HU219600B - Mutáns foszfo-enolpiruvát-karboxiláz, ennek génje, valamint eljárás aminosav előállítására - Google Patents

Abstract

Escherichia coli vagy Corynebacterium sejtekbe olyan foszfo-enolpiruvát-karboxiláz-gént vittek be, amely az N-- terminálistólszámított 625. glutaminsavat lizinnel, a 438. arginint ciszteinnelstb. helyettesítő mutációval rendelkezett, miáltal olyan foszfo-enolpiruvát-karboxilázt állítottak elő, amelyet az aszparaginsavlényegében nem gátol, lehetővé téve az aminosavak hatékonyelőállítását. A találmány tárgya mutáns foszfo-enolpiruvát--karboxiláz, amely az aszparaginsav feedback gátlásával szembenlényegében deszenzibilizált; a mutáns foszfo-- enolpiruvát-karboxiláztkódoló gén; valamint eljárás alkalmazásukra. ŕ

Description

A találmány tárgya mutáns foszfo-enolpiruvát-karboxiláz, az ezt kódoló gén, valamint eljárás aminosav előállítására. A találmány elsődleges tárgya az aszparaginsav által kiváltott feedback gátlással szembeni deszenzibilizáláshoz alkalmas mutációval rendelkező gén, valamint ennek alkalmazása.

A foszfo-enolpiruvát-karboxiláz majdnem valamennyi baktériumban és valamennyi növényben megtalálható enzim, amely az aszparaginsav és glutaminsav bioszintézisében játszik szerepet, és a citromsav (trikarbonsav-) ciklusba négy szénatomos dikarbonsavat szállít, fenntartva a ciklus tumoverét. Az aminosavak mikroorganizmusok alkalmazásával végzett fermentációs előállításával kapcsolatban megjelent néhány cikk azonban nem világította meg a foszfo-enolpiruvát-karboxiláz hatását (Atsushi Yokota és Isamu Shiio, Agric. Bioi. Chem., 52, 455-463,1988; Josef Cremer és munkatársai, Appl. Environ. Microbiol., 57, 1746-1752, 1991; Petra, G., Peters-Weintisch, FEMS Microbiol. Letters, 112, 269-274,1993).

Az aminosavak a sejtekben proteinek komponenseiként univerzálisan előforduló vegyületek, azonban a gazdaságos energiaforgalom és anyagcsere biztosítása érdekében szintézisük szigorúan szabályozott. Ez a szabályozás elsősorban feedback mechanizmuson alapul, melyben egy metabolikus reakcióút végterméke gátolja a reakcióút korábbi lépéseit katalizáló enzim aktivitását. A foszfo-enolpiruvát-karboxilázt, aktivitásának kifejtésében, szintén érik különböző szabályozóhatások.

Például, a Cotynebacterium vagy az Escherichia nemzetségbe tartozó mikroorganizmusok foszfo-enolpiruvát-karboxiláza esetében az enzimaktivitást az aszparaginsav gátolja, így a fentebb említett aminosav-bioszintézist - melyben részt vesz a foszfo-enolpiruvátkarboxiláz -, is gátolja.

Az aminosavak hatékony fermentációs előállítása érdekében korábban számos technikát fejlesztettek ki, melyeket a leucin, izoleucin, triptofán, fenil-alanin és hasonlók előállításához alkalmaztak. Ezen eljárásokban mutáns törzseket alkalmaztak, melyeket úgy alakítottak át, hogy ne legyenek érzékenyek a feedback szabályozásra. Mind ez idáig azonban nem ismert sem az aszparaginsav gátlására érzéketlen mutáns foszfo-enolpiruvát-karboxiláz, sem olyan kísérlet, amelyben ezt a módosított enzimet az aszparaginsav- és a glutaminsavcsaládba tartozó aminosavak fermentációs előállításában alkalmazták volna.

Ezzel szemben, az Escherichia coli - foszfo-enolpiruvát-karboxilázt kódoló - ppc génjét már klónozták, és meghatározták nukleotidszekvenciáját is (Fujita, N., Miwa, T., Ishijima, S., ízűi, K. és Katsuki, H. J. Biochem., 909-916, 1984). Nem számoltak be azonban olyan mutánsról, amelyben az aszparaginsav gátlása deszenzibilizált.

Találmányunkat a fenti hiányosság kiküszöbölése céljából valósítottuk meg. A találmány tárgya mutáns foszfo-enolpiruvát-karboxiláz, amely az aszparaginsav feedback gátlásával szemben lényegében deszenzibilizált; a mutáns foszfo-enolpiruvát-karboxilázt kódoló gén; valamint eljárás alkalmazásukra.

A fentiek megvalósítása érdekében végzett szorgalmas kutatás eredményeként felismertük, hogy az aszparaginsav által kiváltott gátlás jelentős mértékben deszenzibilálható, ha az E. coli foszfo-enolpiruvát-karboxilázának meghatározott helyén egy aminosavat egy másik aminosavval helyettesítünk, amit úgy érünk el, hogy ilyen mutáns enzimet kódoló gént hozunk létre.

A találmány egyik tárgya mutáns foszfo-enolpiruvát-karboxiláz, amely Escherichia nemzetségbe tartozó mikroorganizmusból származik, s olyan mutációval rendelkezik, amely az aszparaginsav által kiváltott feedback gátlással szemben deszenzibilálja az enzimet. A találmány további tárgya a mutáns foszfo-enolpiruvátkarboxilázt kódoló DNS-szekvencia.

A találmány további tárgyai az említett DNS-szekvenciát tartalmazó, Escherichia vagy a Corynebacterium nemzetségbe tartozó mikroorganizmusok, valamint eljárás aminosav előállítására, melynek során az említett mikroorganizmusok valamelyikét megfelelő tápközegben tenyésztjük, és az aminosavat (mely lehet Llizin, L-treonin, L-metionin, L-izoleucin, L-gutaminsav, L-arginin vagy L-prolin) elkülönítjük a tápközegből.

A találmány leírásában a mutáns foszfo-enolpiruvát-karboxilázt kódoló DNS-szekvenciát vagy a kódolószekvencián kívül promotert is tartalmazó DNS-szekvenciát rendszerint a „találmány szerinti DNS-szekvencia”, „mutáns gén” vagy „foszfo-enolpiruvát-karboxiláz-gén” kifejezéssel említjük.

A találmányt az alábbiakban írjuk le részletesen.

Mutáns foszfo-enolpiruvát-karboxiláz

A találmány szerinti mutáns foszfo-enolpiruvát-karboxiláz (a továbbiakban „mutáns enzim”) az Escherichia nemzetségbe tartozó mikroorganizmusok foszfo-enolpiruvát-karboxiláza, amely mutáció folytán nem érzékeny az aszparaginsav által kiváltott feedback gátlásra.

Az említett mutáció bármilyen mutáció lehet, feltéve, hogy a feedback gátlással szemben deszenzibilizálja az enzimet anélkül, hogy az elveszítené foszfoenolpiruvát-karboxiláz-aktivitását. E feltételnek megfelelően, példaként olyan mutációt említhetünk, amely ha a mutációval rendelkező mutáns foszfo-enolpiruvátkarboxiláz jelen van az Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumsejtekben - a sejteket rezisztenssé teszi az alábbi tulajdonságokkal rendelkező vegyületre:

az Escherichia nemzetségbe tartozó, vad típusú foszfo-enolpiruvát-karboxilázt termelő mikroorganizmusok ellen növekedésgátló hatást mutat;

az említett növekedésgátló hatás L-glutaminsav vagy L-aszparaginsav jelenlétével visszaállítható;

gátolja a vad típusú foszfo-enolpiruvát-karboxiláz aktivitását.

Közelebbről, a foszfo-enolpiruvát-karboxilázt érintő mutációk (N-terminálistól számítva) az alábbiak lehetnek:

(1) a 625. glutaminsavat lizinnel helyettesítő mutáció;

(2) a 222. arginint hisztidinnel, illetve a 223. glutaminsavat lizinnel helyettesítő mutáció;

(3) a 288. szerint fenil-alaninnal helyettesítő, a 289. glutaminsavat lizinnel, az 551. metionint izoleucinnal,

HU 219 600 Β illetve a 804. glutaminsavat lizinnel helyettesítő mutáció;

(4) a 867. alanint treoninnal helyettesítő mutáció;

(5) a 438. arginint ciszteinnel helyettesítő mutáció;

(6) a 620. lizint szerinnel helyettesítő mutáció.

Az Escherichia nemzetségbe tartozó mikroorganizmusok foszfo-enolpiruvát-karboxilázaként az Escherichia coli foszfo-enolpiruvát-karboxiláz-génjéből (Fujita, N., Miwa, T., Ishijima, S., ízűi, K. és Katsuki, H., J. Biochem., 909-916,1984) származtatott aminosavszekvenciát a szekvencialistában 2. számú szekvenciaként mutatjuk be. Az Escherichia coli foszfo-enolpiruvát-karboxiláz-génjét tartalmazó pT2 plazmid teljes nukleotidszekvenciáját (az aminosavszekvenciával együtt) a szekvencialista 1. számú szekvenciájaként mutatjuk be.

A fentebb említett mutáns enzimeket az alábbiakban leírt, találmány szerinti DNS-szekvenciák kódolják, és ezeket az enzimeket úgy állítjuk elő, hogy a DNS-szekvenciákat Escherichia coliban és hasonló baktériumokban expresszáljuk.

A találmány szerinti DNS-szekvencia, és az azt tartalmazó mikroorganizmusok

A találmány szerinti DNS-szekvencia kifejezés a fentebb említett mutáns enzimeket kódoló DNS-szekvenciákat foglalja magában. Ezek a DNS-szekvenciák az Escherichia nemzetségbe tartozó mikroorganizmusok foszfo-enolpiruvát-karboxilázát kódoló DNS-fragmensekben olyan mutációkat tartalmaznak, amelyek deszenzibilizálják a foszfo-enolpiruvát-karboxilázt az aszparaginsav által kifejtett feedback gátlással szemben.

