CZ289051B6 - Mutanta karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu, kódový řetězec pro tuto mutantu, produkční mikroorganismus a způsob výroby aminokyseliny - Google Patents
Mutanta karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu, kódový řetězec pro tuto mutantu, produkční mikroorganismus a způsob výroby aminokyseliny Download PDFInfo
- Publication number
- CZ289051B6 CZ289051B6 CZ1996524A CZ52496A CZ289051B6 CZ 289051 B6 CZ289051 B6 CZ 289051B6 CZ 1996524 A CZ1996524 A CZ 1996524A CZ 52496 A CZ52496 A CZ 52496A CZ 289051 B6 CZ289051 B6 CZ 289051B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- residue
- phosphoenolpyruvate carboxylase
- leu
- mutation
- ala
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/14—Glutamic acid; Glutamine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/20—Aspartic acid; Asparagine
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Podstatu °e en tvo° mutanta karboxyl zy fosfoenolpyrohroznanu z mikroorganismu, n le ej c ho do rodu Escherichia s obsahem mutace pro desensitizaci inhibice karboxyl zy fosfoenolpyrohroznanu kyselinou asparagovou v d sledku zp tn vazby, v n mutac je n hrada zbytku kyseliny glutamov v poloze 625 zbytkem p°irozen aminokyseliny, odli n od kyseliny glutamov , po t no od N-zakon en karboxyl zy fosfoenolpyrohroznanu.\
Description
Vynález se týká mutanty karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu, kódového řetězce genu pro tuto mutantu, produkčního mikroorganismu a způsobu výroby aminokyseliny ze skupiny přírodních L-aminokyselin.
Dosavadní stav techniky
Karboxyláza kyseliny fosfoenolpyrohroznové je enzym, který se nachází téměř ve všech bakteriích a téměř ve všech rostlinách. Úlohou tohoto enzymu je biosyntéza kyseliny asparagové a kyseliny glutamové a přivádění dikarboxylové kyseliny, obsahující 4 atomy uhlíku do cyklu kyseliny citrónové k udržování chodu tohoto cyklu. Avšak při fermentačních postupech pro výrobu aminokyselin při použití mikroorganismů bylo až dosud uváděno jen málo skutečností, které by pomáhaly objasnit úlohu tohoto enzymu, šlo například o publikace Atsuschi Yokota alsamu Shiio, Agric. Biol. Chem., 52, 455 - 463, 1988, Josef Cremer a další, App.. Environ. Microbiol., 57, 1746 - 1752, 1991, Petra G., Peters-Weintisch, FEMS Microbiol. Letters, 112, 269-274, 1993.
Aminokyseliny jsou sloučeniny, které se universálně vyskytují v živých buňkách jako složky bílkovin, avšak pro dosažení hospodárného energetického metabolismu a hospodárného metabolismu jednotlivých sloučenin je produkce aminokyselin přesně řízena. Toto řízení spočívá v podstatě v tom, že výskyt výsledného produktu určité metabolické cesty způsobuje inhibici účinnosti enzymu, který katalyzuje některý z předchozích stupňů této metabolické cesty (zpětná vazba.) Tato skutečnost znamená, že také enzym karboxyláza fosfoenolpyrohroznanu podléhá při expresi své účinnosti kontrole a různých typů řízení.
Například v případě karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu v mikroorganismech, náležejícím do rodu Corynebacterium nebo do rodu Escherichia, je účinnost enzymu enihibována kyselinou asparagovou. To znamená, že svrchu uvedená biosyntéza aminokyseliny, při níž se tento enzym účastní, je rovněž inhibována kyselinou asparagovou.
Již dříve byly vyvinuty různé postupy pro účinnou výrobu aminokyselin fermentací, fermentativní produkce byla úspěšně uskutečněna pro leucin, isoleucin, tryptofan, fenylalanin a podobně tak, že byly použity mutanty kmenů, které byly touto mutací pozměněny tak, aby byly necitlivé ke svrchu uvedené zpětné vazbě. Není však známa žádná mutanta karboxylázy fosfoenylpyrohroznanu, která by byla necitlivá k inhibici působením kyseliny asparagové a nebyl také popsán žádný pokud využít takovou mutantu pro fermentativní výrobu aminokyselin ze skupiny kyseliny asparagové a kyseliny glutamové.
Na druhé straně gen ppc, který je kódovým řetězcem pro karboxylázu fosfoenolpyrohroznanu v Escherichia coli již byl klonován a byl také stanoven jeho nukleotidový řetězec, který byl popsán v publikaci Fujita N., Miwa T., Ishijima S., Izui K. a Katsuki H., J. Biochem., 95, 909 až 916, 1984. Prozatím však nejsou uváděny žádné zprávy o existenci mutant, které by byly desensitizovány, pokud jde o inhibici přítomností kyseliny asparagové.
Vynález si klade za úkol nalézt mutantu karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu, v podstatě desensitizovanou, pokud jde o inhibici zpětnou vazbou v přítomnosti kyseliny asparagové. Vynález si rovněž klade za úkol analyzovat nukleotidovou sekvenci kódového genu pro tuto karboxylázu a navrhnout také využití tohoto enzymu.
-1 CZ 289051 B6
Podstata vynálezu
Podstatu vynálezu tvoří mutanta karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu z mikroorganismu, náležejícího do roku Eschirichia s obsahem mutace pro desensitizací inhibice karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu kyselinou asparagovou v důsledku zpětné vazby, v níž mutací je náhrada zbytku kyseliny glutamové v poloze 625 zbytkem přirozené aminokyseliny, odlišné od kyseliny glutamové, počítáno od N-zakončení karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu.
Získání této mutanty bylo výsledkem dlouhodobých a pracných výzkumů, jimiž bylo zjištěno, že inhibici v přítomnosti kyseliny asparagové je možno vyřadit tak, že se aminokyselina ve specifické poloze karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu z Escherichia coli nahradí jinou aminokyselinou a současně se připraví kódový řetězec genu pro takovou mutantu uvedeného enzymu.
Podstatu vynálezu tvoří nejen mutanta karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu z mikroorganismu rodu Escherichia coli, nýbrž také řetězec DNA, který je kódovým řetězcem pro tuto mutantu.
Podstatu vynálezu tvoří také produkční mikroorganismus, náležející do rodu Escherichia nebo ke coryneformním bakteriím s obsahem uvedeného fragmentu DNA a také způsob výroby aminokyseliny ze skupiny L-lysin, L-threonin, L-methionin, L-isoleucin, kyselina L-glutamová, L-arginin a L-prolin tak, že se uvedený produkční mikroorganismus pěstuje ve vhodném živném prostředí a aminokyselina, vytvořená tímto mikroorganismem se z prostředí izoluje.
V průběhu přihlášky je kódový řetězec pro mutantu karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu nebo řetězec DNA s obsahem promotoru navíc k uvedenému kódovému řetězci uváděn také jako „řetězec DNA podle vynálezu“, „mutovaný gen“, „mutanta genu“ nebo „gen pro karboxylázu fosfoenolpyrohroznanu“.
Dále bude podstata vynálezu popsána podrobněji.
1) Mutanta karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu
Mutanta karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu podle vynálezu (dále jednoduše označovaná také jako „mutanta enzymu“) je obsažena v mikroorganismu, který náleží do rodu Escherichia a který obsahuje mutaci, způsobující desensitizací zpětné vazby, v jejímž důsledku dochází k inhibici enzymu v přítomnosti kyseliny asparagové.
Může jít o jakoukoliv mutaci za předpokladu, že jejím důsledkem dochází k desensitivaci svrchu uvedené zpětné vazby, která způsobuje inhibici, a to bez ztráty účinnosti enzymu karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu. Jako příklad je možno uvést, že v případě výskytu mutanty karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu v buňkách mikroorganismu, který náleží do rodu Escherichia, je uvedený buněčný materiál odolný proti působení sloučeniny s následujícími vlastnostmi:
sloučenina má inhibiční účinek na růst mikroorganismu, který náleží do rodu Escherichia, produkujícího karboxylázu fosfoenolpyrohroznanu divokého typu,
- inhibiční účinnost na růst svrchu uvedeného typu se výrazněji projevuje po přidání kyseliny L-glutamové nebo L-asparagové a
- sloučenina způsobuje inhibici účinnosti karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu divokého typu.
-2CZ 289051 B6
Pokud jde o uvedení příkladů mutované karboxylázy fosfoenolpyrozhronanu, je možno uvést od N-zakončení:
1) Mutaci, při níž je zbytek kyseliny glutamové v poloze 625 nahrazen zbytkem lysinu,
2) mutaci, při níž je zbytek argininu v poloze 22 nahrazen zbytkem histidinu a zbytek kyseliny glutamové v poloze 223 je nahrazen zbytkem lysinu,
3) mutaci, při níž je zbytek šeřinu v poloze 288 nahrazen zbytkem fenylalaninu, zbytek kyseliny glutamové v poloze 289 nahrazen zbytkem lysinu, methionin v poloze 551 je nahrazen isoleucinem a zbytek kyseliny glutamové v poloze 804 je nahrazen lysinem,
4) mutace, při níž je alanin v poloze 867 nahrazen zbytkem threoninu,
5) mutace, při níž je zbytek arginu v poloze 438 nahrazen zbytkem cysteinu a
6) mutace, při níž je zbytek lysinu v poloze 620 nahrazen zbytkem šeřinu.
Pokud jde o karboxylázu fosfoenolpyrohroznanu z mikroorganismu, náležejícího do rodu Escherichia, je řetězec aminokyselin, odvozený od genu pro karboxylázu fosfoenolpyrohroznanu z Escherichia coli (Fujita N., Miwa T., Ischijima S., Uzui K. a Katsuki H., J. Biochem., 95, 909 až 916, 1984) znázorněn jako řetězec č. 2 v dále uvedeném seznamu řetězců. Mimoto je celý nukleotidový řetězec plasmidu pT2, který obsahuje gen pro karboxylázu fosfoenolpyrohroznanu z Escherichia coli znázorněn jako řetězec č. 1 spolu s odpovídajícím řetězcem aminokyselin.
Pro uvedené mutované enzymy jsou kódovými řetězci řetězce DNA podle vynálezu, tak jak budou dále uvedeny, enzymy jsou pak tvořeny expresí těchto řetězců v Escherichia coli a podobných kmenech.
2) Řetězec DNA podle vynálezu a mikroorganismy, které tyto řetězce obsahují
Řetězec DNA podle vynálezu je kódový řetězec DNA pro svrchu uvedenou mutantu enzymu a obsahuje mutantu, v jejíž důsledku dochází k desensitizaci inhibice karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu zpětnou vazbou v přítomnosti kyseliny asparagové. Uvedená mutace se zejména nachází v kódové oblasti fragmentu DNA, který je kódem pro uvedený enzym v mikroorganismu, náležejícího do rodu Escherichia.
Dále budou uvedeny jednotlivé příklady řetězců DNA, které jsou kódovými řetězci pro karboxylázu fosfoenolpyrohroznanu a obsahují některou ze svrchu uvedených typů mutací 1) až 6), například v nukleotidovém řetězci č. 1, tak jak bude dále uveden. Příkladem může být řetězec DNA, který obsahuje některou z následujících mutací:
i) mutaci, která zaj istí přeměnu GAA v polohách 2109 až 2111 na AAA nebo AAG, ii) mutaci pro přeměnu CGC v polohách 900 - 902 na CAT nebo CAC a pro přeměnu bází GAA v polohách 903 - 905 na AAA nebo AAG, iii) mutaci, která zajistí přeměnu bází TCT v polohách 1098 - 1100 na TTT nebo TTC, bází GAA v polohách 1101 - 1103 na AAA nebo AAG, bází ATG v polohách 1887 - 1889 na ATT, ATC, nebo ATA a bází GAA v polohách 2646 - 2648 na AAA nebo AAG, iv) mutaci, která zajistí přeměnu bází GCG v polohách 2835 - 2837 na baze ACT, ACC, ACA nebo ACG,
v) mutace, která zajistí přeměnu bází CGT v polohách 1548 - 1550 na TGT nebo TGC a
-3CZ 289051 B6 iv) mutaci pro přeměnu bází AAA v polohách 2094 -2096 na TCT, TCC, TCA nebo TCG.
Mutovaný gen svrchu uvedeného typu je možno získat tak, že se rekombinantní DNA připravená vazbou genu divokého typu pro karboxylázu fosfoenolpyrohroznanu nebo genu s jinou mutací na DNA vektoru, vhodnou pro použití ve zvoleném hostiteli podrobí mutaci tak, aby bylo možno vzniklé mutované kmeny sériově vyšetřit na výskyt požadované mutace. Je také možno poskytovat tak, že se podrobí mutaci mikroorganismus, který produkuje enzym divokého typu, takže vzniká mutovaný kmen, produkující mutovaný enzym a pak se z tohoto mutovaného kmene izoluje příslušný gen a analyzuje se jeho řetězec, pro vyvolání mutace v rekombinantní DNA je možno použít například hydroxylamin a podobné látky. V případě, že se podrobuje mutaci mikroorganismus, je možno mutaci vyvolat působením chemických látek nebo jiným postupem, běžně užívaných pro vyvolání umělých mutací.
Mimoto je možno při použití dalších postupů, například metodou, využívající překrývání prodloužených zakončení podle publikací Ho S. N., Hunt H. D., Horton R., M., Pullen J. K. aPease L. R., Gene, 77, 51 - 59, 1998, metodou pro vyvolání mutací, specifických pro určitou polohu podle Kramer W. a Frits H. J., Meth. In Enzyml., 154, 350, 1987, Kunkel T. A. a další, Meth. in Enzymol., 154, 367, 1987 a podobnými postupy rovněž připravit mutovaný gen cílenou mutací, například náhradou jedné aminokyseliny jinou aminokyselinou, přidáním nebo vypuštěním některé aminokyseliny a podobně, k přípravě mutace je možno použít gen pro divoký enzym nebo gen, který již obsahuje mutaci jiného typu. Tyto metody jsou založeny na principu, při němž se jako matrice užívá DNA nemutovaného genu a jako jeden z primerů se užívá syntetická DNA, která v místě mutace není homologní a obsahuje jiné báze, takže dochází k syntéze komplementárního řetězce pro DNA svrchu uvedeného genu a tím k zavedení požadované mutace. Při použití svrchu uvedených postupů je možno zavést cílenou mutaci do jakékoliv zvolené polohy kódového řetězce DNA pro enzym.
Je také možno postupovat tak, že se syntetizuje řetězec, který na obou svých zakončeních obsahuje místa pro štěpení restrikčními enzymy a přitom zahrnuje obě sousední místa mutace a pak se odpovídající část řetězce zamění za odpovídající část nemutovaného genu, čímž se získá gen s obsahem požadované mutace (mutace s použitím kazety).
Gen pro karboxylázu fosfoenolpyrohroznanu, kteiý je genem pro enzym divokého typu nebo který obsahuje jinou mutaci a má být použit pro zavedení požadované mutace může být jakýkoliv gen za předpokladu, že jde o kódový řetězec pro svrchu uvedený enzym karboxylázu fosfoenolpyrohroznanu, tak jak je produkována mikroorganismy, náležejícími do rodu Escherichia, s výhodou jde o gen, u nějž byl analyzován řetězec bází a který byl klonován. V případě, že gen nebyl klonován, je možno fragment DNA s obsahem genu podrobit amplifikaci a izolovat použitím PCR-metody a podobně, pak se užije vhodný vektor pro klonování.
Ze svrchu popsaných genů je možno jako konkrétní příklad uvést gen Escherichia coli, který byl klonován a jehož řetězec bází byl analyzován, tak jak je uvedeno v publikaci Fujita N., Miwa T., Ishijima S., Izui K. a Katsuki H., J. Biochem., 95, 909 - 916, 1984. Sekvence bází v kódové oblasti tohoto genu je znázorněn v řetězci č. 1, jde o báze č. 237 - 2888.
Sériové sledování hostitele na obsah mutovaného genu je možno provést při použití sloučenin, analogické kyseliny asparagové. Tato analogická sloučenina by s výhodo měla zejména způsobovat inhibici růstu mikroorganismu z rodu Escherichia, produkujícího enzym karboxylátu fosfoenolpyrohroznanu divokého typu, přičemž tato inhibiční účinnost na růst by měla být vyvolána nebo obnovena přítomností kyseliny L-glutamové nebo L-asparagové.
V případě, že mutovaný kmen je odolný proti působení svrchu uvedené látky a byl získán selekcí z mikroorganismu, náležejícího krodu Eschirichia, například Eschirichia coli, HB101, u nějž dochází k produkci divokého typu enzymu karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu a inhibice růstu
-4CZ 289051 B6 tohoto mikroorganismu byla použita jako index pro selekci, je velmi pravděpodobné, že byl izolován hostitelský mikroorganismus, schopný produkovat enzym karboxylázu fosfoenolpyrohroznanu, u nějž nedochází působením zpětné vazby v přítomnosti kyseliny asparagové k inhibici enzymatické účinnosti.
Bylo navrhováno použít jako obecnou strukturu při sledování inhibice uvedeného enzymu dikarboxylovou kyselinu s obsahem 4 atomů uhlíku. Z tohoto hlediska byly sledovány různé sloučeniny. Kmen Eschirichia coli HB101 byl pěstován v živném prostředí LB a pak přenesen do prostředí M9 s obsahem 20 mikrogramů/ml thiaminu a 3 mikrogramy/ml každé z aminokyselin Leu a Pro, mimoto obsahovalo živné prostředí některou z kyselin ze skupiny kyseliny DL-2-amino-4-fosfonomáselné, kyseliny bromjantarové, kyseliny meso-2,3-dibromjantarové, kyseliny 2,2-difluoijantarové, kyseliny 3-brompyrohroznové, kyseliny alfa-ketomáselné, kyseliny alfa-ketoadipové, kyseliny DL-threo-beta-hydroxyasparagové, kyseliny alfa-methylDL-asparagové, beta-methylesteru kyseliny L-asparagové, kyseliny 2,3-diaminojantarové nebo beta-hydrazinu kyseliny asparagové a pak byla měřena absorbance živného prostředí v průběhu času při 660 nm, čímž byla sledována rychlost růstu mikroorganismu.
V případě, že tyto látky byly přítomny v živném prostředí v koncentraci, způsobující inhibici růstu mikroorganismu, bylo dále sledováno, zda je možno tuto inhibici vyvolat přidáním nukleových kyselin (uridin nebo adenosin 10 mg/dl), kyseliny glutamové nebo aminokyselin ze skupiny kyseliny asparagové (asp: 0,025 %, nebo Met, Thr nebo Lys, v koncentraci 0,1 %).
Jako výsledek těchto pokusů byly vybrány tři sloučeniny, a to 3-brompyrohroznan (3BP) (1), aspartát-beta-hydrazid (AHY) (2) a DL-threo-beta-hydroxyaspartát, (betaHA) (3).
COO
I c=o
I
CH2Br
CONHNH2
I
HCH
I
H3NCH
I
COOH
COOH
I
HCOH
I h3nch
COOH
...(1)
-(2)
Inhibice růstu Escherichia coli těmito analogickými sloučeninami je znázorněn na obr. 1 až 3. Mimoto je růst Escherichia coli v případě přidání uvedených látek jednotlivě nebo ve směsi dvou látek nebo tří látek znázorněn na obr. 4 až 6. Mimoto je jako kontrola znázorněn růst v případě
-5CZ 289051 B6 přidání některé z těchto látek bez přítomnosti inhibiční látky na obr. 7. Na obr. 4 až 7 znázorňují přísady 1, 2 a 3 nukleové kyseliny, glutamovou kyselinu nebo aminokysleiny ze skupiny kyseliny asparagové.
Mimoto byl sledován inhibiční účinek na účinnost v přítomnosti analogické sloučeniny. Surový enzym karboxyláza kyseliny fosfoenolyprohroznanové byl připraven z kmene Eschirichia coli HB101 způsobem podle publikace The Joumal of Biochemistry, sv. 67, č. 4, 1970, enzymatická účinnost byla měřena způsobem podle publikace Eur. J. Chiobhem., 202, 797 - 803,1991.
Kmen Escherichia coli HB101, vypěstovaný v živném prostředí LB byl rozrušen a suspenze byla odstředěna, čímž byl získán supematant, který byl použit jako roztok surového enzymu. Měření účinnosti enzymu bylo uskutečněno měřením poklesu absorbance při 340 nm a současně byl použit acetylkoenzym A, o němž je známo, že je schopen ovlivnit účinnost v koncentraci 0,1 mM v měřicím systému, který obsahuje 2 mM fosfoenolyprohroznanu draselného, 0,1 mM NADH, 0,1 M tris-acetátu o pH 8,5, 1,5 jednotky malátdehydrogenázy a surový enzym. Výsledky jsou znázorněny na obr. 8.
