KR20150112575A - GlnD 또는 GlnK의 활성이 증가되도록 유전적으로 조작된 박테리아 세포 및 그를 이용하여 유기산을 생산하는 방법 - Google Patents

Abstract

GlnD 또는 GlnK의 활성이 증가되도록 유전적으로 조작된 박테리아 세포 및 그를 이용하여 숙신산을 생산하는 방법이 제공된다.

Description

GlnD 또는 GlnK의 활성이 증가되도록 유전적으로 조작된 박테리아 세포 및 그를 이용하여 유기산을 생산하는 방법{Genetically engineered bacterial cell having enhanced GlnD or GlnK and method of producing organic acid using the same}

GlnD 또는 GlnK의 활성이 증가되도록 유전적으로 조작된 박테리아 세포 및 그를 이용하여 숙신산을 생산하는 방법에 관한 것이다.

코리네박테리움 속 미생물은 그람 양성 균주로서, 글루타메이트, 리신, 트레오닌과 같은 아미노산을 생산하는 용도로 널리 이용되고 있다. 코리네박테리움 글루타미쿰은 생장 조건이 단순하고, 유전체 구조가 안정적이며, 환경 유해성이 없어 산업용 균주로서의 장점을 갖추고 있다. 코리네박테리움 글루타미쿰은 호기 세균으로, 산소 공급이 중단되거나 부족한 혐기 조건 하에서 최소한의 생존을 위한 에너지를 생산하는 외의 대사 과정이 중단되고, 에너지 생산을 위해 젖산, 아세트산, 숙신산 등을 생산하여 배출한다.

트리카르복실산(TCA) 회로는 생물종에서 에너지 및 중간 대사 산물을 생성하는 대사 과정이다. TCA 회로의 중간 대사 산물은 세포 내 여러 대사 과정을 통해 유용한 화학물질로 합성된다. 숙신산(succinic acid)은 생분해성 고분자, 의약, 식품 및 화장품의 원료물질 등으로 사용되는 디카르복실산의 일종이다. 산업적으로 사용되는 대부분의 숙신산은 원유나 액화천연가스에서 유래한 n-부탄 및 아세틸렌으로부터 합성된다. 의약품, 식품 등 특수한 용도로 사용되는 소량의 숙신산만이 미생물을 이용한 발효 공정에 의해 생산되고 있다.

일반적으로 화학적 합성 공정은 유해 물질을 다량 배출하고, 자원의 고갈 가능성이 높은 화석원료를 기초물질로 사용한다. 따라서, 종래 기술에 의하더라도, 숙신산을 효율적으로 생산할 수 있는 미생물 및 이를 이용한 숙신산 생산 방법이 요구된다.

일 양상은 유전적으로 조작된 박테리아 세포를 제공한다.

다른 양상은 유기산을 생산하는 방법을 제공한다.

본 명세서에서 사용된 용어 단백질 또는 효소의 "활성 증가"는 단백질 또는 효소가 활성을 나타낼 수 있도록 충분한 정도로 증가된 것일 수 있으며, 세포 또는 단리된 단백질 또는 효소가 비교 가능한 동일 종의 세포 또는 그의 본래 단백질 또는 효소에서 측정된 활성 수준과 비교하여 높은 활성 수준을 나타냄을 의미한다. 즉 해당 단백질 또는 효소의 활성이 본래 조작되지 않은 단백질 또는 효소에 의한 동일한 생화학적 활성보다 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 또는 약 100% 이상 증가된 것일 수 있다. 또한, 해당 세포 중의 특정 단백질 또는 효소의 활성이 조작되지 않은 세포 중의 상기 단백질 또는 효소의 활성보다 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 또는 약 100% 이상 증가된 것일 수 있다. 단백질 또는 효소의 증가된 활성을 갖는 세포는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 확인될 수 있다.

단백질 또는 효소의 활성 증가는 발현 증가 또는 비활성 (specific activity)의 증가에 의하여 얻을 수 있다. 상기 발현 증가는 단백질 또는 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 세포에 도입되거나 세포 내 카피 수가 증가되거나, 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 조절 영역의 변이에 의한 것일 수 있다. 외부에서 도입되거나 또는 카피 수가 증가되는 폴리뉴클레오티드는 내인성 (endogenous) 또는 외인성 (exogenous)일 수 있다. 상기 내인성 유전자는 미생물 내부에 포함된 유전물질 상에 존재하던 유전자를 말한다. 외인성 유전자는 외부로부터 세포 내로 도입되는 유전자를 의미하며, 도입되는 유전자는 도입되는 숙주세포에 대해 동종 (homologous) 또는 이종 (heterologous)일 수 있다.

용어 "카피 수 증가 (copy number increase)"는 상기 유전자의 도입 또는 증폭에 의한 것일 수 있으며, 조작되지 않은 세포에 존재하지 않는 유전자를 유전적 조작에 의해 갖게 되는 경우도 포함한다. 상기 유전자의 도입은 벡터와 같은 비히클을 매개하여 이루어질 수 있다. 상기 도입은 상기 유전자가 게놈에 통합되지 않은 임시적 (transient) 도입이거나 게놈에 삽입되는 것일 수 있다. 상기 도입은 예를 들면, 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 벡터를 상기 세포로 도입한 후, 상기 벡터가 세포 내에서 복제되거나 상기 폴리뉴클레오티드가 게놈으로 통합됨으로써 이루어질 수 있다.

용어 "유전자 (gene)"는 전사 및 번역 중 하나 이상에 의하여 발현 산물, 예를 들면, mRNA 또는 단백질을 생성할 수 있는 핵산 단편을 의미하며, 코딩영역 또는 코딩영역 외 5'-비코딩 서열 (5'-non coding 서열)과 3'-비코딩 서열 (3'-non coding 서열) 등의 조절 (regulatory) 서열을 포함할 수 있다.

"이종성 (heterologous)"은 천연 (native)이 아닌 외인성 (foreign)을 의미한다.

"세포 (cell)", "균주 (strain)", 또는 "미생물 (microorganism)"은 교체 사용이 가능한 것으로서, 박테리아, 효모, 곰팡이 등을 포함한다.

단백질 또는 효소의 "활성이 감소되는 것"은 상기 단백질 또는 효소를 코딩하는 유전자의 제거 또는 파괴에 의한 것일 수 있다. 본 발명의 유전자의 "제거 (deletion)" 또는 "파괴 (disruption)"는 유전자가 발현되지 않거나 발현량이 감소되거나 발현되어도 효소 활성을 나타내지 않거나 활성이 감소되도록, 유전자의 일부 또는 전부가, 또는 그 프로모터, 그 터미네이터 영역 등의 조절 서열의 일부 또는 전부가 변이되는 것을 말한다. 상기 변이는 유전자의 하나 이상의 염기가 부가, 치환, 삽입, 또는 전환되는 것을 포함한다. 상기 유전자의 제거 또는 파괴는 상동재조합과 같은 유전자 조작, 돌연변이 유발, 분자 진화를 통해 달성될 수 있다. 세포가 복수 개의 같은 유전자를 포함하거나 2개 이상의 다른 폴리펩티드 동종상동유전자 (paralog)를 포함하는 경우, 하나 또는 그 이상의 유전자가 제거 또는 파괴될 수 있다.

본 발명의 핵산 또는 폴리펩티드의 "서열 동일성 (sequence identity)"은 특정 비교 영역에서 양 서열을 최대한 일치되도록 얼라인시킨 후 서열간의 염기 또는 아미노산 잔기의 동일한 정도를 의미한다. 서열 동일성은 특정 비교 영역에서 2개의 서열을 최적으로 얼라인하여 비교함으로써 측정되는 값으로서, 비교 영역 내에서 서열의 일부는 대조 서열 (reference sequence)과 비교하여 부가 또는 삭제되어 있을 수 있다. 서열 동일성 백분율은 예를 들면, 비교 영역 전체에서 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하는 단계, 두 서열 모두에서 동일한 아미노산 또는 핵산이 나타나는 위치의 갯수를 결정하여 일치된 (matched) 위치의 갯수를 수득하는 단계, 상기 일치된 위치의 갯수를 비교 범위 내의 위치의 총 갯수 (즉, 범위 크기)로 나누는 단계, 및 상기 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 수득하는 단계에 의해 계산될 수 있다. 상기 서열 동일성의 퍼센트는 공지의 서열 비교 프로그램을 사용하여 결정될 수 있으며, 상기 프로그램의 일례로 BLASTN 및 BLASTP (NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlign^TM (DNASTAR Inc.) 등을 들 수 있다.

여러 종의 동일하거나 유사한 기능이나 활성을 가지는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 확인하는데 있어서 여러 수준의 서열 동일성을 사용할 수 있다. 예를 들어, 50%이상, 55%이상, 60%이상, 65%이상, 70%이상, 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100% 등을 포함하는 서열 동일성이다.

본 명세서에서 사용된 용어 "조작되지 않은 세포 (non-engineered cell)"란 GlnD, 및 GlnK로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 것의 양 또는 활성이 증가되도록, 유전적으로 조작되지 않은 것을 의미한다. "유전적 조작 (genetical engineering)"이란 세포의 유전물질의 구성 또는 구조를 인위적으로 변경시키는 것을 포함한다. 상기 조작되지 않은 세포는 GlnD, 및 GlnK로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 것의 양 또는 활성이 증가되도록 유전적으로 조작하는데 사용된 모균주 (parent strain)일 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "유기산 (organic acid)"은 유기산 자체뿐만 아니라, 음이온 형태 (예, succinate), 그의 염, 용매화물, 다형체 또는 그 조합을 포함하는 것으로 해석된다. 상기 염은 예를 들면 무기산염, 유기산염 또는 금속염일 수 있다. 무기산염은 염산염, 브롬산염, 인산염, 황산염 또는 이황산염일 들 수 있다. 유기산염은 포름산염, 초산염, 아세트산염, 프로피온산염, 젖산염, 옥살산염, 주석산염, 말산염, 말레인산염, 구연산염, 푸마르산염, 베실산염, 캠실산염, 에디실염, 트리플루오로아세트산염, 벤조산염, 글루콘산염, 메탄술폰산염, 글리콜산염, 숙신산염, 4-톨루엔술폰산염, 갈룩투론산염, 엠본산염, 글루탐산염 또는 아스파르트산염일 수 있다. 금속염은 칼슘염, 나트륨염, 마그네슘염, 스트론튬염 또는 칼륨염일 수 있다.

일 양상은 조작되지 않은 세포에 비하여, GlnK, 및 GlnD로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 것의 양 또는 활성이 증가되어 있는, 유기산 생산능이 증가되어 있는 유전적으로 조작된 박테리아 세포를 제공한다.

GlnK는 glnK 유전자에 의하여 코딩되는 단백질을 나타낸다. GlnK는 P_II-타입 신호 전달 단백질일 수 있다. GlnD는 glnD 유전자에 의하여 코딩되는 것일 수 있다. GlnD 단백질은 GlnK를 아데닐화 및/또는 탈아데닐화 (adenylation and/or deadenylation) 또는 우리딜화 및/또는 탈우리딜화 (uridylation and/or deuridylation)시키는 것일 수 있다. GlnD 단백질은 예를 들면, 코리네박테리움 속 박테리아, 예를 들면 C. 글루타미쿰에서는 GlnK를 아데닐화 및/또는 탈아데닐화 (adenylation and/or deadenylation)시키는 것이고, 또는 에세리키아 (Escherichia) 속 박테리아, 예를 들면 대장균에서는 GlnK를 우리딜화 및/또는 탈우리딜화 (uridylation and/or deuridylation)시키는 것일 수 있다. GlnD 단백질은 아데닐릴 트란스퍼라제 및/또는 우리딜릴 트란스퍼라제일 수 있다. GlnK와 GlnD는 코리네박테리움 글루타미쿰에서 질소 조절 시스템의 핵심 성분으로 알려져 있다. glnK와 glnD 유전자는 regulon으로서 공통적으로 조절되는 것일 수 있다.