Példaként olyan, foszfo-enolpiruvát-karboxilázát kódoló DNS-szekvenciákat említhetünk, amelyek a fenti (1)-(6) pontokban leírt mutációk valamelyikét tartalmazzák. Például az 1. számú szekvenciaként bemutatott nukleotidszekvenciát illetően, olyan DNS-szekvenciát hozhatunk például, amely tartalmazza az alábbi mutációk bármelyikét:

i) a 2109-2111. helyen lévő GAA bázishármast (triplett) AAA vagy AAG triplettre változtató mutáció;

ii) a 900-902. helyen lévő CGC triplettet CAT vagy CAC triplettre, illetve a 903-905. helyen lévő GAA triplettet AAA vagy AAG triplettre változtató mutáció;

iii) az 1098-1100. helyen lévő TCT triplettet TTT vagy TTC triplettre, az 1101-1103. helyen lévő GAA triplettet AAA vagy AAG triplettre, az 1887-1889. helyen lévő ATG triplettet ATT, ATC vagy ATA triplettre, illetve a 2646-2648. helyen lévő GAA triplettet AAA vagy AAG triplettre változtató mutáció;

iv) a 2835-2837. helyen lévő GCG triplettet ACT, ACC, ACA vagy ACG triplettre változtató mutáció;

v) az 1548-1550. helyen lévő CGT triplettet TGT vagy TGC triplettre változtató mutáció; és vi) a 2094-2096. helyen lévő AAA triplettet TCT, TCC, TCA vagy TCG triplettre változtató mutáció.

Ilyen mutáns gént úgy kapunk, hogy egy vad típusú (vagy egy másfajta mutációval rendelkező) enzim génjeként egy foszfo-enolpiruvát-karboxiláz-génnek az adott gazdasejthez alkalmas vektor-DNS-sel való ligálásával kapott rekombináns DNS-t mutációs kezelésnek vetünk alá, hogy a transzformánsokat a rekombináns DNS-sel screenelhessük. Más módon, egy vad típusú enzimet termelő mikroorganizmust vetünk alá mutációs kezelésnek, miáltal mutáns enzimet termelő mutáns törzset kapunk, és a mutáns gént screeneljük a mutáns törzsből. A rekombináns DNS mutációs kezeléséhez hidroxilamint és hasonlókat alkalmazhatunk. Amikor magát a mikroorganizmust vetjük alá a mutációs kezelésnek, a mesterséges mutációhoz általánosan használt hatóanyagot vagy eljárást alkalmazhatunk.

Olyan eljárások alkalmazásával, mint az átfedőextenzió- (overlapping extension) eljárás (Ho, S. N., Hunt, H. D., Horton, R. M., Pulién, J. K. és Pease, L.

R. , Gene, 77, 51-59, 1989), a helyspecifikus mutáció (Kramer, W. és Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350,1987; Kunkel, T. A. és munkatársai, Meth. in Enzymol., 154, 367, 1987) és hasonlók, a fentebb említett mutáns gén úgy is előállítható, hogy a foszfo-enolpiruvát-karboxiláz-gén - mint vad típusú gén vagy más mutációval rendelkező gén - nukleotidszekvenciájába mutációt (aminosavhelyettesítés, inszerció, deléció stb.) viszünk be. Ezen eljárások alapelve, hogy templátként nem mutált gén DNS-ét alkalmazzuk, és a primerek egyikeként a mutációs pontnál nem komplementer bázispárosodást (mismatch) tartalmazó szintetikus DNS-t alkalmazunk, hogy az említett nem mutált gén komplementer szálát hozzuk létre, miáltal a szekvenciába mutációt viszünk be. Ezen eljárások alkalmazásával egy megcélzott helyen szándékosan idézhetünk elő mutációt.

Más lehetőség szerint, olyan szekvenciát szintetizálhatunk, amely mindkét terminálisán restrikciós enzimes hasítási végekkel és egy mutációs pont mindkét oldalával rendelkezik, s ezzel a szekvenciával egy nem mutált gén megfelelő részletét helyettesítjük, miáltal mutációt idézünk elő (kazettamutációs eljárás).

A foszfo-enolpiruvát-karboxiláz-gén (amelyet a mutáció beviteléhez vad típusú enzimgénként vagy másik mutációt tartalmazó génként alkalmazunk), bármilyen gén lehet, azzal a feltétellel, hogy az Escherichia nemzetségbe tartozó mikroorganizmusok foszfo-enolpiruvát-karboxiláz-génjét kódolja, amit előnyösen bázisszekvenciája alapján határozunk meg, és klónozunk. Amennyiben a gént nem klónoztuk, FCR (polimerázláncreakció) és egyéb eljárások alkalmazásával ilyen gént tartalmazó DNS-fragmenst amplifikálhatunk és izolálhatunk, majd a klónozás végrehajtásához megfelelő vektort alkalmazunk.

A fent említett génként például olyan Escherichia coli gént alkalmazhatunk, amely klónozott, és bázisszekvenciája meghatározott (Fujita, N., Miwa, T., Ishijima,

S. , ízűi, K. és Katsuki, H., J. Biochem., 95, 909-916, 1984). E gén kódolórégiójának szekvenciáját az 1. számú szekvencia 237-2888. bázisai képezik.

A mutáns gént tartalmazó gazdasejt screenelését az aszparaginsav analógjának alkalmazásával hajthatjuk végre. Az analóg vegyület előnyösen az alábbi tulajdonságokkal rendelkezik: az Escherichia nemzetségbe tartozó, vad típusú foszfo-enolpiruvát-karboxilázt tartalmazó mikroorganizmusokkal szemben növekedést gát3

HU 219 600 Β ló hatást mutat, ami az L-glutaminsav vagy az L-aszparaginsav jelenlétével visszaállítható), és gátolja a vad típusú foszfo-enolpiruvát-karboxiláz-aktivitást.

Ha az Escherichia nemzetségbe tartozó mikroorganizmusok közül (indexként a baktérium növekedésének gátlását alkalmazva) az említett analóg vegyületre rezisztens, mutáns törzset választunk ki, például a vad típusú foszfo-enolpiruvát-karboxilázt termelő Escherichia coli HB101 törzset, sokkal nagyobb a valószínűsége annak, hogy az aszparaginsav által kiváltott feedback gátlással szemben deszenzibilizált foszfo-enolpiruvát-karboxilázt termelő gazdabaktériumot kapjunk.

A foszfo-enolpiruvát-karboxiláz inhibitorának általános szerkezetét tekintve alapvetően egy négy szénatomos dikarbonsavstruktúrára van szükség. Ebből kiindulva, különböző vegyületeket vizsgáltunk. Az Escherichia coli HB101 törzset LB tápközegben tenyésztettük, majd 20 pg/ml tiamint és 3-3 pg/ml leucint és prolint tartalmazó M9 tápközegbe helyeztük, amely a fentieken kívül az alábbi vegyületek valamelyikét tartalmazta: DL-2amino-4-foszfino-vajsav, bróm-borostyánkősav, mezo2,3-dibróm-borostyánkősav, 2,2-difluor-borostyánkősav, 3-bróm-piroszőlősav, α-ketovajsav, a-ketoadipinsav, DL-treo-P-hidroxi-aszparaginsav-P-metil-észter, ametil-DL-aszparaginsav, 2,3-diamino-borostyánkősav vagy aszparaginsav-P-hidrazid. A tápközeg abszorbanciáját az idő előrehaladtával 660 nm-nél mértük, miáltal nyomon követtük a növekedést.

Amikor ezek a vegyületek növekedést gátló koncentrációikban voltak jelen, azt vizsgáltuk, hogy a nukleinsavak (100-100 mg/dm³ uridin és adenozin) a glutaminsav- vagy az aszparaginsavcsaládba tartozó egyéb aminosavak (Asp: 0,025%, Met, Thr, Lys: 0,1-0,1%) hozzáadása után a gátlás megszűnt-e vagy sem.

Eredményül három vegyületet, a 3-bróm-borostyánkősavat (3BP) [(1) képlet], az aszparaginsav-p-hidrazidot (AHY) [(2) képlet] és a DL-treo-p-hidroxi-aszpartátot (βΗΑ) [(3) képlet] választottuk ki.

Az Escherichia coli szaporodásának fenti analóg vegyületek által történő gátlását az 1-3. ábrákon mutatjuk b. A 4-6. ábrákon a fentebb említett, gátlást megszüntető anyagok hozzáadása után az Escherichia coli szaporodásának visszaállítását mutatjuk be. A 7. ábrán (kontrollként) a gátlást megszüntető anyag hozzáadásakor tapasztalható szaporodást mutatjuk be, olyan esetben, amikor gátlóanyagok nem voltak jelen. A 4-7. ábrákon az 1., 2. és 3. adalék nukleinsavakat, glutaminsavat, illetve az aszparagincsaládba tartozó aminosavakat jelöl.

Vizsgáltuk a foszfo-enolpiruvát-karboxiláz aktivitásának analóg vegyület által történő gátlását. A nyersenzimet a The Journal of Biochemistryben (67. évfolyam, 4. szám, 1970) leírt eljárás szerint Escherichia coli HB101 törzsből állítottuk elő, az enzimaktivitást pedig az Eur. J. Biochem.-ben (202, 797-803,1991) leírt eljárás szerint mértük.

Az LB tápközegben tenyésztett HB101 Escherichia coli sejteket feltártuk, és a kapott szuszpenzió centrifugálásával kapott felülúszót nyersenzimoldatként használtuk. Az enzimaktivitást az abszorbancia 340 nm-nél mért csökkenése alapján határoztuk meg. A 2 mM kálium-foszfo-enolpiruvátot, 0,1 mM NADH-t, 0,1 M Tris-acetátot (pH=8,5), 1,5 egység malát-dehidrogenázt és a nyersenzimet tartalmazó vizsgálati rendszerben az aktivitást gátló acetil-koenzim A koncentrációja 0,1 mM volt. Az eredményeket a 8. ábrán mutatjuk be.

A bemutatott eredmények alapján nyilvánvaló, hogy a fentebb említett három vegyület gátolja az Escherichia coli növekedését (szaporodását), és ez a gátlás önmagukban alkalmazott nukleinsavakkal nem szüntethető meg, míg glutaminsav (vagy az aszparagincsaládba tartozó aminosavak) hozzáadásával megszüntethető. Következésképpen, ezek az analóg vegyületek a foszfo-enolpiruvát-karboxiláz szelektív inhibitorai. Amint az alábbi példákban leíquk, találmányunkban e vegyületeket sikerrel alkalmaztuk mutáns foszfo-enolpiruvát-karboxilázt termelő Escherichia coli szelektálásához.

