MX2012003604A - Metodo para producir acido 3-hidroxipropionico y otros productos. - Google Patents

Metodo para producir acido 3-hidroxipropionico y otros productos.

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Ryan T Gill
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Abstract

La invención es concerniente con cepas de microorganismos diseñadas metabólicamente, tales como cepas bacterianas, en las cuales hay una utilización incrementada de malonil-CoA para la producción de un producto químico, que incluye ácido 3 -hidroxipropiónico.

Description

METODO PARA PRODUCIR ACIDO 3-HIDROXIPROPIONICO Y OTROS PRODUCTOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención es concerniente con microorganismos diseñados metabólicamente, tales como cepas bacterianas, en las cuales hay una utilización incrementada de malonil-CoA para la producción de un producto químico, que puede incluir el químico ácido 3-hidroxipropiónico (3-HP) y productos elaborados a partir 3-HP. Los microorganismos diseñados metabólicamente pueden ser aptos para exhibir tolerancia incrementada a 3-HP. También, se pueden hacer modificaciones genéticas para proveer una o más rutas de biosíntesis de 3-HP tales como en microorganismos que comprenden una o más modificaciones genéticas de un complejo identificado como el complejo toleragénico 3-HP.
LISTADO DE SECUENCIAS La presente solicitud contiene un Listado de Secuencias que ha sido presentado en formato ASCII vía EFS-Web y es incorporado en la presente por referencia en su totalidad. Dicha copia de ASCII, creada el 24 de septiembre de 2010 es denominada 34246744.txt y es de 2,228,808 bytes de tamaño.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Con la aceptación incrementada de que los suministros de hidrocarburos del petróleo están disminuyendo y sus costos se están incrementando finalmente, se ha incrementado el interés por desarrollar y mejorar sistemas microbianos industriales para la producción de químicos y combustibles. Tales sistemas microbianos industriales podrían reemplazar completa o parcialmente el uso de hidrocarburos de petróleo para la producción de ciertos químicos.
Numerosos químicos son producidos por medio de tales medios a varían de productos farmacéuticos antibióticos y anti-malaria a productos químicos finos combustibles tales como etanol. Los objetivos comerciales para la fermentación microbiana incluyen el incremento del título, velocidad de producción y rendimiento de un producto químico objetivo. Cuando la productividad específica global en un evento de fermentación es elevada, esto puede afectar positivamente el rendimiento además de la velocidad de producción y otros factores económicos, tales como costos de capital.
Un químico candidato para tal producción es el ácido 3-hidroxipropiónico ("3-HP", CAS No. 503-66-2), que puede ser convertido a un número de bloques de construcción básicos para polímeros usados en un amplio intervalo de productos industrial y productos del consumidor. Desafortunadamente, los esfuerzos previos para sintetizar microbianamente 3-HP para obtener títulos comercialmente viables han revelado que los microbios que son usados fueron inhibidos por concentraciones de 3-HP muy por debajo de un título comercialmente viable determinado.
A pesar del fuerte interés para mejorar la economía de fermentación microbiana al mejorar el rendimiento y/o productividad para ciertos productos químicos, todavía hay necesidad de incrementar la conversión neta en una célula de microorganismo fermentativo a productos químicos objetivo deseados empleando métodos de fermentación comercialmente viables. Más particularmente, entre los problemas que permanecen a ser resueltos son como mejorar la productividad especifica y productividad volumétrica, tal como a niveles económicamente importantes, en microorganismos modificados que son aptos para producir un producto químico que tiene malonil-CoA como sustrato en la ruta de producción microbiana de aquel producto químico, tal como ácido 3-hidroxipropiónico (3-HP).
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN De acuerdo con una modalidad, la invención es concerniente con un método para producir un producto del consumidor a base de ácido acrílico, dicho método comprende i) combinar una fuente de carbono y un cultivo celular de microorganismo para producir ácido 3-hidroxipropiónico, en donde a) dicho cultivo celular comprende un inhibidor de ácido graso sintasa o dicho microorganismo está modificado genéticamente por la actividad enzimática reducida en la ruta de ácido graso sintasa del organismo; o b) en donde dicho microorganismo es modificado genéticamente para la actividad enzimática incrementada en la ruta de malonil-CoA reductasa (mcr) del organismo mediante la introducción de una secuencia de ácido nucleico heterologa que codifica por un polipéptido que tiene una actividad de malonil-CoA reductasa mono-funcional; o c) dicho ácido 3-hidroxipropiónico es producido a una productividad especifica mayor*' que 0.05 gramos por gramo de célula de microorganismo en una base de peso seco por hora o a un productividad volumétrica mayor que 0.50 gramos por litro por hora; ii) convertir el ácido 3-hidroxipropiónico a ácido acrilico; y iii) procesar el ácido acrilico en un producto del consumidor. En varios aspectos, la fuente de carbono tiene una proporción de carbono-14 a carbono-12 de aproximadamente 1.0 x 10~14 o mayor.
La fuente de carbono de acuerdo con la invención puede ser predominantemente glucosa, sacarosa, fructosa, dextrosa, lactosa o una combinación de los mismos. Alternativamente, la fuente de carbono es glicerol.
En ciertas modalidades, el cultivo celular comprende un inhibidor de ácido graso sintasa o dicho microorganismo es modificado genéticamente para la actividad enzimática reducida en la ruta de ácido graso sintasa del organismo. Por ejemplo, el inhibidor de un ácido graso sintasa puede ser seleccionado del grupo que consiste de tiolactomicina, triclosan, cerulenina, tienodiazaborina, isoniazida y análogos de los mismos.
El microorganismo de la invención puede ser modificado genéticamente para la actividad enzimática incrementada en la ruta de malonil-CoA reductasa (mcr) del organismo mediante la introducción de una secuencia de ácido nucleico heteróloga que codifica por un polipéptido que tiene actividad de malonil-CoA mono-funcional. En varias modalidades, la malonil-CoA reductasa mono-funcional es NADPH-independiente.
En varias modalidades, el ácido 3-hidroxipropiónico es producido de acuerdo con la invención a una productividad especifica mayor de 0.05 gramos por gramo de célula de microorganismo en una base de peso seco por hora o a una productividad volumétrica mayor de 0.05 gramos por litro por hora .
Incluidas en la invención están modalidades en donde el cultivo celular comprende un microorganismo modificado genéticamente. El microorganismo modificado genéticamente puede ser modificado por un rasgo seleccionado de actividad enzimática reducida en la ruta de ácido graso sintasa del organismo, actividad enzimática incrementada en la ruta de malonil-CoA reductasa del organismo, tolerancia incrementada a ácido 3-hidroxipropiónico, actividad enzimática incrementada en la ruta de transhidrogenasa NADPH-dependiente del organismo, niveles de bicarbonato intracelular incrementado, actividad enzimática incrementada en la ruta de acetil-CoA carboxilasa del organismo y combinaciones de los mismos. Por ejemplo, el microorganismo modificado genéticamente puede ser modificado para una actividad enzimática reducida en la ruta de ácido graso sintasa del organismo. Alternativamente, la actividad enzimática reducida es una reducción en la actividad enzimática en una enzima seleccionada del grupo que consiste de beta-cetoacil-ACP reductasa, 3-hidroxiacil-CoA deshidratasa, enoil-ACP reductasa y tioesterasa. En varios aspectos, la actividad enzimática reducida en la ruta de ácido graso sintasa del organismo ocurre vía introducción de una secuencia de ácido nucleico heteróloga que codifica por un promotor inducible enlazado operativamente a una secuencia que codifica por una enzima en la ruta de ácido graso sintasa u homólogo de la misma o una secuencia de ácido nucleico heteróloga . que codifica por una enzima en la ruta de ácido graso sintasa u homólogo de la misma con actividad reducida. En varios aspectos, la enzima en la ruta de ácido graso sintasa u homólogo de la misma es un polipéptido con actividad de beta-cetoacil-ACP sensible a la temperatura o actividad de enoil-ACP reductasa sensible a la temperatura. Diversamente, el microorganismo modificado, genéticamente es modificado por actividad enzimática incrementada en la ruta de malonil-CoA reductasa del organismo.
En ciertas modalidades, el incremento en actividad enzimática en la ruta de malonil-CoA reductasa (mcr) ocurre mediante introducción de una secuencia de ácido nucleico heteróloga que codifica por un polipéptido que tiene actividad de malonil-CoA reductasa enzimática bi-funcional o actividad de malonil-CoA reductasa mono-funcional. La secuencia de ácido nucleico heteróloga puede ser seleccionada de una secuencia que tiene por lo menos 70% de homología con una secuencia seleccionada de SEQ ID NO. 780-789.
En varias modalidades, el microorganismo modificado genéticamente es modificado por tolerancia incrementada al ácido 3-hidroxipropiónico. El incremento en tolerancia al ácido 3-hidroxipropiónico puede ocurrir en uno o más componentes del complejo toleragénico 3-HP (3HPTGC) o en donde dicho incremento en tolerancia al ácido 3-hidroxipropiónico resulta de proveer por lo menos una modificación genética de cada uno de Grupo A y Grupo B del 3HPTGC. El uno o más componentes pueden ser seleccionados de CynS, CynT, AroG, SpeD, SpeE, SpeF, ThrA, Asd, CysM, IroK, IIvA y homólogos de los mismos. En varias modalidades, la modificación es una disrupción de uno o más genes represores de 3HPTGC. Los genes represores pueden ser seleccionados de tyrR, trpR, metJ, purR, lysR, nrdR y homólogos de los mismos.
La actividad enzimática incrementada en la ruta de transhidrogenasa NADPH-dependiente del organismo puede ocurrir mediante introducción de una secuencia de ácido nucleico heterologa que codifica por un polipéptido que tiene por lo menos 70% de homología con una secuencia seleccionada de SEQ ID NO. 776 ó 778. En varias modalidades, los niveles de bicarbonato intracelular incrementado ocurren mediante introducción de una secuencia de ácido nucleico heterologa que codifica por un polipéptido que tiene actividad de cinasa y/o carbónico anhidrasa. La secuencia de ácido nucleico heterologa puede ser seleccionada de una secuencia que tiene por lo menos 70% de homología con una secuencia seleccionada de SEQ ID' NO. 337.
En varias modalidades, una actividad enzimática incrementada en la ruta de acetil-CoA carboxilasa del organismo ocurre mediante introducción de una secuencia de ácido nucleico heterologa que codifica por un polipéptido que tiene por lo menos 70% de homología con una secuencia seleccionada de SEQ ID NO. 768-775.
La bacteria modificada genéticamente puede ser modificada adicionalmente para disminuir la actividad de lactato deshidrogenasa, fosfato acetiltransferasa, piruvato oxidasa o piruvato-formiato liasa y combinaciones de los mismos .
El método de acuerdo con la invención puede comprender además separar y/o purificar el ácido 3-hidroxipropiónico del cultivo celular mediante extracción del ácido 3-hidroxipropiónico del cultivo en presencia de una amina terciaria. Variadamente, el ácido 3-hidroxipropiónico es producido a una productividad especifica mayor de 0.05 gramos por gramo de célula de microorganismo en una base de peso seco por hora o a una productividad volumétrica mayor de 0.50 gramos por litro por hora.
El método de la invención puede incluir la producción de un producto del consumidor, tal como pañales, alfombra, pintura, adhesivos y vidrio acrilico. La invención incluye ácido 3-hidroxipropiónico producido biológicamente, en donde el ácido 3-hidroxipropiónico es producido de acuerdo con el método de la invención. Tal ácido 3-hidroxipropiónico puede estar esencialmente libre de catalizador químico, incluyendo un catalizador a base de molibdeno y/o vanadio. El ácido 3-hidroxipropiónico es producido de acuerdo con el método de la invención puede tener una proporción de carbono-14 a carbono-12 de aproximadamente 1.0 x 10~14 o mayor. En varios aspectos, el ácido 3-hidroxipropiónico contiene menos de aproximadamente 10% de carbono derivado de petróleo. Además, el ácido 3-hidroxipropiónico de acuerdo con la invención puede contener una cantidad residual de material orgánico relacionado con su método de producción. En varias modalidades, el ácido 3-hidroxipropiónico contiene una cantidad residual de material orgánico en una cantidad de entre 1 y 1, 000 partes por millón del ácido 3-hidroxipropiónico .
El ácido acrilico y un polímero producido a partir de ácido acrilico, en donde tal son producidos de acuerdo con el método de la invención, también están incluidos en la invención. Productos, incluyendo productos comerciales y productos del consumidor, obtenidos de los polímeros son también abarcados. Por ejemplo, pañales, alfombra, pintura, adhesivos y vidrio acrilico son abarcados.
Además, la invención abarca un sistema para la bioproducción de ácido acrilico de acuerdo con la reivindicación 40, dicho sistema comprende: un tanque para la sacarificación de biomasa; una línea para hacer pasar el producto de sacarificación a un tanque de fermentación opcionalmente vía un tanque de pre-fermentacion; un tanque de fermentación apropiado para cultivo de células de microorganismos; una línea para descargar el contenido del tanque de fermentación a un recipiente de extracción y/o separación; un recipiente de extracción y/o separación apropiado para la remoción del ácido 3-hidroxipropiónico del desperdicio de cultivo celular; una línea para transferir ácido 3-hidroxipropiónico a un recipiente de deshidratación; y un recipiente de deshidratación apropiado para conversión del ácido 3-hidroxipropiónico a ácido acrilico. En varias modalidades, el sistema comprende además uno o más tanques de pre-fermentación, columnas de destilación, recipientes de centrífuga, columnas de retro-extracción, recipientes de mezcla o combinaciones de los mismos. En varias modalidades, el sistema tiene una capacidad de producción mínima de por lo menos 1 tonelada de ácido acrílico por año.
Dentro del alcance de la- invención están microorganismo modificados genéticamente, en donde el microorganismo es apto de producir 3-hidroxipropionato a una velocidad específica seleccionada de velocidades mayores de 0.05 ojo g/gDCW-h, 0.08g/gDCW-h mayor de 0.1 g/gDCW-h, mayor de 0.13 g/gDCW-h, mayor de 0.15 g/gDCW-h, mayor de 0.175 g/gDCW-h, mayor de 0.2 g/gDCW-h, mayor de 0.25 g/gDCW-h, mayor de 0.3 g/gDCW-h, mayor de 0.35 g/gDCW-h, mayor de 0.4 g/gDCW-h, mayor de 0.45 g/gDCW-h o mayor de 0.5 g/gDCW-h.
El microorganismo modificado genéticamente puede comprender modificaciones genéticas para incrementar la actividad de malonil-coA reductasa y actividad de acetil-coA carboxilasa y modificaciones genéticas para reducir la actividad de enoil-ACP reductasa, actividad de lactato deshidrogenase y actividad de acetato cinasa. Variadamente, el microorganismo comprende modificaciones genéticas para incrementar la actividad de malonil-coA reductasa y acetil-coA carboxilasa y modificaciones genéticas para reducir la actividad de enoil-ACP reductasa, actividad de lactato deshidrogenasa y actividad de acetilfosfato transferasa. Además, el microorganismo puede comprender modificaciones genéticas para incrementar la actividad de malonil-coA reductasa y actividad de acetil-coA carboxilasa y modificaciones genéticas para reducir la actividad de enoil-ACP reductasa, actividad de lactato deshidrogenasa, actividad de acetato cinasa y actividad de acetilfosfato transferasa. En varios aspectos, el microorganismo comprende modificaciones genéticas para incrementar la actividad de malonil-coA reductasa y actividad de acetil-coA carboxilasa, y modificaciones genéticas para reducir la actividad de enoil-ACP reductasa, actividad de lactato deshidrogenasa y actividad de piruvato formiato liasa. En varias modalidades, el microorganismo comprende modificaciones genéticas para incrementar la actividad de malonil-coA reductasa y actividad de acetil-coA carboxilasa y modificaciones genéticas para reducir la actividad de enoil-ACP reductasa, actividad de lactato deshidrogenasa y actividad de piruvato oxidasa. También incluidos están microorganismos que comprenden modificaciones genéticas para incrementar la actividad de malonil-coA reductasa y actividad de acetil-coA carboxilasa, y modificaciones genéticas para reducir la actividad de enoil-ACP reductasa, actividad de lactato deshidrogenasa y actividad de metilglioxal sintasa. Además, microorganismos de acuerdo con la invención pueden comprender modificaciones genéticas para incrementar la actividad de malonil-coA reductasa y actividad de acetil-coA carboxilasa y modificaciones genéticas para incrementar la actividad de ß-cetoacil-ACP y " disminuir la actividad de lactato deshidrogenase y actividad de metilglioxal sintasa y/o el microorganismo puede comprender modificaciones genéticas para incrementar la actividad de malonil-coA reductasa y actividad de acetil-coA carboxilasa y modificaciones genéticas para reducir la actividad de enoil-ACP reductasa, actividad de guanosina 3' -difosfato 5' -trifosfato sintasa y actividad de guanosina 3' -difosfato 5' -difosfato sintasa. También, en algunos microorganismos, la enoil-CoA reductasa, es reducida en lugar de o además de hacer tal por la actividad de enoil-ACP reductasa.
En varias modalidades, una modificación genética adicional ha sido realizada que incrementan la actividad de transhidrogenasa NADH/NADPH. Por ejemplo, la actividad de transhidrogenasa puede ser soluble, puede ser enlazada a membrana, puede tener una modificación genética adicional que se ha hecho que incrementan la actividad de cinasa puede incluir una modificación benéfica adicional que incrementa la actividad de anhidrasa carbónica y/o puede incluir una modificación genética adicional que incrementa la actividad de piruvato deshidrogenasa .
En varias modalidades, una modificación genética adicional ha sido realizada si disminuye la actividad de guanosina 3' -difosfato 5' -trifosfato sintasa y actividad de guanosina 3' -difosfato 5' -difosfato sintasa. También incluida es cuando una modificación genética se ha hecho que incrementa la proporción de NADH/NAD+ en un medio ambiente aireado. Además, una modificación genética se puede hacer que disminuye la actividad de ß-cetoacil-ACP sintasa, disminuye la actividad de 3-hidroxipropionato reductasa, disminuye la actividad de 3-hidroxipropionato deshidrogenasa NAD+ dependiente, disminuye la actividad de 3-hidroxipropionato deshidrogenasa NAD+ dependiente, incrementa la tolerancia a ácido 3-hidroxipropiónico, incrementa la actividad de cualquier enzima en el complejo tolerogénico 3-HP, incrementan la actividad de piruvato deshidrogenasa, incrementan la actividad de cinasa, incrementa la actividad de anhidrasa carbónica, incrementa la actividad de aspartato cinasa, incrementa la actividad de treonina deshidrátasa, incrementa la actividad de 2-deshidro-3-desoxifosfoeptonato aldolasa, incrementa la actividad de cisteina sintasa, incrementa la actividad de ribosa-fosfato difosfocinasa, incrementa la actividad de ribonucléosido-difosfato reductasa, incrementa la actividad de L-cisteina desulfhidrasa, incrementa la actividad de lisina descarboxilasa, incrementa la actividad de homocisteina transmetilasa, incrementa la actividad de dihidrofoliato reductasá, incrementa la actividad de N-acetilglutamilfosfato reductasa, incrementa la actividad de acetilglutamato cinasa, incrementa la actividad de argininosuccinato liasa, incrementa la actividad de acetilornitina desacetilasa, incrementa la actividad de corismato mutasa, incrementa la actividad de prefenato deshidratasa, incrementa la actividad de prefenato deshidrogenasa, incrementa la actividad de 2-deshidro-3-desoxifosfoeptonato aldolasa y/o incrementa la actividad de D-3-fosfoglicerato deshidrogenasa.
En varias modalidades, la invención incluye un sistema de cultivo que comprende una fuente de carbono en un medio acuoso y un microorganismo modificado genéticamente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 48-92, en donde dicho organismo modificado genéticamente está presente en una cantidad seleccionada de mayor de 0.05 gDCW/L, 0.1 gDCW/L, mayor de un 1 gDCW/L, mayor de 5 gDCW/L, mayor de 10 gDCW/L, mayor de 15 gDCW/L o mayor de 20 gDCW/L, tal como cuando el volumen del medio acuoso es seleccionado de mayor de 5 mi, mayor de 100 mi, mayor de 0.5 L, mayor de 1 L, mayor de 2 L, mayor de 10 L, mayor de 250 L, mayor de 1000 L, mayor de 10,000 L, mayor de 50,000 L, mayor de 100,000 L o mayor de 200,000 L y tal como cuando el volumen del medio acuoso es mayor de 250 L y contenido dentro de un recipiente de acero.
De manera variada, la fuente de carbono para tales sistemas de cultivo es seleccionada de dextrosa, sacarosa, una pentosa, un poliol, una hexosa, tanto una hexosa como una pentosa y combinaciones de las mismas, el pH del medio acuoso es menor de 7.5, el sistema de cultivo es aireado, tal como a una velocidad de transferencia de oxígeno seleccionada de i) mayor de 5 mmol/L-h de oxígeno y menor de 200 mmol/L-h de oxígeno; ii) mayor de 5 mmol/L-h de oxígeno y menos de 100 mmol/L-h de oxígeno; iii) mayor de 5 mmol/L-h de oxígeno y menos de 80 mmol/L-h de oxígeno; y v) mayor de 5 mmol/L-h de oxígeno y menos de 50 mmol/L-h de oxígeno.
En varias modalidades, la invención es un caldo acuoso obtenido de un sistema de cultivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 93-99, en donde dicho caldo acuoso comprende: i) una concentración de 3-hidroxipropionato seleccionada de mayor de 5 g/1, mayor de 10 g/1, mayor de 15 g/1, mayor de 20 g/1, mayor de 25 g/1, mayor de 30 g/1, mayor de 35 g/1, mayor de 40 g/1, mayor de 50 g/1, mayor de 60 g/1, mayor de 70 g/1, mayor de 80 g/1, mayor de 90 g/1 o mayor de 100 g/13-hidroxipropionato; y ii) una concentración de 1,3-propandiol seleccionada de menos de 30 g/1; menos de 20 g/1; menos de 10 g/1; menos de 5 g/1; menos de 1 g/1 o menos de 0.5 g/1. en algunos aspectos, el caldo acuoso comprende una cantidad de biomasa seleccionada de menos de 20 gDCW/L de biomasa, menos de 15 gDCW/L de biomasa, menos de 10 gDC /L de biomasa, menos de 5 gDCW/L de biomasa o menos de 1 gDCW/L de biomasa. Alternativamente, el caldo acoso de acuerdo con la invención es de tal manera que la proporción de 3-HP/succinato (g3-HP/g de succinato) es mayor de 3, mayor de 10, mayor de 30, mayor de 60, mayor de 100, mayor de 150 o mayor de 200. En varios aspectos, la proporción de 3-HP/fumarato (g3-HP/g de fumarato) es mayor de 3, mayor de 10, mayor de 30, mayor de 60, mayor de 100, mayor de 150 o mayor de 200, o la proporción de 3-HP/glicerol (g3-HP/g de glicerol) es mayor de 3, mayor de 10, mayor de 30, mayor de 60, mayor de 100, mayor de 150 o mayor de 200 o la proporción de 3-HP/acetato (g3-HP/g de acetato) es mayor de 1.5, mayor de 3, mayor de 10 , mayor de 30, mayor de 60, mayor de 100, mayor de 150 o mayor de 200 o la proporción de 3-HP/alanina (g3-HP/g de alanina) es mayor de 3, mayor de 10, mayor de 30, mayor de 60, mayor de 100, mayor de 150, mayor de 200 o la proporción de 3-HP/beta-alanina (g3-HP/g de beta-alanina) es mayor de 1.5, mayor de 3, mayor de 10, mayor de 30, mayor de 60, mayor de 100, mayor de 150 o mayor de 200 o la proporción de 3-HP/glutamato (g3-HP/g de glutamato) es mayor de 3, mayor de 10, mayor de 30, mayor de 60, mayor de 100, mayor de 150 o mayor de 200 o la proporción de 3-HP/glutamina (g3-HP/g de glutamina) es mayor de 3, mayor de 10, mayor de 30, mayor de 60, mayor de 100, mayor de 150 o mayor de 200 o la proporción de 3-HP/3-hidroxipropionaldehido (g3-HP/g de 3-hidroxipropionaldehido) es mayor de 1.5, mayor de 3, mayor de 10, mayor de 30, mayor de 60, mayor de 100, mayor de 150 o mayor de 200 o la proporción de 3-HP/l,3 propandiol (g3-HP/g de 1 , 3-propandiol) es mayor de 1.5, mayor de 3, mayor de 10, mayor de 30, mayor de 60, mayor de 100, mayor de 150 o mayor de 200 y/o la proporción de 3-HP/lactato (g3-HP/g de lactato) es mayor de 3, mayor de 10, mayor de 30, mayor de 60, mayor de 100, mayor de 150 o mayor de 200.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Los nuevos elementos de invención son resumidos con particularidad en las reivindicaciones. Un mejor entendimiento de los elementos y ventajas de la presente invención será obtenido por referencia a la siguiente descripción detallada que resume modalidades ilustrativas en las cuales los principios de la invención son utilizados y las figuras adjuntas de las cuales: La Figura 1 ilustra rutas metabólicas de un microorganismo relacionado con aspectos de la invención, mas particularmente relacionado con la producción de 3-HP, con nombres de gen de E.coli mostrados en ciertas etapas enzimáticas, la última por ejemplo y no pretende ser limitante .
La Figura 2A ilustra rutas metabólicas de un microorganismo relacionado con aspectos de la presente invención, con nombres genéticos de E.coli mostrados en ciertas etapas enzimáticas, lo último por ejemplo y no pretende ser limitante.
La Figura 2B provee una ilustración más detallada de conversiones enzimáticas representativas y genes de E.coli ejemplares del sistema de ácido graso sintetasa que fue ilustrado más en general en la Figura 2A.
La Figura 3 provee una alineación de secuencia múltiple ejemplar, que compara polipéptidos de anhidrasa carbónicos (alineación de secuencia múltiple CLUSTAL 2.0.12 de péptidos de anhidrasa carbónica) .
La Figura 4A provee una alineación de secuencia ejemplar: Comparación de secuencias de ADN de mutación de ADN de genes de fablts (JPllll (SEQ ID No.:769)) y tipo silvestre (BW25113 (SEQ ID No.:827)) E.coli genes de ADN de mutación: C722T.
La Figura 4B provee una alineación de secuencia ejemplar: Comparación de secuencias de proteina de genes fabl de E.coli de Amino Ácido-s241F JPllll (SEQ ID No.:770) y tipo silvestre (B 25113 ( SEQ ID No . : 828 ) ) .
Las Figuras 5,6 y 7 proveen datos y resultados del Ejemplo 11.
La Figura 8 ilustra rutas metabólicas de un microorganismo con múltiples modificaciones genéticas relacionadas con aspectos de la presente invención, mas en particular relacionados con la producción de 3-HP, con nombres genéticos¦ de E.coli mostrados a ciertas etapas enzimáticas, lo último por ejemplo y no pretendiendo ser limitante .
La figura 9A, hojas 1-7 es una ilustración de múltiples láminas de porciones de rutas metabólicas que muestran rutas metabólicas y enzimas, que conjuntamente comprenden el complejo toleragénico de 3-HP (3HPTGC) en E. coli. La lámina 1 provee una ilustración esquemática general del arreglo de las hojas restantes.
La figura 9B, láminas 1-7 proveen una ilustración de múltiples láminas del 3HPTGC para Bacillus subtilis. La lámina 1 provee una ilustración esquemática general del arreglo de las láminas restantes.
La figura 9C, láminas 1-7, proveen una ilustración de múltiples láminas del 3HPTGC para Saccharomyces cerevisiae. La lámina 1 provee una ilustración esquemática general del arreglo de las láminas restantes.
La figura 9D, láminas 1-7, proveen una ilustración de múltiples láminas del 3HPTGC para Cupriavidus necator (previamente, Ralstonia eutropha) . La lámina 1 provee una ilustración esquemática general del arreglo de las láminas restantes .
La figura 10 provee una representación de la ruta de escición de glicina.
La Figura 11 provee, de una referencia del arte previo, un resumen de una ruta de producción de 3-HP conocida de glucosa a piruvato a acetil-CoA a malonil-CoA a 3-HP.
La figura 12 provee, de una referencia del arte previo, un resumen de una ruta de producción de 3-HP conocida de glucosa a fosfoenolpiruvato (PEP) a oxaloacetato (directamente o vía piruvato) a aspartato o ß-alanina a malonato semialdehido a 3-HP.
La Figura 13 provee, de una referencia del arte previo, un resumen de rutas de producción de 3-HP conocidas.
La Figura 14A y B proveen un diagrama esquemático de rutas de fermentación mezcladas naturales en E.coli.
La figura 15A-P provee datos gráficos de respuestas de microorganismos testigo a 3-HP y la figura 15P provee una comparación con una modificación genética del 3HPTGC.
La figura 16 ilustra una reacción química conocida catalizada mediante alfa-cetoglutarato codificado por el gen de kgd de M. tuberculosis.
La .figura 17 ilustra una nueva función enzimática, la descarboxilación de oxaloacetato a malonato semialdehido que es obtenida mediante modificación del gen de kgd.
La figura 18 muestra un procedimiento de selección propuesto para mutantes de kgd.
La figura 19 muestra un protocolo de selección ' relacionado con el procedimiento de selección propuesto ilustrado en la figura 18.
La figura 20 provee una comparación con respecto a' la secuencia de péptido de IroK.
La Figura 21 provee una curva de calibración para 3-HP llevada a cabo con HPLC.
La Figura 22 provee una curva de calibración para 3-HP llevada a cabo para GC/MS.
La Figura 23 provee una curva estándar representativa para el análisis enzimático de 3-HP.
Las Figura 24A, B y C y las Figuras 25A y B muestran un esquema de todo el proceso para convertir biomasa a un producto terminado tal como un pañal.
También se provee en la presente tablas y son parte de la especificación.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención es concerniente con varios métodos de producción y/o microorganismos modificados genéticamente que tienen utilidad para la producción fermentativa de varios productos químicos, con métodos de publicación de tales productos químicos que utilizan poblaciones de estos microorganismos en recipientes y con sistemas para la producción química que emplean estos microorganismos y métodos. De entre los beneficios de la presente invención está la productividad específica incrementada cuando tales microorganismos producen un producto químico durante un evento o ciclo de fermentación. La presente invención provee técnicas de producción y/o microorganismos modificados genéticamente para producir un producto químico de interés tal como ácido 3-hidroxipropiónico (3-HP) con uno o más medios para modular la conversión de malonil-CoA a moléculas de acilo grasas (que posteriormente en la presente pueden ser convertidas a ácidos grasos, por ejemplo moléculas de acil-ACP grasas) , en donde la ruta de producción comprende una etapa de conversión enzimática que usa malonil-CoA como sustrato. Los medios para modular la conversión de malonil-CoA a moléculas de acilo grasas, tales, como moléculas de acil-ACO grasas, son efectivos para equilibrar el flujo de carbono a biomasa microbiana con flujo de carbono al producto químico y sorprendentemente proporcionan la obtención de proporciones de productividad específicas elevadas.
Como se indica en la presente, varios aspectos de la presente invención son concernientes con una célula de microorganismo que comprende una ruta metabólica de malonil-CoA a 3-HP y medios para modular la conversión de malonil-CoA a moléculas de acilo grasas (que posteriormente pueden ser convertidas a ácidos grasos) también son provistos. Luego, cuando los medios para modulación modulan para disminuir tal conversión, un número proporcionalmente mayor de moléculas de malonil-CoA son i) producidas y/o 2) convertidas vía la ruta metabólica de malonil-CoA a 3-HP. En varias modalidades, modificaciones genéticas adicionales se pueden hacer, tal como para 1) incrementar los niveles de bicarbonato intracelular, tal como al incrementar la anhidrasa carbónica, 2) incrementar la actividad enzimática de acetil-CoA carboxilasa y transhidrogenasa NADPH-dependiente .
Incrementos inesperados en productividad especifica por una población de un microorganismo modificado genéticamente pueden ser obtenidos en los métodos y sistemas en los cuales aquel microorganismo tiene una ruta de producción microbiana de malonil-CoA a un producto químico seleccionado, también como la reducción en la actividad enzimática de una enzima seleccionada del sistema de ácido graso sintasa del microorganismo (más par icularmente, sus enzimas de alargamiento de ácido graso) . En varias modalidades, complementos específicos a un recipiente de bioreactor que comprende tal población de microorganismos pueden también ser provistos para mejorar adicionalmente los métodos y sistemas.
Adicionalmente, para un producto químico, ácido 3-hidroxipropiónico (3-HP) se proveen modificaciones genéticas para la ruta de producción y un complejo toleragénico es descrito para el cual se pueden hacer modificaciones genéticas y/o modificaciones del sistema de cultivo para incrementar la tolerancia del microorganismo 3-HP. Además, modificaciones genéticas para incrementar la expresión y/o actividad enzimática de anhidrasa carbónica y/o cianasa pueden proveer funciones dobles para mejorar ventajosamente tanto la producción de 3-HP como la tolerancia a 3-HP.
Otras modificaciones genéticas adicionales son reveladas en la presente para varias modalidades.
DEFINICIONES Como se usa en la presente, el peso seco de célula (DC ) para cepas de E.coli es calculado como 0.33 veces el valor de OD60o medido, en base al DCW de referencia a determinaciones de OD60o.
Como se usa en la presente, "actividad enzimática reducida", "reducir la actividad enzimática" y los semejantes pretende indicar que la célula de un microorganismo o una enzima aislada, exhibe un nivel de actividad más bajo que aquel medido en una célula comparable de la misma especie o su enzima natural. Esto es, la conversión enzimática del (los) sustrato (s) indicado (s) a producto (s) indicado (s) bajo condiciones estándar conocidas para aquella enzima es por lo menos 10, por lo menos 20, por lo menos 30, por lo menos 40, por lo menos 50, por lo menos 60, por lo menos 70, por lo menos 80 o por lo menos 90 por ciento menor que la actividad enzimática para la misma conversión bioquímica por una enzima natural (sin modificar) bajo una condición especificada estándar. Este término también puede incluir la eliminación de aquella actividad enzimática. Una célula que tiene actividad enzimática reducida de una enzima puede ser identificada utilizando cualquier método conocido en el arte. Por ejemplo, análisis de actividad enzimática puede ser usados para identificar células que tienen actividad enzimática reducida. Véase, por ejemplo Enzyme Nomenclature, Academic Press, Inc., New York 2007.
El término "ADN heterólogo", "secuencia de ácido nucleico heterólogo" y los semejantes como se usa en la presente se refieren a una secuencia de ácido nucleico en donde por lo menos uno de los siguientes es cierto: a) la secuencia de ácidos nucleicos es extraña a (esto es, no encontrada de manera natural) un microorganismo huésped dado, b) la secuencia puede ser encontrada naturalmente en un microorganismo huésped dado, pero en una cantidad no natural (por ejemplo, mayor que la esperada) o c) la secuencia de ácidos nucleicos comprende dos o más subsecuencias que no son encontradas en la misma relación entre si en la naturaleza. Por ejemplo, con respecto a la instancia (c) , una secuencia de ácido nucleico heteróloga que es producida recombinantemente · en grados o mas secuencias de genes no relacionados dispuestas para hacer un nuevo ácido nucleico funcional .
El término "heterólogo" pretende ' incluir el término "exógeno" ya que el último término es en general usado en el arte. Con referencia al genoma del microorganismo huésped antes de la introducción de una secuencia de ácido nucleico heterólogo, la secuencia de ácido nucleico que codifica para la enzima es heteróloga (ya sea que la secuencia de ácido nucleico heteróloga sea introducida o no a aquel genoma) .
Como se usa en la presente, el término "disrupción genética" o equivalentes gramaticales del mismo (incluyendo "disrumpir la función enzimática""disrupción de función enzimática" y los semejantes) , pretende dar a entender una modificación genética a un microorganismo que vuelve al producto genético codificado por tener una actividad de polipétido producida en comparación con la actividad de polipéptido en o de una célula de microorganismo no modificada. La modificación genética puede ser, por ejemplo cancelación de todo el gen, cancelación u otra modificación de una secuencia reguladora requerida para transcripción o traducción, cancelación de una porción del gen que da como resultado un producto genético truncado (por ejemplo, enzimas) o mediante cualquiera de varias estrategias de mutación que reducen la actividad (incluyendo a un nivel de actividad no detectable) del producto genético codificado. Una disrupción puede incluir ampliamente una cancelación de toda o parte de la secuencia de ácido nucleico que codifican la enzima y también incluyen pero no está limitada a otro tipo de modificaciones genéticas, por ejemplo introducción de codones separada, mutaciones de desplazamiento de cuadro, introducción o remoción de porciones del gen e introducción de una señal de degradación, aquellas modificaciones genéticas que afectan los niveles de transición de mARN y/o estabilidad y alteran el promotor o represor corriente arriba del gen que codifica la enzima. Alternativamente, tecnología antisentido puede ser usada para reducir la actividad de un polipéptido particular. Por ejemplo, una célula puede ser diseñada para contener un cADN que codifica una molécula antisentido e impide que un polipéptido sea traducido. Además, se puede usar silenciación del gen para reducir la actividad de un polipéptido particular.
El término "molécula antisentido" como se usa en la presente, abarca cualquier molécula de ácido nucleico o análogo de ácido nucleico (por ejemplo, ácidos nucleicos de péptidos) que contiene una secuencia que corresponde a la hebra de codificación de un polipétido endógeno. Una molécula antisentido también puede tener secuencias de flanqueo (por ejemplo, secuencias reguladoras) . Así, las moléculas antisentido pueden ser ribozimas u oligonucleótidos de antisentido.
Como se usa en la presente, un ribozima puede tener cualquier estructura general incluyendo, sin limitación, horquilla, cabeza de martillo o estructuras de cabeza de eje, a condición de que la molécula escinda el ARN.
El término "reducción" o "reducir" cuando es usado en tal frase y sus equivalentes gramaticales pretenden abarcar la eliminación completa de tal (es) conversión (es) .
La bio-producción como se usa en la presente, puede ser aeróbica, micro aeróbica o anaeróbica.
Como se usa en la presente, el término "suficientemente homólogo" se refiere a proteínas o porciones de las mismas que tienen secuencias de aminoácidos que incluyen un número mínimo, de residuos de aminoácidos idénticos o equivalentes cuando se comparan con una secuencia de aminoácidos de las secuencias de aminoácidos provistas en esta solicitud (incluyendo las SEQ ID No .: /Listados de secuencias) de tal manera que la proteína o porción de la misma es apta de obtener la reacción enziraática respectiva y/u otra función. Para determinar si una proteína particular o porción de la misma es suficientemente homologa puede ser determinado mediante un análisis de actividad enzimática, tal como aquellos conocidos comúnmente en el arte.
Descripciones y métodos para identidad y homologar la secuencia pretenden ser ejemplares y se reconoce que estos conceptos son bien entendidos en el arte. Además, se apreciará que las secuencias de ácido nucleico pueden ser variadas y todavía codificar una enzima u otro polipéptido que exhibe una funcionalidad deseada y tales variaciones están dentro del alcance de la presente invención.
Además de secuencias de ácidos nucleicos, "hibridización" se refiere al proceso en el cual dos polinucleótidos de una sola hebra se enlazan no covalentemente para formar un polinucleótido de doble hebra estándar estable. El término "hibridización" también se puede referir a la hibridización de triple hebra. El polinucleótido (usualmente) de doble hebra resultante es un "híbrido" o"dúplex". Las "condiciones de hibridización" incluirán comúnmente concentraciones de sal de menos de aproximadamente 1 M mas usualmente menor de aproximadamente 500 mM y menor de aproximadamente 200 mM. Las temperaturas de hibridización pueden ser tan bajas como de 5°C, pero son comúnmente mayores de 22°C, más comúnmente mayores de aproximadamente 30°C y frecuentemente están en exceso de aproximadamente 37°C. Las hibridizaciones son usualmente efectuadas bajo condiciones severas, esto es, bajo las cuales una sonda se hibridizará a su subsecuencia objetivo. Las condiciones severas son dependientes de la secuencia y son diferentes en diferentes circunstancias. Los fragmentos más largos pueden requerir temperaturas de hibridización más altas para la hibridización específica. Ya que otros factores pueden aceptar la de la hibridización incluyendo composición de base y longitud de las hebras complementarias, la presencia de solventes orgánicos y la extensión de desajustes de bases, la combinación de parámetros es más importante que la medida absoluta de cualquiera solo. En general, las condiciones severas son seleccionadas para ser aproximadamente 5°C más bajas que la Tm para la secuencia especifica a una fuerza iónica y pH definidos. Las condiciones severas ejemplares incluyen concentración de sal de por lo menos 0.01 M a no más de 1 M de concentración de Na (u otras sales) a un Ph de 7.0 a 8.3 y una temperatura de por lo menos 25°C. Por ejemplo, condiciones de SSPE 5X (750 mM NaCl, Na Fosfato 50 mM, EDTA 5 mM, pH 7.4) y una temperatura de 25-30°C son apropiados para las hibridizaciones de sonda alelo-especificas . Para condiciones severas, véase, por ejemplo, Sambrook y Russell y Anderson "Nucleic Acid Hybridization" Ist Ed., BIOS Scientific Publishers Limited (1999), que son incorporadas en la presente por referencia por' protocolos de hibridización . "Hibridización específicamente a" o "hibridización específicamente a" o expresiones semejantes se refieren al enlace, duplexión o hibridización de una molécula sustancialmente a o solamente una secuencia de nucleótidos particular o secuencias bajo condiciones severas cuando aquella secuencia está presente en una mezcla compleja (por ejemplo, ADN o ARN celular total) .
El término "variante funcional enzimática identificada" significa un polipéptido que se determina que posee una actividad enzimática y especifidad de una enzima de interés pero que tiene una secuencia de aminoácido diferente de tal enzima de interés. Una correspondiente "secuencia de ácido nucleico variante" puede ser construida que se determina que codifica tal variante funcional enzimática identificada. Para un propósito particular, tal como tolerancia increméntada a 3-HP vía modificaciones genéticas para incrementar la conversión enzimática en una o más de las etapas de conversión enzimáticas del 3 HPTGC en un microorganismo, una o más modificaciones genéticas se pueden hacer para proveer una o más secuencia (s) de ácido nucleico heterólogas que codifican una o más variante (s) funcionales enzimáticas de 3 HPTGC. Esto es, cada secuencia de ácido nucleico codifica un polipéptido que no es exactamente el polipéptido conocido de una enzima del 3 HPTGC, pero que no obstante se muestra que exhibe actividad enzimática de cada enzima. Tal secuencia de ácido nucleico y el polipétido que se codifica, puede caer dentro de un limite especificado de homología o identidad pero todavía mediante su provisión provee no obstante una actividad enzimática y especificidad deseada. La habilidad de obtener tales secuencias de ácido nucleico variantes y variantes funcionales esquemáticas especificadas por cada por avance permitido en los estados del arte en bio informática y diseño y bosquejo de proteína, incluyendo . avances en metodologías computacionales , predictivas y de alto rendimiento. Las diferentes funcionales incluyen más en general variantes funcionales enzimáticas y las frecuencias de ácido nucleicos que codifican, también como variantes de polipéptidos no enzimáticos, en donde la variante exhibe la función de la secuencia original (objetivo) .
Cuando se hace referencia en la presente, incluyendo en las reivindicaciones, a la modificación genética de un producto genético^ esto es, una enzima, se comprenderá que la modificación genética es de una secuencia de ácido nucleico, tal como o incluyendo en el gen, que codifica normalmente el producto genético afirmado, esto es, la enzima.
En algunas modalidades, un polipéptido respectivo truncado tiene por lo menos aproximadamente 90% de la plena longitud de un polipéptido codificado por una secuencia de ácido nucleico que codifica la enzima natural respectiva y más en particular, por lo menos 95% de la plena longitud de un polipéptido codificado por una secuencia de ácido nucleico que codifica la enzima natural respectiva. Polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido por lo menos, por ejemplo 95% "idéntica" a una secuencia de aminoácido de referencia de un polipéptido se pretende que la secuencia de aminoácidos del polipéptido reivindicado es idéntica a la secuencia de referencia excepto que la secuencia de polipétido reivindicada puede incluir hasta 5 alteraciones de aminoácido por cada 100 aminoácidos del aminoácido de referencia del polipéptido. En otras modalidades, la truncación puede ser más sustancial, como se describe en cualquier parte en la presente .
Especies y otras identificaciones filogénicas están de acuerdo con la clasificación conocida por la persona experimentada en el arte de microbiología.
En donde los métodos y etapas descritas en la presente indican ciertos eventos que ocurren en cierto orden, aquellos de habilidad ordinaria en el arte reconocerán que el ordenamiento de ciertas etapas puede ser modificado y que tales modificaciones están de acuerdo con las variaciones de la invención. Adicionalmente, ciertas etapas pueden ser efectuadas concurrentemente en un proceso en paralelo cuando sea posible, también como efectuadas secuencialmente .
Ejemplos proféticos provistos en la presente pretenden ser ampliamente ejemplares y no limitantes de ninguna manera.
Esto se aplica a los ejemplos con respecto a la separación y purificación de 3-HP y conversiones de 3-HP a compuestos corriente abajo, puesto que hay numerosos procedimientos posibles a tales etapas y conversiones incluyendo aquellas reveladas en referencias citadas e incorporadas en la presente.
El significado de las abreviaturas es como sigue: "C" significa Celsius o grados Celsius, como es claro de su uso, DCW significa peso seco de célula, "s" significa segundo (s), "min" significa minutos ( s ) , "h", "hr" o "hrs" significa hora(s), "psi" significa libras por pulgada cuadrada, "nm" significa nanómetros, "d" significa día(s), "µ?' o "uL" o "ul" significa microlitro ( s ) , "mi" significa mililitro (s) , "L" significa litro (s) , "mm" significa milímetro (s) , "nm" significa nanómetros, "mM" significa milimolar, "µ?" o "u " significa micromolar, "M" significa molar, "mmol" significa milimolíes), "umol" o "uMol" significa micromol (es) , "g" significa gramo (s), x^g" o "ug" significa microgramo ( s ) y "ng" significa nanogramo (s) , "PCR" significa reacción en cadena de polimerasa, "OD" significa densidad óptica, "OD6oo" significa la densidad óptica medida a una longitud de onda de fotón de 600 nm, "kDa" significa kilodalton, "g" significan la constante de gravitación, "pb" significa par (es) de base(s), "kpb" significa par (es) de kilo bases, "% w/v" significa porciento en peso/volumen, "% v/v" significa por ciento en volumen/volumen, "IPTG" significa isopropil^-D-tiogalactopiranoside, "RBS" significa sitio de enlace de ribosoma, "rpm" significa revoluciones por minuto, "HPLC" significa cromatografía líquida de alto desempeño y "GC" significa cromatografía de gases. Como se revela en la presente, "3-HP" significa ácido 3-hidroxipropiónico . También, 10?5 y los semejantes son tomados para dar a entender 105 y los semejantes.
I. FUENTES DE CARBONO Los medios de bio-producción que son usados en la presente invención con microorganismos recombinantes que tienen una ruta para biosintética para 3-HP deben contener fuentes de carbono o sustratos apropiados para las rutas metabólicas propuestas. Sustratos apropiados pueden incluir pero no están limitados a monosacáridos tales como glucosa y fructosa, oligosacáridos tales como lactosa o sacarosa, polisacáridos tales como almidón o celulosa o mezclas de los mismos y mezclas sin purificar de materias primas renovables tales como permeado de suero de queso, licor de maíz, melaza de remolacha de azúcar y malta de cebada. Adicionalmente, el sustrato de carbono puede también ser sustratos de un carbono tales como dióxido de carbono, monóxido de carbono o metanol para los cuales la conversión metabólica a intermediarios bioquímicos clave ha sido demostrada. Además de sustratos de uno y dos carbonos organismos metilotróficos son también conocidos para utilizar -un número de otros compuestos que contienen carbono tales como metilamina, glucosamina y una variedad de aminoácidos para actividad metabólica.
Aunque se contempla que todos los sustratos de carbono mencionados anteriormente y mezclas de los mismos son apropiados en la presente invención como fuente de carbono, sustratos de carbono comunes, sustratos como fuentes de carbono son glucosa, fructosa y sacarosa, también como mezclas de cualquiera de estos azúcares. Otros sustratos apropiados incluyen xilosa, arabinosa, otros azúcares de C-5 a base de celulosa, jarabe de maíz de alto contenido de fructosa y varios otros azúcares y mezclas de azúcar como están disponibles comercialmente . La sacarosa puede ser obtenida de materias primas tales como caña de azúcar, remolachas, cassava , plátanos u otra fruta y sorgo dulce. La glucosa y dextrosa pueden ser obtenidas por medio de sacarificación de materias primas a base de almidón incluyendo granos tales como maíz, trigo, centeno, cebada y avena. También, en algunas modalidades toda o una porción de la fuente de carbono puede ser glicerol. Alternativamente, el glicerol puede ser excluido como una fuente de carbono agregada.
En una modalidad, la fuente de carbono es seleccionada de glucosa, fructosa, sacarosa, dextrosa, lactosa, glicerol y mezclas de los mismos. Variadamente, la cantidad de estos componentes en la fuente de carbono puede ser mayor de aproximadamente 50%, mayor de aproximadamente 60%, mayor de aproximadamente 70%, mayor de aproximadamente 80%, mayor de aproximadamente 90% o mas, hasta 100% o esencialmente 100% de la fuente de carbono.
Además, se sabe que los organismos metilotróficos utilizan un número de otros compuestos que contienen carbono tales como metilamina, glucosamina y una variedad de aminoácidos por actividad metabólica. Por ejemplo, se sabe que la levadura metilotrófica utiliza el carbono de metilamina para formar trehalosa o glicerol (Bellion et al., Microb. Growth Cl Compd. (Int. Symp. ) , 7th (1993), 415-32.
Editor(s) : Murrell, J. Collin; Kelly, Don P. Publisher: Intercept, Andover, UK) . Similarmente, varias especies de Candida metabolizarán alanina o ácido oleico (Sulter et al., Aren. Microbiol. 153:485-489 (1990)) . De aquí, se contempla que la fuente de carbono utilizada en modalidades de la presente invención pueden abarcar una amplia variedad de sustratos que contienen carbono.
Además, azúcares fermentables pueden ser obtenidos de biomasa celulósica y lignocelulósica por medio de procesos de pretratamiento y sacarificación, como se describe, por ejemplo en la Publicación de Patente Estadounidense No. 2007/0031918A1, que es incorporada en la presente por referencia. La biomasa se refiere a cualquier material celulósico o lignocelulósico e incluye materiales que comprenden celulosa y opcionalmente comprenden además hemicelulosa, lignina, almidón, oligosacáridos y/o monosacáridos . La biomasa puede también comprender componentes adicionales, tales como proteina y/o lipido. La biomasa puede ser derivada de una sola fuente o la biomasa puede comprender una mezcla derivada de más de una fuente; por ejemplo, la biomasa podría comprende una mezcla de mazorcas de maíz y rastrojo de maíz o una mezcla dé césped y hojas. La biomasa incluye pero no está limitada a cosechas de bioenergía, residuos agrícolas, desperdicio sólido municipal, desperdicio sólido industrial, lodos de la manufactura de papel, desperdicio de patio, desperdicio de madera y bosques. Ejemplos de biomasa incluyen, pero no están limitados a, grano de maíz, mazorcas de maíz, residuos de cosecha tales como cáscaras de maíz, rastrojo de maíz, céspedes, trigo, paja de trigo, cebada, paja de cebada, heno, paja de arroz, césped de cambio, papel de desperdicio, bagazo de caña de azúcar, sorgo, soya, componentes obtenidos de la molienda de granos, árboles, ramas, raices, hojas, fragmentos de madera, aserrín, arbustos y matorrales, vegetales, frutas, flores y abono de animales. Cualquiera de tal biomasa puede ser usada en un método o sistema de bio-producción para proveer una fuente de carbono. Varios procedimientos para romper biomasa celulósica a mezclas de moléculas de carbono más disponibles y utilizables, incluyendo azúcares, incluyen: calentamiento en presencia de ácido concentrado o diluido (por ejemplo, <1% ácido sulfúrico) ; tratamiento con amoníaco; tratamiento con sales iónicas; degradación enzimática; y combinaciones de estos. Estos métodos normalmente siguen la separación mecánica y molienda y son seguidos por procesos de separación apropiados.
En varias modalidades, cualquiera de una amplia variedad de azúcares, incluyendo pero no limitados a sacarosa, glucosa, xilosa, celulosa o semicelulosa, son provistos a un microorganismo, tal como en un sistema industrial que comprende un recipiente de reactor en el cual un medio deprimido (tal como medio de sales mínimas que incluyen pero no están limitados a medios mínimos de M9, medios mínimos de sulfato de potasio, medios mínimos de levadura sintética y muchos otros o variaciones de estos) , un inoculo de un microorganismo que provee una o más de las alternativas de ruta biosintética de 3-HP y la fuente de carbono pueden ser combinados. La fuente de carbono entra a la célula y es catabolizada mediante rutas metabólicas bien conocidas y comunes para producir intermediarios metabólicos comunes, incluyendo fosfoenolpiruvato (PEP) . (Véase Molecular Biology of the Cell, 3rd Ed. , B. Alberts et al. Garland Publishing, New York, 1994, pp. 42-45, 66-74, incorporada por referencia por las enseñanzas de rutas catabólicas metabólicas básicas para azúcares; Principies of Biochemistry, 3rd Ed. , D. L. Nelson & M. M. Cox, Worth Publishers, New York, 2000, pp 527-658, incorporada por referencia por las enseñanzas de rutas metabólicas mayores; y Biochemistry, 4th Ed. , L. Stryer, W. H. Freeman and Co., New York, 1995, pp. 463-650, también incorporada por referencia por las enseñanzas de rutas metabólicas mayores) .
El carbono bio-basado puede ser distinguido del carbono a base de petróleo de acuerdo con una variedad de métodos, incluyendo sin limitación ASTM D6866 o varias otras técnicas. Por ejemplo, las proporciones de carbono 14 y carbono 12 difieren en fuentes de carbón bio-basadas versus fuentes a base de petróleo, en donde proporciones de carbono 14 más altas son encontradas en fuentes de carbono bio-basadas. En varias modalidades, la fuente de carbono no es a base de petróleo no es predominantemente a base de petróleo. En varias modalidades, la fuente de carbono es mayor de aproximadamente 50% no a base de petróleo, mayor de aproximadamente 60% no a base de petróleo, mayor de aproximadamente 70% no a base de petróleo, mayor de aproximadamente 80% no a base de petróleo, mayor de aproximadamente 90% no a base de petróleo o más. En varias modalidades, la fuente de carbono tiene una proporción de carbono 14 a carbono 12 de aproximadamente 1.0 x 10~14 o mayor .