상기 유기산은 C1 내지 C20를 갖는 유기산일 수 있다. 상기 유기산은 아세트산, 젖산, 프로피온산, 3-히드록시프로피온산, 부티르산, 4-히드록시부티르산, 숙신산, 푸마르산, 말산, 옥살산, 아디프산, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 유기산은 C3 내지 C20의 디카르복실산일 수 있다. 상기 유기산은 C3 내지 C20의 디카르복실산, 예를 들면, C3 내지 C5, 또는 C4의 디카르복실산일 수 있다.

상기 GlnK 및 GlnD는 각각 서열번호 1 및 서열번호 2의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다.

상기 GlnK 및 GlnD는 각각 서열번호 3 및 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 것에 의하여 코딩되는 것일 수 있다.

상기 GlnK 및 GlnD는 각각 glnK 유전자 (Ncgl1982) 및 glnD 유전자 (NCgl981)에 의하여 코딩되는 것일 수 있다.

상기 박테리아 세포는 미호기성 또는 혐기성 조건에서 숙신산 생산능을 갖는 것일 수 있다. 미호기성(microaerobic) 조건은 낮은 수준의 산소가 배지 중으로 용해되는 배양 조건을 의미할 수 있다. 상기 낮은 수준의 산소는 대기 중 산소 수준 미만인 것을 의미한다. 상기 낮은 수준의 산소는 대기 중 산소의 0.1% 내지 10%, 1% 내지 9%, 2% 내지 8%, 3% 내지 7%, 또는 4% 내지 6%가 배양액과 접촉되도록 하는 것일 수 있다.

상기 박테리아 세포는 코리네박테리움 속, 바실러스 속, 리조비움 속, 에세리키아 속, 락토바실러스 속, 악티노바실러스, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 박테리아 세포는 코리네박테리움 속, 예를 들면, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 써모아미노게네스(Corynebacterium thermoaminogenes), 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum) 또는 브레비박테리움 락토페르멘툼(Brevibacterium lactofermentum)일 수 있다. 상기 코리네박테리움 글루타미쿰은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032, S003, 또는 S006 균주일 수 있다.

상기 하나 이상과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 것의 양 또는 활성이 증가되는 것은, 상기 하나 이상을 코딩하는 유전자의 카피 수 증가 또는 상기 유전자의 발현 조절 서열의 변형에 의한 것일 수 있다.

상기 카피 수 증가는 상기 유전자의 세포 외부로부터 내부로의 도입 또는 내재적 유전자의 증폭에 의한 것일 수 있다.

상기 도입은 벡터와 같은 비히클을 매개하여 이루어질 수 있다. 상기 도입은 상기 유전자가 게놈에 통합되지 않은 임시적 (transient) 도입 또는 게놈에 삽입된 도입일 수 있다. 상기 도입은 예를 들면, 상기 유전자가 삽입된 벡터를 상기 세포로 도입한 후, 상기 벡터가 세포 내에서 복제되거나 상기 유전자가 게놈 내로 통합됨으로써 이루어질 수 있다. 상기 유전자는 그의 발현을 조절에 관련된 조절 서열과 작동가능하게 연결된 것일 수 있다. 상기 조절 서열은 프로모터, 5'-비코딩 서열, 3'-비코딩 서열, 전자 종결자 서열, 인핸서, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 유전자는 내재적 유전자 또는 외인성 유전자일 수 있다. 또한, 상기 조절 서열은 유전자 발현에 영향을 줄 수 있는 모티프를 코딩하는 서열일 수 있다. 상기 모티프는 예를 들면, 이차 구조-안정화 모티프, RNA 불안정화 모티프, 스플라이스-활성화 모티프, 폴리아데닐화 모티프, 아데닌-풍부 서열(adenine-rich sequence), 또는 엔도뉴클레아제 인식 부위일 수 있다.

상기 하나 이상과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 것의 양 또는 활성이 증가되는 것은, 상기 하나 이상을 코딩하는 유전자의 돌연변이에 의한 것일 수 있다. 돌연변이는 하나 이상의 염기의 치환, 삽입, 부가, 또는 전환을 야기하는 것일 수 있다.

상기 박테리아 세포는, L-락테이트 데히드로게나제, 피루베이트 옥시다제, 포스포트란스아세틸라제, 아세테이트 키나제, 아세테이트 CoA 트란스퍼라제, 또는 그 조합의 양 또는 활성이 감소되어 있는 것일 수 있다.

상기 박테리아 세포는, L-락테이트 데히드로게나제 유전자, 피루베이트 옥시다제 유전자, 포스포트란스아세틸라제 유전자, 아세테이트 키나제 유전자, 아세테이트 CoA 트란스퍼라제 유전자, 또는 그 조합이 제거 또는 파괴된 것일 수 있다.

상기 L-락테이트 데히드로게나제 (lactate dehydrogenase, LDH)는 락테이트를 피루베이트로 전환시키는 것을 촉매하는 것일 수 있다. 상기 LDH는 EC.1.1.1.27로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 LDH는 예를 들면, 서열번호 5의 아미노산 서열을 가질 수 있다. L-락테이트 데히드로게나제 유전자는 서열번호 5의 아미노산 서열을 코딩하는 것일 수 있다.

상기 피루베이트 옥시다제 (pyruvate oxidase, PoxB)는 피루베이트를 아세테이트로 전환시키는 것을 촉매하는 것일 수 있다. 상기 PoxB는 EC.1.2.5.1로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 PoxB는 예를 들면, 서열번호 6의 아미노산 서열을 가질 수 있다. poxB 유전자는 서열번호 6의 아미노산 서열을 코딩하는 것일 수 있다.

상기 포스포트란스아세틸라제 (phosphotransacetylase, PTA)는 아세틸-CoA를 아세틸 포스페이트로 전환시키는 것을 촉매하는 것일 수 있다. 상기 PTA는 EC.2.3.1.8로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 PTA는 예를 들면, 서열번호 7의 아미노산 서열을 가질 수 있다. pta 유전자는 서열번호 7의 아미노산 서열을 코딩하는 것일 수 있다.

상기 아세테이트 키나제 (acetate kinase, Ack)는 아세틸 포스페이트를 아세테이트로 전환시키는 것을 촉매하는 것일 수 있다. 상기 Ack는 EC.2.7.2.1로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 Ack는 예를 들면, 서열번호 8의 아미노산 서열을 가질 수 있다. ack 유전자는 서열번호 8의 아미노산 서열을 코딩하는 것일 수 있다.

아세테이트 CoA 트란스퍼라제 (acetate coenzyme A transferase, ActA)는 아세틸-CoA를 아세테이트로 전환시키는 것을 촉매하는 것일 수 있다. 상기 ActA는 EC.2.8.3.-으로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 ActA는 예를 들면, 서열번호 9의 아미노산 서열을 가질 수 있다. actA 유전자는 서열번호 9의 아미노산 서열을 코딩하는 것일 수 있다.

상기 박테리아 세포는 피루베이트를 옥살로아세테이트로 전환시키는 것을 촉매하는 피루베이트 카르복실라제 (pyruvate carboxylase, PYC) 활성이 증가된 것일 수 있다. "활성의 증가"에 대하여 상기한 바와 같다. 상기 활성의 증가는 예를 들면, 피루베이트 카르복실라제의 변이에 의하여 비활성이 증가된 피루베이트 카르복실라제를 코딩하는 유전자의 도입에 의하여 이루어질 수 있다. 상기 변이는 피루베이트 카르복실라제의 아미노산 서열의 치환, 부가, 결실 또는 그 조합을 포함할 수 있다. 상기 치환은 예를 들면, 서열번호 10의 458번째 프롤린의 세린으로의 치환 즉, P458S 치환일 수 있다. 상기 세포는 예를 들면, 무작위적인 돌연변이 또는 유전공학적인 조작을 통해 증가된 활성을 갖는 것일 수 있다. 피루베이트 카르복실라제는 서열번호 10 또는 서열번호 10의 458번째 프롤린의 세린으로 치환된 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 피루베이트 카르복실라제 유전자는 서열번호 10 (예를 들면, Ncgl0659) 또는 서열번호 10의 458번째 프롤린의 세린으로 치환된 서열을 코딩하는 것일 수 있다.

다른 양상은 상기한 박테리아 세포를 포함하는, 숙신산을 생산하는데 사용하기 위한 조성물을 제공한다.

다른 양상은 상기한 박테리아 세포를 숙신산을 생산하는데 사용하기 위한 용도를 제공한다.

다른 양상은 상기한 박테리아 세포를 배양하는 단계; 및 배양물로부터 유기산을 회수하는 단계를 포함하는 유기산을 생산하는 방법을 제공한다.

상기 배양은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 통상의 기술자라면 선택되는 미생물에 따라 배지 및 배양조건을 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 배양 방법은 예를 들면, 회분식, 연속식 및 유가식 배양을 포함할 수 있다. 상기 박테리아 세포는 상기한 바와 같다.

상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함할 수 있다.

상기 탄소원은, 예를 들면, 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토오스, 전분, 셀룰로오스와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리셀롤 및 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산, 및/또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 배양은 예를 들면, 글루코스를 탄소원으로 하여 수행될 수 있다. 상기 질소원은, 예를 들면, 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액 (CSL), 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원, 및/또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 배지는 인의 공급원으로서, 예를 들면, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 상응하는 소듐-함유 염, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 또한, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 배지에 포함될 수 있다. 상기 배지 또는 개별 성분은 배양액에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

또한, 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 미생물 배양액에 적절한 방식으로 첨가하여 배양액의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다.

상기 세포는 호기, 미호기, 또는 혐기 조건에서 배양될 수 있다. 상기 미호기 조건은 대기 중 산소의 수준보다 낮은 수준의 산소가 배지 중으로 용해되는 배양 조건을 의미한다. 상기 낮은 수준의 산소는 예를 들면, 대기에 대한 포화 용존 산소 농도의 0.1% 내지 10%, 1% 내지 9%, 2% 내지 8%, 3% 내지 7%, 또는 4 내지 6%일 수 있다. 또한, 미호기 조건은 예를 들면, 배지 중의 용존 산소 농도가 0.9 ppm에서 3.6 ppm인 것일 수 있다. 배양 온도는 예를 들면, 20℃ 내지 45℃ 또는 25℃ 내지 40℃일 수 있다. 배양 기간은 원하는 목적 숙신산이 원하는 만큼 얻어질 때까지 지속될 수 있다.

상기 유기산에 대하여는 전술한 바와 같다. 상기 유기산, 예를 들면 숙신산의 회수는 통상적으로 알려진 분리 및 정제방법을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 회수는 원심분리, 이온교환 크로마토그래피, 여과, 침전, 또는 그 조합에 의하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 배양물을 원심분리하여 바이오매스를 제거하고, 얻어진 상등액을 이온교환 크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있다.

일 양상에 따른 유전적으로 조작된 박테리아 세포에 의하면, 유기산 생산능이 높아 유기산 생산에 효과적으로 사용될 수 있다.

다른 양상에 따른 유기산을 생산하는 방법에 의하면, 유기산, 예를 들면 숙신산을 효과적으로 생산할 수 있다.

도 1은 pGS-EX4-glnDK 벡터의 개열지도를 나타낸다.
도 2는 pGS-EX4-glnD 벡터의 개열지도를 나타낸다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법:

달리 언급이 없는 한 아래 실시예에서는 아래의 재료 및 방법을 사용하였다.