Ha egy megcélzott mutáns enzimet kódoló génnel rendelkező transzformánst a fentebb említett vegyületek alkalmazásával screenelünk, és rekombináns DNS-t nyerünk ki, a mutáns enzimet kódoló gént kapjuk. Más módon, abban az esetben, ha önmagát a baktériumot vetjük alá mutációs kezelésnek, ha a megcélzott mutáns enzimet kódoló génnel rendelkező mutáns törzset a fentebb említett vegyülettel screeneljük, a törzsből a megcélzott mutáns enzim génjét tartalmazó DNS-ffagmenst izolálhatjuk, és ezt megfelelő vektorral ligáivá a mutáns enzim génjét kapjuk.

Sokrétű kutatásunk eredményeként, melynek során figyelmet fordítottunk az Escherichia coli aszpartátkötő proteinjében jelen lévő arginingyök jelentőségére (Krikos, A., Mouth, N., Boyd, A. és Simon, M. 1., Ccü, 33, 615-622, 1983; Mowbray, S. L. és Koshland, D; E., J. Bioi. Chem., 264, 15 638-15 643, 1990; Mílbum, Μ. V., Prive, G. G., Milligan, D. L., Scott, W. G., Yeh, J., Jancarik, J., Koshland, D. E. és Kim, S. H. Science, 254, 1342-1347, 1991), felismertük hogy az aszparaginsav által kiváltott gátlás lényegében deszenzibilizálható, ha a foszfo-enolpiruvát-karboxiláz 438. arginingyökét ciszteingyökkel helyettesítjük. Annak érdekében, hogy a 438. arginint ciszteinre cseréljük, a foszfo-enolpiruvát-karboxilázt kódoló gén 438. arginint kódoló kodonját a cisztein kodonjára cseréljük. Például, az 1. számú szekvenciában az 1548-1550. helyen lévő CGT triplettet TGT vagy TGC triplettre cserélhetjük.

Ezenkívül elvégeztük a foszfo-enolpiruvát-karboxiláz lizingyökeinek kémiai módosítását, melyhez 2,4,6trinitro-benzolszulfonsavat (TNBS) alkalmaztunk, amely képes a proteinek lizingyökeinek kémiai módosítására. A módosítóreakció során a foszfo-enolpiruvátkarboxiláz gátlására képes almasav is jelen volt, mert feltételeztük, hogy a foszfa-enolpiruvát-karboxiláz kötőhelyének szomszédságában jelen levő lizingyök megvédhető a kötött almasavval, miáltal a kémiai módosítás nem hat rá. Eredményként arra következtettünk, hogy a 620. lizingyök lényeges az almasav foszfo-enolpiruvát-karboxilázhoz való kötődése szempontjából, s azt találtuk, hogy a 620. lizingyököt szerinre változtatva az aszparaginsav által kiváltott feedback gátlás

HU 219 600 Β deszenzibilizálható, miközben a foszfo-enolpiruvát-karboxiláz enzimaktivitása fennmarad. Annak érdekében, hogy a 620. lizingyököt szerinné alakítsuk, a foszfoenolpiruvát-karboxilázt kódoló gén 620. lizint kódoló kodonját szerint kódoló kodonná változtathatjuk. Például az 1. számú szekvenciában, a 2094-2096. számú nukleotidokból álló AAA triplettet TCT, TCC, TCA, TCG, AGT vagy AGC triplettel helyettesíthetjük.

Olyan eljárások alkalmazásával, mint az átfedőextenzió- (overlapping extension) eljárás (Ho, S. N., Hunt, H. D., Horton, R. M., Pulién, J. K. és Pease, L. R., Gene, 77, 51-59, 1989), a helyspecifikus mutáció (Kramer, W. és Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350, 1987; Kunkel, T. A. és munkatársai, Meth. in Enzymol., 154, 367, 1987) és hasonlók, a fentebb említett mutáns gén úgy is előállítható, hogy a foszfo-enolpiruvát-karboxiláz-gén - mint vad típusú gén vagy más mutációval rendelkező gén - nukleotidszekvenciájába mutációt (aminosavhelyettesítés, inszerció, deléció stb.) viszünk be. Ezen eljárások alapelve, hogy templátként nem mutált gén DNS-ét alkalmazzuk, és a primerek egyikeként a mutációs pontnál nem komplementer bázispárosodást (mismatch) tartalmazó szintetikus DNS-t alkalmazunk, hogy az említett nem mutált gén komplementer szálát hozzuk létre, miáltal a szekvenciába mutációt viszünk be. Ezen eljárások alkalmazásával egy megcélzott helyen szándékosan idézhetünk elő mutációt.

Más lehetőség szerint, olyan szekvenciát szintetizálhatunk, amely mindkét terminálisán restrikciós enzimes hasítási végekkel és egy mutációs pont mindkét oldalával rendelkezik, s ezzel a szekvenciával egy nem mutált gén megfelelő részletét helyettesítjük, miáltal mutációt idézünk elő (kazettamutációs eljárás). A foszfo-enolpiruvát-karboxilázt kódoló, fentiek szerint mutált DNSffagmenst megfelelő gazda-vektor rendszer alkalmazásával expresszáljuk, miáltal lehetővé válik a mutáns enzim előállítása. Más módon a megcélzott mutáns enzim úgy is előállítható, hogy a találmány szerinti DNS-fragmenst egy gazdasejt kromoszomális DNS-ébe építve transzformációt végzünk.

Gazdasejtként az Escherichia nemzetségbe tartozó mikroorganizmusokat, például Escherichia colit, coryneform baktériumokat és hasonlókat alkalmazhatunk. A coryneform baktériumok közé tartoznak a Corynebacterium nemzetségbe tartozó baktériumok, a Brevibacíerium nemzetségbe tartozó baktériumok (melyeket eddig a Brevibacterium nemzetségbe soroltak, de jelenleg a Corynebacterium nemzetségben egyesítenek), valamint a Brevibacterium nemzetségbe tartozó baktériumok, melyek közeli rokonságban állnak a Corynebacterium nemzetségbe tartozó baktériumokkal. Az aminosavak előállításához előnyös gazdasejteket az alábbiakban írjuk le.

Vektor-DNS-ként előnyösen plazmidvektort alkalmazunk, és azokat részesítjük előnyben, amelyek a gazdasejtben önreplikációra képesek. Amennyiben gazdasejtként Escherichia colit alkalmazunk, vektorként például a pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG399, RSF1010 és hasonló plazmidok alkalmazhatók. Más lehetőség szerint fág-DNS-vektort is felhasználhatunk.

Amennyiben a gazdasejt Corynebacterium, az alábbi vektorokat (és az azokat tartalmazó gazdasejteket) alkalmazhatjuk. Zárójelben feltüntetjük a deponálási számokat.

pAJ655 Escherichia coli AJ11882 (FERM BP-136);

Corynebacterium glutamicum SR8201 (ATCC 39135);

pAJ1844 Escherichia coli AJ11883 (FERM BP-137);

Corynebacterium glutamicum SR8202 (ATCC 39136);

pAJ611 Escherichia coli AJ11884 (FERM BP-138);

pAJ3148 Corynebacterium glutamicum SR8203 (ATCC 39137);

pAJ440 Bacillus subtilis AJ11901 (FERM BP-140).

A fenti vektorokat a letétbe helyezett organizmusokból az alábbiak szerint nyerhetjük ki. A logaritmikus növekedési fázisban összegyűjtött sejteket lizozim és SDS alkalmazásával bakteriolízisnek vetjük alá, és 30 000 xg-vei centrifugálva a lizátumból felülúszót kapunk, amelyhez polietilénglikolt adunk, hogy a vektorokat cézium-klorid/etidium-bromid egyensúlyi sűrűséggradiens-centrifúgálással elválasszuk és tisztítsuk.

Annak érdekében, hogy az Escherichia colit a DNS-szekvencia fentebb említett vektorba történő inzertálásával kapott rekombináns vektorral transzformáljuk, Escherichia coli transzformációjához általánosan: alkalmazott eljárást alkalmazhatunk, például olyan eljárást, melyben a sejteket a DNS permeábilitásának fokozása érdekében kalcium-kloriddal kezeljük (Mandel, M. és Higa, A., J. Mól. Bioi., 53, 159,1977) stb.

A Corynebacteriumok transzformálásához a fenti eljárást (melyben a sejteket nátrium-kloriddal kezeljük) vagy olyan eljárást alkalmazhatunk, melyben a DNSbevitelt meghatározott növekedési periódusban hajtjuk végre, amikor a sejtek képesek a DNS felvételére (Bacillus subtilisre vonatkozó leírás, Duncan, C. H. és munkatársai). A DNS-t úgy is bevihetjük a baktériumsejtekbe, hogy a DNS-recipiensekből protoplasztokat vagy szferoplasztokat hozunk létre, melyek könnyen beépítik a plazmid-DNS-t. Ezek a Bacillus subtilis, Actinomyces fajok és az élesztők esetében ismertek (Chang, S. és munkatársai, Molec. Gén. Génét., 168, 111, 1979; Bibb és munkatársai, Natúré, 274, 398, 1978; Hinnen A. és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929, 1978). A 2-207781 számú japán szabadalomban eljárást írtak le Corynebacteriumok transzformálására.

A találmány szerinti DNS-szekvencia fentebb említett gazdasejtekben történő expresszálása érdekében a baktériumban hatékonyan működő promotert (például lac, trp, PL stb.) alkalmazhatunk, vagy ha a találmány szerinti DNS-szekvencia a foszfo-enolpiruvát-karboxiláz-gén promoterét tartalmazza, úgy az is alkalmazható. Más módon, ha gazdasejtként Corynebacteriumot alkalmazunk, a Brevibacterium nemzetségbe tartozó baktériumból származó, ismert trp promoter (62-244382 számújapán szabadalom) és hasonlók is alkalmazhatók.