Ze získaných výsledků po provedení popsaných pokusů je zřejmé, že tři svrchu uvedené sloučeniny způsobují inhibici růstu Escherichia coli a tuto inhibici není možno překonat přidáním samotné nukleové kyseliny, avšak je možno ji překonat přidáním kyseliny glutamové nebo aminokyselin ze skupiny kyseliny asparagové. Je proto možno předpokládat, že uvedené analogické sloučeniny jsou selektivními inhibitory karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu. Jak bude uvedeno v následujících příkladech, je možno při použití těchto látek uskutečnit selekci kmenů Escherichia coli, které produkují mutantu karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu.
V případě, že se cíleně izoluje při použití svrchu uvedených sloučenin mutovaný enzym a pro tento enzym se izoluje gen a připraví se rekombinantní DNA, je k dispozici gen pro mutantu enzymu. Je také možno postupovat tak, že se vytvoří přímo mutovaný mikroorganismus a kmeny s předpokládanou mutantou genu pro enzym se pak sledují při použití svrchu uvedených sloučenin. Tímto způsobem se izoluje fragment DNA s obsahem mutovaného genu pro enzym a tento fragment je pak možno uložit do vhodného vektoru a přenášet.
Na druhé straně byly provedeny ještě další velmi pracné pokusy, týkající se důležitosti argininového zbytku v bílkovině pro vazbu aspartátu v Escherichia coli, jak bylo popsáno v publikacích Krikos A., Mouth N., Boyd A. a Simon Μ. I., Ceel, 33, 615 - 622, 1983, Mowbray S. L. a Koshland D. E., J. Biol. Chem., 264, 15638 - 15643, 1990, Milbum Μ. V., Prive G. G., Milligan D. L., Scott W. G., Yeh J., Jancarik J., Koshland D. E. a Kim S. H., Science, 254, 1342 - 1347, 1991. Bylo zjištěno, že inhibice působením asparagové kyseliny je vpodstatě desensitizována v případě, že se v genu pro karboxylázu fosfoenolpyrohroznanu nahradí argininový zbytek v poloze 438 cysteinovým zbytkem. Aby bylo možno nahradit argininový zbytek v poloze 438 cysteinovým zbytkem, je nutno v kódovém řetězci pro karboxylázu fosfoenolpyrohroznanu nahradit kodon pro arginin v uvedené poloze kodonem pro cystein. Například v řetězci č. 1 je možno převést kodon CGT v poloze nukleotidů 1548 - 1550 na TGT nebo TGC.
Dále byla provedena chemická modifikace lysinového zbytku vkarboxyláze fosfoenolpyrohroznanu při použití kyseliny 2,4,6-trinitrobenzensulfonové, TNBS, o níž je známo, že je schopna chemicky modifikovat lysinové zbytky v bílkovinách. V průběhu modifikační reakce byla v prostředí přítomna kyselina jablečná, která slouží jako inhibitor karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu. Bylo totiž předpokládáno, že by lysinový zbytek v blízkosti místa vazby karboxylázy fosfoenolyprohroznanu mohl být chráněn navázanou kyselinou jablečnou a tak by mohl uniknout chemické modifikaci. V důsledku těchto pokusů byl vysloven předpoklad, že lysinový zbytek v poloze 620 je důležitý pro vazbu kyseliny jablečné na karboxylázu fosfoenolpyrohroznanu a bylo prokázáno, že je možno zrušit inhibici uvedeného enzymu zpětnou vazbou v přítomnosti kyseliny asparagové a současně zachovat enzymatickou účinnost karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu tak, že se lysinový zbytek v poloze 620 nahradí serinovým
-6CZ 289051 B6 zbytkem. Aby bylo možno skutečně nahradit lysinový zbytek v poloze 620 serinovým zbytkem, je nutno v kódonovém řetězci genu pro karboxylázu fosfoenolpyrohroznanu převést kodon pro lysin v poloze 620 na kodon pro serin v téže poloze. Například v řetězci č. 1 je možno nahradit kodon AAA s čísly nukleotidů 2094 - 2006 některý z kodonů TCT, TCC, TCA, TCG, AGT nebo AGC.
V souladu s potupy, které jsou v oboru známy, například s postupem překrývajících se řetězců pro extensi podle publikace Ho S. N., Hunt H. D., Horton R. M., Pullen J. K., a Pease L. R., Gene, 77, 51 - 5í, 1989, pomocí specificky cílené mutace podle publikací Kremer W. a Frits H.
J. , Meth. in Enzymol., 154, 350, 1987, Kunkel T. A. a další Meth. in Enzymol., 154, 367, 1987 a podobně je možno dosáhnout přeměny určitého kodonu zavedením mutace například záměnou jednoho zbytku aminokyseliny za jiný zbytek, uložením nebo vypuštěním kodonu pro některý zbytek v genu pro karboxylázu fosfoenolpyrohroznanu, přičemž může jít o gen divokého typu nebo o gen, obsahující jinou mutaci. Tyto postupy jsou založeny na tom, že se jako matrice užije gen bez mutace a jako jeden z primerů se užije syntetická DNA, která obsahuje odlišné kodony v místě mutace a syntetizuje se komplementární řetězec pro tuto DNA, čímž dochází k zavedení požadované mutace. Při použití těchto postupů je možno vyvolat požadovanou mutaci v jakékoliv poloze.
Je také možno postupovat tak, že se syntetizuje řetězec, obsahující na obou zakončeních místo působení restrikčního enzymu, přičemž řetězec současně obsahuje místo mutace a obě strany řetězce po stranách této mutace, načež se pak tento řetězec použije jako náhrada odpovídající části mutovaného genu, čímž dochází k zavedení mutace (mutace pomocí kazety).
K. expresi kódového fragmentu DNA pro mutaci karboxylázy fosfoenolpyrohroznové, uloženého svrchu uvedeným způsobem dochází při použití vhodného systému vektoru a hostitele, čímž je možno dosáhnout produkce mutovaného enzymu. Je také možno postupovat tak, že se uskuteční transformace integrací fragmentu DNA podle vynálezu do chromosomové DNA hostitele, takže přímo dochází k produkci požadované mutanty enzymu.
Z vhodných hostitelů je možno jako příkladu uvést mikroorganismy, náležející do rodu Eschetichia, například Escherichia coli, coryneformní bakterie a podobně. Coryneformní bakterie zahrnují bakterie, náležející do rodu Coryneformní bakterie zahrnují bakterie, náležející do rodu Coryneacterium, bakterie rodu Brevibacterium byly až dosud klasifikovány jako rod Brevibacterium, avšak nyní jsou nově zařazovány do rodu Coiynebacterium vzhledem k tomu, že jde o bakterie, které jsou tomuto rodu velmi blízce příbuzné. Jednotlivé kmeny hostitelských bakterií, výhodně pro produkci aminokyselin, budou dále podrobněji popsány.
Jako DNA vektoru je výhodný zejména plasmid, přičemž by mělo jít o plasmid, schopný samostatné replikace v hostitelských buňkách. Například v případě, že se jako hostitel užije Eschirichia coli, je možno použít plasmid pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG399, RSF1010 a podobně. Mimoto je také možno užít DNA fágu.
V případě, že hostitelem jsou coryneformní bakterie, je možno použít vektory a hostitele, tak jak jsou dále jako příklady uvedeny, číslo uložení jednotlivých kmenů ve veřejných sbírkách je uvedeno v závorce.
pAJ655 Escherichia coli AJ11882 (FERMBP-136)
Corynebacterium glutamicum SR8201 (ATCC 39135) pAJ1844 Escherichia coli AJ11883 (FERM BP-137)
Coiynebacterium glutamicum SR8202 (ATCC 39136) pAJ611 Escherichia coli AJ11884 (FERM BP-138)
-7CZ 289051 B6 pAJ3148 Coiynebacterium glutamicum SR8203 (ATCC 39137) pAJ440 Bacillus subtilis AJ11901 (FERM BP-140).
Uvedené vektory je možno získat z mikroorganismů, uložených ve veřejných sbírkách následujícím způsobem. Buněčný materiál, oddělený v logaritmické fázi růstu se rozruší při použití lysozymu a SDS a odstředí při 30 000 g, čímž se získá supematant, k němuž se přidá polyethylenglykol k oddělení a čištění vektorů při použití hustotního gradientu chloridu česného a ethidiumbromidu po dosažení vodovážného stavu a odstřední.
Aby bylo možno transformovat Escherichia coli rekombinantním vektorem, získaným uložením řetězcem DNA podle vynálezu do svrchu uvedeného vektoru, je možno použít postup, obvykle užívaný pro transformaci Escherichia coli, například postupu, při němž se buněčný materiál zpracovává chloridem vápenatým, aby se zvýšila permeabilita pro DNA, jak bylo popsáno například v publikaci Mandel M. a Higa A., J. Mol. Biol., 53,159, 1977.
V průběhu transformace coryneformních bakterií je rovněž možno použít svrchu uvedený postup, při němž se na buněčný materiál působí chloridem vápenatým, nebo postup, při němž se provádí uložení DNA ve specifickém období růstu, jenž buňky mohou DNA přijímat (pokud jde o Bacillus subtilis, Duncan C. H. a další). Dále je možno zařazení do bakteriálních buněk dosáhnout tak, že se vytvoří u příjemců DNA protoplasty nebo s feroplasty, snadno přijímající DNA plasmidu. Takové útvary jsou známé v případě Bacillus substilis, Actinomyces a u kvasinek podle publikací Chang S. a další, Molec. Gen. Genet., 168, 111, 1979, Bibb a další, Nátuře, 274, 398, 1979, Hinnen A. a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 75, 1929, 1978. Další postup pro transformaci coryneformních bakterií je uveden ve zveřejněné japonské patentové přihlášce č. 2-207791.
Aby bylo možno dosáhnout exprese řetězce DNA podle vynálezu ve svrchu uvedených hostitelských buňkách, je možno použít promotor, například lac, trp, PL a podobně, který je účinný u mikroorganismů nebo v případě, že řetězec DNA podle vynálezu již obsahuje promotor genu pro karboxylázu fosfoenolpyrohroznanu, je možno použít tento gen jako takový. V případě, že se jako hostitel užije coryneformní bakterie, je také možno použít známý promotor trp z bakterií rodu Brevibacterium podle zveřejněné japonské patentové přihlášky č. 62-244382 a podobně.
Jak již bylo svrchu uvedeno, je možno postupovat tak, že se řetězec DNA podle vynálezu uloží do vektoru, schopného samovolné replikace a v tomto vektoru se uloží do hostitele ve formě plasmidu, je však také možno řetězec DNA podle vynálezu integrovat přímo do chromosomu mikroorganismu při použití transposonu podle publikace Berg D.E. a Berg C.M., Bio/Technol., 1,417, 1983, fágu Mu podle zveřejněné japonské patentové přihlášky č. 2-109985 nebo při použití homologní rekombinace podle publikace Experimente in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab., 1972. Mimoto je k integraci DNA podle vynálezu do coryneformních bakterií možno využít plasmidů, citlivých na různé teploty podle zveřejněné japonské patentové přihlášky č. 5-7491.
V případě, že se pěstuje mikroorganismus, transformovaný řetězcem DNA podle vynálezu svrchu uvedených způsobem a při pěstování dochází k expresi tohoto řetězce DAN, získá se mutovaný enzym. Při měření účinnnosti po přidání kyseliny asparagové k reakčnímu systému, v němž se enzym nachází, záleží na tom, zda byl mutovaný enzym desensitizován, pokud jde o zpětnou vazbu, v jejím důsledku dochází k inhibici enzymu v přítomnosti kyseliny asparagové. Při měření účinnosti enzymu k tomuto účelu je možno použít spektrometrického postupu podle publikace Xoshunage T., Izui K. a Katsuki H., J. Biochem., 68, 747 - 750, 1970 a podobně.
Řetězec DNA podle vynálezu je kódovým řetězcem pro mutantu enzymu s desentizovanou zpětnou vazbou,která je příčinou inhibice enzymu v přítomnosti kyseliny asparagové. To
-8CZ 289051 B6 znamená, že mikroorganismus, který tento řetězec DNA obsahuje, může být využit pro účinnou fermentační produkci aminokyselin ze skupiny kyseliny asparagové a kyseliny gíutamové, jak bude dále popsáno.
Kmeny Escherichia coli AJ12907, AJ 12908, AJ12909 a AJ12910 s obsahem genu pro mutovaný enzym, jak bude popsáno v následujících příkladech, byly uloženy ve veřejné sbírce kultur a National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology (1-3, Higashi 1-chome, Tsukaba-shi, Ibaraki-ken, Japonsko, zip cod 305) pod čísly FERM P-13774, FERM P-13775, FERM P-13776 a FERM P-13777, dne 3. srpna 1993, pak byly kmeny z původního uložení přeneseny do oddělení na bázi Budapešťské úmluvy dne 11. července 1994 a jednotlivým kmenům ve stejném pořadí byla udělena nová čísla uložení FERM BP-4734, FEMR BP-4735, FERM BP-4736 a FERM BP-4737.
3) Výroba aminokyselin
Aminokysleiny je možno získat tak, že se pěstuje mikroorganismus, obsahující řetězec DNA podle vynálezu ve vhodném živném prostředí a vzniklé aminokyseliny se izolují. Jako příklad aminokyselin, které je možno tímto způsobem získat, je možno uvést L-lysin, L-threonin, L-methionin, L-isoleucin, kyselinu L-glutamovou, L-arginin a L-prolin.
Výhodným hostitelem, vhodným pro uložení DNA podle vynálezu je řada dále uvedených hostitelských kmenů, tyto kmeny budou jednotlivě uvedeny spolu s vhodností použití pro určité aminokyseliny a spolu s vhodnými způsoby pěstování.
1) Hostitelské kmeny, výhodné pro produkci aminokyselin podle vynálezu
i) kmeny, vhodné pro produkci L-lysinu.
Z hostitelských kmenů pro pěstování k získání L-lysinu je možno uvést například bakterie, náležející do rodu Escherichia, s výhodou Escherichia coli, produkující L-lysin. Jako příklad je možné zejména uvést mutovaný kmen s odolností proti analogu lysinu. Jde o analog lysinu, způsobující inhibici růstu mikroorganismu rodu Eschirichia, avšak tato inhibice je částečně nebo úplně potlačena v případě, že prostředí současně obsahuje L-lysin. Může jít například o oxalysin, hydroxamát lysinu, S-(2-aminoethyl)cystein, dále uváděný jako AEC, gammamethyllysin, alfa-chlorkaprolaktam a podobně. Mutované kmeny s odolností proti těmto analogům lysinu je možno získat zavedením běžné umělé mutace do mikroorganismů rodu Escherichia. Konkrétním bakteriálním kmenem, vhodným pro použití pro výrobu L-lysinu je například Escherichia coli AJ11442 (FERM P-5084, zveřejněná japonská patentová přihláška č. 56-18596, dolní levý sloupec na str. 471).
Pro účely vynálezu je možno použít také různé umělé mutanty coryneformních bakterií k produkci L-lysinu. Z umělých mutovaných kmenů je možno uvést například AEC resistentní mutovaný kmen, dále mutovaný kmen, který pro svůj růst vyžaduje aminokyselinu, například L-homoserin (zveřejněná japonská patentová přihláška č. 48-28078 a 56-6499), mutovaný kmen sodolností proti AEC, navíc vyžadují krustu přítomnosti aminokyseliny, jako L-leucinu, L-homoserinu, L-prolinu, L-serinu, L-argininu, L-aianinu, L-valinu a podobně (US patentové spisy č. 3 708 395 a 3 825 472), dále mutovaný kmen, produkující L-lysin, s odolnosti proti DLalfa-amino-eta-kaprolaktamu, alfa-aminoiauryllaktamu a N-Iaurylleucinu, L-lysin produkující mutovaný kmen s odolností proti inhibitoru oxalacetátdekarboxylázy nebo enzymům respiračního systému (zveřejněné japonské patentové přihlášky č. 50-53588, 50-31093, 52-102498, 53-86089, 55-9783, 55-9759, 56-32995, 56-39778 a také 53-43591 a 53-1833), dále L-lysin produkující mutovaný kmen, který ke svému růstu vyžaduje inositol nebo kyselinu octovou (zveřejněné japonské patentové přihlášky č. 55-9784 a 56-8692), L-lysin produkující mutovaný kmen, citlivý na fluorpyrohroznan nebo na teplotu nižší než 34 °C (zveřejněné japonské patentové přihlášky č. 55-9783 a 53-86090) a také mutovaný kmen Brevibacterium
-9CZ 289051 B6 nebo Coiynebacterium s odolností proti ethylenglykolu, produkující L-lysin (US patentová přihláška č. 333 455).
Dále budou uvedeny konkrétní cyronoformní bakterie, vhodné k produkci lysinu:
Brevibacterium Iactofermentum AJ 12031 (FEMR BP-277), str. 525 zveřejněné japonské patentové přihlášky č. 60-62994,
Brevibacterium Iactofermentum ATCC 39134, spodní pravý sloupec na str. 473 ve zveřejněné japonské patentové přihlášce č. 60-62994.
Brevibacterium Iactofermentum AJ3463 (FERM-P1987), zveřejněná japonská patentová přihláška 4: 51-34477.
Mimoto je však možno užít při provádění způsobu podle vynálezu stejně dobře dále popsané kmeny divokých bakterií coryneformního typu:
| Corvnebacterium acetoicidoDhilum Corvnebacterium acetoglutamicum Corvnebacterium callunae Corvnebacterium glutamicum | ATCC 13870 ATCC 15806 ATCC 15991 ATCC 13032 ATCC 13060 |
| (Brevibacterium divaricatum) (Brevibacterium Iactofermentum) (Corvnebacterium lilium) Corvnebacterium melassecola Brevibacterium saccharolvticum Brevibacterium immarioDhilum Brevibacterium roseum Brevibacterium flavum Brevibacterium thiogenitalis Microbacterium ammoniaohilum | ATCC 14020 ATCC 13869 ATCC 15990 ATCC 17965 ATCC 14066 ATCC 14068 ATCC 13825 ATCC 13826 ATCC 19240 ATCC 15354 |
ii) Hostitelské kmeny, vhodné pro použití k produkci L-threoninu
Escherichia coli B-3996 (RIA 1867), zveřejněná japonská patentová přihláška č. 3-501682 (PCT),
Escherichia coli AJ12349 (FERM-P9574), horní levý sloupec na str. 887 zveřejněné japonské patentové přihlášky č. 2-458,
Escherichia coli AJ12351 (FERM-P9576), spodní pravý sloupec na str.887 zveřejněné japonské patentové přihlášky č. 2-458,
Escherichia coli AJ12352 (FERM P-9577), horní levý sloupec na str. 888 zveřejněné japonské patentové přihlášky ě. 2—458,
Escherichia coli AJ 11332 (FERM P-4898), horné levý sloupec na str. 889 zveřejněné japonské patentové přihlášce č. 2-458,
Escherichia coli AJ12350 (FERM P-9575), horní levý sloupec na str. 889 zveřejněné japonské patentové přihlášky č. 2.458,
Escherichia coli AJ1353 (FERM P-9578), horní pravý sloupec na str. 889 zveřejněné japonské patentové přihlášky č. 2-258,
-10CZ 289051 B6
Escherichia coli AJ12358 (FERM P-9764), horní levý sloupec na str. 890 zveřejněné japonské patentové přihlášky č. 2^458,
Escherichia coli AJ12359 (FEMR P-9765), horní levý sloupec na str. 890, zveřejněné japonské patentové přihlášky č. 2-458,
Escherichia coli AJ11334 (FERM P-4900), sloupec 6 na str. 201 zveřejněné japonské patentové přihlášky č. 1-29559,
Escherichia coli AJ11333 (FERM P-4899), sloupec 6, na str. 201 zveřejněné japonské patentové přihlášky č. 1-29559,
Escherichia coli AJ11335 (FERM P-4901), sloupec Ί na str. 202 zveřejněné japonské patentové přihlášky č. 1-29559.