Varios componentes pueden ser excluidos de la fuente de carbono. Por ejemplo, en algunas modalidades, ácido acrílico, 1, 4-butandiol y/o glicerol son excluidos o esencialmente excluidos de la fuente de carbono. Como tal, la fuente de carbono de acuerdo con algunas de las modalidades de la invención puede ser menor de aproximadamente 50% de glicerol, menor de aproximadamente 40% de glicerol, menor de aproximadamente 30% de glicerol, menor de aproximadamente 20% de glicerol, menor de aproximadamente 10% de glicerol, menor de aproximadamente 5% de glicerol, menor de aproximadamente 1% de glicerol o menos. Por ejemplo, la fuente de carbono puede estar esencialmente libre de glicerol. Esencialmente libre de glicerol significa que cualquier glicerol que puede estar presente en una cantidad residual no contribuye sustancialmente a la producción del compuesto químico objetivo.
II. MICROORGANISMOS Los elementos como se describen y reivindican en la presente pueden ser provistos en un. microorganismo seleccionado¦ del listado en la presente u otro microorganismo apropiado, que también comprende una o más rutas de bio-producción de 3-HP natural, introducidas o mejoradas. Así, en algunas modalidades, el microorganismo comprende una ruta de producción de 3-HP endógena (que puede en algunas de tales modalidades ser mejorada) , mientras que en otras modalidades, el microorganismo no comprende una ruta de producción de 3-HP endógena .
Variedades de estos microorganismo modificados genéticamente pueden comprender modificaciones genéticas y/u otras alteraciones del sistema como se puede describir en otras solicitudes de patente de uno o más del (los) presente (s) inventor (es) y/o sujeto a cesión al propietario de la presente solicitud de patente.
Los ejemplos describen modificaciones específicas y evaluaciones a ciertos microorganismos bacterianos y de levadura. El alcance de la invención no pretende estar limitado a tales especies, pero para ser en general aplicable a un amplio intervalo de microorganismos apropiados. En general, un microorganismo usado por la presente invención puede ser seleccionado de bacterias, cianobacterias, hongos filamentosos y levaduras.
Para algunas modalidades, los huéspedes microbianos inicialmente seleccionados para la bio-producción toleragénica de 3-HP deben también utilizar azúcares incluyendo glucosa a una alta proporción. La mayoría de los microbios son aptos de utilizar carbohidratos. Sin embargo, ciertos microbios ambientales no pueden utilizar carbohidratos a alta eficiencia y por consiguiente no serian huéspedes apropiados para tales modalidades que son destinadas para glucosa u otros carbohidratos como la fuente de carbono agregada principal.
A medida que los genomas de varias especies son conocidas, la presente invención puede ser aplicada fácilmente a un intervalo siempre incrementado de microorganismos apropiados. Además, dado el relativamente bajo costo de secuenciación genética, la secuencia genética de una especie de interés puede fácilmente ser determinada para hacer aplicación de- aspectos de la presente invención más fácilmente obtenible (en base a la facilidad de aplicación de modificaciones genéticas a un organismo que tiene una secuencia genómica conocida) .
Más en particular, en base a los varios criterios descritos en la presente, huéspedes microbianos apropiados para la bio-producción de 3-HP que comprenden aspectos de tolerancia provistos en la presente en general pueden incluir, pero no están limitados a, cualesquier organismos gram-negativos, más particularmente un miembro de la familia Enterobacteriaceae, tal como E. coli, o Oligotropha carboxidovorans o Pseudomononas sp. ; cualquier microorganismo gram-positivo, por ejemplo Bacillus subtilis , Lactobaccilus sp. o Lactococcus sp.; una levadura, por ejemplo Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris o Pichia stipitis; y otros grupos o especies microbianas. Más par icularmente, huéspedes microbianos apropiados para la bio-producción de 3-HP incluyen en general, pero no están limitados a miembros de los géneros Clostridium, Zymomonas, Escherichia , Salmonella , Rhodococcus, Pseudomonas , Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus, Alcaligenes, Klebsiella , Paenibacillus, Arthrobacter, Corynebacterium , Brevibacterium , Pichia, Candida, Hansenula y Saccharomyces. Huéspedes que pueden ser particularmente de interés incluyen: Oligotropha carboxidovorans (tal como cepa 0M5) , Escherichia coli, Alcaligenes eutrophus (Cupriavidus necator) , Bacillus licheniformis, Paenibacillus macerans, Rhodococcus erythropolis, Pseudomonas putida, Lactobacillus plantarum, Enterococcus faecium, Enterococcus gallinarium, Enterococcus faecalis, Bacillus subtilis y Saccharomyces cerevisiae.
Los huéspedes que pueden ser particularmente de interés incluyen: Oligotropha carboxidovorans (tal como la cepa OM5T) , Escherichiá coli, Alcaligenes eutrophus {Cupriavidus necator) , Bacillus lichenifor is, Paenibacillus macerans, Rhodococcus erythropolis, Pseudomonas putida, Lactobacillus plantarum, Enterococcus faecium, Enterococcus gallínarium, Enterococcus faecalis, Bacillus subtilis y Saccharomyces cerevisiae. También, cualquiera de las cepas conocidas de estas especies pueden ser utilizadas como microorganismo de partida, como pueden cualquiera de las siguientes especies incluyendo respectivas cepas de los mismos - Cupriavidus basilensis, Cupriavidus campinensis, Cupriavidus gilardi, Cupriavidus laharsis, Cupriavidus metallidurans, Cupriavidus oxalaticus, Cupriavidus pauculus, Cupriavidus¦pinatubonensis, Cupriavidus respiraculi y Cupriavidus taiwanensis .
En algunas modalidades, el microorganismo recombinante es una bacteria gram-positiva . En algunas modalidades, el microorganismo recombinante es seleccionado de los géneros Clostridium, Salmonella , Rhodococcus, Bacillus , Lactobacillus, Enterococcus, Paenibacillus , Arthrobacter, Corynebacterium y Brevibacterium. En algunas modalidades, el microorganismo recombinante es seleccionado de la especie Bacillus licheniformis, . Paenibacillus macerans, Rhodococcus erythropolis, Lactobacillus plantarum, Enterococcus faecium, Enterococcus gallinarium, Enterococcus faecalis y Bacillus subtilis . En modalidades particulares, el microorganismo recombinante es una cepa de B. subtilis.
En algunas modalidades, el microorganismo recombinante es una levadura. En algunas modalidades, el microorganismo recombinante es seleccionado de los géneros Pichia, . Candida, Hansenula y Saccharomyces . En modalidades particulares, el microorganismo recombinante es Saccharomyces cerevisiae.
Se apreciará además, en vista de la revelación, que cualquiera de los microorganismos anteriores pueden ser usados para la producción de productos químicos diferentes de 3-HP.
La habilidad para modificar genéticamente el huésped es esencial para la producción de cualquier microorganismo recombinante .
El modo de tecnología de transferencia genética puede ser mediante electroporación, conjugación, transducción o transformación natural. Un amplio intervalo de plásmidos conjugativos de. huésped y marcadores de resistencia al fármaco están disponibles. Los vectores de clonación son confeccionados a los organismos huésped en base a la naturaleza de marcadores de resistencia a antibiótico que pueden funcionar en aquel huésped.
III. MEDIOS Y CONDICIONES DE CULTIVO Además de una fuente de carbono apropiada, tal como seleccionada de uno de los tipos revelados en la presente, los medios de bio-producción deben contener minerales apropiados, sales, co-factores, soluciones reguladoras del pH y otros componentes, conocidos para aquellos experimentados en el arte, apropiados para el crecimiento de los cultivos y promoción de la ruta enzimática necesaria para la producción de 3-HP u otros productos fabricados en virtud de la presente invención .
Otro aspecto de la invención es concerniente con medios y condiciones de cultivo que comprenden microorganismos modificados genéticamente de la invención y opcionalmente complementos .
Comúnmente las células son cultivadas a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 25°C a aproximadamente 40°C en un medio apropiado, también como hasta 70°C para' microorganismos termofilicos . Medios de cultivo apropiados en la presente invención son medios preparados comercialmente comunes tales como caldo de Luria Bertani (LB) , medio mínimo M9, caldo de Dextrosa de Sabouraud (SD) , caldo de medio de Levadura (YM) , medio mínimo de levadura sintética (Ymin) y medios mínimos como se describen en la presente, tales como medios mínimos M9. Otros medios de cultivo definidos o sintéticos pueden también ser usados y el medio apropiado para cultivo del microorganismo particular será conocido para aquel experimentado en el arte de microbiología o ciencia de bio-producción . En varias modalidades el medio mínimo puede ser desarrollado y usado que no compromete o que tiene un bajo nivel de adición de varios componentes, por ejemplo menos de 10, 5, 2 ó 1 g/L de una fuente de nitrógeno compleja incluyendo pero no limitado a extracto de levadura, peptona, triptona, harina de soya, licor de maíz, o caseína. Estos medios mínimos pueden también tener complementación limitada de mezclas de vitaminas incluyendo biotina, vitamina B12 y derivados de vitamina B12, tiamina, pantotenato y otras vitaminas. Los medios mínimos pueden también tener fuentes nutrientes inorgánicas simples que contienen menos de 28, 17 ó 2.5 mM de fosfato, menos de 25 ó 4 mM de sulfato y menos de 130 ó 50 mM de nitrógeno total.
Los medios de bio-producción que son usados en modalidades de la presente invención con microorganismo modificados genéticamente, deben contener sustratos de carbono apropiados para las rutas metabólicas propuestas. Como se describe anteriormente en la presente, sustratos de carbono apropiados incluyen monóxido de carbono, dióxido de carbono y varios azúcares monoméricos y oligoméricos .
Intervalos de pH apropiados para la bio-producción son de entre pH 3.0 a pH 10.0, en donde el pH de 6.0 a pH 8.0 es un intervalo de pH típico para la condición inicial. Sin embargo, las condiciones de cultivo reales para una modalidad particular no pretenden estar limitados por estos intervalos de pH.
La bio-producción puede ser efectuada bajo condiciones aeróbicas, microaeróbicas o anaeróbicas con o sin agitación.
La cantidad de 3-HP u otro (s) producto (s) producido en los medios de bio-producción puede ser determinada en general utilizando un número de métodos conocidos en el arte, por ejemplo, cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC) , cromatografía de gases (GC) o GC/espectroscopía de masas (MS) . . Métodos de HPLC específicos para los ejemplos específicos son provistos en la presente.
IV. REACTORES Y SISTEMAS DE BIO-PRODUCCIÓN Los sistemas de fermentación que utilizan métodos y/o composiciones de acuerdo con la invención también están dentro del alcance de la invención.
Cualquiera de los microorganismos recombinantes como se describen y/o son referidos en la presente pueden ser introducidos a un sistema de bio-producción industrial en donde los microorganismos convierten una fuente de carbono a 3-HP en una operación comercialmente viable. El sistema de bio-producción incluye la introducción de tal microorganismo recombinante a un recipiente de bioreactor, con un sustrato de fuente de carbono y medios de bio-producción apropiados para el cultivo del microorganismo recombinante y mantener el sistema de bio-producción dentro de un intervalo de temperatura apropiado (e intervalo de concentración de oxigeno disuelto si la reacción. es aeróbica o microaeróbica) por un tiempo apropiado para obtener una conversión deseada de una porción de las moléculas de sustrato a 3-HP. Los sistemas de bio-producción industriales y su operación son bien conocidos para aquellos experimentados en las artes de ingeniería química e ingeniería de bioproceso.
La bio-producción puede ser efectuada bajo condiciones aeróbicas, microaeróbicas o anaeróbicas, con o sin agitación. La operación de cultivos y poblaciones de microorganismos para obtener condiciones aeróbicas, microaeróbicas y anaeróbicas son conocidas en el arte y los niveles de oxígeno disuelto de un cultivo líquido que comprende medios nutrientes y tales poblaciones de microorganismos pueden ser monitoreados para mantener o confirmar una condición aeróbica, microaeróbica o anaeróbica deseada. Cuando se usa gas de síntesis como materia prima de alimentación, se pueden utilizar condiciones aeróbicas, microaeróbicas o anaeróbicas. Cuando se usan azúcares, se pueden implementar condiciones anaeróbicas, aeróbicas o microaeróbicas en varias modalidades.
Cualquiera de los microorganismos recombinantes como se describen y/o son referidos en la presente pueden ser introducidos a un sistema de bio-producción industrial en donde los microorganismos convierten en una fuente de carbono en 3-HP y opcionalmente en varias modalidades también a uno o más compuestos corriente debajo de 3-HP en una operación comercialmente viable. El sistema de bio-producción incluye la introducción de tal microorganismo recombinante a un recipiente de bioreactor, con un sustrato de fuente de carbono y medios de bio-producción apropiados para el cultivo del microorganismo recombinante y mantener el sistema de bio-producción dentro de un intervalo de temperatura apropiado (e intervalo de concentración de oxigeno disuelto si la reacción es aeróbica o microaeróbica) por un tiempo apropiado para obtener una conversión deseada de una porción de las moléculas de sustrato a 3-HP.
En varias modalidades, componentes de gas de síntesis o azúcares son provistos a un microorganismo, tal como en un sistema industrial que comprende un recipiente de reactor en el cual medios definidos (tales como medios de sales mínimas incluyendo pero no limitado a medios mínimos de M9, medios mínimos de sulfato de potasio, medios mínimos de levadura sintética y muchas otras de variaciones de estos), un inoculo de un microorganismo- que provee una modalidad de la(s) ruta(s) biosintética ( s ) enseñada (s) en la presente y la fuente de carbono pueden ser combinados. La fuente de carbono entra a la célula y es catabolizada mediante rutas metabólicas bien conocidas y comunes para producir intermediarios metabólicos comunes, incluyendo fosfoenolpiruvato (PEP) . Molecular Biology of the Cell, 3rd Ed., B. Alberts et al. Garland Publishing, New York, 1994, pp. 42-45, 66-74, incorporada por referencia por las enseñanzas de rutas catabólicas metabólicas básicas para azúcares; Pxinciples of Bíochemistry, 3rd Ed. , D. L. Nelson & M. M. Cox, Worth Publishers, New York, 2000, pp. 527-658, incorporada por referencia a las enseñanzas de rutas metabólicas mayores; y Bioc emístry, 4th Ed. , L. Stryer, W. H. Freeman and Co., New York, 1995, pp. 463-650, también incorporada por referencia por las enseñanzas de rutas metabólicas mayores) .
Además de los tipos de bio-producción industrial, varias modalidades de la presente invención pueden emplear un tipo por lotes de bioreactor industrial. Un sistema de bioreactor por lotes clásico es considerado "cerrado" lo que significa que la composición de medios es establecida al comienzo de un evento de bio-producción respectivo y no sometida a alteraciones y adiciones artificiales durante el periodo de tiempo que termina sustancialmente con el final del evento de bio-producción. Así, al comienzo del evento de bio-producción el medio es inoculado con el organismo u organismos deseados y se permite que la bio-producción ocurra sin agregar nada al sistema. Sin embargo, comúnmente un tipo de evento de bio-producción "por lotes" es un lote con respecto a la adición de la fuente de carbono y se hacen frecuentemente intentos para controlar factores tales como el pH y concentración de oxigeno. En los sistemas por lotes, las composiciones de metabolito y biomasa del sistema cambian constantemente hasta el tiempo en que el evento de bio-producción es detenido. Dentro de los cultivos por lotes las células se moderan por medio de una fase de retardo estática a una fase logarítmica de crecimiento alto y finalmente a una fase estacionaria en donde la velocidad de crecimiento es disminuida o detenida. Si esta sin truncar, las células en la fase estacionaria inevitablemente morirán. Las células en 1 fase logarítmica en general son responsables por el global de la producción de un producto final deseado o intermediario.
Una variación en el sistema por lotes estándar es el sistema de alimentación por lotes. Los procesos de bio-producción de alimentación por lotes son también apropiados de la presente invención y comprenden un sistema por lotes típico con la excepción de que los nutrientes, incluyendo el sustrato, son agregados en incrementos a medida que la bio-producción avanza. Los sistemas de alimentación por lotes son útiles cuando la represión catabólica es apta de inhibir el metabolismo de las células y en donde es deseable tener cantidades limitadas de sustrato en el medio. La medición de la . concentración real de nutriente en los sistemas de alimentación por lotes se puede efectuar directamente, tal como mediante análisis de muestra a diferentes tiempos o se puede estimar en base a los cambios de factores mensurables tales como pH, oxigeno disuelto y la presión parcial de gases desperdicios tales como C02. Los procedimientos por lotes y los procedimientos de alimentación por lotes- son comunes y bien conocidos en el arte y se pueden encontrar ejemplos en Thomas D. Brock in Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Second Edition (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, Mass., Deshpande, Mukund V., Appl . Biochem. Biotechnol., 36:227, (1992), y Biochemical Engíneering Fundamentáis, 2nd Ed. J. E. Bailey ay D. F. Ollis, cGraw Hill, New York, 1986, incorporadas en la presente por referencia por la instrucción general en cuanto a bio-producción .
Aunque las modalidades de la presente invención pueden ser efectuadas en modo por lotes o en modo de alimentación* por lotes, se contempla que la invención seria adaptable a métodos de bio-producción continuos. La bio-producción continua se considera un sistema "abierto" en donde un medio de bio-producción definido es agregado continuamente a un bioreactor y una cantidad igual de medio condicionado es removida simultáneamente para tratamiento. La bio-producción continua mantiene en general los cultivos dentro de un intervalo de densidad controlado en donde las células están principalmente en crecimiento de fase logarítmica. Dos tipos de operación de bioreactor continuo incluyen un quimiostático, en donde se alimentan medios nuevos al recipiente en tanto que simultáneamente se retira una proporción igual del contenido del recipiente. La limitación de este procedimiento es que se pierden células y no es obtenible en general alta densidad celular. En efecto, comúnmente se puede obtener una densidad celular mucho más alta con un proceso de alimentación por lotes. Otro bioreactor continuo utiliza cultivo de perfusión, que es similar al procedimiento de quimiostático excepto que la corriente que es removida del recipiente es . sometida a una técnica de separación que recicla las células viables de regreso al recipiente. Este tipo de operación de bioreactor continuo ha mostrado producir densidades celulares significativamente mas altas que la alimentación por lotes y se puede poner en operación continuamente. La bio-producción continua es particularmente ventajosa para operaciones industriales debido a que tienen menos tiempo de paralización asociado con el drenaje, limpieza y preparación del equipo para el siguiente evento de bio-producción. Además, es comúnmente mas económico poner en operación continuamente operaciones unitarias corriente abajo, tales como destilación, que ponerlas en operación en el modo por lotes.
La bio-producción continua permite la modulación de un factor o cualquier número de factores que afectan el crecimiento celular o concentración del producto final. Por ejemplo, un método mantendrá un nutriente limitante tal como la fuente de carbono o nivel de nitrógeno a una proporción fija y permitirá que todos los otros parámetros se moderen. En otro sistema, una diversidad de factores que afectan el crecimiento pueden ser alterados continuamente mientras que la concentración celular medida por la turbidez del medio, es mantenida constante. Los métodos de modulación de nutrientes y factores de crecimiento para procesos de bio-producción continuos, también como técnicas para maximizar la velocidad de formación de producto son bien conocidos en el arte de microbiología industrial y una variedad de métodos son detallados por Brock, supra.
Se contempla que las modalidades de la presente invención se pueden llevar a la práctica utilizando ya sea procesos por lotes, de alimentación por lotes o continuos y que cualquier modo de bio-producción seria apropiado. Se contempla que las células pueden ser inmovilizadas sobre un andamio inerte como catalizadores de célula entera sometidos a condiciones de bio-producción apropiadas para la producción de 3-HP o ser cultivadas en medio líquido en un recipiente, tal como un recipiente de cultivo. Así, las modalidades usadas en tales procesos y en sistemas de bio-producción que usan estos procesos, incluyen una población de microorganismos modificados genéticamente de la presente invención, un sistema de cultivo que comprende tal población en un medio que comprende nutrientes para la población y métodos de fabricación de 3-HP y después de esto, un producto corriente debajo de 3-HP.
Modalidades de la invención incluyen métodos de fabricación de 3-HP en un sistema de bio-producción, algunos de tales métodos pueden incluir obtener 3-HP después de tal evento de bio-producción. Por ejemplo, un método de fabricación de 3-HP puede comprender: proveer a un recipiente de cultivo un medio que comprende nutrientes apropiados; proveer al recipiente de cultivo un inoculo de un microorganismo modificado genéticamente que comprende modificaciones genéticas descritas en la presente, de tal manera que el microorganismo produce 3-HP a partir de gas de síntesis y/o una molécula de azúcar y mantener el recipiente de cultivo bajo condiciones apropiadas para que el microorganismo modificado genéticamente produzca 3-HP.
Está dentro del alcance de la presente invención producir y utilizar el método de bio-producción y sistemas de bio-producción, incluyendo sistemas de bio-producción industriales para la producción de 3-HP, un microorganismo recombinante diseñado genéticamente para modificar uno o más aspectos efectivos para incrementar la tolerancia a 3-HP (y en algunas modalidades, también la bio-producción de 3-HP) por al menos 20% con respecto al microorganismo testigo que carece de una o más modificaciones.
En varias modalidades, la invención es concerniente con un sistema para la bio-producción de ácido acrilico como se describe en la presente, el sistema comprende: un tanque para la sacarificación de biomasa; una linea para hacer pasar el producto de sacarificación a un tanque de fermentación opcionalmente via un tanque de pre-fermentación; un tanque de fermentación apropiado para el cultivo de la célula de microorganismo; una linea para descargar el contenido del tanque de fermentación a un recipiente de extracción y/o separación ; un recipiente de extracción y/o separación apropiado para la remoción de ácido 3-hidroxipropiónico del desperdicio del cultivo celular; una linea para transferir el ácido 3-hidroxipropiónico a un recipiente de deshidratación y un recipiente de deshidratación apropiado para la conversión del ácido 3-hidroxipropiónico a ácido acrilico. En varias modalidades, el sistema incluye uno o más tanques de 3-fermentación, columnas de destilación, recipiente de centrifuga, columnas de retro extracción, recipientes mezcladores o combinaciones de los mismos.
Las siguientes fuentes publicadas e incorporadas por referencia en la presente por sus respectivas enseñanzas para indicar el nivel de habilidad en estas artes relevantes y como sea necesario para apoyar una revelación que enseña como elaborar y usar métodos de bio-producción industrial de 3-HP u otro(s) producto (s) producidos en virtud de la invención a partir de fuentes de azúcar y también sistemas industriales que pueden ser usados para obtener tal conversión con cualquiera de los microorganismos recombinantes de la presente invención (Biochemical Engineering Fundamentáis, 2nd Ed. J. E . Bailey and D. F. Ollis, McGraw Hill, New York, 1986, todo el libro por propósitos indicados en el Capitulo 9, páginas 533-657 en particular para diseño del reactor biológico ; Unit Operations of Chemical Engineering, 5th Ed., W. L. McCabe et al., McGraw Hill, New York 1993, todo el libro por propósitos indicados y particularmente por procesos y análisis de tecnologías de separación; Equilibrium Staged Separations, P. C. Wankat, Prentice Hall, Englewood Cliffs, NJ USA, 1988, todo el libro por las enseñanzas de tecnologías de separación) . En general, se apreciará además en vista de la revelación que cualquiera de . los métodos y sistemas anteriores pueden ser usados para la producción de productos químicos diferentes de 3-HP.
V. MODIFICACIONES GENÉTICAS, SECUENCIAS DE UCLEÓTIDOS Y SECUENCIAS DE AMINOÁCIDOS Modalidades de la presente invención pueden resultar de introducción de un vector de expresión a un organismo huésped, en donde el vector de expresión contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica por una enzima que es encontrada o no, normalmente en un microorganismo huésped.
La habilidad para modificar genéticamente una célula huésped es esencial para la producción de cualquier microorganismo modificado genéticamente ( recombinante ) . El modo de tecnología de transferencia genética puede ser mediante electroporación, conjugación, transducción o transformación natural. Un amplio intervalo de plásmidos conjugativos huésped y marcadores de resistencia a fármaco están disponibles. Los vectores de clonación son confeccionados a los organismos huésped en base a la naturaleza de los marcadores de resistencia a antibiótico que pueden funcionar en aquel huésped. También, como se revela en la presente, un microorganismo modificado genéticamente (recombinante) puede comprender modificaciones diferentes de vía introducción de plásmido, incluyendo modificaciones a su ADN genómico.
Se ha reconocido por mucho tiempo en el arte que los aminoácidos en secuencias dé aminoácidos se pueden hacer variar sin efecto significativo sobre la estructura y función de proteínas. Tales variantes incluidas pueden constituir cancelaciones, inserciones, inversiones, repeticiones y sustituciones tipo, en tanto que la actividad enzimática indicada no sea afectada de manera adversa significativamente. Guía concerniente a cuales cambios de aminoácidos son. probables de ser fenotípicamente silentes se puede encontrar, ínter alia, en Bowie, J. U., et al., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions, " Science 247:1306-1310 (1990). Esta referencia es incorporada por referencia por tales enseñanzas que, sin embargo, también son generalmente conocidas para aquellos experimentados en el arte.
En varias modalidades, los polipéptidos obtenidos mediante la expresión de las moléculas de polipéptido de la presente invención pueden tener por lo menos aproximadamente 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad con una o más secuencias de aminoácidos codificadas por los genes y/o secuencias de ácido nucleico descritas en la presente por la tolerancia a 3-HP relacionada y rutas de bio síntesis.
De hecho, si cualquier polipéptido particular es por lo menos, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticos a cualquier secuencia de aminoácidos de referencia de cualquier polipéptido descrito en la presente (que pueden corresponder con una secuencia de ácido nucleico particular descrito en la presente) , tal secuencia de polipéptido particular puede ser determinada convencionalmente utilizando programas de computadora conocidos tales como el programa de Bestfit (Paquete de Análisis de Secuencia de isconsin, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, adison, Wis. 53711)). Cuando se usa Bestfit o cualquier otro programa de alineación de secuencia para determinar si una secuencia particular es por ejemplo 95% idéntica a una secuencia de referencia de acuerdo con la presente invención, los parámetros son ajustados de tal manera que el porcentaje de identidad es calculado con respecto a la plena longitud de la secuencia de aminoácido de referencia y separaciones en homología de hasta 5% del número de total de residuos de aminoácidos en la secuencia de referencia son permitidas.
Mas en general, las construcciones de ácido nucleico pueden ser preparadas que comprenden un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene una actividad enzimática enlazada operativamente a una o más (varias) secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia de codificación en un microorganismo, tal como E.coli, bajo condiciones compatibles con la secuencias de control. El polinucleótido aislado puede ser manipulado para proveer la expresión del polipéptido. La manipulación de la secuencia del polinucleótido antes de su inserción a un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. Las técnicas para modificar secuencias de polinucleótidos que utilizan métodos de ADN recombinantes están bien establecidas en el arte.
La secuencia de control puede ser una secuencia de promotor apropiada, una secuencia de nucleótidos que es reconocida por una célula huésped para expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención. La secuencia de promotor contiene secuencias de control transcripcionales que moderan la expresión del polipéptido. El promotor puede ser cualquier secuencia de nucleótidos que muestra actividad transcripcional en la célula huésped de elección, incluyendo promotores mutantes, truncados e híbridos y puede ser obtenido de genes que codifican polipéptidos extracelulares o intracelulares ya sea homólogos o heterólogos a la célula huésped. Ejemplos de promotores apropiados para elegir la transcripción de construcciones de ácido nucleico, especialmente en una célula huésped de E.coli, son el promotor lac (Gronenborn, 1976, Mol. Gen. Genet. 148: 243-250), promotor tac (DeBoer et a/., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80: 21-25), promotor trc (Brosius et al, 1985, J. Biol. Chem. 260: 3539-3541 promotor de ARN polimerasa T7 (Studier and Moffatt, 1986, J. Mol. Biol. 189: 113-130), promotor de pago pL (Elvin et al., 1990, Gene 87: 123-126), promotor tetA (Skerra, 1994, Gene 151: 131-135), promotor araBAD (Guzmán et al., 1995, J. Bacteriol. 177: 4121-4130), promotor rhaPBAD (Haldimann et al., 1998, J. Bacteriol. 180: 1277-1286) . Otros promotores son descritos en " Proteínas útiles de Bacterias Recombinantes" en Scientific American, 1980, 242: 74-94; y en Sambrook and Russell, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Third Edition 2001 (volumes 1-3), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.
La secuencia de control puede también ser una secuencia de terminador de transcripción apropiada, una secuencia reconocida por una célula huésped para terminar la transcripción. . La secuencia de terminadores enlazada operativamente al término 3' de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido. Cualquier terminador que es funcional en una célula de E.coli puede ser usado en la presente invención. Puede ser deseable agregar secuencias reguladores que permiten la regulación de la expresión del polipéptido en relación con el procedimiento de la célula huésped. Ejemplos de sistemas reguladores son aquellos que provocan que la expresión del gen sea encendida o apagada en respuesta a un estimulo químico o físico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador. Los sistemas reguladores en sistemas prokarióticos incluyen los sistemas de operador lac, tac y trp.
Para varias modalidades, de la invención, las manipulaciones genéticas pueden ser descritas para incluir varias manipulaciones genéticas, incluyendo aquellas divididas a regulación de cambio y por consiguiente actividad final de una enzima o actividad enzimática de una enzima identificada en cualquiera de las rutas respectivas. Tales modificaciones genéticas pueden ser dirigidas a modificaciones transcripcionales , de traducción y posttraducción que dan como resultado un cambio de actividad enzimática y/o selectividad bajo condiciones de cultivo seleccionadas y/o identificadas y/o con la provisión de secuencias de ácido nucleicos adicionales tales como para incrementar el número de copia y/o mutantes de una enzima relacionada con la producción de 3-HP. Metodologías y procedimientos específicos para obtener tal modificación genética son bien conocidos por aquellos experimentados en el arte e incluyen pero no están limitados a: incrementar la expresión de un elemento genético endógeno; disminuir la funcionalidad de un gen represor; introducir un elemento genético heterólogo; incrementar el número de copia de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que cataliza una etapa de conversión enzimática para producir 3-HP; mutar un elemento genético para proveer una proteína mutada para incrementar la actividad enzimática especifica; sobre expresión; sub expresión; sobre expresión de una chaperona; desactivación de una proteasa; alteración o modificación de inhibición de retroalimentación ; provisión de una variante enzimática que comprende uno o más de un sitio de enlace deteriorado para un represor y/o inhibidor competitivo; desactivación de un gen represor; evolución, selección y/u otros procedimientos para mejora la estabilidad de mARN, también como el uso de plásmidos que tienen un número de copia efectivo y promotores para obtener un nivel efectivo de mejora. La mutagénesis aleatoria se puede llevar a la práctica para proveer modificaciones genéticas que caen en cualquiera de estos y otros procedimientos afirmados. Las modificaciones genéticas caen además ampliamente en adiciones (incluyendo inserciones) , cancelaciones (tal como mediante una mutación) y sustituciones de uno o más ácidos nucleicos en un ácido nucleico de interés. En varias modalidades, una modificación genética resulta de actividad especifica enzimática mejorada y/o número de rendimiento de una enzima. Sin estar limitados, los cambios pueden ser medidos mediante uno o más de los siguientes: KM; Kcat y Kavidez.
En varias modalidades,. para funcionar más eficientemente, un microorganismo puede comprender una o más cancelaciones genéticas. Por ejemplo, en E. coli, los genes que codifican la lactato deshidrogenasa (ldhA) , fosfato acetiltransferasa (pta) , piruvato oxidasa (poxB) y piruvato-formiato liasa (pflB) pueden ser sometidos a disrupción, incluyendo . cancelados. Tales disrupciones genéticas, incluyendo cancelaciones, no pretenden ser limitantes y pueden ser implementadas en varias combinaciones en varias modalidades. Las cancelaciones genéticas pueden ser llevadas a cabo mediante procedimientos de cancelación genética mutacionales y/o partiendo con una cepa mutante que tiene expresión reducida o ninguna expresión de una o más de estas enzimas y/u otros métodos conocidos para aquellos experimentados en el arte. Las cancelaciones genéticas pueden ser efectuadas mediante cualquiera de un número de metodologías específicas conocidas, incluyendo pero no limitado a los métodos de RED/ET utilizando kits y otros reactivos vendidos por Gene Bridges (Gene Bridges GmbH, Dresden, Alemania, <<www.genebridges.com>>).
Más particularmente en cuanto al último método, el uso de recombinación de Red/ET, es conocida para aquellos de habilidad ordinaria en el arte y descritas en las patentes estadounidenses Nos. 6,355,412 y 6,509,156, expedidas a Stewart et al. e incorporadas por referencia en la presente por sus enseñanzas de este método. Materiales y kits para tal método están disponibles de Gene Bridges (Gene Bridges GmbH, Dresden, Alemania, <<www.genebridges.com>>), y el método puede proceder al seguir las instrucciones del fabricante. El método involucra reemplazo del gen objetivo por un marcador seleccionable vía recombinación homologa efectuada .por la recombinasa de ?-fago. El organismo huésped que expresa ?-red recombinasa es transformado con un producto de ADN lineal que codifica por un marcador seleccionable flanqueado por las regiones terminales (en general -50 pares de bases y alternativamente hasta aproximadamente ~300 pares de bases) homologas con el gen objetivo. El marcador podría luego ser removido mediante otra etapa de recombinación efectuada por un vector de plásmido que porta la FLP-recombinasa u otra recombinasa, tal como Cre.
La cancelación apuntada de partes de ADN cromosomal microbiano o la adición de material genético extraño a cromosomas microbianos se puede llevar a la práctica para alterar el metabolismo de la célula huésped para reducir o eliminar la producción de productos metabólicos indeseables. Esto puede ser usado en combinación con otras modificaciones genéticas tal como se describe en la presente en este ejemplo general. En esta descripción detallada, se ha hecho referencia a múltiples modalidades y a las figuras adjuntas en las cuales se muestran a manera de ilustración modalidades ejemplares específicas en las cuales la invención se puede llevar a la práctica. Estas modalidades son descritas en detalle suficiente para habilitar a aquellos experimentados en el arte a llevar a la práctica la invención y se comprenderá que se pueden hacer modificaciones a las varias modalidades reveladas por el experimentado en el arte.
Además, para la producción de 3-HP, tales modificaciones genéticas pueden ser escogidas y/o seleccionadas para obtener una proporción de flujo más alta a través de ciertas etapas de conversión enzimáticas dentro de las respectivas rutas de producción de 3-HP y así pueden afectar el metabolismo celular general de manera fundamentales y/o mayores.
Se apreciará que la "homología" de aminoácido incluye sustituciones conservadoras, esto es, aquellas que sustituyen un aminoácido dado en un polipéptido por otro aminoácido de características similares. Comúnmente vistas como sustituciones conservadoras están los siguientes reemplazos: reemplazos de un aminoácido alifático tal como Ala, Val, Leu e lie con otro aminoácido alifático; reemplazo de una Ser con un Thr o viceversa; reemplazo de un residuo ácido tal como Asp o Glu con otro residuo ácido; reemplazo de un residuo que lleva un grupo amida, tal como Asn o Gln, con otro residuo que lleva un grupo amida; intercambio de un residuo básico tal como Lys o Arg con otro residuo básico; y reemplazo de un residuo aromático tal como Phe o Tyr con otro residuo aromático.
Para todas las secuencias de ácido nucleicos y aminoácidos provistas en la presente, se apreciará que variantes modificadas conservadoramente de estas secuencias son incluidas y están dentro del alcance de la invención en sus varias modalidades. Secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos funcionalmente equivalentes (variantes funcionales) , que pueden incluir variantes modificadas conservadoramente, también como secuencias variadas más extensamente, que están dentro de la habilidad de la persona de habilidad ordinaria en el arte y microorganismos que comprenden estos, también están dentro del alcance de varias modalidades de la invención, como lo están métodos y sistemas que comprenden tales secuencias y/o microorganismos. En varias modalidades, secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas suficientemente homologas o porciones de las mismas están dentro del alcance de la invención. Más en general, secuencias de ácidos nucleicos que codifican una secuencia de aminoácido particular empleados en la invención pueden variar debido a la degeneración del código genético y no obstante caen dentro del alcance de la invención. La siguiente tabla provee un resumen de similaridades entre aminoácidos, en las cuales sustituciones conservadoras y menos conservadoras pueden estar basadas y también varias redundancias de codón que reflejan esta degeneración..
Tabla 1 Leyenda: grupos laterales y otras propiedades relacionadas: A=ácido; B=básico; Ali=alifético; Ami=amina; Aro=aromático; N=no polar; PU=polar sin cargar; NEG=cargado negativamente; POS=cargado positivamente.
También, variantes y porciones de secuencias de ácido nucleico particulares y respectivas secuencias de aminoácidos codificadas citadas en la presente pueden exhibir una funcionalidad deseada, por ejemplo, actividad enzimática a un nivel seleccionado, cuando tal variante de secuencia de ácido nucleico y/o porción contiene una secuencia de 15 nucleótidos idéntica a cualquier secuencia de 15 nucleótidos resumida en las secuencias de ácidos nucleicos citadas en la presente incluyendo, sin limitación, la secuencia que inicia en el número de nucleótido 1 y que termina en el número de nucleótido 15, la secuencia que inicia en el número de nucleótido 2 y que termina en el número de nucleótido 16, la secuencia que inicia en el número de nucleótido 3 y termina en el elemento de nucleótido 17 y asi sucesivamente. Se apreciará que la invención también provee el ácido nucleico aislado que contiene una secuencia de nucleótidos que es mayor de 15 nucleótidos (por ejemplo, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más nucleótidos) de longitud e idéntica a cualquier porción de la secuencia resumida en las secuencias de ácido nucleico citadas en la presente. Por ejemplo, la invención provee ácido nucleico aislado que contiene una secuencia de 25 nucleótidos idéntica a cualquiera secuencia de 25 nucleótidos resumida en cualquiera de una o más (incluyendo cualqüier agrupación de) secuencias de ácido nucleico citadas en la presente, incluyendo sin limitación, la secuencia que inicia en el número de nucleótido 1 y que termina en el número de nucleótido 25, la secuencia que inicia en el número de nucleótido 2 y termina en el número de nucleótido 26, la secuencia que inicia en el número de nucleótido 3 y que termina en el número de nucleótido 27 y asi sucesivamente. Ejemplos adicionales incluyen, sin limitación, ácidos nucleicos aislados que contienen una secuencia de nucleótidos que es de 50 o más nucleótidos (por ejemplo, 100, 150, 200, 250, 300 o más nucleótidos) de longitud e idénticos a cualquier porción de cualquiera de las secuencias reveladas en la presente. Tales ácidos nucleicos aislados pueden incluir, sin limitación, aquellos ácidos nucleicos aislados que contienen una secuencia de ácido nucleico representada en cualquier sección de discusión y/o ejemplos, tal como respecto a rutas de producción, de 3-HP, secuencias de ácido nucleico que codifican enzimas del sistema de ácido graso sintasa o tolerancia a 3-HP. Por ejemplo, la invención provee un ácido nucleico aislado que contiene una secuencia de ácido nucleico enlistada en la presente que contiene una sola inserción, una sola cancelación, una sola sustitución, múltiples inserciones, múltiples cancelaciones, múltiples sustituciones o cualquier combinación de los mismos (por ejemplo, una sola cancelación junto con múltiples inserciones) . Tales moléculas de ácido nucleico aisladas pueden compartir por lo menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 ó 99 por ciento de identidad de secuencia con una secuencia de ácido nucleico enlistada en la presente (esto es, en el listado de secuencias).
Ejemplos adicionales incluyen, sin limitación, ácidos nucleicos aislados que contienen una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que es de 50 o más residuos de aminoácidos (por ejemplo, 100, 150, 200, 250, 300 o más residuos de aminoácidos) de longitud e idénticos a cualquier porción de una secuencia de aminoácidos enlistada o de otra manera revelada en la presente.
Además, la invención provee ácido nucleico aislado que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una variación de una secuencia de aminoácidos enlistada o de otra manera revelada en la presente. Por ejemplo, la invención provee un ácido nucleico aislado que contiene una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia de aminoácidos enlistada o de otra manera revelada en la presente que contiene una sola inserción, una sola cancelación, una sola sustitución, múltiples inserciones, múltiples cancelaciones, múltiples sustituciones o cualquier combinación de las mismas (por ejemplo, una sola cancelación junto con múltiples inserciones) . Tales moléculas de ácido nucleico aisladas pueden contener una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comparte por lo menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 ó 99 por ciento de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos enlistada o de otra manera revelada en la presente.
Ejemplos de propiedades que proveen las bases para sustituciones conservadoras y otras sustituciones de aminoácidos son ejemplificados en la Tabla 1. Asi, el experimentado en el arte puede hacer numerosas sustituciones para obtener una variante de secuencia de aminoácidos que exhibe una funcionalidad deseada. BLASTP, CLUSTALP y otras herramientas de alineación y comparación pueden ser usadas para determinar regiones altamente conservadas, a las cuales se pueden hacer menos sustituciones (a no ser que sea dirigida a alterar la actividad a un nivel seleccionado, lo que puede requerir múltiples sustituciones) . Más sustituciones se pueden hacer en regiones reconocidas o que se cree que no están involucradas con un sitio activo u otro enlace o porción estructural. De acuerdo con la Tabla 1, por ejemplo, sustituciones se pueden hacer de un aminoácido sin cargar polar (PU) por un aminoácido sin cargar polar de una secuencia enlistada, opcionalmente considerando el tamaño/peso molecular (esto es, sustitución de una serina por una treonina) . Guias concernientes con cuales cambios de aminoácidos son probables de ser fenotipicamente silentes se puede encontrar, inter alia, en Bowie, J. U., et Al., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions, " Science 247:1306-1310 (1990). Esta referencia es incorporada por referencia por tales enseñanzas que, sin embargo, también en general son conocidas para aquellos experimentados en el arte. Sustituciones de aminoácidos conservadoras reconocidas comprenden (aminoácidos sustituibles que siguen a cada codón de un conjunto) : ala:ser; arg:lys; asn:gln o his; asp:glu; cysrser; gln:asn; glu:asp; gly:pro; hisrasn o gln; ile:leu o val; leu:ile o val; lys: arg o gln o glu; met:leu o ile; phe:met o leu o tyr; serrthr; thr:ser; trprtyr; tyr:trp o phe; val:ile o leu.
Se notará que las preferencias de codón y tablas de uso de codón para una especie particular pueden ser usadas para diseñar moléculas de ácido nucleico aisladas que toman ventaja de las preferencias de uso de codón de aquella especie particular. Por ejemplo, el ácido nucleico aislado provisto en la presente puede ser diseñado para tener codones que son usados preferiblemente por un organismo de interés particular. Numerosos' elementos de programación y servicios de secuenciación están disponibles por tal optimización de codón de secuencias.
La invención provee polipéptidos que contienen toda la secuencia de aminoácido de una secuencia de aminoácidos enlistada o de otra manera revelada en la presente. Además, la invención provee polipéptidos que contienen una porción de una secuencia de aminoácidos enlistada o de otra manera revelada en la presente. Por ejemplo, la invención provee polipéptidos que contienen una secuencia de 15 aminoácidos idéntica a cualquier ' secuencia de 15 aminoácidos de una secuencia de aminoácidos enlistada o de otra manera revelada en la presente incluyendo, sin limitación, la secuencia que inicia en el residuo de aminoácidos número 1 y que termina en el número de residuo de aminoácidos 15, la secuencia que inicia en el residuo de aminoácidos número 2 y que termina en el residuo de aminoácidos número 16, la secuencia que inicia en el residuo de aminoácidos número 3 y que termina en el residuo de aminoácidos número 17 y asi sucesivamente. Se apreciará que la invención' también provee polipéptidos que contienen una secuencia de aminoácidos que es mayor de 15 residuos de aminoácidos (por ejemplo, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más residuos de aminoácidos) de longitud e idénticos a cualquier porción de una secuencia de aminoácidos enlistada o de otra manera revelada en. la presente. Por ejemplo, la invención provee polipéptidos que contienen una secuencia de 25 aminoácidos idéntica a cualquier secuencia de 25 aminoácidos de una secuencia de aminoácidos enlistada o de otra manera revelada en la presente incluyendo, sin limitación, la secuencia que inicia en el residuo de aminoácidos número 1 y que termina en el residuo de aminoácidos número 25, la secuencia que inicia en el residuo de aminoácidos número 2 y que termina en el residuo de aminoácidos número 26, la secuencia que inicia en el residuo de aminoácidos número 3 y que termina en el residuo de aminoácidos número 27 y asi sucesivamente. Ejemplos adicionales incluyen, sin limitación, polipéptidos que contienen una secuencia de aminoácidos que es de 50 o más residuos de aminoácidos (por ejemplo, 100, 150, 200, 250, 300 o más residuos de aminoácidos) de longitud e idénticos a cualquier porción de una secuencia de aminoácidos enlistada o de otra manera revelada en la presente. Además, se apreciará que, según lo anterior, una secuencia de 15 nucleótidos proveerá una secuencia de 5 aminoácidos, de tal manera que la última y secuencias de aminoácido de longitud más alta, pueden ser definidas por las longitudes de secuencia de nucleótidos descritas anteriormente que tienen identidad con una secuencia provista en la presente.
Además, la invención provee polipéptidos que una secuencia de aminoácidos que tiene una variación de la secuencia de aminoácidos resumida en una secuencia de aminoácidos enlistada o de otra manera revelada en la presente. Por ejemplo, la invención provee polipéptidos que contienen una secuencia de aminoácidos enlistada o de otra manera revelada en la presente que contiene una sola inserción, una sola cancelación, una sola sustitución, múltiples inserciones, múltiples cancelaciones, múltiples sustituciones o cualquier combinación de las mismas (por ejemplo, una sola cancelación junto con múltiples inserciones) . Tales polipéptidos pueden contener una secuencia de aminoácidos que comparte por lo menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 ó 99 por ciento de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos enlistada o de otra manera revelada en la presente. Una secuencia de aminoácidos variante particular puede comprender cualquier número de variaciones, también como cualquier combinación de tipos de variaciones.
La invención incluye, en varias modalidades, una secuencia de aminoácidos que tiene una variación de cualquiera de las secuencias de polinucleótidos y polipéptidos reveladas en la presente. Como un ejemplo, variaciones son ejemplificadas para la secuencia de aminoácidos de anhidrasa carbónica (cynT de E. coli) resumida en SEQ ID NO:- 544. La Fiqura 3 provee una alineación de secuencia múltiple de CLUSTAL de la anhidrasa carbónica de E. coli alineada con anhidrasas carbónicas de once otras especies que tienen homología relativamente alta, en base a los bajos valores de E, en una comparación de BLASTP. SEQ ID NO: 544 es la quinta secuencia mostrada. Múltiples sustituciones conservadoras y sustituciones menos conservadoras son mostradas (esto es, por las designaciones ":" y respectivamente), que pueden conducir a modificaciones adicionales por aquel experimentado en el arte. Asi, ejemplos de variaciones de la secuencia resumida en SEQ ID NO: 544 incluyen, sin limitación, cualquier variación de las secuencias resumidas en la Figura 3. Tales variaciones son provistas en la Figura 3 en que una comparación del residuo de aminoácidos (o carencia del mismo) en una posición particular de la secuencia resumida en SEQ ID NO: 544 con el residuo de aminoácidos (o carencia del mismo) a la misma posición alineada de cualquiera de las otras secuencias de aminoácido dé la Figura 3 provee una lista de cambios específicos para la secuencia resumida en SEQ ID NO: 544. Por ejemplo, el ácido glutámico "E" en posición 14 de SEQ ID NO: 5'44 puede ser sustituido con un ácido aspártico "D" o asparagina "N" como se indica en la Figura 3. Se apreciará que la secuencia resumida en SEQ ID NO: 544 puede contener cualquier número de variaciones, también como cualquier combinación de tipos de variaciones. Se notará que las secuencias de aminoácidos provistas en la Figura 3 pueden ser polipéptidos que tienen actividad de anhidrasa carbónica.
Como se indica en la presente, polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos variante pueden retener actividad enzimática. Tales polipéptidos pueden ser producidos al manipular la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido utilizando procedimientos estándar tales como mutagénesis dirigida al sitio o varias técnicas de PCR. Como se indica en la presente, un tipo de modificación incluye la sustitución de uno o más residuos de aminoácidos por residuos de aminoácidos que tienen una propiedad química y/o bioquímica similar. Por ejemplo, un polipéptido puede tener una secuencia de aminoácidos resumida en una secuencia de aminoácidos enlistada o de otra manera revelada en la presente que comprende una o más sustituciones conservadoras .
Cambios más sustanciales pueden ser obtenidos al seleccionar sustituciones que son menos conservadoras y/o en áreas de la secuencia que son más críticas, por ejemplo seleccionar residuos que difieren más significativamente en su efecto en mantener: (a) la estructura de la cadena fundamental de polipéptido en el área de sustitución, por ejemplo, como una conformación de hoja o helicoidal; (b) la carga o hidrofobicidad del polipéptido en el sitio objetivo; o (c) el global de la cadena lateral. Las sustituciones que en general se espera que produzcan los cambios más grandes en función de polipéptido son aquellas en las cuales: (á) un residuo hidrofílico, por ejemplo, serina o treonina, es sustituido por (o por) un residuo hidrofóbico, por ejemplo, leucina, isoleucina, fenilalanina, valina o alanina; (b) una cisteina o prolina es sustituida por (o por ) cualquier otro residuo; (c) un residuo que tiene una cadena lateral electropositiva, por ejemplo, lisina, arginina o histidina, es sustituido por (o por) un residuo electronegativo, por ejemplo, ácido glutámico o ácido aspártico; o (d) un residuo que tiene una cadena lateral voluminosa, por ejemplo, fenilalanina, es sustituido por (o por) uno que no tiene una cadena lateral,, por ejemplo, glicina. Los efectos de estas sustituciones de aminoácidos (u otras cancelaciones o adiciones) pueden ser determinados para polipéptidos que tienen actividad enzimática al analizar la habilidad del polipéptido para catalizar la conversión del mismo sustrato como el polipéptido natural relacionado al mismo producto como el polipéptido natural relacionado. Asi, polipéptidos que tienen 5, 10, 20, 30, 40, 50 o menos sustituciones conservadoras son provistos por la invención.
Los polipéptidos y ácidos nucleicos que codifican polipéptidos pueden ser producidos mediante técnicas de mutagénesis de ADN estándar, por ejemplo, mutagénesis de cebador M13. Detalles de estas técnicas son provistos en Sambrook y Russell, 2001. Moléculas de ácido nucleico pueden contener cambios de una región de codificación para ajustar la predisposición de uso de codón del organismo particular al cual la molécula va a ser introducida.
Alternativamente, la región de codificación puede ser alterada al tomar ventaja de la generación del código genético para alterar la secuencia de codificación de tal manera que, mientras que la secuencia de ácido nucleico es sustancialmente alterada, codifica no obstante un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica o sustancialmente similar a la secuencia de aminoácidos natural. Por ejemplo, alanina es codificada en el cuadro de lectura abierto por el triplete de codón de nucleótidos GCT. Debido a la degeneración del código genético, otros tres tripletes de codón de nucleótidos —GCA, GCC y GCG— también codifican para alanina. Asi, la secuencia de ácido nucleico del cuadro de lectura abierta puede ser cambiada en esta posición a cualquiera de estos tres codones sin afectar la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado o las características del polipéptido. En base a la degeneración del código genético, variantes de ácido nucleico pueden ser derivadas de una secuencia de ácido nucleico revelada en la presente utilizando técnicas de mutagénesis de ADN estándar como se describe en la presente o mediante síntesis de secuencias de ácido nucleico. Así, para varias modalidades de la invención que abarcan moléculas de ácido nucleico que codifican el mismo polipéptido pero varían en secuencia de ácidos nucleicos en virtud de la degeneración del código genético.
La invención también provee un ácido nucleico aislado que es ' de por lo menos aproximadamente 12 bases de longitud (por ejemplo, por lo menos aproximadamente 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 100, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000 ó 5000 bases en longitud) y se hibridiza, bajo condiciones de hibridización, a la hebra de sentido o antisentido de un ácido nucleico que tiene una secuencia enlistada o de otra manera revelada en la presente. Las condiciones de hibridización pueden ser condiciones de hibridización moderada o altamente severas. También, en algunas modalidades, el microorganismo comprende una ruta de producción de 3-HP endógena (que puede, en algunas de tales modalidades, ser mejorada) , mientras que en otras modalidades, el microorganismo no comprende una ruta de producción de 3-HP, pero es provisto con una o más secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos que tienen actividad o actividades enzimáticas para completar una ruta, descrita en la presente, dando como resultado la producción de 3-HP. En algunas modalidades, las secuencias particulares reveladas en la presente o variantes modificadas conservadoramente de las mismas, son provistas a un microorganismo seleccionado, tal como seleccionado de una o más de las especies y grupos de especies u otros grupos taxonómicos enlistados en la presente.
VI. REDIRECCIONAMIENTO DE MALONIL-COA DE SÍNTESIS DE ÁCIDO GRASO A 3-HP Las composiciones de la presente invención, tales como microorganismos modificados genéticamente, comprenden una ruta de producción para un producto químico en el cual malonil-CoA es un sustrato y pueden también comprender una o más modificaciones genéticas para reducir la actividad de enzimas codificadas por uno o más de los genes del sistema de ácido graso sintetasa. Las composiciones pueden ser usadas en los métodos y sistemas de la presente invención.
Con respecto a la fermentación microbiana de un número de productos químicos en muchos microorganismos de interés de fermentación comercial, malonil-CoA es un intermediario metabólico que, bajo condiciones de crecimiento normales, es convertido a ácidos grasos y derivados de los mismos, tales como fosfolípidos , que son luego usados en membranas celulares y para otras funciones celulares clave. Por ejemplo, en Escherichia coli, el sistema de ácido graso sintasa es de un tipo II o sistema de ácido graso sintasa disociado. En este sistema, las enzimas de la ruta de producción de ácido graso son codificadas, por genes distintos y comunes muchas rutas metabólicas críticas, es bien regulada, incluyendo por productos corriente abajo que inhiben las enzimas corriente arriba.