HU 219 600 Β

Amint fentebb említettük, a találmány szerinti DNSszekvenciát önreplikációra képes vektor DNS-be inzertálhatjuk és bevihetjük a gazdasejtbe, hogy abban plazmidként legyen jelen, továbbá az is elfogadható, hogy a találmány szerinti DNS-szekvenciát transzpozon (Berg, D. E., és Berg, C. M., Bio/Technol., 1, 417, 1983), Mu fág (2-109985 számú japán szabadalom) vagy homológ rekombináció (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Láb., 1972) alkalmazásával végzett eljárással egy mikroorganizmus kromoszómájába integráljuk. A találmány szerinti DNS Corynebacteriumokba való beépítéséhez hőmérsékletre érzékeny plazmidot is alkalmazhatunk (5-7491 számú japán szabadalom).

A találmány szerinti DNS-szekvenciával fentiek szerint transzformált mikroorganizmust tenyésztve (és a bevitt DNS-t expresszálva) mutáns enzimet kapunk. Az enzimes reakciórendszerhez aszparaginsavat adva az enzimaktivitás mérésével kiderül, hogy a kapott mutáns enzim deszenzibilizált-e az aszparaginsav által kiváltott feedback gátlással szemben. Az enzimaktivitás méréséhez spektrometriás eljárás (Yoshinage, T., ízűi, K. és Katsuki, H., J. Biochem., 68, 747-750, 1970) és hasonlók alkalmazhatók.

A találmány szerinti DNS-szekvencia mutáns enzimet kódol, amely az aszparaginsav által kiváltott feedback gátlással szemben deszenzibilizált, s így az e DNSszekvenciát tartalmazó mikroorganizmus felhasználható az aszparaginsav- és glutaminsavcsaládba tartozó aminosavak hatékony fermentetatív termeléséhez.

A mutáns enzim géneket tartalmazó, alábbi példákban nyert AJ12907, AJ12908, AJ12909 és AJ12910 Escherichia coli törzseket 1993. augusztus 3-án a National Institute of Bioscience and Humán Technology of Agency of Industrial Science and Technologynál (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japán; postai irányítószám: 305) FERM P-13774, FERM P-13775, FERM P-13776, illetve FERM P-13777 deponálási számon helyeztük letétbe, illetve 1994. július 11-én, a Budapest Szerződés értelmében FERM BP-4734, FERM BP-4735, FERM BP-4736, illetve FERM BP-4737 deponálási számon nemzetközi letétbe helyeztük át.

Az aminosavak előállítási eljárása

Az aminosavak előállíthatok úgy, hogy a találmány szerinti DNS-szekvenciát tartalmazó mikroorganizmust megfelelő tápközegben tenyésztjük, és a képződött aminosavakat elkülönítjük. Az ilyen aminosavak példáiként az L-lizin, L-treonin, L-metionin, L-izoleucin, L-glutaminsav, L-arginin és L-prolin említhető.

Az alábbiakban az aminosayak előállításához alkalmazni kívánt, találmány szerinti DNS-szekvencia beviteléhez előnyben részesített gazdasejteket, valamint a tenyésztésükhöz alkalmazott eljárást írjuk le.

A találmány szerinti aminosavtermelési eljáráshoz előnyös gazdasejtek (i) A lizintermeléshez előnyösen alkalmazható gazdasejtek

A találmány szerinti lizintermeléshez alkalmazható gazdasejtek példáiként az Escherichia nemzetségbe tartozó mikroorganizmusokat említhetünk, előnyösen az

L-lizint termelő Escherichia colit. Közelebbről, egy lizinanalógra rezisztens mutáns törzset alkalmazhatunk. Az ilyen lizinanalóg gátolja az Escherichia nemzetségbe tartozó mikroorganizmusok növekedését (szaporodását), a gátlás azonban teljesen vagy részben deszenzibilizálható, feltéve, hogy az L-lizin is jelen van a tápközegben. Ilyen analógok például, az oxalizin, lizinhidroxamát, S-(2-amino-etil)-cisztein (a továbbiakban „AEC”), γ-metil-lizin, α-klór-kaprolaktám és hasonlók. Az e lizinanalógokkal szemben rezisztens mutáns törzseket úgy alakíthatjuk ki, hogy az Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumot hagyományos mesterséges mutációs kezelésnek vetjük alá. Az L-lizin termeléséhez alkalmazható baktériumtörzsként az AJ11442 Escherichia coli törzset említhetjük (FERM P-5084, lásd 56-18596 számú japán szabadalom, 471. oldal).

Másrészről, a Corynebacteriumok különböző, L-lizin termelésére alkalmas, mesterséges mutáns törzseit is felhasználhatjuk a találmány céljaira. Ilyen mesterséges, mutáns törzsek az AEC-rezisztens mutáns törzs; a növekedéséhez aminosavat, például L-homoszerint igénylő mutáns törzs (48-28078 és 56-6499 számú japán közrebocsátási irat); az AEC-vel szemben rezisztenciát mutató mutáns törzsek, amelyek például L-leucint, L-homoszerint, L-prolint, L-szerint, L-arginint, L-alanint, L-valint és hasonló aminosavakat igényelnek (3 708 395 és 3 825 472 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmak); L-lizint termelő mutáns törzs, amely rezisztens a DL-a-amino-a-kaprolaktámmal, aamino-lauril-laktámmal, kinoiddal, és N-lauril-leucinnal szemben; az oxálacetát-dekarboxiláz vagy a respirációs rendszer enziminhibitorára rezisztens L-lizin-termelő mutáns törzs (50-53588, 50-31093, 52-102498,. 53-86089, 55-9783, 55-9759, 56-32995 és 56-39778 számú japán szabadalmak és 53-43591 és 53-1833 számú japán közrebocsátási irat); inozitolt és ecetsavat igénylő L-lizin-termelő mutáns törzs (55-9748 és 56-8692 számú japán szabadalom); a fluor-piroszőlősavra vagy a 34 °C feletti hőmérsékletre érzékeny, L-lizin-termelő mutáns törzs; (55-9783 és 53-86090 számú japán szabadalom); és az etilénglikollal szemben rezisztens, L-lizin-termelő mutáns Brevibacterium és Corynebacterium törzs (lásd 4 411 997 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom).

A következőkben a lizintermeléshez alkalmazható konkrét coryneform baktériumokat soroljuk fel:

Brevibacterium lactofermentum AJ 12031 (FERM-BP277), lásd 60-62994 számú japán szabadalom, 525. oldal;

Brevibacterium lactofermentum ATCC 39134, lásd 60-62994 számú japán szabadalom, 473. oldal, jobb alsó hasáb;

Brevibacterium lactofermentum AAJ3463 (FERM-P1987), lásd 51-34477 számú japán szabadalom.

A fentieken kívül, az alábbi coryneform baktériumok szintén alkalmazhatók a találmány gyakorlati megvalósításában:

Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870 Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806

HU 219 600 Β

Corynebacterium callunae ATCC 15991

Corynebacterium glutamicum ATCC 13032

ATCC 13060 (Brevibacterium divaricatum) ATCC 14020 (Brevibacterium lactofermentum) ATCC 13869 (Corynebacterium lilium) ATCC 15990

Corynebacterium melassecola ATCC 17965

Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066

Brevibacterium immariophilum ATCC 14068

Brevibacterium roseum ATCC 13825

Brevibacterium flavum ATCC 13826

Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240

Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354 (ii) Az L-treonin termeléséhez előnyös gazdasejtek

Escherichia coli B-3996 (RIA 1867), lásd 3-501682 számú japán szabadalom (PCT);

Escherichia coli AJ12349 (FERM-P9574), lásd 2-458 számú japán szabadalom, 887. oldal, bal felső hasáb;

Escherichia coli AJ12351 (FERM-P9576), lásd 2-458 számú japán szabadalom, 887. oldal, jobb alsó hasáb;

Escherichia coli AJ12352 (FERM P-9577), lásd 2-458 számú japán szabadalom, 888. oldal, bal felső hasáb;

Escherichia coli AJ11332 (FERM P-4898), lásd 2-458 számú japán szabadalom, 889. oldal, bal felső hasáb;

Escherichia coli AJ1235O (FERM P-9575), lásd 2-458 számú japán szabadalom, 889. oldal, bal felső hasáb;

Escherichia coli AJ12353 (FERM P-9578), lásd 2-458 számú japán szabadalom, 889. oldal, jobb felső hasáb;

Escherichia coli AJ12358 (FERM P-9674), lásd 2-458 számú japán szabadalom, 890. oldal, bal felső hasáb;

Escherichia coli AJ12359 (FERM P-9675), lásd 2-458 számú japán szabadalom, 890. oldal, bal felső hasáb;

Escherichia coli AJ11334 (FERM P-4900), lásd 1-29559 számú japán közrebocsátási irat, 201. oldal,

6. hasáb;

Escherichia coli AJ11333 (FERM P-4899), lásd 1-29559 számú japán közrebocsátási irat, 201. oldal,

6. hasáb;

Escherichia coli AJ11335 (FERM P-4901), lásd 1-29559 számú japán közrebocsátási irat, 202. oldal,

7. hasáb.

Az alábbi baktériumtörzseket az alkalmazható coryneform baktériumok példáiként soroljuk fel:

Brevibacterium lactofermentum AJ11188 (FERM P-4190), lásd 60-87788 számú japán szabadalom, 473. oldal, jobb felső hasáb;

Corynebacterium glutamicum AJ 11682 (FERM BP-118), lásd 2-31956 számú japán közrebocsátási irat, 230. oldal, 8. hasáb);

Brevibacterium flavum AJ11683 (FERM BP-119), lásd 2-31956 számú japán közrebocsátási irat, 231. oldal, 10. hasáb).

(iii) Az L-metionin termeléséhez előnyös gazdasejtek

Az alábbi baktériumtörzseket az L-metionin termeléséhez alkalmazható baktériumok példáiként soroljuk fel:

Escherichia coli AJ11457 (FERM P-5175), lásd 56-35992 számú japán szabadalom, 552. oldal, jobb felső hasáb;

Escherichia coli AJ11458 (FERM P—5176), lásd 56-35992 számú japán szabadalom, 552. oldal, jobb felső hasáb;

Escherichia coli AJ11459 (FERM P-5177), lásd 56-35992 számú japán szabadalom, 552. oldal, jobb felső hasáb;

Escherichia coli AJ11539 (FERM P-5479), lásd 56-144092 számú japán szabadalom, 435. oldal, bal alsó hasáb;

Escherichia coli AJ11540 (FERM P-5480), lásd 56-144092 számú japán szabadalom, 435. oldal, bal alsó hasáb;

Escherichia coli AJ11541 (FERM P-5481), lásd 56-144092 számú japán szabadalom, 435. oldal, bal alsó hasáb;

Escherichia coli AJ11542 (FERM P-5482), lásd 56-144092 számú japán szabadalom, 435. oldal, bal alsó hasáb.