Jako příklady coryneformních bakterií je možno uvést následující bakteriální kmeny:
Brevibacterium lacofermentum AJ11188 (FERM P-4190), horní pravý sloupec na str. 473 zveřejněné japonské patentové přihlášky č. 60-87788,
Corynebacterium glutamicum AJ 11682 (FERM BP-118), sloupec 8 na str. 230 zveřejněné japonské patentové přihlášky č. 2-31956,
Brevibacterium flavumA JI 1683 (FERM BP-119), sloupec 10 na str. 231 zveřejněné japonské patentové přihlášky č. 2-31956.
iii) Hostitelské kmeny, vhodné pro produkci L-methioninu
Jako příklady bakterií, vhodných pro produkci L-methioninu je možno uvést následující kmeny:
Escherichia coli AJ11457 (FERM P-5175), horní pravý sloupec na str. 552 zveřejněné japonské patentové přihlášky č. 56-35992,
Escherichia coli AJ11458 (FERM P-5176), horní pravý sloupec na str. 552 zveřejněné japonské patentové přihlášky č. 56-35992,
Escherichia coli AJ11459 (FERM P—5177), horní pravý sloupec na str. 551 zveřejněné japonské patentové přihlášky č. 56-35992,
Escherichia coli AJ11539 (FERM P-5479), dolní levý sloupec na str. 435 zveřejněné japonské patentové přihlášky č. 56-144092,
Escherichia coli AJ11540 (FERM P-5480), spodní levý sloupec na str. 435 zveřejněné japonské patentové přihlášky č. 56-144092,
Escherichia coli AJ11541 (FERM P—5481), spodní levý sloupec na str. 435 zveřejněné japonské patentové přihlášky č. 56-144092,
Escherichia coli AJ11542 (FERM P-5482), spodní levý sloupec na str. 435 zveřejněné japonské patentové přihlášky č. 56-144092,
-11 CZ 289051 B6 iv) Hostitelské kmeny, vhodné pro produkci kyseliny L-asparagové
Jako příklady vhodných bakterií k tomuto účelu je možno uvést následující kmeny bakterií:
Brevibacterim flavum AJ3859 (FERM P-2799) homí levý sloupec na str. 254 zveřejněné japonské patentové přihlášky č. 51-61589,
Brevibacterium lactofermentum AJ3860 (FERM P-2800), homí levý sloupec na str. 524 zveřejněné japonské patentové přihlášky č. 51-61689,
Corynebacterium acetoacidophilum AJ3877 (FERM-P2803), homí levý sloupec na str. 524 zveřejněné japonské patentové přihlášky č. 51—61689,
v) Hostitelské kmeny, vhodné pro produkci L-isoleucinu
Escherichia coli KX141 (VKPM-B4781), kmen, uvedený ve 45. odstavci zveřejněné japonské patentové přihlášky č. 4-33027 je možno uvést jako příklad bakterií rodu Eschericha a Brevibacterium lactofermentum AJ12404 (FERM P—10141), kmen, uvedený v dolním levém sloupci na str. 603 ve zveřejněné japonské patentové přihlášce č. 2—42988 a Brevibacterium flavum AJ 12405 (FERM P—10142) spodní levý sloupec na str. 524 zveřejněné japonské patentové přihlášky č. 2-42988 je možno uvést jako příklady použitelných coryneformních bakterií.
vi) Hostitelské kmeny, vhodné pro produkci kyseliny L-glutamové
Z bakterií, náležejících do rodu Escherichia je k tomuto účelu možno použít následujících kmenů:
Escherichia coli AJ12628 (FERM P-12380), francouzský patentový spis č. 2 680 178 (1993),
Escherichia coli AJ 12634 (FERM P-12379), francouzský patentový spis Č. 2 680 178 (1993).
Z coryneformních bakterií je k tomuto účelu možno použít následující kmeny:
Brevibacterium lactofermentum AJ 12745 (FERM BP-2922), spodní pravý sloupec na str. 561 zveřejněné japonské patentové přihlášky č. 3-49690,
Brevibacterium lactofermentum AJ 12746 (FERM BP-2923), homí levý sloupec na str. 562 zveřejněné japonské patentové přihlášky č. 3-49690,
Brevibacterium lactofermentum AJ12747 (FERM BP-2924), homí levý sloupec na str. 562 zveřejněné japonské patentové přihlášky č. 3-49690,
Brevibacterium lactofermentum AJ 12748 (FERM BP-2925), homí levý sloupec na str. 562 zveřejněné japonské patentové přihlášky č. 3-49690,
Brevibacterium flavum ATCC 14067, tabulka 1 na str. 3 zveřejněné japonské patentové přihlášky č. 5-3793,
Corynebacterium glutamicum ATCC 21492, tabulka 1 na str. 3 zveřejněné japonské patentové přihlášky č. 5-3793.
-12CZ 289051 B6 vii) Hostitelské kmeny, výhodné pro použití k produkci L-argininu
Z bakteriálních kmenů rodu Escherichia je pro toto použití možno uvést následující kmeny:
Escherichia coli AJ11593 (FERM P-5616), horní levý sloupec na str. 468 zveřejněné japonské patentové přihlášky č. 57-5693,
Escherichia coli AJ11594 (FERM P-5617), horní pravý sloupec na str. 468 zveřejněné japonské patentové přihlášky č. 57—‘5693.
Z coryneformních bakterií je možno jako vhodné uvést následující kmeny:
Brevibacterium flavum AJ12144 (FERM P-7642), sloupec 4, na str. 174 zveřejněné japonské patentové přihlášky č. 5-27388,
Corynebacterium glutamicum AJ12145 (FERM P-7643), sloupec 4 na str. 174 zveřejněné japonské patentové přihlášky č. 5-27388,
Brevibacterium flavum ATCC 21493, tabulka 1 na str. 3 zveřejněné japonské patentové přihlášky č. 5-3793,
Corynebacterium glutamicum ATCC 21569, tabulka 1 na str. 3, zveřejněné japonské patentové přihlášky č. 5-3793, viii) Hostitelské kmeny, vhodné pro použití při produkci L-prolinu
Z kmenů, náležejících do rodu Escherichia je pro toto použití možno uvést následující kmeny:
Escherichia coli AJ11543 (FERM P-5483), spodní levý sloupec na str. 435 zveřejněné japonské patentové přihlášky č. 56-144093,
Escherichia coli AJ11544 (FERM P-5484), spodní levý sloupec na str. 435 zveřejněné japonské patentové přihlášky č. 56-144093.
Z coryneformních bakterií je možno jako vhodné pro toto použití uvést následující kmeny:
Brevibacterium lactofermentumA JI 1225 (FERM P-4370), horní levý sloupec na str. 473 zveřejněné japonské patentové přihlášky č. 60-87788,
Brevibacterium flavum AJ11512 (FERM P—5332), sloupec 2 na str. 185 zveřejněné japonské patentové přihlášky č. 62-36679,
Brevibacterium flavum AJ11513 (FERM P—5333), sloupec 2, na str. 185 zveřejnění japonské patentové přihlášky č. 62-36679,
Brevibacterium flavum AJ11514 (FERM P-5334), sloupec 2, na str. 185 zveřejněné japonské patentové přihlášky č. 62-36679,
Corynebacterium glutamicum AJ11522 (FERM P-5342), sloupec 2, na str. 185 zveřejněné japonské patentové přihlášky č. 62-36679,
Coiybacterijm glatamicum AJ11523 (FERM P—5343), sloupec 2, na str. 185 zveřejněné japonské patentové přihlášky č. 62-36679.
-13CZ 289051 B6
2) Způsob kultivace
Způsob kultivace svrchu uvedených hostitelských kmenů není zvláště odlišný od způsobu kultivace známých mikroorganismů, produkujících aminokyseliny. Užívá se běžné živné prostředí, které obsahuje zdroj uhlíku, zdroj dusíku, zdroj anorganických iontů a popřípadě stopová množství organický živin, například aminokyselin, vitaminů a podobně.
Ze zdrojů uhlíku je možno použít glukózu, sacharózu, laktózu a podobně, včetně hydrolyzátu škrobu, syrovátky, melasy a podobných materiálů. Ze zdrojů dusíku je možno použít plynný amoniak, vodný amoniak, amonné soli a podobně. V případě, že se užije mutovaný kmen, který ke svému růstu potřebuje aminokyseliny nebo podobně, je také nezbytné přidávat příslušné množství takové živiny, například aminokysleiny, do živného prostředí. Dále bude jako například uvedeno v tabulce 1 živné prostředí, vhodné pro produkci lysinu. Živné prostředí se sterilizuje a po sterilizaci je popřípadě možno přidat ještě uhličitan vápenatý.
Tabulka 1
| Složka | množství |
| glukóza | 5 g/dl |
| (NH^SC^ | 2,5 g/dl |
| KH2PO4 | 0,2 g/dl |
| MgSO4.7H2O | 0,1 g/dl |
| extrakt z kvasnic | 0,05 g/dl |
| thiaminhydrochlorid | 1 pg/l |
| biotin | 300 pg/l |
| FeSO4.7H2O | 1 mg/ml |
| MnSO4.4H2O | 1 mg/ml |
| uhličitan vápenatý (pH 7,0) | 2,5 g/dl |
Mikroorganismus se pěstuje tak dlouho, až se nahromadí aminokyselina, která má být vyprodukována, v průběhu pěstování se upravuje pH a teplota a udržují se aerobní podmínky. K izolaci aminokyselin z živného prostředí je možno použít běžné postupy.
Vynálezu bude dále osvětlen v souvislosti s přiloženými výkresy.
Přehled obrázků na výkresech
Na obr. 1 je znázorněna inhibice růstu v přítomnosti 3-brompyrohroznanu.
Na obr. 2 je znázorněna inhibice růstu působením aspartát-beta-hydrazidu.
Na obr. 3 je znázorněna inhibice růstu v přítomnosti DL-threo-beta-hydroxyaspartátu.
Na obr. 4 je znázorněn zvrat inhibice růstu 3-pyrohroznanem působením různých látek.
Na obr. 5 je znázorněn zvrat inhibice růstu aspartát-beta-hydrazidem působením některých látek.
Na obr. 6 je znázorněn zvrat inhibice růstu DL-threo-beta-hydroxyaspartátem působením různých látek.
Na obr. 7 je znázorněn vliv některých látek na růst mikroorganismů.
Na obr. 8 je znázorněna inhibice karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu některými látkami.
-14CZ 289051 B6
Na obr. 9 je znázorněna inhibice karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu podle vynálezu kyselinou asparagovou.
Na obr. 10 je znázorněna inhibice karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu podle vynálezu kyselinou asparagovou.
Na obr. 11 je znázorněn způsob zavedení mutace do genu pro karboxylázu fosfoenolpyrohroznanu.
Na obr. 12 je znázorněn vliv kyseliny asparagové na účinnost karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu divokého typu a na účinnost mutantu téhož enzymu, v němž byl arginin v poloze 438 nahrazen cysteinem (počítáno od N-zakončení).
Na obr. 13 je znázorněn vliv kyseliny asparagové na účinnost karboxylázy divokého typu a mutanty, v níž byl lysin v poloze 620 nahrazen serinem (počítáno od N-zakončení).
Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následující příklady.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Příprava mutanty genu pro karboxylázu fosfoenolpyrohroznanu
Mutovaný gen byl připraven při použití plasmidu pS2. Tento plasmid byl získán uložením klonovaného genu pro karboxylázu fosfoenolpyrohroznanu s analyzovaným řetězcem bází do místa působení enzymu Sall v plasmidu pBR322. Plasmid pS2 obsahuje gen pro odolnost proti ampicilinu jako značící gen podle publikace Sabe H. a další, Gene, 31, 279 - 283, 1984. Nukleotidový řetězec genu pro karboxylázu fosfoenolpyrohroznanu, obsažený v plasmidu pS23 je tentýž řetězec, jaký je obsažen ve svrchu uvedeném plasmidu pT2.
DNA plasmidu pS2 byla zpracovávána 2 hodiny při teplotě 75 °C roztokem s obsahem hydroxylaminu (20 mikrogramů/ml) DNA pS2, 0,05 M fosfát sodný o pH 6,0, 1 mM EDTA a 0,4 M hydroxylaminu). Vzhledem k citlivosti působení hydroxylaminu na pH smíseno 80 mikrolitrů l M hydroxylaminhydrochloridu a 1 mM EDTA o pH 6,0 po úpravě hydroxidem sodným, 100 mikrolitrů 0,1 M fosfátu sodného o pH 6,0 a 1 mM roztok EDTA a TE-pufr (10 mM trisHC1 a 1 mM EDTA) s obsahem 2 mikrogramů DNA plasmidu pS2, objem směsi byl doplněn vodou na 200 mikrolitrů.
Za svrchu uvedených podmínek přežívá 0,2 % transformovaných organismů v závislosti na svém stavu před zpracováním při použití živného prostředí s obsahem ampicilinu, po zpracování je plasmidem pS2 zpracován kmen Escherichia coli HB101.
Kmen Escherichia coli HB 101, transformovaný pS2 po zpracování hydroxylaminem byl naočkován na pevné živné prostředí s obsahem ampicilinu tak, aby bylo získáno přibližně 10 000 kolonií transformovaného mikroorganismu. Tyto kolonie byly uvedeny do suspenze v kapalném živném prostředí a pak byly naočkovány na pevné živné prostředí s obsahem některé ze sloučenin ze skupiny 3-brompyrohroznan (3BP), aspartát-beta-hydroxanát (AHX), aspartátbeta-hydrazid (AHY) a DL-threo-beta-hydroxyaspartát (betaHA) jako analogů kyseliny asparagové v koncentraci v blízkosti minimální inhibiční koncentrace k získání 103 až 10’ buněk na jednu plotnu s pevným živným prostředím a vzniklé kolonie byly podrobeny selekci.
-15CZ 289051 B6
Ze 100 kmenů, resistentních proti působení uvedených látek byla karboxyláza fosfoenolpyrohroznanu, produkovaná těmito kmeny částečně čištěna způsobem podle publikace The Joumal of Biochemistry, sv. 67, č. 4, 1970, a byla sledována inhibice účinnosti enzymů působením analogů kyseliny asparagové. Enzymatická účinnost byla měřena svrchu uvedeným způsobem.
Mimoto byly z bakteriálních kmenů, produkujících mutované enzymy izolovány plasmidy zejména v případě enzymů, které nebyly inhibovány analogy kyseliny asparagové a tyto plasmidy byly uloženy do kmene Escherichia coli PCR1, jde o kmen, jemuž chybí karboxyláza fosfoenolpyrohroznanu, jak bylo popsáno v Sabe H. a další, Gene, 31, 279 - 283, 1984, aby bylo možno potvrdit produkci mutovaných enzymů.
Tímto způsobem bylo z transformantů získáno pět genů pro mutovaný enzym. Na základě stanovení řetězce bází v těchto kmenech bylo prokázáno, že dva kmeny obsahovaly tutéž mutaci, takže byly získány čtyři druhy mutovaných genů.
Transformanty, které tyto kmeny obsahovaly, byly označeny AJ12907, AJ1208, AJ 12909 a AJ12910 a byly uloženy do veřejné sbírky kultur National Institure of Bioscience and Human Technology of Agency of industrial Science and Technology, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukubashi, Ibaraki-ken, Japonsko, zip code 305, 3. srpna 1993 pod č. FERM P-13774, FERM P-13775, FERM P-13776 a FERM P-13777 a z původní sbírky byly pak kmeny přeneseny do mezinárodní části sbírky podle Budapešťské úmluvy 11. července 1994, kde byly označeny novými čísly FERM BP—4734, FERM BP-4735, FERM BP-4736 a FERM BP-4737 ve svrchu uvedeném prostředí. Mimoto byly plasmidy obsažené v těchto kmenech označeny pBP5, pHA19, pBP122 a pR6, rovněž ve svrchu uvedeném pořadí. Mutace v genech pro karboxylázu fosfoenolpyrohroznanu v těchto plasmidech jsou uvedeny v následující tabulce 2. Číselné hodnoty v této tabulce znamenají číslo nukleotidu nebo číslo aminokyseliny v řetězci č. 1.
Tabulka 2
| transformant | plasmid | mutace | náhrada aminokyseliny v důsledku mutace |
| AJ12907 | pBP5 | awG-A | ‘“Glu-Lys |
| AJ12908 | pHA19 | ^G-A | 222Arg-»HÍ3 |
| 223Glu-*Lys | |||
| AJ12909 | pBP122 | «ot | “•Ser^Phe |
| 1101G-A | ^Glu-Lys | ||
| 1M,G-A | |||
| 2644G-A | •^Glu-^Lys | ||
| AJ12910 | pR6 | «’ο-α | M7Ala-Thr |
V případě kmenů AJ 12907 a AJ12909 byla selekce provedena na prostředí s obsahem 500 mikrogramů/ml, v případě kmene AJ 12908 bylo užito prostředí s obsahem 1000 mikrogramů/ml betaHA a v případě AJ12910 bylo užito prostředí, obsahující 500 mikrogramů/ml AHY.
-16CZ 289051 B6
Příklad 2
Mutanta karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu
Pro karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu, produkované svrchu uvedenými čtyřmi transformovanými kmeny byla sledována citlivost na kyselinu asparagovou. Tyto bakteriální kmeny jsou kmeny, jimž chybí gen pro karboxylázu fosfoenolpyrohroznanu, takže celé množství produkovaného enzymu pochází z uloženého plasmidu.
i.
Citlivost na kyselinu asparagovou byla sledována v souladu se známým postupem podle publikace Yoshinaga T., Izui K. a Katsuki H., J. Biochem., 68, 747 - 750, 1970. Byla měřena účinnost enzymu, produkovaného každým z transformovaných kmenů nebo Escherichia coli s obsahem plasmidu pS2 v přítomnosti acylkoenzymu A, o němž je známo, že ovlivní systém pro měření účinnosti, v koncentraci 0,1 nebo 1 mM, citlivost na kyselinu asparagovou, naměřená tímto způsobem je uvedena na obr. 9 alO.
Z uvedených výsledků je zřejmé, že v případě enzymu divokého typu dochází ke ztrátě účinnosti v přítomnosti vyšší koncentrace kyseliny asparagové, zatímco v případě mutované karboxylázy fosfoenopyrohroznanu podle vynálezu si enzym v podstatě uchovává celou svou účinnost.
Příklad 3
Fermentativní produkce L-threoninu kmenem Escherichia coli s genem pro mutantu karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu
Z bakterií, produkujících threonin je v současné době známým kmenem s nejvyšší produkcí této látky kmen Eschirichia coli B-3996, popsaný ve zveřejněné japonské patentové přihlášce č. 3-501682 (PCT). Po vyhodnocení mutované karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu byl proto uvedený kmen užit jako hostitelský kmen. Kmen B-3996 byl uložen ve veřejné sbírce kultur Research Institute for Genetics and Industrial Microorganism Breeding pod registračním číslem RIA 1867. Dále byl pro uvedenou sérii pokusů použit plasmid pBP5 jako plasmid s obsahem genu pro mutantu karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu.
Plasmid pBP5, obsahující gen pro mutantu karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu byl uložen do kmene Escherichia coli B-3996 v souladu se známým postupem podle publikace Hanahan, J. Mol. Biol., sv. 106, str. 577, 1983 a byl izolován transformovaný mikroorganismus.
V kontrolním pokusu byl tentýž kmen Escherichia coli B-3006 transformován tímtéž způsobem při použití plasmidu pS2, aby bylo dosaženo exprese genu pro divoký typ karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu.
V případě, že kmen Escherichia coli B-3996 a transformanty tohoto kmenu byly naočkovány v Sakaguchiho lahvi s objemem 500 ml a s obsahem 20 ml prostředí se složením, které je uvedeno v tabulce 3 a pak byly kmeny pěstovány 40 hodin při teplotě 37 °C, došlo k produkci různých množství L-threoninu, získané výsledky jsou shrnuty v následující tabulce 4. Svrchu uvedené živné prostředí bylo připraveno ve dvou podílech, z nichž první podíl obsahoval glukózu, MgSC>4 . 7H2O a ostatní složky s výjimkou uhličitanu vápenatého, tento podíl byl upraven na pH 7,0 přidáním hydroxidu draselného a pak byl sterilizován v autoklávu 10 minut při teplotě 115 °C, načež byl přidán odděleně sterilizovaný uhličitan vápenatý v množství 30 g/1.
-17CZ 289051 B6
Tabulka 3
| složka | množství g/1 |
| glukóza | 40 |
| síran amonný | 16 |
| dihydrogenfosforečnan draselný | 1 |
| síran hořečnatý. 7H2O | 1 |
| síran železnatý. 7H2O | 0,01 |
| síran manganatý. 5H2O | 0,01 |
| extrakt z kvasnic (Difco) | 2 |
| L-Met | 0,5 |
| uhličitan vápenatý | 30 |
| Tabulka 4 | |
| bakteriální kmen | produkce threoninu g/1 |
| Escherichia coli B-3996 | 15,7 |
| Escherichia coli B-3996/pS2 | 15,8 |
| Escherichia coli B-3996/pBP5 | 16,8 |
Jak je z výsledků zřejmé, dochází u kmene Escherichia coli B-3996/pBP5 k expresi genu pro 10 mutovaný enzym, uloženého v uvedeném plasmidu, takže takto transformovaný kmen má zlepšenou produkci threoninu ve srovnání s kmenem Escherichia coli B-3996/pS2, který obsahuje plasmid s genem pro divoký typ enzymu.