En varios microorganismos, la conversión del intermediario metabólico malonil-CoA a ácidos grasos vía un sistema de síntesis de ácido graso (esto es, ruta o complejo) es el único o el mayor uso de malonil-CoA. Se ha determinado que cuando existe una ruta de producción a un producto químico alternativo en un microorganismo, la reducción de tal conversión de malonil-CoA a ácidos grasos puede mejorar la métrica para la ' producción de aquel producto químico alternativo (por ejemplo, 3-HP) . Por ejemplo, en muchas células de microorganismos, el sistema de ácido graso sintasa comprende polipéptidos que tienen las siguientes actividades enzimáticas: proteína portador de malonil-CoA-acilo (ACP) transacilasa ; ß-cetoacil-ACP sintasa; ß-cetoacil-ACP reductasa; ß-hidroxiacil-ACP deshidratasa; 3-hidroxiacil- (acp) deshidratasa; y proteína portador de enoil-acil reductasa (enoil-ACP reductasa) . En varias modalidades, secuencias de ácido nucleico que codifican formas sensibles a la temperatura de estos polipéptidos pueden ser introducidas en lugar de las enzimas naturales y cuando tales microorganismos modificados genéticamente son cultivados a temperaturas elevadas (a las cuales estos polipéptidos termolábiles son desactivados, parcial o completamente, debido a alteraciones en la estructura de proteína o desnaturalización completa) , se observa un incremento en un producto tal como 3-HP. En otras modalidades, otros tipos de modificaciones genéticas se pueden hacer para modular de otra manera, tal como disminuir, actividades enzimáticas de uno o más de estos polipéptidos . En varias modalidades, un resultado de tales modificaciones genéticas es desplazar la utilización de malonil-CoA de tal manera que hay una conversión reducida de malonil-CoA a ácidos grasos, biomasa global y conversión proporcionalmente mayor de la fuente de carbono a un producto químico tal como 3-HP. En varias modalidades, la productividad específica para el producto químico producido microbianamente es inesperadamente alta. También, modificaciones genéticas adicionales, tal como incrementar la producción de malonil-CoA, se puede hacer para ciertas modalidades.
Una enzima, enoil (proteína portadora de acilo) reductasa (EC No. 1.3.1.9, también denominada como enoil-ACP reductasa) es una enzima clave para la biosíntesis de ácido graso a partir de malonil-CoA. En Escherichia coli esta enzima, FabI, es codificada, por el gen fabl (Véase "Enoyl-Acyl Carrier Protein (fabl) Plays a Determinant Role in Completing Cycles of Fatty Acid Elongation in Escherichia coli," Richard J. Heath and Charles O. Rock, J. Biol. Chem. 270:44, pp. 26538-26543 (1995), incorporada por referencia por su discusión de fabl y el sistema de ácido graso sintasa) .
La presente invención puede utilizar un microorganismo que es provisto con una secuencia de ácido nucleico (polinucleótido) que codifica un polipéptido que tiene actividad enzimática de enoil-ACP reductasa que puede ser modulada durante un evento de fermentación. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que codifica una enoil-ACP reductasa sensible a la temperatura puede ser provista en lugar de la enoil-ACP reductasa natural, de tal manera que una temperatura de cultivo elevada da como resultado actividad enzimática reducida, que luego da como resultado un desplazamiento de la utilización de malonil-CoA a la producción de un producto químico deseado. A tal temperatura elevada, la enzima es considerada no permisiva, como es la temperatura. Una de tales secuencias es un fabl sensible a la temperatura mutante (fabITS) de E. coli, SEQ ID NO: 769 para ADN, SEQ ID NO: 770 para proteína.
Se apreciará que las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos para enoil-ACP reductasa en especies diferentes a E. coli son fácilmente obtenidas al llevar a cabo búsquedas de homología en bases de datos genómicas conocidas, tales como BLASTN y BLASTP. Procedimientos para obtener homólogos en otras especies y secuencias equivalentes funcionales son descritos en la presente. Así, se apreciará que la presente invención se puede llevar a la práctica por aquel experimentado en el arte para muchas especies de microorganismos de interés comercial.
Otros procedimientos que una enoil-ACP reductasa sensible a la temperatura puede ser empleado como son conocidos para aquellos experimentados en el arte, tales como, pero no limitados a, reemplazar una enoil-ACP o enoil-coA reductasa natural con una secuencia de ácido nucleico que incluye un promotor inducible para esta enzima, de tal manera que una inducción inicial puede ser seguida por ninguna inducción, disminuyendo mediante esto la actividad enzimática de enoil-ACP o enoil-coA reductasa después de que se obtiene una densidad celular seleccionada.
En algunos aspectos, composiciones, métodos y sistemas de la presente invención desplazan la utilización de malonil-CoA en un microorganismo modificado genético, que comprende por lo menos una enzima del sistema de ácido graso sintasa, tal como reductasa de la proteina portadora de enoil-acilo (enoil-ACP reductasa) o enoil-coenzima A reductasa (enoil-coA reductasa), ß-cetoacil-ACP sintasa o ß-cetoacil-coA sintasa malonil-CoA-ACP y puede comprender además por lo menos una modificación genética de la secuencia de ácido nucleico que codifica la anhidrasa carbónica para incrementar los niveles de bicarbonato en la célula de microorganismo- y/o una complementación de su medio de cultivo con bicarbonato y/o carbonato y puede comprender además una o más modificaciones genéticas para incrementar la actividad enzimática de una o más de acetil-CoA carboxilasa y transhidrogenasa NADPH-dependiente. Más en general, la adición de carbonato y/o bicarbonato puede ser usada para incrementar los niveles de bicarbonato en un caldo de fermentación.
En algunos aspectos, la presente invención comprende un microorganismo modificado genéticamente que comprende por lo menos una modificación genética que provee, completa o mejora una ruta de producción de 3-HP efectiva para convertir malonil-CoA a 3-HP y además comprende una modificación genética de anhidrasa carbónica para incrementar los niveles de bicarbonato en la célula de microorganismo y/o una complementación de su medio de cultivo con bicarbonato y/o carbonato y puede comprender además una o más modificaciones genéticas para incrementar la actividad enzimática de una o más de acetil-CoA carboxilasa y transhidrogenasa NADPH-dependiente. Métodos y sistemas relacionados utilizan tal microorganismo modificado genéticamente.
En algunos aspectos, la presente invención comprende un microorganismo modificado genéticamente que comprende por lo menos una modificación genética que provee, completa o mejora la ruta de producción de 3-HP efectiva para convertir malonil-CoA a 3-HP y comprende además una modificación genética de por lo menos una enzima del sistema de ácido graso sintasa, tal como enoil-acil proteina portadora reductasa (enoil-ACP reductasa) o enoil-coenzima A reductasa (enoil-coA reductasa) , ß-cetoacil-ACP sintasa o ß-cetoacil-coA sintasa, malonil-CoA-ACP y puede comprender además una modificación genética de la anhidrasa carbónica para incrementar los niveles de bicarbonato en la célula del microorganismo y/o una complementación de su medio de cultivo con bicarbonato y/o carbonato y puede comprender además una o más modificaciones genéticas para incrementar la actividad enzimática de una o más de acetil-CÓA carboxilasa y transhidrogenasa NADPH-dependiente . Los métodos y sistemas relacionados utilizan tal microorganismo modificado genéticamente .
En varias modalidades, la presente invención es concerniente con un método para la fabricación de un producto químico que comprende: proveer una densidad celular seleccionada de una población de microorganismos modificados genéticamente en un recipiente, en donde el microorganismo modificado genéticamente comprende un ruta de producción para la producción de un producto químico a partir de malonil-CoA; y reducir la actividad enzimática de por lo menos una enzima de la ruta de ácido graso sintasa del microorganismo modificado genéticamente.
En varias modalidades, la reducción de la actividad enzimática de una enoil-ACP reductasa en una célula huésped del microorganismo da como resultado la producción de 3-HP a una productividad específica y volumétrica elevada. En todavía otras modalidades, la reducción de la actividad enzimática de una enoil-CoA reductasa en una célula huésped del microorganismo da como resultado la producción de 3-HP a una productividad especifica y volumétrica elevada.
Otro procedimiento a la modificación genética para reducir la actividad enzimática de estas enzimas es proveer un promotor inducible que promueve tal enzima, tal como el gen de enoil-ACP reductasa (por ejemplo, fabl en E. coli) . En tal ejemplo, este promotor es inducido (tal como con isopropil^-D-tiogalactopiranoside (IPTG)) durante una primera fase de un método de la presente y después que el IPTG es agotado, removido o diluido de la segunda etapa, de reducir la actividad enzimática de enoil-ACP reductasa puede comenzar. Otros procedimientos pueden ser aplicados para controlar la expresión y actividad enzimática tal como se describe en la presente y/o son conocidos para aquellos experimentados en el arte.
En tanto que la enoil-CoA reductasa es considerada una enzima importante del sistema de ácido graso sintasa, se pueden hacer modificaciones genéticas a cualquier combinación de los polinucleótidos (secuencias de ácido nucleico) que codifican los polipéptidos que exhiben las actividades enzimáticas de este sistema, tal como se enlista en la presente. Por ejemplo, FabB, ß-cetoacil-proteina portadora de acilo sintasa I, es una enzima en E. coli que es esencial para el crecimiento y la biosintesis tanto de ácidos grasos saturados como insaturados. La desactivación de FabB da como resultado la inhibición del alargamiento del ácido graso y crecimiento celular disminuido, también como eliminación de un ciclo fútil que recicla la porción de malonato de malonil-ACP de regreso a acetil-CoA. FabF, proteina portadora de ß-cetoacil-acilo sintasa II, es requerida para la síntesis de ácidos grasos saturados y la fluidez membrana de control en las células. Ambas enzimas son inhibidas por cerulenina.
Se reporta que la sobreexpresión de FabF da como resultado biosíntesis disminuida de ácido graso. Se propone que FabF compite con FabB para la asociación con FabD, malonil-CoA: ACP transacilasa . La asociación de FabB con FabD es requerida para la reacción de condensación que inicia el alargamiento del ácido graso. (Véase Microbiological Reviews, Sept. 1993, p. 522-542 Vol . 57, No. 3; K. Magnuson et al., "Regulation of Fatty Acid Biosynthesis in Escherichia coli," American Society for Microbiology; W. Zha et al., "Improving cellular malonyl-CoA level in Escherichia coli via metabolic engineering, " Metabolic Engineering 11 (2009) 192-198) ). Una alternativa a la modificación genética para reducir tales enzimas de ácido graso sintasa es proveer a un sistema de cultivo un inhibidor apropiado para una o más de tales enzimas. Este procedimiento se puede practicar independientemente o en combinación con el procedimiento de modificación genética. Inhibidores, tales cómo cerulenina , tiolactomicina y triclosán (esta lista no es limitante) o modificaciones genéticas dirigidas a reducir la actividad de enzimas codificadas por uno o mas de los genes del sistema de ácido graso sintetasa pueden ser empleadas, individualmente o en combinación.
Sin estar limitados a una teoría particular, se cree que la reducción de la actividad enzimática de enoil-ACP reductasa (y/o de otras enzimas del sistema de ácido graso sintasa) en un microorganismo conduce a una acumulación y/o derivación de malonil-CoA, un intermediario metabólico corriente arriba de la enzima y tal malonil-CoA puede luego ser compartido a un producto químico para el cual la célula del microorganismo comprende una ruta metabólica que utiliza malonil-CoA. En ciertas composiciones, métodos y sistemas de la presente invención la reducción de actividad enzimática de enoil-ACP reductasa (o más en general, del sistema de ácido graso sintasa) se hace que ocurra después que se obtiene una densidad celular suficiente de un microorganismo modificado genéticamente. Este procedimiento de cultivo bifásico equilibra una cantidad deseada de catalizador, en la biomasa celular que soporta una velocidad de producción particular, con rendimiento que puede parcialmente ser atribuido a tener menos carbono dirigido a la masa celular después que la actividad de enoil-ACP reductasa (y/o actividad de otras enzimas del sistema de ácido graso sintasa) es reducida. Esto da como resultado un desplazamiento en la utilización neta de malonil-CoA, proporcionando así un mayor flujo de carbono a un producto químico deseado.
En varias modalidades de la presente invención, la productividad específica es elevada y esto da como resultado métodos y sistemas de fermentación microbiana globales rápidos y eficientes. En varias modalidades, la productividad volumétrica es también sustancialmente elevada.
En varias modalidades, un microorganismo modificado genéticamente comprende una ruta metabólica que incluye conversión de malonil-CoA a un producto químico deseado, ácido 3-hidroxipropiónico (3-HP) . Esto es visto como bastante ventajoso para la economía de producción de 3-HP comercial y es visto como un avance que tiene claro beneficio económico. Otros productos químicos también son revelados en la presente .
Las mejoras tanto en parámetros de productividad específica como volumétricas son inesperados y son un avance en el arte.
La reducción de la actividad de enoil-CoA reductasa y/o de otras enzimas del sistema de ácido graso sintasa puede ser obtenida en una diversidad de maneras, como se discute en la presente .
"Medios para modular" la conversión de malonil-CoA a acil-ACP graso o moléculas de acil-CoA grasas y a moléculas de ácido graso, significa cualquiera de los siguientes: 1) proveer en una célula de microorganismo por lo menos un polinucleótido que codifica por lo menos un polipéptido que tiene actividad de una de las enzimas del sistema de ácido graso sintasa (tal como se cita en la presente) , en donde el polipéptido asi codificado tiene (tal como mediante mutación y/o sustitución de promotor, etc., para disminuir la actividad enzimática) o puede ser modulado para tener (tal como mediante sensibilidad a temperatura, promotor inducible, etc.) una actividad enzimática reducida; 2)proveer a un recipiente que comprende una célula de microorganismos o población un inhibidor que inhibe actividad enzimática de una o más de las enzimas del sistema de ácido graso sintasa (tal como se indica en la presente) a una dosificación efectiva para . reducir la actividad enzimática de una o más de estas enzimas. Estos medios pueden ser provistos en combinación entre si. Cuando un medio para modulación involucra una conversión, durante un evento de fermentación, de una actividad mas alta a una actividad mas baja del sistema de ácido graso sintetasa, tal como al incrementar la temperatura de un recipiente de cultivo que comprende una población de microorganismos modificados genéticamente que comprenden un polipéptido del sistema de ácido graso sintetasa sensible a la temperatura (por ejemplo, enil-ACP reductasa) o al agregar un inhibidor, hay dos modos concebidos-uno durante el cual hay actividad mas alta y un segundo durante el cual hay actividad mas baja de tal sistema de ácido graso sintetasa.
Durante el modo de actividad mas baja, un desplazamiento a mayor utilización del malonil-CoA a un producto químico seleccionado puede proceder.
Una vez que la modulación esta en efecto para disminuir la(s) actividad (es) enzimática (s) inyectada (s) > cada actividad enzimática respectiva a ser modulada puede ser reducida por al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90 por ciento en comparación con la actividad de la actividad enzimática natural, no modulada (tal como en una célula o aislada) . Similarmente, la conversión de malonil-CoA a acil-ACP graso o moléculas de acil-coA grasas puede ser reducida por al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90 por ciento en comparación con tal conversión en una célula no modulada u otro sistema. Así mismo, la conversión de malonil-CoA a moléculas de ácido graso puede ser reducida por al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90 por ciento en comparación con tal conversión en una célula no modulada u otro sistema.
VII . Ruta de Producción de Malonil-CoA a 3-HP En varias modalidades, las composiciones, métodos y sistemas de la presente invención involucran la inclusión de una ruta de producción metabolica que convierte malonil-CoA a un producto químico de interés.
Como un ejemplo, 3-HP es seleccionado como el producto químico de interés.
Además, en cuanto a secuencias específicas para la ruta de producción de 3-HP, malonil-CoA reductasa (mcr) de C. aurantiacus fue sintetizado genéticamente y codón optimizado por los servicios de ADN 2.0. La secuencia FASTA es mostrada en SEQ ID NO: 783 (gi | 42551982 | g | AAS20429.1 | malonil-CoA reductasa (Chloroflexus aurantiacus) .
Mcr tiene muy pocos homólogos de secuencia en la base de datos de NCBI. Las búsquedas mediante Blast encuentran 8 secuencias diferentes cuando se busca en toda la proteína. De aquí, se espera que el desarrollo de una comparación de secuencias apiladas produzca información limitada. Sin embargo, modalidades de la presente invención pueden comprender no obstante cualquiera de estas 8 secuencias, mostradas en la presente e identificadas como SEQ ID NO: 784 a 791, que son esperadas pero todavía a ser confirmadas como bifuncionales en cuanto a esta actividad enzimática. Otras modalidades pueden comprender formas mutadas y otras formas variantes de cualquier SEQ ID NO: 784 a 791, también como polinucleótidos (incluyendo formas variantes con sustituciones conservadoras de otras sustituciones) , tales como aquellas introducidas a un microorganismo seleccionado para proveer o incrementar la producción de 3-HP en las mismas .
La porción de una alineación de secuencia múltiple CLUSTAL 2.0.11 identifica estas ocho secuencias con respectivas SEQ ID NO: 783-791, como se muestra en la siguiente tabla.
Tabla 2 Malonil-CoA puede ser convertido a 3-HP en un microorganismo que comprende uno o más de los siguientes: Una malonil-CoA reductasa bi-funcional, tal como puede ser obtenida de Choroflexus aurantiacus y otras especies de microorganismos. Bi-funcional a este respecto significa que la malonil-CoA reductasa cataliza tanto la conversión de malonil-CoA a malonato semialdehido a 3-HP.
Una malonil-CoA reductasa mono-funcional en combinación con una 3-HP deshidrogenasa . Mono-funcional significa que la malinol-CoA reductasa cataliza la conversión de malonil-CoA a malonato semiladehido .
Cualquiera de los polipéptidos anteriores puede ser NADH- o NADPH-dependiente y métodos conocidos en el arte pueden ser usados para convertir una enzima particular ya sea a una u otra forma. Mas particularmente, como se indica en WO 2002/042418, "cualquier método puede ser usado para convertir un polipéptido que usa NADPH como cofactor a un polipéptido que usa NADH como cofactor tales como aquellos descritos por otros" (Eppink et al., J Mol. Biol., 292 (1): 87-96 (1999), Hall and Tomsett, Microbiology, 146 (Pt 6): 1399-406 (2000), y Dohr et al., Proc. Nati. Acad. Sci., 98 (1): 81-86 (2001) ) ." Sin ser limitantes, una malonil-CoA reductasa bi-funcional puede ser seleccionada de la malonil-CoA reductasa de Chloroflexus aurantiacus (tal como de ATCC 29365) y otras secuencias. También sin ser limitantes, una malonil-CoA reductasa mono-funcional puede ser seleccionada de la malonil-CoA reductasa de Sulfolobus tokodaii (SEQ ID NO: 826) . En cuanto a la malonil-CoA reductasa de C. aurantiacus, aquella secuencia y otras secuencias de especies pueden también ser bi-funcionales en cuanto a esta actividad enzimática .
Cuando una malonil-CoA reductasa mono-funcional es provista en una célula de microorganismo, la actividad enzimática de 3-HP deshidrogenasa también puede ser provista para convertir malonato semialdehido a 3-HP. Como se muestra en los ejemplos, una malonil-CoA reductasa mono-funcional puede ser obtenida mediante truncación de una malonil-CoA bi-funcional mono-funcional y combinada en una cepa con una enzima que convierte malonato semialdehido a 3-HP.
También, se notará que otra malonil-CoA reductasa es conocida en Metallosphaera sedula (Maed_79, identificada como malonil-CoA reductasa/succinil-CoA reductasa) . ?? proveer secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos que tienen las actividades enzimáticas anteriores, un microorganismo modificado genéticamente puede comprender una ruta de 3-HP efectiva para convertir malonil-CoA a 3-HP de acuerdo con las modalidades de la presente invención .
Otras rutas de 3-HP, tales como aquellas que comprenden una aminotransferasa (véase, por ejemplo WO 2010/011874, publicada el 28 de Enero de 2010) , pueden también ser provistas en modalidades de un microorganismo modificado genéticamente de la presente invención.
Incorporada a esta sección, la presente invención provee métricas de productividad especificas y volumétricas elevadas en cuanto a la producción de un producto químico seleccionado, tal como ácido 3-hidroxipropiónico (3-HP) . En varias modalidades, la producción de un producto químico, tal como 3-HP, no está enlazada al crecimiento.
En varias modalidades, la producción de 3-HP o alternativamente uno de sus productos corriente abajo tal como se describe en la presente, puede alcanzar por lo menos 1, por lo menos 2, por lo menos 5, por lo menos 10, por lo menos 20, por lo menos 30, por lo menos 40, por lo menos 50 g/litro de titulo, tal como al usar uno de los métodos revelados en la presente.
Como se puede contemplar por la apreciación de los avances revelados en la presente a medida que se relacionan con fermentaciones comerciales de productos químicos seleccionados, modalidades de la presente invención pueden ser combinadas con otras modificaciones genéticas y/o modulaciones de método o sistema para obtener un microorganismo (y método correspondiente) efectivo para producir por lo menos 10, por lo menos 20, por lo menos 30, por lo menos 40, por lo menos 45, por lo menos 50, por lo menos 80, por lo menos 100, por lo menos 120 gramos de un producto químico, tal como 3-HP por litro de caldo de fermentación final (por ejemplo, agotado) en tanto que se obtiene esto con velocidades de productividad específicas y/o volumétricas como se revela en la presente.
En algunas modalidades, un evento de producción química microbiana (esto es, un evento de fermentación utilizando una población cultivada de un microorganismo) procede utilizando un microorganismo modificado genéticamente como se describe en la presente, en donde la productividad específica es de entre 0.01 y 0.60 gramos de 3-HP producido por gramos de célula de microorganismo en una base de peso seco por hora (g3-HP/g DCW-h) . En varias modalidades, la productividad específica es mayor de 0.01, mayor de 0.05, mayor de 0.10, mayor de 0.15, mayor de 0.20, mayor de 0.25, mayor de 0.30, mayor de 0.35, mayor de 0.40, mayor de 0.45, mayor de 0.50 g 3-HP/g DCW-h. La productividad específica puede ser terminada en un período de 2, 4, 6, 8, 12 o 24 horas en un evento de producción química microbiana particular. Mas en particular, la productividad específica para 3-HP u otro producto químico es de entre 0.05 y 0.10, 0.10 y 0.15, 0.15 y 0.20, 0.20 y 0.25, 0.25 y 0.30, 0.30 y 0.35, 0.35 y 0.40, 0.40 y 0.45 o 0.45 y 0.50 g 3-HP/g DCW-h, 0.50 y 0.55 o 0.55 y 0.60 f 3-HP/g DCW-h. Varias modalidades comprenden sistemas de cultivo que demuestran tal productividad.
También, en varias modalidades de la presente invención, la productividad volumétrica obtenida puede ser de 0.25 g de 3-HP (u otro producto químico) por litro por hora (g (producto químico) /L-h) , puede ser mayor de 0.25 g de 3-HP (u otro producto químico) /L-h, puede ser mayor de 0.50 g de 3-HP (u otro producto químico) /L-h, puede ser mayor de 1.0 g de 3-HP (u otro producto químico) /L-h, puede ser mayor de 1.50 g de 3-HP (u otro producto químico) /L-h, puede ser mayor de 2.0 g de 3-HP (u otro producto químico) /L-h, puede ser mayor de 2.50 g de 3-HP (u otro producto químico) /L-h, puede ser mayor de 3.0 g de 3-HP (u otro producto químico) /L-h, puede ser mayor de 3.50 g de 3-HP (u otro producto químico) /L-h, puede ser mayor de 4.0 g de 3-HP (u otro producto químico) /L-h, puede ser mayor de 4.50 g de 3-HP (u otro producto químico) /L-h, puede ser mayor de 5.0 g de 3-HP (u otro producto químico) /L-h, puede ser mayor de 5.50 g de 3-HP(u otro producto químico) /L-h, puede ser mayor de 6.0 g de 3-HP (u otro producto químico) /L-h, puede ser mayor de 6.50 g de 3-HP (u otro producto químico) /L-h, puede ser mayor de 7.0 g de 3-HP (u otro producto químico) /L-h, puede ser mayor de 7.50 g de 3-HP (u otro producto químico) /L-h, puede ser mayor de 8.00 g de 3-HP(u otro producto químico) /L-h, puede ser mayor de 8.50 g de 3-HP (u otro producto químico) /L-h, puede ser mayor de 9.0 g de 3-HP (u otro producto químico) /L-h, puede . ser mayor de 9.50 g de 3-HP (u otro producto químico) /L-h, puede ser mayor de 10.0 g de 3-HP (u otro producto químico) /L-h.
En algunas modalidades, la productividad específica, tal como es medida en un período de fermentación (cultivo de 24 horas) puede ser mayor de 0.01, 0.05, 0.10, 0.20, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0, 11.0 o 12.0 gramos de producto químico por gramo de DCW de microorganismos (en base al DCW final al final del período de 24 horas) .
En varios aspectos y modalidades de la presente invención, hay un incremento sustancial resultante en productividad específica de microorganismos que hace un avance al arte de fermentación y factibilidad económica comercial de la producción química microbiana, tal como de 3-HP (pero no limitado al mismo) .
Dicho de otra manera, en varias modalidades, la productividad específica excede (és de por lo menos) 0.01 g de producto químico/g DCW-h, excede (es de por lo menos) 0.05 g de producto químico/g DCW-h, excede (es de por lo menos) 0.10 g de producto químico/g DCW-h, excede (es de por lo menos) 0.15 g de producto químico/g DCW-h, excede (es de por lo menos) 0.20 g de producto químico/g DCW-h, excede (es de por lo menos) 0.25 g de producto químico/g DCW-h, excede (es de por lo menos) 0.30 g de producto químico/g DCW-h, excede (es de por lo menos) 0.35 g de producto químico/g DCW-h, excede (es de por lo menos) 0.40 g de producto químico/g DCW-h, excede (es de por lo menos) 0.45 g de producto químico/g DCW-h, excede (es de por lo menos) 0.50 g de producto químico/g DCW-h, excede (es de por lo menos) 0.60 g de producto quimico/g DCW-h.
Mas en general, en base a varias combinaciones de las modificaciones genéticas descritas en la presente, opcionalmente en combinación con complementaciones descritas en la presente, los valores de productividad especifica par 3-HP y para otros productos químicos descritos en la presente, puede exceder de 0.01 g de producto químico/g DCW-h, puede exceder de 0.05 g de producto químico/g DCW-h, puede exceder de 0.10 g de producto químico/g DCW-h, puede exceder de 0.15 g de producto químico/g DCW-h, puede exceder de 0.20 g de producto químico/g DCW-h, puede exceder de 0.25 g de producto químico/g DCW-h, puede exceder de 0.30 g de producto químico/g DCW-h, puede exceder de 0.35 g de producto químico/g DCW-h, puede exceder de 0.40 g de producto químico/g DCW-h, puede exceder de 0.45 g de producto químico/g DCW-h, y puede exceder de 0.50 g de producto químico/g DCW-h o 0.60 de producto químico /g DCW-h. Tal productividad específica puede ser determinada en un periodo de 2, 4, 6, 8, 12 o 24 horas en un evento de producción química microbiana particular.
Las mejoras obtenidas por modalidades de la presente invención pueden ser determinadas por el porcentaje de incremento en productividad específica o por el porcentaje de incremento en productividad volumétrica, en comparación con un microorganismo de control apropiado que carece de las combinaciones de modificación genética particulares enseñadas en la presente (con o sin los complementos enseñados en la presente, agregados a un recipiente que comprende la población de microorganismos) . Para modalidades particulares y grupos de las mismas, tales mejoras en productividad específica y/o productividad volumétrica son de por lo menos 10, por lo menos 20, por lo menos 30, por lo menos 40, por lo menos 50, por lo menos 100, por lo menos 200, por lo menos 300, por lo menos 400 y por lo menos 500 porciento con respecto a la productividad específica y/o productividad volumétrica respectiva de tal microorganismo de control apropiado .
Los métodos específicos y enseñanzas de ' la especificación y/o referencias citadas que son incorporadas por referencia, pueden ser incorporados en los ejemplos. También, la producción de 3-HP o uno de sus productos corriente abajo, tal como se describe en la presente, puede llegar a por lo menos 1, por lo menos 2, por lo menos 5, por lo menos 10, por lo menos 20, por lo menos 30, por lo menos 40 y por lo menos 50 g/litros de título en varias modalidades .
Las métricas pueden ser aplicables a cualquiera de las composiciones, por ejemplo microorganismos modificados genéticamente, métodos, para producir 3-HP u otros productos químicos y sistemas, por ejemplo sistemas de fermentación que utilizan los microorganismos modificados genéticamente y/o métodos revelados en la presente.
Se apreciará que mejoras imperativas utilizando las estrategias y métodos provistos en la presente y en base a los descubrimientos de las interrelaciones de las rutas y porciones de las rutas, pueden conducir a una producción de 3-HP a un mayor intolerancia y títulos de 3-HP mas elevados en la conclusión de un evento de bio-producción de 3-HP.
Cualquier número de estrategias pueden conducir al desarrollo de una enzima modificada apropiada para uso en la ruta de producción de 3-HP. Con respecto a malonil-CoA reductasa se puede utilizar o modificar una enzima tal como codificada por las secuencias en la tabla anterior, para obtener un nivel apropiado de capacidad de producción de 3-HP en una cepa de microorganismo.
IX. Combinaciones de Modificaciones Genéticas Como se describe en la Solicitud de Patente Estadounidense Provisional No. 61/246,141, incorporada por referencia y de la cual se reivindica prioridad, varias combinaciones de modificaciones genéticas pueden ser implementadas en varias modalidades de la invención. Estas son .descritas en los siguientes párrafos y tablas 6A, 6B y 7, notando que el primer párrafo relacionado con varias formas de malonil-CoA reductasa pueden ser usadas en las combinaciones .
Varias modalidades de la presente invención comprenden un microorganismo modificado genéticamente que comprende por lo menos una modificación genética para introducir o implementar la actividad enzimática de malonil-CoA reductasa, incluyendo al introducir un polinucleótido que expresa un equivalente funcional de la malonil-CoA reductasa provista en la presente. Un equivalente funcional de la actividad enzimática de malonil-CoA reductasa es apta de incrementar la actividad enzimática para la conversión de malonil-CoA a malonato semialdehido, malonato semialdehido a 3-HP o ambos.
En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos de la malonil-CoA reductasa comprende SEQ ID NO: 783. En otras modalidades, la malonil-CoA reductasa comprende una variante de cualquiera de SEQ ID NO: 783 a 791 que exhiben actividad enzimática de malonil-CoA reductasa.
La secuencia de aminoácidos de la malonil-CoA reductasa puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98 o 99% de identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID NO: 783 a 791.
En algunas modalidades, por lo menos una modificación genética comprende proveer un polinucleótido que Codifica una secuencia de aminoácidos que comprende una o una porción funcional de cualquiera de SEQ ID NO: 783 a 791. En varias modalidades, por lo menos una modificación genética comprende proveer un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98 o 99% de identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID NO: 783 a 791.
En modalidades ejemplares, el polinucleótido es codón-optimizado para una especie de microorganismo seleccionada para codificar cualquiera de SEQ ID NO: 783 a 791. En varias modalidades el polinucleótido es codón-optimizado para codificar una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98 o 99% de identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID NO: 783 a 791. El polinucleótido puede ser codón-optimizado para E.coli por ej emplo .
En algunas modalidades, el microorganismo modificado genéticamente que asi posee modificación (es) genética (s) de malonil-CoA reductasa comprende adicionalmente por lo menos una modificación genética para incrementar, en el microorganismo modificado genéticamente, una función de proteina seleccionada de las funciones de proteina de la tabla 6A (función de transportador de glucosa (tal como mediante galP, piruvato deshidrogenasa Elp, lipoamida acetiltransferasa y piruvato deshidrogenasa E3) ) . En ciertas modalidades, el microorganismo modificado genéticamente comprende por lo menos una modificación genética para incrementar dos, tres, cuatro funciones de proteina seleccionadas de las funciones de proteína de la Tabla 6A.
En algunas modalidades, tal microorganismo modificado genéticamente comprende adicionalmente por lo menos una modificación genética para disminuir funciones de proteínas seleccionadas de las funciones de proteína de la Tabla 6B, lactato deshidrogenasa, piruvato formiato liasa, piruvato oxidasa, fosfato acetiltransferasa, proteína de histidil, fosforilable (de PTS) proteína de transferencia fosforilo (de PTS) y la cadena de polipéptido (de PTS) .
En varias modalidades, tal microorganismo modificado genéticamente comprende por lo menos una modificación genética para disminuir la actividad enzimática de dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete funciones de proteína seleccionadas de las funciones de proteína de la Tabla 6B. También, en varias modalidades, por lo menos una o más de una modificación genética se hace para modificar las funciones de proteína de la Tabla 7 de acuerdo con los comentarios en la misma .
Se apreciará que en varias modalidades, pueden haber muchas combinaciones posibles de incrementos en una o mas funciones de proteína de Tabla 6A, con reducciones en una o mas funciones de proteína de la Tabla 6A en el microorganismo modificado genéticamente que comprende por lo menos una modificación genética para proveer incremento de función de proteina de malonil-CoA-reductasa (esto es, actividad enzimática) . Las funciones de proteína se pueden hacer variar independientemente y cualquier combinación (esto es, un pleno factorial) de modificaciones genéticas de funciones de proteína en las Tablas 6A, 6B y 7 en la presente pueden ser ajustadas por los métodos enseñados y provistos al microorganismo modificado genéticamente.
En algunas modalidades, por lo menos una modificación genética para disminuir la actividad enzimática es una disrupción genética. En algunas modalidades, por lo menos una modificación genética para disminuir la actividad enzimática es cancelación genética.
En varias modalidades, para obtener ácido 3-hidroxipropiónico (3-HP) como un producto deseable, el microorganismo modificado genéticamente comprende una función de proteína efectiva para convertir malonato semialdehído a 3-HP. La función de proteína efectiva para convertir malonato semialdehído a 3-HP puede ser natural al microorganismo, pero esto de ninguna manera significa que es necesario.
En algunas modalidades, la función de proteína efectiva para convertir malonato semialdehído a 3-HP es una forma natural o mutada de mmsBD Pseudomonas aeruginosas s o un equivalente funcional de la misma. Alternativa o adicionalmente, esta función de proteína puede ser una forma natural o mutada de ydfG o un equivalente funcional de la misma .
Ciertas modalidades de la invención comprenden adicionalmente una modificación genética para incrementar la disponibilidad del cofactor NADPH, que puede incrementar la proporción de NADPH/NADP+ como puede ser deseable. Ejemplos no limitantes para tal modificación genética son pgi (E.C. 5,3.1.9, en una forma mutada) pntAB (E.C. 1.6.1.2), sobre expresado, gapA (E.C.1.2.1.12) : gapN (E.C. 1.2.1.9, de estreptococos mutans) sustitución/reemplazo, y disrupción o modificación de una transhidrogenasa soluble tal como sthA (E.C. 1.6.1.2), y/o modificaciones genéticas de uno o mas de zwf (E.C. 1.1.1.49), gnd (E.C. 1.1.1.44), y edd (E.C. 4.2.1.12) . Secuencias de estos genes están disponibles en www . metacyc . org . También, las secuencias para los genes y proteínas codificadas para los nombres de gen de E.coli mostrados en las Tablas 6a, 6B y 7 son provistas en la Solicitud de Patente Estadounidense Provisional No: 61/246,141, incorporada en la presente en su totalidad y para tales secuencias y están también disponibles en www. ncbi . gov también como www . metacyc . org o www . ecocy . org.
En algunas modalidades, la modificación genética incrementa la síntesis microbiana de 3-HP por encima de una proporción o · titulo de un microorganismo testigo que carece de dicha por lo menos una modificación genética para reducir 3-HP. En algunas modalidades, la modificación genética es efectiva para incrementar conversiones enzimáticas a 3-HP por al menos aproximadamente 5%, por al menos aproximadamente 10%, por al menos aproximadamente 20%, por al menos aproximadamente 30% o por al menos aproximadamente 50% por encima de la conversión enzimática de un microorganismo testigo que carece de la modificación genética.
Tabla 6A Función Enzimática Clasificación Nombre de Gen en de E.C. E. coli Transportador de Glucosa N/A galP Piruvato deshidrogenasa E 1 p 1.2.4.1 aceE Lipoato acetiltransferasa / dihidrolipoamida 2.3.1.12 aceF acetiltransferasa Piruvato deshidrogenasa E3 (lipoamida 1.8.1.4 lpd deshidrogenasa) Tabla 6B Función Enzimática Clasificación Nombre de Gen en en E.C. E. coli Lactato deshidrogenasa 1.1.1.28 ldhA Piruvato formiato liasa (B "inactivo") 2.3.1.- pflB Piruvato oxidasa 1.2.2.2 poxB Fosfato acetiltransferasa 2.3.1.8 Pta Proteína histidil fosforilable estable N/A ptsH (HPr) térmicamente (de PTS) Proteína de transferencia de fosforilo(de PTS) N/A ptsl Cadena de polipéptido (de PTS) N/A Crr Tabla 7 Además, con respecto a disminuir la función enzimática en base a las enseñanzas de la Tabla 7, cualquier o una combinación de funciones enzimáticas de las siguientes pueden ser disminuidas en una modalidad particular combinada con otras modificaciones genéticas en la presente: ß-cetoail-ACP sintasa I, 3-oxoacil-ACP-sintasa I; malonil-CoA-ACP transacilasa; reductasa de proteina portadora de enoil acilo y proteina portadora de ß-cetoacil-acilo sintasa III.
Asi, como se describe en varias secciones anteriores, algunas composiciones, métodos y sistemas de la presente invención, comprenden proveer un microorganismo modificado genéticamente que comprende tanto una ruta de producción a un producto químico seleccionado, tal como 3-HP y un polinucleótido modificado que codifica una enzima del sistema de ácido graso sintasa que exhibe actividad reducida, de tal manera que la utilización de malonil-CoA se desplaza hacia la ruta de producción en comparación con un microorganismo (testigo) comparable que carece de tales modificaciones. Los métodos involucran producir el producto químico utilizando una población de tal microorganismo modificado genéticamente en un recipiente provisto con medios nutrientes. Otras modificaciones genéticas descritas en la presente, a otras enzimas, tales como acetil-CoA carboxilasa /o trasnhidrogenasa NADPH-dependiente, pueden estar presentes en algunas de tales modalidades. La producción de copias adicionales de polinucleotidos que codifican polipéptidos que exhiben estas actividades enzimáticas se muestra que incrementa la producción de 3-HP. Otras maneras para incrementar estas actividades enzimáticas respectivas son conocidas en el arte y pueden ser aplicadas a varias modalidades de la presente invención. Las SEQ ID NO para estos polinucleotidos y polipéptidos de E.coli son: acetil-CoA carboxilasa (accABCD, SEQ ID NO: 771-778); y transhidrogenasa NADPH (SEQ ID NO: 779-782), también denominada como piridina nucleótido transhidrogenasa, pntAB en E.coli.
También, sin estar limitados, una primera etapa en algunas modalidades de métodos de múltiples fases de fabricación de un producto químico pueden ser e emplificadas al proveer en un recipiente, tal como un recipiente de cultivo o recipiente de bioreactor, un medio nutriente, tal como un medio mínimo como es conocido para aquellos experimentados en el arte y un inoculo de un microorganismo modificado genéticamente para proveer una población de tales microorganismos, tales como bacterias y mas en particular un miembro de la familia de Enterobacteriaceae, tal como E.coli, en donde el microorganismo modificado genéticamente comprende una ruta metabólica que convierte malonil-CoA a moléculas de 3-HP. Por ejemplo, modificaciones genéticas pueden incluir la provisión de por lo menos una secuencia de ácido nucleico que codifica un gen que codifica la enzima malonil-CoA reductasa en una de sus formas bifuncionales o que codifica genes que codifican una malonil-CoA reductasa mono-funcional y una 3-hidroxipropionato deshidrogenasa NADH- o NADPH-dependiente (por ejemplo, ydfG o mmsB de E.coli, o mmsB de Pseudomonas aeruginosa) . Ya se en un caso u otro, cuando son provistas a una célula huésped de E.coli, estas modificaciones genéticas completan una ruta metabólica que convierte malonil-CoA a 3-HP. Este inoculo es cultivado en el recipiente, de tal manera que la densidad celular se incrementa a una densidad celular apropiada para alcanzar el nivel de producción de 3-HP que cumple con las métricas de productividad global tomando en consideración las siguiente etapa del método. En varias modalidades alternativas, una población de estos microorganismos modificados genéticamente puede ser cultivados a una primera densidad celular en un primer recipiente preparatorio y luego transferidos al recipiente indicado para proveer la densidad celular seleccionada. Novedosas estrategias de cultivo de multi-recipientes son conocidas para aquellos experimentados en el arte. Cualquiera de tales modalidades provee la densidad celular seleccionada de acuerdo con la primera etapa indicada del método.
También sin estar limitados, una etapa subsecuente puede ser ejemplificada por dos procedimientos, que también se pueden llevar a la práctica en combinación en varias modalidades. Un primer procedimiento provee una modificación genética al microorganismo modificado genéticamente de tal manera que su actividad enzimática de enoil-ACP reductasa puede ser controlada. Como un ejemplo, una modificación genética se puede hacer para sustituir la enoil-ACP reductasa natural una enoil-ACP reductasa mutante sensible a la temperatura (por ejemplo, Fablus en E. coli) . La última puede exhibir actividad enzimática reducida a temperaturas mayores de 30°C, pero la actividad enzimática normal a 30°C, de tal manera que al elevar la temperatura del cultivo a, por ejemplo to 34°C, 35°C, 36°C, 37°C o aún 42°C, reduce la actividad enzimática de enoil-ACP reductasa. En tal caso, más malonil-CoA es convertida a 3-HP u otro producto químico que a 30 °C, en donde la conversión de malonil-CoA a ácidos grasos no es impedida por una enoil-ACP reductasa menos efectiva.
Para el segundo procedimiento, un inhibidor de enoil-ACP reductasa u otro de la enzima de ácido graso sintasa, es agregado para reducir la conversión de malonil-CoA a ácidos grasos. Por ejemplo, el inhibidor cerulenina es agregado a una concentración que inhibe una o más enzimas del sistema de ácido graso sintasa. La Figura 2A ilustra rutas relevantes y muestra tres inhibidores - tiolactomicina, triclosan y cerulenina, próximos a las enzimas que inhiben. Los nombres del gen de E. coli circundados indican que un mutante sensible a la temperatura está disponible para el polipéptido codificado por el gen. La Figura 2B provee una ilustración más detallada de las conversión enzimáticas representativas y genes de E. coli ejemplares del sistema de ácido graso sintetasa que fue más ilustrado más en general en la Figura 2A. El listado de inhibidores de enzimas de ácido graso sintetasa de microorganismo no pretende ser limitante. Otros inhibidores, algunos de los cuales son usados como antibióticos, son conocidos en el arte e incluyen, pero no están limitados a, diazaborinas tales como tienodiazaborina, e isoniazida.
Los aspectos de tolerancia a 3-HP de la presente invención pueden ser usados con cualquier microorganismo que elabora 3-HP, ya sea que el organismo elabore 3-HP naturalmente o ha sido modificado genéticamente por cualquier método para producir 3-HP.
En cuanto a los aspectos de incremento de producción de 3-HP de la invención, que pueden dar como resultado un titulo elevado de 3-HP en la bio-producción industrial, las modificaciones genéticas comprenden introducción de una o más secuencias de ácido nucleico a un microorganismo, en donde la una o más secuencias de ácido nucleico codifican por y expresan una o más enzimas de ruta de producción (o actividades enzimáticas de enzimas de una ruta de producción) . En varias modalidades, estas mejoras combinan mediante esto para incrementar la eficiencia y eficacia de y consecuentemente para disminuir los costos por la bio-producción industrial de 3-HP.
Cualquiera de una o más de un número de rutas de producción de 3-HP pueden ser usadas en un microorganismo tal como en combinación con modificaciones genéticas dirigidas a mejorar la tolerancia a 3-HP. En varias modalidades, se hacen modificaciones genéticas para proveer actividad enzimática para implementación de una o más de tales rutas de producción de 3-HP. Varias rutas de producción de 3-HP son conocidas en el arte. Por ejemplo, la patente estadounidense No. 6,852,517 enseña una ruta de producción de 3-HP a partir de glicerol como fuente de carbono y es incorporada por referencia por sus enseñanzas de aquella ruta. Esta referencia enseña proveer una construcción genética que expresa el gen dhaB de Klebsiella pneumoniae y un gen para un aldehido deshidrogenasa . Se afirma que estos son aptos de catalizar la producción de 3-HP a partir de glicerol. Sin embargo, es reconocido que en algunas modalidades la fuente de carbono para la bio-producción de 3-HP excluye glicerol como una porción mayor de la fuente de carbono.
WO 2002/042418 enseña varias rutas de producción de 3-HP. Esta publicación de PCT es incorporada por referencia por sus enseñanzas de tales rutas. También, la Figura 44 de aquella publicación, que resume una ruta de producción de 3-HP a partir de glucosa a piruvato a acetil-CoA a malonil-CoA a 3-HP, es provista en la presente. La Figura 55 de aquella publicación, que resume una ruta de producción de 3-HP a partir de glucosa a fosfoenolpiruvato (PEP) a oxaloacetato (directamente o vía piruvato) a aspartato a ß-alanina a malonato semialdehido a 3-HP, es provista en la presente. Enzimas representativas para varias conversiones son también mostradas en estas figuras.' La Figura 13, de la publicación de patente estadounidense No. US2008/0199926, publicada el 21 de agosto de 2008 e incorporada por referencia en la presente, resume las rutas de producción de 3-HP descritas en la presente y otras rutas naturales conocidas. Más en general, en cuanto al desarrollo ' de rutas metabólicas específicas, de las cuales muchas pueden ser encontradas en la naturaleza, Hatzimanikatis et al.' discute esto en "Exploring the diversity of complex metabolic networks", Bioinformatics 21 (8) : 1603-1609 (2005) . Este artículo es incorporado por referencia por sus enseñanzas de la complejidad de rutas metabólicas.
Además de la ruta de producción de 3-HP resumida en las figuras, Strauss y Fuchs ("Enzymes of a novel autotrophic C02 fixation pathway in the phototrophic bacterium Chloroflexus aurantiacus, the 3-hydroxyproprionate cycle", Eur. J. Bichem. 215, 633-643 (1993) ) identificaron una ruta bacteriana natural que produce 3-HP. En aquel tiempo los autores afirmaron que la conversión de malonil-CoA a malonato semialdehido fuera mediante una malonato semialdehido deshidrogenasa acilante NADP-dependiente y conversión de malonato semialdehido a 3-HP fue catalizada mediante una 3-hidroxipropionato deshidrogenasa. Sin embargo, desde aquel tiempo se ha .apreciado que, por lo menos para Chloroflexus aurantiacus, una sola enzima puede catalizar ambas etapas (M. Hugler et al., "Malonyl-Coenzyme A Reductase from Chloroflexus aurantiacus, a Key Enzyme of the 3-Hydroxypropionate Cycle for Autotrophic C02 Fixation", J. Bacter, 18 (9) : 2404-2410 (2002)).
Asi, una ruta de producción de varias modalidades de la presente invención comprende la actividad enzimática de malonil-Co-A reductasa que obtiene conversiones de malonil-CoA a malonato semialdehido a 3-HP. Como se provee en un ejemplo en la presente, la introducción a un microorganismo de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que proveer esta enzima (o actividad enzimática) es efectiva para proveer biosintesis de 3-HP incrementada.
Así, para varias modalidades de la invención, las manipulaciones genéticas a cualesquier rutas del 3HPTCG y cualquiera de las bio-rutas de producción de 3-HP pueden ser descritas que incluyen varias manipulaciones genéticas, incluyendo aquellas dirigidas a cambiar la regulación de y por. consiguiente actividad final de, una enzima o actividad enzimática de una enzima¦ identificada en cualquiera de las rutas respectivas. Tales modificaciones genéticas pueden ser dirigidas a modificaciones transcripcionales, de traducción y post-traducción que dan como resultado un cambio en la actividad enzimática y/o selectividad bajo condiciones de cultivo seleccionadas y/o identificadas. Asi, en varias modalidades, para funcionar más eficientemente, un microorganismo puede comprender una o más cancelaciones genéticas. Por ejemplo, como se resume en la Figura 14B para una modalidad particular en E. coli, los genes que codifican lactato deshidrogenasa (ldhA) , fosfato acetiltransferasa (pta) , piruvato oxidasa (poxB) y piruvato-formiato liasa (pflB) pueden ser cancelados. Tales cancelaciones genéticas son resumidas en el fondo de la Figura 14B para una modalidad particular, que no pretende ser limitante. Adicionalmente, una cancelación adicional u otra modificación para reducir la actividad enzimática de 2-ceto-3-desoxigluconato 6-fosfato aldolasa multifuncional y 2-ceto-4-hidroxiglutarato aldolasa y .oxaloacetato decarboxilasa (eda en E: coli), puede ser provista a varias cepas. Además de lo último, en varias modalidades combinadas con tal reducción de actividad enzimática de 2-ceto-3-desoxigluconato 6-fosfato aldolasa multifuncional y 2-ceto-4-hidroxiglutarato aldolasa y oxaloacetato decarboxilasa (eda en E. coli) , modificaciones genéticas adicionales se pueden hacer para incrementar un transportador de glucosa (por ejemplo, galP en E. coli) y/o para disminuir la actividad de una o más proteínas de histidil fosforolizable. estables térmicamente (de PTS) (ptsH (HPr) en E. coli) , proteína de transferencia de fosforilo (de PTS) (ptsl en E. coli), y la cadena de polipéptido de PTS (Crr en E. coli) .
Las cancelaciones genéticas se pueden llevar a cabo mediante procedimientos de cancelación genética mutacionales y/o partiendo con una cepa mutante que tiene expresión reducida o ninguna expresión de una o más de estas enzimas y/u otros métodos conocidos para aquellos experimentados en el arte.
Aspectos de la invención también con respecto a la provisión de múltiples modificaciones genéticas para mejorar la efectividad global del microorganismo en convertir una fuente de carbono seleccionada a un producto químico tal como 3-HP. Combinaciones particulares son mostradas, tales como en los ejemplos, para incrementar la productividad específica, productividad volumétrica, título y rendimiento sustancialmente con respecto a combinaciones más básicas de modificaciones genéticas.
Además de las modificaciones genéticas de la Figura 9, modificaciones genéticas adicionales apropiadas pueden proveer métricas de producción mejoradas adicionales. Por ejemplo, una cepa modificada genéticamente es ilustrada en la Figura 8. Esta cepa comprende modificaciones genéticas para la producción de 3-HP (tal como se describe anteriormente en la Sección VII anterior) , tolerancia a 3-HP (tal como se describe posteriormente) y modificaciones genéticas adicionales como se revela en la presente (incluyendo una modificación genética particular con respecto al sistema de ácido graso sintasa, no para ser limitantes, tales modificaciones reveladas más en general en cualquier parte en la presente incluyendo en la Sección VI). En esta figura, las funciones enzimáticas son indicadas por conversiones enzimáticas indicadas y/o identificadores de gen de E. coli representativos que codifican proteínas que tienen tales funciones enzimáticas (excepto que mcr indica sin malonil-CoA reductasa de E. coli) , las cancelaciones son mostradas por el estándar "?" antes del identificador de gen respectivo y las actividades enzimáticas incrementadas son mostradas mediante subrayado (nótese que objetivos adicionales para modificaciones son como se indica en la tabla incrustada de la figura) . Los genes en paréntesis son sustitutos son posibles para o complementos de una enzima codificada por otro gen también mostrado junto con la etapa- de ruta respectiva. También, el uso de fabITS representa una sustitución por el gen no sensible a la temperatura natural. Esto no pretende ser limitante; como se describe en cualquier parte en la presente hay un número de procedimientos para controlar y limitar el flujo a acil graso-ACP.
La modalidad de la Figura 8 ilustra un número de modificaciones genéticas en combinación, sin embargo en varias modalidades de la presente invención otras combinaciones de las modificaciones genéticas de estas funciones enzimáticas pueden ser provistas para obtener un nivel deseado de proporción incrementada, titulo y rendimiento en cuanto a bio-producción de un producto químico.
Modificaciones genéticas adicionales pueden ser provistas en una cepa de microorganismo de la presente invención. Muchas de tales modificaciones pueden ser provistas para impartir un fenotipo particular.
Como un ejemplo, una cancelación, de 2-ceto-3-desoxigluconato 6-fosfato aldolasa multifuncional y 2-ceto-4-hidroxiglutarato aldolasa y oxaloacetato decarboxilasa (eda en E. coli) , puede ser provista a varias cepas.
Por ejemplo, la habilidad para utilizar sacarosa puede ser provista y esta expanderia el intervalo de materias primas de alimentación que pueden ser utilizadas para producir 3-HP u otros productos químicos. Cepas de laboratorio e industriales comunes de E. coli, tales como las cepas descritas en la presente, no son aptas de utilizar sacarosa como la única fuente de carbono. Puesto que la sacarosa y materia prima de alimentación que contienen sacarosa tales como melasas son abundantes y frecuentemente usadas como materias primas de alimentación para la producción mediante fermentación microbiana, la adición de modificaciones genéticas apropiadas para permitir la absorción y uso de sacarosa se puede llevar a la práctica en cepas que tienen otros elementos como se provee en la presente. Varios sistemas de absorción y metabolismo de sacarosa son conocidos en el arte (por ejemplo, patente estadounidense No. 6,960,455), incorporada por referencia por tales enseñanzas. Estos y otros procedimientos pueden ser provistos en cepas de la presente invención. Los ejemplos proveen por lo menos dos procedimientos.
También, modificaciones genéticas pueden ser provistas para agregar funcionalidad para el rompimiento de fuentes de carbono más complejas, tales como biomasa celulósica o productos de la misma, para absorción y/o utilización de tales fuentes de carbono. Por ejemplo, numerosos sistemas de degradación de celulasas y celulosa a base de celulasa han sido estudiados y caracterizados (véase, por ejemplo e incorporadas por referencia en la presente por tales enseñanzas, Beguin, P y Aubert, J-P (1994) FEMS icrobial. Rev. 13: 25-58; Ohima, K. et al. (1997) Biotechnol . Genet. Eng. Rev. 1 : 365414) .
Además de las modificaciones genéticas descritas anteriormente, en varias modalidades, modificaciones genéticas también son provistas para incrementar el fondo y disponibilidad del co-factor NADPH y/o consecuentemente, la proporción de NADPH/NADP+. . Por ejemplo, en varias modalidades para E. coli, esto se puede hacer al incrementar la actividad, tal como mediante modificación genética, de uno o más de los siguientes genes-pgi (en una forma mutada) , pntAB, sobreexpresado, sustitución/reemplazo de gapA:gapN y disrupción o modificación de una transhidrogenasa soluble tal como sthA, y/o modificaciones genéticas de uno o más de z f, gnd y edd.
Cualesquier de tales modificaciones genéticas pueden ser provistas a especies que no tiene tal funcionalidad o que tienen un nivel menor que el deseado de tal funcionalidad.