(iv) Az L-aszparaginsav termeléséhez előnyös gazdasejtek

Az alábbi baktériumtörzseket az L-aszparaginsav termeléséhez alkalmazható baktériumok példáiként soroljuk fel:

Brevibacterium flavum AJ3859 (FERM P-2799), lásd 51-61689 számú japán szabadalom, 524. oszlop, bal felső hasáb;

Brevibacterium lactofermentum AJ3860 (FERM: P-2800), lásd 51-61689 számú japán szabadalom, 524. oszlop, bal felső hasáb;

Corynebacterium acetoacidophilum AJ3877 (FERM P-2803), lásd 51-61689 számú japán szabadalom, 524. oszlop, bal felső hasáb;

Corynebacterium glutamicum AJ3876 (FERM P-2802), lásd 51-61689 számú japán szabadalom, 524. oszlop, bal felső hasáb.

(v) Az L-izoleucin termeléséhez előnyös gazdasejtek

Az Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumok példájaként az Escherichia coli KX141 törzset (VKPM-B4781) (lásd 4-33027 számú japán szabadalom, 45. szakasz), míg a coryneform baktériumok példáiként a Brevibacterium lactofermentum AJ12404 törzset (FERM P—10141) (lásd 2-42988 számú japán szabadalom, 603. oldal, bal alsó hasáb) és a Brevibacterium flavum AJ12405 törzset (FERM P-10142) (lásd 2-42988 számú japán szabadalom, 524. oldal, bal alsó hasáb) említjük.

(vi) Az L-glutaminsav termeléséhez előnyös gazdasejtek

Az Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumok példáiként az alábbi baktériumtörzseket említjük:

Escherichia coli AJ12628 (FERM P-12380), lásd 2 680 178 számú francia közrebocsátási irat (1993);

Escherichia coli AJ2624 (FERM P-12379), lásd 2 680 178 számú francia közrebocsátási irat (1993).

HU 219 600 Β

Az alábbi baktériumtörzseket a coryneform baktériumok példáiként soroljuk fel:

Brevibacterium lactofermentum AJ12745 (FERM BP-2922), lásd 3-49690 számú japán szabadalom,

561. oldal, jobb alsó hasáb;

Brevibacterium lactofermentum AJ12746 (FERM BP-2923), lásd 3-49690 számú japán szabadalom,

562. oldal, bal felső hasáb;

Brevibacterium lactofermentum AJ12747 (FERM BP-2924), lásd 3-49690 számú japán szabadalom, 562. oldal, bal felső hasáb;

Brevibacterium lactofermentum AJ12748 (FERM BP-2925), lásd 3-49690 számú japán szabadalom, 562. oldal, bal felső hasáb;

Brevibacterium flavum ATCC 14067 (lásd 5-3793 számú japán szabadalom, 3. oldal, 1. táblázat);

Brevibacterium glutamicum ATCC 21492, (lásd 5-3793 számú japán szabadalom, 3. oldal, 1. táblázat).

(vii) Az L-arginin termeléséhez előnyös gazdasejtek

Az alábbi baktériumtörzseket az Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumok példáiként soroljuk fel:

Escherichia coli AJ11593 (FERM P-5616), lásd 57-5693 számú japán szabadalom, 468. oldal, bal felső hasáb;

Escherichia coli AJ11594 (FERM P-5617), lásd 57-5693 számú japán szabadalom, 468. oldal, jobb felső hasáb.

Az alábbi baktériumtörzseket a coryneform baktériumok példáiként említjük:

Brevibacterium flavum AJ12144 (FERM P-7642), lásd 5-27388 számú japán közrebocsátási irat, 174. oldal, 4. hasáb;

Corynebacterium glutamicum AJ12145 (FERM P-7643), lásd 5-27388 számú japán közrebocsátási irat, 174. oldal, 4. hasáb;

Brevibacterium flavum ATCC 21493, lásd 5-3793 számú japán szabadalom, 3. oldal, 1. táblázat;

Corynebacterium glutamicum ATCC 21659, lásd 5-3793 számú japán szabadalom, 3. oldal, 1. táblázat.

(viii) Az L-prolin termeléséhez előnyös gazdasejtek

Az alábbi baktériumtörzseket az Escherichia nemzetségbe tartozó baktériumok példáiként soroljuk fel:

Escherichia coli AJ11543 (FERM P-5483), lásd 56-144093 számú japán szabadalom, 435. oldal, bal alsó hasáb;

Escherichia coli AJ11544 (FERM P-5484), lásd 56-144093 számú japán szabadalom, 435. oldal, bal alsó hasáb.

Az alábbi baktériumtörzseket a coryneform baktériumok példáiként említjük:

Brevibacterium lactofermentum AJ11225 (FERM P-4370), lásd 60-87788 számú japán szabadalom, 473. oldal, bal felső hasáb;

Brevibacterium flavum AJ11512 (FERM P—5332), lásd 62-36679 számú japán szabadalom, 185. oldal, 2. hasáb;

Brevibacterium flavum AJ11513 (FERM P-5333), lásd 62-36679 számú japán szabadalom, 185. oldal, 2. hasáb;

Brevibacterium flavum AJ11514 (FERM P-5334), lásd 62-36679 számú japán szabadalom, 185. oldal, 2. hasáb;

Corynebacterium glutamicum AJ11533 (FERM P-5342), lásd 62-36679 számú japán szabadalom, 185. oldal, 2. hasáb;

Corynebacterium glutamicum AJ11523 (FERM P-5343), lásd 62-36679 számú japán szabadalom, 185. oldal, 2. hasáb.

Tenyésztési eljárás

A fentebb említett gazdasejtek tenyésztési eljárása nem különbözik lényegesen az aminosavtermelő mikroorganizmusok hagyományos tenyésztési módszerétől. A tenyésztéshez szokványos tápközeget alkalmazunk, amely szén- és nitrogénforrást, szervetlen ionokat, és adott esetben szerves tápanyag-kiegészítőket (például aminosavakat, vitaminokat és hasonlókat) tartalmaz.

Szénforrásként glükózt, szacharózt, laktózt és hasonlókat, valamint keményítőhidrolizátumot, tejsavót, melaszt és hasonlókat alkalmazhatunk. Nitrogénforrásként ammóniagázt, vizes ammóniumoldatot, ammóniumsót és hasonlókat használhatunk. Amennyiben gazdasejtként olyan mutáns törzset alkalmazunk, amely az aminosavtermeléshez tápanyag-kiegészítőket igényel, a tápanyaghoz az adott törzs által igényelt megfelelő tápanyagokat (például aminosavakat vagy hasonlókat) kell adni. A lizintermeléshez alkalmas tápközeg egy példáját az I. táblázatban mutatjuk be (a kalcium-karbonátot az elkülönített sterilizálás után adjuk a többi komponenshez).

I. táblázat

Tápközegkomponens	Elegyítcsi koncentráció
Glükóz	5 g/dl
(NH4)2SO4	2,5 g/dl
kh2po4	0,2 g/dl
MgSO4-7H2O	0,1 g/dl
Élesztőkivonat	0,05 g/dl
Tiamin-hidroklorid	i pg/i
Biotin	300 pg/l
FeSO4 -7 H2O	1 pg/dl
MnSO4-4H2O	1 pg/dl
Kalcium-karbonát (pH=7,0)	2,5 g/dl

A tenyésztést az aminosavak termelődésének és felhalmozódásának befejeződéséig végezzük, miközben anaerob körülmények között a tápközeg pH-ját és hőmérsékletét megfelelően szabályozzuk. A tenyésztő tápközegben felhalmozódott aminosavak összegyűjtéséhez hagyományos eljárást alkalmazhatunk.

Az ábrák rövid leírása

Az 1. ábrán a 3-bróm-piroszőlősav növekedésgátló hatását mutatjuk be.

A 2. ábrán az aszpartát-p-hidrazid növekedésgátló hatását mutatjuk be.

A 3. ábrán a DL-treo-P-hidroxi-aszpartát növekedésgátló hatását mutatjuk be.

HU 219 600 Β

A 4. ábrán a gátlást megszüntető anyagok 3-brómpiroszőlősavra gyakorolt hatását mutatjuk be.

Az 5. ábrán a gátlást megszüntető anyagok aszpartát-p-hidrazidra gyakorolt hatását mutatjuk be.

A 6. ábrán a gátlást megszüntető anyagok DL-treoβ-hidroxi-aszpartátra gyakorolt hatását mutatjuk be.

A 7. ábrán a növekedést helyreállító faktorok növekedésre gyakorolt hatását mutatjuk be.

A 8. ábrán a foszfo-enolpiruvát-karboxiláz növekedésgátló anyagok által történő gátlását mutatjuk be.

A 9. ábrán a találmány szerinti foszfo-enolpiruvátkarboxiláz aszparaginsav által történő gátlását mutatjuk be.

A 10. ábrán a találmány szerinti foszfo-enolpiruvát-karboxiláz aszparaginsav által történő gátlását mutatjuk be.

All. ábrán a foszfo-enolpiruvát-karboxiláz-gén mutációs módszerét mutatjuk be.

A 12. ábrán az aszparaginsav vad típusú, illetve mutáns foszfo-enolpiruvát-karboxiláz (melyben az N-terminálistól számított 438. arginint ciszteinnel helyettesítettük) aktivitására gyakorolt hatását mutatjuk be.

A 13. ábrán az aszparaginsav vad típusú, illetve mutáns foszfo-enolpiruvát-karboxiláz (melyben az N-terminálistól számított 620. lizint szérűinél helyettesítettük) aktivitására gyakorolt hatását mutatjuk be.

A továbbiakban a találmányt a példák segítségével jellemezzük részletesebben.