Příklad 4
Fermentativní produkce kyseliny L-glutamové kmene Escherichia coli s uloženým genem pro mutovanou karboxylázu fosfoenolpyrohroznanu
Jako bakterie, produkující kyselinu galutamovou byl užit kmen s dosud známou nejvyšší produkcí této kyseliny, Escherichia coli AJ-12628, popsaný ve zveřejněné japonské patentové přihlášce č. 4-11461. Po vyhodnocení mutanty karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu byl tedy uvedený kmen použit jako hostitelský kmen.
Kmen AJ-12628 byl uložen ve veřejné sbírce kultur vNational Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology pod registračním číslem FERM BP-385. Plasmid pBP5 byl vybrán pro vyhodnocení mutanty karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu pro uložení do svrchu uvedeného kmene.
Plasmid pBP5, obsahující gen pro mutantu karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu byl uložen do kmene Escherichia coli AJ-12628 v souladu se způsobem, popsaným v publikaci Hanahan J. Mol. Biol., sv. 106, str. 577, 1983 a byl izolován transformovaný mikroorganismus. Stejným způsobem byl při použití plasmidu pS2 připraven ještě další odlišný transformovaný mikroorganismus na bázi kmene Escherichia coli AJ-12628.
Kmen Escherichia coli AJ-12628 a svrchu uvedené transformanty byly naočkovány v Sakaguchino lahvi s objemem 500 ml do 20 ml živného prostředí, jehož složení je uvedeno v následující tabulce 5 a pak byly mikroorganismy pěstovány 36 hodin při teplotě 37 °C a byla sledována produkce kyseliny L-glutamové. Získané výsledky jsou shrnuty v následující tabulce 40 6. Svrchu uvedené prostředí bylo připraveno ve dvou podílech, z nichž s výjimkou uhličitanu vápenatého. Tento podíl byl upraven na pH 7,0 hydroxidem draselným a pak byl 10 minut
-18CZ 289051 B6 sterilizován v autoklávu při teplotě 115 °C, načež k němu byl přidán odděleně sterilizovaný uhličitan vápenatý v množství 30 g/1.
Tabulka 5
| složka | množství g/1 |
| glukóza | 40 |
| síran amonný | 16 |
| dihydrogenfosforečnan draselný | 1 |
| síran hořečnatý. 7H2O | 1 |
| síran železnatý. 7H2O | 0,01 |
| síran manganatý. 5H2O | 0,01 |
| extrakt z kvasnic (Difco) | 2 |
| uhličitan vápenatý | 30 |
| Tabulka 6 | |
| bakteriální kmen | kyselina glutamová g/1 |
| Escherichia coli AJ-12628 | 18,0 |
| Escherichia coli AJ-12628/pS2 | 18,3 |
| Escherichia coli AJ-12628/pBP5 | 19,6 |
Jak je z výsledků zřejmé, dochází u kmene Escherichia coli AJ-12628/pBP5 s obsahem genu pro mutantu enzymu k expresi tohoto genu a důsledkem této exprese je zlepšená schopnost produkce kyseliny glutamové ve srovnání s kmenem Escherichia coli AJ-12628/pS2, který obsahuje 15 plasmid s genem pro divoký typ enzymu.
Příklad 5
Produkce L-lysinu coryneformními bakteriemi s uloženým genem pro mutantu karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu
Aby bylo možno uložit gen pro mutantu uvedeného enzymu do coryneformních bakterií a dosáhnout jeho exprese, byl získán promotor z bakterií, náležejících do rodu Brevibacterium 25 a tento promotor byl pak navázán na gen pro mutantu svrchu uvedeného enzymu k získání plasmidu pro expresi. Tento plasmid byl pak uložen do bakterie, náležející do rodu Brevibacterium tak, aby bylo možno dosáhnout produkce L-lysinu těmito bakteriemi.
1) Příprava genu pro aspartokinázu AK z bakterií, náležejících do rodu Brevibacterium
Chromosomová DNA byla připravena běžným známým způsobem při použití divokého kmene Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum), ATCC 13869. Z chromosomové DNA byl amplifikován gen pro AK s použitím PCR-reakce (řetězová polymerázová reakce podle publikace White T. J. a další, Trensd Genet., 5, 185, 1989. Pro primery DNA, použité při 35 amplifíkaci byly syntetizovány oligonukleotid (23-mer), řetězec č. 3 a oligonukleotid (21 mer) řetězec č. 4 tak, aby bylo možno amplifikovat oblast v rozsahu přibližně 1643 párů bází, která je kódovou oblastí genu Ak na bázi řetězce, známého z mikroorganismu Corynebacterium glutamicum podle Molecular Microbiology, 1919, 5 (5), 1197 - 1204, Mol. Gen. Genet., 1990, 224,317-324.
Syntéza DNA byla uskutečněna v souladu s běžným postupem s použitím fosfoamiditu podle Tetrahedron Letters, 1981, 22, 1859, při použití syntetizátoru DNA model 380B (Applied
-19CZ 289051 B6
Biosystems CO). V průběhu PCR-reakce bylo použito zařízení DNA Thermal Cycler PJ2000 (Takara Shuzo Co., Ltd.) a amplifikace genu byla uskutečněna při použití Taq-DNA-polymerázy podle návodu výrobce.
Přítomnost amplifikovaného fragmentu genu o 1643 kb byla potvrzena elektroforézou na agarosovém gelu, pak byl fragment z gelu vyříznut a čištěn běžnými postupy, načež byl rozštěpen restrikčními enzymy Nrul (Takara Shuzo Co, Ltd) a EcoRI (Takara Shuzo Co., Ltd.). Plasmid pHSG399 podle publikace Takeshita S. a další, Gene, 1987, 61, 63 - 74, byl použit jako vektor pro klonování svrchu uvedeného fragmentu genu. K tomuto účelu byl plasmid pHSG399 rozštěpen restrikčními enzymy Smál (Takara Shuzo Co., Ltd.) a restrikčním enzymem EcoRI a do plasmidu byl uložen amplifikovaný fragment genu AK.
Vazba DNA byla uskutečněna při použití balíčku pro vazbu DNA (Takana Shuzi Co., Ltd.) podle návodu výrobce. Tímto způsobem byl získán plasmid, který obsahoval původní plasmid pHSG399, navázaný na fragment genu pro AK, amplifikovaný zchromosomu bakterií rodu Brevibacterium. Plasmid, který obsahoval gen pro AK, pocházející z divokého kmene ATCC 13869 byl označen p399AKY.
2) Stanovení řetězce bází genu pro AK z Brevibacterium lactofermentum
Byl připraven plasmid p399AKY s obsahem genu pro AK a byl stanoven řetězec tohoto genu. Stanovení řetězce bází bylo uskutečněno způsobem podle publikace F. Sanger a další, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 74, 5463, 1977. Byly zjištěny řetězce bází, které jsou dále uvedeny jako řetězec č. 5 a řetězec č. 7. Fragmenty DNA mají dva otevřené čtecí rámce, které odpovídají alfa-podjednotce a beta-podjednotce genu pro AK. V řetězci č. 5 a řetězci č. 7 jsou společně s nukleotidovými řetězci uvedeny také odpovídající řetězce aminokyseliny. Dále jsou jako řetězce č. 6 a řetězce č. 8 uvedeny pouze řetězce aminokyselin, odpovídající jednotlivým čtecím rámcům.
3) Příprava plasmidu pro expresi karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu
Z plasmidu pS2 jako plasmidu s obsahem genu pro divoký typ karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu a plasmidu pBP5 jako plasmidu s obsahem genu pro mutantu karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu byly odštěpeny fragmenty Sáli o přibližně 4,4 kb s obsahem genů pro karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu a tyto fragmenty pak byly uloženy do místa působení enzymu Sáli v plasmidu pHSG399, který je běžně užíván jako vektor pro Escherichia coli. Takto připravené plasmidy byly připraveny pHS2 pro divoký typ enzymu a pHBP5 pro mutovaný enzym.
Aby bylo možno při použití plasmidu pHS2 a pHPB5 získat plasmidy pro expresi v Brevibacterium, byly navázány ještě promotor a počátek replikace, funkční v mikroorganismech rodu Brevibacterium. Jako promotor byl navázán fragment genu, obsahující řetězec bází od prvního místa působení enzymu Nrul do 207 místa působení enzymu AoaLI v řetězci bází, tato oblast je pravděpodobně promotorovou oblastí v klonovaném genu AK. Uvedená oblast byla extrahována z plasmidu p399AKY a uložena do místa působení enzymu Aval, uloženého přibližně 60 bp před strukturním genem pHS2 a pHBP5 tak, aby transkripce probíhala správným směrem.
Dále byl do vektoru uložen fragment genu, umožňující autonomní replikaci plasmidu v mikroorganismu rodu Brevibacterium, šlo zejména o počátek replikace. Fragment genu s počátkem replikace plasmidu byl odštěpen z vektoru pHC4 pro Brevibacterium tak, jak je uveden v odstavci 10 zveřejněné japonské patentové přihlášky č. 5-7491. Kmen Escherichia coli AJ12039, který tento plasmid obsahuje, byl uložen ve veřejné sbírce kultur National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology, pod číslem
-20CZ 289051 B6
FERM PÍ2215. Na obou zakončeních plasmidu byla modifikována místa působení restrikčních enzymů na místo působení enzymu Pstl pomocí vazných řetězců.
Vzniklý fragment pak byl uložen do místa působení enzymu Pstl ve vektorové části plasmidu spolu s promotorem, odvozeným od rodu Brevibacterium. Takto zkonstruované plasmidy pro expresi karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu byly označeny pHS2B pro divoký typ karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu z plasmidu pS2 a pHBP5B pro mutantu karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu z plasmidu pBP5.
4) Produkce L-lysinu při použití plasmidu pro expresi karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu
Svrchu připravené plasmidy pHS2B a pHBP5B byly uloženy do kmene AJ3463, šlo o L-lysin produkující mikroorganismus Brevibacterium lactofermentum podle zveřejněné japonské patentové přihlášky č. 51-34477. Pro uložení genu byl použit způsob transformace s využitím elektrických pulsů podle zveřejněné japonské patentové přihlášky č. 2-207791. Hostitelský kmen a transformanty byly pěstovány za protřepávání celkem 72 hodin při teplotě 31,5 °C v živném prostředí, vhodném pro produkci lysinu, složení tohoto prostředí je uvedeno v následující tabulce 7. Toto prostředí bylo připraveno ve dvou podílech, první podíl tvořily všechny složky s výjimkou uhličitanu vápenatého. Tyto složky byly smíseny s 1 litrem vody, pH bylo upraveno na 8,0 přidáním hydroxidu draselného a pak bylo živné prostředí sterilizováno 15 minut při teplotě 115 °C, načež byl přidán uhličitan vápenatý, který byl odděleně sterilizován teplem. Množství L-lysinu v živném prostředí po pěstování uvedených kmenů je shrnuto v následující tabulce 8.
Tabulka 7 složka množství na 1 liter
| glukóza | 100 g |
| síran amonný | 55 g |
| sojový koncentrát* | 35 ml |
| dihydrogenfosforečnan draselný | 1 g |
| síran hořečnatý. 7H2O | 1 g |
| vitamin B1 | 20 g |
| biotin | 5g |
| amid kyseliny nikotinové | 5 mg |
| síran železnatý . 7H2O | 0,01 g |
| síran manganatý. 5H2O | 0,01 g |
| uhličitan vápenatý | 50 g |
51 Produkt Ajinomoto Co., Ltd., obchodní název Memenou.
Tabulka. 8
| bakteriální kmen | produkt z lysinu g/1 |
| Brevibacterium lactofermentum AJ3463 Brevibacterium lactofermentum AJ3463/pHS2B Brevibacterium lactofermentum AJ3463/pHBP5B | 20,0 22,0 25,0 |
Jak je se svrchu uvedených výsledků zřejmé, docházelo u Brevibacterium lactofermentum AJ3463/pHBP5B s obsahem genu pro mutovaný enzym v plasmidu pro expresi ke zlepšené účinnosti při produkci lysinu ve srovnání s kmenem Brevibacterium lactofermentum AJ3463/pHS2B, který obsahuje plasmid pro expresi enzymu divokého typu.
-21 CZ 289051 B6
Příklad 6
Další příklad mutanty karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu podle vynálezu a genu pro tento enzym
1) Příprava genu pro mutovaný enzym karboxylázu fosfoenolpyrohroznanu
Při přípravě kódové DNA pro mutantu karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu byl použit gen pro tento enzym, který byl klonován v plasmidu pT2.
Hostitel, do nějž má být uložen plasmid pT2 by s výhodou měl být hostitel, jemuž chybí gen pro karboxylázu fosfoenolpyrohroznanu tak, aby později byla prokazována pouze účinnost enzymu, jehož původem je použitý plasmid. Jako kmen, deficientní v uvedeném smyslu byl použit v tomto případě kmen Escherichia coli F15 (Hfr, recAl, met, delta (ppc-argECBH), TnlO). Kmen Escherichia coli AJ-12873, v němž je uložen plasmid pT2 v F15 je uložen pod číslem FERM P13752 ve veřejné sbírce kultur National Instituce of Bioscience and Human Technology (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonsko, zip code 305) 15. července 1993 a byl pak přenesen z původního uložení do mezinárodního oddělení podle Budapešťské úmluvy 11. července 1994 a byl zařazen pod novým číslem FERM BP-^4732. Celý řetězec bází pT2 je uveden v řetězci č. 1.
Aby bylo možno nahradit kodon pro arginin v poloze 438 v karboxyláze fosfoenolpyrohroznanu kodonem pro cystein při použití plasmidu pT2, byl užit postup s překrývajícími se zakončeními podle publikace Ho S. N., Hunt H. D., Horton R. M., Pullen J. K. a Pease L. R., Gene, 77, 51—59,1989 a PCR-reakce.
PCR-reakce je postup, při němž se cyklicky opakuje amplifikace, spočívající v tepelné denaturaci DNA s dvojitým řetězcem za vzniku DNA s jednoduchým řetězcem, v následném navázání oligonukleotidových primerů, odpovídajících sekvencím na obou stranách místa, v němž má dojít k amplifikaci tepelně denaturované DNA a v polymerační reakci s použitím těchto oligonukleotidů, tímto postupem dochází k amplifikaci svrchu uvedeného řetězce DNA v exponenciálním měřítku.
Oblast, v níž má být dosaženo specificky cílené mutace při použití PCR-reakce je znázorněna na obr. 11.Jako primery byly při provádění tohoto postupu užitý čtyři typy primeru:c (řetězec č. 11, odpovídající bázím č. 1535 až 1554 v řetězci č. 1) s řetězcem z oblasti kodonu pro arginin v poloze 438, dále primer b (řetězec č. 10) s řetězcem, komplementární k primeru c, dále primer a (řetězec č. 9, odpovídající bázím č. 1185 až 1200 v řetězci č. 1) s řetězcem proti směru exprese genu od řetězce primeru a, mimoto byl použit ještě primer d (řetězec č. 12, odpovídající bázím č. 2327 až 2342 v řetězci č. 1) s řetězcem, komplementárním k řetězci po směru exprese genu.
V primeru b a primeru c byl kodon CGT pro arginin v poloze 437 nahrazen kodonem TGT pro cystein. Při tomto postupu je možno použít také kodon TGC, který je odlišným kodonem pro cystein. Dále byla báze C v kodonu AAC pro asparagin v poloze 434 nahrazena bází T, čímž došlo ke vzniku místa působení enzymu EcoRI uvnitř řetězce, aniž by současně došlo k záměně aminokyseliny, takže mutovaný plasmid mohl být podroben selekci na základě této vlastnosti. Tato mutace však není pro vynález podstatná.
V případě, že byla uskutečněna PCR-reakce při použití DNA plasmidu pT2 jako matrice a jako primery byly použity primer a a b, došlo k amplifikaci fragmentu směrem proti směru exprese genu od místa mutace (fragment AB na obr. 11). V případě, že PCR-reakce byla uskutečněna při použití primeru c a primeru d, došlo k amplifikaci fragmentu po směru exprese genu od místa mutace (fragmentu CD na obr. 11). V případě, že byly produkty amplifikace, to znamená amplifikované fragmenty AB a CD navázány po tepelné denaturaci pomocí PCR-reakce, byl
-22CZ 289051 B6 získán fragment AD z obr. 11. PCR-reakce byla uskutečněna opakováním třiceti cyklů, každý z těchto cyklů byl prováděn zahřátím na 1 minutu na 94 °C, denaturací 1,5 minut při 94 °C, navázáním 2 minuty při teplotě 50 °C a reakcí s polymerázou 3,5 minut při teplotě 72 °C. Složení reakčních směsí je uvedeno v následující tabulce 9.
Tabulka 9
| složení (konečná koncentrace), | AB | PCR-fragment CD | AD |
| voda | 53,5 | 53,5 | 53,5 |
| lOx reakční pufr | 10 | 10 | 10 |
| směs 1,25 mM dNTP | 16 | 16 | 16 |
| 20 μΜ primerů a (1 μΜ) | 5 | — | 5 |
| 20 μΜ primerů b (1 μΜ) | 5 | - | — |
| 20 μΜ primerů c (1 μΜ) | - | 5 | - |
| 20 μΜ primerů d (1 μΜ) | - | 5 | 5 |
| 10 μg/μl pT2 (0,^g) | 10 | 10 | - |
| PCR fragment AB* | - | - | 5 |
| PCR fragment CD* | - | - | 5 |
| 2,5 U/μΙ Taq-polymerázy | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
| celkové množství | 100 μΐ | 100 μΐ | 100 μΐ |
* PCR-fragmenty AB a CD byly připraveny po uskutečnění PCR-reakce oddělením lOmikrolitrů z polyakrylamidového gelu a rozpuštěním v 5 mikrolitrech pufru TE (10 mM tris-HCl o pH 8,0 a 1 mM EDTA o pH 8,0).
Ve fragmentu AD, získaném svrchu uvedeným způsobem se nachází místo působení enzymu 15 BssHII (polohy 1231 - 1236 v řetězci č. 1) směrem proti směru exprese genu a místo působení enzymu SplI v polohách 2249 - 2254 v řetězci č. 1 po směru exprese genu, takže je možno uskutečnit úplné štěpení uvedenými enzymy k náhradě odpovídající oblasti v plasmidu pT2, jak je znázorněno na obr. 11.
2) Selekce karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu, desensitizované vzhledem k inhibici
Mikroorganismus Escherichia coli byl transformován plasmidem, získaným svrchu uvedeným způsobem a transformovaný kmen byl pěstován a plasmid byl izolován a byly vyhledávány plasmidy štěpitelné enzymem EcoRI. Pokud jde o řetězec DNA po selekci, byl řetězec bází 25 oblasti, amplifikované svrchu uvedenou PCR-rekcí stanoven pro potvrzení, že došlo k náhradě bází přesně očekávaným způsobem. Získaný plasmid byl označen pT2R438C. Kmen AJ12874, získaný uložením uvedeného plasmidu do kmene Escherichia coli F15 byl uložen pod číslem FERM P-13753 do veřejné sbírky kultur National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology (1-3, igashi 1-chome, Tsukuba30 shi, Ibáraki-ken, Japonsko, zip code 305) 15. července 1993 a pák byl přenesen z původního oddělení do mezinárodního oddělení podle Budapešťské úmluvy 11. července 1994 a bylo mu uděleno nové číslo FERM BP-4733.
Řetězec bází v plasmidu pT2R438C je řetězec, v němž jsou nukleotidy v polohách 1541 a 1550 35 v řetězci č. 1 nahrazeny, místo nukleotidu C je v obou případech zařazen nukleotid T.
-23CZ 289051 B6
3) Potvrzení desensitizace mutanty karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu vzhledem k inhibici působením kyseliny asparagové
Citlivost na kyselinu asparagovou byla sledována pro karboxylázu fosfoenolpyrohroznanu, produkovanou svrchu uvedeným kmenem Escherichia coli AJ 12874 s obsahem plasmidu pT2R438C. Vhledem ktomu, že mikroorganismus Escherichia sólu F15 chybí gen pro karboxylázu fosfoenolpyrohroznanu pochází veškerý enzym, produkovaný kmenem AJ 12874 z uloženého plasmidu.
Citlivost na kyselinu asparagovou byla sledována pomocí známého způsobu podle publikace Yoshinaga T., Izui K. a Katsuki H., J. Biochem., 68, 747 - 750,1970. Výsledky měření účinnosti enzymu v přítomnosti acetylkoenzymu A, o němž je známo, že ovlivňuje měření v koncentraci 1 mM nebo 2 mM jsou uvedeny na obr. 12.
Z výsledků je zřejmé, že enzym divokého typu v přítomnosti vyšších koncentrací kyseliny asparagové v podstatě ztrácí svou účinnost, zatímco mutanta karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu podle vynálezu si v přítomnosti kyseliny asparagové svoji účinnost zachovává.
