験して昇温速度を１０℃／ｍｉｎにして－４０℃から２２０℃まで昇温させて測定した。
その結果を下記図４および５に示した。図４および５から確認できるように、本発明のＰ（３ＨＰ－ｂ－ＬＡ）ブロック共重合体はＰ（３ＨＰ）とＰＬＡのガラス転移温度（Ｔｇ）および溶融温度（Ｔｍ）が全て特定されるのに反して、比較例のＰ（３ＨＰ－ｒ－ＬＡ）ランダム共重合体の場合、ＴｇはＰ（３ＨＰ）とＰＬＡの中間位置で確認され、Ｔｍは測定されなかった。したがって、本発明によって製造された共重合体はＰ（３ＨＰ－ｂ－ＬＡ）ブロック共重合体であるのを明確に確認することができた。
Claims (9)
- （ａ）乳酸を生合成しないように改良された組換え微生物を３－ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ（３－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎｙｌ－ＣｏＡ）生合成遺伝子およびポリヒドロキシアルカノエート（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ：ＰＨＡ）合成酵素遺伝子を含むベクター、およびラクテート生合成遺伝子およびラクテート（ｌａｃｔａｔｅ）をラクチルＣｏＡ（ｌａｃｔｙｌ－ＣｏＡ）に転換する酵素の遺伝子を含むベクターで形質転換させて組換え微生物を製造する段階；
（ｂ）前記段階（ａ）で製造された組換え微生物をグリセロールを炭素源として使用して培養してポリ（３－ヒドロキシプロピオネート）［Ｐ（３ＨＰ）］を合成する段階；
（ｃ）ＩＰＴＧおよびグルコースを投入してＰ（３ＨＰ）生産を抑制し、ラクテート生合成酵素およびラクテートをラクチルＣｏＡ（ｌａｃｔｙｌ－ＣｏＡ）に転換する酵素が発現されるようにして段階（ａ）で合成されたＰ（３ＨＰ）末端にＰＬＡを生合成させる段階；
を含み、
ラクテート生合成遺伝子およびラクテート（ｌａｃｔａｔｅ）をラクチルＣｏＡ（ｌａｃｔｙｌ－ＣｏＡ）に転換する酵素の遺伝子がＩＰＴＧ誘導システムの制御下に置かれる、
３－ヒドロキシプロピオネート－ラクテートブロック共重合体［Ｐ（３ＨＰ－ｂ－ＬＡ）］の製造方法。 - 前記乳酸を生合成しない組換え微生物は、ラクテート脱水素酵素Ａコーディング遺伝子（ｌｄｈＡ）が不活性化されたものである、請求項１に記載の製造方法。
- 前記３－ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ（３－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎｙｌ－ＣｏＡ）生合成遺伝子は、グリセロールデヒドラターゼ、グリセロールデヒドラターゼアクチバーゼ、ＣｏＡ－依存プロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼおよびアルデヒドデヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子である、請求項１または２に記載の製造方法。
- 前記ポリヒドロキシアルカノエート（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ：ＰＨＡ）合成酵素遺伝子は、キュープリアビダスネカター（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ）に由来したＰＨＡ合成酵素変異体のコーディング遺伝子ｒｅＣ＿ＧＫである、請求項１から３のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記ラクテート生合成遺伝子は、ペディオコッカスアシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）に由来したラクテート脱水素酵素（Ｌｄｈ）をコーディングする遺伝子である、請求項１から４のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記ラクテート（ｌａｃｔａｔｅ）をラクチルＣｏＡ（ｌａｃｔｙｌ－ＣｏＡ）に転換する酵素は、クロストリジウムプロピオニクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）に由来したものである、請求項１から５のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記微生物は、大腸菌である、請求項１から６のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記段階（ｃ）で、０．１～１．０ｍＭのＩＰＴＧを投入する、請求項１から６のいずれか一項に記載の製造方法。
- 乳酸を生合成しないように改良された組換え微生物に３－ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ（３－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎｙｌ－ＣｏＡ）生合成遺伝子およびポリヒドロキシアルカノエート（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ：ＰＨＡ）合成酵素遺伝子を含むベクター、およびラクテート生合成遺伝子およびラクテート（ｌａｃｔａｔｅ）をラクチルＣｏＡ（ｌａｃｔｙｌ－ＣｏＡ）に転換する酵素の遺伝子を含むベクターであって、
ラクテート生合成遺伝子およびラクテート（ｌａｃｔａｔｅ）をラクチルＣｏＡ（ｌａｃｔｙｌ－ＣｏＡ）に転換する酵素の遺伝子がＩＰＴＧ誘導システムの制御下に置かれるベクターで形質転換された、組換え微生物。
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