1. példa

A mutáns foszfo-enolpiruvát-karboxiláz-gén előállítása

A pS2 plazmid alkalmazásával mutáns gént állítottunk elő. A pS2 plazmidot úgy kaptuk, hogy egy klónozott (és meghatározott bázisszekvenciával rendelkező) foszfo-enolpiruvát-karboxiláz-gént a pBR322 plazmidvektor Sáli helyére inzertáltunk. A pS2 plazmid ampicillinrezisztenciamarker-gént tartalmaz (Sabe, H. és munkatársai, Gene, 31, 279-283, 1984). A pS2 plazmidban található foszfo-enolpiruvát-karboxiláz-gén nukleotidszekvenciája megegyezik a fentebb említett pT2 plazmidban lévő génével.

A pS2 DNS-t 75 °C-on két óra hosszat hidroxilamin-oldattal [20 pg/ml pS2 DNS, 0,05 M nátriumfoszfát (pH=6,0), 1 mM EDTA, 0,4 M hidroxil-amin] kezeltük. A pH hidroxil-aminos kezelést befolyásoló hatása miatt 1 M hidroxil-amin HC1 és 1 mM EDTA (nátrium-hidroxiddal pH=6,0-ra beállított) 80 pl oldatát, 0,1 M nátrium-foszfát (pH=6,0) és 1 mM EDTA 100 pl oldatát, és 2 pg pS2 DNS-t tartalmazó TE puffért (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) elegyítettünk, és az elegy térfogatát vízzel 200 pl-re egészítettük ki.

A fenti feltételek mellett a kezelés után pS2 plazmiddal transzformált Escherichia coli HB101 transzformánsok túlélési aránya 0,2% (az ampicillintartalmú tápközegben végzett kezelés előtti állapothoz viszonyítva).

A HB101 Escharichia coli törzset hidroxil-aminnal kezelt pS2 plazmiddal transzformáltuk, és a sejteket ampicillint tartalmazó szilárd táptalajra kentük, miáltal körülbelül 10 000 transzformáns telepet kaptunk. Ezeket folyékony tápközegben szuszpendáltuk, majd a szuszpenziót az aszparaginsav analógjaként (a minimális gátlókoncentrációhoz közeli mennyiségben) 3bróm-piroszőlősavat (3BP), aszpartát^-hidroxamátot (AHX), aszpartát^-hidrazidot (AHY) vagy DL-treo-βhidroxi-aszpartátot (βΗΑ) tartalmazó táptalajra kentük, csészénként 10³—10⁵ sejtmennyiségben, és a növekvő telepeket szelektáltuk.

Az így kapott 100 (analóg vegyületre rezisztens) törzsből előállított foszfo-enolpiruvát-karboxilázt a The Journal of Biochemistryben (67. évfolyam, 4. szám, 1970) leírt eljárás szerint részlegesen tisztítottuk, és vizsgáltuk az enzimaktivitás analóg vegyületek által történő gátlását. Az enzimaktivitás mérését a fentebb leírtakkal azonos módon végeztük.

A plazmidokat olyan mutáns enzimeket termelő baktériumtörzsekből izoláltuk, amelyeket az analóg vegyületek nem gátoltak, és az izolált plazmidokat a PCR1 Escherichia coli foszfo-enolpiruvát-karboxilázhiányos törzsbe vittük be (Sabe, H. és munkatársai, Gene, 31, 279-283,1984), hogy igazoljuk a mutáns enzimek termelődését.

Ilyen módon öt transzformánst kaptunk, melyek mutáns enzimgént tartalmaztak. A mutáns gének bázisszekvenciájának meghatározásával megállapítottuk, hogy két törzs azonos mutációval rendelkezett, és összesen négyféle mutáns gént kaptunk. A mutáns géneket tartalmazó transzformánsokat AJ12907, AJ12908, AJ12909 és AJ12910 jelöléssel azonosítottuk, és ezeket 1993. augusztus 3-án a National Institute of Bioscience and Humán Technology of Agency of Industrial Science and Technologynél (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japán; postai irányítószám: 305) FERNt P-13774, FERM P-13775, FERM P-13776, illetve FERM P-13777 deponálási számon helyeztük letétbe, és 1994. július 11-én, a Budapest Szerződés értelmében FERM BP-4734, FERM BP-4735, FERM BP-4736, illetve FERM BP-4737 deponálási számon nemzetközi letétbe helyeztük át. Az e törzsek által hordozott plazmidokat az előbbi sorrendben pBP5, pHA19, pBP122, illetve PR6 jelöléssel azonosítottuk. A plazmidokban lévő foszfo-enolpiruvát-karboxiláz-gén mutációit a II. táblázatban mutatjuk be. A táblázatban feltüntetett exponens értékek az 1. számú szekvenciának megfelelő nukleotidés aminosavsorszámokat jelzik.

11. táblázat

Transzformáns	Plazmid	Mutáció	A mutációval kapcsolatos aminosavcsere
AJ13907	pBP5	2109G-»A	625Glu->Lys
AJ12908	pHA19	‘^'G—>A »’G+A	222Arg-»His 223Glu-»Lys
AJ12909	pBP122	109í>C->T iioig->A 1889G->A 2646G->A	288Ser—>Phe 289Glu-»Lys 551Met->IIe 804Glu->Lys
AJ12910	pR6	2835Q—>A	867Ala->Thr

HU 219 600 Β

A szelekciót az AJ12907 és AJ12909 transzformáns esetében 500 pg/ml 3BP-t tartalmazó tápközegben, az AJ12908 transzformáns esetében 1000 pg/ml βΗΑ-t tartalmazó tápközegben, míg az AJ12910 transzformáns esetében 500 pg/ml AHY-t tartalmazó tápközegben végeztük.

2. példa

Mutáns foszfo-enolpiruvát-karboxiláz

Az előző példában említett négy transzformáns által termelt foszfo-enolpiruvát-karboxiláz aszparaginsavra mutatott érzékenységét vizsgáltuk. Ezek a baktériumtörzsek nem tartalmaznak a gazdából származó foszfoenolpiruvát-karboxiláz-gént, így a termelődött foszfoenolpiruvát-karboxiláz a plazmidból származik.

Az aszparaginsavra mutatott érzékenységet ismert eljárás szerint vizsgáltuk (Yoshinaga, T., ízűi, K. és Katsuki, H., J. Biochem., 68, 747-750,1970). Az említett transzformánsok, illetve a pS2 plazmidot tartalmazó Escherichia coli sejtek által termelt enzimaktivitás 0,1 mM, illetve 1 mM acetil-koenzim A jelenlétében (melyről ismert, hogy aktivitásmérési rendszerben befolyásolja az aktivitást) végzett mérésével az aszparaginsavra mutatott érzékenységre a 9. és 10. ábrán látható eredményeket kaptuk.

Az eredmények alapján nyilvánvaló, hogy a vad típusú enzim nagy koncentrációjú aszparaginsav jelenlétében elveszíti aktivitását, míg a találmány szerinti mutáns foszfo-enolpiruvát-karboxiláz lényegében folyamatosan megtartja aktivitását.

3. példa

Az L-treonin fermentációs előállítása bevitt mutáns foszfo-enolpiruvát-karboxilázzal rendelkező Escherichia coli alkalmazásával

A jelenleg ismert treonintermelő Escherichia coli baktériumok közül a B-3996 törzs (3-501682 számú japán szabadalom, PCT) rendelkezik a legnagyobb termelékenységgel. Ilyenformán a mutáns foszfo-enolpiruvát-karboxiláz értékeléséhez a B-3996 törzset alkalmaztuk gazdasejtként. A B-3996 törzset a Research Institute fór Genetics and Industrial Microorganism Breedingnél RIA 1867 deponálási számon helyezték letétbe. Az értékelni kívánt mutáns foszfo-enolpiruvátkarboxilázként a pPB5-öt választottuk ki, és ezt alkalmaztuk a kísérletekben.

A mutáns foszfo-enolpiruvát-karboxiláz-gént tartalmazó pBP5 plazmidot Hanahan eljárása szerint (J. Mól. Bioi., 106, 577, 1983) Escherichia coli B-3996 törzsbe vittük be, és transzformánst izoláltunk. Kontrollként Escherichia coli B-3996 törzset azonos módon pS2 plazmiddal (amely a vad típusú foszfo-enolpiruvátkarboxiláz-gént expresszálja) transzformáltunk.

Az Escherichia coli B-3996 törzset, illetve az abból származó transzformánsokat 500 ml-es Sakaguchilombikban 20 ml tápközegbe (összetételét lásd III. táblázat) helyeztük, 37 °C-on 40 óra hosszat tenyésztettük, és vizsgáltuk a termelődött L-treonin mennyiségét. A kapott eredményeket a IV. táblázatban foglaljuk össze. Az említett tápközeget két részre osztottuk: a glükóz és a

MgSO₄-7 H₂O, illetve a többi komponens alkotta részre, amelyek pH-ját kálium-hidroxiddal 7,0-re állítottuk be, majd 10 percig 115 °C-on autoklávoztuk, és összekeverésük után a külön sterilizált kalcium-karbonátot 30 g/dm³ mennyiségben adtuk az elegyhez.

III. táblázat

Komponens	Elegyítési koncentráció (g/dm3)
Glükóz	40
(NH4)2SO4	16
kh2po4	1
MgSO4-7H2O	1
FeSO4-7H2O	0,01
MnSO4-5H2O	0,01
Élesztőkivonat (Difco)	2
L-Met	0,5
Kalcium-karbonát	30

IV. táblázat

Baktériumtörzs	Treonintermelés mennyisége (g/dm3)
Escherichia coli B-3996	15,7
Escherichia coli B-3996/pS2	15,8
Escherichia coli B-3996/PBP5	16,8

Az eredmények alapján jól látható, hogy a találmány szerinti DNS-szekvenciával rendelkező mutáns enzimexpressziós plazmidot tartalmazó Escherichia coli B-3996/pBP5 törzs a vad típusú enzimet expresszáló plazmidot tartalmazó Escherichia coli B-3996/pS2 törzshöz képest fokozott treonintermelő képességet mutat.

4. példa

Az L-glutaminsav fermentációs előállítása bevitt mutáns foszfo-enolpiruvát-karboxilázzal rendelkező Escherichia coli alkalmazásával

A jelenleg ismert glutaminsavtermelő Escherichia coli baktériumok közül az Escherichia coli AJ-12628 törzs (lásd 4-11461 számú japán szabadalom) rendelkezik a legnagyobb termelékenységgel. Ilyenformán, a mutáns foszfo-enolpiruvát-karboxiláz értékeléséhez ezt a törzset alkalmaztuk gazdasejtként.