4) Příprava genu (II) pro mutantu karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu
Aby bylo možno nahradit kodon pro lysin v poloze 620kodonem pro serin v genu pro karboxylátu fosfoenolpyrohroznanu v plasmidu pT2, byl použit postup s překrývajícími se zakončeními podle publikace Ho S. N., Hunt H. D., Horton R. M., Pullen J. K. a Pease L. R., Gene, 77, 51 - 59, 1989 s využitím PCR-reakce. Postup byl prováděn způsobem, uvedeným svrchu v odstavci 1). Plasmid s obsahem mutovaného genu po provedení uvedené změny kodonů byl označen pT2K620S. Získaná mutanta enzymu byla označena K62OS.
5) Potvrzení desensitizace karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu k inhibici působením kyseliny asparagové
Byla sledována citlivost karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu, produkované transformovaným kmenům, získaným uložením plasmidu pT2K620S do kmene Escherichia coli F15 na přítomnost kyseliny asparagové. Jak již bylo uvedené svrchu, vzhledem ktomu, že mikroorganismu Escherichia coli F15 chybí gen pro karboxylázu fosfoenolpyrohroznanu, je jakýkoliv produkovaný enzym tohoto typu získán působením plasmidu v transformovaném organismu.
Citlivost na přítomnost kyseliny asparagové byla sledována známým postupem podle publikace Yoshinaga T, UzuiK. a Katsuki H., J. Biochem., 68, 747 - 750, 1970. Citlivost na kyselinu asparagovou byla měřena v přítomnosti acetylkoenzymu A stejným způsobem jako v předchozích případech při koncentraci acetylkoenzymu A 1 mM nebo 2 mM, výsledky zkoušek jsou uvedeny na obr. 13.
Je zřejmé, že enzym divokého typu v přítomnosti vyšší koncentrace kyseliny asparagové v podstatě ztrácí svou účinnost, kdežto enzym podle vynálezu si tuto účinnost uchovává.
Na obr. 13 je znázorněna také citlivost na kyselinu asparagovou pro mutantu karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu, v níž byl zbytek lysinu v poloze 650 nahrazen serinem (mutanta K650A) a pro mutantu, v níž byl zbytek lysinu v poloze 491 nahrazen serinem (mutanta K491A). V případě těchto mutant byla inhibice kyselinou asparagovou zachována.
Průmyslová využitelnost
Kódový řetězec DAN pro mutantu karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu je možno uložit do mikroorganismu, který pak produkuje uvedený enzym.
-24CZ 289051 B6
Takto získaná mutanta enzymu neztrácí svou účinnost v přítomnosti kyseliny asparagové, takže je možno ji využít pro fermentativní produkci aminokyselin, jejichž produkce biosyntézou je jinak omezena v přítomnosti kyseliny asparagové a k obdobným účelům.
Informace o řetězcích
1) Obecné informace:
i) přihlašovatel: Ajinomoto Co., Inc.
ii) Název vynálezu: Mutanta karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu, kódový řetězec pro tuto mutantu, produkční mikroorganismus a způsob výroby aminokyseliny iii) Počet řetězců: 12
v) Forma, odečitatelná počítačem:
A) Typ prostředí: floppy disk
B) Počítač: IBM PC-kompatibilní
C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS
D) Software: Patent In Release 1,0, verse 1,25
2) Informace o řetězci č. 1:
i) Vlastnosti řetězce:
A) Délka: 5186
B) Typ sloučeniny: nukleová kyselina
C) Typ řetězce: dvojitý
D) Topologie: cirkulámí ii) Typ molekuly: DNA genomu a DNA vektoru iii) Hypotetický řetězec: žádný iv) Antimediátorový řetězec: žádný vi) Původní zdroj:
A) Organismus: Escherichia coli ix) Vlastnosti:
A) Název/klíč: CDS
B) Polohy: 237 až 2888 xi) Popis řetězce: č. 1:
-25CZ 289051 B6
TCGACCGGCG ATTTTTTAAC ATTTCCATAA GTTACGCTTA TTTAAAGCGT CGTGAATTTA 60
ATGACCTAAA TTCCTGCTAT TTATTCGTTT GCTGAAGCGA TTTCGCAGCA TTTGACGTCA 120
CCGCTTTTAC GTGGCTTTAT AAAAGACGAC GAAAAGCAAA GCCCGAGCAT ATTCGCGCCA 180
ATGCGACGTG AAGGATACAG GGCTATCAAA CGATAAGATG GGGTGTCTGG GCTAAT 236
| ATG AAC GAA CAA | TAT | TCC GCA | TTG | CGT AGT AAT GTC ACT ATG CTC GGC | 284 | |||||||||||
| Met 1 | Asn | Glu | Gin | Tyr 5 | Ser | Ala | Leu | Arg | Ser 10 | Asn | Val | Ser | Met | Leu 15 | Gly | |
| AAA | GTG | CTG | GGA | GAA | ACC | ATC | AAG | GAT | GCG | TTG | GGA | GAA | CAC | ATT | CTT | 332 |
| Lys | Val | Leu | Gly 20 | Glu | Thr | Ile | Lys | Asp 25 | Ala | Leu | Gly | Glu | His 30 | Zle | Leu | |
| GAA | CGC | GTA | GAA | ACT | ATC | CGT | AAG | TTG | TCG | AAA | TCT | TCA | CGC | GCT | GGC | 380 |
| Glu | Arg | Val 35 | Glu | Thr | ile | Arg | Lys 40 | Leu | Ser | Lys | Ser | Ser 45 | Arg | Ala | Gly | |
| AAT | GAT | GCT | AAC | CGC | CAG | GAG | TTG | CTC | ACC | ACC | TTA | CAA | AAT | TTG | TCG | 428 |
| Asn | Asp 50 | Ala | Asn | Arg | Gin | Glu 55 | Leu | Leu | Thr | Thr | Leu 60 | Gin | Asn | Leu | Ser | |
| AAC | GAC | GAG | CTG | CTG | CCC | GTT | GCG | CGT | GCG | TTT | AGT | CAG | TTC | CTG | AAC | 476 |
| Asn 65 | Asp | Glu | Leu | Leu | Pro 70 | Val | Ala | Arg | Ala | Phe 75 | Ser | Gin | Phe | Leu | Asn 80 | |
| CTG | GCC | AAC | ACC | GCC | GAG | CAA | TAC | CAC | AGC | ATT | TCG | CCG | AAA | GGC | GAA | 524 |
| Leu | Ala | Asn | Thr | Ala 85 | Glu | Gin | Tyr | His | Ser 90 | Zle | Ser | Pro | Lys | Gly 95 | Glu | |
| GCT | GCC | AGC | AAC | CCG | GAA | GTG | ATC | GCC | CGC | ACC | CTG | CCT | AAA | CTG | AAA | 572 |
| Ala | Ala | Ser | Asn 100 | Pro | Glu | Val | Ile | Ala 105 | Arg | Thr | Leu | Arg | Lys 110 | Leu | Lys | |
| AAC | CAG | CCG | GAA | CTG | AGC | GAA | GAC | ACC | ATC | AAA | AAA | GCA | GTG | GAA | TCG | 620 |
| Asn | Gin | Pro 115 | Glu | Leu | Ser | G1U | Asp 120 | Thr | Ile | Lys | Lys | Ala 125 | Val | Glu | Ser | |
| CTG | TCG | CTG | GAA | CTG | GTC | CTC | ACG | GCT | CAC CCA | ACC | GAA | ATT | ACC | CGT | 668 | |
| Leu | Ser 130 | Leu | Glu | Leu | Val | Leu 135 | Thr | Ala | His | Pro | Thr 140 | Glu | ile | Thr | Arg | |
| CGT | ACA | CTG | ATC | CAC | AAA | ATG | GTG | GAA | GTG | AAC | GCC | TGT | TTA | AAA | CAG | 716 |
| Arg 145 | Thr | Leu | Ile | His | Lys 150 | Met | Val | G1U | Val | Asn 155 | Ala | Cys | Leu | Lys | Gin 160 | |
| CTC | GAT | AAC | AAA | GAT | ATC | GCT | GAC | TAC | GAA | CAC | AAC | CAG | CTG | ATG | CCT | 764 |
| Leu | Asp | Asn | Lys | Asp 165 | Ile | Ala | Asp | Tyr | Glu 170 | His | Asn | Gin | Leu | Met 175 | Arg | |
| CGC | CTG | CGC | CAG | TTG | ATC | GCC | CAG | TCA | TGG | CAT | ACC | GAT | GAA | ATC | CCT | 812 |
| Arg | Leu | Arg | Gin | Leu | Ile | Ala | Gin | Ser | Trp | H1S | Thr | Asp | Glu | Ile | Arg |
180 185 190
-26CZ 289051 B6
| AAG | CTG | CGT | CCA | AGC | CCG | GTA | GAT | GAA | GCC | AAA | TGG | GGC | TTT | GCC GTA | |
| Lys | Leu | Arg | Pro | Ser | Pro | Val | Asp | Glu | Ala | Lys | Trp | Gly | Phe | Ala Val | |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| GTG | GAA | AAC | AGC | CTG | TGG | CAA | GGC | GTA | CCA | AAT | TAC | CTG | CGC | GAA | CTG |
| Val | Glu | Asn | Ser | Leu | Trp | Gin | Gly | Val | Pro | Asn | Tyr | Leu | Arg | Glu | Leu |
| 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
| AAC | GAA | CAA | CTG | GAA | GAG | AAC | CTC | GGC | TAC | AAA | CTG | CCC | GTC | GAA | TTT |
| Asn | Glu | Gin | Leu | Glu | Glu | Asn | Leu | Gly Tyr | Lys | Leu | Pro | Val | Glu | Phe | |
| 225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| GTT | CCG | GTC | CGT | TTT | ACT | TCG | TGG | ATG | GGC | GGC | GAC | CGC | GAC | GGC | AAC |
| Val | Pro | Val | Arg | Phe | Thr | Ser | Trp | Met | Gly Gly Asp | Arg | Asp | Gly | Asn | ||
| 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
| CCG | AAC | GTC | ACT | GCC | GAT | ATC | ACC | CGC | CAC | GTC | CTG | CTA | CTC | AGC | CGC |
| Pro | Asn | Val | Thr | Ala | Asp | Ile | Thr | Arg | His | Val | Leu | Leu | Leu | Ser | Arg |
| 260 | 265 | 270 | |||||||||||||
| TGG | AAA | GCC | ACC | GAT | TTG | TTC | CTG | AAA GAT | ATT | CAG | GTG | CTG | GTT | TCT | |
| Trp | Lys | Ala | Thr | Asp | Leu | Phe | Leu | Lys Asp | ile | Gin | Val | Leu | Val | Ser | |
| 275 | 280 | 285 | |||||||||||||
| GAA | CTG | TCG | ATG | GTT | GAA | GCG | ACC | CCT | GAA | CTG | CTG | GCG | CTG | GTT | GGC |
| Glu | Leu | Ser | Met | Val | Glu | Ala | Thr | Pro | Glu | Leu | Leu | Ala | Leu | Val | Gly |
| 290 | 295 | 300 | |||||||||||||
| GAA | GAA | GGT | GCC | GCA | GAA | CCG | TAT | CGC | TAT | CTG | ATG | AAA | AAC | CTG | CGT |
| Glu | Glu | Gly | Ala | Ala | Glu | Pro | Tyr | Arg | Tyr | Leu | Met | Lys | Asn | Leu | Arg |
| 305 | 310 | 315 | 320 |
| TCT | CGC | CTG | ATG | GCG | ACA | CAG | GCA | TGG | CTG | GAA | GCG | CGC | CTG | AAA | GGC |
| Ser | Arg | Leu | Met | Ala | Thr | Gin | Ala | Trp | Leu | Glu | Ala | Arg | Leu | Lys | Gly |
| 325 | 330 | 335 | |||||||||||||
| GAA | GAA | CTG | CCA | AAA | CCA | GAA | GGC | CTG | CTG | ACA | CAA | AAC | GAA | GAA | CTG |
| Glu | Glu | Leu | Pro | Lys | Pro | Glu | Gly | Leu | Leu | Thr | Gin | Asn | Glu | Glu | Leu |
| 340 | 345 | 350 | |||||||||||||
| TGG | GAA | CCG | CTC | TAC | GCT | TGC | TAC | CAG | TCA | CTT | CAG | GCG | TGT | GGC | ATG |
| Trp | Glu | Pro | Leu | Tyr | Ala | Cys | Tyr | Gin | Ser | Leu | Gin | Ala | Cys | Gly | Met |
| 355 | 360 | 365 | |||||||||||||
| GGT | ATT | ATC | GCC | AAC | GGC | GAT | CTG | CTC | GAC | ACC | CTG | CGC | CGC | GTG | AAA |
| Gly | Ile | Ile | Ala | Asn | Gly Asp | Leu | Leu | Asp | Thr | Leu | Arg | Arg | Val | Lys | |
| 370 | 375 | 380 | |||||||||||||
| TGT | TTC | GGC | CTA | CCG | CTG | GTC | CGT | ATT | GAT | ATC | CGT | CAG | GAG | AGC | ACG |
| Cys | Phe | Gly | Val | Pro | Leu | Val | Arg | Ile | Asp | Ile | Arg | Gin | Glu | Ser | Thr |
| 385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
| CGT | CAT | ACC | GAA | GCG | CTG | GGC | GAG | CTG | ACC | CGC | TAC | CTC | GGT | ATC | GGC |
| Arg | His | Thr | Glu | Ala | Leu | Gly | Glu | Leu | Thr | Arg Tyr | Leu | Gly | Ile | Gly | |
| 405 | 410 | 415 |
860
908
956
1004
1052
1100
1148
1196
1244
1292
1340
1388
1436
1484
-27CZ 289051 B6
| GAC TAC GAA AGC TGG TCA GAG GCC GAC AAA CAG GCG TTC CTG ATC CGC | 1532 | |||||||||||||||
| Asp | Tyr 1 | Glu | Ser | Trp | Ser | Glu Ala . | Asp | Lys | Gin Ala | Phe | Leu | lle | Arg | |||
| 420 | 425 | 430 | ||||||||||||||
| GAA | CTG . | AAC | TCC | AAA | CCT | CCG i | CTT | CTG | CCG | CGC | AAC | TGG | CAA | CCA | AGC | 1580 |
| Glu | Leu | Asn | Ser | Lys Arg | Pro | Leu | Leu | Pro | Arg | Asn | Trp | Gin | Pro | Ser | ||
| 435 | 440 | 445 | ||||||||||||||
| GCC | GAA | ACG | CGC | GAA | GTG | CTC | GAT | ACC | TGC | CAG | GTG | ATT | GCC | GAA | GCA | 1628 |
| Ala | Glu | Thr | Arg | Glu | Val | Leu | Asp | Thr | Cys | Gin | val | lle | Ala | Glu | Ala | |
| 450 | 455 | 460 | ||||||||||||||
| CCG | CAA | GGC | TCC | ATT | GCC | GCC | TAC | GTG | ATC | TCG | ATG | GCG | AAA | ACG | CCG | 1676 |
| Pro | Gin | Gly | Ser | lle | Ala | Ala | Tyr | Val | lle | Ser | Met | Ala | Lys | Thr | Pro | |
| 465 | 470 | 475 | 480 | |||||||||||||
| TCC | GAC | GTA | CTG | GCT | GTC | CAC | CTG | CTG | CTG | AAA | GAA | GCG | GGT | ATC | GGG | 1724 |
| Ser | Asp | Val | Leu | Ala | Val | His | Leu | Leu | Leu | Lys | Glu | Ala | Gly | lle | Gly | |
| 485 | 490 | 495 | ||||||||||||||
| TTT | GCG | ATG | CCG | GTT | GCT | CCG | CTG | TTT | GAA | ACC | CTC | GAT | GAT | CTG | AAC | 1772 |
| Phe | Ala | Met | Pro | Val | Ala | Pro | Leu | Phe | Glu | Thr | Leu | Asp Asp | Leu | Asn | ||
| 500 | 505 | 510 | ||||||||||||||
| AAC | GCC | AAC | GAT | GTC | ATG | ACC | CAG | CTG | CTC | AAT | ATT | GAC | TGG | TAT | CGT | 1820 |
| Asn | Ala | Asn | Asp | Val | Met | Thr | Gin | Leu | Leu | Asn | lle | Asp Trp | Tyr Arg | |||
| 515 | 520 | 525 | ||||||||||||||
| GGC | CTG | ATT | CAG | GGC | AAA | CAG | ATG | GTG | ATG | ATT | GGC | TAT | TCC | GAC | TCA | 1868 |
| Gly | Leu | lle | Gin | Gly | Lys | Gin | Met | Val | Met | lle | Gly Tyr | Ser | ASp | Ser | ||
| 530 | 535 | 540 | ||||||||||||||
| GCA | AAA | GAT | GCG | GGA | GTG | ATG | GCA | GCT | TCC | TGG | GCG | CAA | TAT | CAG | GCA | 1916 |
| Ala | Lys | Asp | Ala | Gly | Val | Met | Ala | Ala | Ser | Trp | Ala | Gin | Tyr | Gin | Ala | |
| 545 | 550 | 555 | 560 | |||||||||||||
| CAG | GAT | GCA | TTA | ATC | AAA | ACC | TGC | GAA | AAA | GCG | GGT | ATT | GAG | CTG | ACG | 1964 |
| Gin | Asp | Ala | Leu | lle | Lys | Thr | Cys | Glu | Lys | Ala | Gly | lle | Glu | Leu | Thr | |
| 565 | 570 | 575 | ||||||||||||||
| TTG | TTC | CAC | GGT | CGC | GGC | GGT | TCC | ATT | GGT | CGC | GGC | GGC | GCA | CCT | GCT | 2012 |
| Leu | Phe | His | Gly Arg | Gly Gly | Ser | lle | Gly Arg | Gly Gly | Ala | Pro | Ala | |||||
| 580 | 585 | 590 | ||||||||||||||
| CAT | GCG | GCG | CTG | CTG | TCA CAA | CCG | CCA | GGA AGC | CTG | AAA | GGC | GGC | CTG | 2060 | ||
| H1S | Ala | Ala | Leu | Leu | Ser | Gin | Pro | Pro | Gly Ser | Leu | Lys | Gly | Gly | Leu | ||
| 59S | 600 | 605 | ||||||||||||||
| CGC | GTA | ACC | GAA | CAG | GGC | GAG | ATG | ATC | CGC | TTT | AAA | TAT | GGT | CTG | CCA | 2108 |
| Arg | Val | Thr | Glu | Gin | Gly | Glu | Met | lle | Arg | Phe | Lys | Tyr Gly | Leu | Pro | ||
| 610 | 615 | 620 | ||||||||||||||
| GAA | ATC | ACC | GTC | AGC | AGC | ; ctg | TCG | 1 CTT | TAT | ACC | GGG | GCG | ATT | CTG | GAA | 2156 |
| Glu | lle | ; Thr | Val | Ser | ’ Ser | ' Leu | Ser | Leu | . Tyr | Thr | Gly | Ala | lle | Leu | Glu | |
| 625 | 630 | 635 | 640 | |||||||||||||
| GCC | : AAC | : CTG | ί CTG | i CCA | . CCG CCG | : GAG | : CCG | ; AAA GAG | AGC | ! TGG | l CGT | CGC | : att | 2204 | ||
| Ala | . Asn | i Leu | ; Leu | . Pro | i Pro | i Pro | Glu | , Pro | i Lys | ; Glu | Ser | Trp Arg | Arg | lle |
645 650 655
-28CZ 289051 B6
ATG GAT GAA CTG TCA GTC ATC TCC TGC GAT GTC TAC CGC GGC TAC CTA 2252
| Met | Asp | Glu | Leu | Ser Val Ile | Ser | Cys Asp | val | Tyr Arg | Gly Tyr | Val | ||||
| 660 | 665 | 670 | ||||||||||||
| CGT | GAA | AAC | AAA | GAT TTT GTG | CCT | TAC | TTC | CGC | TCC GCT | ACG | CCG | GAA | 2300 | |
| Arg | Glu | Asn | Lys Asp Phe Val | Pro | Tyr | Phe | Arg | Ser Ala | Thr | Pro | Glu | |||
| 675 | 680 | 685 | ||||||||||||
| CAA | GAA | CTG | GGC | AAA CTG CCG | TTG | GGT | TCA | CGT | CCG GCG | AAA | CCT | CGC | 2348 | |
| Gin | Glu | Leu | Gly | Lys Leu Pro | Leu | Gly | Ser | Arg | Pro | Ala | Lys Arg Arg | |||
| 690 | 695 | 700 | ||||||||||||
| CCA | ACC | GGC | GGC | GTC GAG TCA | CTA | CGC | GCC | ATT | CCG | TGG | ATC | TTC | GCC | 2396 |
| Pro | Thr | Gly Gly Val Glu Ser | Leu | Arg | Ala | Ile | Pro | Trp | Ile | Phe | Ala | |||
| 705 | 710 | 715 | 720 | |||||||||||
| TGG | ACG | CAA | AAC | CGT CTG ATG CTC | CCC | GCC | TGG | CTG | GCT | GCA | GCT | ACG | 2444 | |
| Trp | Thr | Gin | Asn | Arg Leu Mat | Leu | Pro | Ala | Trp | Leu | Gly Ala | Gly | Thr | ||