1. 코리네박테리움 (Δ ldh ) 균주, S003 및 S006 균주의 제작

코리네박테리움 S003 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰 (C.glutamicum, CGL) ATCC 13032를 모균주로 하여, 락테이트 및 아세테이트 합성 경로를 제거한 재조합 균주로서 다음과 같이 제작하였다.

(1) 치환 벡터 ( replacement vector )의 제작

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 L-락테이트 데히드로게나제 (ldh), 피루베이트 옥시다제 (poxB), 포스포트란스아세틸라제 (pta), 아세테이트 키나제 (ackA), 및 아세테이트 CoA 트란스퍼라제 (actA) 유전자를 상동 재조합에 의하여 불활성화시켰다. 상기 유전자들을 불활성화시키기 위한 벡터로 pK19 mobsacB (ATCC 87098) 벡터를 사용하였으며, 재조합에 사용될 두 상동 부위는 주형으로 CGL ATCC 13032의 게놈 DNA를 사용한 PCR을 통한 증폭에 의하여 얻었다.

ldh 유전자를 제거하기 위한 두 상동 부위는 상기 유전자의 상류 (upstream) 및 하류 (downstream) 부위로서, ldhA_5'_HindIII (서열번호 11) 및 ldhA_up_3'_XhoI (서열번호 12)의 프라이머 세트와, ldhA_dn_5'_XhoI (서열번호 13) 및 ldhA_3'_EcoRI (서열번호 14)의 프라이머 세트를 사용한 PCR 증폭에 의해 얻었다. PCR 증폭은 95℃에서 30초간 변성, 55℃에서 30초간 어닐링, 및 72℃에서 30초간 신장단계를 30회 반복함으로써 수행하였다. 이하 모든 PCR 증폭은 이와 동일한 조건으로 수행하였다. 얻어진 증폭 산물을 pK19 mobsacB 벡터의 HindIII 및 EcoRI 제한효소 위치에 클로닝하여 pK19_Δldh 벡터를 제작하였다.

poxB 유전자를 제거하기 위한 두 상동 부위는 상기 유전자의 상류 및 하류 부위로서, poxB 5'_H3 (서열번호 15) 및 DpoxB_up 3' (서열번호 16)의 프라이머 세트와, DpoxB_dn 5' (서열번호 17) 및 poxB 3' E1 (서열번호 18)의 프라이머 세트를 사용한 PCR 증폭에 의해 얻었다. 얻어진 증폭 산물을 pK19 mobsacB 벡터의 HindIII 및 EcoRI 제한효소 위치에 클로닝하여 pK19_ΔpoxB 벡터를 제작하였다.

pta-ackA 유전자를 제거하기 위한 두 상동 부위는 상기 유전자의 상류 및 하류 부위로서, pta 5' H3 (서열번호 19) 및 Dpta_up_R1 3' (서열번호 20)의 프라이머 세트와, DackA_dn_R1 5' (서열번호 21) 및 ackA 3' Xb (서열번호 22)의 프라이머 세트를 사용한 PCR 증폭에 의해 얻었다. 얻어진 증폭 산물을 pK19 mobsacB 벡터의 HindIII 및 XbaI 제한효소 위치에 클로닝하여 pK19_Δpta_ackA 벡터를 제작하였다.

actA 유전자를 제거하기 위한 두 상동 부위는 상기 유전자의 상류 및 하류 부위로서, actA 5' Xb (서열번호 23) 및 DactA_up_R4 3' (서열번호 24)의 프라이머 세트와, DactA_dn_R4 5' (서열번호 25) 및 actA 3' H3 (서열번호 26)의 프라이머 세트를 사용한 PCR 증폭에 의해 얻었다. 얻어진 증폭 산물을 pK19 mobsacB 벡터의 XbaI 및 HindIII 제한효소 위치에 클로닝하여 pK19_ΔactA 벡터를 제작하였다.

C.glutamicum ATCC 13032의 피루베이트 카르복실라제 (서열번호 10)의 458번 프롤린이 세린으로 치환된 변이체 (이하 'PYC^P458S'라 함)를 제조하기 위하여, 중첩 연장 (overlap extension) PCR 방법에 의해 PYC 아미노산 서열 중 458번 프롤린을 코딩하는 코돈 CCG를 TCG로 치환하였다. C.glutamicum ATCC 13032의 게놈 DNA로부터, pyc-F1 (서열번호 27) 및 pyc-R1 (서열번호 28)의 프라이머 세트를 사용하여 PCR을 수행하여 PCR 산물을 얻고, pyc-F2 (서열번호 29) 및 pyc-R2 (서열번호 30)의 프라이머 세트를 사용한 PCR을 수행하여 PCR 산물을 얻었다. 얻어진 두 PCR 산물을 주형으로 pyc-F1 및 pyc-R2의 프라이머 세트를 사용한 PCR을 수행하여 PCR 산물을 얻었다. 최종적으로 얻어진 PCR 산물을 pK19mobsacB 벡터의 XbaI 제한 효소 위치로 클로닝하여 pK19mobsacB-pyc* 벡터를 제작하였다.

(2) CGL (Δ ldh ), CGL (Δ ldh , Δ poxB ,Δ pta - ackA ,Δ actA )[이하 ' S003 '이라 함] 및 CGL (Δ ldh , Δ poxB ,Δ pta - ackA ,Δ actA , pyc ^P458S )[이하 ' S006 '이라 함] 제조

C. glutamicum ATCC13032에 전기천공법 (electroporation)을 통해 상기의 pK19_Δldh 벡터, pK19_ΔpoxB, pK19_Δpta_ackA, pK19_ΔactA 벡터, 또는 pK19mobsacB-pyc* 벡터를 도입하였다. 도입된 균주를 25 ㎍/ml의 카나마이신을 함유한 LBHIS 아가 플레이트 (agar plate)에 도말하여 30℃에서 배양하였다. LBHIS 아가 플레이트는 Difco LB^TM broth 25 g/L, 뇌-심장 침출배지 (brain-heart infusion broth) 18.5 g/L, D-소르비톨(sorbitol) 91 g/L, 및 아가 15 g/L를 포함한다. 이하 LBHIS 배지의 조성은 이와 동일하다. 형성된 콜로니를 brain heart infusion powder 37 g/L 및 D-소르비톨 91 g/L를 포함하는 BHIS 배지 (pH 7.0)에서 30℃에서 배양한 후, 배양액을 LB/Suc10 아가 플레이트에 도말하고 30℃에서 배양하여 이중 교차가 일어난 것만을 선별하였다. LB/Suc10 아가 플레이트는 Difco LB^TM broth 25 g/L, 아가 15 g/L 및 수크로스 100 g/L를 포함한다.

선별된 콜로니로부터 게놈 DNA를 분리한 후, 상기 유전자들의 결손 여부를 확인하였다. ldh 유전자의 결손 확인을 위해 ldhA_5'_HindIII 및 ldhA_3'_EcoRI의 프라이머 세트를 사용하였고, poxB 유전자의 결손 확인을 위해 poxB_up_for (서열번호 31) 및 poxB_dn_rev (서열번호 32)의 프라이머 세트를 사용하여 PCR을 통해 유전자 결손 여부를 확인하였다. 또한, pta-ackA 유전자의 결손 확인을 위해 pta_up_for (서열번호 33) 및 ackA_dn_rev (서열번호 34)의 프라이머 세트를 사용하였고, actA 유전자의 결손 확인을 위해 actA_up_for (서열번호 35) 및 actA_dn_rev (서열번호 36)의 프라이머 세트를 각각 사용하여 PCR을 통해 유전자 결손 여부를 확인하였다. pyc 유전자의 변이를 확인하기 위하여, pyc-F1 및 pyc-R2의 프라이머 세트를 사용한 PCR을 수행하고, PCR 산물을 서열분석하여 pyc 유전자의 치환 여부를 확인하였다.

그 결과, CGL (Δldh), CGL (Δldh, ΔpoxB, Δpta-ackA, ΔactA) (이하 "S003"이라고도 함), 및 CGL (Δldh, ΔpoxB, Δpta-ackA, ΔactA, pyc^P458S) (이하 "S006"이라고도 함)를 얻었다.

2. GlnD 및 GlnK 과발현 벡터의 제작

GlnDK 유전자 또는 glnD 유전자가 pGS-EX4 벡터의 HindIII/EcoRI 부위에 도입되어, Ptuff 프로모터와 작동가능하게 연결된 벡터를 제작하였다.

(1) pGS - EX 벡터의 제작

코리네박테리움과 대장균에서 셔틀벡터로 쓰이는 pGT1 (서열번호 42)의 KpnI 위치에 tuf 유전자 (NCgl0480)의 프로모터 (Ptuf)를 클로닝하여 pGS-EX4 벡터를 얻었다. 이때 Ptuf 단편은 C.glutamicum ATCC 13032의 게놈 DNA를 주형으로 하고, Tuf-F (서열번호 37) 및 Tuf-R (서열번호 38)의 프라이머 세트를 사용하여 증폭되었으며, In-Fusion^® HD Cloning Kit (Clontech 639648)를 이용하여 pGT1에 클로닝되었다.

(2) pGS - EX4 - glnDK 벡터의 제작

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 glnDK 유전자를 서열번호 39와 서열번호 40의 프라이머 세트와 코리네박테리움 글루타미쿰 13032의 게놈을 주형으로 사용한 PCR을 통하여 증폭하였다. 상기 glnDK 유전자를 코리네박테리움 글루타미쿰의 tuf 프로모터 하에서 발현시키기 위하여, pGS-EX4 벡터의 HindIII 및 EcoRI 위치에 클로닝하여, pGS-EX4-glnDK 벡터를 얻었다 (도 1).

(3) pGS - EX4 - glnD 벡터의 제작

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 glnD 유전자를 서열번호 41과 서열번호 40의 프라이머 세트와 코리네박테리움 글루타미쿰 13032의 게놈을 주형으로 사용한 PCR을 통하여 증폭하였다. 상기 glnD 유전자를 코리네박테리움 글루타미쿰의 tuf 프로모터 하에서 발현시키기 위하여, pGS-EX4 벡터의 HindIII 및 EcoRI 위치에 클로닝하여, pGS-EX4-glnD 벡터를 얻었다 (도 2).

실시예 1: glnDK 과발현 또는 GlnD 과발현 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 특성 확인

본 실시예에서는 glnDK 또는 glnD를 과발현하는 균주를 제조하고, 그를 배양하고 그 배양물로부터 포도당 소비 속도 (glucose consumption rate)와 숙신산 생산량을 측정하여, 그 배양 특성을 확인하였다.

glnDK 또는 glnD를 과발현하는 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰 S006 균주에 pGS-EX4-glnDK 벡터 또는 pGS-EX4-glnD를 각각 형질전환시켜 코리네박테리움 글루타미쿰 S006 (+glnDK), 및 S006 (+glnD) 균주를 얻었다. 형질전환은 전기천공법 (1.25kV/cm,5ms)에 의하여 수행하였다. 대조군으로서, 코리네박테리움 글루타미쿰 S006에 빈 벡터인 pGS-EX4 벡터를 동일하게 형질전환하여 코리네박테리움 글루타미쿰 S006 (pGS-EX4) 균주를 얻었다.

종 배양 (seed culture)을 위해 상기 각 균주를 LB 배지 (5g/L의 효모 추출물, 10g/L의 NaCl, 10g/L 트립톤, 15 g/L의 아가) 플레이트에 도말 (streaking)한 후, 30℃에서 48 시간 동안 배양하였다. 단일 콜로니를 BHIS 배지 (뇌-심장 침출배지 37 g/L, D-소르비톨 91 g/L, pH 7.0) 5 ml에 접종하고 30℃에서 16시간 배양하였다.