Az AJ-12628 törzset a National Institute of Bioscience and Humán Technology of Agency of Industrial Science and Technologynál FERM BP-385 deponálási számon helyezték letétbe. Az értékelni kívánt mutáns foszfo-enolpiruvát-karboxilázként a pBP5 plazmidot választottuk ki.

A mutáns foszfo-enolpiruvát-karboxiláz-gént tartalmazó pBP5 plazmidot Hanahan eljárása szerint (J. Mól. Bioi., 106, 577, 1983) Escherichia coli AJ-12628 törzsbe vittük be, és transzformánst izoláltunk. Hasonló

HU 219 600 Β módon, pS2 plazmidot tartalmazó Escherichia coli AJ-12628 transzformánst is izoláltunk.

Az Escherichia coli AJ-12628 törzset, illetve az abból származó transzformánsokat 500 ml-es Sakaguchilombikban 20 ml tápközegbe (összetételét lásd V. táblázat) helyeztük, 37 °C-on 36 óra hosszat tenyésztettük, és vizsgáltuk a termelődött L-glutaminsav mennyiségét. A kapott eredményeket a VI. táblázatban foglaljuk össze. Az említett tápközeget két részre osztottuk; glükóz és MgSO₄-7 H₂O, illetve a többi komponens alkotta részre, melyek pH-ját kálium-hidroxiddal 7,0-re állítottuk be, majd 10 percig 115 °C-on autoklávoztuk, és összekeverésük után a külön sterilizált kalcium-karbonátot 30 g/dm³ mennyiségben adtuk az elegyhez.

V. táblázat

Komponens	Elegyítési koncentráció (g/dm3)
Glükóz	40
(NH4)2so4	16
kh2po4	1
MgSO4-7H2O	1
FeSO4-7H2O	0,01
MnSO4-5H2O	0,01
Élesztőkivonat (Difco)	2
Kalcium-karbonát	30

VI. táblázat

Baktériumtörzs	Treonintcrmelés mennyisége (g/dm3)
Escherichia coli AJ-12628	18,0
Escherichia coli AJ-12628/pS2	18,3
Escherichia coli AJ-12628/pBP5	19,6

Az eredményekből jól látható, hogy a találmány szerinti DNS-szekvenciával rendelkező mutáns enzimexpressziós plazmidot tartalmazó Escherichia coli AJ- 12628/pBP5 törzs a vad típusú enzimet expresszáló plazmidot tartalmazó Escherichia coli AJ-12628/pS2 törzshöz képest javított glutaminsavtermelő képességet mutat.

5. példa

Expressziós plazmid előállítása coryneform baktériumokhoz (és L-lizin előállítása bevitt mutáns foszfoenolpiruvát-karboxilázzal rendelkező coryneform baktérium alkalmazásával)

Annak érdekében, hogy egy coryneform baktériumba mutáns gént vigyünk be, és azt expresszáljuk, egy Brevibacterium nemzetségbe tartozó baktériumból származó promotert nyertünk ki, amit expressziós plazmid előállítása érdekében a mutáns génnel ligáltunk. A kapott plazmid az L-lizin termelése érdekében Brevibacterium nemzetségbe tartozó baktériumba vihető be.

(1) Brevibacterium nemzetségbe tartozó baktériumból származó aszpartokináz (AK)-gén előállítása

Szokványos eljárással egy vad Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) törzsből (ATCC 13869) kromoszomális DNS-t készítettünk. Ebből a kromoszomális DNS-ből polimeráz-láncreakcióval (PCR; lásd White, T. J. és munkatársai, Trends Génét., 5, 185,1989) AK-gént amplifikáltunk. Az amplifikációban DNS-primerként egy 23-mer oligonukleotidot (3. számú szekvencia) és egy 21-mer oligonukleotidot (4. számú szekvencia) szintetizáltunk, hogy a Corynebacterium glutamicumban ismert szekvencia alapján [lásd Molecular Microbiology, 5 (5), 1197-1204, 1991; és Mól. Gén. Génét., 224, 317-324, 1990] egy körülbelül 1643 bp hosszúságú, AK-gént kódoló régiót amplifikáljunk.

A DNS-szintézist 380B DNS-szintetizátor (Applied Biosystems Co.) alkalmazásával a szokványos foszforamidit-eljárás alapján végeztük (lásd Tetrahedron Letters, 22, 1859, 1981). A PCR-reakcióhoz DNS Thermal Cycler PJ2000 típusú PCR-készüléket (Takara Shuzo Co., Ltd.) alkalmaztunk, és a génamplifikációt Taq polimeráz alkalmazásával, a gyártó útmutatásai szerint végeztük.

Agarózgél-elektroforézissel 1643 kb-os amplifikált génfragmenst azonosítottunk, majd a gélről kivágott fragmenst hagyományos eljárással tisztítottuk, és Nrul (Takara Shuzo Co., Ltd.) és EcoRI (Takara Shuzo Co., Ltd.) restrikciós enzimekkel hasítottuk. A génfragmens klónozóvektoraként pHSG399-et (lásd Takeshita, S. és munkatársai, Gene, 61, 63-74, 1987) alkalmaztunk. Ezt a vektort Smal (Takara Shuzo Co., Ltd.) és EcoRI restrikciós enzimekkel hasítottuk, és az amplifikált AK-gén-fragmenssel ligáltuk.

A DNS-t DNS-ligáló készlet (Takara Shuzo Co., Ltd.) alkalmazásával ligáltuk. A ligálás során olyan plazmidot állítottunk elő, amelyben a pHSG399 vektort a Brevibacterium kromoszómából amplifikált AK-génfragmenssel ligáltuk. Az ATCC 13869 deponálási számú (vad) törzsből származó AK-génnel rendelkező plazmidot p399AKY-nak neveztük el.

(2) A Brevibacterium lactofermentum AK-génje bázisszekvenciájának meghatározása

A p399AKY plazmid előállítása után Sanger és munkatársai eljárása szerint (F. Sanger és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463,1977) meghatároztuk az AK-gén bázissorrendjét. A szekvenálás eredményét az 5. és 7. számú szekvenciákban mutatjuk be. A DNSfragmensek két nyitott leolvasási kerettel rendelkeznek, amelyek az AK α-, illetve β-alegységének felelnek meg. Az 5. és 7. számú szekvenciában a nyitott leolvasási kereteknek megfelelő aminosavszekvenciákat a nukleotidszekvenciákkal együtt tüntetjük fel, míg a 6. és 8. számú szekvenciában a nyitott leolvasási kereteknek megfelelő aminosavszekvenciákat önmagukban mutatjuk be.

(3) Foszfo-enolpiruvát-karboxiláz expressziós plazmid előállítása

A vad típusú foszfo-enolpiruvát-karboxiláz-gént tartalmazó pS2 plazmidból, és a mutáns foszfo-enolpiruvát-karboxiláz-gént tartalmazó pBP5 plazmidból körülbelül 4,4 kb-os Sáli fragmenst vontunk ki, és ezt a

HU 219 600 Β fragmenst az Escherichia colihoz általánosan alkalmazott pHSG399 plazmidvektor Sáli helyére inszertáltuk. A kapott plazmidokat pHS2-nek (vad típus) és pHBP5nek (mutáns) neveztük el.

Annak érdekében, hogy a pHS2 és pHB5 plazmidot Brevibacteriumban expresszálható plazmiddá alakítsuk, Brevibacteriumban működőképes promotert és replikációs kezdőhelyet adtunk hozzájuk. Promoterként a bázisszekvencia 1. Nrul helyétől a 207. ApaLI helyéig teijedő ffagmensét tartalmazó génfragmenst (melyről feltételeztük, hogy a klónozott AK-gén promoterrégiója) hasítottuk ki a p399AKY plazmidból, és ezt a pHS2 és a pHBP5 strukturális génjei előtt körülbelül 60 bp távolságban lévő Aval helyre inzertáltuk, hogy a transzkripció szabályos irányban történjen.

Ezután a vektorba olyan génfragmenst építettünk be (nevezetesen a plazmid replikációs kezdőhelyét), amely lehetővé teszi a plazmid Brevibacteriumban történő autonóm replikációját. A plazmid replikációs kezdőhelyét tartalmazó génfragmenst a Brevibacteriumhoz alkalmazható pHC4 vektorból vontuk ki (lásd 5-7491 számú japán szabadalom, 10. szakasz; az ugyanezen plazmidot tartalmazó Escherichia coli AJ12039 törzset a National Institute of Bioscience and Humán Technology of Agency of Industrial Science and Technologynál FERM P-12215 deponálási számon helyeztük letétbe), és a restrikciós enzimes hasítási helyeket linkerek bevitelével mindkét terminálison PstI helyekre változtattuk.

Ezt a fragmenst a Brevibacteriumbol származó promoterrel együtt a plazmid vektorrészében lévő PstI helyre vittük be. A pS2-ből származó vad típusú foszfoenolpiruvát-karboxiláz-plazmidot pHS2B-nek, a pBP5ből származó mutáns foszfo-enolpiruvát-karboxilázplazmidot pedig pHBP5B-nek neveztük el.

(4) L-lizin előállítása foszfo-enolpiruvát-karboxiláz expressziós plazmid alkalmazásával (referenciapélda)

A pHS2B és pHBP5B plazmidot külön-külön Llizint termelő Brevibacterium lactofermentum AJ3463 törzsbe (lásd 51-34477 számú japán közrebocsátási irat) vittük be. A gén beviteléhez elektromos impulzust alkalmazó transzformációs eljárást használtunk (lásd 2-207791 számú japán szabadalom). A gazdatörzset és a transzformánsokat 31,5 °C-on 72 óra hosszat keverve lizintermelő tápközegben (összetételét lásd VII. táblázat) tenyésztettük. A tápközeget úgy állítottuk elő, hogy a táblázatban felsorolt komponenseket, a kalciumkarbonát kivételével, 1 dm³ vízhez adtuk, és az oldat pH-ját kálium-hidroxiddal 8,0-ra állítottuk be, majd a hővel sterilizált kalcium-karbonátot is hozzáadtuk az oldathoz. Az tápközegben a tenyésztés után felhalmozódott L-lizin mennyiségét a VIII. táblázatban mutatjuk be.