| 725 | 730 | 735 | ||||||||||||
| GCG | CTG | CAA | AAA | GTG GTC GAA | GAC | GGC | AAA | CAG AGC | GAG | CTG | GAG | GCT | 2492 | |
| Ala | Leu | Gin | Lys | Val Val Glu | Asp Gly Lys | Gin | Ser | Glu | Leu | Glu | Ala | |||
| 740 | 745 | 750 | ||||||||||||
| ATG | TGC | CGC | GAT | TGG CCA TTC | TTC | TCG | ACG | CGT | CTC | GGC | ATG | CTG | GAG | 2540 |
| Met | Cys | Arg Asp | Trp Pro Phe | Phe | Ser | Thr | Arg | Leu | Gly | Met | Leu | Glu | ||
| 755 | 760 | 765 | ||||||||||||
| ATG | GTC | TTC | GCC | AAA GCA GAC | CTG | TGG | CTG | GCG GAA | TAC | TAT | GAC | CAA | 2588 | |
| Met | Val | Phe | Ala | Lys Ala Asp | Leu | Trp | Leu | Ala Glu | Tyr Tyr Asp | Gin | ||||
| 770 | 775 | 780 | ||||||||||||
| CGC | CTG | GTA | GAC | AAA GCA CTG | TGG | CCG | TTA | GGT AAA | GAG | TTA | CGC | AAC | 2636 | |
| Arg | Leu | Val | Asp | Lys Ala Leu | Trp | Pro | Leu | Gly Lys | Glu | Leu | Arg | Asn | ||
| 785 | 790 | 795 | 800 | |||||||||||
| CTG | CAA | GAA | GAA | GAC ATC AAA | GTG | GTG CTG | GCG | ATT | GCC | AAC | GAT | TCC | 2684 | |
| Leu | Gin | Glu | Glu | Asp Ile Lys | Val | Val | Leu | Ala | Ile | Ala | Asn | Asp | Ser | |
| 805 | 810 | 815 | ||||||||||||
| CAT | CTG | ATG | GCC | GAT CTG CCG | TGG | ATT | GCA GAG | TCT | ATT | CAG | CTA | CGG | 2732 | |
| His | Leu | Met | Ala | Asp Leu Pro | Trp | ile | Ala Glu | Ser | Ile | Gin | Leu | Arg | ||
| 820 | 825 | 830 | ||||||||||||
| AAT | ATT | TAC | ACC | GAC CCG CTG | AAC | GTA | TTG | CAG GCC | GAG | TTG | CTG | CAC | 2780 | |
| Asn | Ile | Tyr | Thr | Asp Pro Leu | Asn Val | Leu | Gin Ala | Glu | Leu | Leu | His | |||
| 835 | 840 | 845 | ||||||||||||
| CGC | TCC | CGC | CAG | GCA GAA AAA | GAA | GGC | CAG | GAA CCG | GAT | CCT | CGC | CTC | 2828 | |
| Arg | Ser | Arg | Gin | Ala Glu Lys | Glu | Gly Gin Glu | Pro | Asp | Pro | Arg | Val | |||
| 850 | 855 | 860 | ||||||||||||
| GAA | CAA | GCG | TTA | ATG GTC ACT | ATT | GCC GGG ATT | GCG | GCA | GGT | ATG | CCT | 2876 | ||
| Glu | Gin | . Ala | Leu | Met Val Thr | Ile | ; Ala Gly Ile | > Ala | Ala | Gly | Met | Arg | |||
| 865 | 870 | 875 | 880 |
AAT ACC GGC TAATCTTCCT CTTCTGCAAA CCCTCGTGCT TTTGOGCGAG 2925
Asn Thr Gly
-29CZ 289051 B6
GGTTTTCTGA AATACTTCTG TTCTAACACC TATTCAAATT CTGAATATAC CTTCAGATAT ATAGGTTAAT GTCATGATAA TAATGGTTTC TGTGCGCGGA ACCCCTATTT GTITATTTTT GAGACAATAA CCCTGATAAA TGCTTCAATA ACATTTCCGT GTCGCCCTTA TTCCCTTTTT CCCAGAAACG CTGGTGAAAG TAAAAGATGC CATCGAACTG GATCTCAACA GCGGTAAGAT TCCAATGATG AGCACTTTTA AAGTTCTGCT CGGGCAAGAG CAACTCGGTC GCCGCATACA ACCAGTCACA GAAAAGCATC TTACGGATGG CATAACCATG AGTGATAACA CTGCGGCCAA GGAGCTAACC GCTTTTTTGC ACAACATGGG ACCGGAGCTG AATGAAGCCA TACCAAACGA GGCAACAACG ITGCGCAAAC TATTAACJGG ATTAATAGAC TGGATGGAGG CGGATAAAGT GGCTGGCTGG TTTATTGCTG ATAAATCTGG TGCAGCACTG GGGCCAGATG GTAAGCCCTC TCAGGCAACT ATGGATGAAC GAAATAGACA GCATTGGTAA CTGTCAGACC AAGTTTACTC ΤΤΊΤΤΑΑΤΤΤ AAAAGGATCT AGGTGAAGAT TTAACGTGAG TTTTCGTTCC ACTGAGCGTC TTGAGATCCT TTTTTTCTGC GCGTAATCTG
CAGCAGAGCG CAGATACCAA ATACTGTCCT CAAGAACTCT GTAGCACCGC CTACATACCT TGCCAGTGGC GATAAGTCGT GTCTTACCGG GGCGCAGCGG TCGGGCTGAA CGGGGGGTTC CTACACCGAA CTGAGATACC TACAGCGTGA GAGAAAGGCG GACAGGTATC CGCTAAGCGG GCTTCCAGGG GGAAACGCCT GGTATCTTTA TGAGCGTCGA TTTTTGTGAT GCTCGTCAGG CGCGGCCTTT TTACGGTTCC TGGCCTmG GTTATCCCCT GATTCTGTGG ATAACCGTAT CCGCAGCCGA ACGACCGAGC GCAGCGAGTC ACGCAAACCG CCTCTCCCCG CGCGTTGGCC CATTCACAGT TCTCCGCAAG AATTGATTGG CGAGGTGCCG CCGGCTTCCA TTCAGGTCGA
CTCGTTTTCA ATATATTTCT GTCTGCATTT CCTTAAGGGC CTCGTGATAC GCCTATTTTT TTAGACGTCA GGTGGCACTT TTCGGGGAAA CTAAATACAT TCAAATATGT ATCOGCTCAT ATATTGAAAA AGGAAGAGTA TGAGTATTCA TGCGGCATTT TGCCTICCTG TTTTTGCTCA TGAAGATCAG TTGGOTGCAC GAGTGGGTTA CCTTGAGAGT TTTCGCCCCG AAGAACGm ATGTGGCGCG GTATTATCCC GTATTGACGC CIATTCTCAG AATGACTTGG TTGAGTACTC CATGACAGTA AGAGAATTAT GCAGTGCTGC CTTACTTCTG ACAACGATCG GAGGACCGAA GGATCATGTA ACTCGCCTTG ATCGTTGGGA CGAGCGTGAC ACCACGATGC CTGTAGCAAT CGAACTACTT ACTCTAGCTT CCCGGCAACA TGCAGGACCA CTTCTGCGCT CGGCCCTTCC AGCOGGTGAG CGTGGGTCTC GCGGTATCAT CCGTATCGTA CTTATCTACA CGACGGGGAG GATCGCTGAG ATAGGTGCCT CACTGATTAA ATATATACTT TAGATTGATT TAAAACTTCA CCTTTTTGAT AATCTCATGA CCAAAATCCC AGACCCCGTA GAAAAGATCA AAGGATCTTC CTGCTTGCAA ACMMMAC CACCGCTACC ACCAACTCTT TTTCCGAAGG TAACTGGCTT TCTAOTGTAG CCGTAGTTAG GCCACCACTT CGCTCTGCTA ATCCTGTTAC CAGTGGCTGC GTTGGACTCA AGACGATAGT TACCGGATAA GTGCACACAG CCCAGCTTGG AGCGAACGAC GCATTGAGAA AGCGCCACGC TTCCCGAAGG CAGGGTCGGA ACAGGAGAGC GCACGAGGGA TAGTCCTGTC GGGTTTCGCC ACCTCTGACT GGGGCGGAGC CTATGGAAAA ACOCCAGCAA CTGGCCTTTT GCTCACATGT TCTTTCCTGC TACCGCCTTT GAGTGAGCTG ATAOCGCTCG AGTGAGCGAG GAAGCGGAAG AGCGCCCAAT GATTCATTAA TGCAGAAGGG TTGGTTTGCG CTCCAATTCT TGGAGTGOTG AATCCGTTAG GGTGGCCCGG G
2985 3045 3105 3165 3225 3285 3345 3405 3465 3525 3585 3645 3705 3765 3825 3885 3945 4005 4065 4125 4185 4245 4305 4365 4425 4485 4545 4605 4665 4725 4785 4845 4905 4965 5025 5085 5145 5186
-30CZ 289051 B6
2) Informace o řetězci č. 2:
i) Vlastnosti řetězce:
A) Délka: 883 aminokyselin
B) Typ sloučeniny: aminokyseliny
D) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: bílkovina ix) Popis řetězce č. 2:
| Met Asn | Glu Gin Tyr Ser Ala Leu Arg Ser Asn Val | Ser Met | Leu | Gly | ||||||||
| 1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||
| Lys | Val | Leu Gly Glu Thr Ile Lys Asp Ala | Leu Gly | Glu His | ne | Leu | ||||||
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||
| Glu | Arg | Val | Glu Thr | Ile Arg Lys | Leu | Ser | Lys Ser | Ser | Arg | Ala | Gly | |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||
| Asn | Asp | Ala | Asn Arg | Gin Glu | Leu | Leu | Thr | Thr Leu | Gin | Asn | Leu | Ser |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||
| Asn | Asp | Glu | Leu Leu | Pro Val | Ala | Arg | Ala | Phe Ser | Gin | Phe | Leu | Asn |
| 65 | 70 | 75 | 80 | |||||||||
| Leu | Ala | Asn | Thr Ala | Glu Gin Tyr | His | Ser | ne Ser | Pro | Lys Gly Glu | |||
| 85 | 90 | 95 | ||||||||||
| Ala Ala | Ser | Asn Pro | Glu Val | Ile | Ala | Arg | Thr Leu | Arg Lys | Leu Lys | |||
| 100 | 105 | 110 | ||||||||||
| Asn | Gin | Pro | Glu Leu | Ser Glu Asp | Thr | ne | Lys Lys | Ala | Val | Glu Ser | ||
| 115 | 120 | 125 | ||||||||||
| Leu | Ser | Leu | Glu Leu | Val Leu | Thr | Ala | His | Pro Thr | Glu | ne | Thr Arg | |
| 130 | 135 | 140 | ||||||||||
| Arg | Thr | Leu | Ue His | Lys Mat | Val | Glu | Val | Asn Ala | Cys | Leu | Lys | Gin |
| 145 | 150 | 155 | 160 | |||||||||
| Leu | Asp | Asn | Lys Asp | ne Ala | Asp Tyr | Glu | His Asn | Gin | Leu | Met | Arg | |
| 165 | 170 | 175 | ||||||||||
| Arg | Leu | Arg | Gin Leu | ne Ala | Gin | Ser | Trp | His Thr | Asp | Glu | Ile | Arg |
| 180 | 185 | 190 | ||||||||||
| Lys | Leu | Arg | Pro Ser | Pro Val | Asp | Glu | Ala | Lys Trp | Gly | Phe | Ala | Val |
| 195 | 200 | 205 | ||||||||||
| Val | Glu Asn Ser Leu | Trp Gin Gly Val | Pro | Asn Tyr | Leu Arg | Glu | Leu | |||||
| 210 | 215 | 220 | ||||||||||
| Asn Glu | Gin Leu Glu Glu Asn Leu Gly Tyr Lys Leu | Pro Val | Glu | Phe |
225 230 235 240
Val Pro Val Arg Phe Thr Ser Trp Met Gly Gly Asp Arg Asp Gly Asn
245 250 255
Pro Asn Val Thr Ala Asp Ile Thr Arg His Val Leu Leu Leu Ser Arg
260 265 270
-31CZ 289051 B6
Trp Lys Ala Thr Asp Leu Phe Leu Lys Asp 275280
Glu Leu Ser Met Val Glu Ala Thr Pro Glu
290295
Glu Glu Gly Ala Ala Glu Pro Tyr Arg Tyr 305310
Ser Arg Leu Met Ala Thr Gin Ala Trp Leu
325330
Glu Glu Leu Pro Lys Pro Glu Gly Leu Leu
340345
Ile Gin Val Leu Val Ser
285
Leu Leu Ala Leu Val Gly
300
Leu Met Lys Asn Leu Arg 315 320
Glu Ala Arg Leu Lys Gly
335
Thr Gin Asn Glu Glu Leu
350
Trp Glu Pro Leu Tyr Ala Cys Tyr Gin Ser Leu Gin Ala Cys Gly Met 355 360 365
Gly Ile Ile Ala Asn Gly Asp Leu Leu Asp Thr Leu Arg Arg Val Lys
| 370 | 375 | 380 | |||||||||||
| Cys | Phe | Gly Val | Pro Leu Val | Arg Ue Asp | Ile | Arg | Gin Glu Ser | ||||||
| 385 | 390 | 395 | |||||||||||
| Arg | His | Thr Glu | Ala Leu Gly Glu | Leu | Thr Arg Tyr | Leu | Gly | Ile | |||||
| 405 | 410 | 415 | |||||||||||
| Asp Tyr | Glu Ser | Trp Ser Glu Ala | Asp | Lys | Gin Ala | Phe | Leu | Ile | |||||
| 420 | 425 | 430 | |||||||||||
| Glu | Leu | Asn Ser | Lys Arg | Pro | Leu | Leu | Pro | Arg Asn Trp | Gin | Pro | |||
| 435 | 440 | 445 | |||||||||||
| Ala | Glu | Thr | Arg | Glu Val | Leu | Asp | Thr | Cys | Gin Val | Ile | Ala | Glu | |
| 450 | 455 | 460 | |||||||||||
| Pro | Gin Gly | Ser | Ile Ala | Ala | Tyr | Val | Ile | Ser | Met | Ala | Lys | Thr | |
| 465 | 470 | 475 | |||||||||||
| Ser Asp | Val | Leu | Ala Val | His | Leu | Leu | Leu | Lys | Glu | Ala | Gly Ile | ||
| 485 | 490 | 495 | |||||||||||
| Phe | Ala | Met | Pro | Val Ala | Pro | Leu | Phe | Glu | Thr | Leu | Asp Asp Leu | ||
| 500 | 505 | 510 | |||||||||||
| Asn | Ala | Asn Asp Val Met | Thr | Gin | Leu | Leu | Asn | Ile | Asp Trp Tyr | ||||
| 515 | 520 | 525 | |||||||||||
| Gly | Leu | Ue Gin Gly Lys | Gin Met | Val | Met | Ile | Gly Tyr Ser Asp | ||||||
| 530 | 535 | 540 | |||||||||||
| Ala | Lys Asp Ala Gly Val | Met Ala Ala | Ser | Trp | Ala Gin Tyr | Gin | |||||||
| 545 | 550 | 555 |
Gin Asp Ala Leu Ile Lys Thr Cys Glu Lys Ala Gly Ile Glu Leu 565 570575
Leu Phe His Gly Arg Gly Gly Ser Ile Gly Arg Gly Gly Ala Pro 580 585590
His Ala Ala Leu Leu Ser Gin Pro Pro Gly Ser Leu Lys Gly Gly 595 600605
Arg Val Thr Glu Gin Gly Glu Met Ile Arg Phe Lys Tyr Gly Leu 610 615620
-32CZ 289051 B6
Glu Ile lín Val Ser Ser Leu Ser Leu Tyr Bir Gly Ala Ile Leu Glu
625 630 635640
Ala Asn Leu Leu Pro Pro Pro Glu Pro Lys Glu Ser Trp Arg Arg Ile
645 650655
Met Asp Glu Leu Ser Val Ile Ser Cys Asp Val Tyc Arg Gly Tyr Val 660 665670
Arg Glu Asn Lys Asp Phe Val Pro Tyr Fbe Arg Ser Ala Thr Pro Glu 675 680685
Gin Glu Leu Gly Lys Leu Pro Leu Gly Ser Arg Pro Ala Lys Arg Arg 690 695700
Pro Thr Gly Gly Val Glu Ser Leu Arg Ala Ile Pro Trp Ue PheAla
705 710 715720
Trp Thr Gin Asn Arg Leu Met Leu Pro Ala Trp Leu Gly Ala GlyThr
725 730735
Ala Leu Gin Lys Val Val Glu Asp Gly Lys Gin Ser Glu Leu Glu Ala 740 745750
Met Cys Arg Asp Trp Pro Phe Phe Ser Thr Arg Leu Gly Met Leu Glu 755 760765
Met Val Phe Ala Lys Ala Asp Leu Trp Leu Ala Glu Tyr Tyr Asp 770 775780
Arg Leu Val Asp Lys Ala Leu Trp Pro Leu Gly Lys Glu Leu Arg 785 790795
Leu Gin Glu Glu Asp Ile Lys Val Val Leu Ala Ue Ala Asn Asp
805 810815
His Leu Met Ala Asp Leu Pro Trp Ile Ala Glu Ser Ile Gin Leu 820 825830
Asn Ile Tyr Thr Asp Pro Leu Asn Val Leu Gin Ala Glu Leu Leu 835 840845
Arg Ser Arg Gin Ala Glu Lys Glu Gly Gin Glu Pro Asp Pro Arg Val 850 855860
Glu Gin Ala Leu Met Val ttir Ile Ala Gly Ile Ala Ala Gly Met Arg 865 870 875880
Asn Thr Gly
-33CZ 289051 B6
2) Informace o řetězci č. 3:
i) Vlastnosti řetězce:
A) Délka: 23
B) Typ sloučeniny: nukleová kyselina
C) Typ řetězce: jednoduchý
D) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: syntetické DNA iii) Hypotetický řetězec: žádný xi) Popis řetězce č. 3:
TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTT
2) Informace o řetězci č. 4:
i) Vlastnosti řetězce:
A) Délka: 21
B) Typ sloučeniny: nukleová kyselina
C) Typ řetězce: jednoduchý
D) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: syntetické DNA iii) Hypotetický řetězec: žádný xi) Popis řetězce ě. 4:
ACGGAATTCA ATCTAACGGC C
2) Informace o řetězci č. 5:
i) Vlastnosti řetězce:
A) Délka: 1643
B) Typ sloučeniny: nukleová kyselina
C) Typ řetězce: jednoduchý
D) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: DNA genomu iii) Hypotetický řetězec: žádný iv) Antimediátorový řetězec: žádný vi) Původní zdroj:
A) Organismus: Corynebacterium glutamicum
C) Kmen: ATCC 13869
-34CZ 289051 B6 ix) Vlastnosti:
A) Název/klíč: mat. peptid
B) Polohy: 217 až 1482 xi) Popis řetězce č. 5
TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC ΑΑΑΤΑΤΓΑΑΑ TCGAATATCA ATATACGGTC60
TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCOGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT120
GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGCTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG180
GTAACTGTCA GCACCTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAG GTG GCC CTG GTC GTA CAG234
Met Ala Leu Val Val Gin
| AAA TAT GGC GGT | TCC | TCG CTT GAG AGT GCG GAA CGC ATT AGA AAC GTC | 282 | ||||||||||
| Lys Tyr Gly Gly | Ser | Ser | Leu | Glu | Ser | Ala Glu Arg | Ile | Arg | Asn Val | ||||
| 10 | 15 | 20 | |||||||||||
| GCT GAA | CGG | ATC | GTT | GCC | ACC | AAG | AAG | GCT GGA | AAT | GAT | GTC | GTG GTT | 330 |
| Ala Glu | Arg | Ile | Val | Ala | Thr | Lys | Lys | Ala Gly | Asn | Asp | Val Val Val | ||
| 25 | 30 | 35 | |||||||||||
| GTC TGC | TCC | GCA | ATG | GGA GAC | ACC | ACG | GAT GAA | CTT | CTA GAA CTT GCA | 378 | |||
| Val Cys | Ser | Ala | Met | Gly Asp | Thr | Thr | Asp Glu | Leu | Leu Glu Leu Ala | ||||
| 40 | 45 | 50 | |||||||||||
| GCG GCA | GTG | AAT | CCC | GTT | CCG | CCA | GCT | CGT GAA ATG | GAT ATG CTC CTG | 426 | |||
| Ala Ala Val | Asn | Pro | Val | Pro | Pro | Ala | Arg Glu Met | Asp | Met | Leu Leu | |||
| 55 | 60 | 65 | 70 | ||||||||||
| ACT GCT | GGT | GAG | CGT | ATT | TCT | AAC | GCT | CTC GTC GCC | ATG | GCT | ATT GAG | 474 | |
| Thr Ala | Gly | Glu | Arg | Ile | Ser | Asn | Ala | Leu Val | Ala | Met | Ala | Ile Glu | |
| 75 | 80 | 85 | |||||||||||
| TCC CTT | GGC | GCA | GAA GCT | CAA | TCT | TTC | ACT GGC | TCT | CAG GCT | GGT GTG | 522 |
Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gin Ser Phe Thr Gly Ser Gin Ala Gly Val
95 100
CTC ACC ACC GAG CGC CAC GGA AAC GCA CGC ATT GTT GAC GTC ACA CCG 570
Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg Ha Val Asp Val Thr Pro
105 110 115
-35CZ 289051 B6
GGT CGT CTG CGT GAA GCA CTC GAT GAG GGC AAG ATC TGC ATT GTT GCT 618
Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly Lys Ile Cys Ile Val Ala
120 125 130
GGT TTT CAG GGT GTT AAT AAA GAA ACC CGC GAT GTC ACC ACG TTG GCT 666
Gly Phe Gin Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg Asp Val Thr Thr Leu Gly
| 135 | 140 | 145 | 150 | ||||||||||
| CGT GGT GGT | TCT | GAC ACC | ACT GCA GTT | GCG | TTG | GCA | GCT | GCT | TTG | AAC | 714 | ||
| Axg Gly Gly | Ser | Asp | Thr | Thr Ala Val | Ala | Leu | Ala | Ala | Ala | Leu | Asn | ||
| 155 | 160 | 165 | |||||||||||
| GCT GAT GTG | TCT | GAG | ATT | TAC TCG | GAC | GTT | GAC | GGT | GTG | TAT | ACC | GCT | 762 |
| Ala Asp Val | Cys | Glu | Ile Tyr Ser | Asp | Val | Asp Gly Val | Tyr | Thr | Ala | ||||
| 170 | 175 | 180 | |||||||||||
| GAC CCG CGC | ATC | GTT | CCT AAT GCA | CAG | AAG CTG | GAA AAG | CTC | AGC | TTC | 810 | |||
| Asp Pro Arg | Ile | Val | Pro Asn Ala | Gin | Lys | Leu | Glu | Lys | Leu | Ser | Phe | ||