Más en general y dependiendo de las rutas metabólicas particulares de un microorganismo seleccionado para modificación genética, cualquier subgrupo de modificaciones genéticas se puede hacer para disminuir la producción celular de producto (s) de fermentación seleccionado ( s ) del grupo que consiste de acetato, acetoina, acetona, acrilico, malato, etil ésteres de ácido graso, isoprenoides, glicerol, etilenglicol, etileno, propileno, butileno, isobutileno, acetato de etilo, acetato de vinilo, otros acetatos, 1,4-butandiol, 2, 3-butandiol, butanol, isobutanol, sec-butanol, butirato, isobutirato, . 2-OH-isobutirato, 3-OH-butirato, etanol, isopropanol, D-lactato, L-lactato, piruvato, itaconato, levulinato, glucarato, glutárato, caprolactama, ácido adipico, propanol, isopropanol, alcoholes de fusel y 1, 2-propandiol, 1, 3-propandiol, formiato, ácido fumárico, ácido propiónico, ácido succinico, ácido valérico y ácido maleico. Cancelaciones genéticas se pueden hacer como se revela en general en la presente y otros procedimientos pueden también ser usados para obtener una producción celular disminuida deseada o de productos de fermentación seleccionados.
X. Separación y Purificación del Producto Químico 3-HP Cuando 3-HP es el producto químico, el 3-HP puede ser separado y purificado mediante los procedimientos descritos en los siguientes párrafos, tomando en cuenta que muchos métodos de separación y purificación son conocidos en el arte y la siguiente revelación no pretende ser limitante. Choque osmótico, sonificación, homogenización y/o un ciclo de congelación-deshielo repetido seguido por filtración y/o centrifugación, entre otros métodos, tales como ajuste del pH y tratamiento térmico, pueden ser usados para producir un extracto libre de células de células intactas. Cualquiera de uno o más de estos métodos también pueden ser empleados para liberar 3-HP de células como una etapa de extracción.
Además, en cuanto al procesamiento general de un caldo de bio-producción que comprende 3-HP, varios métodos se pueden llevar a la práctica para remover biomasa y/o separar 3-HP del caldo de cultivo y sus componentes. Métodos para separar y/o concentrar el 3-HP incluyen centrifugación, filtración, extracción, conversión química tal como esterificación, destilación (que puede dar como resultado conversión química, tal como deshidratación a ácido acrilico, bajo algunas condiciones de destilación reactivas) , cristalización, cromatografía e intercambio iónico, en varias formas. Adicionalmente, la ruptura celular' se puede llevar a cabo como se necesite para liberar 3-HP de la masa celular, tal como mediante sonificación, homogenización, ajuste del pH o calentamiento. El 3-HP puede ser separado adicionalmente y/o purificado mediante métodos conocidos en el arte, incluyendo cualquier combinación de uno o más de centrifugación, separaciones líquido-líquido, incluyendo extracciones tales como extracción de solvente, extracción reactiva, extracción acuosa de dos fases y extracción de solvente de dos fases, tecnologías de separación de membrana, destilación, evaporación, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de adsorción, cromatografía de fase inversa y cristalización. Cualquiera de los métodos anteriores pueden ser aplicados a una porción de un caldo de bio-producción (esto es, un caldo de fermentación, ya sea hecho bajo condiciones aeróbicas, anaeróbicas o microaeróbicas ) , tal como puede ser removido de un evento de bio-producción gradual o periódicamente o al caldo en la terminación de un evento de bio-producción. La conversión de 3-HP a productos corriente abajo, tal como se describe en la presente, puede proceder después de la separación y purificación o tal como con destilación, evaporación de película delgada o evaporación de película enjugada opcionalmente también en parte como medio de separación.
Para varios de estos procedimientos, se puede aplicar una estrategia a contracorriente o una estrategia secuencial o iterativa, tal como extracciones de multi-pasos. Por ejemplo, una solución acuosa dada que comprende 3-HP puede ser extraída repetidamente con una fase no polar que comprende una amina para obtener múltiples extracciones reactivas.
Cuando un evento de cultivo (evento de fermentación) está a un punto de consumación, el caldo agotado puede ser transferido a un tanque separado o permanecer en el recipiente de cultivo ya sea en un caso u otro, la temperatura puede ser elevada a por lo menos 60 °C por un mínimo de una hora con el fin de exterminar los microorganismos. (Alternativamente, se pueden llevar a la práctica otros procedimientos para exterminar los microorganismos) . Caldo agotado significa el volumen de líquido final que comprende los medios nutrientes iniciales, células cultivadas del inoculo de microorganismo (y posiblemente incluyendo algunas células originales del inoculo) , 3-HP y opcionalmente adiciones líquidas hechas después de proveer los medios nutrientes iniciales, tal como adiciones periódicas para proveer fuente de carbón adicional, etc. Se notará que el caldo agotado puede comprender ácidos orgánicos diferentes a 3-HP, tales como por ejemplo ácido acético y/o ácido láctico.
Una etapa de centrifugación se puede luego llevar a la práctica para filtrar los sólidos de biomasa (por ejemplo, células de microorganismos) . Esto se puede obtener en una centrífuga continua o por lotes y la remoción de sólidos puede ser por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90% o 95% en un solo paso o acumulativamente después de dos o más centrifugaciones seriales.
Una etapa opcional es pulir el líquido centrifugado a través de un filtro, tal como microfiltración o ultrafiltración o puede comprender una prensa de filtros u otro dispositivo de filtro al cual se agrega un auxiliar de filtración tal como tierra diatomácea. Procedimientos alternativos o complementarios a esto y la centrifugación pueden incluir remoción de células por un agente floculante, en donde las células floculan y se permite que se asienten y el liquido es extraído o de otra manera removido. Un agente floculante puede ser agregado a un caldo de fermentación después de lo cual se permite el asentamiento del material por un tiempo y luego se pueden aplicar separaciones, incluyendo pero no limitado a centrifugación.
Después de tales etapas, un caldo agotado que comprende 3-HP y sustancialmente libre de sólidos es obtenido para procesamiento adicional. "Sustancialmente libre de sólidos" significa mayor de 98%, 99% o 99.5% de los sólidos han sido removidos .
En varias modalidades, este caldo agotado comprende varios iones de sales, tales como Na, Cl, S04 y P0 . En algunas modalidades, estos iones pueden ser removidos al hacer pasar este caldo agotado a través de columnas de intercambio iónico o de otra manera poner en contacto el caldo agotado con el material de intercambio iónico apropiado. Aquí y en cualquier parte en este documento, "contacto" significa un contacto por el propósito afirmado mediante cualquier manera conocida para las personas experimentadas en el arte, tales como por ejemplo en una columna, bajo condiciones apropiadas que están bien dentro de la habilidad de personas de habilidad ordinaria en el arte relevante para determinar. Como solo un ejemplo, estos pueden comprender contacto secuencial con materiales de intercambio aniónico y catiónico (en cualquier orden) o con un material aniónico/catiónico mezclado. Esta etapa de desmineralización debe remover la mayoría de tales iones inorgánicos sin remover el 3-HP. Esto puede ser obtenido, por ejemplo, al disminuir el pH suficientemente para protonar 3-HP y ácidos orgánicos similares de tal manera que estos ácidos no son enlazados al material de intercambio aniónico, mientras que aniones tales como Cl y S04, que permanecen cargados a tal pH son removidos de la solución mediante el enlace a la resina. Asimismo, los iones cargados positivamente son removidos mediante contacto con el material de intercambio catiónico. Tal remoción de iones puede ser determinada por una disminución de la conductividad de la solución. Tales materiales de intercambio iónico pueden ser regenerados mediante métodos conocidos para aquellos experimentados en el arte.
En algunas modalidades, el caldo agotado (tal como, pero no necesariamente después de la etapa de desmineralización previa) es sometido a una elevación de pH, después de lo cual se hace pasar a través de una columna de intercambio iónico o de otra manera se pone en contacto con una resina de intercambio iónico, que comprende grupos aniónicos, tales como aminas, a las cuales ácidos orgánicos, iónicos a este pH, se asocian. Otros orgánicos que no se asocian con aminas a este pH (que puede ser de más de 6.5, más de 7.5, más de 8.5, más de 9.5, más de 10.5 o pH más alto) pueden ser separados, de los ácidos orgánicos en esta etapa, tal como mediante lavado con un enjuague a pH elevado. Después de esto, la elución con un enjuague de pH más bajo y/o contenido de sal elevado puede remover los ácidos orgánicos. La elución con un gradiente de pH en disminución y/o enjuagues de contenido de sal incrementado puede permitir una separación más distinta de 3-HP de otros ácidos orgánicos, simplificando mediante esto el procesamiento adicional.
Esta última etapa de retención de resina de intercambio aniónico de ácidos orgánicos se puede llevar a la práctica antes o después de la etapa de desmineralización . Sin embargo, los siguientes dos procedimientos son alternativas a la etapa de resina de intercambio aniónico.
Un primer procedimiento alternativo comprende extracción reactiva (una forma de extracción liquido-líquido) como se ejemplifica en este y en los párrafos siguientes. El caldo agotado, que puede estar a una etapa antes o después de la etapa de desmineralización anterior, es combinado con una cantidad de una amina terciario tal como Alamine336® (Cognis Corp., Cincinnati, OH EUA) a bajo pH. Co-solventes para la Alamine336 u otra amina terciaria pueden ser agregados e incluyen, pero no están limitados a benceno, tetracloruro de carbono, cloroformo, ciclohexano, diisobutil cetona, etanol, aceite combustible #2, isopropanol, queroseno, n-butanol, isobutanol, octanol y n-decanol, que incrementan el coeficiente de división cuando son combinados con la amina. Después de la mezcla apropiada un período de tiempo para la separación de fase transpira, después de lo cual la fase no polar, que comprende 3-HP asociado con la Alamine336 u otra amina terciaria, es separado de la fase acuosa.
Cuando un co-solvente es usado que tiene un punto de ebullición más bajo que el 3-HP/amina terciaria, se puede usar una etapa de destilación para remover el co-solvente, dejando mediante esto el complejo de 3-HP-amina terciaria en la fase no polar.
Ya sea que haya o no tal etapa de destilación, una etapa de separación o recuperación puede ser usada para separar el 3-HP de la amina terciaria. Una sal inorgánica, tal como sulfato de amonio, cloruro de sodio o carbonato de sodio o una base tal como hidróxido de sodio o hidróxido de amonio, es agregada al 3-HP/amina terciaria para invertir la reacción de protonación de amina y una segunda fase es provista mediante la adición de una solución acuosa (que puede ser el vehículo para provisión de la sal inorgánica) . Después de la mezcla apropiada, se tienen como resultado dos fases y esto permite la regeneración y reutilización de la amina terciaria y provee el 3-HP . en una solución acuosa. Alternativamente, también se puede usar agua caliente sin una sal o base para recuperar el 3HP de la amina.
En el procedimiento anterior la separación de fases y extracción de 3-HP a la fase acuosa puede servir para concentrar el 3-HP. Se notará que la separación cromatográfica de ácidos orgánicos respectivos también puede servir para concentrar tales ácidos, tales como 3-HP. En procedimientos similares, otras aminas no polares apropiadas que pueden incluir aminas primarias, secundarias y cuaternarias, pueden ser usadas en lugar de y/o en combinación con una amina terciaria.
Un segundo procedimiento alternativo es cristalización. Por ejemplo, el caldo agotado (tal como libre de sólidos de biomasa) se puede poner en contacto con una base fuerte tal como hidróxido de amonio, que da como resultado la formación de una sal de amonio de 3-HP. Esta puede ser concentrada y luego cristales de amonio-3-?? son formados y pueden ser separados, tal como mediante filtración de la fase acuosa. Una vez recolectado, los cristales de amonio-3-?? pueden ser tratados con un ácido, tal como ácido sulfúrico, de tal manera que se regenera sulfato de amonio, de tal manera que 3-HP y sulfato de amonio se tienen como resultado.
También, varios métodos de extracción de dos fases acuoso pueden ser utilizados para separar y/o concentrar un producto químico deseado de un caldo de fermentación o solución obtenida más tarde. Es conocido que la adición de polímeros, tales como dextrana y polímeros de glicol, tales como polietilenglicol (PEG) y polipropilenglicol (PPG) a una solución acuosa puede dar como resultado la formación de dos fases acuosas. En tales sistemas, un producto químico deseado se puede segregar a una fase mientras que las células y otros químicos se dividen a la otra fase, proporcionando así una separación sin el uso de solventes orgánicos. Este procedimiento ha sido demostrado para algunos productos químicos, pero retos asociados con la recuperación de productos químicos de una solución de polímeros y bajas selectividades son reconocidos (véase "Extractive Recovery of Products from Fermentation Broths", Joong Kyun Kim et al., Biotechnol. Bioprocess Eng., 1999(4)1-11, incorporada por referencia por todas sus enseñanzas de los métodos de recuperación extractivas) .
Varias sustituciones y combinaciones de las etapas y procesos anteriores se pueden hacer para obtener una solución de 3-HP relativamente purificada. También, los métodos de separación y purificación revelados en la patente estadounidense US 6,534,679, expedida el 18 de marzo de 2003, e incorporada por referencia en la ¦ presente por tales revelaciones de métodos, pueden ser considerados en base al esquema de procesamiento particular. También, en algunos eventos de cultivo, la remoción periódica de una porción del volumen de liquido se puede hacer y el procesamiento de tal (es) porción (es) se puede hacer para recuperar el 3-HP, incluyendo mediante cualquier combinación de los procedimientos revelados anteriormente.
Como se indica, la extracción de solvente es otra alternativa. Esta puede ser cualquiera de un número de y/o combinaciones de solventes, incluyendo alcoholes, ésteres, cetonas y varios solventes orgánicos. Sin ser limitantes, después de la separación de fases o etapa de destilación o una extracción secundaria puede ser empleada para separar 3-HP de la fase orgánica.
Las siguientes fuentes publicadas son incorporadas por referencia en la presente por sus respectivas enseñanzas para indicar el nivel de habilidad en estas artes relevantes, y como se necesario para apoyar una revelación que enseña cómo fabricar y usar métodos de bio-producción industrial de 3-HP y también sistemas industriales que pueden ser usados para obtener tal conversión con cualquiera de los microorganismos recombinantes de la presente invención {Biochemical Engineering Fundamentáis, 2nd Ed. J. E. Bailey and D. F. Ollis, McGraw Hill, New York, 1986, todo el libro por los propósitos indicados en el Capitulo 9, pp. 533-657 en particular por el diseño del reactor biológico; Unit Operations of Chemical Engineering, 5th Ed. , W. L. McCabe et al., McGraw Hill, New York 1993, todo el libro por propósitos indicados y particularmente para el proceso y análisis de tecnologías de separación; Equilibrium Staged Separations, P. C. Wankat, Prentice Hall, Englewood Cliffs, NJ USA, 1988, todo el libro para las enseñanzas de tecnologías de separación) .
XI . Conversión de 3-HP a Ácido Acrilico y Productos Corriente Abajo Como se discute en la presente, varias modalidades descritas en la presente son concernientes con la producción de un producto químico particular, ácido 3-hidroxipropiónico (3-HP). Este ácido orgánico, 3-HP, puede ser convertido a varios otros productos que tienen usos industriales, tales como pero no limitados a ácido acrilico, ésteres de ácido acrilico y otros químicos obtenidos de 3-HP, denominados como "productos corriente abajo". Bajo algunos procedimientos, el 3-HP puede ser convertido a ácido acrilico, acrilamida y/u otros productos químicos corriente abajo, en algunas instancias, la conversión está asociada con las etapas de separación y/o purificación. Muchas conversiones a tales productos corriente abajo son descritas en la presente . ^ Los métodos de la invención incluyen etapas para producir productos corriente abajo de 3-HP.
Como un bloque de construcción de C3, 3-HP ofrece mucho potencial en una variedad de conversiones químicas a intermediarios comercialmente importantes, productos finales industriales y productos del consumidor. Por ejemplo, el 3-HP puede ser convertido a ácido .acrilico, acrilatos (por ejemplo, sales y ésteres de ácido acrilico), 1 , 3-propandiol , ácido malónico, etil-3-hidroxipropionato, etil etoxi propionato, propiolactona, acrilamida o acrilonitrilo .
Por ejemplo, el acrilato de metilo puede ser fabricado a partir de 3-HP vía deshidratación y esterificación, la última para agregar un grupo metilo (tal como usando metanol) ; la acrilamida puede ser fabricada a partir de 3-HP vía deshidratación y reacciones de amidación; el acrilonitrilo puede ser fabricado vía una reacción de deshidratación y formación de una porción de nitrilo; la propriolactona puede ser fabricado a partir de 3-HP vía una reacción de esterificación interna de formación de anillo (eliminación de una molécula de agua) ; el etil-3-?? puede ser fabricado a partir de 3-HP vía esterificación con etanol; el ácido malónico puede ser fabricado a partir de 3-HP vía una reacción de oxidación; y el 1, 3-propandiol puede ser fabricado a partir de 3-HP vía una reacción de reducción. También, el ácido acrilico, convertido primero de 3-HP mediante deshidratación, puede ser esterificado con compuestos apropiados para formar un número de ésteres a base de acrilato comercialmente importantes, incluyendo pero no limitados a acrilato de metilo, acrilato de etilo, acrilato de metilo, acrilato de 2-etilhexilo, acrilato de butilo y acrilato de laurilo. Alternativamente, el 3HP puede ser esterificado para formar un éster de 3HP y luego deshidratado para formar el éster de acrilato.
Adicionalmente, el 3-HP puede ser oligomerizado o polimerizado para formar homopolimeros de poli (3-hidroxipropionato) o co-polimerizado con uno o más otros monómeros para formar varios copolimeros. Debido a que el 3-HP tiene solamente un estereoisómero individual, la polimerización de 3-HP no es complicada por la estéreo-especificidad de monómeros durante el crecimiento de cadena. Esto es en contraste con el ácido ( S ) -2-hidroxipropanoico (también conocido como ácido láctico) , que tiene dos estereoisómeros (D, L) que deben ser considerados durante sus polimerizaciones.
Como se describirá adicionalmente, 3-HP puede ser convertido a derivados partiendo (i) sustancialmente como la forma protonada de ácido 3-hidroxipropiónico; (ii) sustancialmente como la forma desprotonada, 3-hidroxipropionato; o (iii) como mezclas de las formas protonada y desprotonada. En general, la fracción de 3-HP presente como el ácido versus la sal dependerá del pH, la presencia de otras especies iónicas en solución, temperatura (que cambia la constante de equilibrio concerniente con las formas de ácido y sal) y a alguna extensión la presión.
Muchas conversiones químicas pueden ser llevadas a cabo ya sea a partir de una u otra de formas de 3-HP y la economía de proceso global comúnmente determinará la forma de 3-HP para la conversión corriente abajo.
También, como ejemplo de una conversión durante la separación, 3-HP en una forma de sal de amina, tal como en la etapa de extracción revelada en la presente utilizando Alamine 336 como la amina, puede ser convertido a ácido acrílico al poner en contacto una solución que comprende la sal de amina de 3-HP con un catalizador de deshidratacion, tal como óxido de aluminio, a una temperatura elevada, tal como 170 a 180°C o 180 a 190°C o 190 a 200°C, y hacer pasar la fase vapor recolectada sobre un condensador de baja temperatura. Las condiciones de operación, incluyendo concentración de 3-HP, amina orgánica, co-solvente (si lo hay) , temperatura, velocidades de flujo, catalizador de deshidratacion y temperatura del condensador, son evaluadas y mejoradas por propósitos comerciales. Se espera que la conversión de 3-HP a ácido acrílico exceda por lo menos 80 por ciento o por lo menos 90 por ciento, en un solo evento de conversión. La amina puede ser reutilizada, opcionalmente después de la limpieza. Otros catalizadores de deshidratacion, como se proveen en la presente, pueden ser evaluados. Se notará que la patente estadounidense No. 7,186,856 revela datos con respecto a este procedimiento de conversión, aunque como parte de una conversión de división de sal extractiva que difiere de las enseñanzas en la presente. Sin embargo, la patente estadounidense No. 7,186,856 es incorporada por referencia por sus métodos, incluyendo división de sal extractiva, la última para indicar adicionalmente las varias maneras en que 3-HP puede ser extraído de un caldo de fermentación microbiano.
Además, en cuanto a modalidades en las cuales el producto químico que es sintetizado por la célula huésped del microorganismo es 3-HP, elaborado como se provee en la presente y opcionalmente purificado a una pureza seleccionada antes de la conversión, los métodos de la presente invención pueden también ser usados para producir compuestos "corriente abajo" derivados de 3-HP, tales como 3-HP polimerizado (poli-3-HP) , ácido acrílico, ácido poliacrílico (ácido acrílico polimerizado, en varias formas) , acrilato de metilo, acrilamida, acrilonitrilo, propiolactona, etil 3-HP, ácido malónico y 1, 3-propandiol . Numerosos procedimientos pueden ser empleados para tales conversiones corriente abajo, que caen en general en enzimáticos, catalíticos (proceso de conversión química utilizando un catalizador) , térmicos y combinaciones de los mismos (incluyendo algunos en donde se aplica una presión deseada para acelerar la reacción) .
Como se indica, un producto químico industrial importante que puede ser producido a partir de 3-HP es ácido acrilico. Químicamente, uno de los enlaces sencillos carbono-carbono en 3-HP deben sufrir una reacción de deshidratación, convirtiendo a un doble enlace carbono-carbono y rechazando una molécula de agua. La deshidratación de 3-HP en principio se puede llevar a cabo en fase líquida o en fase gaseosa. En algunas modalidades, la deshidratación toma lugar en presencia de un catalizador homogéneo o heterogéneo apropiado. Catalizadores de deshidratación apropiados son tanto catalizadores ácidos como catalizadores alcalinos. Enseguida de la deshidratación, se obtiene una fase que contiene ácido acrilico y puede ser purificada en donde sea apropiado mediante etapas de purificación adicionales, tales como mediante métodos de destilación, métodos de extracción o métodos de cristalización o combinaciones de los mismos.
La fabricación de ácido acrilico a partir de 3-HP vía una reacción de deshidratación puede ser obtenida mediante un número de metodologías comerciales incluyendo vía un proceso de destilación, que puede ser parte del régimen de separación y que puede incluir un ácido y/o un ion de metal como catalizador. Más ampliamente, incorporados en la presente por sus enseñanzas de conversión de 3-HP y otros compuestos de ß-hidroxi carbonilo, a ácido acrilico y otros compuestos corriente abajo relacionados, está la publicación de patente estadounidense No. 2007/0219390 Al, publicada el 20 de septiembre de 2007, ahora abandonada. Esta publicación enlista numerosos catalizadores y provee ejemplos de conversiones, que son incorporadas específicamente en la presente. También entre los varios métodos específicos para deshidratar 3-HP para producir ácido acrílico es un método más viejo, descrito en la patente estadounidense No. 2,469,701 (Redmon) . Esta referencia enseña un método para la preparación de ácido acrílico mediante calentamiento de 3-HP a una temperatura de entre 130 y 190°C, en presencia de un catalizador de deshidratacion, tal como ácido sulfúrico o ácido fosfórico, bajo presión reducida. La publicación de patente estadounidense No. 2005/0222458 Al (Craciun et al.) también provee un proceso para la preparación de ácido acrílico mediante calentamiento de 3-HP o sus derivados. La deshidratacion en fase vapor de 3-HP ocurre en presencia de catalizadores de deshidratacion, tales como lechos empacados de sílice, alúmina o titania. Estas publicaciones de patente son incorporadas por referencia por sus métodos concernientes con la conversión de 3-HP a ácido acrílico.
El catalizador de deshidratacion puede comprender uno o más óxidos de metal, tales como AI2O3, S1O2 o Ti02. En algunas modalidades, el catalizador de deshidratacion es un AI2O3 de alta área superficial o una sílice de alta área superficial, en donde la sílice consiste sustancialmente de Si02. Alta área superficial para los propósitos de la invención significa un área superficial de por lo menos aproximadamente 50, 75, 100 m2/g o más. En algunas modalidades, el catalizador de deshidratación puede comprender un aluminosilicato, tal como una zeolita.
Por ejemplo, incluyendo como forma ejemplificada de tales referencias incorporadas, 3-HP puede ser deshidratado a ácido acrilico via varios métodos específicos, que cada uno involucra frecuentemente uno o más catalizadores de deshidratación. Un catalizador de valor aparente particular es titanio, tal como en forma de óxido de titanio, TiO(2) . Un catalizador de dióxido de titanio puede ser provisto en un sistema de deshidratación que destila una solución acuosa que comprende 3-HP, en donde el 3-HP se deshidrata, tal como después de la volatilización, convirtiéndose a ácido acrilico y el ácido acrilico es recolectado mediante condensación de la fase vapor.
Como solo un método específico, una solución acuosa de 3-HP se hace pasar a través de una columna de reactor empacada con un catalizador de óxido de titanio mantenido a una temperatura de entre 170 y 190°C y presión atmosférica ambiental. El vapor que sale de la columna del reactor se hace pasar sobre un condensador de baja temperatura, en donde se recolecta ácido acrilico. El condensador de baja temperatura puede ser enfriado a 30°C o menos, 2°C o menos o a cualquier temperatura apropiada para la condensación eficiente en base a la velocidad de flujo y diseño del sistema. También, la temperatura de columna del reactor puede ser más baja, por ejemplo cuando se' opera a una presión más baja que la presión atmosférica ambiental. Se notará que el Ejemplo 1 de la publicación de patente estadounidense No. 2007/0219390, publicada el 20 de septiembre de 2007, ahora abandonada, provee parámetros específicos que emplean el procedimiento de este método. Como se indica, esta publicación es incorporada por referencia por sus enseñanzas y también por su listado de catalizadores que pueden ser usados en una reacción de deshidratación de 3-HP a ácido acrílico .
Además, en cuanto a los catalizadores de deshidratación, la siguiente tabla resume un número de catalizadores (incluyendo clases químicas) que pueden ser usados en una reacción de deshidratación de 3-HP (o sus ésteres) a ácido acrílico (o ésteres de acrilato) . Tales catalizadores, algunos de los cuales pueden ser usados en cualquier formas sólida, líquida o gaseosa, pueden ser usados individualmente o en cualquier combinación. Este listado de catalizadores no pretende ser limitante y muchos catalizadores específicos no enlistados pueden ser usados para reacciones de deshidratación específicas. Además, sin ser limitantes, la selección de catalizador puede depender del pH de la solución y/o la forma del 3-HP en una conversión particular, de tal manera que un catalizador ácido puede ser usado cuando 3-HP está en forma ácida y un catalizador básico puede ser usado cuando la sal de amonio de 3-HP es convertida a ácido acrilico. También, algunos catalizadores pueden estar en forma de resinas de intercambio iónico.
Tabla 8 : Catalizadores de Deshidratación En cuanto a otro método especifico utilizando uno de estos catalizadores, ácido sulfúrico concentrado y una solución acuosa que comprende 3-HP se hacen fluir separadamente a un reactor mantenido a 150 a 165°C a una presión reducida de 100 rara de Hg. Fluyendo del reactor se encuentra una solución que comprende ácido acrilico. Una modalidad especifica de este método, revelado en el Ejemplo 1 de US2009/007629 , incorporada por referencia en la presente, indica el rendimiento del ácido acrilico excede de 95 por ciento .
En base al amplio intervalo de catalizadores posibles y conocimiento en el arte de reacciones de deshidratación de este tipo, numerosos otros métodos de deshidratación específicos pueden ser evaluados e implementados para producción comercial.
La deshidratación de 3-HP puede también tomar lugar en ausencia de un catalizador de deshidratación. Por ejemplo, la reacción se puede poner en operación en fase vapor en presencia de un empaque nominalmente inerte tal como vidrio, cerámica, una resina, porcelana, plástico, empaque de polvo metálico o de ladrillo y todavía formar ácido acrilico en rendimientos y pureza razonables. Las partículas catalíticas pueden ser dimensionadas y configuradas de tal manera que la química es, en algunas modalidades, limitada por transferencia de masa o limitada cinéticamente. El catalizador puede tomar la forma de polvo, pelotillas, gránulos, perlas, extruídos y así sucesivamente. Cuando un soporte de catalizador es empleado opcionalmente, el soporte puede asumir cualquier forma física tales como pelotillas, esferas, canales monolíticos, etc. Los soportes pueden ser co-precipitados con especies de metal activas; o el soporte puede ser tratado con la especie de metal catalítica y luego usado tal cual o formado a las formas mencionadas anteriormente o el soporte puede ser formado a las formas mencionadas anteriormente y luego tratado con las especies catalíticas .
Un reactor para deshidratación de 3-HP puede ser diseñado y ponerse en operación en una amplia variedad de maneras. La operación del reactor puede ser continua, semi-continua o por lotes. Se percibe que una operación es sustancialmente continua y un estado estable es ventajoso desde las perspectivas de operaciones y economía. El patrón de flujo puede ser sustancialmente flujo tapón, sustancialmente bien mezclado o un patrón de flujo entre estos extremos. Un "reactor" puede realmente ser una serie o red de varios reactores en varias disposiciones.
Por ejemplo, sin ser limitantes, el ácido acrílico puede ser fabricado a partir de 3-HP vía una reacción de deshidratación, que puede ser obtenida mediante un número de metodologías comerciales incluyendo un proceso de destilación, que puede ser parte del régimen de separación y que puede incluir un ácido y/o ion de metal como catalizador. Más ampliamente, incorporado en la presente por sus enseñanzas de conversión de 3-HP y otros compuestos ß-hidroxi carbonilo a ácido acrilico y otros compuestos corriente abajo relacionados, está la publicación de patente estadounidense No. 2007/0219390 Al, publicada el 20 de septiembre de 2007, ahora abandonada. Esta publicación enlista numerosos catalizadores y provee ejemplos de conversiones, que son incorporados específicamente en la presente.
Por ejemplo, incluyendo como se ejemplifica de tales referencias incorporadas, 3-HP puede ser deshidratado a ácido acrilico vía varios métodos específicos, cada uno frecuentemente involucra uno o más catalizadores de deshidratación . Un catalizador de valor aparente particular es titanio, tal como en forma de óxido de titanio, Ti02. Un catalizador de dióxido de titanio puede ser provisto en un sistema de deshidratación que destila una solución acuosa que comprende 3-HP, en donde el 3-HP se deshidrata, tal como después de la volatilización, convirtiéndose a ácido acrilico y el ácido acrilico es recolectado mediante condensación de la fase vapor.
Como solo un método específico, una solución acuosa de 3-HP se hace pasar a través de una columna de reactor empacada con un catalizador de óxido de titanio mantenido a una temperatura de entre 170°C y 190°C y una presión atmosférica ambiental. Los vapores que salen de la columna de reactor se hacen pasar a un condensador de baja temperatura, en donde se recolecta ácido acrilico. El condensador de baja temperatura puede ser enfriado a 30 ! O menos, 20 °C o menos, 2°C o menos o a cualquier temperatura apropiada para la condensación eficiente en base a la velocidad de flujo y diseño del sistema. También, la temperatura de columna de reactor pueden ser más bajas, por ejemplo cuando se pone en operación a una presión más baja que la presión atmosférica ambiental. Se notará que el Ejemplo 1 de la publicación de patente estadounidense No. 2007/0219390, publicada el 20 de septiembre de 2007, ahora abandonada, provee parámetros específicos que emplean el procedimiento de este método. Como se indica, esta publicación es incorporada por referencia por sus enseñanzas y también por su listado de catalizadores que pueden ser usados en una reacción de deshidratación de 3-HP a ácido acrilico.
La cristalización del ácido acrilico obtenido mediante deshidratación de 3-HP puede ser usada como una de las etapas de separación/purificación finales. Varios procedimientos para la cristalización son conocidos en el arte, incluyendo cristalización de ésteres.
Como se indica anteriormente, en . algunas modalidades, una sal de 3-HP es convertida a ácido acrilico o un éster o sal del mismo. Por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 7, 186, 856 (Meng et al.) enseña un proceso para producir ácido, acrilico a partir de la sal de amonio de 3-HP, que involucra una primera etapa de calentamiento de la sal de amonio de 3-HP en presencia . de una amina orgánica o solvente que es invisible con agua, para formar una solución de dos fases y dividir la sal de 3-HP en sus respectivos constituyentes y únicos bajo condiciones que transfieren 3-HP de la fase acuosa a la fase orgánica de la solución, dejando los cationes amoniaco y amonio en la fase acuosa. La fase orgánica es luego re extraída para separar el 3-HP, seguido por una segunda etapa de calentamiento de 3-HP de la solución que contiene 3-HP en presencia de un catalizador de deshidratación para producir ácido acrílico. La Patente Estadounidense No. 7, 186,856 es incorporada por referencia por sus métodos para producir ácido acrílico a partir de sales de 3-HP. Varias alternativas al procedimiento particular revelado en esta patente pueden ser desarrolladas para la extracción apropiada y proceso de conversión.
El acrilato de metilo puede ser fabricado a partir de 3-HP vía deshidratación y esterificación, la última para agregar un grupo metilo (tal como usando metanol) , la acrilamida puede ser fabricada a partir de 3-HP vía reacciones de deshidratación y amidación, el acrilonitrilo puede ser fabricado vía una reacción de deshidratación y formación de una porción de nitrilo, la propiolactona puede ser fabricada a partir de 3-HP vía una reacción de esterificación interna de formación de anillo (eliminando una molécula de agua) , el etil-3HP puede ser fabricado a partir de 3-HP vía esterificación con etanol, el ácido malonico puede, ser fabricado a partir de 3-HP vía una reacción de oxidación y el 1, 3-propandiol puede ser fabricado a partir de 3-HP vía una reacción de reducción.
El ácido malonico puede ser producido a partir de oxidación de 3-HP como es producido en la presente. La Patente Estadounidense No. 5, 817,870 (Haas et al.) revela la oxidación catalítica de 3-HP mediante un metal precioso seleccionado de Ru, Rh, Pd, Os, Ir o Pt . Estos pueden ser catalizadores de metal puro o catalizadores soportados. La oxidación catalítica se puede llevar a cabo utilizando un catalizador de suspensión en un reactor de suspensión o utilizando un catalizador de lecho fijo en un reactor de lecho fijo. Si el catalizador, preferiblemente un catalizador soportado, es dispuesto en un reactor de lecho fijo, el último se puede poner en operación en un procedimiento de lecho de goteo también como en un procedimiento en fase líquida. El procedimiento de lecho de goteo de la fase acuosa que comprende el material de partida de 3-HP, también como los productos de oxidación de los mismos y medios para el ajuste de pH y oxígeno o un gas que contiene oxígeno puede ser conducido en flujo en paralelo o contra flujo. En el procedimiento de fase líquida, la fase líquida y la fase gaseosa son conducidas convenientemente en flujo en paralelo.
Con el fin de obtener un tiempo de reacción suficientemente corto, la conversión se lleva a cabo a un pH igual o mayor de 6, preferiblemente por lo menos 7 y en particular entre 7.5 y 9. De acuerdo con una modalidad preferida, durante la reacción de oxidación el pH es mantenido constante, preferiblemente a un pH en el intervalo de 7.5 y 9, al agregar una base, tal como una solución de hidróxido de metal alcalino o alcalinotérreo . La oxidación se lleva a cabo usualmente a una temperatura de por lo menos 10°C y máximamente 70°C. El flujo de oxigeno no es limitado. En el método de suspensión, es importante que el liquido y la fase gaseosa sean puestos en contacto mediante agitación vigorosa. El ácido malonico puede ser obtenido en rendimientos casi cuantitativos. La Patente Estadounidense No. 5, 817,870 es incorporada por referencia en la presente por sus métodos para oxidar 3-HP a ácido malonico.
El 1,3 propandiol puede ser producido a partir de hidrogenación de 3-HP como es producido en la presente. La Publicación de Patente Estadounidense No. 2005/0283029 (Meng et al.) es incorporada por referencia en la presente por sus métodos para la hidrogenación de 3-HP o ésteres del ácido o mezclas en presencia de un catalizador especifico, en fase liquida, para prepara 1, 3-propandiol . Catalizadores posibles incluyen metal de rutenio o compuestos de rutenio, soportados o sin soportar, solos o en combinación con por lo menos uno o mas metales adicionales seleccionados de molibdeno, tungsteno, titanio, zirconio, niobio, vanadio o cromo. El metal de rutenio o compuesto del mismo y/o el (los) metal (es) adicional (es) o compuesto del mismo, pueden ser utilizados en forma soportado o sin soportar. Si son utilizados en forma soportada, el método de preparación del catalizador soportado no es critico y puede ser cualquier técnica tal como impregnación del soporte o deposición sobre el soporte. Cualquier soporte apropiado puede ser utilizado. Los soportes que pueden ser utilizados incluyen pero no están limitados a alumina, titania, sílice, zirconia, carbonos, negros de carbono, grafitos, silicatos, zeolitas, zeolitas de aluminosilicatos, arcillas de aluminosilicatos y los seme antes .
El proceso de hidrogenación se puede llevar a cabo en fase líquida. La fase líquida incluye agua, solventes orgánicos que no son hidrogenables , tales como cualquier hidrocarburo alifático o aromático, alcoholes, éteres, tolueno, decalino, dioxano, diglima, n-heptano, hexano, xileno, benceno, tetrahidrofurano, ciclohexano, metilciclohexano y los semejantes y mezclas de agua y solvente (s) orgánico (s). El proceso de hidrogenación se puede llevar a cabo por lotes, semicontinua o continuamente. El proceso de hidrogenación se puede llevar a cabo en cualquier aparato apropiado. Ejemplos de tales aparatos son reactores de tanque agitado, reactores de lecho de goteo, reactores de hidrogenacion de alta presión y los semejantes.
El proceso de hidrogenacion se lleva a cabo en general a una temperatura que varia de aproximadamente a 20 a aproximadamente 250°C, mas particularmente de alrededor de 100 de alrededor de 200°C. Además, el proceso de hidrogenacion se lleva a cabo en general en un intervalo de presión · de aproximadamente 7 Kg/cm2 (20 libras/pulgada cuadrada) a aproximadamente 281 Kg/cm2 (4000 libras/pulgada cuadrada) . El gas que contiene hidrógeno utilizado en el proceso de hidrogenacion es opcionalmente hidrógeno comercialmente puro. El gas que contiene hidrógeno es utilizable si nitrógeno, hidrocarburos gaseosos u óxidos de carbono y materiales similares están presentes en el gas que contiene hidrógeno. Por ejemplo, se puede emplear hidrógeno de gas de síntesis (hidrógeno y monóxido de carbono) , tal gas de síntesis incluye además potencialmente dióxido de carbono, agua y varias impurezas.
Como es conocido en el arte, también es posible convertir 3-HP a 1 , 3-propandiol utilizando métodos biológicos. Por ejemplo, el 1 , 3-propandiol puede ser creado a partir de ya sea 3-HP-CoA o 3-HP vía el uso de polipéptidos que tiene actividad enzimática. Estos polipéptidos pueden ser usados ya sea in vitro o in vivo. Cuando se convierte 3-HP-CoA a 1, 3-propandiol, se pueden usar polipéptidos que tienen actividad de óxido reductasa o actividad de reductasa (por ejemplo, enzimas de la clase de enzimas 1.1.1) . Alternativamente, cuando se crea 1, 3-propandiol a partir de 3-HP, se puede usar una combinación de un polipéptido que tiene actividad de aldehido deshidrogenasa (por ejemplo, una enzima de la clase 1.1.1.34) y un polipéptido que tiene actividad de alcohol deshidrogenasa (por ejemplo, una enzima de la clase 1.1.1.32) .
Otra producción corriente debajo de 3-HP, acrilonitrilo, puede ser convertido de ácido acrilico mediante varias síntesis orgánicas, incluyendo pero no limitados al proceso de acrilonitrilo de Sohio, un método de una sola etapa de producción conocido en la industria de manufactura química.
También, reacciones de adición pueden producir ácido acrilico o derivados de acrilato que tienen grupos alquilo o arilo en el grupo carbonilo hidroxilo. Tales adiciones pueden ser catalizadas químicamente, tales como mediante hidrógeno, aluros de hidrógeno, cianuros de hidrógeno o adiciones de Michael bajo condiciones alcalinas opcionalmente en presencia de catalizadores básicos. Alcoholes, fenoles, sulfuro de hidrógeno y tioles son conocidos para agregar bajo condiciones básicas. Aminas aromáticas o amidas e hidrocarburos aromáticos, pueden ser agregados bajo condiciones ácidas. Estas y otras reacciones son descritas en Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Acrylic Acid and Derivatives, iley VCH Verlag GmbH, ienham (2005), incorporada por referenciá por sus enseñanzas de reacciones de conversión para ácido acrilico y sus derivados.
El ácido acrilico obtenido de 3-HP elaborado por la presente invención puede ser convertido adicionalmente a varios químicos, incluyendo polímeros, que también son considerados producto corriente abajo en algunas modalidades. Ésteres de ácido acrilico pueden ser formados a partir de ácido acrilico (o directamente de 3-HP) tal como mediante reacciones de condensación de esterificación con un alcohol, liberando agua. Esta química descrita en Monomeric Acrylic Esters, E.H. Riddle, Reinhold, NY (1954), incorporada por referencia por sus enseñanzas en cuanto a esterificación . Entre los ésteres que son formados están acrilato de metilo, acrilato de etilo, acrilato de n-bulo, acrilato de hidroxipropilo, acrilato de hidroxietilo, acrilato de isobutilo y acrilato de 2-etilhexilo y estos y/u otros ésteres de ácido acrilico y/u otros ésteres de acrilato pueden ser combinados, incluyendo con otros compuestos para formar varios polímeros a base de ácido acrilico conocidos. Aunque la acrilamida es producida en síntesis químicas mediante hidratación de acrilonitrilo, en la presente una conversión puede convertir ácido acrilico a acrilamida mediante amidación.
El ácido acrilico obtenido de 3-HP elaborado por la presente invención puede ser convertido adicionalmente a varios químicos, incluyendo polímeros, que son también considerados productos corriente abajo en algunas modalidades. Los ésteres de ácido acrílico pueden ser formados a partir de ácido acrílico (o directamente de 3-HP) tales como mediante reacciones de esterificación de condensación con un alcohol, liberando agua. Esta química es descrita en Monomeric Acrylic Esters, E.H. Riddle, Reinhold, NY (1954), incorporada por referencia por sus enseñanzas de esterificación . Entre los ésteres que son formados están acrilato de metilo, acrilato de etilo, acrilato de n-butilo, acrilato de hidroxipropilo, acrilato de hidroxietilo, acrilato de isobutilo y acrilato de 2-etilhexilo y estos y/u otros ésteres de ácido acrílico y/u otros ésteres de acrilato pueden ser combinados, incluyendo con otros compuestos para formar varios polímeros a base de ácido acrílico conocidos. Aunque la acrilamida es producida en síntesis química mediante hidratación de acrilonitrilo, en la presente una conversión puede convertir ácido acrílico a acrilamida mediante amidación.
La esterificación directa de ácido acrílico puede tomar lugar mediante métodos de esterificación conocidas por la persona experimentada en el arte, al poner en contacto el ácido acrílico obtenido de la deshidratación de 3-HP con uno o mas alcoholes, tales como metanol, etanol, 1-propanol, 2-propanol, n-butanol, tert-butanol o isobutanol y calentamiento a una temperatura de por lo menos 50, 75, 100, 125 o 150°C. El agua formada durante la esterificación puede ser movida de la mezcla de reacción, tal como mediante destilación azeotrópica por medio de la adición de auxiliares de separación apropiados o por otros medios de separación. Se pueden realizar conversiones de hasta el 25% o más, como es conocido en el arte.
Varios catalizadores de esterificación apropiados están disponibles comercialmente, tal como de Dow Chemical (Midland, Michigan US) . Por ejemplo, el catalizador en gel de Monodispersión en húmedo Amberlyst™131Wet confiere propiedades hidráulicas y de reactividad mejoradas y es apropiado para reactores de lecho fijo. Amberlyst™39Wet es un catalizador macroreticular particularmente apropiado para reactores en bucle agitados y de suspensión. Amberlyst™ 46 es un catalizador macroporoso que produce menos productos secundarios de éster que el catalizador convencional (como se describe en la Patente Estadounidense No. 5, 426,199 expedida Rohm and Haas, dicha patente es incorporada por referencia por sus enseñanzas de composiciones de catalizadores de esterificación y consideraciones de selección) .
El ácido acrílico y cualquiera de sus ésteres, puede ser convertido adicionalmente a varios polímeros. La polimerización puede proceder mediante cualquiera de calor, luz, otra radiación de energías suficiente y compuestos que generan radicales libres, tales como compuestos azo o peróxidos, para producir un polímero deseado de ácido acrílico o ésteres de acido acrílico. Como un ejemplo, la temperatura de la solución acuosa de ácido acrílico elevada a una temperatura conocida para iniciar la polimerización (en parte basada en la concentración de ácido acrílico inicial) y la reacción procede, el proceso involucra frecuentemente remoción de calor dada la alta exotermicidad de la reacción. Muchos otros métodos de polimerización son conocidos en el arte. Algunos son descritos en Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Polyacrylamides and Poly (Acrylic Acids), Wiley VCH Verlag GmbH, ienham (2005), incorporada por referencia por sus enseñanzas de reacciones de polimerización.
Por ejemplo, la polimerización por radical libre de ácido acrílico toman lugar mediante métodos de polimerización conocidos para el experimentado en el arte y se pueden llevar a cabo ya sea en una emulsión o suspensión en solución acuosa u otros solventes. Iniciadores, tales como pero no limitados a peróxidos orgánicos, frecuentemente son agregados para ayudar en la polimerización. Entre las clases de peróxidos orgánicos que pueden ser usados como iniciadores están diacilos, peroxidicarbonatos , monoperoxicarbonatos , peroxicetal'es, peroxiesteres, dialquilos e hidroperóxidos .
Otra clase de iniciadores son los iniciadores azo, que pueden ser usados para la polimerización de acrilato también como co-polimerizacion con otros. monómeros. Las Patentes Estadounidenses No. 5,470,928; 5,510,307; 6,709,919 y 7,678,869 enseñan varios procedimientos para la polimerización utilizando un numero de iniciadores, incluyendo peróxidos orgánicos, compuestos azo y otros tipos de químicos y son incorporadas por referencia por tales enseñanzas como sean aplicables a los polímeros descritos en la presente.
Así, .es además posible que co-monomeros, tales como agentes de reticulación, estén presentes durante la polimerización. La polimerización por radicales libres del ácido acrílico obtenido de la deshidratación de 3-HP, tal como es producido en la presente, en forma por lo menos parcialmente neutralizada en presencia de agentes de reticulación se lleva la practica en ciertas modalidades. Esta polimerización puede dar como resultado hidrogeles que pueden luego ser triturados, molidos y en donde sea apropiado, modificados en su superficie mediante técnicas conocidas .
Un uso comercial importante del ácido poliacrílico es para polímeros superabsorbentes . Esta especificación incorpora por referencia Modem Superabsorbent Pólymer Technology, Buchhol'z and Graham (Editors), Wiley-VCH 1997, en su totalidad por sus enseñanzas con respecto a componentes de polímeros superabsorbentes, manufactura, propiedades y usos. Los polímeros superabsorbentes son usados principalmente como absorbentes para agua y soluciones acuosas para pañales, productos de incontinencia de adultos, productos de higiene femenina y productos del consumidor similares. En tales productos del consumidor, los materiales superabsorbentes pueden reemplazar los materiales absorbentes tradicionales tales como tela, algodón, empaque de papel y fibra de celulosa. Los materiales superabsorbentes absorben y retienen bajo una ligera presión mecánica, hasta 25 veces de su peso en liquido. El gel hinchado mantiene el líquido en un estado cauteloso o a un lado solido impide que el líquido se fugue. Las partículas poliméricas superabsorbentes pueden ser modificadas en su superficie para producir una estructura de cubierta con la cubierta que esta más altamente reticulada. Esta técnica mejora el equilibrio de absorción, absorción bajo carga y resistencia a bloqueo de gel. Es reconocido que los polímeros superabsorbentes tienen usos en campos diferentes a productos del consumidor, incluyendo agricultura, horticultura y medicina.
Los polímeros superabsorbentes son preparados a partir de ácido acrílico (tal como ácido acrílico derivado de 3-HP provisto en la presente) y un agente de reticulación, mediante polimerización en solución o suspensión. Métodos ejemplares incluyen las Patentes Estadounidenses Nos. 5,145,906; 5,350,799; 5,342,899; 4,857,610; 4,985,518; 4,708, 997; 5,180,798; 4,666,983; 4,734,478; y 5,331,059, cada una incorporada por referencia por sus enseñanzas concernientes con polímeros superabsorbentes.
Entre los productos del consumidor, un pañal, un producto de higiene femenina y un producto de incontinencia de adultos son fabricados con polímeros superabsorbentes que en si mismo es fabricado sustancialmente de ácido acrílico convertido de 3-HP fabricado de acuerdo con la presente invención.
Los pañales y otros productos de higiene personal pueden ser producidos que incorporan polímeros superabsorbente fabricado a partir de ácido acrílico fabricad a partir de 3-HP que es bio-producido por las enseñanzas de la presente solicitud. Los siguientes proveen guía general para fabricar un pañal que incorpora tal polímero superabsorbente. El polímero superabsorbente es preparado primero en una almohadilla absorbente que puede ser formada al vacío y en la cual otros materiales tal como un material fibroso (por ejemplo, pulpa de madera) son agregados. La almohadilla absorbente es luego ensamblada con hoja(s) de tela, en general una tela no tejida (por ejemplo, fabricada de uno o más de nylon, poliéster, polietileno y plásticos de polipropileno) para formar pañales.
Mas en particular, en un proceso no limitante, por encima de una banda transportadora múltiples boquillas pueden ser usadas atomizan partículas poliméricas superabsorbentes (tal como de aproximadamente 4000 mieras de tamaño o menores) superabsorbente (tal como de aproximadamente 400 mieras de tamaño o mayores) material fibroso y/o una combinación de estos sobre la banda transportadora a espacios/intervalos diseñados. La banda transportadora es perforada y bajo vacíos desde debajo de tal manera que los materiales atomizados son jalados hacia la superficie de la banda para formar una almohadilla plana. En varias modalidades, el material fibroso es aplicado primero sobre la banda, seguido por una mezcla de material fibroso y las partículas poliméricas superabsorbentes, seguidas por material fibroso, de tal manera que el polímero superabsorbente es concentrado en la mitad de la almohadilla. Un rodillo liberador puede ser usado hacia el extremo de la trayectoria de la banda para producir almohadillas de espesor uniforme. Después de esto, cada almohadilla puede ser procesada adicionalmente, tal como cortarla a una forma apropiada para el pañal y la almohadilla puede estar en forma de un rollo largo suficiente para múltiples pañales. Después de esto, la almohadilla es emparedada de una hoja superior y una hoja inferior de tela (una en general que es permeable al líquido la otra impermeable al líquidos) tal como sobre una banda transportadora y estas son unidas conjuntamente tal como mediante, pegado, calentamiento o soldadura ultrasónica y cortadas a unidades de tamaño de pañal (si no están asi cortadas previamente) . En eventos adicionales pueden ser provistos, tales como componentes elásticos, bandas de cinta, etc, para encajar y facilitar el uso por la persona..
La proporción de material fibroso a partículas poliméricas se sabe que afecta las características del desempeño. En algunas modalidades, esta proporción es de entre 75:25 y 90:10 (Véase Patente Estadounidense. No. 4, 685,915 incorporada por referencia por sus enseñanzas de manufactura de pañales) . Otros artículos absorbentes desechables pueden ser construidos de manera similar, tal como para incontinencia de adulto, higiene femenina (toallas sanitarias), tampones, etc., (véase, por ejemplo Patentes Estadounidenses Nos. 5, 009,653 y 5, 827,255 incorporadas por referencia por sus enseñanzas de la manufactura de toallas sanitarias) .
El ácido poliacrilico de bajo peso molecular tiene usos para tratamiento de agua, floculantes y espesantes para varias aplicaciones incluyendo cosméticos y preparaciones farmacéuticas. Para estas aplicaciones, el polímero puede estar reticular y ligeramente reticulado, dependiendo de la aplicación específica. Los pesos moleculares son comúnmente alrededor de 200 a alrededor de 1, 000,000 g/mol. La preparación de estos polímeros de ácido poliacrilico de baja peso molecular es descrita en las Patentes Estadounidenses Nos. 3, 904,685; 2, 798,053 y 5, 093,472, en donde cada una de las cuales es incorporada por referencia por sus enseñanzas concernientes con métodos para producir estos polímeros.
El ácido acrílico puede. ser co-polimerizado con un o más de otros monómeros seleccionados de acrilamida, ácido 2-acrilamido, -2-metilpropansulfonico, NN-dimetilacrilamida, N-isopropilacrilamida, ácido metacrílico y metacrilamida, para nombrar unos pocos. Las reactividades relativas de los monómeros afectan la microestructura y asi las propiedades físicas del polímero, los monómeros pueden ser derivados de 3-HP o provistos de otra manera para producir co-polímeros . Ullman' s Encyclopedia of Industrial Chemistry, Polyacrylamides and Poly (Acrylic Acids) , WileyVCH Verlag Gmb H, Wienham (2005) , es incorporada por referencia en la presente por sus enseñanzas de procesamiento de polímeros y co-polímeros.
El ácido acrílico en principio puede ser co-polimerizado con casi cualesquier monómeros polimerizables por radicales libres, incluyendo estieno, butadieno, acrilonitrilo, ésteres acrílicos, ácido maleico, anhídrido maleico, cloruro de vinilo, acrilamida, ácido itacónico y así sucesivamente. Las aplicaciones de uso final comúnmente determinan la composición del co-polímero, lo · que influencia las propiedades. El ácido acrilico también puede tener un número sustituciones opcionales en el mismo y después tales sustituciones son usadas como monómeros para polimerización o reacciones co-polimerizacion . Como regla general, el ácido acrilico (o uno de sus monómeros de co-polimerizacion) puede ser sustituido por cualquier sustituyente que no interfiere con el proceso de polimerización, tal como alquilo, alcoxi, arilo, heteroarilo, benzilo, vinilo, hidroxilo, epoxi, amida, éteres, ésteres, cetonas, maleimidas, succinimidas, sulfóxido, glicidilo y sililo (véase Patente Estadounidense No. (7,678, 869, incorporada por referencia anteriormente, para discusión adicional) . Los siguientes párrafos proveen unos pocos ejemplos no limitantes de aplicación de co-polimerizacion .
Las pinturas que comprenden polímeros y co-polímeros de ácido acrilico y sus éteres están amplio uso como productos industriales y productos del consumidor. Aspectos de la tecnología para fabricación de tales pinturas se pueden encontrar en las Patentes Estadounidenses Nos. 3,687,885 y 3,891,591, incorporadas por referencia por sus enseñanzas de tal manufactura de pinturas. En general, el ácido acrilico y sus ésteres pueden formar homopolímeros o co-polímeros entre si mismos o con otros monómeros, tales como amidas, metacrilatos, acrilonitrilo, vinilo, estireno y butadieno.