얻어진 배양액 0.5 ml를 25 ml의 BHIS 배지가 들어있는 250 ml 플라스크에 접종하였다. OD₆₀₀ 값이 6.0이 될 때까지 배양한 후, 배양액을 원심분리하여 상등액을 버리고 미생물만 수거하여 CGXII 최소배지로 세척하였다. CGXII 배지는 (NH₄)₂SO₄ 20g/L, 우레아 5g/L, KH₂PO₄ 1g/L, K₂HPO₄ 1g/L, MgSO₄·7H₂O 0.25g/L, CaCl₂ 10mg/L, FeSO₄·7H₂O 10 mg/L, MnSO₄·H₂O 0.1mg/L, ZnSO₄·7H₂O 1mg/L, CuSO₄·5H₂O 0.2mg/L, NiCl₂·6H₂O 20mg/L, 비오틴 0.2mg/L, 3-모르폴리노프로판설폰산(MOPS) 42g/L 및 4%(w/v) 포도당을 포함한다. OD₆₀₀ 값이 30이 되도록 CGXII로 현탁한 세포를 1ml씩 1.5ml Eppendorf tube에 넣고 뚜껑을 꼭 닫아 30℃에서 24시간 배양하였다. 배양액을 원심분리하여 상등액에 들어있는 숙신산과 포도당의 농도를 HPLC를 이용하여 정량하였다.

S006 (+glnDK)와 S006 (+glnD)균주에 대한 포도당 소비 속도 (glucose consumption rate) 및 숙신산 생산량 측정 결과는 표 1에 나타낸 바와 같다.

균주	숙신산 생산		균주	포도당 소비
	양(g/l)	증가비(%)	균주	양(g/l)	증가비(%)
S006(+con)	3.89	0	S006(+con)	11.77	0
S006(+glnDK)	5.78	48.59	S006(+glnDK)	15.22	29.31
S006(+glnD)	5.19	33.41	S006(+glnD)	14.42	22.51

표 1에서, S006 (+con)는 S006 에 빈 벡터가 도입된 것을 나타낸다.

표 1에 나타낸 바와 같이, glnDK 또는 glnD가 과발현되는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에서 숙신산 생산 및 포도당 소비 속도가 현저히 증가하였다.