| 185 | 190 | 195 | |||||||||||
| GAA GAA ATG | CTG | GAA | CTT | GCT GCT | GTT | GGC | TCC | AAG | ATT | TTG | GTG | CTG | 858 |
| Glu Glu Met | Leu | Glu | Leu | Ala Ala Val | Gly | Ser | Lys | Ile | Leu | Val | Leu | ||
| 200 | 205 | 210 | |||||||||||
| CGC AGT GTT | GAA | TAC | GCT | CGT GCA | TTC | AAT | GTG | CCA | CTT | CGC | GTA | CGC | 906 |
| Arg Ser Val | Glu | Tyr | Ala | Arg Ala | Phe | Asn | Val | Pro | Leu | Arg | val | Axg | |
| 215 | 220 | 225 | 230 | ||||||||||
| TCG TCT TAT | AGT | AAT | GAT | CCC GGC | ACT | TTG ATT | GCC | GGC | TCT | ATG | GAG | 954 | |
| Ser Ser Tyr | Ser | Asn | Asp | Pro Gly | Thr | Leu | Ile Ala Gly | Ser | Met | Glu | |||
| 235 | 240 | 245 | |||||||||||
| GAT ATT CCT | GTG | GAA GAA | GCA GTC | CTT | ACC | GCT | GTC | GCA | ACC | GAC | AAG | 1002 | |
| Asp Ile Pro | Val | Glu | Glu | Ala Val | Leu | Thr | Gly | Val | Ala | Thr | Asp | Lys | |
| 250 | 255 | 260 | |||||||||||
| TCC GAA GCC | AAA | GTA | ACC | GTT CTG | GGT | ATT | TCC | GAT | AAG | CCA | GGC | GAG | 1050 |
| Ser Glu Ala | Lys | Val | Thr | Val Leu | Gly | Ile | Ser | Asp | Lys | Pro | Gly Glu | ||
| 265 | 270 | 275 | |||||||||||
| GCT GCC AAG | GTT | TTC | CGT | GCG TTG | GCT | GAT | GCA | GAA ATC | AAC | ATT | GAC | 1098 | |
| Ala Ala Lys Val Phe Axg Ala Leu | Ala | Asp | Ala | Glu | Ile | Asn | Ile | Asp | |||||
| 280 | 285 | 290 | |||||||||||
| ATG GTT CTG CAG MC GTC | TCC TCT | GIG | GAA | GAC | GGC | ACC | ACC | GAC | ATC | 1146 | |||
| Met Val Leu | Gin Asn Val | Ser Ser Val | Glu | Asp Gly | Thr | Thr | Asp | Ile | |||||
| 295 | 300 | 305 | 310 | ||||||||||
| ACG TTC ACC | TGC | CCT | CGC | GCT GAC GGA | CGC | CGT GCG | ATG | GAG | ATC | TTG | 1194 | ||
| Thr Phe Thr | Cys | Pro | Arg | Ala Asp Gly Axg | Axg Ala | Met | Glu | Ile | Leu | ||||
| 315 | 320 | 325 | |||||||||||
| AAG AAG CTT | CAG | l GTT | CAG | GGC AAC TGG ACC AAT GTG CTT | TAC | GAC | GAC | 1242 | |||||
| Lys Lys Leu | Gin Val | Gin Gly Asn Trp Thr Asn Val | Leu | Tyr Asp Asp |
330 335 340
CAG GTC GGC AAA GTC TCC CTC GTG GGT GCT GGC ATG AAG TCT CAC CCA 1290
Gin Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro
345 350 355
-36CZ 289051 B6
| GGT GTT | ACC | GCA | GAG | TTC | ATG GAA GCT | CTG | CGC GAT | GTC AAC GTG AAC | 1338 | ||||
| Gly Val | Ώ1Γ | Ala | G1U | Phe | Met | Glu Ala | Leu | Arg Asp | Val Asn val | Rsa | |||
| 360 | 365 | 370 | |||||||||||
| ATC | TTG | ATT | TCC | ACC | TCT | GAG | ATC | CGC ATT | TCC | GTG CTG ATC | CGT | 1386 | |
| Ile Glu | Leu | Ile | Ser | Thr | Ser | G1U | Ile | Arg | Ile | Ser | Val Leu Ile | Arg | |
| 375 | 380 | 385 | 390 | ||||||||||
| GAA GAT | GAT | CTG | GAT | GCT | GCT | GCA | CGT | GCA | TTG | CAT | GAG CAG TTC | CAG | 1434 |
| Glu Asp Asp | Leu | Asp | Ala Ala | Ala | Arg | Ala | Leu | His | Glu Gin Phe | Gin | |||
| 395 | 400 | 405 | |||||||||||
| CTG GGC GGC | GAA | GAC | GAA GCC | GTC | GTT | TAT | GCA | GGC | ACC GGA CGC | TAA | 1482 | ||
| Leu Gly Gly Glu Asp | Glu Ala | Val | Val | Tyr | Ala | Gly Thr Gly Arg | |||||||
| 410 | 415 | 420 |
ACTTTTAAAG GAGTAGTTTT ACAATGACCA CCATCGCAGT TGTTGGTGCA ACCGGCCAGG 1542
TCGGCCAGGT TATGCGCACC CTTTTGGAAG AGCGCAATTT CCCAGCTGAC ACTGTTCGTT
1602
TCTTTGCTTC CCCGCGTTCC GCAGGOCGTA AGATTGAATT C
1643
2) Informace o řetězci č. 6:
i) Vlastnosti řetězce:
A) Délka: 421 aminokyselina
B) Typ sloučeniny: aminokyselina io D) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: bílkovina xi) Popis řetězce č. 6:
Met Ala Leu Val Val Gin Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala 15 1015
Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala 20 2530
Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp 35 4045
Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg 50 5560
Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu 65 70 7580
Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gin Ser Phe Thr 85 9095
Gly Ser Gin Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg 100 105110
Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly
115 120125
-37CZ 289051 B6
Lys Ha Cys Ile Val Ala Gly Phe Gin Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg 130 135140
Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala ValAla
145 150 155160
Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser AspVal
165 170175
Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gin Lys 180 185190
Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val
195 200205
Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe 210 215220
Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr 225 230235
Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu
245 250255
Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly
260 265270
Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala
275 280285
Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gin Asn Val Ser Ser Val 290 295300
Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly
305 310315
Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gin Val Gin Gly Asn Trp
325 330335
Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gin Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly
340 345350
Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala
355 360365
Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile
370 375380
Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg
385 390395
Leu His Glu Gin Phe Gin Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val 405 410415
Ala Gly Thr Gly Arg
420
-38CZ 289051 B6
2) Informace o řetězci č. 7:
i) Vlastnosti řetězce:
A) Délka: 1643
B) Typ sloučeniny: nukleová kyselina
C) Typ řetězce: dvojitý
D) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: DNA genomu iii) Hypotetický řetězec: žádný iv) Antimediátorový řetězec: žádný vi) Původní zdroj:
A) Organismus: Corynebacterium glutamicum
C) Kmen: ATCC13869 ix) Vlastnosti:
A) Název/klíč: mat. peptid
B) Polohy: 964-1482 xi) Popis řetězce č. 7:
TCGCGAAGTA TGTTTATTGG GCAGAAAGAA GTAACTGTCA GGCGGTTCCT ACCAAGAAGG GAACTTCIAG CTCCTGACTG GGCGCAGAAG GGAAACGCAC AAGATCTGCA TTGGGTCGTG GTGTGTGAGA AATGCACAGA TCCAAGATTT GTACGCTCGT
GCACCTCTCA AACGCATOCC AACACTCCTC GCACGTAGAT CGCTTGAGAG CTGGAAATGA AACTTGCAGC CTGGTGAGCG CTCAATCTTr GCATTGTTGA TTGTTGCTGG GTGGITCTGA rmcrcGGA AGCTGGAAAA TGGTGCTGCG CTTATAGTAA
CTTTTGTCTC AGTGGCTGAG TCGCTAGGTA CGAAAGGTGC TGCGGftACGC TGTCGTGGTT GGCAGTGAAT TATTTCTAAC CftCTGGCTCT CGTCACACCG TTTTCAGGGT CACCACTGCA COTTGACGGT GCTCAGCTTC CAGTOTTGAA TGATCCCGGC
AAATATTAAA ACGCATCCGC GACACAGTTT ACAAAGGTGG ATTAGAAACG GTCTGCTCCG CCCGTTCCGC GCTCTCGTCG CAGGCTGGTG GGTCGTGTGC GTTAATAAAG GTTGCGTTGG GTGTATACCG GAAGAAATGC TACGCTCGTO ACTTTGATTG
TCGAATATCA TAAAGCCCCA ATAAAGGTAG CCCTGGTCGT TCGCTGAACG CAATGGGAGA CAGCTCGTGA CCATGGCTAT TGCTCACCAC GTGAAGCACT AAACCCGCGA CAGCTGCTTT CTGACCCGCG TOGAACTTGC CATTCAATGT CCGGCTCTAT
ATATACGGTC GGAACCCTGT AGTTGAGCGG ACAGAAATAT GATCGTTGCC CACCACGGAT AATGGATATG TGAGTCCCTT CGAGCGCCAC CGATGAGGGC TGICACCACG GAACGCTGAT CATCGTTCCT TGCTGTTGGC GCCftCTTCGC GGAGGATATT
120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960
-39CZ 289051 B6
| CCT | CTG GAA GAA GCA GTC CTT ACC GGT GTC GCA ACC GAC AAG TCC GAA Met Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu | 1008 | |||
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||
| GCC | AAA GTA ACC CTT | CTG GGT ATT TCC GAT AAG CCA GGC | GAG GCT GCC | 1056 | |
| Ala | Lys Val Thr Val Leu Gly Ile Ser Asp | Lys Pro Gly | Glu Ala Ala | ||
| 20 | 25 | 30 | |||
| AAG | GTT TTC CCT GCG | TTG GCT GAT GCA GAA | ATC AAC ATT | GAC ATG GTT | 1104 |
| Lys | Val Phe Arg Ala | Leu Ala Asp Ala Glu | Ile Asn Ile | Asp Met Val | |
| 35 | 40 | 45 | |||
| CTG | CAG AAC GTC TCC | TCT GTG GAA GAC GGC | ACC ACC GAC | ATC ACG TTC | 1152 |
| Leu | Gin Asn Val Ser | Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp | Ile Thr Phe | ||
| 50 | 55 | 60 | |||
| ACC | TGC CCT CGC GCT | GAC GGA CGC CGT GCG | ATG GAG ATC | TTG AAG AAG | 1200 |
| Thr | Cys Pro Arg Ala | Asp Gly Arg Arg Ala | Met Glu Ile | Leu Lys Lys | |
| 65 | 70 | 75 | |||
| CTT | CAG GTT CAG GGC | AAC TGG ACC AAT GTG | CTT TAC GAC | GAC CAG CTC | 1248 |
| Leu | Gin Val Gin Gly | Asn Trp Thr Asn Val | Leu Tyr Asp | Asp Gin Val | |
| 80 | 85 | 90 | 95 | ||
| GGC | AAA GTC TCC CTC | GTG GGT GCT GGC ATG | AAG TCT CAC | CCA GGT GTT | 1296 |
| Gly | Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met | Lys Ser His | Pro Gly Val | ||
| 100 | 105 | 110 | |||
| ACC | GCA GAG TTC ATG | GAA GCT CTG CGC GAT | CTC AAC GTG | AAC ATC GAA | 1344 |
| Thr | Ala Glu Phe Met | Glu Ala Leu Arg Asp | Val Asn Val | Asn Ile Glu | |
| 115 | 120 | 125 | |||
| TTG | ATT TCC ACC TCT | GAG ATC CGC ATT TCC | GTG CTG ATC | CGT GAA GAT | 1392 |
| Leu | Ile Ser Thr Ser | Glu Ile Arg Ile Ser | Val Leu Ile | Arg Glu Asp | |
| 130 | 135 | 140 | |||
| GAT | CTG GAT GCT GCT | GCA CCT GCA TTG CAT | GAG CAG TTC | CAG CTG GGC | 1440 |
| Asp | Leu Asp Ala Ala | Ala Arg Ala Leu His | Glu Gin Phe | Gin Leu Gly | |
| 145 | 150 | 155 | |||
| GGC | GAA GAC GAA GCC | GTC GTT TAT GCA GGC | ACC GGA CGC | TAAAGTTTTAA | 1490 |
Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg 160 165 170 172
AGGACTACTT TTACAATGAC CACCATCGCA GTTGTTGCTG CAACCGGCCA GGTCGGCCAG
GTTATGCGCA CCCTTTTGGA AGAGOGCAAT TTCCCAGCTG ACACTGTTCG TTTCTTTGCT
TCCCCGCCTT CCGCAGGCCG TAAGATTGAA TTC
1550
1610
1643
-40CZ 289051 B6
2) Informace o řetězci č. 8:
i) Vlastnosti řetězce:
A) Délka: 172 aminokyselin
B) Typ sloučeniny: aminokyselina
D) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: bílkovina ix) Popis řetězce č. 8:
| Met: 1 | Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp | Lys Ser Glu Ala | |
| 5 | 10 | 15 | |
| Lys | Val Thr Val Leu Gly Ile Ser Asp Lys Pro Gly | Glu Ala Ala Lys | |
| 20 | 25 | 30 | |
| Val | Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu Ile Asn Ile | Asp Met Val Leu | |
| 35 | 40 | 45 | |
| Gin | Asn val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp 50 55 60 | Ile Thr Phe Thr | |
| Cys | Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu Ile | Leu Lys Lys Leu | |
| 65 | 70 | 75 | 80 |
| Gin | Val Gin Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp | Asp Gin Val Gly | |
| 85 | 90 | 95 | |
| Lys | Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His | Pro Gly Val Thr | |
| 100 | 105 | 110 | |
| Ala | Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val | Asn Ile Glu Leu | |
| 115 | 120 | 125 | |
| Ile | Ser Thr Ser Glu Ile Arg Ue Ser Val Leu Ile 130 135 140 | Arg Glu Asp Asp | |
| Leu | Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gin Phe | Gin Leu Gly Gly | |
| 145 | 150 | 155 | 160 |
| Glu | Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg 165 170 |
2) Informace o řetězci č. 9:
i) Vlastnosti řetězce:
A) Délka: 16
B) Typ sloučeniny: nukleová kyselina
C) Typ řetězce: jednoduchý
D) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: syntetické DNA iii) Hypotetický řetězec: žádný ix) Popis řetězce č. 9:
AAAACCTGC GTTCTC
-41 CZ 289051 B6
2) Informace o řetězci č. 10:
i) Vlastnosti řetězce:
A) Délka: 20
B) Typ sloučeniny: nukleová kyselina
C) Typ řetězce: jednoduchý
D) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: syntetické DNA iii) Hypotetický řetězec: žádný ix) Popis řetězce č. 10:
TGACTTAAG GTTTACAGGCC
2) Informace o řetězci δ. 11:
i) Vlastnosti řetězce:
A) Délka: 20
B) Typ sloučeniny: nukleová kyselina
C) Typ řetězce: jednoduchý
D) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: syntetické DNA iii) Hypotetický řetězec: žádný ix) Popis řetězce č. 11:
ACTGAATTCC AAATGTCCGC
2) Informace o řetězci č. 12:
i) Vlastnosti řetězce:
A) Délka: 16
B) Typ sloučeniny: nukleová kyselina
C) Typ řetězce: jednoduchý
D) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: syntetické DNA iii) Hypotetický řetězec: žádný ix) Popis řetězce č. 12:
AAGTGCAGG CCGTTT
Claims (17)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Mutanta karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu z mikroorganismu, náležejícího do rodu Escherichia s obsahem mutace pro desensitizaci inhibice karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu kyselinou asparagovou v důsledku zpětné vazby, v níž mutací je náhrada zbytku kyseliny glutamové v poloze 625 zbytkem přirozené aminokyseliny, odlišné od kyseliny glutamové, počítáno od N-zakončení karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu.
- 2. Mutanta podle nároku 1, v níž mutací je náhrada zbytku kyseliny glutamové v poloze 625 zbytkem lysinu, počítáno od N-zakončení karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu.
- 3. Mutanta karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu z mikroorganismu, náležejícího do rodu Escherichia s obsahem mutace pro desensitizaci inhibice karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu kyselinou asparagovou v důsledku zpětné vazby, v níž mutací je mutace k náhradě zbytku argininu v poloze 222 zbytkem přirozené aminokyseliny, odlišné od argininu a kyseliny glutamové v poloze 223 zbytkem přirozené aminokyseliny, odlišné od kyseliny glutamové, počítáno od N-zakončení karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu.
- 4. Mutanta podle nároku 3, v níž mutací je náhrada zbytku argininu v poloze 222 zbytkem histidinu a náhrada zbytku kyseliny glutamové v poloze 223 zbytkem lysinu, počítáno od N-zakončení karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu.
- 5. Mutanta karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu z mikroorganismu, náležejícího do rodu Escherichia s obsahem mutace pro desensitizaci inhibice karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu kyselinou asparagovou v důsledku zpětné vazby, v níž mutací je náhrada serinového zbytku v poloze 288 zbytkem přirozené aminokyseliny, odlišné od šeřinu, náhrada zbytku kyseliny glutamové v poloze 289 zbytkem přirozené aminokyseliny, odlišné od kyseliny glutamové, náhrada zbytku methioninu v poloze 551 zbytkem přirozené aminokyseliny, odlišné od methioninu a náhrada zbytku kyseliny glutamové v poloze 804 zbytkem přirozené aminokyseliny, odlišné od kyseliny glutamové, počítáno od N-zakončení karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu.
- 6. Mutanta podle nároku 5, v níž mutací je náhrada zbytku šeřinu v poloze 288 zbytkem fenylalaninu, náhrada zbytku kyseliny glutamové v poloze 289 zbytkem lysinu, náhrada zbytku methioninu v poloze 551 zbytkem isoleucinu a náhrada zbytku kyseliny glutamové v poloze 804 zbytkem lysinu, počítáno od N-zakončení karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu.