Una mezcla deseada de homopolimeros y/o co-polimeros denominados en la industria de pinturas como "vehículo" (o "aglutinante") son agregados a una solución acuosa y agitados suficientemente para formar una dispersión acuosa que incluye partículas poliméricas de tamaño sub microscópico. La pintura cura o solidifica mediante coalescencia de estas partículas de "vehículo" a medida que el agua y cualquier otro solvente se evaporan. Otros aditivos a la dispersión acuosa pueden incluir pigmento, relleno (por ejemplo, carbonato de calcio, silicato de aluminio) , solvente (por ejemplo, acetona, benzol, alcoholes, etc., aunque estos no son encontrados en ciertas pinturas, sin VOC) , espesante y aditivos adicionales dependiendo de las condiciones, aplicaciones, superficie propuesta, etc. En muchas pinturas, el porcentaje en peso de la porción de vehículo puede variar de aproximadamente nueve a aproximadamente 26 por ciento, pero para otras pinturas el porciento en peso puede variar más allá de este intervalo.
Los polímeros a base de acrílicos son usados para muchos recubrimientos además de pinturas. Por ejemplo, para látex de recubrimiento de papel, el ácido acrilico es usado de 0.1-5.0 %, junto con estireno y butadieno, para mejorar el enlace al papel y modificar la reología, estabilidad de congelación-deshielo y estabilidad del esfuerzo cortante. En este contexto, las Patentes Estadounidenses Nos. 3, 875,101 y 3, 872,037 son incorporadas por referencia por sus enseñanzas con respecto a tales látex. Polímeros a base de acrilato también son usados en muchas tintas, particularmente tintas de impresión curables por UV. Para tratamiento de agua, •acrilamida y/o hidroxietilacrilato son comúnmente co-polimerizados con ácido acrílico para producir polímeros lineales de bajo peso molecular. En este contexto, las Patentes Estadounidenses Nos. 4, 431,547 Y 4, 029,577 son incorporadas por referencia por sus enseñanzas de tales polímeros. Co-polímeros de ácido acrílico con ácido maleico o ácido itacónico son también producidos para aplicaciones de tratamiento de agua, como se describe en la Patente Estadounidense No. 5, 135,677, incorporadas por referencia por aquella enseñanza. El acrilato de sodio (la sal de sodio de ácido acrílico glacial) puede ser co-polimerizado con acrilamida (que puede ser derivada de ácido acrílico vía química de amidación) para fabricar un co-polímero aniónico que es usado como floculante en el tratamiento de aguas.
Para agentes espesantes, una variedad de co-monómeros puede ser usados, tal como se describe en las Patentes Estadounidenses No. 4, 268,61 y 3, 915,921, incorporadas por referencia por la descripción de estos co-monómeros. La Patente Estadounidense No. 5, 135,677, describe un número de monómeros que pueden ser usados con ácido acrílico para producir polímeros solubles en agua y es incorporada por referencia por tal descripción.
También como se indica, algunas conversiones productos corriente abajo se pueden hacer enzimáticamente . Por ejemplo, 3-HP puede ser convertido a 3-HP-CoA, que luego puede ser convertido a 3-HP polimerizado con una enzima que tiene actividad de polihidroxiácido sintasa (EC 2.3.1-). También, 1, 3-propandiol puede ser fabricado utilizando polipéptidos que tienen actividad de óxido reductasa o actividad de reductasa (por ejemplo, enzimas de la clase de enzimas EC 1.1.1). Alternativamente, cuando se crea 1 , 3-propandiol a partir de 3-HP, una combinación de (1) un polipéptido que tiene actividad de aldehido deshidrogenasa (por ejemplo, una enzima de la clase de 1.1.1.34) y (2) un polipéptido que tiene actividad de alcohol deshidrogenasa (por ejemplo, una enzima de la clase 1.1.1.32) puede ser usada. Los polipéptidos que tienen actividad reductasa pueden ser usados para formar ésteres. Reacciones enzimáticas tales como estas pueden ser conducidas in vitro, tal como usando extractos libres de células o in vivo.
Asi, varias modalidades de la presente invención, tales como métodos "de fabricación de un químico, incluyen etapas de conversión a cualesquiera de tales productos corriente abajo indicados de 3-HP producido microbianamente, incluyendo pero no limitados a aquellos químicos des.critos en la presente y en las referencias incorporadas (las ultimas para jurisdicciones que permiten esto) . Por ejemplo, una modalidad es la fabricación de moléculas de 3-HP por las enseñanzas en la presente y además convertir las moléculas de 3-HP a 3-HP polimerizado (poli-3-??) o ácido acrilico y tal como de ácido acrilico luego producir de las moléculas de 3-HP cualquiera de ácido poliacrilico (ácido acrilico polimerizado, en varias formas) , acrilato de metilo, acrilamida, acrilonitrilo, propiolactona, etil 3-HP, ácido malonico, 1, 3-propandiol, acrilato de etilo, acrilato de n-butilo, acrilato de hidroxipropilo, acrilato de hidroxietilo, acrilato de isobutilo, acrilato de 2-etilhexilo y ácido acrilico o un éster de ácido acrilico al cual se hace una adición de alquilo o arilo y/o al cual se agregan halógenos, aminas o amidas aromáticas e hidrocarburos aromáticos.
También como se indica, algunas conversiones a producto corriente abajo se pueden hacer enzimáticamente . Por ejemplo, 3-HP puede ser convertido a 3-HP-CoA, que luego puede ser convertido a 3-HP polimerizado con una enzima que tiene actividad de polihidroxiácido sintasa (EC 2.3.1.-) . También, 1, 3-propandiol puede ser fabricado utilizando polipéptidos que tienen actividad de óxido reductasa o actividad de reductasa (por ejemplo, enzimas de la clase de enzimas de EC 1.1.1) . Alternativamente, cuando se crea 1 , 3-propandiol a partir de 3-HP, una combinación de (1) un polipéptido que tiene actividad de aldehido deshidrogenasa (por ejemplo, una enzima de la clase de 1.1.1.34) y (2) un polpéptido que tiene actividad de alcohol deshidrogenasa (por ejemplo, una enzima de la clase de 1.1.1.32) puede ser usado. Polipéptidos que tiene actividad de lipasa pueden ser usados para formar ésteres. Reacciones enzimáticas tales' como estas pueden ser conducida in vitro, tal como utilizando extractos libres de células o in vivo.
Asi, varias modalidades de la presente invención, tales como métodos de fabricación de un químico, incluyen etapas de conversión a cualesquiera de tales productos corriente abajo indicados de 3-HP producido microbianamente, incluyendo pero no limitado a aquellos químicos descritos en la presente y en las referencias incorporadas (las ultimas para jurisdicciones que permiten esto) . Por ejemplo, una modalidad es la fabricación de moléculas de 3-HP por las enseñanzas en la presente y además convertir las moléculas de 3-HP a 3-HP polimerizado (poli-3-??) o ácido acrílico y tal como de ácido acrílico luego producir moléculas de 3-HP cualquiera de ácido poliacrilico (ácido acrílico polimerizado, en varias formas) , acrilato de metilo, acrilamida, acrilonitrilo, propiolactona, etil 3-HP, ácido malonico, 1, 3-propandiol, acrilato de etilo, acrilato de n-butilo, acrilato de hidroxipropilo, acrilato de hidroxietilo, acrilato de isobutilo, acrilato de 2-etilhexilo y ácido acrílico o un éster de ácido acrílico al cual se hace una adición de alquilo o arilo y/o al cual se agregan halógenos, aminas o amidas aromáticas e hidrocarburos aromáticos.
Las reacciones que forman compuestos corriente abajo tales como acrilatos o acrilamidas pueden ser conducidas en conjunción con el uso de agentes estabilizadores apropiados o agentes inhibidores reduciendo la probabilidad de formación de polímeros. Véase, por ejemplo Publicación de Patente Estadounidense No. 2007/02119390 Al. Agentes estabilizantes y/o agentes inhibidores incluyen pero no están limitados a, por ejemplo compuestos fenolicos (por ejemplo, dimetoxifenol (DMP) o compuestos fenolicos alquilados tales como bi-tert-butil fenol) , quinonas (por ejemplo, t-butil hidroquinona o el monometil éter de hidroquinino (MEHQ) ) y/o cobre metálico o sales de cobre (por ejemplo, sulfato de cobre, cloruro de cobre o acetato de cobre). Inhibidores y/o estabilizadores pueden ser usados individualmente o en combinaciones como será conocidos por aquellos de habilidad en el arte. También, en varias modalidades, el uno o mas compuestos corriente abajo es/son recuperado ( s ) a un rendimiento molar de hasta aproximadamente 100% o un rendimiento molar en intervalo de aproximadamente 70% a aproximadamente 90% o un rendimiento molar en el intervalo de aproximadamente 80% a aproximadamente 100% o un rendimiento molar en intervalo de aproximadamente 90% a aproximadamente 100%. Tales rendimientos pueden ser el resultado de etapas de separación y purificación de un solo paso (por lotes o continuas) o iterativas en un proceso particular.
El ácido acrilico y otros productos corrientes abajo son útiles como mercancías en la manufactura, tal como en la manufactura de bienes del consumidor, incluyendo pañales, textiles, alfombras, pinturas, adhesivos y vidrio acrilico.
XIII. Las modalidades reveladas no son limitantes.
En tanto que varias modalidades de la presente invención han sido mostradas y descritas en la presente, se enfatiza que tales modalidades son provistas a manera de ejemplo solamente. Numerosas variaciones, cambios y sustituciones se pueden hacer sin desviarse de la invención de la presente y sus varias modalidades. Específicamente y por cualquier razón, para cualquier agrupamiento de compuestos, secuencias de ácidos nucleicos, polipéptidos incluyendo proteínas específicas que incluyen enzimas funcionales, enzimas de ruta metabólica o intermediarios, elementos u otras composiciones o concentraciones afirmadas o de otra manera presentadas en la presente en una lista, tabla u otro agrupamiento ('tales como enzimas de ruta metabólica mostradas en la figura) , a no ser que se afirme claramente de otra manera, se pretende que cada uno de tales agrupamientos proporcione la base para y sirva para identificar varias modalidades de subconjuntos, las modalidades de subconjuntos en su alcance mas amplio que comprenden cada subconjunto de tal agrupamiento mediante exclusión de uno o mas elementos (o subconjuntos) del agrupamiento afirmado respectivo. Además, cuando se describe cualquier intervalo de laA presente, a no ser que se afirme claramente de otra manera, el intervalo incluye todos los valores en el mismo y todos los subintervalos en el mismo.
También y mas en general, de acuerdo con las revelaciones, discusiones, ejemplos y- modalidades de la presente, se pueden emplear técnicas de biología molecular, biología celular, microbiología y técnicas de ADN recombinantes convencionales dentro de la habilidad de aquellos experimentados en el arte. Tales técnicas son explicadas plenamente en la literatura. (Véase, por ejemplo Sambrook and Russell, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Tercera Edición 2001 (Volúmenes 1-3) , Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold Springs Harbor, N.Y; Animal Cell Culture, R.I. Freshney, ed., 1986). Esta Fuentes publicadas son incorporadas por referencia en la presente por sus respectivas enseñanzas de métodos de laboratorio estándar encontrados en los mismos. Tal incorporación, como mínimo, es por la enseñanza específica y/u otro propósito que puede ser notado cuando se cita la referencia en la presente. Si una enseñanza específica y/u otro propósito no es indicado, entonces la fuente publicada es incorporada específicamente por la(s) enseñanza (s) indicada (s) por uno o mas del titulo, resumen y/o sumario de la referencia. Si ninguna de tal enseñanza identificada específicamente y/u otro propósito puede ser tan relevante, entonces la fuente publicada es incorporada con el fin de describir mas plenamente el estatus del arte con el cual la presente invención es concerniente y/o proveer tales enseñanzas como son en general conocidos para aquellos experimentados en el arte, como puedan ser aplicables. Sin embargo, se afirma específicamente que una cita de una fuente publicada en la presente no será interpretada como una adición que tal es arte previo a la presente invención. También, en el caso de que una o mas fuentes publicadas incorporadas difiera de o contradiga esta solicitud, incluyendo pero no limitado a los términos definidos, uso de términos, técnicas descritas o los semejantes, la presente solicitud prevalece. La materia en los ejemplos es incorporada a esta sección a la extensión no ya presente.
EJEMPLOS Los siguientes ejemplos en la presente proveen algunos ejemplos, no pretenden ser limitantes de combinaciones de modificaciones genéticas y adiciones de complemento. Los siguientes ejemplos incluyen tanto ejemplos reales como ejemplos proféticos.
A no ser que se afirme de otra manera, la temperatura esta en grados Celsius y -la presión es la presión atmosféricas o cerca de la presión atmosférica a aproximadamente 1,628 metros (5,340 pies) por encima' del nivel del mar. Se notara que el trabajo hecho en instalaciones analíticas y sintéticas no se lleva a cabo a presión atmosférica o cerca de la presión atmosférica a aproximadamente 1,628 metros (5,340 pies) por encima del nivel del mar. Los ejemplos 11A y 11C fueron llevados en un laboratorio de contrato, no a la elevación indicada. Todos los recibos, a no ser que se indique de otra manera, son obtenidos comercialmente . Las especies y otras identificaciones filogénicas están de acuerdo con la clasificación conocida para la persona experimentada en el arte de microbiología.
Los nombres y direcciones de ciudad de los proveedores mayores son provistos en la presente. Además, en cuanto a los productos Qiagen, el kit de DNeasy® Blood and Tissue No. de Catalogo 69506, es usado en los métodos para preparación de ADN genómico; el QIAprep® Spin ("mini prep") No. de Catalogo 27106 es usado para la purificación de ADN de plásmido y el kit - de extracción de gel de QIAquick® Gel Extraction, No. de catalogo 28706, es usado para extracciones de gel como se describen en la presente.
Ejemplo 1: Construcción de plásmidos que expresan malonil-CoA reductasa (mcr) La secuencia de nucleótidos para el gen de malonil-CoA reductasa de Chloroflexus aurantiacus fue codón optimizada por E.coli de acuerdo con un servicio de DNA2.0 (Menlo Park, California, Estados Unidos de América) , un proveedor de síntesis genética de ADN comercial. Esta secuencia genética (SEQ ID NO: 803) incorporo un sitio de restricción de EcoRI antes del codón de parada y fue seguido por un sitio de restricción de HindIII. Además, un sitio de enlace ribosomal fue colocado enfrente del codón de parada. Esta construcción genética fue sintetizada mediante DNA2.0 y provista en una cadena fundamental del vector de pJ206 (SEQ ID NO: 804) . El ADN de plásmido pJ206 que contiene el gen de mcr sintetizado fue sometido a digestión de restricción enzimática con las enzimas EcoRI e Hind III obtenidas de New England Bio Labs (Ipswich, MA Estados Unidos de América) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La mezcla de digestión fue separada mediante electroforesis de gel de agarosa y fragmentos de ADN apropiado recuperado como se describe en la sección de métodos comunes. Una cepa de clonación de E.coli que lleva pKK223-aroH fue obtenida como una donación amable del laboratorio del Profesor Ryan T. Gilí de la Universidad de Colorado en Boulder. Los continuos de esta cepa que llevan el plásmido fueron cultivados y ADN de plásmido preparado como se describe en la sección de métodos comunes. El ADN de plásmido fue sometido a digestión con las endonucleasas de restricción EcoRI y HindIII obtenidas de New England Biolabs (Ipswich, MA Estados Unidos de América) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Esta digestión sirvió para separar el cuadro de lectura de aro H de la cadena fundamental de pK 223. La mezcla de digestión fue separada mediante electroforesis de gel de agarosa y la rebanada de .gel de agarosa que contiene la pieza de ADN correspondiente a la cadena fundamental del plásmido de pKK223 fue recuperada como se describe en la sección de métodos comunes.
Fragmentos de ADN purificados correspondientes al gen de mcr y la cadena fundamental del vector de pKK223 fueron ligados y el producto de ligación fue transformado y sometido al electroporación de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La secuencia del vector resultante denominado pKK223-mcr fue confirmada mediante secuenciación de rutina efectuada por un proveedor comercial (SEQ ID NO: 003) . pKK223-mcr confiere resistencia a ampicilina y contiene el gen de mcr de C. aurantiacus bajo el control de un promotor Ptac inducible en huéspedes de E.coli mediante IPTG.
Para expresar el gen de mcr bajo la regulación de otros promotores además de Ptac en pKK223, el gen de mcr sintético fue transferido a otros plásmidos. El plásmido Trc- Ptrc- mcr estaba basado en pTrcHisA (Invitrogen, Carlsbad, CA; No. de catalogo V360-20) y la expresión de mcr es dirigida por el promotor Ptcr IPTG-inducible . El promotor PtaiA inductor-independiente esta basado en secuencias corriente arriba del gen de talA .de E.coli. Las secuencias de nucleótidos de este promotor, colocada inmediatamente corriente arriba del codón de ATG iniciador del gen de mcr sintético, es enlistada como SEQ ID NO: 805.
La construcción de PtaiA :mcr fue incorporada mediante PCR a un vector de pSC-B (Stratagene Corporation, La Jolla, California, Estados Unidos de América) , que fue propagado en una materia prima o inventario de E.coli, el ADN de plásmido purificado de acuerdo con métodos descritos en cualquier parte en la presente. La región de PtaiA :mcr en pSC-B-PtaiA :mcr fue transferida a un vector de plásmido, pSMAR-HCamp (Lucigen Corporation, Middleton, I, No. de catalogo 40041-2, GenBank AF399742) mediante PCR utilizando separadores de vector M13F y M13R. El fragmento generado mediante PCR fue clonado a pSMART-HCamp de acuerdo con el protocolo del fabricante dando como resultado el plásmido pSMART-HCamp (HC) Amp-PtaiA-mcr (SEQ ID NO: 806) en el cual la expresión de mcr no requiere inducción con IPTG.
Ejemplo2: Construcción de un plásmido que expresa transhidrogenasa (pntAB) Una fusión del promotor de E.coli inductor-independiente derivado del gen de tpiA (PtpiA) y los genes de transhidrogenasa de nucleótido de piridina, pntAB (SEQ ID NO: 779 y SEQ ID NO: 781) fue creada mediante la amplificación de la región de promotor de tpiA y la región de pntAB del ADN de K12 de E.coli genómico mediante reacciones en cadena de polimerasa. Para los genes de pntAB, la región fue amplificada utilizando el cebador delantero de pntAB GGGAACCATGGCAATTGGCATACCAAG (SEQ ID NO: 807, nótese que todos los cebadores revelados en la presente son secuencias artificiales) que contienen un sitio de Ncol y que incorpora el iniciador Met para la secuencia de proteina de pntA y el cebador inverso de pntAB de GGGTTACAGAGCTTTCAGGATTGCATCC (SEQ ID NO: 808) . Asi mismo, la región de PtpiA fue amplificada utilizando el cebador delantero GGGAACGGCGGGGAAAAACAAACGTT (SEQ ID NO: 809) y el cebador inverso GGTCCATCCTAATTCTCCACGCTTATAAGC (SEQ ID NO: 810) que contiene un sitio de restricción de Ncol. Los productos de reacción en cadena de polimerasa fueron purificados utilizando un kit de purificación de PCR de Qiagen Corporation (Valencia, CA, Estados Unidos de América) utilizando las instrucciones del fabricante. Enseguida de la purificación, los productos fueron sometidos a digestión de restricción enzimática con la enzima Ncol. Las enzimas de restricción fueron obtenidas de New England Biolabs (Ipswich, A Estados Unidos de América) y usadas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las mezclas de digestión fueron separadas mediante electroforesis de gel de agarosa y visualizadas bajo transiluminación de UV como se describe en la sección de Métodos Comunes. Las rebanadas de gel de agarosa que contienen fragmentos de ADN correspondiente al producto genética que contiene pntAB amplificado y el producto de PtpiA fueron extirpadas del gel y el ADN recuperado con un kit de extracción de gel de Qiagen usado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los productos recuperados fueron ligados conjuntamente con ligasa de ADN de T4 (New England BioLabs, Ipswich, MA Estados Unidos de América) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Debido a que la reacción de ligación puede dar como resultado varios productos diferentes, el producto deseado correspondiente al fragmento de PtpiA ligado a los genes de pntAB fue amplificado mediante reacción en cadena de polimerasa y aislado mediante una segunda purificación en gel. Para esta reacción en cadena de polimerasa, el cebador o delantero fue GGGAACGGCGGGGAAAAACAAACGTT (SEQ ID NO: 809) y el cebador inverso fue GGGTTACAGAGCTTTCAGGATTGCATCC (SEQ ID NO: 808) y la mezcla de ligación fue usada como plantilla. Las mezclas de digestión fueron separadas mediante electroforesis de gel de agarosa y visualizadas bajo transiluminación de UV como se describe la Sección de Métodos Comunes. Las rebanadas de gel de agarosa que contienen la pieza de ADN correspondiente a la fusión de PtpiA~pntAB amplificada fue cortada del gel y el ADN recuperado con un protocolo de extracción de gel estándar y los componentes de Qiagen de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Este ADN extraído fue insertado a un vector de pSC-B utilizando el kit de Clonación de PCR Blunt obtenido de Stratagene Corporation (La Jolla, CA, Estados Unidos de América) utilizando las instrucciones del fabricante. Las colonias fueron seleccionadas mediante reacciones en cadena de polimerasa de colonia. El ADN de plásmido de colonias que muestra insertos de tamaño correcto fueron cultivados y sometidos de miniprep utilizando un protocolo de miniprep estándar y componentes de Qiagen de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los plásmidos aislados fueron verificados mediante digestos de restricción y confirmados mediante secuenciación . Los plásmidos aislados secuenciados-verificados producidos con este procedimiento fueron designados pSC-B-PtpiA·' pntAB .
La región de PtpiA:pntAB en pSC-B-Ptpift: pntAB fue transferida a un vector de pBT-3 (SEQ ID NO: 811) que provee un origen de replicación de intervalo de huésped amplio y un marcador de selección de cloranfenicol . Para obtener esta construcción, un fragmento del vector de pBT-3 fue producido mediante amplificación de cadena de polimerasa utilizando el cebador delantero AACGAATTCAAGCTTGATATC (SEQ ID NO: 812) y el cebador inverso GAATTCGTTGACGAATTCTCT (SEQ ID NO: 813), utilizando pBT-3 como plantilla. El producto amplificado fue sometido a tratamiento con Dpnl para restringir el ADN de plantilla metilado y la mezcla fue separada mediante electroforesis de gel de agarosa y visualizada bajo transiluminación de UV como se describe en la Sección de Métodos Comunes. La rebanada de gel de agarosa que contiene el fragmento de ADN correspondiente al producto de vector de pBT-3 amplificado fue cortada del gel y el ADN recuperado con un protocolo de extracción de gel estándar y componentes de Qiagen de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El inserto de PtpiA:pntAB en pSC-B-PtpiA: pntAB fue amplificado utilizando una reacción en cadena de polimerasa con el cebador delantero GGAAACAGCTATGACCATGATTAC (SEQ ID NO: 814) y el cebador inverso TTGTAAAACGACGGCCAGTGAGCGCG (SEQ ID NO: 815. Ambos cebadores fueron 5' fosforilados .
El producto de PCR fue separado mediante electroforesis de gel de agarosa y visualizado bajo transiluminación de UV como se describe en la Sección de Métodos Comunes. Rebanadas de gel de agarosa que contienen el fragmento de ADN correspondiente al inserto de PtpiA:pntAB amplificado fueron extirpadas del gel y · el ADN recuperado con un protocolo de extracción de gel estándar y componentes de Qiagen de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Este ADN de inserto fue ligado al vector de pBT-3 preparado como se describe en la presente con ligasa de ADN T4 obtenida de New England Biolabs (Bedford, MA, Estados Unidos de América) , siguiendo las instrucciones del fabricante. La mezclas de ligación fueron transformadas a células 10G de E. coli obtenidas de Lucigen Corp de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las colonias fueron seleccionadas mediante reacciones en cadena de polimerasa de colonia. El ADN de plásmido de colonias que muestran insertos de tamaño correcto fue cultivado y purificado utilizando un protocolo de miniprep estándar y componentes de Qiagen de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los plásmidos aislados fueron verificados mediante digestos de restricción y confirmados mediante secuenciación . El plásmido aislado secuenciado-verificado producido con este procedimiento fue designado pBT-3- PtPiA:pntAB (SEQ ID NO: 816) .
Ejemplo 3: Construcción de un plásmido que expresa acetil-CoA carboxilasa (accABCD) Un plásmido que porta dos operones aptos de expresar los componentes del complejo de acetil-CoA carboxiltransferasa de E. coli fue construido mediante DNA2.0 (Menlo Park, CA Estados Unidos de América) , un proveedor de síntesis de gen de ADN comercial. Esta construcción incorporó las secuencias de ADN de los genes de accA y accD bajo el control de un promotor inductor-independiente derivado del gen de tpiA de E. coli y las secuencias de ADN de los genes accB y accC bajo el control de un promotor inductor-independiente derivado de los genes de rpiA de E. coli. Cada secuencia de codificación fue precedida por una secuencia de enlace de ribosoma. Los operones designados fueron provistos en una cadena fundamental del vector de pJ251 y fueron designados pJ251:26385 (SEQ ID NO: 817).
El promotor de tpiA del plásmido pJ251: 26385 fue alterado para proveer mejor expresión. Esta modificación fue incorporada al amplificar el plásmido de pJ251: 26385 con el cebador delantero GCGGGGCAGGAGGAAAAACATG (SEQ ID NO: 818) y el cebador inverso GCTTATAAGCGAATAAAGGAAGATGGCCGCCCCGCAGGGCAG (SEQ ID NO: 819) . Cada uno de estos cebadores fueron sintetizados con una modificación de fosforilación 5' . El producto de PCR resultante fue preparado mediante electroforesis de gel de agarosa y el fragmento de ADN apropiado recuperado como se describe en la Sección de Métodos Comunes. El producto recuperado fue auto-ligado con ligasa de ADN T4 obtenida de New England BioLabs (Ipswich, MA Estados Unidos de América) y digerido con Dpnl de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN del plásmido de colonias que muestran insertos del tamaño correcto fue cultivado y purificado utilizando un protocolo de miniprep estándar y componentes de Qiagen de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los plásmidos aislados fueron verificados mediante digestos de restricciones y confirmados mediante secuenciación . Los plásmidos aislados secuenciados-verificados producidos con este procedimiento fueron designados pJ251 (26385) -PtpiA: accAD-PrpiA: accBC (SEQ ID NO: 820).
Ejemplo 5: Construcción de cepas especificas que producen ácido 3-hidroxipropiónico De acuerdo con las respectivas combinaciones indicadas en la siguiente tabla, los plásmidos descritos en la presente fueron introducidos a las cepas base respectivas. Todos los plásmidos fueron introducidos al mismo tiempo vía electroporación utilizando métodos estándar. Las células transformadas fueron cultivadas en el medio apropiado con complementación de antibiótico y las colonias fueron seleccionadas en base a su crecimiento apropiado en el medio selectivo. El plásmido de expresión de mcr pKK223-mcr fue transformado a DF40 de E. coli (Hfr, garBIO, fhuA22, ompF627, fadL701, relAl, pitAlO, spoTl, rrnB-2, pgi-2, mcrBl, creC527) o JP1111 de E. coli (Hfr, galE45 (GalS) , LAM-, fabI392(ts, sensible a la temperatura), relAl, spoTl, thi-1) como se describe en la Sección de Métodos Comunes. Como es conocido en el arte, las cepas DF40 y JP1111 son en general cepas de E. coli disponibles, disponibles de fuentes incluyendo la Yale Coli Genetic Stock Collection (New Haven, CT Estados Unidos de América) . Las cepas que portan múltiples plásmidos compatibles fueron construidas a partir de estos transformantes de mcr al preparar células competentes para transformación mediante electroporación como se describe en la Sección de Métodos Comunes y transformación con los plásmidos adicionales. Los .transformantes fueron seleccionados subsecuentemente sobre el medio que contiene la combinación apropiada de antibióticos.
Tabla 9. Nombres y características de cepas Ejemplo 6 ; Producción de ácido 3-hidroxipropiónico La producción de 3-HP mediante KX3_0001 fue demostrada a escala de 100 mi en alimentación por lotes (rica) o medio de AM2 (sales mínimas) . Los cultivos fueron iniciados de inventarios del congelador por la práctica estándar (Sambrook y Russell, 2001) en 50 mi de medio LB más 100 ug/ml de ampicilina y cultivados a fase estacionaria de la noche a la mañana a 37 °C con rotación a 225 rpm. Cinco mi de este cultivo fueron transferidos a 100 mi de alimentación por lotes o medio AM2 más 40 g/1 de glucosa, 100 µ9/??1 de ampicilina, IPTG 1 mM por triplicado, matraces amortiguados de 250 mi e incubados a 37 °C, 225 rpm. Para monitorear el crecimiento celular y producción de 3-HP mediante estos cultivos, se extrajeron muestras (2 mi) a los puntos en el tiempo indicados para mediciones de densidad óptica a 600 nm (OD6OOÍ longitud de trayectoria de 1 cm) y aglomerados mediante centrifugación a 12,000 rpm por 5 minutos y el sobrenadante recolectado para análisis de producción de 3-HP como se describe en "Análisis de cultivos para producción de 3-HP" en la sección de Métodos Comunes. El peso de célula seco (DCW) es calculado como 0.33 veces el valor de OD600 medido, en base al DCW de referencia determinaciones de ??ß??· Todos los datos son el promedio de cultivos por triplicado. Por propósitos de comparación, la productividad especifica es calculada a partir de los datos promediados al punto en el tiempo de 24 horas y expresados como gramos de 3-HP producidos por gramos de DCW. La producción de 3-HP por la cepa KX3_0001 en el medio de alimentación por lotes es mostrada en la siguiente tabla. Bajo estas condiciones, la productividad especifica después de 24 horas es de 0.0041 g de 3-HP por gramo de DCW.
Tabla 10. Producción de 3-HP mediante KX3_0001 en el medio de alimentación por lotes Ejemplo 7: Efecto sobre la producción de 3-HP de fondos de precursor de malonil-CoA incrementados mediante inhibición de s ntesis de ácido graso Como se describe en la presente, es conocido que ciertos químicos inhiben varias enzimas del sistema de ácido graso sintasa, algunos de los cuales son usados como antibióticos dado el papel de la síntesis de ácido graso en el mantenimiento de membrana y crecimiento y crecimiento del microorganismo. Entre estos inhibidores está la cerulenina, que inhibe la ß-cetoacil-ACP sintasa KASI (por ejemplo, fabB en E. coli) . Para evaluar adicionalmente procedimientos para modular y desplazar la utilización de malonil-CoA en microorganismos que comprenden rutas de producción a un producto químico selección, en la presente 3-HP, en donde malonil-CoA es un sustrato en aquella ruta, se evaluó la adición de cerulenina durante el cultivo.
Las rutas corriente abajo de malonil-CoA están limitadas a la biosíntesis de ácido graso y producción de 3HP (cuando una ruta a la última vía malonil-CoA existe o es provista en una célula) . Este experimento está diseñado para determinar como controlar el uso de fondos de malonil-CoA en cepas de producción de 3HP y mejorar adicionalmente la proporción de producción de 3HP. Se tiene la hipótesis que al dividir la biosíntesis de ácido graso y regular los fondos de malonil-CoA, el flujo a través de la ruta será desplazado hacia la producción de 3HP. Un diagrama del flujo de crb posible a través del malonil-CoA en rutas de producción de 3HP actuales es mostrado en la Figura 9. Un inhibidor representativo ha sido seleccionado que tanto interrumpe el alargamiento de ácido graso como disrumpe un ciclo fútil que recaptura la porción de malonato de regreso al fondo de acetil-CoA.
La producción por la cepa KX3_0001 en el medio de alimentación por lotes en presencia de 10 g/ml de cerulenina es mostrada en la Tabla 11. En presencia del inhibidor, se propone que los fondos internos del precursor de malonil-CoA se incrementen conduciendo así a la producción incrementada de 3-HP. Como se puede ver por la comparación con los resultados sin cerulenina (Tabla 5) , sustancialmente más 3-HP es producido en cada punto en el tiempo y la productividad especifica a 24 horas es de 0.128 g de 3-HP por gramo de DCW, un incremento de 31 veces en relación con los resultados sin cerulenina .
Tabla 11. Producción de 3-HP mediante KX3_0001 en el medio de alimentación por lotes y la presencia de 10 pg/ml de cerulenina Ejemplo 8: Efecto sobre la producción de 3-HP de fondos del precursor de malonil-CoA incrementados utilizando mutantes de sintesis de ácido graso sensibles a la temperatura Un procedimiento alternativo para incrementar los fondos de malonil-CoA internos es usar mutaciones genéticas en lugar de inhibidores químicos. En tanto que la desactivación de mutaciones en los genes que codifican funciones de síntesis de ácido graso son usualmente mortales y así no obtenibles, mutantes condicionales, tales como mutantes sensibles a la temperatura, han sido descritos (de Mendoza, D., and Cronan, J. E., Jr. (1983) Trends Biochem. Sci . , 8, 49-52). Por ejemplo, una mutación sensible a la temperatura en el gen de fabl, que codifica enoil-ACP reductasa, de la cepa JP1111 (genotipo fabI392 (ts ) ) tiene actividad relativamente normal a temperatura reducida, tal como 30°C y se vuelve no permisible, probablemente por medio de desnaturalización y desactivación a temperatura elevada, de tal manera que cuando es cultivado a 37 a 42 °C un microorganismo solamente comprende este mutante sensible a la temperatura ya que su enoil-ACP reductasa producirá sustancialmente menos ácidos grasos y fosfolipidos . Esto conduce al crecimiento disminuido o ningún crecimiento. Sin embargo, se tiene la hipótesis de que cuando tal mutante provisto en un microorganismo modificado genéticamente que también comprende una ruta de producción, tal como 3-HP, de malonil-CoA, métodos de cultivo efectivos que involucran temperatura de cultivo elevada puede dar como resultado una productividad especifica de 3-HP incrementada.
La producción de 3-HP por la cepa JX3_0077 en el medio de alimentación por lotes a constante temperatura de 30 °C y por un cultivo sometido a un desplazamiento de temperatura de 30°C a 42°C es mostrada en la Tabla 12. El desplazamiento de temperatura está diseñado para desactivar la enoil-ACP reductasa, eliminado de aquí la acumulación de ácido graso que a su vez incrementa el fondo de malonil-CoA interno. Sustancialmente más 3-HP es producido en cada punto en el tiempo y la productividad especifica a 24 horas por el cultivo temperatura-desplazado es 1.15 g de 3-HP por gramo de DCW, un incremento mayor de 100 veces con respecto a la productividad especifica de 0.011 g de 3-HP por gramo de DCW por el cultivo mantenido constantemente a 30°C. Esta productividad incrementada de 3-HP por el cultivo en el cual la enoil-ACP reductasa es desactivada por la temperatura elevada soporta la visión de que el desplazamiento de la utilización de malonil-CoA conduce a producción de 3-HP incrementada .
Tabla 12. Producción de 3-HP mediante JX3 0077 en el medio de alimentación por lotes La Tabla 13 muestra la producción de 3-HP por la cepa JX3_0087 que portaba un plásmido que sobreexpresa el gen de transhidrogenasa además de un plásmido que porta el gen de mcr. En el cultivo mantenido a una temperatura constante de 30°C, se obtuvo una produc ividad especifica de 0.085 g de 3-HP por gramo de DCW en 24 horas. Esta es significativamente más alta que la productividad especifica de JX3_0077 que no porta el gen de transhidrogenasa sobreexpresado (Tabla 7). La productividad especifica del cultivo desplazado en temperatura de JX3_0087 fue de 1.68 g de 3-HP por gramo de DCW un incremento de 20 veces con respecto a la productividad especifica del cultivo mantenido constantemente a 30°C en el cual la enoil-ACP reductasa no fue desactivada.
Tabla 13. Producción de 3-HP mediante JX3_0087 en medio de alimentación por lotes La Tabla 14 muestra la producción de 3-HP por la cepa JX3_0097 que portaba un plásmido que sobreexpresa genes que codifican el complejo de acetil-CoA carboxilasa además de un plásmido que porta el gen de mcr. En el cultivo mantenido a temperatura constante de 30°C, se obtuvo una productividad especifica de 0.0068 g de 3-HP por gramo de DCW en 24 h. Esta productividad especifica es similar a aquella obtenida por la cepa JX3_0077 en la cual acetil-CoA carboxilasa no es sobreexpresada . La productividad especifica del cultivo desplazado en la temperatura de JX3_0097 fue de 0.29 g de 3-HP por gramo de DCW, un incremento de 42 veces con respecto a la productividad especifica del cultivo mantenido constantemente a 30 °C en el cual la enoil-ACP reductasa no desactivada.
Tabla 1 . Producción de 3-HP mediante JX3_0097 en el medio de alimentación por lotes El medio de alimentación por lotes, un medio rico, puede contener componentes que sirven como precursores de ácido graso y así pueden reducir la demanda por malonil-CoA. Así, la producción de 3-HP por las cepas derivadas de JP1111 en AM2, un medio mínimo fue verificado. Como se muestra en la Tabla 15, 3-HP fue producido mediante JX3_0077 en el medio de AM2. Se obtuvo una productividad específica de 0.024 g de 3-HP por gramo de DCW en 24 horas por el cultivo mantenido constantemente a 30 °C, aproximadamente dos veces el valor obtenido en el medio de alimentación por lotes. El cultivo desplazado en temperatura obtuvo una productividad especifica de 1.04 g de 3-HP por gramo de DCW en 24 horas, un incremento de 44 veces en comparación con la productividad especifica del cultivo mantenido constantemente a 30 °C, indicando otra vez que la desactivación condicional de la enoil-ACP reductasa incrementó el fondo de malonil-CoA interno y de aquí incrementó la producción de 3-HP, como se contemplaba por los inventores.
Tabla 15. Producción de 3-HP mediante JX3 0077 en medio de AM2 La producción de 3-HP en el medio de AM2 por la cepa de JX3_0087, que portaba un plásmido que sobreexpresa el gen de transhidrogenasa además de un plásmido que porta el gen de mcr, es mostrada. En el cultivo de JX3_0087 mantenido a temperatura constante de 30 °C, se obtuvo una productividad especifica de 0.018 g de 3-HP por gramo de DCW en 24 horas. En contraste con los resultados obtenidos en el medio de alimentación por lotes, este valor no es más alto que la productividad especifica obtenida en AM2 con la cepa de JX3_0077 que no porta el gen de transhidrogenasa sobreexpresado (Tabla 15) . La productividad especifica del cultivo desplazado en temperatura de JX3_0087 fue de 0.50 g de 3-HP por gramo de DCW, un incremento de 27 veces con respecto a la productividad especifica del cultivo mantenido constantemente a 30 °C en el cual la enoil-ACP reductasa no fue desactivada.
Tabla 16. Producción de 3-HP por JX3_0087 en AM2 La Tabla 17 muestra la producción de 3-HP en el medio de AM2 por la cepa de JX3_0097 que portaba un plásmido que sobreexpresa genes que codifican el complejo de acetil-CoA carboxilasa además de un plásmido que porta el gen de mcr. En el cultivo mantenido a temperatura constante de 30 °C, se obtuvo una productividad especifica de 0.021 g de 3-HP por gramo de DCW en 24 horas. Esta productividad especifica es similar a aquella obtenida por la cepa de JX3_0077 en la cual la acetil-CoA carboxilasa no es sobreexpresada . La productividad especifica del cultivo desplazado en temperatura de JX3_0097 fue de 0.94 g de 3-HP por gramo de DCW en 24 horas, un incremento de 45 veces con respecto a la productividad especifica del cultivo mantenido constantemente a 30 °C en el cual la enoil-ACP reductasa no fue desactivada.
Tabla 17. Producción de 3-HP mediante JX3 0097.0 en AM2 El efecto de combinar los plásmidos que expresan mcr (malonil-CoA reductasa) , pntAB ( transhidrogenasa) y accABCD (complejo de acetil-CoA carboxilasa) en el mismo organismo fue probado al construir la cepa de JX3_0098. La tabla anterior muestra la producción de 3-HP por esta cepa en el medio de AM2. Se obtuvo una productividad especifica de 0.54 g de 3-HP por gramo de DC en 24 horas en el cultivo mantenido constantemente a 30 °C, lo .que representa un incremento de >20 veces con respecto a cepas que portan mcr solo o mcr ya sea con pntAB o accABCD, pero no ambos. El desplazamiento de la temperatura para desactivar la enoil-ACP reductasa dio como resultado una productividad especifica de 2.01 g de 3-HP por gramo de DCW en 24 horas, un incremento adicional de 3.8 veces. Asi, la combinación de sobreexpresión de pntAB y de accABCD, más la desactivación de enoil-ACP reductasa vía el alelo fablts sensible a la temperatura, dio como resultado un incremento de aproximadamente 500 veces en productividad especifica de 3-HP por células portadoras de mcr (productividad especifica de 2.01 vs . 0.0041 g de 3-HP por gramo de DCW en 24 horas) .
Tabla 18. Producción de 3-HP mediante JX3_0098.0 en medio AM2 Ejemplo 9: Secuencia de la mutación de fablts La naturaleza del cambio de secuencia exacto en el alelo fablts portado por las cepas de JP1111 fue reconfirmada . La confirmación de este cambio permite la mutagénesis apuntada para generar cepas alternativas con diferentes sensibilidades de la temperatura y mutantes con estabilidades intermedias entre el alelo tipo silvestre y el alelo sensible a la temperatura de fabl392, permitiendo un crecimiento a una temperatura constante más alta de 30 °C en tanto que provee el beneficio de fondos de malonil-CoA internos incrementados. Para confirmar la secuencia de ADN de este segmento del cromosoma de un mutante tipo silvestre (BW25113) y el mutante JPllll de E. coli, el ADN cromosomal fue preparado a partir de estas cepas. Estos ADN fueron usados como plantillas en una reacción de PCR con cebadores: FW043 ATGGGTTTTCTTTCCGG SEQ ID NO: 821 FW0 7 TTATTTCAGTTCGAGTTCG SEQ ID NO: 822 Las condiciones del termociclador para la PCR fueron: 95°C, 10 minutos; 30 ciclos de 95°C, 10 segundos; 47°C incrementándose a 58 °C, 30 segundos; 72°C, 1 min; seguido por una incubación final a 72 °C por 5 minutos. El producto de PCR fue separado sobre un gel de agarosa y el fragmento de tamaño apropiado recuperado como se describe en la Sección de Métodos Comunes y secuenciados usando cebadores: FW044 CTATCCATCGCCTACGGTATC SEQ ID NO: 823 FW045 CGTTGCAATGGCAAAAGC SEQ ID NO: 824 FW046 CGGCGGTTTCAGCATTGC SEQ ID NO: 825 Una comparación de la secuencia de ADN obtenida del ' fabl392 (SEQ ID NO: 769) y cepas tipo silvestre revela una sola diferencia entre los alelos de C en posición 722 del gen tipo silvestre a T (véase Figura 4A) , conduciendo a un cambio de proteina de Ser en el codón 241 a Phe (véase Figura 4B) . Estos cambios son idénticos a aquellos encontrados por Bergler, H., Hogenauer, G., and Turnowsky, F. , J. Gen. Microbiol. 138:2093-2100 (1992).
La identificación del residuo afectado en el codón 241 indica que la mutagénesis apuntada en este codón, por ejemplo a residuos de aminoácidos tales como Trp, Tyr, His, lie, u otros aminoácidos diferentes a Ser o Phe, pueden dar como resultado alelos de fabl con propiedades diferentes que el fabl392 aislado originalmente en JP1111. La mutagénesis apuntada en codones cerca del codón 241 puede también ser contemplada para obtener los mutantes de fabl deseados con propiedades alteradas.
Ejemplo 11: Efecto sobre la producción de 3-HP volumétrica en fermentaciones de 1 litro de fondos del precursor de malonil-coA incrementado utilizando mutantes de sintesis de ácido graso sensibles a la temperatura.
Cuatro experimentos de fermentación de alimentación por lotes de 1 litro se llevar a cabo utilizando la cepa JX3_0098. Brevemente, cultivos de siembra fueron iniciados y cultivados de la noche a la mañana en medio LB (Caldo de Luria) y utilizados para inocular cuatro recipientes de fermentación de New Brunswick de 1 litro. El primer recipiente contenia el medio de AM2 definido a 30°C, la inducción de IPTG fue agregada a 2 mM a una OD600 nm de 2, la alimentación de glucosa adicional fue iniciada cuando la glucosa estaba' agotada a entre 1-2 'g/1. La temperatura fue desplazada 37 °C durante 1 hora a una OD objetivo de 10. Una alta velocidad de alimentación de glucosa fue mantenida a > 3 g/l/h hasta que la glucosa se comenzó a acumular a concentraciones mayores de 1 g/1 tiempo en el cual la velocidad de alimentación se hizo variar para mantener la glucosa residual entre 1 y 10 g/1. El segundo recipiente contenia el medio de AM2 definido a 30°C, la inducción de IPTG fue agregada a una concentración de 2 mM a una ??ß?? nm de 2, la alimentación de glucosa adicional fue iniciada cuando la glucosa fue agotada a 0 g/1. La temperatura fue desplazada a 37 °C durante 1 hora a una OD objetivo de 10. La velocidad de alimentación de glucosa fue mantenida menor o igual a 3 g/l/h. El tercer recipiente contenia medio rico a 30°C, la inducción de IPTG fue agregada a 2 mM a una ??ß?? nm de 2, se inició una alimentación de glucosa adicional cuando la glucosa fue agotada a 1-2 g/1. La temperatura fue desplazada a 37 °C durante 1 hora una OD objetivo de 10. Una alta velocidad «de alimentación de glucosa fue mantenida a > 3 g/l/h hasta que la glucosa se comenzó a acumular a concentraciones mayores de 1 g/1 tiempo en el cual la velocidad de alimentación se hizo variar para mantener la glucosa residual entre 1 y 10 g/1. El cuarto recipiente contenia medio rico a 30°C, la inducción de IPTG fue agregada a 2 mM a una OD60o nm de 2, se inició la alimentación de glucosa adicional cuando la glucosa estaba agotada a 0 g/1. La temperatura fue desplazada a 37 °C durante 1 hora a una OD objetivo de 10. La velocidad de alimentación de glucosa fue mantenida menor o igual a 3 g/l/h.
Los perfiles de crecimiento son mostrados en la Figura 5, las flechas indican el inicio del desplazamiento de temperatura. Todos los recipientes de fermentación fueron mantenido a pH = 7.4 mediante la adición controlada de hidróxido de amonio al 50% en v/v (Fisher Scientific) . Todos los recipientes fueron mantenidos por lo menos con oxigeno disuelto al 20% mediante aireación on aire filtrado burbujeado. Se tomaron muestras para mediciones de densidad óptica también como análisis de HPLC para la concentración de 3-HP. (Refiérase a métodos comunes) . Las productividades volumétricas máximas llegaron a 2.99 g/l/h. Además, las figuras demuestran la correlación entre la concentración de biomasa promedio de 3-4 horas y velocidades de productividad volumétrica promedio de 3-4 horas en estos 4 recipientes.
Ejemplo 11A: Producción de 3-HP en fermentaciones de 250 litro Ejemplos de dos fermentaciones por lote de alimentación en un fermentador de acero inoxidable de un volumen de 250 litros se llevaron a cabo utilizando la cepa BX3_0240, el genotipo de la cual es descrito en cualquier parte en la presente. Se usó un proceso de siembra de dos etapas para generar inoculo para el fermentador de 250 L. En la primera etapa, un mi de solución concentrada de glicerol de la cepa fue inoculado a 100 mi del medio de TB (Caldo Terrxfic) en un matraz agitado e incubado a 30 °C hasta que la ????? fue de entre 3 y 4. En la segunda etapa, 85 mi del cultivo del matraz agitado fueron transferidos asépticamente a un fermentador de New Brunswick de 14 L que contiene 8 L del medio de TB y cultivados a 30 °C y agitación a 500 rpm hasta que la ??&?? era de entre 5 y 6. El cultivo del fermentador de 14 L fue usado para inocular asépticamente el bioreactor de 250 L de volumen que contiene el medio de FM5 definido (véase Sección dé Métodos Comunes) a 30°C de tal manera que el volumen de post-inoculación fue de 155 L.
En la primera fermentación, la inducción fue efectuada al agregar IPTG a- una concentración final de 2 mM a una ??e?? de 20. La alimentación de glucosa (que consiste de una solución de glucosa de 700 g/1) fue iniciada cuando la glucosa residual en el fermentador era de 10-15 g/1. La velocidad de alimentación fue ajustada para mantener la glucosa residual entre 10 y 15 g/1 hasta aproximadamente las últimas 6 horas de la fermentación, cuando la velocidad de alimentación fue reducida de tal manera que la glucosa residual en la cosecha fue de <1 g/1 para facilitar la recuperación de 3-HP. Tres horas después de la inducción, la temperatura fue desplazada a 37 °C durante 1 hora. Al tiempo en que el desplazamiento de temperatura fue iniciado, el punto de ajuste de oxigeno disuelto (DO) fue cambiado de 20% de saturación de aire a un punto en donde el DO fue mantenido entre 2-4% de saturación de aire. El caldo de fermentación fue cosechado 48 horas después de la inoculación. El volumen de caldo final fue de 169.5 litros.
La segunda fermentación se puso en . operación idénticamente al primer ejemplo de fermentación descrito anteriormente excepto por las siguientes diferencias: la inducción con IPTG fue efectuada a una OD60o de 15, la glucosa residual (después que se inició la alimentación de glucosa) varió de entre 3-30 g/1 y el caldo de fermentación fue cosechado a 38.5 horas después de la inoculación, de tal manera que la concentración de glucosa residual final fue de 25 g/1. El volumen final del caldo fue de 167 litros.
Cada caldo de fermentación fue mantenido a un pH de aproximadamente 7.4 mediante la adición controlada de gas amoniaco anhidro. El oxigeno disuelto fue mantenido a los niveles deseados mediante aireación con aire filtrado estéril barboteado. Se tomaron muestras para mediciones de densidad óptica también como análisis de HPLC para la concentración de 3-HP. En la primera fermentación, la concentración de biomasa máxima fue de 12.0 g de peso de célula seca/L y la concentración de biomasa en la cosecha fue de 11.4 g de peso de célula seca/L. El titulo máximo de 3-HP en esta fermentación fue de 20.7 g/1. En la segunda fermentación, la concentración de biomasa máxima fue de 10.2 g de peso de célula seca/L y la concentración de biomasa en la cosecha fue de 9.5 g de peso de célula seca/L. El título de 3-HP máximo en esta fermentación fue de 20.7 g/1.
Ejemplo 11 B: Efecto del medio de cultivo sobre la producción de 3-HP en fermentaciones de un litro.
Ocho experimentos de fermentación de alimentación por lotes de 1 L se llevaron a cabo . utilizando las cepas BX3_0240. El cultivo de siembra fue iniciado de un mililitro de solución concentrada de glicerol de la cepa inoculada a 400 mi del medio de TB (Caldo Terrific)en un matraz agitado e incubado a 30°C hasta que la ???0? fue de entre 5 y 6. El cultivo del matraz agitado fue usado para inocular asépticamente cada bioreactor de un volumen de 1 L de tal manera que el volumen de post-inoculación fue de 653 mi en cada recipiente.
Los ferraentadores 1 y 2 contenían medio FM3. Los termentadores 3-5 contenían el medio FM4 definido. Los termentadores 6-8 contenían el medio F 5 definido. Todas las formulaciones de medios son enlistadas en la sección de Métodos Comunes. En cada termentador la temperatura inicial fue de 30°C.
La fermentación fue efectuada al agregar IPTG a una concentración final de 2 mM a valores de OD600 de q 15-16. La alimentación de glucosa (que consiste de una solución de glucosa de 500 g/1 para los medios FM3 y FM5 y 500 g/1 de glucosa mas 75 mM MgS04 para FM4) fue iniciada cuando la glucosa residual en el termentador era de aproximadamente 10 g/1. La velocidad de alimentación fue ajustada para mantener la glucosa residual >3 g/1 (la excepción fue el termentador 8 en el cual la glucosa residual llego temporalmente a ser 0.1 g/1 antes de que la velocidad de alimentación fuera incrementada) . Tres horas después de la inducción, la temperatura fue desplazada a 37°C durante 1 hora. Al tiempo en que se inicio el desplazamiento de temperatura, el tiempo de ajuste de oxígeno disuelto (DO) fue cambiado de 20% de saturación de aire a 1% de saturación de aire. Las fermentaciones fueran detenidas 48 horas después de la inoculación.
El caldo de termentador fue mantenido a un pH de aproximadamente 7.4 mediante la adición controlada de un agente titulante del pH. El agente titulante del pH* para el medio de FM3 fue 5M Na OH y para FM4 y FM5 fue una mezcla 50:50 de hidróxido de amonio concentrado y agua. El oxigeno disuelto fue mantenido a los niveles deseados mediante barboteo con aire filtrado estéril. Se tomaron muestras para mediciones de densidad óptica, también como análisis de HPLC en cuanto a la concentración de 3-HP. La concentración de biomasa máxima y la concentración de biomasa en la cosecha, también como el titulo de 3-HP máximo en cada termentador son resumidas en la Tabla 22 a continuación.
Tabla 22 Ejemplo 11 C: Efecto de la concentración de fosfato por lotes sobre la producción de 3-HP en fermentaciones de 1 L.
Se llevaron a cabo cuatro experimentos de fermentación de alimentación por lotes de 1 L utilizando la cepa BX3_0240.
El cultivo de siembra fue iniciada de 1 mi de solución concentrada de glicerol de la cepa inoculada a 400 mi del medio TB (Caldo Terrific) en un matraz agitado e incubado a 30°C hasta que la ??e?? fue de entre 5 y 7. El cultivo del matraz agitado fue usado para inocular asépticamente cada bioreactor de un volumen de 1 L de tal manera que el volumen post-inoculación fue de 653 mi en cada recipiente. Todos los fermentadores contenían el medio de cultivo F 5 definido, pero cada uno tenía diferentes concentraciones iniciales de fosfato de potasio monobásico y bifásico. Las concentraciones de fosfato en el medio por lotes en cada fermentador son resumidas en la Tabla 23. La formulación del medio de FM5 es enlistada en la sección de Métodos Comunes.