<110> Samsung Electronics Co., Ltd. <120> Genetically engineered bacterial cell having enhanced GlnD or GlnK and method of producing organic acid using the same <130> PN101625KR <160> 42 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 112 <212> PRT <213> Corynebacterium Glutamicum ATCC13032 <400> 1 Met Lys Leu Ile Thr Ala Ile Val Lys Pro Phe Thr Leu Thr Asp Ile 1 5 10 15 Lys Asp Ala Leu Glu Gln Ala Gly Val Gln Gly Met Thr Val Thr Glu 20 25 30 Thr Gln Gly Phe Gly Gln Gln Lys Gly His Thr Glu Val Tyr Arg Gly 35 40 45 Ala Glu Tyr Ala Val Asp Phe Val Pro Lys Val Lys Ile Glu Val Ile 50 55 60 Ile Ser Asp Ala Gln Ala Glu Glu Val Ile Asn Ile Ile Val Glu Thr 65 70 75 80 Ala Arg Thr Gly Lys Val Gly Asp Gly Lys Val Trp Met Thr Asn Ile 85 90 95 Glu Glu Leu Val Arg Val Arg Thr Gly Glu Arg Gly Glu Ala Ala Leu 100 105 110 <210> 2 <211> 692 <212> PRT <213> Corynebacterium Glutamicum ATCC13032 <400> 2 Met Asn Asn Pro Ala Gln Leu Arg Gln Asp Thr Glu Lys Glu Val Leu 1 5 10 15 Ala Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Pro Ala Gly Thr Ala Leu Ala Ala 20 25 30 Thr Gly Ser Leu Ala Arg Ser Glu Leu Thr Pro Tyr Ser Asp Leu Asp 35 40 45 Leu Ile Leu Ile His Pro Pro Gly Ala Thr Pro Asp Gly Val Glu Asp 50 55 60 Leu Trp Tyr Pro Ile Trp Asp Ala Lys Lys Arg Leu Asp Tyr Ser Val 65 70 75 80 Arg Thr Pro Asp Glu Cys Val Ala Met Ile Ser Ala Asp Ser Thr Ala 85 90 95 Ala Leu Ala Met Leu Asp Leu Arg Phe Val Ala Gly Asp Glu Asp Leu 100 105 110 Cys Ala Lys Thr Arg Arg Arg Ile Val Glu Lys Trp Arg Gln Glu Leu 115 120 125 Asn Lys Asn Phe Asp Ala Val Val Asp Thr Ala Ile Ala Arg Trp Arg 130 135 140 Arg Ser Gly Pro Val Val Ala Met Thr Arg Pro Asp Leu Lys His Gly 145 150 155 160 Arg Gly Gly Leu Arg Asp Phe Glu Leu Ile Lys Ala Leu Ala Leu Gly 165 170 175 His Leu Cys Asn Leu Pro Gln Leu Asp Ala Gln His Gln Leu Leu Leu 180 185 190 Asp Ala Arg Thr Leu Leu His Val His Ala Arg Arg Ser Arg Asp Val 195 200 205 Leu Asp Pro Glu Phe Ala Val Asp Val Ala Met Asp Leu Gly Phe Val 210 215 220 Asp Arg Tyr His Leu Gly Arg Glu Ile Ala Asp Ala Ala Arg Ala Ile 225 230 235 240 Asp Asp Gly Leu Thr Thr Ala Leu Ala Thr Ala Arg Gly Ile Leu Pro 245 250 255 Arg Arg Thr Gly Phe Ala Phe Arg Asn Ala Ser Arg Arg Pro Leu Asp 260 265 270 Leu Asp Val Val Asp Ala Asn Gly Thr Ile Glu Leu Ser Lys Lys Pro 275 280 285 Asp Leu Asn Asp Pro Ala Leu Pro Leu Arg Val Ala Ala Ala Ala Ala 290 295 300 Thr Thr Gly Leu Pro Val Ala Glu Ser Thr Trp Val Arg Leu Asn Glu 305 310 315 320 Cys Pro Pro Leu Pro Glu Pro Trp Pro Ala Asn Ala Ala Gly Asp Phe 325 330 335 Phe Arg Ile Leu Ser Ser Pro Lys Asn Ser Arg Arg Val Val Lys Asn 340 345 350 Met Asp Arg His Gly Leu Trp Ser Arg Phe Val Pro Glu Trp Asp Arg 355 360 365 Ile Lys Gly Leu Met Pro Arg Glu Pro Ser His Ile Ser Thr Ile Asp 370 375 380 Glu His Ser Leu Asn Thr Val Ala Gly Cys Ala Leu Glu Thr Val Thr 385 390 395 400 Val Ala Arg Pro Asp Leu Leu Val Leu Gly Ala Leu Tyr His Asp Ile 405 410 415 Gly Lys Gly Phe Pro Arg Pro His Glu Gln Val Gly Ala Glu Met Val 420 425 430 Ala Arg Ala Ala Ser Arg Met Gly Leu Asn Leu Arg Asp Arg Ala Ser 435 440 445 Val Gln Thr Leu Val Ala Glu His Thr Ala Val Ala Lys Ile Ala Ala 450 455 460 Arg Leu Asp Pro Ser Ser Glu Gly Ala Val Asp Lys Leu Leu Asp Ala 465 470 475 480 Val Arg Tyr Asp Leu Val Thr Leu Asn Leu Leu Glu Val Leu Thr Glu 485 490 495 Ala Asp Ala Lys Ala Thr Gly Pro Gly Val Trp Thr Ala Arg Leu Glu 500 505 510 His Ala Leu Arg Ile Val Cys Lys Arg Ala Arg Asp Arg Leu Thr Asp 515 520 525 Ile Arg Pro Val Ala Pro Met Ile Ala Pro Arg Ser Glu Ile Gly Leu 530 535 540 Val Glu Arg Asp Gly Val Phe Thr Val Gln Trp His Gly Glu Asp Leu 545 550 555 560 His Arg Ile Leu Gly Val Ile Tyr Ala Lys Gly Trp Thr Ile Thr Ala 565 570 575 Ala Arg Met Leu Ala Asn Gly Gln Trp Ser Ala Glu Phe Asp Val Arg 580 585 590 Ala Asn Gly Pro Gln Asp Phe Asp Pro Gln His Phe Leu Gln Ala Tyr 595 600 605 Gln Ser Gly Val Phe Ser Glu Val Pro Ile Pro Ala Leu Gly Ile Thr 610 615 620 Ala Thr Phe Trp His Gly Asn Thr Leu Glu Val Arg Thr Glu Leu Arg 625 630 635 640 Thr Gly Ala Ile Phe Ala Leu Leu Arg Thr Leu Pro Asp Ala Leu Trp 645 650 655 Ile Asn Ala Val Thr Arg Gly Ala Thr Leu Ile Ile Gln Ala Ala Leu 660 665 670 Lys Pro Gly Phe Asp Arg Ala Thr Val Glu Arg Ser Val Val Arg Ser 675 680 685 Leu Ala Gly Ser 690 <210> 3 <211> 339 <212> DNA <213> Corynebacterium Glutamicum ATCC13032 <400> 3 atgaaactca tcaccgcaat tgtcaagccg tttaccctca ccgacattaa agatgctctc 60 gagcaggcag gtgtgcaggg catgactgtc accgaaaccc aaggctttgg ccagcagaaa 120 ggccacaccg aggtgtaccg tggtgctgaa tacgctgtcg attttgtgcc taaggtcaag 180 attgaagtta ttatctccga tgctcaggct gaggaagtca tcaacattat cgtcgagacc 240 gcacgcaccg gcaaagtcgg cgacggcaaa gtgtggatga ctaacatcga agagctggtt 300 cgtgttcgta ccggtgagcg cggcgaagca gccctttaa 339 <210> 4 <211> 2079 <212> DNA <213> Corynebacterium Glutamicum ATCC13032 <400> 4 atgaataatc cagcccagct gcgccaagat actgaaaagg aagtcctggc gttgctgggc 60 tctttggttt tacccgccgg caccgcgctt gccgccaccg gatctttggc caggtccgaa 120 ctcacgccgt attccgattt ggacctcatt ttgatccatc caccaggagc caccccggat 180 ggcgtggagg atttgtggta cccgatttgg gacgcaaaaa agcgtctcga ctactccgtg 240 cgcaccccag atgagtgtgt ggctatgatt tctgcggatt ccactgcagc ccttgccatg 300 cttgacctgc ggtttgtcgc tggcgatgag gatctgtgtg ccaaaacgcg ccggcgcatc 360 gtggagaagt ggcgccagga actcaacaaa aacttcgatg ccgttgtgga caccgcgatt 420 gcccgttggc gccgctccgg acccgtcgtg gcaatgacgc ggccagatct taaacacggc 480 aggggagggc tgcgcgattt cgaactgatc aaggccctcg cgctcggcca cctatgcaac 540 cttccacagc ttgatgcgca acaccagctg cttctcgacg cccgcacctt gctgcacgtc 600 cacgcgcgac gctcccgcga cgtccttgac cccgaatttg cggtggatgt ggccatggat 660 ttgggctttg ttgaccgcta tcacctgggc cgggagatcg ccgatgcagc ccgcgccatt 720 gatgatggcc tgaccaccgc gctggccacc gcccgtggca ttttgccacg tcgcacaggt 780 tttgcattca ggaatgcttc tcgacgccca cttgatcttg atgtcgtcga cgccaacggc 840 accatcgaat tgtccaaaaa accagatctt aatgatcccg cacttccact tcgagtggcc 900 gcagccgcag caaccaccgg acttccggtg gcagaatcaa cctgggttcg acttaatgaa 960 tgcccgccac ttcctgagcc atggcctgcc aatgcagcag gggacttctt tcggattctc 1020 tccagtccga aaaactcacg ccgagtggtg aaaaatatgg atcgccacgg attgtggtcg 1080 cgttttgttc cagaatggga ccgcatcaaa gggcttatgc cccgtgaacc cagccatatt 1140 tccaccatcg atgaacatag tctgaacact gttgcaggat gtgcgctaga aactgtgacc 1200 gtcgcgcgcc ccgatctttt agttttggga gccttgtacc acgacattgg caagggcttc 1260 ccgcgtccac acgaacaagt aggtgcagag atggtggcga gggctgcaag ccgcatggga 1320 ttgaaccttc gcgatcgtgc cagcgtgcaa acgctggtcg ccgagcacac cgcggtggcc 1380 aaaatcgccg cgcgccttga tccctcctcg gagggcgccg tcgataagct gcttgatgct 1440 gttaggtatg acctggtgac attgaatctg cttgaggtgc taacagaagc tgatgcgaaa 1500 gccacggggc ctggcgtgtg gacggcgcgt ttggagcatg cgctgcggat tgtgtgcaag 1560 cgtgcgcgtg atcgcctcac cgatattcgc ccggttgcgc cgatgattgc gccacgtagt 1620 gaaattggtt tggtggaacg cgatggcgtg ttcacagtgc aatggcacgg cgaagactta 1680 catcggattc ttggcgtaat ttatgccaaa ggatggacaa tcaccgcggc gcgcatgctg 1740 gccaatggtc aatggagtgc ggaatttgat gtccgcgcaa acggccccca agattttgat 1800 ccgcagcatt tcctgcaggc atatcaatcc ggtgtgtttt ccgaggttcc cattccagca 1860 cttgggataa cagccacatt ttggcacggg aacactttag aagtgcgcac tgagcttcgc 1920 acaggagcta tttttgccct gctcagaaca ttgcccgatg ccctctggat caacgctgtg 1980 acccgcggtg cgaccctgat tatccaggca gcactgaagc ccggcttcga tcgagcaacg 2040 gtggaacgct ccgtagtcag gtcgttggca ggtagctga 2079 <210> 5 <211> 314 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032 <400> 5 Met Lys Glu Thr Val Gly Asn Lys Ile Val Leu Ile Gly Ala Gly Asp 1 5 10 15 Val Gly Val Ala Tyr Ala Tyr Ala Leu Ile Asn Gln Gly Met Ala Asp 20 25 30 His Leu Ala Ile Ile Asp Ile Asp Glu Lys Lys Leu Glu Gly Asn Val 35 40 45 Met Asp Leu Asn His Gly Val Val Trp Ala Asp Ser Arg Thr Arg Val 50 55 60 Thr Lys Gly Thr Tyr Ala Asp Cys Glu Asp Ala Ala Met Val Val Ile 65 70 75 80 Cys Ala Gly Ala Ala Gln Lys Pro Gly Glu Thr Arg Leu Gln Leu Val 85 90 95 Asp Lys Asn Val Lys Ile Met Lys Ser Ile Val Gly Asp Val Met Asp 100 105 110 Ser Gly Phe Asp Gly Ile Phe Leu Val Ala Ser Asn Pro Val Asp Ile 115 120 125 Leu Thr Tyr Ala Val Trp Lys Phe Ser Gly Leu Glu Trp Asn Arg Val 130 135 140 Ile Gly Ser Gly Thr Val Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg Tyr Met Leu 145 150 155 160 Gly Glu Leu Tyr Glu Val Ala Pro Ser Ser Val His Ala Tyr Ile Ile 165 170 175 Gly Glu His Gly Asp Thr Glu Leu Pro Val Leu Ser Ser Ala Thr Ile 180 185 190 Ala Gly Val Ser Leu Ser Arg Met Leu Asp Lys Asp Pro Glu Leu Glu 195 200 205 Gly Arg Leu Glu Lys Ile Phe Glu Asp Thr Arg Asp Ala Ala Tyr His 210 215 220 Ile Ile Asp Ala Lys Gly Ser Thr Ser Tyr Gly Ile Gly Met Gly Leu 225 230 235 240 Ala Arg Ile Thr Arg Ala Ile Leu Gln Asn Gln Asp Val Ala Val Pro 245 250 255 Val Ser Ala Leu Leu His Gly Glu Tyr Gly Glu Glu Asp Ile Tyr Ile 260 265 270 Gly Thr Pro Ala Val Val Asn Arg Arg Gly Ile Arg Arg Val Val Glu 275 280 285 Leu Glu Ile Thr Asp His Glu Met Glu Arg Phe Lys His Ser Ala Asn 290 295 300 Thr Leu Arg Glu Ile Gln Lys Gln Phe Phe 305 310 <210> 6 <211> 579 <212> PRT <213> Corynebacterium Glutamicum ATCC13032 <400> 6 Met Ala His Ser Tyr Ala Glu Gln Leu Ile Asp Thr Leu Glu Ala Gln 1 5 10 15 Gly Val Lys Arg Ile Tyr Gly Leu Val Gly Asp Ser Leu Asn Pro Ile 20 25 30 Val Asp Ala Val Arg Gln Ser Asp Ile Glu Trp Val His Val Arg Asn 35 40 45 Glu Glu Ala Ala Ala Phe Ala Ala Gly Ala Glu Ser Leu Ile Thr Gly 50 55 60 Glu Leu Ala Val Cys Ala Ala Ser Cys Gly Pro Gly Asn Thr His Leu 65 70 75 80 Ile Gln Gly Leu Tyr Asp Ser His Arg Asn Gly Ala Lys Val Leu Ala 85 90 95 Ile Ala Ser His Ile Pro Ser Ala Gln Ile Gly Ser Thr Phe Phe Gln 100 105 110 Glu Thr His Pro Glu Ile Leu Phe Lys Glu Cys Ser Gly Tyr Cys Glu 115 120 125 Met Val Asn Gly Gly Glu Gln Gly Glu Arg Ile Leu His His Ala Ile 130 135 140 Gln Ser Thr Met Ala Gly Lys Gly Val Ser Val Val Val Ile Pro Gly 145 150 155 160 Asp Ile Ala Lys Glu Asp Ala Gly Asp Gly Thr Tyr Ser Asn Ser Thr 165 170 175 Ile Ser Ser Gly Thr Pro Val Val Phe Pro Asp Pro Thr Glu Ala Ala 180 185 190 Ala Leu Val Glu Ala Ile Asn Asn Ala Lys Ser Val Thr Leu Phe Cys 195 200 205 Gly Ala Gly Val Lys Asn Ala Arg Ala Gln Val Leu Glu Leu Ala Glu 210 215 220 Lys Ile Lys Ser Pro Ile Gly His Ala Leu Gly Gly Lys Gln Tyr Ile 225 230 235 240 Gln His Glu Asn Pro Phe Glu Val Gly Met Ser Gly Leu Leu Gly Tyr 245 250 255 Gly Ala Cys Val Asp Ala Ser Asn Glu Ala Asp Leu Leu Ile Leu Leu 260 265 270 Gly Thr Asp Phe Pro Tyr Ser Asp Phe Leu Pro Lys Asp Asn Val Ala 275 280 285 Gln Val Asp Ile Asn Gly Ala His Ile Gly Arg Arg Thr Thr Val Lys 290 295 300 Tyr Pro Val Thr Gly Asp Val Ala Ala Thr Ile Glu Asn Ile Leu Pro 305 310 315 320 His Val Lys Glu Lys Thr Asp Arg Ser Phe Leu Asp Arg Met Leu Lys 325 330 335 Ala His Glu Arg Lys Leu Ser Ser Val Val Glu Thr Tyr Thr His Asn 340 345 350 Val Glu Lys His Val Pro Ile His Pro Glu Tyr Val Ala Ser Ile Leu 355 360 365 Asn Glu Leu Ala Asp Lys Asp Ala Val Phe Thr Val Asp Thr Gly Met 370 375 380 Cys Asn Val Trp His Ala Arg Tyr Ile Glu Asn Pro Glu Gly Thr Arg 385 390 395 400 Asp Phe Val Gly Ser Phe Arg His Gly Thr Met Ala Asn Ala Leu Pro 405 410 415 His Ala Ile Gly Ala Gln Ser Val Asp Arg Asn Arg Gln Val Ile Ala 420 425 430 Met Cys Gly Asp Gly Gly Leu Gly Met Leu Leu Gly Glu Leu Leu Thr 435 440 445 Val Lys Leu His Gln Leu Pro Leu Lys Ala Val Val Phe Asn Asn Ser 450 455 460 Ser Leu Gly Met Val Lys Leu Glu Met Leu Val Glu Gly Gln Pro Glu 465 470 475 480 Phe Gly Thr Asp His Glu Glu Val Asn Phe Ala Glu Ile Ala Ala Ala 485 490 495 Ala Gly Ile Lys Ser Val Arg Ile Thr Asp Pro Lys Lys Val Arg Glu 500 505 510 Gln Leu Ala Glu Ala Leu Ala Tyr Pro Gly Pro Val Leu Ile Asp Ile 515 520 525 