- 7. Mutanta karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu z mikroorganismu, náležejícího do rodu Escherichia s obsahem mutace pro desensitizaci inhibice karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu kyselinou asparagovou v důsledku zpětné vazby, v níž mutací je náhrada zbytku alaninu v poloze 867 zbytkem přirozené aminokyseliny, odlišné od alaninu, počítáno od N-zakončení karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu.
- 8. Mutanta podle nároku 7, v níž mutací je náhrada zbytku alaninu v poloze 867 zbytkem threoninu počítáno od N-zakončení karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu.
- 9. Mutanta karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu z mikroorganismu, náležejícího od rodu Escherichia s obsahem mutace pro desensitizaci inhibice karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu kyselinou asparagovou v důsledku zpětné vazby, v níž mutací je náhrada zbytku argininu v poloze 438 zbytkem přirozené aminokyseliny, odlišné od argininu, počítáno od N-zakončení karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu.
- 10. Mutanta podle nároku 9, v níž mutací je náhrada zbytku argininu v poloze 438 zbytkem cysteinu, počítáno od N-zakončení karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu.-43CZ 289051 B6
- 11. Mutanta karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu z mikroorganismu, náležejícího do rodu Escherichia s obsahem mutace pro desensitizaci inhibice karboxylázy fosfoenolpyrohronanu kyselinou asparagovou v důsledku zpětné vazby, v níž mutací je náhrada zbytku lysinu v poloze 620 zbytkem přirozené aminokyseliny, odlišné od lysinu, počítáno od N-zakončení karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu.
- 12. Mutanta podle nároku 11, v níž mutací je náhrada zbytku lysinu v poloze 620 zbytkem šeřinu, počítáno od N-zakončení karboxylázy fosfoenopyrohroznanu.
- 13. Fragment DNA, který je kodovým fragmentem pro mutantu karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu podle některého z nároků 1 až 12.
- 14. Mikroorganismus, náležející do rodu Escherichia nebo do skupiny coryneformních bakterií, který je transformován integrací kodového fragmentu DNA podle nároku 13 do chromosomální DNA.
- 15. Rekombinantní DNA, vytvořená navázáním fragmentu DNA podle nároku 13 na DNA vektoru, schopného autonomní replikace v bakteriích, náležejících do rodu Escherichia nebo do skupiny coryneformních bakterií.
- 16. Mikroorganismus, náležející do rodu Escherichia nebo do skupiny coryneformních bakterií, který je transformován rekombinantní DNA podle nároku 15.
- 17. Způsob výroby aminokyseliny ze skupiny L-lysin, L-threonin, L-methionin, L-isoleucin, kyselina L-glutamová, L-arginin nebo L-prolin, vyznačující se tím, že se v živném prostředí pěstuje mikroorganismus podle některého z nároků 14 nebo 16 a ze živného prostředí se izoluje aminokyselina ze skupiny L-lysin, L-threonin, L-methionin, Lisoleucin, kyselina L-glutamová, L-arginin nebo L-prolin.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20977593 | 1993-08-24 | ||
| JP20977693 | 1993-08-24 | ||
| JP15387694 | 1994-07-05 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ52496A3 CZ52496A3 (en) | 1996-06-12 |
| CZ289051B6 true CZ289051B6 (cs) | 2001-10-17 |
Family
ID=27320552
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ1996524A CZ289051B6 (cs) | 1993-08-24 | 1994-08-17 | Mutanta karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu, kódový řetězec pro tuto mutantu, produkční mikroorganismus a způsob výroby aminokyseliny |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5876983A (cs) |
| EP (1) | EP0723011B1 (cs) |
| KR (2) | KR100337959B1 (cs) |
| CN (1) | CN1179043C (cs) |
| AT (1) | ATE220099T1 (cs) |
| AU (1) | AU682547B2 (cs) |
| BR (1) | BR9407625A (cs) |
| CA (1) | CA2169170C (cs) |
| CZ (1) | CZ289051B6 (cs) |
| DE (1) | DE69430919T2 (cs) |
| HU (1) | HU219600B (cs) |
| MY (1) | MY112250A (cs) |
| PL (1) | PL181380B1 (cs) |
| SK (1) | SK283369B6 (cs) |
| WO (1) | WO1995006114A1 (cs) |
Families Citing this family (73)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6969782B2 (en) | 1993-10-06 | 2005-11-29 | Ajinomoto Co., Inc. | Method of producing transgenic plants having improved amino acid composition |
| JPH09285294A (ja) * | 1996-04-23 | 1997-11-04 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造法 |
| KR100697552B1 (ko) * | 1997-07-18 | 2007-03-21 | 아지노모토 가부시키가이샤 | 발효에 의한 퓨린 뉴클레오사이드의 제조 방법 |
| BRPI9813021B1 (pt) * | 1997-10-04 | 2016-04-05 | Degussa | processo para a preparação microbiana de aminoácidos de l-lisina, l-treonina, l-homosserina e glutamato, vetor, e célula transformada |
| AU756507B2 (en) * | 1998-03-18 | 2003-01-16 | Ajinomoto Co., Inc. | L-glutamic acid-producing bacterium and method for producing L-glutamic acid |
| US20030087381A1 (en) * | 1998-04-13 | 2003-05-08 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Metabolically engineered organisms for enhanced production of oxaloacetate-derived biochemicals |
| MY121380A (en) | 1998-04-13 | 2006-01-28 | Univ Georgia | Pyruvate carboxylase overexpression for enhanced production of oxaloacetate-derived biochemicals in microbial cells |
| US6171833B1 (en) | 1998-12-23 | 2001-01-09 | Massachusetts Institute Of Technology | Pyruvate carboxylase from corynebacterium glutamicum |
| MXPA01006290A (es) * | 1998-12-23 | 2002-04-17 | Massachusetts Inst Technology | Piruvato carboxilasa a partir de corynebacterium glutamicum. |
| CA2377488A1 (en) * | 1999-06-29 | 2001-01-04 | Archer-Daniels-Midland Company | Regulation of carbon assimilation |
| US6599732B1 (en) | 1999-06-29 | 2003-07-29 | Archer-Daniels-Midland Company | Regulation of carbon assimilation |
| CN1298854C (zh) | 1999-07-02 | 2007-02-07 | 味之素株式会社 | 编码蔗糖pts酶ⅱ的dna |
| DE19931314A1 (de) * | 1999-07-07 | 2001-01-11 | Degussa | L-Lysin produzierende coryneforme Bakterien und Verfahren zur Herstellung von Lysin |
| AU1206801A (en) * | 1999-10-13 | 2001-04-23 | University Of Georgia Research Foundation, Inc., The | High yield protein expression system and methods |
| US6727411B2 (en) | 1999-12-13 | 2004-04-27 | Ajinomoto Co., Inc. | Method of producing transgenic plants having improved amino acid composition |
| AU2223601A (en) * | 1999-12-24 | 2001-07-09 | Ajinomoto Co., Inc. | Process for producing l-amino acid and novel gene |
| US6927046B1 (en) | 1999-12-30 | 2005-08-09 | Archer-Daniels-Midland Company | Increased lysine production by gene amplification using coryneform bacteria |
| BRPI0016995B1 (pt) * | 2000-01-21 | 2016-03-08 | Ajinomoto Kk | bactéria escherichia coli geneticamente modificada, e, método para produzir l-lisina |
| US7368266B2 (en) | 2001-02-13 | 2008-05-06 | Cj Corporation | Method for L-threonine production |
| KR100397423B1 (ko) * | 2001-02-13 | 2003-09-13 | 씨제이 주식회사 | Ｌ-쓰레오닌의 제조방법 |
| US20030115638A1 (en) * | 2001-08-17 | 2003-06-19 | Ajinomoto Co., Inc. | Plants having increased amino acids content and methods for producing the same |
| AU2003205041A1 (en) * | 2002-07-12 | 2004-01-29 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing target substance by fermentation |
| BR0304860A (pt) * | 2002-11-11 | 2004-08-31 | Ajinomoto Kk | Método para produzir uma substância alvo pela utilização de uma-bactéria pertencente ao gênero escherichia |
| KR100498971B1 (ko) * | 2003-04-04 | 2005-07-04 | 씨제이 주식회사 | 염색체 내 ｔｄｃＢＣ 및 ｐｃｋＡ 유전자가 불활성화된 미생물 및 이를 이용하여 Ｌ-쓰레오닌을 제조하는 방법 |
| EP1735339A2 (en) * | 2004-04-09 | 2006-12-27 | Genencor International, Inc. | Pcka modifications and enhanced protein expression in bacillus |
| KR100768748B1 (ko) | 2004-12-30 | 2007-10-19 | 씨제이 주식회사 | 외래의 ｎａｄｐ 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트디히드로게나제 유전자를 포함하는 에세리키아 종 또는코리네박리움 종 미생물 및 그를 이용하여 ｌ-라이신을생산하는 방법 |
| WO2007017710A1 (en) | 2005-08-11 | 2007-02-15 | Metabolic Explorer | Process for the preparation of aspartate and derived amino acids like lysine, threonine, isoleucine, methionine, homoserine, or valine employing a microorganism with enhanced isocitrate lyase and/or malate synthase expression |
| EP1979486B1 (en) | 2006-01-30 | 2013-04-17 | Ajinomoto Co., Inc. | L-amino acid producing bacterium and method of producing l-amino acid |
| JP2009118740A (ja) | 2006-03-03 | 2009-06-04 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP2010017082A (ja) | 2006-10-10 | 2010-01-28 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP2010041920A (ja) | 2006-12-19 | 2010-02-25 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP2010515465A (ja) * | 2007-01-12 | 2010-05-13 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティー オブ コロラド，ア ボディー コーポレート | 微生物によって生成される有機化学物質の生成に対する耐性を高めるための組成物および方法 |
| JP2010088301A (ja) | 2007-02-01 | 2010-04-22 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP2010110216A (ja) | 2007-02-20 | 2010-05-20 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸または核酸の製造方法 |
| US8883453B2 (en) * | 2007-04-30 | 2014-11-11 | University Of Maryland | Codon specific mutagenesis |
| CN101939412B (zh) | 2007-09-04 | 2016-01-20 | 味之素株式会社 | 生产氨基酸的微生物以及氨基酸的生产方法 |
| US8048624B1 (en) | 2007-12-04 | 2011-11-01 | Opx Biotechnologies, Inc. | Compositions and methods for 3-hydroxypropionate bio-production from biomass |
| JP2011067095A (ja) | 2008-01-10 | 2011-04-07 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法による目的物質の製造法 |
| EP2248906A4 (en) | 2008-01-23 | 2012-07-11 | Ajinomoto Kk | PROCESS FOR THE PREPARATION OF L-AMINO ACID |
| EP2336347B1 (en) | 2008-09-08 | 2017-03-15 | Ajinomoto Co., Inc. | An l-amino acid-producing microorganism and a method for producing an l-amino acid |
| JP2012029565A (ja) | 2008-11-27 | 2012-02-16 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| JPWO2011013707A1 (ja) | 2009-07-29 | 2013-01-10 | 味の素株式会社 | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP2012223091A (ja) | 2009-08-25 | 2012-11-15 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP2012223092A (ja) | 2009-08-28 | 2012-11-15 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| MX2012003604A (es) | 2009-09-27 | 2012-09-12 | Opx Biotechnologies Inc | Metodo para producir acido 3-hidroxipropionico y otros productos. |
| US8809027B1 (en) | 2009-09-27 | 2014-08-19 | Opx Biotechnologies, Inc. | Genetically modified organisms for increased microbial production of 3-hydroxypropionic acid involving an oxaloacetate alpha-decarboxylase |
| JP2013013329A (ja) | 2009-11-06 | 2013-01-24 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| WO2011063363A2 (en) * | 2009-11-20 | 2011-05-26 | Opx Biotechnologies, Inc. | Production of an organic acid and/or related chemicals |
| CA2788596A1 (en) | 2010-02-11 | 2011-08-18 | Metabolix, Inc. | Process for producing a monomer component from a genetically modified polyhydroxyalkanoate biomass |
| WO2012103261A2 (en) | 2011-01-25 | 2012-08-02 | Finley Kenneth R | Compositions and methods for succinate production |
| WO2012103263A2 (en) * | 2011-01-25 | 2012-08-02 | Finley Kenneth R | Compositions and methods for malate and fumarate production |
| EP2495317A1 (en) | 2011-03-01 | 2012-09-05 | Technische Universität Hamburg-Harburg | Modified phosphoenolpyruvate carboxylase from Corynebacterium glutamicum and uses thereof |
| WO2012170793A1 (en) | 2011-06-08 | 2012-12-13 | Metabolix, Inc. | Biorefinery process for thf production |
| BR112014002859A2 (pt) | 2011-08-10 | 2017-06-13 | Metabolix Inc | purificação pós-processamento para produção de gama-butiro lactona |
| EP2877568B1 (en) | 2012-07-25 | 2021-04-28 | Cargill, Incorporated | Yeast cells having reductive tca pathway from pyruvate to succinate and overexpressing an exogenous nad(p)+ transhydrogenase enzyme |
| US20140051136A1 (en) | 2012-08-10 | 2014-02-20 | Opx Biotechnologies, Inc. | Micoorganisms and Methods for the Production of Fatty Acids and Fatty Acid Derived Products |
| US10047383B2 (en) | 2013-03-15 | 2018-08-14 | Cargill, Incorporated | Bioproduction of chemicals |
| EP2976141A4 (en) | 2013-03-15 | 2016-10-05 | Cargill Inc | FLASHING FOR PRODUCTION CLEANING AND RECOVERY |
| PE20150681A1 (es) | 2013-05-13 | 2015-05-15 | Ajinomoto Kk | Metodo para producir l-aminoacidos |
| JP2016165225A (ja) | 2013-07-09 | 2016-09-15 | 味の素株式会社 | 有用物質の製造方法 |
| US10337038B2 (en) | 2013-07-19 | 2019-07-02 | Cargill, Incorporated | Microorganisms and methods for the production of fatty acids and fatty acid derived products |
| US11408013B2 (en) | 2013-07-19 | 2022-08-09 | Cargill, Incorporated | Microorganisms and methods for the production of fatty acids and fatty acid derived products |
| JP2016192903A (ja) | 2013-09-17 | 2016-11-17 | 味の素株式会社 | 海藻由来バイオマスからのｌ−アミノ酸の製造方法 |
| JP5958653B2 (ja) | 2013-10-02 | 2016-08-02 | 味の素株式会社 | アンモニア制御装置およびアンモニア制御方法 |
| JP6459962B2 (ja) | 2013-10-21 | 2019-01-30 | 味の素株式会社 | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP6519476B2 (ja) | 2013-10-23 | 2019-05-29 | 味の素株式会社 | 目的物質の製造法 |
| EP2993228B1 (en) | 2014-09-02 | 2019-10-09 | Cargill, Incorporated | Production of fatty acid esters |
| CN105132388B (zh) * | 2015-09-06 | 2018-02-23 | 江南大学 | 一种酶活性提高的丙酮酸羧化酶突变体r485p及其应用 |
| CN105907730B (zh) * | 2016-05-11 | 2019-06-21 | 江南大学 | 一种酶活性提高的丙酮酸羧化酶突变体n1078f及其应用 |
| JP2020506702A (ja) | 2017-02-02 | 2020-03-05 | カーギル インコーポレイテッド | Ｃ６−ｃ１０脂肪酸誘導体を生成する遺伝子組み換え細胞 |
| JP7333913B2 (ja) * | 2017-09-01 | 2023-08-28 | 国立大学法人 新潟大学 | アンブレインの効率的製造方法 |
| WO2022133917A1 (zh) * | 2020-12-24 | 2022-06-30 | 武汉远大弘元股份有限公司 | 改造的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶及其在提高谷氨酸棒杆菌氨基酸产量中的应用 |
| CN115806962A (zh) * | 2021-09-15 | 2023-03-17 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶突变体及其应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2223754B (en) * | 1988-09-12 | 1992-07-22 | Degussa | Dna encoding phosphoenolpyruvate carboxylase |
| JPH07108228B2 (ja) * | 1990-10-15 | 1995-11-22 | 味の素株式会社 | 温度感受性プラスミド |
-
1994
- 1994-08-17 US US08/596,366 patent/US5876983A/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-08-17 WO PCT/JP1994/001365 patent/WO1995006114A1/ja active IP Right Grant
- 1994-08-17 EP EP94924384A patent/EP0723011B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-08-17 AU AU80991/94A patent/AU682547B2/en not_active Ceased
- 1994-08-17 BR BR9407625A patent/BR9407625A/pt not_active IP Right Cessation
- 1994-08-17 CA CA002169170A patent/CA2169170C/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-08-17 HU HU9600240A patent/HU219600B/hu not_active IP Right Cessation
- 1994-08-17 CN CNB941939057A patent/CN1179043C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1994-08-17 PL PL94313119A patent/PL181380B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1994-08-17 CZ CZ1996524A patent/CZ289051B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1994-08-17 KR KR1019960700741A patent/KR100337959B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1994-08-17 AT AT94924384T patent/ATE220099T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-08-17 DE DE69430919T patent/DE69430919T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-08-17 SK SK204-96A patent/SK283369B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1994-08-23 MY MYPI94002202A patent/MY112250A/en unknown
-
1996
- 1996-02-14 KR KR1019960700074A patent/KR960704029A/ko not_active Application Discontinuation
-
1997
- 1997-11-10 US US08/967,104 patent/US5919694A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5919694A (en) | 1999-07-06 |
| PL313119A1 (en) | 1996-06-10 |
| SK283369B6 (sk) | 2003-06-03 |
| EP0723011A4 (en) | 1996-05-21 |
| CN1179043C (zh) | 2004-12-08 |
| CN1133615A (zh) | 1996-10-16 |
| HU219600B (hu) | 2001-05-28 |
| WO1995006114A1 (fr) | 1995-03-02 |
| AU8099194A (en) | 1995-03-21 |
| CA2169170A1 (en) | 1995-03-02 |
| AU682547B2 (en) | 1997-10-09 |
| HU9600240D0 (en) | 1996-03-28 |
| EP0723011B1 (en) | 2002-07-03 |
| KR960704029A (ko) | 1996-08-31 |
| MY112250A (en) | 2001-05-31 |
| HUT73690A (en) | 1996-09-30 |
| ATE220099T1 (de) | 2002-07-15 |
| DE69430919T2 (de) | 2003-02-27 |
| DE69430919D1 (de) | 2002-08-08 |
| CZ52496A3 (en) | 1996-06-12 |
| PL181380B1 (pl) | 2001-07-31 |
| EP0723011A1 (en) | 1996-07-24 |
| KR100337959B1 (ko) | 2002-11-23 |
| US5876983A (en) | 1999-03-02 |
| SK20496A3 (en) | 1996-11-06 |
| CA2169170C (en) | 2007-01-09 |
| BR9407625A (pt) | 1997-01-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ289051B6 (cs) | Mutanta karboxylázy fosfoenolpyrohroznanu, kódový řetězec pro tuto mutantu, produkční mikroorganismus a způsob výroby aminokyseliny | |
| JP5486029B2 (ja) | 遺伝子増幅によるリジン産生の増加 | |
| Riedel et al. | Characterization of the phosphoenolpyruvate carboxykinase gene from Corynebacterium glutamicum and significance of the enzyme for growth and amino acid production | |
| KR102144998B1 (ko) | 효모에 내산성을 부여하는 폴리펩티드, 그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 그 양이 증가되어 있는 효모 세포, 상기 효모 세포를 이용한 산물의 생산 방법 및 내산성 효모 세포를 생산하는 방법 | |
| CN113481136B (zh) | 重组嗜盐单胞菌及构建方法及催化柠檬酸制备衣康酸的应用 | |
| KR101934615B1 (ko) | 위케라모미세스 시페리이로부터의 아세틸트랜스퍼라제 | |
| KR102308556B1 (ko) | 변경된 일산화탄소 탈수소효소(codh) 활성을 가지는 유전자 조작된 박테리아 | |
| KR101831121B1 (ko) | 피리피로펜 생합성 유전자 클러스터 및 표지 유전자를 포함하는 핵산 구성체 | |
| JP3013711B2 (ja) | 変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼとその遺伝子及びアミノ酸の製造方法 | |
| US7141664B2 (en) | Genes coding carbon metabolism and energy-producing proteins | |
| CN115605589A (zh) | 改进的用于生产类异戊二烯的方法 | |
| KR20150112575A (ko) | GlnD 또는 GlnK의 활성이 증가되도록 유전적으로 조작된 박테리아 세포 및 그를 이용하여 유기산을 생산하는 방법 | |
| KR20150051880A (ko) | 철에 의해 조절되는 ａｂｃ 트란스포터의 활성이 증가된 미생물 및 이를 이용한 히드록시카르복실산의 제조방법 | |
| KR20150015588A (ko) | Ｃ4 화합물 생산을 위한 코리네박테리움 균주 및 이를 이용한 ｃ4 화합물 생산 방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20100817 |