Tabla 23 Concentración de Concentración de No de K2HP04 en el KH2PO4 en el medio Fermentador. medio por lotes( g 1) por lotes ( g/1) 1 6.1 1.92 2 2.63 1.38 3 0.87 0.14 4 0.043 0.07 En cada fermentador, la temperatura inicial fue de 30°C. La inducción fue efectuada al agregar IPTG a una concentración final de 2 mM, cuando los valores de OD 600 estuvieron a los siguientes valores: fermentador 1, 15.3; fermentador 2, 16.0; fermentador 3, 18.1; fermentador 4, 18.4. La alimentación de glucosa (que consiste de una solución de 500 g/l de glucosa para los medios FM3 y F 5 y 500 g/l de glucosa mas 75 Mm gS04 para F 4) fue iniciada cuando la glucosa residual en el fermentador era de aproximadamente 10 g/l. La velocidad de alimentación fue ajustada para mantener la . glucosa residual >6.5 g/l. Tres horas después de la inducción, la temperatura fue desplazada a 37 °C durante una hora. Al tiempo en el que se inicio el desplazamiento de temperatura el punto de ajuste de oxigeno disuelto (DO) fue cambiado de 20% de saturación de aire a 1% de saturación de aire. Las fermentaciones fueron detenidas 48 horas después de la inoculación.
El caldo de cada fermentador fue mantenido a un pH de 7.4 mediante la adición controlada de una mezcla de 50:50 de hidróxido de amonio concentrado y agua. El oxigeno disuelto fue mantenido a los niveles deseados y mediante barboteo con aire filtrado estéril. Se tomaron muestras para mediciones de densidad óptica, también como análisis de PHLC para la concentración de 3-HP. La concentración de biomasa máxima y la concentración de biomasa en la cosecha, también como el titulo de 3-HP máximo en cada fermentado son resumidos en la Tabla 24 a continuación.
Tabla 24 Ejemplo 11 D: Producción de 3-HP en fermentaciones de 1 L.
Se llevaron a cabo dos experimentos de fermentación de alimentación por lotes de 1 L utilizando la cepa BX3_0240. El cultivo de siembra fue iniciado de 1 mi de solución concentrada de glicerol de la cepa inoculada a 100 mi del medio de TB (Caldo Terrific) en un matraz agitado e incubado 30°C hasta que la ??ß?? fue de entre 5 y 6. El cultivo del matraz agitado fue usado para inocular asépticamente (5% en volumen/volumen) cada bioreactor de volumen de 1 L de tal manera que el volumen de post-inoculación fue de 800 mi en cada recipiente. Los termentadores usados en este experimento consistieron del sistema de fermentación paralelo de fermentación por lotes Das Gip (DASGIP AG, Julich, Alemania, modelo SR0700DLS) . El sistema de fermentación incluía mantener en tiempo real y control del oxígeno disuelto (% DO), el pH, temperatura, agitación y alimentación. Los fermentadores 1 y 2 contenían el medio FM5 definido, elaborado como se muestra en¦ la Sección de Métodos Comunes excepto que se agrego ácido cítrico a 2.0 g/1 y MgSC a 0.40 g/1. En cada fermentador, la temperatura inicial fue de 30°C. La inducción fue efectuada al agregar IPTG a una concentración final de 2 mM a valores de OD600 de 17-19, que correspondían a una post-inoculación en el tiempo de 14.5 hr. La alimentación de glucosa (que consiste de una solución de glucosa de 500 g/1) fue iniciada cuando glucosa residual en el fermentador era de aproximadamente 1 g/1. la velocidad de alimentación fue ajustada para mantener la glucosa residual >3 g/1. Tres horas después de la inducción, la temperatura fue desplazada a 37°C durante 1 hr. Al tiempo en que se inicio el desplazamiento de temperatura, el OTR fue ajustado a 40 mmol/L-h al ajusfar el flujo de aire y agitación a 1.8 vvm y 1000 rpm, respectivamente. Sé uso aire comprimido a 2 bar la alimentación de aire. El caldo de cada fermentador fue mantenido a un pH de aproximadamente 7.4 por la adición controlada de un agente titulante del pH. Dos horas subsecuentes a la inducción de IPTG, el agente titulante del pH fue cambiado de 50% NH4(OH) a 7.4 M NaOH. Se tomaron muestras para mediciones de densidad óptica también como análisis de HPLC para la concentración de 3-HP. La concentración de biomasa máxima y la concentración de biomasa a la cosecha también como el titulo de 3-HP máximo en cada fermentador son resumidos en la Tabla 25 a continuación.
Tabla 25 La siguiente Tabla 26 provee un resumen de concentraciones de productos metabólicos obtenidos en el caldo de fermentación al tiempo indicado en horas.
Tabla 26 Ejemplo 11E: Producción de 3-HP en fermentaciones de 1 L.
Se llevaron a cabo cuatro experimentos de fermentación de alimentación por lotes de 1 L utilizando la cepa BX3__0240. El cultivo de siembra fue iniciado a partir de 1 mi de solución concentrada de glicerol de la cepa inoculada a 100 mi del medio de TB (Caldo Terrific) en un matraz agitado e incubado a 30°C hasta que la ??ß?? fue de entre 5 y 6. El cultivo de matraz agitado fue usado para inocular asépticamente (5% en volumen/volumen) cada bioreactor de volumen de 1 L de tal manera que el volumen de postinoculación fue de 800 mi en- cada recipiente. Los fermentadores en este' experimento consistieron del sistema de fermentación paralelo pro de alimentación por lotes Das Gip (DASGIP AG, Julich, Alemania, Modelo SR0700ODLS) . El sistema de fermentación incluía monitoreo en tiempo real y control del oxígeno disuelto (% del DO), pH, temperatura, agitación y alimentación. Todos los fermentadores contenían el medio FM5 definido, elaborado como se muestra en la Sección de Métodos Comunes excepto que se agrego ácido cítrico a 2.0 g/1 y MgS04 a 0.40 g/1. En cada termentador, la temperatura inicial fue de 30°C. La inducción fue efectuada al agregar IPTG a la concentración final de 2 mM a valores de OD6oo de 15.19, y correspondieron con una post-inoculación en tiempo de 15.75 h. La alimentación de glucosa (que consiste de una solución de glucosa de 500 g/1) fue iniciada cuando la glucosa residual en el fermentador era de aproximadamente 3 g/1. La velocidad de alimentación fue ajustada para mantener la glucosa residual >3 g/1. Tres horas después de la inducción, la temperatura fue desplazada a 37°C durante una hora. El caldo de cada fermentador fue mantenido a un pH de aproximadamente 7.4 mediante la adición controlada de un agente titulante del pH NH4 (OH) al 50%. Al tiempo en que se inicio el desplazamiento de temperatura, la OTR fue cambiada para cada fermentador al hacer variar la agitación y flujo de aire de acuerdo con la Tabla 27. Aire comprimido a 2 bar fue usado como la alimentación de aire. Se tomaron muestras para mediciones de densidad óptica también como análisis de HPLC para la concentración de 3-HP. La concentración de biomasa máxima y la concentración de biomasa a la cosecha, también como el titulo de 3-HP máximo en cada fermentador son resumidos en la Tabla 27 a continuación.
Tabla 27 Ejemplo 11F: Producción de 3-HP en fermentación de 1.8 L.
Se llevo a cabo un experimento de fermentación de alimentación por lotes de 1.8 L utilizando la cepa BX3_0240. El cultivo de siembra fue iniciado a partir de 1 mi de solución concentrada de glicerol de la cepa inoculada a 105 . mi del medio de TB (Caldo Terrific) en un matraz agitado e incubado a 30°C a la OD6oo fue de entre 5 y 7. Se usaron 90 mi del cultivo del matraz agitado para inocular asépticamente 1.71 L del medio de cultivo FM5, excepto que las concentraciones de fosfato fueron de 0.33 g/1 de K2HP04 y 0.17 g/1 de KH2P04 en medio por lotes. Los otros ingredientes en la formulación de FM5 son enlistados en la Sección de Métodos Comunes. La temperatura inicial en el fermentador fue de 30°C. La inducción fue efectuada al agregar IPTG a una concentración final de 2 mM cuando el valor de ??ß?? estaba a 15.46. La alimentación de glucosa (que consiste de una solución de glucosa de 500 g/1) fue iniciada cuando la glucosa residual en el fermentador era de aproximadamente 10 g/1. la velocidad de alimentación fue ajustada para mantener la glucosa residual >6.5 g/1. Tres horas después de la inducción, la temperatura fue desplazada a 37°C durante 1 hora. Al tiempo que se inicio el desplazamiento de temperatura, el punto de ajuste de oxigeno disuelto (DO) fue cambiado de 20% de saturación e aire a 1% de saturación de aire. El caldo de cada fermentador fue mantenido a un pH de 7.4 mediante la adición controlada de una mezcla 50:50 de hidróxido de amonio concentrado y agua. El oxigeno disuelto fue mantenido a los niveles deseados mediante barboteo con aire estéril-filtrado. Se tomaron muestras para mediciones de densidad óptica también como análisis de HPLC para la concentración de 3-HP. La concentración de biomasa final máxima fue de 9.84 g/1, el titulo de 3-HP máximo fue de 48.4 g/1 con un rendimiento final de glucosa de 0.053 g de 3-HP/g de glucosa.
Ejemplo 12 : construcción de cepa para evaluaciones adicionales de producción de 3-HP.
De acuerdo con las combinaciones respectivas indicadas en la Tabla 28 a continuación, los plásmidos descritos en la presente (por ejemplo, véase ejemplo 1) fueron introducidos a las cepas respectivas. Todos los plásmidos fueron introducidos al mismo tiempo vía electroporacion usando métodos estándar. Las células transformadas fueron cultivadas en los medios apropiados con complementacion de antibióticos y las colonias fueron seleccionadas en base a su crecimiento apropiado en los medios selectivos. Como se resuelve en la Tabla 28, los plásmidos de expresión de mcr p Trc-ptrc-mcr o pACYC (kan) -ptalA-mcr fueron transformados a dos cepas derivadas de E.coli BW25113 (F-, A(arad-araB) ) 567 , AlacZ4787 ( : :rmB-3) , lamba-, rph-?,? (rhaD-rhaB) 568, hsdR514, ) , estas cepas comprenden modificaciones cromosomales adicionales introducidas utilizando la tecnología de Gene Bridges como se describe en la Sección de Métodos Comunes. La cepa BX_0590 comprende cancelaciones adicionales de los genes ldhA, pflB, mgsA y poxB. La cepa BX_0591 comprende cancelaciones adicionales de la cepa BX_0590 y una cancelación adicional de los genes de ack_pta. Los transformantes fueron subsecuentemente seleccionados en medios que contienen las combinaciones apropiadas de antibióticos.
Tabla 28 Ejemplo 12A: Construcción de Cepas Adicionales para Evaluación .
Parte 1 : Cancelaciones Genéticas El método de recombinación homologo utilizando recombinación de Red/ET, como se describe en cualquier parte en la presente, fue empleado para la cancelación genética en cepas de E.coli. Este método es conocido para aquellos de habilidad ordinaria en el arte y es descrito en las Patentes Estadounidenses No. 6,355,412 y 6,509,156, expedidas a Stewart et al. e incorporadas por referencia en la presente por sus enseñanzas de este método. Material y kits para tal método están disponibles de Gene Bridges (Gene Bridges Gmb H, Heidelberg (anteriormente Dresden) ) , Alemania, www . genebridges . com, y el método procedió al seguir las instrucciones del fabricante. El método reemplaza el gen objetivo por un marcador seleccionable vía recombinación homologa efectuada mediante la recombinasa del ?-pago. EL organismo huésped que expresa la recombinasa ?-red es transformado con un producto de ADN lineal que codifica por un marcador seleccionado de planteado por las regiones terminales (en general ~ 50pb y alternativamente hasta aproximadamente ~ 300 pb) homologas con el gen objetivo o secuencia de promotor. El marcador es después de esto removido mediante otra etapa de recombinación efectuada por un vector de plásmido que porta la FLP recombinasa u otra recombinasa tal como Cre.
Cancelaciones específicas fueron construidas mediante amplificación utilizando PCR de la cepa de Keio que portan cancelaciones particulares utilizando cebadores como se específica a continuación. La colección de Keio fue obtenida de Open Biosyste'ms (Huntsville, AL Estados Unidos de América 35806) . Codones individuales pueden ser comprados del Yale Genetci Stock Center (New Haven, CT Estados Unidos de América 06520) . Cada una de estas cepas contiene un marcador de kanamicina en lugar del gen cancelado. En casos en donde la cancelación deseada no estaba en una cepa de Keio, por ejemplo ackA-ptra, la cancelación fue construida mediante el método de recombinación indicado anteriormente utilizando el marcador de resistencia a kanamicina para reemplazar la secuencia cancelada, seguido por selección de un clon de resistencia a kanamicina que tiene la cancelación. Los productos de PCR fueron introducidos a cepas apuntadas utilizando el método de recombinación indicado anteriormente. Combinaciones de cancelaciones fueron generadas secuencialmente para obtener cepas como se describe en los siguientes párrafos de este ejemplo.
Tabla 29 La tabla 31 muestra cepas que tienen genotipos que comprenden cancelaciones de acuerdo con los métodos de esta parte.
Parte 2 : Construcción de cepas BX 0595 y BX 0651 que tienen una mutación de fab I .
La mutación de fab Its (Ser241?Phe) en la cepa JP111 de E.coli incrementa significativamente la concentración de malonil-CoA cuando las células son cultivadas a la temperatura no permisiva (37°C) y asi produce más 3-HP a esta temperatura. Sin embargo, JP111 no es una cepa ideal para efectuar la transición a escala piloto y comercial, puesto que es el producto de mutagénesis de NTG y asi puede albergar mutaciones desconocidas, porta mutaciones en los factores reguladores de severidad reala y spoT, y tiene propensión de conjugación mejorada debido a la presencia de un factor de Hfr. Asi, la mutación de fab I s fue movida a la cepa BX_591, una cepa desarrollada del BW23115 bien caracterizado que porta las mutaciones adicionales AldhA, AplfB, AmgsA, ?????, Apta-ack. Estas mutaciones fueron generadas mediante la aplicación secuencial del método de cancelación genética descrito en la parte 1 anterior.
El gen de fab Its con 600 pb de secuencia de ADN corriente arriba y corriente abajo fue aislado del ADN genómico de JPllll mediante PCR utilizando cebadores: SEQ ID NO: 855 F 056: 5 ' -CCAGTGGGGAGCTACATTCTC; y SEQ ID NO: 856 F 056: 5' -CGTCATTCAGATGCTGGCGCGATC El cásete de FRT: kan: FRT fue luego insertado a un sitio de Smal corriente abajo del fab Its para generar el plásmido pSMAR (HC)amp_ fablts_ FR : : kan : : FRT . Este plásmido fue usado como ADN de plantilla y la región entre cebadores: SEQ ID NO: 857 FW043: 5T ATGGGTTTTCTTTCCGG y FW057 (SEQ ID NO: 856) fue amplificada en una PCR utilizando ADN polimerasa de KOD HS (Novagen) . La reacción fue tratada con Dpnl para fragmentar la plantilla del plásmido y el fragmento de amplificación fue purificado en gel y recuperado utilizando el kit de Limpieza y Concentrador de ADN (Zymo Research, Orange, CA) . La cepa de BX_591 fue transformada con pSIM5 y 1 expresión de los genes de lambda red cortados sobre este plásmido fue inducida mediante incubación a 42°C por 15 minutos .
Células electrocompetentes, fueron elaboradas mediante métodos estándar. Estas células fueron transformadas con el fragmento de amplificación que lleva el cásete fablts_ FR : : kan : : FRT y colonias transformantes isoladas sobre la placa de LB que contienen desde 36 µ/ml de kanamicina a 30°C. Las colonias individuales fueron purificadas mediante rallado y probadas en cuanto sensibilidad a temperatura mediante cultivo en medio liquido a 30°C y'42°C. En comparación con la cepa para el tal tipo silvestre, la cepa que lleva el alelo fablts crece escasamente a 42°C pero exhibió crecimiento comparable a 30°C. La inserción correcta del marcador de FR : : kan : : FRT fue verificada mediante PCR de colonia y la cepa fablts kanR fue designada como BX_594.
Para permitir el uso del marcador de kanR en plásmidos, el marcador incorporado en el cromosoma adyacente a fablts fue reemplazado con un fragmento de ADN que codifica resistencia a zeocina. El gen de zeo R fue amplificado mediante PCR del plásmido pJ402 (ADN 2.0, Menlo Park, CA) utilizando los separadores : SEQ ID NO: 858 HL018: 5' -CAGGTTTGCGGCGTCCAGCGGTTATGTAAACTACTATTGGC GCGACTTACGCCGCTCCCCGCTCGCGATAATGTGGTAGC; y SEQ ID NO: 859 HL019: 5 ' -AATAAAACCAATGATTTGGCTAATGATCACACAGTC CCAGGCAGTAAGACCGACGTATTCTATCATGCCATACCGCGAA.
La reacción fue tratada con Dpnl y purificada en gel como antes. La cepa BX_594 fue transformada con pKD46 (Datsenko and anner, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 96:6640-6645,2000) y los genes lambda red portados en este plásmido fueron introducidos mediante la adición de L-arabinosa a una constelación de 1 iM por 2 horas. Células electrocompetentes fueron elaboradas por medio de métodos estándar (por ejemplo, Sambrook and Russell, 2001) . Estas células fueron transformadas con el fragmento de zeoR y transformantes seleccionadas en placas de LB formuladas con NaCl y con 25 µ/ml de zeocina. Las placas fueron mantenidas en la oscuridad al envolverlas en hojas de aluminio e incubadas a 30°C. Una cepa resistente a zeocina, sensible a kanamicina isolada mediante este método fue designada BX_595. La retención del alelo fablts fue confirmada mediante cultivo fue confirmada como antes.
La cepa BX_651 fue construida al transferir casetes fablts de BX_595 a la cepa B 23113 que no porta mutaciones en genes metabólicos. Un fragmento de ADN que porta este cásete fue obtenido mediante PCR utilizando ADN cromosomal de BX_595 y cebadores FW043 (véase anteriormente) y SEQ ID NO: 860 F 65: 5 ' -GAGATAAGCCTGAAATGTCGC El producto de PCR fue purificado y concentrado utilizando el kit de Limpieza y Concentrador de ADN (Zymo Research, Orange, CA) . La cepa BW25113 fue transformada con pRedD/ET (Gene Bridges GmBH, Heidelberg, Alemania) y los genes lambda red portados en este plásmido fueron inducidos mediante la adición de L-arabinosa a una concentración de 5mM por 2 horas. Células electrocompetentes fueron elaboradas mediante métodos estándar y transformadas con el fragmento de ADN de fabIts-zeoR. Los transformantes fueron depositados como antes sobre zeocina y los clones que llevan el alelo sensible a la temperatura verificados mediante cultivo a 30°C y 42 como se describe anteriormente.
Parte 3 : Reemplazo de Promotor en Genes Seleccionados de un Cromosoma El método de recombinación homologa descrito en cualquier parte en la presente fue empleado para reemplazar promotores de varios genes. Como se indica, la recombinación de Red/ET es conocida para aquellos de habilidad ordinaria en el arte y es descrita en las Patentes Estadounidenses No. 6,355,412' y 6,509,156 expedidas a Stewart et al. e incorporadas por referencia en la presente por sus enseñanzas de este método. El material y kit para al método esta disponible en Gene Bridges (Gene Bridges Gmb H,Heidelber, Alemania, www . genebridges . com) , y el método puede proceder al seguir las instrucciones del fabricante. El método involucra el reemplazo del gel objetivo (o en este caso, una región de promotor) por un marcador seleccionable vía recombinación homologa efectuada por la recombinasa del lambda-pago. El organismo que expresa la recombinasa lambda-red es transformado con un producto de ADN lineal que codifica por un marcador seleccionable flanqueado por las regiones terminales (en general ~ 50 pb y alternativamente hasta aproximadamente ~ 300 pb) homologas con el gen objetivo o secuencia de promotor. El marcador puede luego ser movido mediante otra etapa de recombinación efectuada por un vector de plásmido que portan a FLP-recombinasa u otra recombinasa tal como CRE. Este método fue usado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Secuencias de plantilla, cada una comprendiendo secuencias del extremo para obtener la recombinación para reemplazar un promotor natural para el gen de interés indicado, el promotor de reemplazo deseado y una secuencia de marcador de antibiótico, fueron sintetizadas por un fabricante externo (Integrated DNA Technologies, ¦ CoralVille, IA) . Estas secuencias están diseñadas para reemplazar el promotor natural enfrente de estos genes con un promotor de T5. El cásete de T5-aceEF (SEQ ID NO: 863), también incluye set de resistencia a zeocina flanqueado por sitios loxP. Cada uno de los casetes (SEQ ID NO: 863) incluyen un cásete de resistencia a blasticidin flanqueado por sitios loxP. También, T5-cynTs (SEQ ID NO: 866) comprende sitios de loxP modificados de acuerdo con Lambert et al. ,??? 73 (4)pll26-1135.
Cada cásete es usado primero como plantilla para verificación de PCR para generar un producto de PCR utilizando los cebadores CAGTCCAGTTACGGCTGGAGTC (SEQ ID NO: 861), y ACTGACCATTTAAATCATACCTGACC (SEQ ID NO:863) . Este producto de PCR es usado para electroporacion (utilizando métodos estándar como se describe en cualquier parte en la presente) y recombinación al genoma enseguida del método de recombinación de Red /ET de Gene Bridges descrito anteriormente. Después que recombinante positivos de información son seleccionados en un medio que contiene antibióticos de zeocina o blasticidina . El curado del marcador de resistencia se lleva a cabo mediante la expresión recombinasa de acuerdo con métodos estándar. La Tabla 31 muestra cepas que tienen genotipos que comprenden promotores reemplazados. Estos son mostrados como "T5" seguidos por el (los) gen (es) afectado (s) .
Parte 4 : Construcción de Plásmidos .
La siguiente tabla resume la construcción de plásmidos que fueron usados en las cepas descritas posteriormente en la presente. Para elaborar los plásmidos, un gen respectivo o región genética de interés fue aislada ya sea mediante amplificación de PCR o digestión de enzima PCR o digestión de enzima de restricción directa de una fuente apropiada que porta el gen. El gen aislado fue luego ligado al vector deseado , transformado a células competentes de E.coli 10G (Lucigen, iddleton, WI) mediante mapeo de' restricción y confirmado mediante secuenciación de ADN utilizando procedimientos de biología molecular estándar (por ejemplo, Sambrook an Rusell, 2001) .
Se notará que entre estos plásmidos están aquellos que comprenden actividad de malonil-CoA reductasa mono-funcional. Particularmente, las porciones truncadas de malonil-CoA reductasa de C. aurantiacus fueron construidas mediante el uso de cebadores de PCR adyacentes, respectivamente, a base de nucleótidos que codifican los residuos de aminoácidos 366 y 1220 y 1496 y 1220, de la malonil-CoA reductasa codón-optimizada de TRC-ptcr-mcr-amp. También, una malonil-CoA reductasa de Erythrobacter sp, fue incorporada otro plásmida. En cuanto a otro plásmido, estos fueron incorporados a cepas y evaluados como se describe anteriormente en la presente.
Tabla30 Gen (es) o Método de SEQ ID NO: nombre de Vector y Número de Clonación Fuente Nombre de Plásmido región ?Proveedor Catálogo de Gen (es) Plásmido *A - PCR, RE C. aurantiacus (Ncol/Hindlll)/ pTrc-ptrc-ydfG- pTRCHisA mcr truncado pTRC-ptrc mcr- ptrc-(496- (496-1220) *A V360-20 amp 1220)mcr-amp 873 PCR, RE pTRCHisA (Ncol/Hindlll)/ pTrc-ptrc-mcr- mcr *A V360-20 SEQ ID No. 003 amp 874 pTRCHisA RE (Ahdl, Dlunted) for Kan *A nsertion/ pTRC- mcr *C V360-20 ptrc mcr-amp pTrc-ptrc-mcr-kan 875 Método de SEQ ID NO: Gen (es) o Clonación Plásmido nombre de Vector y Número de Fuente de Gen Nombre de región ?Proveedor Catálogo (es) Plásmido *A RE/ (Ndel, blunted: pTRC ptrc-mcr kan), pTRCHisA (EcoRV: pSMARTHC pTrc-ptrc-mcr- mcr/cynTS *A V360-20 ampcynTS) kan-cynTS 876 RE (EcoNI, Asel, blunted) for Cat pJ251-cat-PtpiA- pJ251 ¡nsertion/ SEQ ID accAD-PrpiA- accABCD *C N/A No 820 accBC 877 RE (Nrul, Pcil, blunted) self- ligate/ pACYC184-cat- PtpiA-accAD- PrpiA-accBC- pACYC184-cat- pntAB pACYC184 cat E4152S ptalA-pntAB PtalA-pntAB 878 *B RE/( EcoRV,Aval, BseBl, blunted: PACYC184), . pACYC184-cat- (BamHI, blunted: PtpiA-accAD- pJ244-pntAB- PrpiA-accBC-acccABCD/pntAB pACYC184 cat E4152S accABCD) ptalA-pntAB 879 *A: Invitrogen, Carlsbad, CA; *B: New England Biolab Ipswich, MA; *C: AND 2.0, Menlo Park,CA.
Parte 5: Clonación de pACYC-cat-accABCD-PT5-udhA.
El promotor de PtaiA que impulsa la expresión de udhA en pACYC-cat-accABCD-udhA -fue reemplazado con el promotor de T5 más fuerte. La construcción PT5-udhA genómica de la cepa BX_00635- fue amplificada utilizando el cebador AS1170 udhA 300 pb corriente arriba) . Véase SEQ ID NO: 886 para la secuencia de udhA) . Los fragmentos de PCR de PTs-udhA obtenidos anteriormente fueron sometidos a digestión con Pmel y Ndél (New England Bio Labs, Ipswich, MA).E1 vector pACYC-cat-accABCD-Ptai-udhA fue similarmente sometido a digestión Swal y Ndel (New England Bio Labs) . Los dos fragmentos de ADN sometidos a digestión fueron ligados y transformados para crear pACYC-cat-accABCD-PT5-udhA (SEQ ID NO: 887) . Los digestos de plásmido fueron usados para confirmar la secuencia correcta. Este plásmido es incorporado a cepas mostradas en la Tabla 31.
Parte 6 : Construcción de Cepa .
Utilizando construcciones elaboradas mediante los métodos anteriores, las cepas mostradas en la Tabla 31, dados los nombres de cepa indicados, fueron producidas proporcionando los genotipos. Esta no pretende ser limitante y otras cepas pueden ser elaboradas utilizando estos métodos y siguiendo las enseñanzas provistas en esta solicitud incluyendo la producción de genes diferentes y regiones genéticas diferentes para tolerancia y/o producción de 3-HP y modificaciones para modular el sistema de ácido graso sintasa. Además de lo último, tales cepas pueden ser producidas mediante modificaciones cromosomales y/o introducción de introducciones no cromosomales tales como plásmidos.
En cuanto a lo último, de acuerdo con las combinaciones respectivas indicadas en la Tabla 38 posteriormente en la presente, los plásmidos descritos anteriormente fueron introducidos a las cepas respectivas. Todos los plásmidos fueron introducidos al mismo tiempo vía electroporacion utilizando métodos estándar. Las células transformadas fueron cultivadas sobre el medio apropiado con complementación de antibiótico y las colonias fueron seleccionadas en base a su crecimiento apropiado en el medio selectivo.
Tabla 31 Nombre de Cepa Genotipo de Cepa BW25113 F-, A(araD-araB)567, AlacZ4787(::rrnB-3), LAM-, rph-1, A(rhaD-rhaB)568, hsdR514 F-, A(araD-araB)567, AlacZ4787(::rrnB-3), LAM-, rph-1, A(rhaD-rhaB)568, hsdR514, BX 0591 aidhA::frt, ApflB::frt, AmgsA::frt, ApoxB::frt, Apta-ack::frt F-, A(araD-araB)567, AlacZ4787(::rrnB-3), LAM-, rph-1, A(rhaD-rhaB)568, hsdR514, BX 0595 AldhA::frt, ApflB::frt, AmgsA::frt, ApoxB::frt, Apta-ack::frt, fablts (S241F)-zeoR F-, A(araD-araB)567, AlacZ4787(::rrnB-3), LAM-, rph-1, A(rhaD-rhaB)568, hsdR514, AldhA::frt, ApflB::frt, AmgsA::frt, ApoxB::frt, Apta-ack::frt, fablts (S241F)-zeoR, T5- BX 0619 pntAB-BSD F-, A(araD-araB)567, AlacZ4787(::rrnB-3), LAM-, rph-1, A(rhaD-rhaB)568, hsdR514, AldhA::frt, ApflB::frt, AmgsA::frt, ApoxB::frt, Apta-ack::frt, fablts (S241F)-zeoR, T5- BX_0634 pntAB, T5-aceEF F-, A(araD-araB)567, AlacZ4787(::rrnB-3), LAM-, rph-1, A(rhaD-rhaB)568, hsdR514, AldhA::frt, ApflB::frt, AmgsA::frt, ApoxB::frt, Apta-ack::frt, fablts (S241F)-zeoR, T5- BX_ 0635 pntAB, T5-aceEF, T5-udhA-BSD F-, A(araD-araB)567, AlacZ4787(::rrnB-3), LAM-, rph-1, A(rhaD-rhaB)568, hsdR514( AldhA::frt, ApflB::frt, AmgsA::frt, ApoxB::frt, Apta-ack::frt, fablts (S241F)-zeoR, T5- BX. 0636 aceEF F-, A(araD-araB)567, AlacZ4787(::rrnB-3), LAM-, rph-1, A(rhaD-rhaB)568, hsdR514, AldhA::frt, ApflB::frt, AmgsA::frt, ApoxB::frt, Apta-ack::frt, fablts (S241F)-zeoR, T5- BX_0637 aceEF, T5-udhA-BSD F-, A(araD-araB)567, AlacZ4787(::rrnB-3), LA -, rph-1, A(rhaD-rhaB)568, hsdR514, AldhA::frt, ApflB::frt, amgsA::frt, ?????::??, flpta-ack::frt, fablts (S241F)÷zéoR, T5- BX 0638 pntAB, T5-aceEF, AaldB::frt F-, A(araD-araB)567, AlacZ4787(::rrnB-3), LAM-, rph-1, A(rhaD-rhaB)568, hsdR514, AldhA::frt, ApflB::frt, AmgsA::frt, ?????-frt, Apta-ack::frt, fablts (S241F)-zeoR, T5- BX 0639 pntAB, T5-aceEF, AtrpR::kan F-, A(araD-araB)567, AlacZ4787(::rrnB-3), LAM-, rph-1, A(rhaD-rhaB)568, hsdR514, BX 0651 fablts (S241F)-zeoR F-, A(araD-araB)567, AlacZ4787(::rrnB-3), LAM-, rph-1, A(rhaD-rhaB)568, hsdR514, _ ldhA::frt, ApflB::frt, AmgsA::frt/ApoxB::frt, Apta-ack::frt, fablts (S241F)-zeoR( T5- BX 0652 pntAB, T5-aceEF, T5-udhA, AarcA::kan F-, A(araD-araB)567, AlacZ4787(::rrnB-3), LAM-, rph-1, A(rhaD-rhaB)568, hsdR514, AldhA::frt, ApflB::frt, AmgsA::frt, ApoxB::frt, Apta-ack::frt, fablts (S241F)-zeoR, T5- BX 0653 pntAB, T5-aceEF, T5-udhA, ApuuC::kan F-, A(araD-araB)567, AlacZ4787(::rrnB-3), LAM-, rph-1, A(rhaD-rhaB)568, hsdR514, AldhA::frt, ApflB::frt, AmgsA::frt, ApoxB::frt, Apta-ack::frt, fablts (S241F)-zeoR, T5- BX. .0654 pntAB, T5-aceEF, T5-udhA, AaldA::kan Ejemplo 12B: Preparación de un célula huésped de E.coli modificada genéticamente que comprende malonil-CoA reductasa (raer) en combinación con otras modificaciones genéticas para incrementar la producción de 3-HP en relación con una célula de E . coli testigo (pro ética) .
Modificaciones genéticas se hacen para introducir un vector que comprende mmsB tal como de Pseudomonas auruginosa, que además es codón-optimizada para E.coli. Vectores que comprenden galP y un ppc natural o mutado también pueden ser introducidos por aquellos experimentados en el arte (véase, por ejemplo Saambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition 2001 (Volúmenes 1-3) , Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,N.Y., "Sambrook and Russell, 2001") , reconociendo adicionalmente que mutaciones se pueden hacer mediante un método utilizando la cepa mutadora de XLl-Red utilizando materiales apropiados siguiendo las instrucciones del fabricante (Stratagene QuikChange Mutagenesis Kit, Stratagene, La Jolla, CA USA) y seleccionados por o seleccionados bajo protocolos estándar.
También, se hacen modificaciones genéticas para reducir o eliminar las actividades enzimáticas del gen de E.coli como se desee. Estas modificaciones genéticas son obtenidas al utilizar el método de recombinación homologo de RED/ET con kits suministrados por Gene Bridges (Gene Bridges GmbH, Dresden, Alemania, www. genebridges . com) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
También en algunas modalidades, se hacen modificaciones genéticas para incrementar el fondo celular de NADPH. Ejemplos no limitantes de algunos sometidos para modificaciones genéticas son provistos en la presente. Estos son pgi (en forma mutada) , pntAB, sobreexpresado, sustitución/reemplazo de gapArgapN y disrupción o modificación de una transhidrogenasa soluble tal como sthA y modificaciones genéticas de uno o más de zwf, gnd y edd.
El microorganismo asi modificado genéticamente de cualquiera de tales modalidades diseñadas es evaluado y se encuentra que exhibe productividad más alta de 3-HP en comparación con E.coli testigo que carece de dichas modificaciones genéticas. La productividad es medida mediante métricas estándar, tal como productividad volumétrica (g3-HP/hr) bajo condiciones de cultivo similares.
Ejemplo 12C: Desarrollo Mutacional de Polinucleótidos Seleccionados (Profético) Una secuencia genética seleccionada, tal como una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para cualquiera de SEQ ID NO: 783-791, es sometida un protocolo de desarrollo de mutación, partiendo al construir una biblioteca mutante de un polinucleótido natural o previamente evolucionado y/o codón-optimizado mediante el uso de un método de mutagénesis dirigido al sitio de PCR que induce error.
Un polinucleótido que exhibe actividad enzimática del gen seleccionado (que puede ser cualquiera revelado en la presente, por ejemplo, una aminotransferasa o mmsB) es clonado a un sistema de expresión apropiado para E. coli. Esta secuencia puede ser codón-optimizada. La clonación de un polinucleótido codón-optimizado y su expresión apropiada será llevada a cabo vía síntesis genética suministrada de un proveedor comercial utilizando técnicas estándar. El gen será sintetizado con una etiqueta C-terminal de ocho aminoácidos para permitir la purificación de proteína a base de afinidad. Una vez obtenido utilizando metodología estándar, el gen será clonado a un sistema de expresión utilizando técnicas estándar.
El plásmido que contiene el polinucleótido descrito anteriormente será mutado mediante métodos estándar dando como resultado una gran biblioteca de mutantes (>106) . Las secuencias mutantes serán extirpadas de estos plásmidos y otra vez clonadas a un vector de expresión, generando una biblioteca final mayor que 106 clones para selección subsecuente. Estos números aseguran una probabilidad mayor de 99% que la biblioteca contendrá una mutación en cada aminoácido codificado por secuencia. Es reconocido que cada método de crear una biblioteca mutacional tiene sus propias predisposiciones, incluyendo transformación a cepas de mutador de E. coli, PCR propensa a error y además más mutagénesis dirigida al sitio.
En algunas modalidades, varios métodos pueden ser considerados y posiblemente varios explorados en paralelo. Uno de tales métodos es el uso de la cepa de mutador XLl-Red, que es deficiente en varios mecanismos de reparación necesarios para la replicación de ADN exacta y genera mutaciones eñ plásmidos a una velocidad 5,000 veces aquella de la velocidad de mutación tipo silvestre, puede ser empleada utilizando materiales apropiados siguiendo las instrucciones del fabricante (véase kit de utagénesis QuikChange de Stratagene, Stratagene, La Jolla, CA Estados Unidos de América) . Esta técnica u otras técnicas conocidas para aquellos experimentados en el arte, puede ser empleada y luego una población de tales mutantes, por ejemplo, en una biblioteca, es evaluada, tal como mediante un método de filtración o selección, para identificar clones que tienen mutación apropiada o favorable.
Con la construcción exitosa de una biblioteca mutante, será posible seleccionar esta biblioteca en cuanto a actividad 'incrementada, tal como actividad de malonil-CoA reductasa incrementada. El proceso de selección será designado para seleccionar toda la biblioteca mayor de 106 mutantes. Esto se hace mediante métodos de selección apropiados a la reacción enzimática particular.
Ejemplo 13: Evaluación de Producción de 3-HP Utilizando Cepas del E emplo 12 : La producción de 3-HP mediante BX3_0194 fue demostrada a escala de 100 mi en medio SM3 (sales mínimas) . Los cultivos fueron iniciados concentradas de congelador mediante la práctica estándar (Sambrook y Russell, 2001) en 50 mi de medio LB más 100 g/ml de ampicilina. y cultivados a fase estacionaria de la noche a la mañana a 37 °C con rotación a 225 rpm. Cinco mi de este cultivo fueron transferidos a 100 mi de medio SM3 más 40 g/1 de glucosa, 100 µg/ml· de ampicilina e IPTG 1 mM por triplicado, matraces amortiguados de 250 mi e incubados a 37 °C, 225 rpm. Para monitorear .el crecimiento celular y la producción de 3-HP mediante estos cultivos, se extrajeron muestras (2 mi) a puntos en el tiempo designados para mediciones de densidad óptica a 600 ratt (ODgoor longitud de trayectoria de 1 cm) y aglomeradas mediante centrifugación a 12,000 rpm por 5 minutos y el sobrenadante recolectado para análisis de producción de 3-HP como se describe en "Análisis de cultivos en cuanto a producción de 3-HP" en la Sección de Métodos Comunes. El peso de célula seco (DCW) es calculado como 0.33 veces el valor de OD600 medido, en base al DCW de referencia a determinaciones de OD6oo- Todos los datos son el promedio de cultivos por triplicado. Por propósitos de comparación, la productividad especifica es calculada a partir de los datos promediados en el punto en el tiempo de 24 horas y expresada como gramos de 3-HP producidos por gramo de DCW. Bajo estas condiciones, no se produce 3HP después de 24 horas en un cultivo que crece a una OD60o que corresponde a aproximadamente 1.0 g de DCW. La producción de 3-HP por la cepa BX3_0194 en medio SM3 es mostrado en la Tabla 32.
Tabla 32. Producción de 3-HP mediante BX3_0194 en el medio de SM3 La producción mediante la cepa BX3_0194 en medio SM3 en presencia de 10 g/ml de cerulenina es mostrado en la Tabla 33. En presencia de cerulenina, un inhibidor del sistema de ácido graso sintasa, se propone que los fondos internos del precursor de malonil-CoA se incrementan, conduciendo asi a producción incrementada de 3-HP. Como se puede ver por comparación con los resultados sin cerulenina (Tabla 32) , sustancialmente más 3-HP es producido en cada punto en el tiempo. Bajo estas condiciones, la productividad especifica después de 24 horas es de 1.3 g de 3HP por gramo de DCW.
Tabla 33. Producción de 3-HP mediante BX3_0194 en medio SM3 y en presencia de 10 g/ml de cerulenina La producción de 3-HP mediante BX3_0195 fue demostrada a escala de 100 mi en medio SM3 (sales mínimas) . Los cultivos fueron iniciados de soluciones concentradas de congelador mediante la práctica estándar (Sambrook y Russell, 2001) a 50 mi de medio LB más 100 pg/ml de ampicilina y cultivados a fase estacionaria de la noche a la mañana a 37 °C con rotación a 225 rpm. Cinco mi de este cultivo fueron transferidos a 100 mi de medio SM3 más 40 g/1 de glucosa, 100 pg/ml de ampicilina e IPTG 1 mM por triplicado en frascos amortiguados de 250 mi e incubados a 37 °C, 225 rpm. Para monitorear el crecimiento celular y la producción de 3-HP mediante estos cultivos, se extrajeron muestras (2 mi) a los puntos en el tiempo designados para mediciones de densidad óptica a 600 nm (OÜ6OOÍ longitud de trayectoria de 1 cm) y aglomeradas mediante centrifugación a 12,000 rpm durante 5 minutos y el sobrenadante recolectado para análisis de producción de 3-HP como se describe en "Análisis de cultivos en cuanto a producción de 3-HP" en la Sección de Métodos Comunes. El peso seco de célula (DCW) es calculado como 0.33 veces el valor de OD6oo medido, en base al DCW de referencia a las determinaciones de OD6oo- Todos los datos son el promedio de cultivos por triplicado. Por propósitos de comparación, la productividad especifica es calculada a partir de los datos promediados en el punto en el tiempo de 24 horas y expresada como gramos de 3-HP producidos por gramo de DCW. Bajo estas condiciones, no se produce 3HP después de 24 horas en un cultivo que crece a una ??e?? q e corresponde a aproximadamente 1.65 g de DCW. La producción de 3-HP por la cepa BX3_0195 en medio SM3 es mostrada en la Tabla 34.
Tabla 34. Producción de 3-HP por BX3 0195 en medio SM3 La producción mediante la cepa de BX3_0195 en medio SM3 en presencia de 10 pg/ml de cerulenina es mostrada en la Tabla 35. En presencia de cerulenina, un inhibidor del sistema de ácido graso sintasa, se propone que los fondos internos del precursor de malonil-CoA se incrementan conduciendo asi a la producción incrementada de 3-HP. Como se puede ver por comparación con los resultados sin cerulenina (Tabla 34), sustancialmente más 3-HP es producido en cada punto en el tiempo. Bajo estas condiciones, la productividad especifica después de 24 horas es de 0.54 g de 3HP por gramo de DC .
Tabla 35. Producción de 3-HP mediante BX3_0195 en medio SM3 y en presencia de 10 ug/ml de cerulenina La producción de 3-HP mediante BX3_0206 fue demostrada a escala de 100 mi en medio SM3 (sales mínimas) . Los cultivos fueron iniciados de soluciones concentradas de congelador mediante la práctica estándar (Sambrook y Russell, 2001) en 50 mi de medio LB más 35 g/ml de kanamicina y cultivados a fase estacionaria de la noche a la mañana a 37 °C con rotación a 225 rpm. Cinco mi de este cultivo fueron transferidos a 100 mi de medio SM3 más 40 g/1 de glucosa y 35 µg/ml de kanamicina por triplicado en matraces amortiguados de 250 mi e incubados a. 37 °C, 225 rpm. Para monitorear el crecimiento celular y la producción de 3-HP mediante estos cultivos, se extrajeron muestras (2 mi) a los puntos en el tiempo designados para mediciones de densidad óptica a 600 nm (OD6OOÍ longitud de trayectoria de 1 cm) y aglomeradas mediante centrifugación a 12,000 rpm durante 5 minutos y el sobrenadante recolectado para análisis de producción de 3-HP como se describe en "Análisis de cultivos en cuanto a producción de 3-HP" en la Sección de Métodos Comunes. El peso seco de célula (DCW) es calculado como 0.33 veces el valor de OD6oo medido, en base al DCW de referencia a determinaciones de OD600 ' Todos los datos son el promedio de cultivos por triplicado. Por propósitos de comparación, la ' productividad especifica es calculada a partir de los datos promediados al punto en el tiempo de 24 horas y expresada como gramos de 3-HP producidos por gramo de DCW. Bajo estas condiciones, la productividad especifica después de 24 horas es de 0.05 g de 3HP por gramo de DCW. La producción de 3-HP por la cepa de BX3 0206 en medio SM3 es mostrada en la Tabla 36.
Tabla 36. Producción de 3-HP por BX3 0206 en medio SM3 La producción por la cepa de BX3_0206 en medio de SM3 en presencia de 10 ug/ml de cerulenina es mostrada en la Tabla 37. En presencia de cerulenina, un inhibidor del sistema de ácido graso sintasa se propone que los fondos internos del precursor de malonil-CoA se incrementan conduciendo asi a producción incrementada de 3-HP. Como se puede ver por la comparación con los resultados sin cerulenina (Tabla 36) , sustancialmente más 3-HP es producido después de 24 horas. Bajo estas condiciones, la productividad especifica después de 24 horas es de 0.20 g de 3HP por gramo de DCW, un incremento de aproximadamente 40 veces en relación con los resultados sin cerulenina.
Tabla 37. Producción de 3-HP mediante BX3_0195 en medio SM3 y en presencia de 10 g/ml de cerulenina Ejemplo 13A: Evaluación de Cepas en cuanto a la Producción de 3-HP La producción de 3-HP en biocatalizadores (cepas) enlistada en la siguiente tabla fue demostrada a escala de 100 mi en medio SM3 (sales mínimas) . SM3 usado es descrito bajo la Sección de Métodos Comunes, pero fue complementado con MOPS 200 mM. Los cultivos fueron iniciados de placas de LB que contienen antibióticos mediante la práctica estándar (Sambrook y Russell, 2001) a 50 mi de medio de TB más el antibiótico apropiado como se indica y cultivados a fase estacionaria de la noche a la mañana a 30 °C con rotación a 250 rpm. Cinco mi de este cultivo fueron transferidos a 100 mi de medio de SM3 más 30 g/1 de glucosa, antibiótico e IPTG 1 mM (identificado como "sí" bajo la columna "Inducido") en matraces amortiguados de 250 mi por triplicado e incubados a 30°C, 250 rpm. Los matraces fueron desplazados a 37°C, 250 rpm después de 4 horas. Para monitorear el crecimiento celular y la producción de 3-HP mediante estos cultivos, se extrajeron muestras (2 mi) a 24 horas para mediciones de densidad óptica a 600 nm (OD60o, longitud de trayectoria de 1 cm) y aglomeradas mediante centrifugación a 14000 rpm durante 5 minutos y el sobrenadante recolectado para análisis de producción de 3-HP como se describe en "Análisis de cultivos en cuanto a producción de 3-HP" en la sección de Métodos Comunes. El titulo de 3-HP y la desviación estándar es expresado como g/1. El peso seco de célula (DCW) es calculado como 0.33 veces el valor de OD60o medido, en base a la DCW de referencia . según las determinaciones de OD6oo- Todos los datos son el promedio de cultivos por triplicado. Por propósitos de comparación, se calcula la proporción de producto a célula de los datos promediados en 24 horas y es expresada como gramos de 3-HP producidos por gramo de DCW. La productividad especifica es calculada a partir de la proporción de célula/producto obtenida durante las 20 horas de producción y expresada como gramos de 3-HP producidos por gramo de DCW por hora.
Tabla 38 Ejemplo 13B: Evaluación de la cepa BX3 240 con Adición de Carbonato La producción de 3-HP en BX3_240 de E. coli (elaborada mediante los métodos anteriores) fue evaluada a escala de 100 mi en medio de SM3 (sales mínimas) que tiene agregado carbonato de sodio. SM3 usado es descrito bajo la Sección de Métodos Comunes, al cual se agregan Na2C03 10 mM, 20 mM y 50 mM como tratamientos. Los cultivos fueron iniciados de placas de LB que contienen antibióticos mediante la práctica estándar (Sambrook y Russell, 2001) a 50 mi de medio de TB más los antibióticos apropiados kan y cat y pueden ser cultivados a fase estacionaria de la noche a la mañana a 30°C con rotación a 250 rpm. Cinco mi de este cultivo fueron transferidos a 100 mi de medio SM3 más 30 g/1 de glucosa, antibiótico, el carbonato de sodio indicado, 0.1% de extracto de levadura e IPTG 1 mM por triplicado en matraces amortiguados de 250 mi e incubados a 30 °C, 250 rpm. Los matraces fueron desplazados a 37 °C, 250 rpm después de 4 horas. Para monitorear el crecimiento celular y la producción de 3-HP mediante estos cultivos, se extrajeron muestras (2 mi) a 24, 48 y 60 horas para mediciones de densidad óptica a 600 nm {OD60o, longitud de trayectoria de 1 cm) y aglomeradas mediante centrifugación a 14000 rpm durante 5 minutos y el sobrenadante recolectado para análisis de producción de 3-HP como se describe en "Análisis de cultivos en cuanto a producción de 3-HP" en la Sección de Métodos Comunes. El titulo de 3-HP y desviación estándar es expresado como g/1. El peso seco de célula (DCW) es calculado como 0.33 veces el valor de OD6oo medido, en base al DCW de referencia según las determinaciones de ??&??· Todos los datos son el promedio de cultivos por triplicado. Por propósitos de comparación, la proporción de producto a célula es alculada a partir de los datos promediados en 60 horas y es expresada como gramos de 3-HP producido por gramo de DCW.
Los títulos de 3-HP fueron 0.32 ( +/- 0.03), 0.87 ( +/-0.10), 2.24 ( +/- 0.03), 4.15 ( +/- 0.27), 6.24 ( +/- 0.51), 7.50 (+/-?.55) y 8.03 ( +/-0.14) g/1 a 9, 11, 15, 19, 24, 48 y 60 horas, respectivamente. Las concentraciones de biomasa fueron 0.54 ( +/- 0.02), 0.79 ( +/- 0.03), 1.03 ( +/- 0.06), 1.18 (+/- 0.04), 1.20 (+/- 0.12), 1.74 (+/- 0.30) y 1.84 (+/-0.22) a 9, 11, 15, 19, 24, 48 y 60 horas, respectivamente. La proporción de producto a célula máxima fue de 4.6 g de 3-HP/g de DCW.
Ejemplo 14: Ejemplo general de modificación genética a una célula huésped (profético y no específico) .
Además de los ejemplos específicos anteriores, este ejemplo pretende describir un procedimiento no limitante a la modificación genética de un microorganismo seleccionado para introducir una secuencia de ácido nucleico de interés. Alternativas .y variaciones son provistos dentro de este ejemplo general. Los métodos de este ejemplo son conducidos para obtener una combinación de modificaciones genéticas deseadas en una especie de microorganismo seleccionada, tal como una combinación de modificaciones genéticas como se describe en secciones en la presente y sus equivalentes funcionales, tales como en otra especie bacteriana y otras especies de microorganismos.
Un gen u otro segmento de secuencia de ácido nucleico de interés es identificado en una especie particular (tal como E. coli como se describe en la presente) y se tiene una secuencia de ácido nucleico que comprende aquel gen o segmento.
En base en las secuencias de ácido nucleico en los extremos de o adyacentes a los extremos del segmento de interés, se preparan' cebadores de ácido nucleico 5' y 3' . Cada cebador está diseñado para tener una sección de superposición suficiente que se hibridiza con tales extremos o regiones adyacentes. Tales cebadores pueden incluir sitios de reconocimiento de enzima para digestión de restricción de inserción de transposasa que podrían ser usados para incorporación de vector subsecuente o inserción genómica. Estos sitios están diseñados comúnmente para estar hacia afuera de las secciones de superposición de hibridización . Numerosos servicios de contrato son conocidos que preparan secuencias de cebador sobre pedido (por ejemplo, Integrated DNA Technologies, Coralville, IA Estados Unidos de América) .
Una vez que los cebadores están diseñados y preparados, se lleva a cabo la reacción en cadena de polimerasa (PCR) para amplificar específicamente el segmento de interés deseado. Este método da como resultado múltiples copias de la región de interés separadas del genoma del microorganismo. El ADN del microorganismo, los cebadores y una polimerasa termofílica son combinados en una solución reguladora del pH con cationes de potasio y cationes divalentes (por ejemplo, Mg o Mn) y con cantidades suficientes de moléculas de desoxinucleósido trifosfato. Esta mezcla es expuesta a un régimen estándar de incrementos y disminuciones de temperatura. Sin embargo, las temperaturas, componentes, concentraciones y tiempos de ciclo pueden variar de acuerdo con la reacción de acuerdo con la longitud de la secuencia a ser copiada, aproximaciones de temperatura de recocido y otros factores conocidos o fácilmente aprendidos por medio de experimentación de rutina por el experimentado en el arte.
En una modalidad alternativa, el segmento de interés puede ser sintetizado, tal como por un proveedor1 comercial y preparado vía PCR, en lugar de obtención de un microorganismo u otra natural fuente de AD .
Las secuencias de ácido nucleico son luego purificadas y separadas, tal como sobre un gel de agarosa vía electroforesis . Opcionalmente, una vez que la región es purificada puede ser validada por medio de metodología de secuencia de ADN estándar y puede ser introducida a un vector. Cualquiera de un número de vectores puede ser usado, que comprenden en general marcadores conocidos para aquellos experimentados en el arte y metodologías estándar son empleadas sistemáticamente para tal introducción. Sistemas de vector usados comúnmente son pSMART (Lucigen, Middleton, WI) , EXPRESSION SYSTEM de E . coli de pET (Stratagene, La Jolla, CA) , pSC-B StrataClone Vector (Stratagene, La Jolla, CA) , vectores pRANGER-BTB (Lucigen, Middleton, WI), y vector TOPO (Invitrogen Corp, Carlsbad, CA, Estados Unidos de América) . Similarmente, el vector es luego introducido a cualquiera de un número de células huésped. Células huésped comúnmente usadas son 10G de E. coli (Lucigen, Middleton, WI), células competentes de StrataClone 10GF' (Lucigen, Middleton, WI), células competentes de StrataClone (Stratagene, La Jolla, CA) , BL21 de E. coli, BW25113 de E. coli, y K12 MG1655 de E. coli. Algunos de estos vectores poseen promotores, tales como promotores inducibles, adyacentes a la región a la cual la secuencia de interés es insertada (tal como a un sitio de clonación múltiple) , mientras que otros vectores, tales como vectores pSMART (Lucigen, Middleton, WI), son provistos sin promotores y con extremos embotados desfosforilados . El cultivo de tales células cargadas de plásmido permite la replicación de plásmido y asi la replicación del segmento de interés, que frecuentemente corresponde a la expresión del segmento de interés.
Varios sistemas de vector comprenden un marcador seleccionable , tal como un gen expresable que' codifica una proteina necesaria para el crecimiento o supervivencia bajo condiciones definidas. Marcadores seleccionables comunes contenidos en secuencias de vector de cadena fundamental incluyen genes que codifican por una o más proteínas requeridas para resistencia a antibiótico también como genes requeridos para complementar deficiencias auxotrópicas o suministrar nutrientes críticos no presentes o disponibles en el medio de cultivo particular. Los vectores también comprenden un sistema de replicación apropiado para una célula huésped de interés.
Los plásmidos que contienen el segmento de interés pueden luego ser aislados mediante métodos de rutina y están disponibles para introducción a otras células huésped de microorganismos de interés. Varios métodos de introducción son conocidos en el arte y pueden incluir introducción de vector o integración genómica. En varias modalidades alternativas, el segmento de ADN de interés puede ser separado de otro ADN de plásmido si el primero será introducido a una célula huésped de interés por medios diferentes a tal plásmido.