Val Thr Asp Pro Asn Ala Leu Ser Ile Pro Pro Thr Ile Thr Trp Glu 530 535 540 Gln Val Met Gly Phe Ser Lys Ala Ala Thr Arg Thr Val Phe Gly Gly 545 550 555 560 Gly Val Gly Ala Met Ile Asp Leu Ala Arg Ser Asn Ile Arg Asn Ile 565 570 575 Pro Thr Pro <210> 7 <211> 461 <212> PRT <213> Corynebacterium Glutamicum ATCC13032 <400> 7 Met Ser Asp Thr Pro Thr Ser Ala Leu Ile Thr Thr Val Asn Arg Ser 1 5 10 15 Phe Asp Gly Phe Asp Leu Glu Glu Val Ala Ala Asp Leu Gly Val Arg 20 25 30 Leu Thr Tyr Leu Pro Asp Glu Glu Leu Glu Val Ser Lys Val Leu Ala 35 40 45 Ala Asp Leu Leu Ala Glu Gly Pro Ala Leu Ile Ile Gly Val Gly Asn 50 55 60 Thr Phe Phe Asp Ala Gln Val Ala Ala Ala Leu Gly Val Pro Val Leu 65 70 75 80 Leu Leu Val Asp Lys Gln Gly Lys His Val Ala Leu Ala Arg Thr Gln 85 90 95 Val Asn Asn Ala Gly Ala Val Val Ala Ala Ala Phe Thr Ala Glu Gln 100 105 110 Glu Pro Met Pro Asp Lys Leu Arg Lys Ala Val Arg Asn His Ser Asn 115 120 125 Leu Glu Pro Val Met Ser Ala Glu Leu Phe Glu Asn Trp Leu Leu Lys 130 135 140 Arg Ala Arg Ala Glu His Ser His Ile Val Leu Pro Glu Gly Asp Asp 145 150 155 160 Asp Arg Ile Leu Met Ala Ala His Gln Leu Leu Asp Gln Asp Ile Cys 165 170 175 Asp Ile Thr Ile Leu Gly Asp Pro Val Lys Ile Lys Glu Arg Ala Thr 180 185 190 Glu Leu Gly Leu His Leu Asn Thr Ala Tyr Leu Val Asn Pro Leu Thr 195 200 205 Asp Pro Arg Leu Glu Glu Phe Ala Glu Gln Phe Ala Glu Leu Arg Lys 210 215 220 Ser Lys Ser Val Thr Ile Asp Glu Ala Arg Glu Ile Met Lys Asp Ile 225 230 235 240 Ser Tyr Phe Gly Thr Met Met Val His Asn Gly Asp Ala Asp Gly Met 245 250 255 Val Ser Gly Ala Ala Asn Thr Thr Ala His Thr Ile Lys Pro Ser Phe 260 265 270 Gln Ile Ile Lys Thr Val Pro Glu Ala Ser Val Val Ser Ser Ile Phe 275 280 285 Leu Met Val Leu Arg Gly Arg Leu Trp Ala Phe Gly Asp Cys Ala Val 290 295 300 Asn Pro Asn Pro Thr Ala Glu Gln Leu Gly Glu Ile Ala Val Val Ser 305 310 315 320 Ala Lys Thr Ala Ala Gln Phe Gly Ile Asp Pro Arg Val Ala Ile Leu 325 330 335 Ser Tyr Ser Thr Gly Asn Ser Gly Gly Gly Ser Asp Val Asp Arg Ala 340 345 350 Ile Asp Ala Leu Ala Glu Ala Arg Arg Leu Asn Pro Glu Leu Cys Val 355 360 365 Asp Gly Pro Leu Gln Phe Asp Ala Ala Val Asp Pro Gly Val Ala Arg 370 375 380 Lys Lys Met Pro Asp Ser Asp Val Ala Gly Gln Ala Asn Val Phe Ile 385 390 395 400 Phe Pro Asp Leu Glu Ala Gly Asn Ile Gly Tyr Lys Thr Ala Gln Arg 405 410 415 Thr Gly His Ala Leu Ala Val Gly Pro Ile Leu Gln Gly Leu Asn Lys 420 425 430 Pro Val Asn Asp Leu Ser Arg Gly Ala Thr Val Pro Asp Ile Val Asn 435 440 445 Thr Val Ala Ile Thr Ala Ile Gln Ala Gly Gly Arg Ser 450 455 460 <210> 8 <211> 397 <212> PRT <213> Corynebacterium Glutamicum ATCC13032 <400> 8 Met Ala Leu Ala Leu Val Leu Asn Ser Gly Ser Ser Ser Ile Lys Phe 1 5 10 15 Gln Leu Val Asn Pro Glu Asn Ser Ala Ile Asp Glu Pro Tyr Val Ser 20 25 30 Gly Leu Val Glu Gln Ile Gly Glu Pro Asn Gly Arg Ile Val Leu Lys 35 40 45 Ile Glu Gly Glu Lys Tyr Thr Leu Glu Thr Pro Ile Ala Asp His Ser 50 55 60 Glu Gly Leu Asn Leu Ala Phe Asp Leu Met Asp Gln His Asn Cys Gly 65 70 75 80 Pro Ser Gln Leu Glu Ile Thr Ala Val Gly His Arg Val Val His Gly 85 90 95 Gly Ile Leu Phe Ser Ala Pro Glu Leu Ile Thr Asp Glu Ile Val Glu 100 105 110 Met Ile Arg Asp Leu Ile Pro Leu Ala Pro Leu His Asn Pro Ala Asn 115 120 125 Val Asp Gly Ile Asp Val Ala Arg Lys Ile Leu Pro Asp Val Pro His 130 135 140 Val Ala Val Phe Asp Thr Gly Phe Phe His Ser Leu Pro Pro Ala Ala 145 150 155 160 Ala Leu Tyr Ala Ile Asn Lys Asp Val Ala Ala Glu His Gly Ile Arg 165 170 175 Arg Tyr Gly Phe His Gly Thr Ser His Glu Phe Val Ser Lys Arg Val 180 185 190 Val Glu Ile Leu Glu Lys Pro Thr Glu Asp Ile Asn Thr Ile Thr Phe 195 200 205 His Leu Gly Asn Gly Ala Ser Met Ala Ala Val Gln Gly Gly Arg Ala 210 215 220 Val Asp Thr Ser Met Gly Met Thr Pro Leu Ala Gly Leu Val Met Gly 225 230 235 240 Thr Arg Ser Gly Asp Ile Asp Pro Gly Ile Val Phe His Leu Ser Arg 245 250 255 Thr Ala Gly Met Ser Ile Asp Glu Ile Asp Asn Leu Leu Asn Lys Lys 260 265 270 Ser Gly Val Lys Gly Leu Ser Gly Val Asn Asp Phe Arg Glu Leu Arg 275 280 285 Glu Met Ile Asp Asn Asn Asp Gln Asp Ala Trp Ser Ala Tyr Asn Ile 290 295 300 Tyr Ile His Gln Leu Arg Arg Tyr Leu Gly Ser Tyr Met Val Ala Leu 305 310 315 320 Gly Arg Val Asp Thr Ile Val Phe Thr Ala Gly Val Gly Glu Asn Ala 325 330 335 Gln Phe Val Arg Glu Asp Ala Leu Ala Gly Leu Glu Met Tyr Gly Ile 340 345 350 Glu Ile Asp Pro Glu Arg Asn Ala Leu Pro Asn Asp Gly Pro Arg Leu 355 360 365 Ile Ser Thr Asp Ala Ser Lys Val Lys Val Phe Val Ile Pro Thr Asn 370 375 380 Glu Glu Leu Ala Ile Ala Arg Tyr Ala Val Lys Phe Ala 385 390 395 <210> 9 <211> 502 <212> PRT <213> Corynebacterium Glutamicum ATCC13032 <400> 9 Met Ser Asp Arg Ile Ala Ser Glu Lys Leu Arg Ser Lys Leu Met Ser 1 5 10 15 Ala Asp Glu Ala Ala Gln Phe Val Asn His Gly Asp Lys Val Gly Phe 20 25 30 Ser Gly Phe Thr Gly Ala Gly Tyr Pro Lys Ala Leu Pro Thr Ala Ile 35 40 45 Ala Asn Arg Ala Lys Glu Ala His Gly Ala Gly Asn Asp Tyr Ala Ile 50 55 60 Asp Leu Phe Thr Gly Ala Ser Thr Ala Pro Asp Cys Asp Gly Val Leu 65 70 75 80 Ala Glu Ala Asp Ala Ile Arg Trp Arg Met Pro Tyr Ala Ser Asp Pro 85 90 95 Ile Met Arg Asn Lys Ile Asn Ser Gly Ser Met Gly Tyr Ser Asp Ile 100 105 110 His Leu Ser His Ser Gly Gln Gln Val Glu Glu Gly Phe Phe Gly Gln 115 120 125 Leu Asn Val Ala Val Ile Glu Ile Thr Arg Ile Thr Glu Glu Gly Tyr 130 135 140 Ile Ile Pro Ser Ser Ser Val Gly Asn Asn Val Glu Trp Leu Asn Ala 145 150 155 160 Ala Glu Lys Val Ile Leu Glu Val Asn Ser Trp Gln Ser Glu Asp Leu 165 170 175 Glu Gly Met His Asp Ile Trp Ser Val Pro Ala Leu Pro Asn Arg Ile 180 185 190 Ala Val Pro Ile Asn Lys Pro Gly Asp Arg Ile Gly Lys Thr Tyr Ile 195 200 205 Glu Phe Asp Thr Asp Lys Val Val Ala Val Val Glu Thr Asn Thr Ala 210 215 220 Asp Arg Asn Ala Pro Phe Lys Pro Val Asp Asp Ile Ser Lys Lys Ile 225 230 235 240 Ala Gly Asn Phe Leu Asp Phe Leu Glu Ser Glu Val Ala Ala Gly Arg 245 250 255 Leu Ser Tyr Asp Gly Tyr Ile Met Gln Ser Gly Val Gly Asn Val Pro 260 265 270 Asn Ala Val Met Ala Gly Leu Leu Glu Ser Lys Phe Glu Asn Ile Gln 275 280 285 Ala Tyr Thr Glu Val Ile Gln Asp Gly Met Val Asp Leu Ile Asp Ala 290 295 300 Gly Lys Met Thr Val Ala Ser Ala Thr Ser Phe Ser Leu Ser Pro Glu 305 310 315 320 Tyr Ala Glu Lys Met Asn Asn Glu Ala Lys Arg Tyr Arg Glu Ser Ile 325 330 335 Ile Leu Arg Pro Gln Gln Ile Ser Asn His Pro Glu Val Ile Arg Arg 340 345 350 Val Gly Leu Ile Ala Thr Asn Gly Leu Ile Glu Ala Asp Ile Tyr Gly 355 360 365 Asn Val Asn Ser Thr Asn Val Ser Gly Ser Arg Val Met Asn Gly Ile 370 375 380 Gly Gly Ser Gly Asp Phe Thr Arg Asn Gly Tyr Ile Ser Ser Phe Ile 385 390 395 400 Thr Pro Ser Glu Ala Lys Gly Gly Ala Ile Ser Ala Ile Val Pro Phe 405 410 415 Ala Ser His Ile Asp His Thr Glu His Asp Val Met Val Val Ile Ser 420 425 430 Glu Tyr Gly Tyr Ala Asp Leu Arg Gly Leu Ala Pro Arg Glu Arg Val 435 440 445 Ala Lys Met Ile Gly Leu Ala His Pro Asp Tyr Arg Pro Leu Leu Glu 450 455 460 Glu Tyr Tyr Ala Arg Ala Thr Ser Gly Asp Asn Lys Tyr Met Gln Thr 465 470 475 480 Pro His Asp Leu Ala Thr Ala Phe Asp Phe His Ile Asn Leu Ala Lys 485 490 495 Asn Gly Ser Met Lys Ala 500 <210> 10 <211> 1140 <212> PRT <213> Corynebacterium Glutamicum ATCC13032 <400> 10 Val Ser Thr His Thr Ser Ser Thr Leu Pro Ala Phe Lys Lys Ile Leu 1 5 10 15 Val Ala Asn Arg Gly Glu Ile Ala Val Arg Ala Phe Arg Ala Ala Leu 20 25 30 Glu Thr Gly Ala Ala Thr Val Ala Ile Tyr Pro Arg Glu Asp Arg Gly 35 40 45 Ser Phe His Arg Ser Phe Ala Ser Glu Ala Val Arg Ile Gly Thr Glu 50 55 60 Gly Ser Pro Val Lys Ala Tyr Leu Asp Ile Asp Glu Ile Ile Gly Ala 65 70 75 80 Ala Lys Lys Val Lys Ala Asp Ala Ile Tyr Pro Gly Tyr Gly Phe Leu 85 90 95 Ser Glu Asn Ala Gln Leu Ala Arg Glu Cys Ala Glu Asn Gly Ile Thr 100 105 110 Phe Ile Gly Pro Thr Pro Glu Val Leu Asp Leu Thr Gly Asp Lys Ser 115 120 125 Arg Ala Val Thr Ala Ala Lys Lys Ala Gly Leu Pro Val Leu Ala Glu 130 135 140 Ser Thr Pro Ser Lys Asn Ile Asp Glu Ile Val Lys Ser Ala Glu Gly 145 150 155 160 Gln Thr Tyr Pro Ile Phe Val Lys Ala Val Ala Gly Gly Gly Gly Arg 165 170 175 Gly Met Arg Phe Val Ala Ser Pro Asp Glu Leu Arg Lys Leu Ala Thr 180 185 190 Glu Ala Ser Arg Glu Ala Glu Ala Ala Phe Gly Asp Gly Ala Val Tyr 195 200 205 Val Glu Arg Ala Val Ile Asn Pro Gln His Ile Glu Val Gln Ile Leu 210 215 220 Gly Asp His Thr Gly Glu Val Val His Leu Tyr Glu Arg Asp Cys Ser 225 230 235 240 Leu Gln Arg Arg His Gln Lys Val Val Glu Ile Ala Pro Ala Gln His 245 250 255 Leu Asp Pro Glu Leu Arg Asp Arg Ile Cys Ala Asp Ala Val Lys Phe 260 265 270 Cys Arg Ser Ile Gly Tyr Gln Gly Ala Gly Thr Val Glu Phe Leu Val 275 280 285 Asp Glu Lys Gly Asn His Val Phe Ile Glu Met Asn Pro Arg Ile Gln 290 295 300 Val Glu His Thr Val Thr Glu Glu Val Thr Glu Val Asp Leu Val Lys 305 310 315 320 Ala Gln Met Arg Leu Ala Ala Gly Ala Thr Leu Lys Glu Leu Gly Leu 325 330 335 Thr Gln Asp Lys Ile Lys Thr His Gly Ala Ala Leu Gln Cys Arg Ile 340 345 350 Thr Thr Glu Asp Pro Asn Asn Gly Phe Arg Pro Asp Thr Gly Thr Ile 355 360 365 Thr Ala Tyr Arg Ser Pro Gly Gly Ala Gly Val Arg Leu Asp Gly Ala 370 375 380 Ala Gln Leu Gly Gly Glu Ile Thr Ala His Phe Asp Ser Met Leu Val 385 390 395 400 Lys Met Thr Cys Arg Gly Ser Asp Phe Glu Thr Ala Val Ala Arg Ala 405 410 415 Gln Arg Ala Leu Ala Glu Phe Thr Val Ser Gly Val Ala Thr Asn Ile 420 425 430 Gly Phe Leu Arg Ala Leu Leu Arg Glu Glu Asp Phe Thr Ser Lys Arg 435 440 445 Ile Ala Thr Gly Phe Ile Ala Asp His Pro His Leu Leu Gln Ala Pro 450 455 460 Pro Ala Asp Asp Glu Gln Gly Arg Ile Leu Asp Tyr Leu Ala Asp Val 465 470 475 480 Thr Val Asn Lys Pro His Gly Val Arg Pro Lys Asp Val Ala Ala Pro 485 490 495 Ile Asp Lys Leu Pro Asn Ile Lys Asp Leu Pro Leu Pro Arg Gly Ser 500 505 510 Arg Asp Arg Leu Lys Gln Leu Gly Pro Ala Ala Phe Ala Arg Asp Leu 515 520 525 Arg Glu Gln Asp Ala Leu Ala Val Thr Asp Thr Thr Phe Arg Asp Ala 530 535 540 His Gln Ser Leu Leu Ala Thr Arg Val Arg Ser Phe Ala Leu Lys Pro 545 550 555 560 Ala Ala Glu Ala Val Ala Lys Leu Thr Pro Glu Leu Leu Ser Val Glu 565 570 575 Ala Trp Gly Gly Ala Thr Tyr Asp Val Ala Met Arg Phe Leu Phe Glu 580 585 590 Asp Pro Trp Asp Arg Leu Asp Glu Leu Arg Glu Ala Met Pro Asn Val 595 600 605 Asn Ile Gln Met Leu Leu Arg Gly Arg Asn Thr Val Gly Tyr Thr Pro 610 615 620 Tyr Pro Asp Ser Val Cys Arg Ala Phe Val Lys Glu Ala Ala Ser Ser 625 630 635 640 Gly Val Asp Ile Phe Arg Ile Phe Asp Ala Leu Asn Asp Val Ser Gln 645 650 655 Met Arg Pro Ala Ile Asp Ala Val Leu Glu Thr Asn Thr Ala Val Ala 660 665 670 Glu Val Ala Met Ala Tyr Ser Gly Asp Leu Ser Asp Pro Asn Glu Lys 675 680 685 Leu Tyr Thr Leu Asp Tyr Tyr Leu Lys Met Ala Glu Glu Ile Val Lys 690 695 700 Ser Gly Ala His Ile Leu Ala Ile Lys Asp Met Ala Gly Leu Leu Arg 705 710 715 720 Pro Ala Ala Val Thr Lys Leu Val Thr Ala Leu Arg Arg Glu Phe Asp 725 730 735 Leu Pro Val His Val His Thr His Asp Thr Ala Gly Gly Gln Leu Ala 740 745 750 Thr Tyr Phe Ala Ala Ala Gln Ala Gly Ala Asp Ala Val Asp Gly Ala 755 760 765 Ser Ala Pro Leu Ser Gly Thr Thr Ser Gln Pro Ser Leu Ser Ala Ile 770 775 780 Val Ala Ala Phe Ala His Thr Arg Arg Asp Thr Gly Leu Ser Leu Glu 785 790 795 800 Ala Val Ser Asp Leu Glu Pro Tyr Trp Glu Ala Val Arg Gly Leu Tyr 805 810 815 Leu Pro Phe Glu Ser Gly Thr Pro Gly Pro Thr Gly Arg Val Tyr Arg 820 825 830 His Glu Ile Pro Gly Gly Gln Leu Ser Asn Leu Arg Ala Gln Ala Thr 835 840 845 Ala Leu Gly Leu Ala Asp Arg Phe Glu Leu Ile Glu Asp Asn Tyr Ala 850 855 860 Ala Val Asn Glu Met Leu Gly Arg Pro Thr Lys Val Thr Pro Ser Ser 865 870 875 880 Lys Val Val Gly Asp Leu Ala Leu His Leu Val Gly Ala Gly Val Asp 885 890 895 Pro Ala Asp Phe Ala Ala Asp Pro Gln Lys Tyr Asp Ile Pro Asp Ser 900 905 910 Val Ile Ala Phe Leu Arg Gly