En tanto que las etapas del ejemplo profético general involucran el uso de plásmidos, otros vectores conocidos en el arte pueden ser usados en lugar de esto. Estos incluyen cósmidos, virus (por ejemplo, bacteriófago, virus de animales y virus de plantas) , y cromosomas artificiales (por ejemplo, cromosomas artificiales de levadura (YAC) y cromosomas artificiales de bacterias (BAC) ) .
Las células huésped a las cuales el segmento de interés ' es introducido pueden ser evaluadas en cuanto a desempeño en cuanto a una etapa enzimática particular y/o tolerancia o bio-producción de un compuesto químico de interés. Las selecciones de efectuar mejor células huésped modificadas genéticamente se pueden hacer, seleccionando en cuanto al desempeño global, tolerancia o producción o acumulación del químico de interés.
Se notará que este procedimiento puede incorporar una secuencia de ácido nucleico para un solo gen (u otro segmento de secuencia de ácido nucleico de interés) o múltiples genes (bajo el control de promotores separados o un solo promotor) y el procedimiento puede ser repetido para crear las secuencias de ácido nucleico heterologas deseadas en vectores de expresión, que son luego suministradas a un microorganismo seleccionado para tener, por ejemplo un complemento deseado de funcionalidad de etapa de conversión enzimática para cualquiera de las rutas metabolicas reveladas en la presente. Sin embargo, se notará que aunque muchos procedimientos dependen de la expresión via transcripción de toda o parte de la secuencia de interés y luego traducción del mARN transcrito para producir un polipéptido, tal como una enzima, ciertas secuencias de interés pueden ejercer un efecto por medios diferentes que tal expresión.
Los métodos de laboratorio específicos usados para estos ' procedimientos son bien conocidos en el arte y se pueden encontrar en varias referencias conocidas para aquellos experimentados en el arte, tales como Sambrook y Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition' 2001 (volumes 1-3) , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (de aquí en adelante en la presente, Sambrook y Russell, 2001) .
Como una alternativa a lo anterior, otras modificaciones genéticas también se pueden llevar a la práctica, tal como una cancelación de una secuencia de ácido nucleico del genoma de la célula huésped. Un método no limitante para obtener esto es mediante el uso de recombinación de Red/ET, conocido para aquellos de habilidad ordinaria en el arte y descrito en las patentes estadounidenses Nos. 6,355,412 y 6,509,156, expedida a Stewart et al. é incorporadas por referencia en la presente por sus enseñanzas de este método. El material y kits para tal método están disponibles de Gene Bridges (Gene Bridges GmbH, Dresden, Alemania, <<www.genebridges.com»), y el método puede proceder al seguir las instrucciones del fabricante. La cancelación apuntada del ADN genómico se puede llevar a la práctica para alterar el metabolismo de las células huésped para reducir o eliminar la producción de productos metabólicos indeseables. Esto puede ser usado en combinación con otras modificaciones genéticas tal como se describe en la presente en este ejemplo general.
Ejemplo 14A. Utilización de sacarosa como la materia prima de alimentación para la producción de 3-HP y otros productos (Parcial Profético) Cepas de laboratorio e industriales comunes de E. coli, tales como las cepas descritas en la presente, no son aptas de utilizar sacarosa como la única fuente de carbono, aunque esta propiedad es encontrada en un número de cepas silvestres, incluyendo cepas de E. coli patógenas. La sacarosa y materias primas de alimentación que contienen sacarosa, tales como melasas, son abundantes y frecuentemente usadas como materias primas de alimentación para la producción mediante fermentación microbiana de ácidos orgánicos, aminoácidos, vitaminas y otros productos. Asi, derivados adicionales de la cepa que produce 3-HP que son aptas de utilizar sacarosa expenderían el intervalo de materias primas de alimentación que pueden ser utilizadas para producir 3-HP.
Varios sistemas de absorción y metabolismo de sacarosa son conocidos en el arte (por ejemplo, patente estadounidense No. 6,960,455), incorporada por referencia por tales enseñanzas. Se describe la construcción de cepas de E. coli que albergan los genes de esc que confieren la habilidad para utilizar sacarosa vía un sistema sin fosfotransferasa, en donde los genes de esc constituyen cscA, que codifica una sacarosa hidrolasa, cscB, que codifica una sacarosa permeasa, cscK, que codifica una fructocinasa y cscR, que codifica un represor. Las secuencias de estos genes están anotadas en la base de datos de NCBI como No. de acceso X81461 AF473544. Para permitir la expresión eficiente utilizando codones que son altamente abundantes en genes de E. coli, un operon que contiene cscB, cscK y cscA fue diseñado y sintetizado utilizando los servicios de un proveedor de ADN sintético comercial (DNA 2.0, Menlo Park, CA) . Las secuencias de aminoácidos de los genes son resumidas como, respectivamente, cscB - SEQ. ID. No. 888; cscA - SEQ. ID. No. 889; csck - SEQ. ID. No. 890. El operón sintético consistía de 60 pares de bases de la región del genoma de E. coli inmediatamente 5' (corriente arriba) del gen de adhE un promotor fuerte de consenso para impulsar la expresión de los genes de esc, las regiones de codificación para cscB, cscK y cscA con regiones intergénicas cortas que contienen sitios de enlace de ribosoma pero no promotores y 60 pares de bases inmediatamente 3' (corriente abajo) del gen de adhE. Los segmentos homólogos a secuencias que flanquean el gen de adhE serán usados para apuntar la inserción de los genes de operón de esc al cromosoma de E. coli, con la cancelación concomitante de adhE. La secuencia de nucleótidos de toda la construcción sintética es mostrada como SEQ. ID. No. 891. El operon de esc sintético es construido en el plásmido pJ214 (DNA 2.0, Menlo Park, CA) que provee un origen de replicación derivado del plásmido. pl5A y un gen que confiere resistencia a ampicilina. Este plásmido es denotado como pSUCR. Una célula huésped apropiada, tal como la cepa BX_595 de E. coli, es transformada simultáneamente con pSUCR y con el plásmido pTrc_kan_mcr u otro plásmido apropiado y las cepas transformadas seleccionadas sobre placas . de medio de LB placas que contienen ampicilina y kanamicina . Los transformantes que portan ambos plásmidos son cultivados y evaluados en cuanto a la producción de 3-HP en matraces agitados como se describe en el Ejemplo 13, excepto que la glucosa en el medio de S 3 es reemplazada con una concentración igual de sacarosa.
Los genes que confieren funciones para habilitar la utilización de sacarosa por E. coli pueden también ser obtenidos del aislado natural pUR400 (Cowan, P.J., et al. J. Bacteriol. 173:7464-7470, 1991) que porta genes para el sistema de fosfotransferasa de absorción de carbohidrato dependiente de fosfoenolpiruvato (PTS) . Estos genes consisten de scrA, que codifica el componente de enzima II del complejo de transporte de PTS, scrB, que codifica la sacarosa-6 fosfato hidrolasa, scrK, que codifica fructocinasa y scrY, que codifica una porina. Estos genes pueden ser aislados o sintetizados como se describe anteriormente, incorporados sobre un plásmido y transformados a una célula huésped apropiada, tal como la cepa de BX_595 de E. coli, simultáneamente con el plásmido pTrc_kan_mcr u otro plásmido apropiado y las cepas transformadas seleccionadas en placas de medio de LB que contiene los antibióticos apropiados. Los transformantes que portan ambos plásmidos son cultivados y evaluados en cuanto a la producción de 3-HP en matraces agitados como se describe en el Ejemplo 13, excepto que la glucosa en el medio de SM3 es reemplazada con una concentración igual de sacarosa.
Ejemplo 14B: Construcción y Evaluación de Cepas Adicionales (Profético) Otras cepas son producidas que comprenden varias combinaciones de los elementos genéticos (adiciones, cancelaciones y modificaciones) descritos en la presente son evaluadas y usadas para la producción de 3-HP, incluyendo producción a escala comercial. La siguiente tabla ilustra un número de estas cepas.
Adicionalmente, una cancelación adicional u otra modificación para reducir la actividad enzimática de la 2-ceto-3-desoxigluconato 6-fosfato aldolasa y 2-ceto-4-hidroxiglutarato aldolasa y oxaloacetato decarboxilasa (eda en E. coli) multifuncional puede ser provista a varias cepas. Además de los último, en varias modalidades combinadas con tal reducción de actividad enzimática de 2-ceto-3-desoxigluconato 6-fosfato aldolasa y 2-ceto-4-hidroxiglutarato aldolasa y oxaloacetato decarboxilasa (eda en E. coli) multifuncional , modificaciones genéticas adicionales es pueden hacer para incrementar un transportador de glucosa (por ejemplo, galP en E. coli) y/o disminuir la actividad de una o más de la proteína fosforilable de histidilo estable térmicamente (de PTS) (ptsH (HPr) en E. coli) , proteína de transferencia de fosforilo (de PTS) (ptsl en E. coli) y la cadena de polipéptido de PTS (Crr en E. coli) .
Estas cepas son evaluadas ya sea en matraces o fermentadores, utilizando los métodos descritos anteriormente. También, se notará que después de una extensión de evaluación dada de cepas que comprenden plásmidos introducidos, los elementos genéticos en los plásmidos aislados pueden ser introducidos al genoma del microorganismo, tal como mediante ios métodos descritos en la presente también como otros métodos conocidos para aquellos experimentados en el arte.
Tabla 39 F-, A(araD-araB)567, AlacZ4787(::rrnB-3), LAM-, rph-1, A(rhaD- rhaB)568, hsd 514, AldhA::frt, ApflB::frt, AmgsA::frt, BX3P. .004 1) ptrc-mcr ApoxB::frt, Apta-ack::frt, fablts (S241F)-zeoR T5 aceEF, T5- pntAB, T5-udhA, reí A, spoT F-, A(araD-araB)567, AlacZ4787(::rrnB-3), LAM-, rph-1, A(rhaD- rhaB)568, hsdR514, AldhA::frt, ApflB::frt, AmgsA::frt, 1) ptrc-mcr, BX3P. .005 ?????-frt, Apta-ack::frt, fablts (S241F)-zeoR T5 aceEF, T5- 2) accABCD pntAB, T5-udhA, relA, spoT F-, A(araD-araB)567, AlacZ4787(::rrnB-3), LAM-, rph-1, A(rhaD- 1) ptrc-mcr, rhaB)568, hsdR514, AldhA::frt, ApflB::frt, AmgsA::frt, BX3P. .006 2) accABCD- ApoxB::frt, Apta-ack::frt, fablts (S241F)-zeoR T5 aceEF, T5- udhA pntAB, T5-udhA, relA, spoT F-, A(araD-araB)567, AlacZ4787(::rrnB-3), LAM-, rph-1, A(rhaD- rhaB)568, hsdR514, AldhA::frt, ApflB::frt, AmgsA::frt, BX3P. .007 1) ptrc-mcr ApoxB::frt, Apta-ack::frt, fablts (S241F)-zeoR T5 aceEF, del- arcA:kan F-, A(araD-araB)567, AlacZ4787(::rrnB-3), LAM-, rph-1, A(rhaD- rhaB)568, hsdR514, AldhA::frt, ApflB::frt, AmgsA::frt, 1) ptrc-mcr, BX3P. .008 ApoxB::frt, Apta-ack::frt, fablts (S241F)-zeoR T5 aceEF, del- 2) accABCD arcA:kan F-, A(araD-araB)567, AlacZ4787(::rrnB-3), LAM-, rph-1, A(rhaD- 1) ptrc-mcr, rhaB)568, hsdR514, AldhA::frt, ApflB::frt, AmgsA::frt, BX3P. .009 2) accABCD- ApoxB::frt, Apta-ack::frt, fablts (S241F)-zeoR T5 aceEF, del- udhA arcA:kan Ejemplo 15: Ejemplo Profético de Producción de 3-HP Un inoculo de un microorganismo modificado genéticamente que posee una ruta de producción de 3-HP y otras modificaciones genéticas como se describe anteriormente es provisto a un recipiente de cultivo al cual se provee un medio liquido que comprende nutrientes a concentraciones suficientes para el periodo de cultivo de bio-proceso deseado .
El celda final (que comprende células microorganismos, medio extensamente "agotado" y 3-HP, el último a concentraciones, en varias modalidades, que exceden de 1, 2, 5, 10, 30, 50, 75 ó 100 gramos/litro) es recolectado y sometido a etapas de separación y purificación de tal manera que se obtiene 3-HP en un estado relativamente purificado. Las etapas de separación y purificación pueden proceder mediante cualquiera de un número de procedimientos que combinan varias metodologías, que pueden incluir centrifugación, concentración, filtración, evaporación a presión reducida, separación de fases líquido/liquido (incluyendo después de la formación de un complejo de poliamina-3-??, tal como con una amina terciaria tal como CAS#68814-95-9, Alamine® 336, una triC8-io alquil amina (Cognis, Cincinnati, OH o Henkel Corp.), membranas, destilación y/u otras metodologías citadas en esta solicitud de patente, incorporado en la presente. Principios y detalles de etapas de separación y purificación estándar son conocidos en el arte, por ejemplo en "Bioseparations Science and Engineering" , Roger G. Harrison et al., Oxford University Press (2003), and Membrane Separations in the Recovery of Biofuels and Biochemicals - An Update Review, Stephen A. Leeper, pp. 99-194, in Separation and Purification Technology, Norman N. Li and Joseph M. Calo, Eds., Marcel Dekker (1992), incorporadas en la presente por tales enseñanzas. La combinación particular de metodologías es seleccionada de aquellas descritas en la presente y en parte está basada en la concentración de 3-HP y otros componentes del caldo final.
Ejemplo 16: Ejemplo profético de conversión de 3-HP a químicos corriente especificados. 3-HP, tal como en el ejemplo 13, es convertido a cualquiera de una o más propiolactonas vía una reacción de esterificación interna de formación de anillo (eliminando una molécula de agua) etil-3-?? vía esterificación con. etanol, ácido malónico vía una reacción de oxidación y 1,3 propandiol vía una reacción de reducción.
Estas conversiones proceden tal como mediante reacciones de síntesis orgánicas conocidas para aquellos experimentados en el arte. Cualquier de estas conversiones de 3-HP pueden proceder vía una reacción de síntesis química bajo condiciones controladas para obtener una alta proporción de conversión y rendimiento con formación de producto secundario aceptablemente baja.
Ejemplo 17 : Ejemplo profético de producción de ácido Bio-acrílico a partir de 3-HP- 3-HP es obtenido en estado relativamente puro a partir de un evento de bio-producción microbiana, tal como se describe en el ejemplo 15. El 3-HP es convertido a ácido acrilico mediante una reacción de deshidratación, tal como mediante calentamiento bajo vacio en presencia de un catalizador. Más en particular, una solución acuosa de 3-HP como un ácido o sal es agregada a un matraz giratorio y un catalizador seleccionado de la tabla 8 incorporado en este •ejemplo de la Sección XI anterior.
La temperatura es elevada a entre 100 y 190°C en tanto que esta bajo rotación y vacio, con vapores recolectados en un condensador. El ácido acrilico es recolectado como condensado y cuantificado tal como mediante procedimientos analíticos descritos en la presente. Varias combinaciones de parámetro, tales como temperatura, proporción de cambio de temperatura, pureza de la solución de 3-HP derivada del evento de bio-producción microbiana, presión reducida (y proporción de cambio de presión) y tipo y concentración de 1 o mas catalizadores son evaluados con objetivos de alta proporción de conversión que en reacciones secundarias indeseables, que podrían, en algunos escenarios de producción, incluir polimerización indeseable de ácido acrilico.
Ejemplo 18: Ejemplo profético alternativo de producción de ácido bio-acrilico a partir de 3-HP.
El 3-HP es obtenido en un estado relativamente puro a partir de un evento de bio-producción microbiano, tal como se describe en el ejemplo 15. El 3-HP es convertido a ácido acrilico mediante una reacción de deshidratación, tal como mediante calentamiento bajo vacio en presencia- de un catalizador, sin embargo, bajo condiciones que favorecen una polimerización controlada de ácido acrilico después de su formación a partir de 3-HP. Varias combinaciones de parámetros tales como temperatura, proporción de cambio de temperatura, incluyendo remoción del calor generado durante la reacción, pureza de la solución de 3-HP derivada del evento de bio-producción microbiano, presión reducida (y proporción de cambio de presión) y tipo y consideración de uno o más catalizadores y/o exposición a la luz, son evaluados con objetivos de alta proporción de conversión sin reacciones secundarias indeseables. El ácido acrilico asi formado puede ser separado y purificado mediante métodos conocidos en el arte, tal como aquellos métodos relevados supra .
Ejemplo 19: Ejemplo profético de conversiones de ácido acrílico a productos corriente abajo.
El ácido acrílico del ejemplo 17 es convertido adicionalmente a uno (o más) de los productos corriente abajo como se describen en la presente. Por ejemplo, el método de conversión es esterificación con metanol para producir acrilato de metilo u otras esterificaciones con otros alcoholes para otros ésteres de acrilato, amidación para producir acrilamida, adición de una porción de nitrilo para producir acrilonitrilo . Otras adiciones se hacen como sea deseado para obtener compuestos corriente abajo sustituido como se describe en la presente.
Ejemplo 20: Ejemplo profético de conversión de ácido acrílico a ácido poliacrilico .
El ácido acrílico del ejemplo 17 es convertido adicionalmente a un ácido poliacrilico mediante calentamiento del ácido acrílico en una solución acuosa e inicio de una reacción de polimerización al exponer la solución a luz y después de esto controlar la temperatura y velocidad de reacción al remover el calor de la polimerización.
Los métodos y enseñanzas específicos de la especificación y/o referencia citada que son incorporadas por referencia, pueden ser incorporados a los ejemplos anteriores. También, la producción de 3-HP o uno de sus productos corriente ' abajo tal como se describe en la presente, puede llegar a por lo menos 1, por lo menos 2, por lo menos 5, por lo menos 10, por lo menos 20, por lo menos 30, por lo menos " 40 y, por lo menos 50 g/1 de titulo en varias modalidades.
Ejemplo 21: Separación y extracción reactiva de 3-HP del Caldo de fermentación.
Un Caldo de fermentación obtenido de un termentador de 10 L en la conclusión de un experimento de fermentación fue calentado a 60°C por una hora como una etapa de exterminio de microorganismos, luego ajustado a aproximadamente 100 g por litro de 3-HP (producido mediante método descrito en la Sección de Métodos Comunes, Subsección Illa) , y ajustado en el pH a aproximadamente 7.0 con sulfato de amonio. Se agrego cloruro de calcio a una concentración de 1 M como floculante para alcanzar una concentración final de aproximadamente 8.2 g/1. después de esto, el pH fue ajustado a un pH de aproximadamente 2.0 utilizando ácido sulfúrico. Después de esto, el volumen de ese caldo de fermentación modificado fue centrifugado a aproximadamente 3,200 g por 5 minutos para producir un caldo clarificado y una pelotilla que fue descartada .
Porciones de caldo clarificado fueron luego sometidas a extracción reactiva mediante mezcla con una fase no polar de amina terciaria comprende varias co-solventes . Después de la mezcla, se permite que las fases acuosas y de amina no polares se separen y la fase no polar de amina fue removida de la fase acuosa, que fue sometida a análisis en cuanto a concentración de 3-HP mediante HPLC (Véase métodos en la Sección de Métodos Comunes). Las aminas incluían la Alamine 336, descrita anteriormente y tripentilamina. La Tabla 40 provee un resumen de la eficiencia de extracción de un solo paso a las respectivas soluciones de fase no polar de amina, cada una calculada respectivamente en base a la diferencia entre el 3-HP de partida y la porción y el 3-HP en el refinado (fase acuosa después de la extracción).
Tabla 40 Se ¦ noto que hubo sustancialmente mas formación de emulsión con la Alamine 336 y la separación de fases fue mas lenta que con los tratamientos de tripentilamina . No obstante, ambas de estas aminas terciarias demostraron que el 3-HP se extraería de la fase acuosa a la fase no polar (esto es, la amina terciaria con co-solvente) . Los co-solventes usados en este ejemplo no pretenden ser limitantes; otros co-solventes pueden ser considerados, por ejemplo pentanol, hexanol, heptanol, octanol, nonanol, decanol . También se notara que el hexano fue probado como co-solvente con tripentilamina pero los datos no fueron considerados validos ya que esta muestra provoco un desplazamiento máximo en el análisis de HPLC.
Además, como se describe en cualquier parte en esta solicitud y como es conocido en el arte, hay otros procedimientos para la separación, extracción y purificación de 3-HP de un caldo de fermentación. Asi, este ejemplo no pretende ser limitante.
Un ejemplo de recuperación de 3-HP de la solución de amina terciaria de fase no polar mediante retro extracción es provisto en el ejemplo 22.
Ejemplo 22: Deshidxatación de 3-HP a ácido acrilico con catalizador ácido.
Aproximadamente 15 mi de una solución acuosa que comprende aproximadamente 350 g de 3-HP por titulo (producido mediante el método descrito en la Sección de Métodos Comunes, Subsección Illa) fueron combinados en un matraz con. aproximadamente 15 mi de ácido sulfúrico concentrado. El matraz fue anexado a un aparato evaporador giratorio (Rotovapor Modelo R-210, BUCHI Labortechnik AG, Suiza), calentado en un baño de calentamiento (BUCCHI, Modelo B-491) a 80°C bajo presión reducida (10 a 20 mbar) , y el condensado fue recolectado debajo de un aparato de condensación puesto en operación con agua enfriada como refrigerante. Después de aproximadamente 5 horas, el condensado fue recolectado su volumen fue medido y una alícuota presentada para el análisis de HPLC (véase Sección de Métodos Comunes) . Una alícuota de la mezcla de reacción en el matraz también fue sometida para análisis de HPLC. El análisis de HPLC indico que aproximadamente 24 g por litro de ácido acrilico que obtuvieron en el condensado, mientras que aproximadamente 4.5 g por litro permanecieron en la mezcla del matraz. Asi, se mostró que 3-HP forma ácido acrilico bajo estas condiciones. Este ejemplo no pretende ser limitante.
Ejemplo 23: Ejemplo profético de conversión de ácido acrilico a ácido poliacrilico .
El ácido acrilico, tal como aquel provisto en el ejemplo 22, es convertido adicionalmente a un ácido poliacrilico mediante tratamiento del ácido acrilico en una solución acuosa e iniciar una reacción de polimerización por radicales libres al exponer la solución a luz y después de esto controlar la temperatura y velocidad de reacción al remover el calor de polimerización.
Se utiliza la polimerización por lotes, en donde el ácido acrilico es disuelto en agua a una concentración de aproximadamente 50% en peso. La solución monomérica es desoxigenada mediante burbujeo de hidrogeno a través de la solución. Un iniciador de radicales libres, tal como un peróxido orgánico que es agregado opcionalmente (para ayudar al inicio vía la fuente de luz) la temperatura es traída a aproximadamente 60°C para iniciar la polimerización.
La masa molecular y distribución de masa molecular del polímero son medidas. Opcionalmente, otras propiedades del polímero incluyendo densidad, viscosidad, temperatura de fusión y temperatura de transición de vidrio son determinadas .
Los métodos y enseñanzas específicos de la especificación y/o referencias citadas que son incorporadas por referencia, pueden ser incorporados a los ejemplos anteriores. También, la producción de 3-HP o uno de sus productos corriente abajo, tal como se ¦ describe en la presente, puede llegar a por lo menos 1, por lo menos 2, por lo menos 5, por lo menos 10, por lo menos 20, por lo menos 30, por lo menos 40 y por lo menos 50 g/1 de titulo en varias modalidades.
Ejemplo 24: Ejemplo profético de polimerización global de ácido acrilico a ácido poliacrilico .
El ácido acrilico tal como aquel provisto en el ejemplo 22, es convertido adicionalmente a ácido poliacrilico mediante polimerización global. El monómero de ácido acrilico, iniciadores solubles en monómero y base neutralizante son combinados en un reactor de polimerización. La polimerización es iniciada y la temperatura es controlada para obtener un nivel de conversión deseado. Los iniciadores son bien conocidos en el arte e incluyen un intervalo de peróxidos orgánicos y otros compuestos, tal como se discute anteriormente. El ácido, acrilico o ácido poliacrilico es neutralizado por lo menos parcialmente con una base tal como hidróxido de sodio.
La masa molecular y distribución de masa molecular del polímero son medidas. Opcionalmente, otras propiedades del polímero incluyendo densidad, viscosidad, temperatura de fusión y temperatura de transición vitria son determinadas.
El ácido poliacrilico producido esta propuesto para uso como polímero superabsorbente como un absorbente para agua y soluciones acuosas para pañales, productos de incontinencia para adultos, productos de higiene femenina y productos del consumidor similares, también como para usos posibles en la agricultura, horticultura y otros campos.
Ejemplo 25: Ejemplo profético de producción de un polímero superabsorbente .
El ácido acrilico, tal como aquel provisto en el ejemplo 22, es convertido adicionalmente a un ácido poliacrilico superabsorbente mediante polimerización en solución. Una solución acuosa de monómero de ácido acrilico (a aproximadamente 25-30 % en peso), iniciadores, base neutralizante, antioxidantes, agentes de reticulación (tal como triacrilato de trimetilolpropano) y opcionalmente otros aditivos son combinados en un reactor de polimerización y la polimerización es iniciada. Las bases que pueden ser usadas para neutralización incluye pero no están limitadas a carbonata de sodio, hidróxido de sodio e hidróxido de potasio .
El contenido de reactores desoxigenado por 60 minutos. Se permite que la temperatura de la reacción de polimerización se eleve a un nivel deseado inicial. Luego el reactor es mantenido a una temperatura de reacción deseada por un periodo de tiempo necesario para que se tenga la conversión del monómero deseado. El producto de reacción resultante esta en forma de un gel de alta viscosidad. Luego, el producto de reacción semejante a gel de alta viscosidad es procesado a una película o hebra, secado y molido en partículas que son tamizadas o clasificadas en varias fracciones de tamaño de partículas. Después que el polímero es secado y molido a un tamaño de partícula final, es analizado en cuanto a ácido acrílico residual y otros químicos, capacidad de centrifuga extraíble, módulos de esfuerzo cortante y absorción bajo carga. Otras propiedades de polímero pueden ser medidas incluyendo masa molecular, distribución de masa molecular, densidad, viscosidad, temperatura de fusión y temperatura de transición vitria. Tratamientos de superficie pueden ser efectuadas al agregar un co-monómero de reticulación a la superficie de las partículas poliméricas.
El ácido poliacrílico producido esta propuesto para uso como polímero superabsorbente, como absorbente para agua y soluciones acuosas para pañales, productos de incontinencia para adultos, productos de higiene femenina y productos del consumidor similares, también como para usos posibles en agricultura, horticultura y otros campos.
Ejemplo 26: Ejemplo profético alternativo de producción de un polímero superabsorbente .
El ácido acrílico, tal como aquel provisto en el ejemplo 22 es convertido adicionalmente a un ácido poliacrílico superabsorbente mediante polimerización en suspensión. Una fase acuosa que comprende agua, monómero de ácido acrilico y base neutralizante es combinada con una fase de aceite que comprende un líquido hidrofóbico inerte y opcionalmente un agente de suspensión es provisto adicionalmente. La fase acuosa y la fase de aceite se ponen en contacto bajo condiciones (incluyendo una temperatura de aproximadamente 75°C) de tal manera que forman gotas de monómeros finas. La polimerización es iniciada y las macropartículas polimerizadas de ácido poliacrílico son recuperadas de la suspensión utilizando una centrifuga.
El ácido poliacrílico es luego secado y molido en partículas que son tamizadas o clasificadas en varias fracciones de tamaño de partícula. Después que el polímero es secado y molido al tamaño de partícula final, es analizado en cuanto a ácido acrilico residual y otros químicos, capacidad de centrifuga extraíble, modulo de esfuerzo cortante y absorción bajo carga. Otras propiedades del polímero pueden ser medidas, incluyendo masa molecular, distribución de masa molecular, densidad, viscosidad, temperatura de fusión y temperatura de transición vitria.
El ácido poliacrílico producido esta propuesto para uso como polímero superabsorbente, como absorbente para agua y soluciones acuosas para pañales, productos para incontinencia de adultos, productos de higiene femenina y productos del consumidor similares, también como para usos posibles en agricultura, horticultura y otros campos.
Ejemplo 27: Ejemplo profético de conversión de ácido acrilico a acrilato de metilo .
El ácido acrilico, tal como aquel provisto en el ejemplo 22, es convertido a acrilato de metilo mediante esterificación catalizada directa. El ácido acrilico es puesto en contacto con metanol y la mezcla es calentada a aproximadamente 50°C en presencia de un catalizador de esterificación . El agua formada durante la esterificación es removida de la mezcla de reacción mediante destilación. El avance de la reacción de esterificación es monitoreada al medir la concentración del ácido acrilico y/o metanol en la mezcla.
Reactivos con otros monómeros e impartiendo resistencia y durabilidad a los co-polimeros acrilicos, el acrilato de metilo es un monómero útil para recubrimientos para piel, papel, cubierta de piso y textiles. Resinas que contienen acrilato de metilo pueden ser formulados como elastómeros, adhesivos, espesantes, surfactantes ampotericos, fibras y plásticos. El acrilato de metilo es también usado en la producción de monómeros usados para fabricar materiales para tratamiento de agua y en síntesis química.
Ejemplo 28: Ejemplo profético de conversión de ácido acrilico a acrilato de etilo .
El ácido acrilico, tal como aquel provisto en el ejemplo 19, es convertido a acrilato de etilo, mediante esterificación catalizada directa. El ácido acrilico es puesto en contacto con etanol y la mezcla es calentada aproximadamente 75°C en presencia de un catalizador de esterificación . El agua formada durante la esterificación es removida de la mezcla de reacción mediante destilación. El avance de la reacción de esterificación es monitoreada al medir la concentración de ácido acrilico y/o etanol en la mezcla .
El acrilato de etilo es usado en la producción de homopolímeros y co-polímeros para uso en textiles, adhesivos y selladores. El acrilato de etilo es también usado en la producción de co-polimeros, por ejemplo ácido acrilico y sus sales, ésteres, amidas, metacrilato, acrilonitrilo, maleatos, acetatos de vinilo, cloruro de vinilo, cloruro de vinilideno, estireno, butadieno y poliésteres insaturados. Además, el acrilato de etilo es usado en síntesis química.
Ejemplo 29: Ejemplo profético de conversión de ácido acrilico a acrilato de butilo .
El ácido acrilico, tal como aquel provisto en el Ejemplo 22, es convertido a acrilato de butilo mediante esterificación catalizada directa. El ácido acrilico es puesto en contacto con 1-butanol y la mezcla es calentada a aproximadamente 100°C en presencia de un catalizador de esterificación . El agua formada durante la esterificación es removida de la mezcla de reacción mediante destilación. El avance de la reacción de esterificación es monitoreado al medir la concentración del ácido acrilico y/o etanol en la mezcla .
El acrilato de butilo es usado en la producción de homopolímeros y co-polímeros para uso en pinturas industriales y arquitectónicas a base de agua, esmaltes, adhesivos, calafateos y selladores y terminados textiles, utilizando homopolímeros y co-polímeros con metacrilato, acrilonitrilo, maleatos, acetato de vinilo, cloruro de vinilo, cloruro de vinilideno, estireno, butadieno o poliésteres insaturados.
Ejemplo 30: Ejemplo profético de conversión de ácido acrilico a acrilato de etilhexilo.
El ácido acrilico, tal como aquel provisto en el ejemplo 22, es convertido a acrilato de etilhexilo mediante esterificación catalizada directa. El ácido acrilico ¦ es puesto en contacto 2-etil-l-hexanol y la mezcla es calentada a aproximadamente 120°C en presencia de un catalizador de esterificación . El agua formada durante la esterificación es movida de la mezcla de reacción durante la destilación. El avance de la reacción de esterificación es monitoreado al medir la concentración de ácido acrilico y/o etanol en la mezcla .
El acrilato de etilhexilo es usado en la producción de homopolimeros y co-polímeros para calafateos, recubrimientos y adhesivos sensibles a la presión, terminado de piel y en recubrimientos textiles y de papel.
Ejemplo 31: Ejemplo profético de conversión de acrilatos a productos finales, incluyendo productos del consumidor.
Uno o más acrilatos tal como son provistos en los ejemplos 24-27 son convertidos adicionalmente a uno o más de adhesivos, recubrimientos de superficie, recubrimientos a base de agua, pinturas, tintas, terminados de piel, recubrimientos de papel, recubrimientos de película, plastificantes o precursores para floculantes. Tales conversiones a productos finales emplean métodos conocidos en el arte.
Ejemplo 32: Ejemplo profético de manufactura de pinturas a base de acrilico.
Una dispersión acuosa que comprende por lo menos un copolímero insoluble en agua en partículas que incluye uno o más de ácido acrilico, acrilato de etilo, acrilato de metilo, acrilato de 2-etilhexilo, acrilato de butilo, acrilato de laurilo u otro copolímero obtenido del ácido acrilico convertido de 3-HP producido microbianamente, como se describe en cualquier parte en la presente, es obtenida al mezclar tales componentes conjuntamente bajo suficiente agitación para formar una dispersión estable de los copolímeros. Los copolímeros tiene un peso molecular promedio que es de por lo menos 50,000 con las partículas de copolímero que tienen diámetros en el intervalo de 0.5 a 3.0 mieras. Otros componentes en la dispersión acuosa pueden incluir pigmentos, relleno (por ejemplo, carbonato de calcio silicato de aluminio), solvente (por ejemplo, acetona, benzol, alcoholes, etc., aunque, estos no son encontrados en ciertas pinturas sin VOC) , espesante y aditivos adicionales dependiendo de las condiciones, aplicación, superficies propuestas, etc.
En variaciones de tales pinturas a base de acrilico, copolimeros además de los polímeros a base de acrilico pueden ser agregados. Tales otros copolimeros pueden incluir pero no están limitados a acetato de vinilo, fluoruro de yinilo, cloruro de vinilideno, ácido metacrílico, ácido itacónico, ácido maleico y estireno.
Ejemplo 33: Ejemplo profético de conversión de 3-HP a 1,3-Propandiol .
El ácido acrilico, tal como aquel provisto en el ejemplo 22, es convertido a 1 , 3-propandiol . El 3-HP es hidrogenado en presencia de un catalizador de rutenio sin soportar, en una fase líquida, para preparar 1 , 3-propandiol . La fase líquida incluye agua y ciclohexano. La hidrogenación se lleva a cabo continuamente en un reactor de tanque agitado a una temperatura de aproximadamente 150°C y una presión de aproximadamente 1000 libras póliza/pulgada cuadrada. EL avance de la hidrogenación es monitoreado al medir la concentración de 3-HP y/o hidrógeno en el reactor Ejemplo 34: Ejemplo profético de conversión de 3-HP a ácido malónico .
El- ácido acrilico, tal como aquel provisto en el ejemplo 22, es convertido a ácido malónico mediante oxidación catalítica de 3-HP mediante un catalizador soportado que comprende Rh. La oxidación catalítica se lleva a cabo en un reactor de lecho fijo puesto en operación en un procedimiento de lecho de goteo. En el procedimiento de lecho de goteo, la fase acuosa que comprende el material de partida de 3-HP, también como los productos 'de oxidación del mismo y medios para el ajuste del pH y oxígeno o un gas que contiene oxígeno se puede llevar a cabo a contra flujo. Con el fin de obtener un tiempo de reacción suficientemente corto, la reacción se lleva a cabo a un pH de aproximadamente 8. La oxidación se lleva a cabo a una temperatura de aproximadamente 40°C. El ácido malónico es obtenido en rendimientos casi cuantitativos .
Ejemplo 35 Ejemplo 41; Bio-producción a escala de 1 L de 3-HP utilizando DF40 + pKK223+MCR de E.coli.
Utilizando la cepa DF40 + pKK223+MCR de E.coli que fue producida de acuerdo con el ejemplo 1, un cultivo por lotes de aproximadamente 1 L de volumen de trabajo se llevo a cabo para determinar la bio-producción microbiana de 3-HP.
DF40 + pKK223+MCR de E.coli fue inoculado de soluciones concentradas de congelador mediante la práctica estándar (Sambrook and Russell, 2001) a un matraz amortiguado de 50 mi de medio LB mas 200 µg/ml de ampicilina en donde se indica y cultivados a fase estacionaria de la noche a la mañana a 37°C con agitación a 225 rpm. En la mañana, este cultivo fue usado para inocular (5%. v/v) un recipiente de bioreactor de 1 L que comprende medio mínimo M9 mas 5% (w/v) de glucosa mas 200µ/??1 de ampicilina, mas IPTG lmM, en donde se indica. El recipiente del bioreactor fue mantenido a pH 6.75 mediante la adición de 10M Na OH o 1M HCI, como sea apropiado. El contenido de oxígeno disuelto del recipiente del bioreactor fue mantenido a 80% de saturación mediante barboteo continuo de aire a una velocidad de 5 L/min y mediante ajuste continuo de la velocidad de agitación del recipiente del bioreactor entre 100 y 1000 rpm. Estas evaluaciones de bio-producción fueron llevadas a cabo en por lo menos por triplicado. Para monitorear el crecimiento de estos cultivos, se tomaron mediciones de densidad óptica (absorbancia a 600 nm, longitud de trayectoria 1 cm) , que se correlaciona con el número de célula al tiempo de la inoculación y cada 2 horas después de la inoculación por las primeras 12 horas. En el día 2 del evento del bio-producción, muestras para mediciones de densidad óptica y otras mediciones fueron recolectadas cada 3 horas. Por cada muestra recolectada, las células fueron aglomeradas mediante centrifugación y el supernatante fue recolectado para análisis de producción de 3-HP como se describe según "Análisis de cultivos en cuanto a producción de 3-HP" en la Sección de Métodos Comunes. El título final preliminar de 3-HP en este volumen de bio-producción de 1 L fue calculado en base a análisis de HPLC para 0.7 g/1 de 3-HP. Se reconoce que hay una coproducción probable de semialdehido de malonato o posiblemente otro aldehido o posiblemente productos de degradación de semialdehido malonato u otros aldehidos, que son indistinguibles de 3-HP mediante este análisis, de HPLC.
Ejemplo 46; Modi cación/introducción genética de malonil-CoA reductasa para producción de 3-HP en DF40 de E.coli.
La secuencia de nucleótidos para el gen de malonil-CoA reductasa de Chloroflexus aurantiacus fue codón-optimizada para E.coli de acuerdo con un servicio de DNA 2.0 (Menlo Park, CA Estados Unidos de América) , un proveedor de síntesis genética de AND comercial. Esta secuencia genética incorporo un sitio de restricción de EcoRI antes del codón de parada y fue seguido por un sitio de restricción de HindIII. Además, una secuencia de Shine-Delgarno (esto es, un sitio de enlace ribosomal) fue convocado enfrente del codón de parada preferido por un sitio de restricción de EcoRI. Esta construcción genética fue sintetizada mediante DNA 2.0 y provisto en una cadena fundamental del vector pJ206. El plásmido de ADN pJ206 que contiene el gen de mcr sintetizado fue sometido a digestión de restricción enzimática con las enzimas EcoRI y HindIII obtenidas de New England BioLabs (Ipswich, MA Estados Unidos de América) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La mezcla de digestión fue separada mediante electroforesis de gel de agarosa y visualizada bajo transiluminación de UV como se describe en la Subsección II de la Sección de Métodos Comunes. Una rebanada de gel de agarosa que contiene una pieza de ADN correspondiente al gen de mcr fue cortada del gen y el ADN recuperado con un protocolo de extracción de gel estándar y los componentes de Qiagen (Valencia, CA Estados Unidos de América) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Una cepa de clonación de E.coli que lleva pKK223-aroH fue obtenida como una donación amable del laboratorio del Profesor Ryan T. Gilí de la Universidad de Colorado en Boulder. Los cultivos de esta cepa que llevan el plásmido fueron cultivados mediante metodologías estándar y el ADN de plásmido fue preparado mediante una columna de miniprep comercial de Qiagen (Valencia, CA Estados Unidos de América) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN de plásmido fue sometido a digestión con las endonucleasas de restricción EcoRI y HindIII obtenidas de New England BioLabs (Ipswich, MA Estados Unidos de América) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Esta digestión sirvió para separar el cuadro de lectura de aroH de la cadena fundamental de pKK223. La mezcla de digestión fue separada mediante electroforesis de gel de agarosa y visualizada bajo transiluminación de UV como se describe en la Subsección II de la Sección de Métodos Comunes. Una rebana de gel de agarosa que contiene una pieza de ADN correspondiente a a cadena fundamental del plásmido de pKK223 fue cortada del gel y el ADN recuperado con un protocolo de extracción de gel estándar y componentes de Qiagen de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Piezas de ADN purificado correspondientes al gen de mcr y la cadena fundamental del vector de pKK223 fueron ligadas y el producto de ligación fue transformado y sometido a electroporación de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La secuencia del vector resultante denominado pKK223-mcr (SEQ ID NO: 189) fue confirmada mediante secuenciación de rutina efectuada por el servicio comercial provisto por Macrogen (Estados Unidos de América) . pKK223-mcr confiere resistencia a beta-lactamasa y contiene el gen de mcr bajo el control de un promotor de Ptac inducible en huéspedes de E.coli mediante IPTG.
El clon de expresión pKK223-mcr y testigo pKK223 fueron transformados en K12 de E.coli y DF40 de E.coli vía metodologías estándar (Sambrook and Russell, 2001) .
Ejemplo 53: Modificación/introducción genética de malonil-CoA reductasa para la producción de 3-HP en Bacillus subtilis .
Para la creación de una ruta de producción de 3-HP en Bacillus subtilis, la secuencia de nucleótidos codón-optimizada para el gen de malonil-CoA reductasa de Chloroflexus aurantiacus fue construida mediante el servicio de síntesis genética de DNA 2.0 ( enlo Park, CA Estados Unidos de América) , un proveedor de síntesis de gen de ADN comercial, fue agregado a un vector de lanzadera de Bacillus subtilis. Este vector de lanzadera pHT08 (SEQ ID NO; 011) fue obtenido de Boca Scientific (Boca Ratón, FL Estados Unidos de América) y porta un promotor IPTG-inducible de Pgrac inducible.
Esta secuencia del gen de mcr fue preparada para inserción al vector de lanzadera de pHT08 mediante amplificación de reacción en cadena de polimerasa con el cebador 1 ( 5' GGAAGGATCCATGTCCGGTACGGGTCG-3' ) (SEQ ID NO: 148) que contiene homología al sitio de partida del gen de mcr y un sitio de restricción de BamHI y cebador 2 (5'-Phos-GGGATTAGACGGTAATCGCACGACCG-3' ) (SEQ ID NO: 149) que contiene el codón de parada del gen de mcr y un termino 5' fosforilado para ' clonación de ligación embotada. El producto de reacción en cadena de polimerasa fue purificado utilizando un kit de purificación de PCR obtenido de Qiagen Corporation (Valencia CA Estados Unidos de América) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Enseguida, el producto purificado fue sometido a digestión con BamHI obtenido de New England BioLabs (Ipswich, MA Estados Unidos de América) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La mezcla de digestión que fue separada mediante electroforesis de gel de agarosa y visualizada bajo transiluminación de UV como se describe en la Subsección II de la Sección de Métodos Comunes. Una rebanada de gel de agarosa que contiene una pieza de ADN correspondiente al gen de mcr fue cortada del gel y el ADN recuperado con un protocolo- de extracción de gel estándar y componentes de Qiagen (Valencia, CA Estados Unidos de América) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Este ADN del vector de lanzadera de pHT08 fue aislado utilizando un kit de purificación de ADN miniprep estándar de Qiagen (Valencia, CA Estados Unidos de América) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN resultante fue sometido a digestión de restricción con BamHI y Smal obtenidos de New England BioLabs (Ipswich, MA Estados Unidos de América) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La mezcla de digestión fue separada mediante electroforesis de gel de agarosa y visualizada bajo transiluminación de UV como se describe en la Subsección II de la Sección de Métodos Comunes. Una rebanada de gel de agarosa que contiene una pieza de ADN correspondiente al producto de cadena fundamental de pHT08 sometido a digestión fue cortada del gel y el ADN recuperado con un protocolo de extracción de gel estándar y componentes de Qiagen (Valencia, CA Estados Unidos de América) de acuerdo con las instrucciones del fabricante .
Tanto el mcr digerido y purificado como los productos de pHTÓ8 fueron ligados conjuntamente utilizando la ligasa T4 obtenida de New England BioLabs (Ipswich, MA Estados Unidos de América) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La mezcla de ligación , fue luego transformada a células de E.coli 10G químicamente competentes obtenidas de Lucigen Corporation (Middleton WI, Estados Unidos de América) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y placas de LB depositadas aumentadas con ampicilina para selección. Varias de las colonias resultantes fueron cultivadas y su ADN fue aislado utilizando un kit de purificación de ADN miniprep estándar de Qiagen (Valencia, CA Estados Unidos de América) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN recuperado fue verificado mediante digestión de restricción seguido por electroforesis de gel de agarosa. Las muestras de ADN que muestran el patrón de bandas correcto fueron verificadas adicionalmente mediante secuenciación de ADN. El ADN verificado en secuencia fue designado como pHT08-mcr y fue luego transformado a células de Bacillus subtilis químicamente competente, utilizando las instrucciones obtenidas de Boca Scientific (Boca Ratón, FL Estados Unidos de América) . Células de Bacillus subtilis que portan el plásmido de pHT08-mcr fueron seleccionadas sobre placas de LB aumentadas con cloranfenicol .
Células de Bacillus subtilis que- portan el pHT08-mcr fueron cultivadas de la noche a la mañana en 5 mi de medio LB complementado con 20 µ/ml de cloranfenicol, agitación a 225 rpm e incubados a 37 grados Celsius. Estos cultivos fueron usados para inocular 1% v/v, 75 mi de medio mínimo de M9 complementado con 1.47 g/1 de glutamato, 0.021 g/1 de triptófano, 20 µ/ml cloranfenicol e IPT.G lmM. Estos cultivos fueron luego cultivados por 18 horas en un matraz Erlenmeyer amortiguado de 250 mi a 25 rpm, incubado a 37 grados Celsius. Después de 18 horas, las células fueron aglomeradas y los sobrantes sometidos a detección de GCMS de 3-HP (descrito en la Sección de Métodos Comunes Illb) . Se detectaron cantidades en trazas de 3-HP con iones calificadores.
Ejemplo 54: Construcción de cepas de Bacillus subtilis.
Plásmidos para elementos genéticos de tolerancia en pWH1520 y el plásmido de producción, pHT08-mcr, fueron transformados a dos cepas de Bacillus subtilis. La cepa de Bacillus subtilis subespecie subtilis 168 fue obtenida como una donación amable del laboratorio del Profesor Ryan T. Gilí de la Universidad de Colorado en Boulder. Las transformaciones fueron efectuadas utilizando un protocolo modificado desarrollado de Anagnostopoulos y Spizizen (Requerimientos para transformación en Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 81:7 1-746(1961)) tal como es provisto con las instrucciones para el vector de lanzadera pHT08 por Boca Scientific (Boca Ratón, FL Estados Unidos de América) .
Ejemplo 57: Ruta Aeróbica de Levadura para producción de 3HP (Profético) La siguiente construcción (SEQ ID NO: 150) que contiene: homología 5' de 200 pares de bases a ACC1, gen de His3 para selección, promotor de levadura de Adhl, sitios de BamHI y Spel para clonación de MCR, terminador de cycl, promotor de Tefl de levadura y los primeros 200 pares de bases de homología al cuadro de lectura abierta de ACC1 de levadura serán construidos utilizando síntesis genética (DNA 2.0). El cuadro de lectura abierta de MCR (SEQ ID NO: 151) será clonado a los sitios de BamHI y Spel, esto permitirá la transcripción constitutiva por el promotor de adhl. Enseguida de la clonación de MCR a la construcción, el elemento genético (SEQ ID NO: 152) será aislado del plásmido mediante digestión de restricción y transformado a cepas de levadura relevantes. El elemento genético desactivará el promotor natural de ACC1 de levadura y lo reemplazará con MCR expresado del promotor de adhl y el promotor de Tefl impulsará ahora la expresión de ACC1 de levadura. La integración será seleccionada para crecimiento en ausencia de histidina. Las colonias positivas serán confirmadas mediante PCR. La expresión de MCR y la expresión incrementada de ACC1 serán confirmadas mediante RT-PCR.
Un procedimiento alternativo que podría ser utilizado para expresar MCR en levadura es la expresión de MCR de un plásmido. El elemento genético que contiene MCR bajo el control del promotor de ADHl (SEQ ID 4) podría ser clonado a un vector de levadura tal como pRS421 (SEQ ID NO: 153) utilizando técnicas de biología molecular estándar creando un plásmido que contiene MCR (SEQ ID NO: 154) . Un MCR a base de plásmido podría luego ser transformado a diferentes cepas de levadura.
En base a la presente revelación, se notará que además de introducir una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica pro la actividad de malonil-CoA reductasa en una célula de levadura, en algunas modalidades modificaciones genéticas adicionales se hacen para disminuir la actividad de enoil-CoA reductasa y/u otra actividad de ácido graso sintasa.
Ejemplo 60: Construcción de Cepa de Levadura Cepas de levadura fueron construidas utilizando transformación de levadura estándar y seleccionadas para complementación de marcadores auxotróficos . Todas las cepas son de fondo S288C. Para métodos de transformación de levadura en general, véase Gietz, R.D. y R.A. Woods . (2002) "Transformation of Yeast by the Liac/SS Carrier DNA/PEG Method". Methods in Enzymology 350: 87-96.
SECCIÓN DE MÉTODOS COMUNES Todos los métodos en esta sección son provistos para incorporación a los ejemplos cuando asi son referidos.
Sub-sección I. Especies y Cepas de Microorganismo, Cultivos y Medios de Cultivo Las especies bacterianas que pueden ser utilizadas como sea necesario con como sigue: Acinetobacter calcoaceticus (DSMZ # 1139) es obtenida de la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (Braunschweig, Alemania) como un cúltivo secado al vacio. Los cultivos son luego resuspendidos en Caldo de Infusión de Cerebro Corazón (BHI) (RPI Corp, Mt . Prospect, IL, Estados Unidos de América) . Diluciones seriales del cultivo de A. calcoaceticus resuspendido se hacen en BHI y se permita que crezcan aeróbicamente por 48 horas a 37 °C a 250 rpm esta que están saturados.
Bacillus subtílis es una donación del Laboratorio Gilí (Universidad de Colorado en Boulder) y es obtenido como un cultivo activamente creciente. Diluciones seriales del cultivo de B. subtilis que crece activamente se hacen en Caldo de Luria (RPI Corp, Mt . Prospect, IL, Estados Unidos de América) y se permite que crezcan aeróbicamente por 24 horas a 37 °C a 250 rpm hasta que están saturados.
Chlorobium limicola (DSMZ# 245) es obtenido de la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (Braunschweig, Alemania) como un cultivo secado al vacio. Los cultivos son luego resuspendidos utilizando Medio I y II de Pfennig (#28 y 29) como se describe según las instrucciones de DSMZ . C. limicola es cultivado a 25°C bajo vórtice constante.
Citrobacter braakii (DSMZ # 30040) es obtenido de la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (Braunschweig, Alemania) como un cultivo secado al vacio. Los cultivos son luego resuspendidos en Caldo de Infusión de Cerebro Corazón (BHI) (RPI Corp, Mt . Prospect, IL, Estados Unidos de América) . Diluciones seriales del cultivo de C. braakii resuspendido se hacen a BHI y se permite que crezcan para aeróbicamente por 48 horas a 30 °C a 250 rpm hasta que están saturados.
Clostridium acetobutylicum (DSMZ # 792) es obtenido de la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (Braunschweig, Alemania) como un cultivo secado al vacio. Los cultivos son luego resuspendidos en medio de Clostridium acetobutylicum .(#411) como se describe según las instrucciones de DSMZ. C. acetobutylicum es cultivado anaerobicamente a 37 °C a 250 rpm hasta que está saturado.
Clostridium aminobutyricum (DSMZ # 2634) es obtenido de la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (Braunschweig, Alemania) como un cultivo secado al vacio. Los cultivos son luego resuspendidos en medio de Clostridiu aminobutyricum (#286) como se describe según las instrucciones de DSMZ. C. aminobutyricum es cultivado anaeróbicamente a 37 °C a 250 rpm hasta que está saturado.
Clostridium kluyveri (DSMZ #555) es obtenido de la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (Braunschweig, Alemania) como un cultivo que crece activamente. Diluciones seriales del cultivo de C. kluyveri es hacen al medio de Clostridium kluyveri (#286) como se describe según las instrucciones de DSMZ. C. kluyveri es cultivado anaeróbicamente a 37 °C a 250 rpm hasta que está saturado .
Cupriavidus metallidurans (DMSZ # 2839) es obtenido de la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (Braunschweig, Alemania) como un cultivo secado al vacio. Los cultivos son luego resuspendidos en Caldo de Infusión de Cerebro Corazón (BHI) (RPI Corp, Mt . Prospect, IL, Estados Unidos de América) . Diluciones seriales del cultivo de C. metallidurans resuspendido se hacen en BHI y se permite que crezcan aeróbicamente por 48 horas a 30 °C a 250 rpm hasta que están saturados.
Cupriavidus necator (DSMZ # 428) es obtenido de la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (Braunschweig, Alemania) como un cultivo secado al vacio. Los cultivos son luego resuspendidos en Caldo de Infusión de Cerebro Corazón (BHI) (RPI Corp, Mt . Prospect, IL, Estados Unidos de América) . Se hacen diluciones seriales del cultivo de C. necator resuspendido a BHI y se permite que crezcan aeróbicamente por 48 horas a 30°C a 250 rpm hasta que están saturados. Como se indica en cualquier parte en la presente, los nombres previos para esta especie son Alcaligenes eutrophus y Ralstonia eutrophus .
Desulfovibrio fructosovorans (DSMZ # 3604) es obtenido de la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (Braunschweig, Alemania) como un cultivo secado al vacio. Los cultivos son luego resuspendidos en medio de Desulfovibrio fructosovorans (#63) como se describe según las instrucciones de DSMZ. D. fructosovorans es cultivado anaeróbicamente a 37 °C a 250 rpm hasta que está saturado.
Escherichia coli Crooks (DSMZ#1576) es obtenido de la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (Braunschweig, Alemania) como un cultivo secado al vacio. Los cultivos son luego resuspendidos en Caldo de Infusión de Cerebro Corazón (BHI) (RPI Corp, Mt . Prospect, IL, Estados Unidos de América) . Se hacen diluciones seriales del cultivo de E. coli Crooks resuspendido a BHI y se permite que crezcan aeróbicamente por 48 horas a 37 °C a 250 rpm hasta que están saturados.