Glu Leu Gly Asn Pro Pro Gly Gly Trp 915 920 925 Pro Glu Pro Leu Arg Thr Arg Ala Leu Glu Gly Arg Ser Glu Gly Lys 930 935 940 Ala Pro Leu Thr Glu Val Pro Glu Glu Glu Gln Ala His Leu Asp Ala 945 950 955 960 Asp Asp Ser Lys Glu Arg Arg Asn Ser Leu Asn Arg Leu Leu Phe Pro 965 970 975 Lys Pro Thr Glu Glu Phe Leu Glu His Arg Arg Arg Phe Gly Asn Thr 980 985 990 Ser Ala Leu Asp Asp Arg Glu Phe Phe Tyr Gly Leu Val Glu Gly Arg 995 1000 1005 Glu Thr Leu Ile Arg Leu Pro Asp Val Arg Thr Pro Leu Leu Val Arg 1010 1015 1020 Leu Asp Ala Ile Ser Glu Pro Asp Asp Lys Gly Met Arg Asn Val Val 1025 1030 1035 1040 Ala Asn Val Asn Gly Gln Ile Arg Pro Met Arg Val Arg Asp Arg Ser 1045 1050 1055 Val Glu Ser Val Thr Ala Thr Ala Glu Lys Ala Asp Ser Ser Asn Lys 1060 1065 1070 Gly His Val Ala Ala Pro Phe Ala Gly Val Val Thr Val Thr Val Ala 1075 1080 1085 Glu Gly Asp Glu Val Lys Ala Gly Asp Ala Val Ala Ile Ile Glu Ala 1090 1095 1100 Met Lys Met Glu Ala Thr Ile Thr Ala Ser Val Asp Gly Lys Ile Asp 1105 1110 1115 1120 Arg Val Val Val Pro Ala Ala Thr Lys Val Glu Gly Gly Asp Leu Ile 1125 1130 1135 Val Val Val Ser 1140 <210> 11 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer ldhA_5_HindIII <400> 11 ttttaagctt cgtcattgtt gccgaaaccg tggtg 35 <210> 12 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer ldhA_up_3_XhoI <400> 12 taggcgccaa agattctcga gtttcgatcc cacttcctga tttccc 46 <210> 13 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer ldhA_dn_5_XhoI <400> 13 ggaagtggga tcgaaactcg agaatctttg gcgcctagtt ggcgacgc 48 <210> 14 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer ldhA_3_EcoRI <400> 14 ttttgaattc ctcatcggca tcttcgaagg catcg 35 <210> 15 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer poxB 5_H3 <400> 15 catgattacg ccaagctttc agcgtgggtc gggttctttg ag 42 <210> 16 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer DpoxB_up 3 <400> 16 aatcatcatc tgaactcctc aacgttatgg ct 32 <210> 17 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer DpoxB_dn 5 <400> 17 ggagttcaga tgatgattga tacacctgct gttctca 37 <210> 18 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer poxB 3 E1 <400> 18 acgacggcca gtgaattcat gtcccgaatc cacttcaatc agag 44 <210> 19 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer pta 5 H3 <400> 19 catgattacg ccaagcttcc ctccatgata cgtggtaagt gcag 44 <210> 20 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Dpta_up_R1 3 <400> 20 gttccctgtt aatgtaacca gctgaggtcg gtgtgtcaga cat 43 <210> 21 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer DackA_dn_R1 5 <400> 21 ttacattaac agggaaccgg aagagttagc tatcgctagg tacgcggt 48 <210> 22 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer ackA 3 Xb <400> 22 acccggggat cctctagagg gctgatgtga tttctgcggg 40 <210> 23 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer actA 5 Xb <400> 23 ggtggcggcc gctctagagg tctgagcttt attcctgggc t 41 <210> 24 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer DactA_up_R4 3 <400> 24 tctggataga agcatctaag ccagcgccgg tgaagc 36 <210> 25 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer DactA_dn_R4 5 <400> 25 agatgcttct atccagagct ccggtgacaa caagtacatg cagacc 46 <210> 26 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer actA 3 H3 <400> 26 gacggtatcg ataagcttcg tacgatgctt gagcggtat 39 <210> 27 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer pyc-F1 <400> 27 catgattacg ccaagcttga ttactgaagc agcacgtcag ctgg 44 <210> 28 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer pyc-R1 <400> 28 gagcaggtgg gagtggtctg caatgaatcc ggtggc 36 <210> 29 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer pyc-F2 <400> 29 agaccactcc cacctgctcc aggctccacc tgct 34 <210> 30 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer pyc-R2 <400> 30 acgacggcca gtgaattcca ccggtgagat caagaacctc tg 42 <210> 31 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer poxB_up_for <400> 31 ggctgaaacc aaaccagac 19 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer poxB_dn_rev <400> 32 ctgcatgatc ggttagatac ag 22 <210> 33 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer pta_up_for <400> 33 gcgtggaatt gagatcgg 18 <210> 34 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer ackA_dn_rev <400> 34 cagagcgatt tgtggtgg 18 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer actA_up_for <400> 35 tgaagcaatg gtgtgaactg 20 <210> 36 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer actA_dn_rev <400> 36 gctaccaaac actagcctg 19 <210> 37 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Tuf-F <400> 37 tagggcgaat tgggtacaca gtaggcgcgt ag 32 <210> 38 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Tuf-R <400> 38 cgaggggggc ccggtaccgg ttgtcctcct tt 32 <210> 39 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for glnDK amplification <400> 39 ttttaagctt tctttttgaa ggagacgatc atg 33 <210> 40 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for glnDK amplification <400> 40 ttttgaattc agctacctgc caacgacc 28 <210> 41 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for glnD amplification <400> 41 ttttaagctt aaaggaggac aaccatgaat aatccagccc agctg 45 <210> 42 <211> 5342 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pGT1 vector nucleotide sequence <400> 42 ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc 60 agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt 120 cagcagagcg cagataccaa atactgttct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt 180 caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc 240 tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa 300 ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac 360 ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg 420 gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga 480 gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact 540 tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgcccctct 600 tcgctattac gccagctggc gaaaggggga tgtgctgcaa ggcgattaag ttgggtaacg 660 ccagggtttt cccagtcacg acgttgtaaa acgacggcca gtgaattgta atacgactca 720 ctatagggcg aattgggtac cgggcccccc ctcgaggtcg acggtatcga taagcttgat 780 atcgaattcc tgcagcccgg gggatccact agttctagag cggccgccac cgcggtggag 840 ctcatttagc ggatgattct cgttcaactt cggccgaagc cacttcgtct gtcataatga 900 cagggatggt ttcggccgtt tttgcaaata aaacgaaagg ctcagtcgaa agactgggcc 960 tttcgtttta tctgttgttt gtcggtgaac gctctcctga gtaggacaaa tccgccggga 1020 gcggatttga acgttgcgaa gcaacggccc ggagggtggc gggcaggacg cccgccataa 1080 actgccaggc atcaaattaa gcagaaggcc atcctgacgg atggcctttt tgcgtttcta 1140 caaactcttc ctgtcgtcat atctacaagc catcccccca cagatacggt agctccagct 1200 tttgttccct ttagtgaggg ttaatttcga gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc 1260 ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt 1320 gtaaagcctg ggaacaacaa gacccatcat agtttgcccc cgcgacattg accataaatt 1380 catcgcacaa aatatcgaac ggggtttatg ccgcttttag tgggtgcgaa gaatagtctg 1440 ctcattaccc gcgaacaccg ccgcattcag atcacgctta gtagcgtccc catgagtagg 1500 cagaaccgcg tccaagtcca catcatccat aacgatcatg cacggggtgg aatccacacc 1560 cagacttgcc agcacctcat tagcgacacg ttgcgcagcg gccacgtcct tagccttatc 1620 cacgcaatct aggacgtact gcctaaccgc gaaatcagac tgaatcagtt tccaatcatc 1680 gggcttcacc aaagcaacag caacgcgggt tgattcgacc cgttccggtg cttccagacc 1740 ggcgagcttg tacagttctt cttccatttc acgacgtaca tcagcgtcta tgtaatcaat 1800 gcccaaagca cgcttagccc cacgtgacca ggacgaacgc aggtttttag aaccaacctc 1860 atactcacgc caccgagcca ccaaaacagc gtccatatcc tcgccggcgt cgctttgatc 1920 ggccaacata tccaacatct gaaacggcgt gtacgacccc ttagacgcgg ttttagtagc 1980 ggagccagtc agttcctgag acatgccctt agcgaggtag gttgccattt tcgcagcgtc 2040 tccaccccag gtagacacct gatcaagttt gaccccgtgc tcacgcagtg gcgcgtccat 2100 accggcctta accacaccag cagaccagcg ggaaaacatg gaatcctcaa acgccttgag 2160 ttcatcgtca gacagtggac gatccaagaa caacagcatg ttgcggtgca agtgccaacc 2220 gttcgcccaa gagtctgtga cctcatagtc actataggtg tgctccaccc cgtaccgtgc 2280 acgttctttc ttccactgag atgttttcac catcgaagag tacgcagtct taatacccgc 2340 ttcaacctgc gcaaatgact gtgagcggtt gtgtcgaaca gtgcccacaa acatcatgag 2400 cgcgccaccc gccgccaagt gattcttagt agcaatagcc agctcaatgc ggcgttcgcc 2460 catgacttcc aattcagcca gaggtgaccc ccagcgagag tgagagtttt gcagaccctc 2520 aaactgcgaa gcaccgttag acgaccagga caccgcaaca gcttcgtccc tgcgccacct 2580 atggcacccc gccagagcct tactattggt gatcttgtac atgacgtttt gcctacgcca 2640 cgccctagcg cgagtgacct tagaaccctc attgacctgc ggttccttag aggtgttcac 2700 ttctatttca gtgttaccta gacccgatgt tgtgcggggt tgcgcagtgc gagtttgtgc 2760 gggtgttgtg cccgttgtct tagctagtgc tatggttgtc aattgaaacc ccttcgggtt 2820 atgtggcccc cgtgcatatg agttggtagc tcgcacgggg gtttgtcttg tctaggaact 2880 attaattttt agtggtgttt ggtggccgcc tagcttggct atgcgtgcca gcttacccgt 2940 actcaatgtt aaagatttgc atcgacatgg gagggttacg tgtccgatac ctaggggggg 3000 tatccgcgac taggtgcccc ggtgctcact gtctgtaccg gcggggcaag ccccacaccc 3060 cgcatggaca gggtggctcc gccccctgca cccccagcaa tctgcatgta catgttttac 3120 acattagcac gacatgactg catgtgcatg cactgcatgc agactaggta aatatgagta 3180 tgtacgacta gtaacaggag cactgcacat aatgaatgag ttgcaggaca atgtttgcta 3240 cgcatgcgca tgacatatcg caggaaagct actagagtct taaagcatgg caaccaaggc 3300 acagctagaa cagcaactac aagaagctca acaggcacta caggcgcagc aagcgcaggc 3360 acaagccacc atcgaagcac tagaagcgca ggcaaaggct aagcccgtcg tggtcaccgc 3420 acgcgttcct ttggcactac gtgaggacat gaagcgcgca ggcatgcaga acggtgaaaa 3480 cctccaagag ttcatgatcg ccgcgtttac cgagcggcta gaaaagctca ccaccaccga 3540 caacgaggaa aacaatgtct aacccactag ttctctttgc ccaccgtgac ccggtaaatg 3600 acgtgacgtt cgagtgcatt gagcacgcca cctacgacac actttcacac gctaaagacc 3660 agatcaccgc ccaaatgcaa gccctagacg aagaagccgc cctactgccc taatgggtgt 3720 ttcatgggtg tttccctagt gtttcatggt gttttcacct aagctaggga attgcgcgag 3780 aagtctcgca aaaatcagca acccccggaa ccacacagtt cacgggggtt cttctatgcc 3840 agaaatcaga aaggggaacc agtgaacgac cccgaatatt ggatcacagc gcagcaggtc 3900 gccgcccgcg tagctctcac cccggccacc attaaaaagt gggcaaacga gggaaaaatc 3960 accgcataca agatcggcaa gtccgtccga ttcaaagcat cagacgtaga caagctaggg 4020 gggggggggc gctgaggtct gcctcgtgaa gaaggtgttg ctgactcata ccaggcctga 4080 atcgccccat catccagcca gaaagtgagg gagccacggt tgatgagagc tttgttgtag 4140 gtggaccagt tggtgatttt gaacttttgc tttgccacgg aacggtctgc gttgtcggga 4200 agatgcgtga tctgatcctt caactcagca aaagttcgat ttattcaaca aagccgccgt 4260 cccgtcaagt cagcgtaatg ctctgccagt gttacaacca attaaccaat tctgattaga 4320 agaactcgtc aagaaggcga tagaaggcga tgcgctgcga atcgggagcg gcgataccgt 4380 aaagcacgag gaagcggtca gcccattcgc cgccaagctc ttcagcaata tcacgggtag 4440 ccaacgctat gtcctgatag cggtccgcca cacccagccg gccacagtcg atgaatccag 4500 aaaagcggcc attttccacc atgatattcg gcaagcaggc atcgccatgg gtcacgacga 4560 gatcctcgcc gtcgggcatg ctcgccttga gcctggcgaa cagttcggct ggcgcgagcc 4620 cctgatgctc ttcgtccaga tcatcctgat cgacaagacc ggcttccatc cgagtacgtg 4680 ctcgctcgat gcgatgtttc gcttggtggt cgaatgggca ggtagccgga tcaagcgtat 4740 gcagccgccg cattgcatca gccatgatgg atactttctc ggcaggagca aggtgagatg 4800 acaggagatc ctgccccggc acttcgccca atagcagcca gtcccttccc gcttcagtga 4860 caacgtcgag cacagctgcg caaggaacgc ccgtcgtggc cagccacgat agccgcgctg 4920 cctcgtcttg cagttcattc agggcaccgg acaggtcggt cttgacaaaa agaaccgggc 4980 gcccctgcgc tgacagccgg aacacggcgg catcagagca gccgattgtc tgttgtgccc 5040 agtcatagcc gaatagcctc tccacccaag cggccggaga acctgcgtgc aatccatctt 5100 gttcaatcat aacacccctt gtattactgt ttatgtaagc agacagtttt attgttcatg 5160 atgatatatt tttatcttgt gcaatgtaac atcagagatt ttgagacaca acgtggcttt 5220 cccccccccc ccaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc 5280 ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct 5340 tc 5342

Claims (20)

1. 조작되지 않은 세포에 비하여, GlnK, 및 GlnD로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 것의 양 또는 활성이 증가되어 있는, 유기산 생산능이 증가되어 있는 유전적으로 조작된 박테리아 세포.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 GlnK 및 GlnD는 각각 서열번호 1 및 서열번호 2의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 것인 박테리아 세포.
3. 청구항 1에 있어서, 상기 GlnK 및 GlnD는 각각 서열번호 3 및 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 것에 의하여 코딩되는 것인 박테리아 세포.
4. 청구항 1에 있어서, 상기 GlnK 및 GlnD는 각각 glnK 유전자 NCgl1982 및 glnD 유전자 NCgl1981에 의하여 코딩되는 것인 박테리아 세포.
5. 청구항 1에 있어서, 미호기성 또는 혐기성 조건에서 숙신산 생산능을 갖는 것인 박테리아 세포.
6. 청구항 1에 있어서, 코리네박테리움 속인 것인 박테리아 세포.
7. 청구항 1에 있어서, 상기 하나 이상과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 것의 양 또는 활성이 증가되는 것은, 상기 하나 이상을 코딩하는 유전자의 카피 수 증가 또는 상기 유전자의 발현 조절 서열의 변형에 의한 것인 박테리아 세포.
8. 청구항 1에 있어서, 상기 카피 수 증가는 상기 유전자의 세포 외부로부터 내부로의 도입 또는 내재적 유전자의 증폭에 의한 것인 박테리아 세포.
9. 청구항 1에 있어서, 상기 하나 이상과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 것의 양 또는 활성이 증가되는 것은, 상기 하나 이상을 코딩하는 유전자의 돌연변이에 의한 것인 박테리아 세포.
10. 청구항 1에 있어서, L-락테이트 데히드로게나제 유전자, 피루베이트 옥시다제 유전자, 포스포트란스아세틸라제 유전자, 아세테이트 키나제 유전자, 아세테이트 CoA 트란스퍼라제 유전자, 또는 그 조합이 제거 또는 파괴된 것인 박테리아 세포.
11. 청구항 1에 있어서, 피루베이트를 옥살로아세테이트로 전환시키는 것을 촉매하는 피루베이트 카르복실라제 활성이 증가된 것인 박테리아 세포.
12. 청구항 11에 있어서, 상기 피루베이트 카르복실라제는 서열번호 14에서 P458S 치환을 갖는 것인 박테리아 세포.
13. 청구항 1의 박테리아 세포를 포함하는, 숙신산을 생산하는데 사용하기 위한 조성물.
14. 청구항 1의 박테리아 세포를 숙신산을 생산하는데 사용하기 위한 용도.
15. 청구항 1의 박테리아 세포를 배양하는 단계; 및
    배양물로부터 숙신산을 회수하는 단계를 포함하는 유기산을 생산하는 방법.
16. 청구항 15에 있어서, 상기 배양은 미호기 또는 혐기 조건에서 배양하는 것인 방법.
17. 청구항 15에 있어서, 상기 박테리아 세포는 코리네박테리움 속인 것인 방법.
18. 청구항 15에 있어서, 상기 박테리아 세포는 L-락테이트 데히드로게나제 유전자, 피루베이트 옥시다제 유전자, 포스포트란스아세틸라제 유전자, 아세테이트 키나제 유전자, 아세테이트 CoA 트란스퍼라제 유전자, 또는 그 조합이 제거 또는 파괴된 것인 방법.
19. 청구항 15에 있어서, 상기 박테리아 세포는 피루베이트를 옥살로아세테이트로 전환시키는 것을 촉매하는 피루베이트 카르복실라제 활성이 증가된 것인 방법.
20. 청구항 15에 있어서, 상기 GlnK 및 GlnD는 각각 서열번호 1 및 서열번호 2의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 것인 방법.

Images