Escherichia coli K12 es una donación del Gilí Lab (Universidad de Colorado en Boulder) y es obtenido como un cultivo que crece activamente. Diluciones seriales del cultivo de K12 de E. coli que crece activamente se hacen en Caldo de Luria (RPI Corp, Mt. Prospect, IL, Estados Unidos de América) y se permite que crezcan aeróbicamente por 24 horas a 37 °C a 250 rpm hasta que están saturados.
Halobacterium salinarum (DSMZ# 1576) es obtenido de la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (Braunschweig, Alemania) como un cultivo secado al vacio. Los cultivos son luego resuspendidos en medio de Halobacterium (#97) como se describe según las instrucciones de DSMZ. H. salinarum es cultivado aeróbicamente a 37 °C a 250 rpm hasta que está saturado.
Lactobacillus delbrueckii (#4335) es obtenido de WYEAST USA (Odell, OR, Estados Unidos de América) como un cultivo que crece activamente. Diluciones seriales del cultivo de L. delbrueckii que crece activamente se hacen en Caldo de Infusión de Cerebro Corazón (BHI) (RPI Corp, Mt . Prospect, IL, Estados Unidos de América) y se permite que crezcan aeróbicamente por 24 horas a 30°C a 250 rpm hasta que están saturados .
Metallosphaera sedula (DSMZ #5348) es obtenido de la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (Braunschweig, Alemania) como un cultivo que crece activamente. Diluciones seriales del cultivo de M. sedula se hacen en el medio de Metallosphaera (#485) como se describe-según las instrucciones de DSMZ. M. sedula es cultivado aeróbicamente a 65°C a 250 rpm hasta que está saturado.
Propionibacterium freudenreichii subespecie. shermanii (DSMZ# 4902) es obtenido de la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (Braunschweig, Alemania) como un cultivo secado al vacio. Los cultivos son luego resuspendidos en medio PYG (#104) como se describe según las instrucciones de DSMZ. P. freudenreichii subespecie shermanii es cultivado anaeróbicamente a 30°C a 250 rpm hasta que está saturado .
Pseudomonas putida es una donación del Laboratorio Gilí (Universidad de Colorado en Boulder) y es obtenido como un cultivo que crece activamente. Diluciones seriales del cultivo de P. putida que crece activamente se hacen en Caldo de Luria (RPI Corp, Mt . Prospect, IL, Estados Unidos de América) y se permite que crezcan aeróbicamente por 24 horas a 37 °C a 250 rpm hasta que están saturados.
Streptococcus mutans (DSMZ# 6178) es obtenido de la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (Braunschweig, Alemania) como un cultivo secado al vacio.. Los cultivos son luego resuspendidos en Caldo de Luria (RPI Corp, Mt. Prospect, IL, Estados Unidos de América). S. mutans es cultivado aeróbicamente a 37 °C a 250 rpm hasta que está saturado.
Las siguientes cepas no limitantes pueden también ser usadas como cepas de partida en los ejemplos: DF40 Hfr(P02A), garBIO, fhuA22, ompF627 (T2R) , fadL701 (T2R) , relAl, pitAlO, spoTl, rrnB-2, pgi-2, mcrBl, creC510, BW25113 F-, A(araD-araB)567, AlacZ4787 ( : : rrnB-3 ) , &lambda-, rph-1, A(rhaD-rhaB)568, hsdR514, JP111 Hfr(POl), galE45 (GalS ) , &lambda-, fabI392{ts), relAl , spoTl, thi-1. Estas cepas poseen modificaciones genéticas reconocidas y están disponibles de fuentes de cultivo públicas tales como la Yale Coli Genetic Stock Collection (New Haven, CT Estados Unidos de América) . Las cepas desarrolladas de estas cepas son descritas en los ej emplos .
El medio de cultivo bacteriano y materiales y condiciones asociados son como sigue: El medio de alimentación por lotes contenia (por litro) : 10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura, 1.5 g de NaCl, 2 g de Na2HP04.7 H20, 1 g de ??2?04, y glucosa como se indica.
El medio de AM2 contenía (por litro) : 2.87 g de ?2??04, 1.50 g de KH2P04/ 3.13 g (NH4)2S04, 0.15 g de KC1, 1.5 mM de MgS04, K+ OPS 0.1 M, pH 7.2, 30 g de glucosa y 1 mi de solución concentrada de minerales en trazas preparada como se describe en Martínez et al. Biotechnol Lett 29:397-404 (2007).
El medio de AM2 utilizado en fermentadores para el medio por lotes inicial (para el ejemplo 11) Solución Concentrada de Metales en Trazas para el medio 2 usado en los Fermentadores La concentración de glucosa en la alimentación de glucosa para recipientes de AM2 : 200 g/l de glucosa El medio rico usado en Medio por Lotes Inicial de los Fermentadores (para el ejemplo 11) La Formulación de Alimentación para la alimentación de glucosa adicional para los medios ricos El medio mínimo de SM3 para E. coli (concentración de fosfato final = 27.5 mM; concentración de N final = 47.4 mM NH4+) .
Componentes por litro: 700 mi de agua DI, 100 mi de de sales de SM3 10X, 2 mi de MgS04 1 M, 1 mi de Solución Concentración de Minerales en Trazas 1000X, 60 mi de glucosa 500 g/1, 100 mi de MOPS 0.1 M (pH 7.4), 0.1 mi de CaCl2 1 M, cuanto baste con agua DI a 1000 mi y 0.2 m de filtro estéril .
Preparación de Soluciones Concentradas Para elaborar sales de SM3 10X (1 L) : 800 mi de agua DI, 28.7 g de K2HP04, 15 g de KH2P04, 31.3 g de (NH4)2S04, 1.5 g de KC1, 0.5 g de ácido cítrico (anhidro) y cuanto baste con agua desionizada a 1000 mi.
Para elaborar la Solución Concentrada de Minerales en Trazas 1000X (1 L) : se ahorra en porciones de 50 mi a temperatura ambiente Por litro en HC1 0.12 M '(concentrado HC1 10 mi diluido a 1 litro de agua) : 2.4 g de FeCL3.6H20, 0.17 g de CoCl2.6H20, 0.15 g de CuCl2.2H20, 0.3 g de ZnCl2, 0.3 g de NaMo04.2H20 (el ácido molíbdico, sal de disodio, dihidratada), 0.07 g de H3BO3 y 0.5 g de MnCl2.4H20.
Para elaborar MOPS 1 M:209.3 g de MOPS, se disuelven en 700 mi de agua. Se toman porciones de 70 mi y se ajusta al pH deseado con KOH al 50%, se ajusta a un volumen final de 100 mi y 0.2 pm de filtro estéril.
Para elaborar MgS04 1 M: 120.37 g disueltos en 1000 mi de agua.
Para elaborar 500 g/1 de solución concentrada de glucosa (50%) : 900 mi de agua DI, 500 g de glucosa y cuanto baste para 1000 mi.
Las Formulaciones de Medio de Cultivo Adicionales son resumidas como: F 10: Formulación de Solución Concentrada de Metales en Trazas : Para elaborar 1 litro de medios de M9: El medio mínimo de 9 fue elaborado al combinar sales M9 5X, MgS04 1 M, 20% de glucosa, CaCl2 1 M y agua desionizada estéril. Las sales M9 5X se hacen al disolver las siguientes sales en agua desionizada a un volumen final de 1 L: 64 g de Na2HP04. 7H20, 15 g KH2P04, 2.5 g de NaCl, 5.0 g de NH4C1. La solución de sal fue dividida en alícuotas de 200 mL y esterilizada mediante autoclave por 15 minutos a 15 libras/pulgada cuadrada en el ciclo líquido. Una solución 1 M de MgS04 y CaCl2 1 M fueron elaboradas separadamente, luego esterilizadas mediante autoclave. La glucosa fue filtrada estéril al hacerla pasar a través de un filtro de 0.22 µ?t?. Todos los componentes son combinados como sigue para hacer 1 L de M9: 750 mL de agua estéril, 200 mL de sales M9 5X, 2 mL de MgS04 1 M, 20 mL de glucosa al 20%, 0.1 mL de CaCl2, cuanto baste para un volumen final de 1L.
Para fabricar medios ricos en EZ: Todos los componentes de los medios fueron obtenidos de TEKnova (Hollister CA Estados Unidos de América) y combinados en los siguientes volúmenes. 100 mL de mezcla de MOPS 10X, 10 mL de K2HP04 0.132 M, 100 mL de ACGU 10X, 200 mL de comlemento¦ de EZ 5X, 10 mL de glucosa al 20%, 580 mL de agua estéril.
Sub-sección II: Preparación de Gel, Separación de ADN Extracción, Ligación y Métodos de Transformación: Agarosa grado biología molecular (RPI Corp, Mt Prospect, IL, Estados Unidos de América) es agregada a TAE lx para hacer Agarosa ai 1% en TAE. Para obtener TAE 50x se agrega lo siguiente a 900 mi de H20 destilada: 242 g de base Tris (RPI Corp, Mt . Prospect, IL, Estados Unidos de América), 5 .1 mi de ácido acético glacial ( Sigma-Aldrich, St . Louis, MO, Estados Unidos de América), 18.6 g de EDTA (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA Estados Unidos de América) y se ajusta el volumen a 1 L con agua destilada adicional. Para obtener TAE lx, se agregan 20 mL de TAE 50x a 980 mL de agua destilada. La solución de agarosa-TAE es luego calentada hasta que ocurre le ebullición y la agarosa está plenamente disuelta. Se permite que la solución se enfrie a 50°C antes de que 10 mg/ml bromuro de etidio (Acros Organics, Morris Plains, NJ, Estados Unidos de América) sea agregado a una concentración de 5 ul por 100 mL de solución de agarosa al 1%. Una vez que el bromuro de etidio es agregado, la solución es mezclada brevemente y vertida a una bandeja de vaciado de gel con el número apropiado de panales (Idea Scientific Co . , Minneapolis, MN, Estados Unidos de América) por análisis de muestra. Las muestras de ADN son luego mezcladas asi con solución reguladora del pH de carga TAE 5X. La solución reguladora del pH de carga TAE 5X consiste de TAE 5X (diluida de TAE 50X como se describe en la presente) , glicerol al 20% (Acros Organics, Morris Plains, NJ, Estados Unidos de América), azul de bromofenol al 0.125% (Alfa Aesar, ard Hill, MA, Estados Unidos de América) , y se ajusta el volumen a 50 mL con agua destilada. Los geles cargados se hacen correr luego en plataformas de gel (Idea Scientific Co., Minneapolis, MN, Estados Unidos de América) llenos con TAE IX a un voltaje constante de 125 volts por 25-30 minutos. En este punto, los geles son removidos de las cajas de gel con voltaje y visualizados bajo un transiluminador de UV (FOTODYNE Inc., Hartland, WI, Estados Unidos de América).
El ADN aislado a través de extracción de gel es luego extraído utilizando el' kit de extracción de gel QIAquick siguiendo las instrucciones del fabricante (Qiagen (Valencia CA, Estados Unidos de América)) . Métodos similares son conocidos para aquellos experimentados en el arte.
El ADN así extraído puede luego ser ligado a pSMART (Lucigen Corp, iddleton, WI, Estados Unidos de América), StrataClone (Stratagene, La Jolla, CA, Estados Unidos de América) o pCR2.1-T0P0 TA (Invitrogen Corp, Carlsbad, CA, Estados Unidos de América) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Estos métodos son descritos en la siguiente sub-sección de Métodos Comunes.
Métodos de Ligación : Para ligaciones a vectores de pSMART: El ADN extraído en gel es embotado utilizando PCRTerminator (Lucigen Corp, Middleton, WI, Estados Unidos de América) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Luego, se agregan 500 ng de ADN a 2.5 uL de premezcla de vector CloneSmart 4.x, 1 µ? de ADN ligasa CloneSmart (Lucigen Corp, Middleton, WI, Estados Unidos de América) y agua destilada es agregada para un volumen total de 10 µ?. Se permite que la reacción se asiente a temperatura ambiente por 30 minutos y luego es desactivada térmicamente a 70 °C por 15 minutos y luego colocada en hielo. Las células químicamente competentes 10G de E. coli (Lucigen Corp, Middleton, WI, Estados Unidos de América) son desheladas por 20 minutos sobre hielo. 40 µ? de células químicamente competentes son colocadas en un tubo de microcentrifuga y se agrega 1 µ? de ligación CloneSmart desactivado térmicamente al tubo. Toda la reacción es agitada brevemente con una punta de pipeta. La ligación y células son incubadas sobre hielo por 30 minutos y luego las células son sometidas a choque de calor por 45 segundos a 42°C y luego vueltas a poner sobre hielo por 2 minutos. 960 µ? de medio de recuperación a temperatura ambiente (Lucigen Corp, Middleton, WI, Estados Unidos de América) y colocados en tubos de microcentrifuga . SE agitan los tubos a 250 rpm por 1 hora a 37 °C. Se depositan 100 µ? de células transformadas sobre placas de caldo de Luria . (RPI Corp, Mt. Prospect, IL, Estados Unidos de América) más antibióticos apropiados dependiendo del vector . de pSMART usado. Se incuban las placas de la noche a la mañana a 37 °C.
Para Ligaciones a StrataClone; El ADN extraído en gel es embotado utilizando PCRTerminator (Lucigen Corp, Middleton, WI, Estados Unidos de América) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Luego se agregan 2 µ? de ADN a 3 µ? de Solución Reguladora del pH de Clonación de Embotado StrataClone y 1 µ? de mezcla de vector de Embotamiento StrataClone amp/kan (Stratagene, La Jolla, CA, Estados Unidos de América) para un total de 6 µ? . La mezcla de la reacción al pipetear hacia arriba y hacia abajo suavemente y es incuba la reacción a temperatura ambiente por 30 minutos, luego se coloca sobre hielo. Se deshiela un tubo de células competentes químicamente de StrataClone (Stratagene, La Jolla, CA, Estados Unidos de América) sobre hielo por 20 minutos. Se agrega 1 µ? de la reacción de clonación al tubo de células químicamente competentes y se mezcla suavemente con una punta de pipeta y se incuba sobre hielo por 20 minutos. El choque térmico de la transformación a 42°C por 45 segundos luego se pone sobre hielo por 2 minutos. Se agregan 250 µ? de Caldo de Luria pre-calentado (RPI Corp, Mt. Prospect, IL, Estados Unidos de América) y se agita a 250 rpm a 37 °C por 2 horas. Se depositan 100 µ? de la mezcla de transformación a placas de Caldo de Luria (RPI Corp, Mt. Prospect, IL, Estados Unidos de América) más los antibióticos apropiados. Se incuban las placas de la noche a la mañana a 37 °C.
Para Ligaciones a pCR2.1-T0P0 TA: Se agrega 1 µ? de vector TOPO, 1 µ? de solución de sal (Invitrogen Corp, Carlsbad, CA, Estados Unidos de América) y 3 µ? de ADN extraído de gel a un tubo de microcentrí fuga . Se permite que el tubo se incube a temperatura ambiente por 30 minutos y luego se coloca la reacción sobre hielo. Se deshiela un tubo de células competentes químicamente de TOP10F' (Invitrogen Corp, Carlsbad, CA, Estados Unidos de América) por reacción. Se agrega 1 µ? de la mezcla de reacción a las células TOP10F' desheladas y se mezcla suavemente mediante torbellino a las células con una punta de pipeta y se incuba sobre hielo por 20 minutos. Se somete a choque térmico la transformación a 42 °C por 45 segundos luego se. pone sobre hielo por 2 minutos. Se agregan 250 µ? de medio SOC pre-calentado (Invitrogen Corp, Carlsbad, CA, Estados Unidos de América) y se agita a 250 rpm por 37 °C por 1 hora. Se depositan 100 µ? de la mezcla de transformación a placas de Caldo de Luria (RPI Corp, Mt. Prospect, IL, Estados Unidos de América) más los antibióticos apropiados. Se incuban las placas de la noche a la mañana a 37 °C.
Transformación General y Metodologías de Cultivo Relacionadas : Protocolos de transformación químicamente competentes se llevan a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante o de acuerdo con la literatura contenida en Molecular Cloning (Sambrook and Russell, 2001). En general, el ADN de plásmido o productos de ligación son enfriados sobre hielo por 5 a 30 minutos en solución con células químicamente competentes. Las células químicamente competentes son un producto ampliamente usado en el campo de biotecnología y están disponibles para múltiples proveedores, tales como aquellos indicados en esta sub-sección. Enseguida del período de enfriamiento, las células en general sometidas a choque térmico por 30 segundos a 42 °C sin agitación, re-enfriadas y combinadas con 250 microlitros de medios ricos, tal como S.O.C. Las células son luego incubadas a 37 °C mientras que se agita a 250 rpm por 1 hora. Finalmente, las células son seleccionadas en cuanto a transformaciones exitosas mediante deposición sobre medio que contiene los antibióticos apropiados.
Alternativamente, las células seleccionadas pueden ser transformadas mediante métodos de electroporacion tales como aquellos conocidos por aquellos experimentados en el arte.
La elección de una cepa huésped de E. coli para transformación de plásmido es determinada al considerar factores tales como estabilidad de plásmido, compatibilidad de plásmido, métodos de selección de plásmido y expresión de proteína. Los fondos de cepa pueden ser cambiados al simplemente purificar el ADN de plásmido como se describe en la presente y transformar el plásmido a una cepa huésped de E. coli deseada o de otra manera apropiada tal como se determina por las necesidades experimentales, tal como cualquier cepa de clonación usada comúnmente (por ejemplo, DH5a, ToplOF' , E. cloni 10G, etc.) .
El ADN de plásmido fue preparado utilizando el kit de miniprep comercial de Qiagen (Valencia, CA Estados Unidos de América) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Sub-sección Illa. Preparación de 3-HP Una solución concentrada de 3-HP fue preparada como sigue. Un frasco de ß-propriolactona ( Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Estados Unidos de América) fue abierto bajo una campana de humos y. todo el contenido de la botella fue transferido a un nuevo recipiente secuencialmente utilizando una pipeta de vidrio de 25 mi. El frasco fue enjuagado con 50 mi de agua grado HPLC ' este enjuague fue vertido al nuevo recipiente. Se efectuaron dos enjuagues adicionales y se agregaron al nuevo recipiente. Se agregó agua grado HPLC adicional al nuevo recipiente para alcanzar una proporción de 50 mi de agua por 5 mi de ß-propriolactona . El nuevo recipiente fue tapado fuertemente y se permite que permanezca en la campana de humos a temperatura ambiente por 72 horas. Después de 72 horas, el contenido fue transferido a tubos de centrífuga y centrifugado por 10 minutos a 4,000 rpm. Luego, la solución fue filtrada para remover las. partículas y como sea necesario, concentrada mediante el uso de un evaporador rotativo a temperatura ambiente. Se llevó a cabo el análisis de la concentración y dilución para hacer una solución concentrada de concentraciones estándar como sea necesario. Sub-sección Illb. HPLC, GC/MS y Otro Métodos Analíticos para la Detección de 3-HP (Análisis de Cultivos para Producción de 3-HP) Para el análisis de HPLC de 3-HP, el sistema de cromatografía de aters (Milford, MA) consistiía de lo siguiente: Controlador 600S, Bomba 616, dispositivo Autosampler Plus 717, Detector de UV Sintonizable 486 y un Desgasificador de fase móvil en línea. Además, un calentador de columna externa Eppendorf es usado y los datos son recolectados utilizando un convertidor análogo a digital SRI (Torrance, CA) enlazado a una computadora de escritorio estándar. Los datos son analizados utilizando los elementos de programación SRI Peak Simple. Se emplea una columna de exclusión iónica Coregel 64H (Transgenomic, Inc., San José, CA) . La resina de la columna es un poliestireno divinil benceno sulfonado con un tamaño de partícula de 10 pm y las dimensiones de la columna son de 300 x 7.8 mm. La fase móvil consistía de ácido sulfúrico (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA Estados Unidos de América) diluido con agua desionizada (18 MQcm) a una concentración de 0.02 N y filtrada al vacío a través de un filtro de nylon de 0.2 µ?t?. La velocidad de flujo de la fase móvil es de 0.6 ml/min. El detector de UV es puesto en operación a una longitud de onda de 210 nm y la columna es calentada a 60 °C. El mismo equipo y método como se describe en la presente es usado para análisis de 3-HP en cuanto a ejemplos proféticos relevantes. Se provee una curva de calibración representativa utilizando este método de HPLC con un estándar de 3-HP en la Figura 13 (TCI America, , Portland, OR) .
El siguiente método es usado para el análisis de GC-MS de 3-HP. 3-HP monomérico soluble es cuantificado utilizando GC-MS después una sola extracción del medio de fermentación con acetato de etilo. Una vez que el 3-HP ha sido extraído con acetato de etilo, los hidrógenos activos en el 3-HP son reemplazados con grupos trimetilsililo utilizando N,0-Bis- (trimetilsililo) trifluoroacetamida para hacer el compuesto volátil para análisis de GC. Una curva estándar de concentraciones de 3-HP conocidas es preparada al comienzo de la corrida y se agrega una cantidad conocida de ácido cetohexanoico (1 g/1) a ambos de los estándares y las muestras para actuar como estándar interno para cuantificación, con ácido trópico como un estándar interno adicional. El contenido de 3-HP de las muestras . individuales es luego analizado al examinar la proporción del ion de ácido cetohexanoico (m/z = 247) al ion de 3-HP (219) y comparado con la curva estándar. 3-HP es cuantificado utilizando una curva estándar de 3-HP al comienzo de la corrida y los datos son analizados utilizando HP Chemstation. El sistema de GC-MS consiste de un GC de Hewlett Packard modelo 5890 y S Hewlett Packard modelo 5972. La columna es Supelco SPB-1 (60 m X 0.32 mm X 0.25 µp? de espesor de película). El recubrimiento capilar es una metilsilicona no polar. El gas portador es helio a una velocidad de flujo de 1 mL/min. El 3-HP tal como es derivado es separado de otros componentes en el extracto de acetato de etilo utilizando ya sea uno u otro de dos regímenes de temperatura similares. En un primer régimen de gradiente de temperatura, la temperatura de la columna inicia con 40 °C por 1 minuto, luego es elevada a una velocidad de 10°C/minuto a 235°C, y luego es elevada a una velocidad de 50°C/minuto a 300°C. En un segundo régimen de temperatura, que fue demostrado para procesar muestras más rápidamente, la temperatura de la columna inicia con 70°C que es mantenida por 1 minuto, seguida por un ascenso de 10°C/minuto a 235°C que es seguido por un ascenso de 50°C/minuto a 300°C. Una curva de calibración representativa es provista en la Figura 22.
Un bioanálisis para la detección de 3-HP también fue usado en varios ejemplos. Esta determinación de la concentración de 3-HP se llevó a cabo en base a la actividad de la 3-HP deshidrogenasa de E. coli codificada por el gen de ydfG (la proteína YDFG) . Las reacciones de 200 µ? se llevaron a cabo en placas de microtítulo de 96 cavidades y contenían Tris-HCl 100 mM, pH 8.8, MgCl2 2.5 mM, NADP+ 2.625 mM, 3 yg de YDFG purificada y 20 µ? de sobrenadante de cultivo. Los sobrenadantes de cultivo fueron preparados mediante centrifugación en una microfuga (14,000 rpm, 5 minutos) para remover las células. Una curva estándar de 3-HP (que contiene de 0.025 a 2 g/1) fue usada en reacciones paralelas para cuantificar la cantidad de 3-HP en los sobrenadantes de cultivo. El medio sin inocular fue usado como el blanco de reactivo. En donde sea necesario, el sobrenadante de cultivo fue diluido en medio para obtener una solución con concentraciones de 3-HP dentro de aquella de la curva estándar.
Las reacciones fueron incubadas a 37°C por 1 hora y se agregaron 20 µ? de revelador de color que contiene nitroazul de tetrasodio 1.43 mM, metosulfato de fenazina 0.143 y albúmina de suero bovino al 2.4% a cada reacción. Se permite que el revelado de color proceda a 37 °C por una hora adicional y se midió la absorbancia a 580 nm. La concentración de 3-HP en los sobrenadantes de cultivo fue cuantificada por comparación con los valores obtenidos de la curva estándar generada en la misma placa de microtitulo. Los resultados obtenidos con el análisis enzimático fueron verificados para coincidir con aquellos obtenidos mediante uno de los métodos analíticos descritos anteriormente. La Figura 23 provee una curva estándar representativa.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un método para producir un producto del consumidor a base de ácido acrilico, el método está caracterizado porque comprende : i) combinar una fuente de carbono y un cultivo celular de microorganismo para producir ácido 3-hidroxipropiónico, en donde : a) dicho cultivo celular comprende un inhibidor de ácido graso sintasa o dicho microorganismo es modificado genéticamente para la actividad enzimática reducida en la ruta de ácido graso sintasa del organismo; o b) en donde dicho microorganismo es modificado genéticamente por actividad enzimática incrementada en la ruta de malonil-CoA reductasa (mcr) del organismo mediante la introducción de una secuencia de ácido nucleico heteróloga que codifica por un polipéptido que tiene una actividad de de malonil-CoA reductasa mono-funcional; o c) dicho ácido 3-hidroxipropiónico es producido a una productividad especifica mayor de 0.05 gramos por gramo de célula de microorganismo en una base de peso seco por hora o a una productividad volumétrica mayor de 0.50 gramos por litro por hora; ii) donvertir el ácido 3-hidroxipropiónico a ácido acrilico; y iü) procesar el ácido acrilico a un producto del consumidor. 2. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la fuente de carbono tiene una proporción de carbono 14 a carbono 12 de aproximadamente 1.0 x 10"14 o mayor. 3. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque dicha fuente de carbono es predominantemente glucosa, sacarosa, fructosa, dextrosa, lactosa o una combinación de las mismas. 4. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque dicha fuente de carbono es menos de 50% de glicerol. 5. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque dicho cultivo celular comprende un inhi .bidor de ácido graso sintasa o dicho microorganismo es modificado genéticamente por actividad enzimática reducida en la ruta de ácido graso sintasa del organismo. 6. El método de la reivindicación 5, caracterizado porque dicho inhibidor de un ácido graso sintasa es seleccionado del qrupo que consiste de tiolactomicina, triclosán, cerulenina, tienodiazaborina, isoniazida y análogos de los mismos. 7. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque dicho microorganismo es modificado genéticamente por actividad enzimática incrementada en la ruta de malonil-CoA reductasa (mcr) del organismo mediante introducción de una secuencia de ácido nucleico heteróloga que codifica por un polipéptido que tiene actividad de malonil-CoA reductasa mono-funcional. 8. El método de la reivindicación 7, caracterizado porque dicha malonil-CoA reductasa mono-funcional es NADPH-independiente. 9. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque dicho ácido 3-hidroxipropiónico es producido a una productividad especifica mayor de 0.05 gramos por gramo de célula de microorganismo en una base de peso seco por hora o a una productividad volumétrica mayor de 0.05 gramos por litro por hora. 10. El método de la reivindicación 9, caracterizado porque dicho cultivo celular comprende un microorganismo modificado genéticamente. 11. El método de la reivindicación 10, caracterizado porque dicho microorganismo modificado genéticamente es modificado por un rasgo seleccionado de actividad enzimática reducida en la ruta de ácido graso sintasa del organismo, actividad enzimática incrementada en la ruta de malonil-CoA reductasa del organismo, tolerancia incrementada a ácido 3-hidroxipropiónico, actividad enzimática incrementada en la ruta de transhidrogenasa NADPH-dependiente del organismo, niveles de bicarbonato intracelular incrementado, actividad enzimática incrementada en la ruta de acetil-CoA carboxilasa del organismo y combinaciones de los mismos. 12. El método de la reivindicación 11, caracterizado porque dicho microorganismo modificado genéticamente es modificado por actividad enzimática reducida en la ruta de ácido graso sintasa del organismo. 13. El método de la reivindicación 12, caracterizado porque la actividad enzimática reducida es una reducción en actividad enzimática en una enzima seleccionada del grupo que consiste de beta-cetoacilo-ACP reductasa, 3-hidroxiacil-CoA deshidratasa, enoil-ACP reductasa y tioesterasa. 14. El método de la reivindicación 12, caracterizado porque dicha actividad enzimática reducida en la ruta de ácido graso sintasa del organismo ocurre via introducción de una secuencia de ácido nucleico heteróloga que codifica por un promotor inducible enlazado operativamente a una secuencia que codifica por una enzima en la ruta de ácido graso sintasa u homólogo de la misma o una secuencia de ácido nucleico heteróloga que codifica por una enzima en la ruta de ácido graso sintasa u homólogo de la misma con actividad reducida. 15. El método de la reivindicación 14, caracterizado porque dicha enzima en la ruta de ácido graso sintasa u homólogo de la misma es un polipéptido con actividad de beta-cetoacil-ACP o enoil-ACP reductasa sensible a la temperatura. 16. El método de la reivindicación 11, caracterizado porque dicho microorganismo modificado genéticamente es modificado por actividad enzimática incrementada en la ruta de malonil-CoA reductasa del organismo. 17. El método de la reivindicación 16, caracterizado porque dicho incremento en actividad enzimática en la ruta de malonil-CoA reductasa (mcr) ocurre mediante introducción de una secuencia de ácido nucleico heteróloga que codifica por un polipéptido que tiene actividad enzimática de malonil-CoA reductasa bi-funcional o actividad de malonil-CoA reductasa mono-funcional. 18. El método de la reivindicación 17, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico heteróloga es seleccionada de una secuencia que tiene por lo menos 70% de homología con una secuencia seleccionada de SEQ ID NO. 780-789. · 19. El método de la reivindicación 11, caracterizado porque dicho microorganismo modificado genéticamente es modificado por tolerancia incrementada al ácido 3-hidroxipropiónico . 20. El método de la reivindicación 19, caracterizado porque dicho incremento en tolerancia al ácido 3-hidroxipropiónico ocurre en uno o más componentes del complejo de 3-HP toleragénico (3HPTGC) o en donde dicho incremento en tolerancia al ácido 3-hidroxipropiónico resulta de proveer por lo menos una modificación genética de cada uno del Grupo A y Grupo B del 3HPTGC. 21. El método de la reivindicación 20, caracterizado porque el uno o más componentes son seleccionados de CynS, CynT, AroG, SpeD, SpeE, SpeF, ThrA, Asd, CysM, IroK, IlvA y homólogos dé los mismos. 22. El método de la reivindicación 20, caracterizado porque dicha modificación es una disrupción de uno o más genes represores de 3HPTGC. 23. El método de la reivindicación 22, caracterizado porque dicho's genes represores son seleccionados de tyrR, trpR, metJ, purR, lysR, nrdR y homólogos de los mismos. 24. El método de la reivindicación 11, caracterizado porque dicha actividad enzimática incrementada en la ruta de transhidrogenasa NADPH-dependiente del organismo ocurre mediante introducción de una secuencia de ácido nucleico heteróloga que codifica por un polipéptido que tiene por lo menos 70% de homología con una secuencia seleccionada de SEQ ID NO. 776 ó 778. 25. El método de la reivindicación 11, caracterizado porque los niveles de . bicarbonato intracelular incrementados ocurren mediante introducción de una secuencia de ácido nucleico heteróloga que codifica por un polipéptido que tiene actividad de cianasa y/o anhidrasa carbónica. 26. El método de la reivindicación 25, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico heteróloga es seleccionada de una secuencia que tiene por lo menos 70% de homología con una secuencia seleccionada de SEQ ID NO. 337. 27. El método de la reivindicación 11, caracterizado porque dicha actividad enzimática incrementada en la ruta de acetil-CoA carboxilasa del organismo ocurre mediante introducción de una secuencia de ácido nucleico heteróloga que codifica por un polipéptido que tiene por lo menos 70% de homología con una secuencia seleccionada de SEQ ID NO. 768-775. 28. El método de la reivindicación 11, caracterizado porque la bacteria modificada genéticamente es modificada además para disminuir la actividad de lactato deshidrogenasa, fosfato acetiltransferasa, piruvato oxidasa, o piruvato-formiato liasa y combinaciones de los mismos. 29. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque enseguida de la etapa (i) , el método comprende además separar y/o purificar el ácido 3-hidroxipropiónico del cultivo celular mediante extracción del ácido 3-hidroxipropiónico del cultivo en presencia de una amina terciaria. 30. El método de la reivindicación 29, caracterizado porque el ácido 3-hidroxipropiónico es producido a una productividad especifica mayor que 0.05 gramos por gramo de célula de microorganismo en una base de peso seco por hora o a una productividad volumétrica mayor de 0.50 'gramos por litro por hora. 31. El método de la reivindicación 1, caracterizado •porque el producto del consumidor es seleccionado del grupo que consiste de pañales, alfombra, pintura, adhesivos y vidrio acrilico. 32. El método de la reivindicación 31, caracterizado porque el producto del consumidor consiste de pañales. 33. Ácido 3-hidroxipropiónico producido biológicamente, caracterizado porque el ácido 3-hidroxipropiónico es producido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-32. 34. El ácido 3-hidroxipropiónico de acuerdo con la reivindicación 33, caracterizado porque el ácido 3-hidroxipropiónico está esencialmente libre de catalizador químico . 35. El ácido 3-hidroxipropiónico de acuerdo con la reivindicación 34, caracterizado porque el catalizador químico es un catalizador a base de molibdeno y/o vanadio. 36. El ácido 3-hidroxipropiónico de acuerdo con la reivindicación 33, caracterizado porque el ácido 3-hidroxipropiónico tiene una proporción de carbono 14 a carbono 12 de aproximadamente 1.0 x 10"14 o mayor. 37. El ácido 3-hidroxipropiónico de acuerdo con la reivindicación 33, caracterizado porque el ácido 3-hidroxipropiónico contiene menos de aproximadamente 10% de carbono derivado del petróleo. 38. El ácido 3-hidroxipropiónico de acuerdo con la reivindicación 33, caracterizado porque el ácido 3-hidroxipropiónico contiene una cantidad residual de material orgánico relacionado con su método de producción. 39. El ácido 3-hidroxipropiónico de acuerdo con la reivindicación 38, caracterizado porque el ácido 3-hidroxipropiónico contiene una cantidad residual de material orgánico en una cantidad de entre 1. y 1,000 partes por millón de dicho ácido 3-hidroxipropiónico. 40. Ácido acrilico caracterizado porque es producido a partir de ácido 3-hidroxipropiónico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 33-39. 41. Un polímero caracterizado porque es producido con ácido acrilico de acuerdo con la reivindicación 40. 42. Un producto del consumidor caracterizado porque es producido con ácido acrilico de acuerdo con la reivindicación 40. 43. El producto del consumidor de la reivindicación 42, caracterizado porque el producto del consumidor es seleccionado de pañales, alfombra, pintura, adhesivos y vidrio acrilico. 44. El producto del consumidor de la reivindicación 43, caracterizado porque el producto del consumidor consiste de pañales . 45. Un sistema para la bioproducción de ácido acrilico de acuerdo con la reivindicación 40, el sistema está caracterizado porque comprende: un tanque para la sacarificación de biomasa; una linea para hacer pasar el producto de sacarificación a un tanque de fermentación opcionalmente vía un tanque de pre-fermentación; un tanque de fermentación apropiado para cultivo celular de microorganismo; una linea para descargar el contenido del tanque de fermentación a un recipiente de extracción y/o separación; un recipiente de extracción y/o separación apropiado para la remoción de ácido 3-hidroxipropiónico del desperdicio de cultivo celular; una linea para transferir el ácido 3-hidroxipropiónico a un recipiente de deshidratación; y un recipiente de deshidratación apropiado para la conversión de ácido 3-hidroxipropiónico a ácido acrilico. 46. El sistema de la reivindicación 45, caracterizado porque comprende uno o más tanques de pre-fermentación, columnas de destilación, recipientes de centrifuga, columnas de retro-extracción, recipientes mezcladores o combinaciones de los mismos. 47. El sistema de la reivindicación 45, caracterizado porque el sistema tiene una capacidad de producción mínima de por lo menos 1 tonelada de ácido acrilico por año. 48. Un microorganismo modificado genéticamente, caracterizado porque el microorganismo es apto de producir 3-hidroxipropionato a una velocidad especifica seleccionada de velocidades mayores de 0.05 g/gDCW-h, 0.08 g/gDCW-h, mayor de 0.1 g/gDCW-h, mayor de 0.13 g/gDCW-h, mayor de 0.15 g/gDCW-h, mayor de 0.175 g/gDCW-h, mayor de 0.2 g/gDCW-h, mayor de 0.25 g/gDCW-h, mayor de 0.3 g/gDCW-h, mayor de 0.35 g/gDCW-h, mayor de 0.4 g/gDCW-h, mayor de 0.45 g/gDCW-h o mayor de 0.5 g/gDCW-h. 49. El microorganismo modificado genéticamente de la reivindicación 48, caracterizado porque el microorganismo comprende modificaciones genéticas para incrementar la actividad de malonil-coA reductasa y actividad de acetil-coA carboxilasa y modificaciones genéticas para reducir la actividad de enoil-ACP reductasa, actividad de lactato deshidrogenasa y actividad de acetato cinasa. 50. El microorganismo modificado genéticamente de la reivindicación 48, caracterizado porque microorganismo comprende modificaciones genéticas para incrementar la actividad de malonil-coA reductasa y actividad de acetil-coA carboxilasa y modificaciones genéticas para reducir la actividad de enoil-ACP reductasa, actividad de lactato deshidrogenasa y actividad de acetilfosfato transferasa. 51. El microorganismo modificado genéticamente de la reivindicación 48, caracterizado porque el microorganismo comprende modificaciones genéticas para incrementar la actividad de malonil-coA reductasa y actividad de acetil-coA carboxilasa y modificaciones genéticas para reducir la actividad de enoil-ACP reductasa, actividad de lactato deshidrogenasa, actividad de acetato cinasa y actividad de acetilfosfato transferasa. 52. El microorganismo modificado genéticamente de la reivindicación 48, caracterizado porque el microorganismo comprende modificaciones genéticas para incrementar la actividad de malonil-coA reductasa y actividad de acetil-coA carboxilasa y modificaciones genéticas para reducir la actividad de enoil-ACP reductasa, actividad de lactato deshidrogenase y actividad de piruvato formiato liasa. 53. El microorganismo modificado genéticamente de la reivindicación 48, caracterizado porque el microorganismo comprende modificaciones genéticas para incrementar la actividad de malonil-coA reductasa y actividad de acetil-coA carboxilasa y modificaciones genéticas para reducir la actividad de enoil-ACP reductasa, actividad de lactato deshidrogenasa y actividad de piruvato oxidasa. 54. El microorganismo modificado genéticamente de la reivindicación 48, caracterizado porque el microorganismo comprende modificaciones genéticas para incrementar la actividad de malonil-coA reductasa y actividad de acetil-coA carboxilasa y modificaciones genéticas para reducir la actividad de enoil-ACP reductasa, actividad de lactato deshidrogenasa y actividad de metilglioxal sintasa. 55. El microorganismo modificado genéticamente de la reivindicación 48, caracterizado porque el microorganismo comprende modificaciones genéticas para incrementar la actividad de malonil-coA reductasa y actividad de acetil-coA carboxilasa y modificaciones genéticas para incrementar la actividad de ß-cetoacil-ACP sintasa, actividad de lactato deshidrogenasa y actividad de metilglioxal sintasa. 56. El microorganismo modificado genéticamente de la reivindicación 48, caracterizado porque el microorganismo comprende modificaciones genéticas para incrementar la actividad de malonil-coA reductasa y actividad de acetil-coA carboxilasa y modificaciones genéticas para reducir la actividad de enoil-ACP reductasa, actividad de guanosina 3'-difosfato 5' -trifosfato sintasa y actividad de guanosina 3'-difosfato 5' -difosfato sintasa. 57. El microorganismo modificado genéticamente de cualquiera de las reivindicaciones 48-56, caracterizado porque se ha hecho modificación genética adicional que incrementa la actividad de NADH/NADPH transhidrogenasa. 58. El microorganismo modificado genéticamente dé la reivindicación 57, caracterizado porque la actividad de transhidrogenasa es soluble. 59. El microorganismo modificado genéticamente de la reivindicación 57, caracterizado porque la actividad de transhidrogenasa está enlazada a membrana. 60. El microorganismo modificado genéticamente de cualquiera de las reivindicaciones 48-59, caracterizado porque se hecho una modificación genética adicional que incrementa la actividad de cianasa. 61. El microorganismo modificado genéticamente de cualquiera de las reivindicaciones 48-60, caracterizado porque se hecho una modificación genética adicional que incrementa la actividad de anhidrasa carbónica. 62. El microorganismo modificado genéticamente de cualquiera de las reivindicaciones 48-60, caracterizado porque se ha hecho una modificación genética adicional que incrementa la actividad de piruvato deshidrogenasa . 63. El microorganismo modificado genéticamente de cualquiera de las reivindicaciones 48-62, caracterizado porque se ha hecho una modificación genética adicional que disminuye la actividad de guanosina 3' -difosfato 5'-trifosfato sintasa y la actividad de guanosina 3' -difosfato 5' -difosfato sintasa. 64. El microorganismo modificado genéticamente de cualquiera de las reivindicaciones 48-63, caracterizado porque se ha hecho una modificación genética que incrementa la proporción de NADH/NAD+ en un medio ambiente aereado. 65. El microorganismo modificado genéticamente de cualquiera de las reivindicaciones 48-64, caracterizado porque se ha hecho una modificación genética que disminuye la actividad ß-cetoacil-ACP sintasa. 66. El microorganismo modificado genéticamente de cualquiera de las reivindicaciones 48-65, caracterizado porque se ha hecho una modificación genética que disminuye la actividad de 3-hidroxipropionato reductasa. 67. El microorganismo modificado genéticamente de cualquiera de las reivindicaciones 48-66, caracterizado porque se ha hecho una modificación genética que disminuye la actividad de 3-hidroxipropionato deshidrogenasa NAD+ dependiente. 68. El microorganismo modificado genéticamente de cualquiera de las reivindicaciones 48-67, caracterizado porque se ha hecho una modificación genética que disminuye la actividad de 3-hidroxipropionato deshidrogenasa NAD+ dependiente . 69. El microorganismo modificado genéticamente de cualquiera de las reivindicaciones 48-68, caracterizado porque se ha hecho una modificación genética que incrementa la tolerancia al ácido 3-hidroxipropiónico . 70. El microorganismo modificado genéticamente de cualquiera de las reivindicaciones 48-69, caracterizado porque la modificación genética que da como resultado tolerancia incrementada a ácido 3-hidroxipropiónico incrementa la actividad de cualquier enzima en el complejo toleragénico de 3-HP. 71. El microorganismo modificado genéticamente de cualquiera de las reivindicaciones 69-70, caracterizado porque la modificación genética que da como resultado tolerancia incrementada al ácido 3-hidroxipropiónico incrementa la actividad de piruvato deshidrogenasa . 72. El microorganismo modificado genéticamente de cualquiera de las reivindicaciones 69-70, caracterizado porque la modificación genética que da como resultado tolerancia incrementada al ácido 3-hidroxipropiónico incrementa la actividad de cianasa. 73. El microorganismo modificado genéticamente de cualquiera de las reivindicaciones 69-70, caracterizado porque la modificación genética que da como resultado tolerancia incrementada al ácido 3-hidroxipropiónico incrementa la actividad de anhidrasa carbónica. 74. El microorganismo modificado genéticamente de cualquiera de las reivindicaciones 69-70, caracterizado porque la modificación genética que da como resultado tolerancia incrementada a ácido 3-hidroxipropiónico incrementa la actividad de aspartato cinasa. 75. El microorganismo modificado genéticamente de cualquiera de las reivindicaciones 69-70, caracterizado porque la modificación genética que da como resultado tolerancia incrementada al ácido 3-hidroxipropiónico incrementa la actividad de treonina deshidratasa . 76. El microorganismo modificado genéticamente de cualquiera de las reivindicaciones 69-70, caracterizado porque la modificación genética que da como resultado tolerancia incrementada al ácido 3-hidroxipropiónico incrementa la actividad de 2-deshidro-3-desoxifosfoheptonato aldolasa. 77. El microorganismo modificado genéticamente de cualquiera de las reivindicaciones 69-70, caracterizado porque la modificación genética que da como resultado tolerancia incrementada al ácido 3-hidroxipropiónico incrementa la actividad de cisteina sintasa. 78. El microorganismo modificado genéticamente de cualquiera de las reivindicaciones 69-70, caracterizado porque la modificación genética que da como resultado tolerancia incrementada al ácido 3-hidroxipropiónico incrementa la actividad de ribosa-fosfato difosfocinasa . 79. El microorganismo modificado genéticamente' de cualquiera de las reivindicaciones 69-70, caracterizado porque la modificación genética que da como resultado tolerancia incrementada al ácido 3-hidroxipropiónico incrementa la actividad de ribonucleósido-difosfato reductasa. 80. El microorganismo modificado genéticamente de cualquiera 1 de las reivindicaciones 69-70, caracterizado porque la modificación genética que da como resultado tolerancia incrementada al ácido 3-hidroxipropiónico incrementa la actividad L-cisteina desulfhidr'asa . 81. El microorganismo modificado genéticamente de cualquiera de las reivindicaciones 69-70, caracterizado porque la modificación genética que da como resultado tolerancia incrementada al ácido 3-hidroxipropiónico incrementa la actividad de lisina decarboxilasa, o en donde la modificación genética que da como resultado tolerancia incrementada al ácido 3-hidroxipropiónico incrementa la actividad de homocisteina transmetilasa . 82. El microorganismo modificado genéticamente de cualquiera de las reivindicaciones 69-70, caracterizado porque la modificación genética que da como resultado tolerancia incrementada al ácido 3-hidroxipropiónico incrementa la actividad de dihidrofoliato reductasa. 84. El microorganismo modificado genéticamente de cualquiera de las reivindicaciones 69-70, caracterizado porque la modificación genética que da como resultado tolerancia incrementada al ácido 3-hidroxipropiónico incrementa la actividad de N-acetilglutamilfosfato reductasa. 85. El microorganismo modificado genéticamente de cualquiera de las reivindicaciones 69-70, caracterizado porque la modificación genética que da como resultado tolerancia incrementada al ácido 3-hidroxipropiónico incrementa la actividad de acetiglutamato cinasa. 86. El microorganismo modificado genéticamente de cualquiera de las reivindicaciones 69-70, caracterizado porque la modificación genética que da como resultado tolerancia incrementada al ácido 3-hidroxipropiónico incrementa la actividad de argininosuccinato liasa. 87. El microorganismo modificado genéticamente de cualquiera de las reivindicaciones 69-70, caracterizado porque la modificación genética que da como resultado tolerancia incrementada al ácido 3-hidroxipropiónico incrementa la actividad de acetilornitina desacetilasa . 88. El microorganismo modificado gené icamente de cualquiera de las reivindicaciones 69-70, caracterizado porque la modificación genética que da como resultado tolerancia incrementada al ácido 3-hidroxipropiónico incrementa la actividad corismato mutasa. 89. El microorganismo modificado genéticamente de cualquiera de las reivindicaciones 69-70, caracterizado porque la modificación genética que da como resultado tolerancia incrementada al ácido 3-hidroxipropiónico incrementa la actividad de prefenato deshidratasa . 90. El microorganismo modificado genéticamente de cualquiera de las reivindicaciones 69-70, caracterizado porque la modificación genética que da como resultado tolerancia incrementada al ácido 3-hidroxipropiónico incrementa la actividad de prefenato deshidrogenasa. 91. El microorganismo modificado genéticamente de cualquiera de las reivindicaciones 69-70, caracterizado porque la modificación genética que da como resultado tolerancia incrementada al ácido 3-hidroxipropiónico incrementa la actividad de 2-deshidro-3-desoxifosfoheptonato aldolasa. 92. El microorganismo modificado genéticamente de cualquiera de las reivindicaciones 69-70, caracterizado porque la modificación genética que da como resultado tolerancia incrementada al ácido 3-hidroxipropiónico incrementa la actividad de D-3-fosfoglicerato deshidrogenasa. 93. Un sistema de cultivo que comprende una fuente de carbono en un medio acuoso y un microorganismo modificado genéticamente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 48-92, caracterizado porque el organismo modificado genéticamente está presente en una cantidad seleccionada de mayor de 0.05 gDCW/L, 0.1 gDCW/L, mayor de 1 gDCW/L, mayor de 5 gDCW/L, mayor de 10 gDCW/L, mayor de 15 gDCW/L o mayor de 20 gDCW/L. 94. El sistema de cultivo de la reivindicación 93, caracterizado porque el volumen del medio acuoso es seleccionado de mayor de 5 mi, mayor de 100 mi, mayor de 0.5 L, mayor de 1 L, mayor de 2 L, mayor de 10 L, mayor de 250 L, mayor de 1000 L, mayor de 10,000 L, mayor de 50,000 L, mayor de 100,000 L o mayor de 200,000 L. 95. El sistema de cultivo de cualquiera de las reivindicaciones 93-94, caracterizado porque el volumen del medio acuoso es mayor de 250 L y está contenido dentro de un recipiente de acero. 96. El sistema de cultivo de cualquiera de las reivindicaciones 93-95, caracterizado porque la fuente de carbono es seleccionada de dextrosa, sacarosa, una pentosa, un poliol, una hexosa, tanto una hexosa como una pentosa y combinaciones de los mismos. 97. El sistema de cultivo de cualquiera de las reivindicaciones 93-96, caracterizado porque el pH del medio acuoso es menor de 7.5. 98. El sistema de cultivo de cualquiera de las reivindicaciones 93-97, caracterizado porque el sistema de cultivo es aereado. 99. El sistema de cultivo de la reivindicación 98, caracterizado porque el sistema de. cultivo es aereado con una velocidad de transferencia de oxigeno seleccionada de: i) mayor de 5 mmoles/L-h de oxigeno y menos de 200 mmoles/L-h de oxigeno; ii) mayor de 5 mmoles/L-h de oxigeno y menos de 100 mmoles/L-h de oxigeno; iii) mayor de 5 mmoles/L-h de oxigeno y menos de 80 mmoles/L-h de oxigeno; y iv) mayor de 5 mmoles/L-h de oxigeno y menos de 50 mmoles/L-h de oxigeno. 100. Un caldo acuoso obtenido de un sistema de cultivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 93-99, caracterizado porque el caldo acuoso comprende: i) una concentración de 3-hidroxipropionato seleccionada de mayor de 5 g/l, mayor de 10 g/l, mayor de 15 g/l, mayor de 20 g/l, mayor de 25 g/l, mayor de 30 g/l, mayor de 35 g/l, mayor de 40 g/l, mayor de 50 g/l, mayor de 60 g/l, mayor de 70 g/l, mayor de 80 g/l, mayor de 90 g/l o mayor de 100 g/l de 3-hidroxipropionato; y ii) una concentración de 1 , 3-propandiol seleccionada de menos de 30 g/l; menos de 20 g/l; menos de 10 g/l; menos de 5 g/l; menos de 1 g/l; o menos de 0.5 g/l. 101. El caldo acuoso de acuerdo con la reivindicación 100, caracterizado porque el caldo acuoso comprende una cantidad de biomasa seleccionada de menos de 20 g de DC /L de biomasa, menor de 15 g de DCW/L de biomasa, menos de 10 g de DCW/L de biomasa, menos de 5 g de DCW/L de biomasa o menos de 1 g de DCW/L de biomasa. 102. El caldo acuoso de acuerdo con la reivindicación 100, caracterizado porque la proporción de 3-HP/succinato (gramos de 3-HP/g de succinato) es mayor de 3, mayor de 10, mayor de 30, mayor de 60, mayor de 100, mayor de 150 o mayor de 200. 103. El caldo acuoso de acuerdo con la reivindicación 100, caracterizado porque la proporción de 3-HP/fumarato (gramos de 3-HP/g de fumarato) es mayor de 3, mayor de 10, mayor de. 30, mayor de 60, mayor de 100, mayor de 150 o mayor de 200. 10 . El caldo acuoso de acuerdo con la reivindicación 100, caracterizado porque la proporción de 3-HP/glicerol (gramos de 3-HP/g de glicerol) es mayor de 3, mayor de 10, mayor de 30, mayor de 60, mayor de 100, mayor de 150 o mayor de 200. 105. El caldo acuoso de acuerdo con la reivindicación 100, caracterizado porque la proporción de 3-HP/acetato (gramos de 3-HP/g de acetato) es mayor de 1.5, mayor de 3, mayor de 10, mayor de 30, mayor de 60, mayor de 100, mayor de 150 o mayor de 200. 106. El caldo acuoso de acuerdo con la reivindicación 100, caracterizado porque la proporción de 3-HP/alanina (gramos de 3-HP/g de alanina) es mayor de 3, mayor de 10, mayor de 30, mayor de 60, mayor de 100, mayor de 150 o mayor de 200. 107. El caldo acuoso de acuerdo con la reivindicación 100, caracterizado porque la proporción de 3-HP/beta-alanina (gramos de 3-HP/g de beta-alanina) es mayor de 1.5, mayor de 3, mayor de 10, mayor de 30, mayor de 60, mayor de 100, mayor de 150 o mayor de 200. 108. El caldo acuoso de acuerdo con la reivindicación 100, caracterizado porque la proporción de 3-HP/glutamato (gramos de 3-HP/g de glutamato) es mayor de 3, mayor de 10, mayor de 30, mayor de 60, mayor de 100, mayor de 150 o mayor de 200. 109. El caldo acuoso de acuerdo con la reivindicación 100, caracterizado porque la proporción de 3-HP/glutamina (gramos de 3-HP/g de glutamina) es mayor de 3, mayor de 10, mayor de 30, mayor de 60, mayor de 100, mayor de 150 o mayor de 200. 110. El caldo acuoso de acuerdo con la reivindicación 100, caracterizado porque la proporción de 3-HP/3-hidroxipropionaldehido (gramos de 3-HP/g de 3-hidroxipropionaldehído) es mayor ' de 1.5, mayor de 3, mayor de 10, mayor de 30, mayor de 60, mayor de 100, mayor de 150 o mayor de 200. 111. El caldo acuoso de acuerdo con la reivindicación 100, caracterizado porque la proporción de 3-HP/l, 3-propandiol (gramos de 3- HP/g de 1, 3-propandiol) es mayor de 1.5, mayor de 3, mayor de 10, mayor de 30, mayor de 60, mayor de 100, mayor de 150 o mayor de 200. 112. El caldo acuoso de acuerdo con la reivindicación 100, caracterizado porque la proporción de 3-HP/lactato (gramos de 3-HP/g de lactató) es mayor de 3, mayor de 10, mayor de 30, mayor de 60, mayor de 100, mayor de 150 o mayor de 200.
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