VII. táblázat

Komponens	Elegyítést koncentráció
Glükóz	100 g/dm3
(NH4)2SO4	55 g/dm3

Komponens	Elegyítést koncentráció
Szójabab-koncentrátum*	35 ml/dm3
KH2PO4	1 g/dm3
MgSO4-7H20	1 g/dm3
Β,-vitamin	20 g/dm3
Biotin	5 g/dm3
Nikotinsavamid	5 mg/dm3
FeSO4-7H2O	0,01 g/dm3
MnSO4-5H20	0,01 g/dm3
CaCO3	50 g/dm3

* Az Ajinomoto Co., Ltd. terméke (márkanév: Mamenou).

Vili. táblázat

Baktériumtörzs	Lizintermelés (g/dm3)
Brevibacterium lactofermentum AJ3463	20,0
Brevibacterium lactofermentum AJ3463/pHS2B	22,0
Brevibacterium lactofermentum AJ3463/pHBP5B	25,0

Az eredményekből látható, hogy a találmány szerinti DNS-szekvenciát tartalmazó, mutáns enzimexpressziós plazmiddal rendelkező Brevibacterium lactofermentum AJ3463/pHBP5B törzs a vad típusú enzimet expresszáló plazmidot tartalmazó Brevibacterium lactofermentum AJ3463/pHS2B törzshöz képest javított lizintermelő képességet mutat.

6. példa

A találmány szerinti mutáns foszfo-enolpiruvátkarboxiláz és az ezt kódoló gén (1)Λ mutáns foszfo-enolpiruvát-karboxiláz-gén előállítása

A mutáns foszfo-enolpiruvát-karboxilázt kódoló DNS előállításához pT2 plazmidba klónozott foszfoenolpiruvát-karboxiláz-gént alkalmaztunk.

A pT2 plazmidot tartalmazó gazdaként előnyösen olyan mikroorganizmust alkalmazunk, amelyből hiányzik a foszfo-enolpiruvát-karboxiláz-gén, hogy csak a plazmidból származó foszfo-enolpiruvát-karboxilázaktivitást detektáljuk. Ilyen deficiens törzsként Escherichia coli FI5 törzset [Hfr, recAl, met, delta(ppcargECBH), TnlO] alkalmaztunk. A pT2 plazmidot tartalmazó Escherichia coli AJ-12873 törzset a National Institute of Bioscience and Humán Technology of Agency of Industrial Science and Technologynál (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken. Japán; postai irányítószám: 305) FERM P-13752 deponálási számon 1993. július 15-én helyeztük letétbe, illetve 1994.

HU 219 600 Β július 11-én, a Budapest Szerződés értelmében FERM BP-4732 deponálási számon nemzetközi letétbe helyeztük át. A pT2 teljes bázisszekvenciáját az 1. számú szekvenciában mutatjuk be.

Annak érdekében, hogy a foszfo-enolpiruvát-karboxiláz 438. argininjét kódoló kodont pT2 plazmid alkalmazásával ciszteint kódoló kodonra cseréljük, polimeráz-láncreakció (PCR) felhasználásával az átfedőextenzió-eljárást (Ho, S. N., Hunt, H. D., Horton, R. M., Pulién, J. K. és Pease, L. R., Gene, 77, 51-59,1989) alkalmaztuk.

A PCR-technika olyan eljárás, melyben amplifikációs ciklusokat ismétlünk. A ciklusok során melegítéssel kétszálú DNS-t egyszálú DNS-sé denaturálunk, a hővel denaturált DNS-t az amplifikálni kívánt szekvencia két végének megfelelő oligonukleotid-primerekkel hibridizáljuk, és a fentebb említett oligonukleotidokat printerekként alkalmazva polimeráz-láncreakciót végzünk, miáltal exponenciális növekedéssel a fentebb említett DNS-szekvenciát amplifikáljuk.

All. ábrán PCR-technika alkalmazásával helyspecifikus mutációval módosított régiót mutatunk be. A találmányban négy prímért alkalmaztunk; a 438. arginin kodonja környékén elhelyezkedő szekvenciával rendelkező „c” prímért (11. számú szekvencia, amely az 1. számú szekvenciában az 1535-1554. bázisoknak felel meg); a „c” printerrel komplementer szekvenciával rendelkező „b” prímért (10. számú szekvencia); az előbbitől 5’-irányban elhelyezkedő szekvenciával rendelkező „a” prímért (9. számú szekvencia, amely az 1. számú szekvenciában az 1185-1200. bázisoknak felel meg), valamint egy 3'-szekvenciával komplementer „d” prímért (12. számú szekvencia, amely az 1. számú szekvenciában a 2327-2342. bázisoknak felel meg).

A „b” és „c” printerben a 438. arginin kodonját (CGT) ciszteint kódoló kodonnal (TGT) helyettesítettük (a helyettesítést TGC kodonnal is végezhetjük, amely szintén a ciszteint kódolja). Ezenkívül a 435. aszparagin kodonjának (AAC) citozinját (C) timinnel (T) helyettesítettük, miáltal aminosavcsere nélkül egy belső EcoRI helyet vittünk be, melynek indexként való alkalmazásával szelektálható a mutáns plazmid. Ez a mutáció azonban a találmány szempontjából nem kulcsfontosságú.

Amikor a PCR-reakciót templátként pT2 DNS, primerekként pedig „a” és „b” primer alkalmazásával végeztük, a mutációs helytől 5'-irányban kezdődő és a mutációs helyig húzódó fragmenst (all. ábrán az AB ffagmens) amplifikáltunk. Ha a PCR-reakciót a „c” és „d” primer alkalmazásával végeztük, a mutációs helytől 3'-irányban elhelyezkedő fragmenst (a 11. ábrán CD fragmens) amplifikáltunk. Amikor a hődenaturálás után valamennyi amplifikált terméket (AB, CD) ismét hibridizáltuk, a fragmensek egy fragmenssé ligálódtak (11. ábra, AD fragmens). A PCR-reakciót 30 ciklus ismétlésével végeztük, melynek során 94 °C-on 1 perces melegítés után denaturálást (94 °C, 1,5 perc), hibridizálást (50 °C, 2 perc), és polimerázzal elongációt (72 °C, 3,5 perc) végeztünk. A reakcióelegyek összetételét a IX. táblázatban mutatjuk be.

IX. táblázat

Összetétel (): végkoncentráció	PCR-fragmens
AB	CD	AD
H2O	53,5	53,5	53,5
10-szeres reakciópuffer	10	10	10
1,25 mM dNTP-elegy	16	16	16
20 μΜ „a” primer (ΙμΜ)	5	-	5
20 μΜ „b” primer (ΙμΜ)	5	-	-
20 μΜ „c” primer (ΙμΜ)	-	5	-
20 μΜ „d” primer (1 μΜ)	-	5	5
10 pg/μΙ pT2 (0,1 pg)	10	10	-
AB PCR-ffagmens*	-	-	5
CD PCR-fragmens*	-	-	5
2,5 egység/μΐ Taq polimeráz	0,5	0,5	0,5
Összesen	100 μΐ	100 μΐ	100 μΐ

* Az AB és CD PCR-fragmenst úgy kaptuk meg, hogy a PCR-reakció után poliakrilamid gélről mindkettőből 10-10 μΐ-t kinyertünk, és ezeket 5 μΐ TE pufferben [10 mM Tris-HCl (pH=8,0), 1 mM EDTA (pH=8,0)] feloldottuk.

A fenti módon kapott AD fragmensben az upstream (5’-) oldalon egy BssHII hely (az 1. számú szekvenciában az 1231-1236. nukleotidok), a downstream (3’-) oldalon pedig egy SplI hely (az 1. számú szekvenciában a 22 249-2254. nukleotidok) volt jelen, így ezekkel az enzimekkel teljes emésztést végeztünk, hogy az kapott fragmenssel a pT2 plazmid megfelelő régióját helyettesítsük (11. ábra).

(2) A gátlással szemben deszenzibilizált foszfoenolpiruvát-karboxiláz kiválasztása

Escherichia colit a fentiek szerint előállított plazmiddal transzformáltunk, és a transzformált törzset tenyésztettük, hogy EcoRI enzimmel hasított plazmid kiválasztásához plazmidot nyerjünk ki. A kiválasztott DNS-t illetően, didezoxieljárással meghatároztuk a fentebb leírt PCR-eljárással amplifikált régió bázisszekvenciáját, hogy meggyőződjünk arról, hogy a kívánt báziscserét sikerült megvalósítani. Ezt a plazmidot pT2R438C-nek neveztük el. Az e plazmid bevitelével kapott Escherichia coli F15 törzset (AJ12874) a National Institute of Bioscience and Humán Technology of Agency of Industrial Science and Technologynál (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japán; postai irányítószám: 305) FERM P-13753 deponálási számon 1993. július 15-én helyeztük letétbe, illetve 1994. július 11-én, a Budapest Szerződés értelmében FERM BP-4733 deponálási számon nemzetközi letétbe helyeztük át.

HU 219 600 Β

A pT2R438C plazmid bázisszekvenciájában az 1. számú szekvencia 1541. és 1550. nukleotidjait citozinról timinre cseréltük.

(3) A mutáns foszfo-enolpiruvát-karboxiláz aszparaginsav által kiváltott gátlása deszenzibilizálásának igazolása

A fentebb említett, pT2R438C plazmidot tartalmazó Escherichia coli AJ12874 törzs által termelt foszfo-enolpiruvát-karboxiláz aszparaginsavra mutatott érzékenységét vizsgáltuk. Mivel az Escherichia coli FI5 nem tártál- 10 máz foszfo-enolpiruvát-karboxilázt, az AAJ12874 törzs által termelt foszfo-enolpiruvát-karboxiláz a plazmidból származik.

Az aszparaginsavra mutatott érzékenységet ismert eljárással vizsgáltuk (Yoshinaga, T., ízűi, K. és Katsuki,

H., J. Biochem., 68, 747-750,1970). Az enzimaktivitás 1 mM, illetve 2 mM acetil-koenzim A jelenlétében (melyről ismert, hogy aktivitásmérési rendszerben befolyásolja az aktivitást) végzett mérésével az aszparaginsavra mutatott érzékenységre a 12. ábrán látható eredmé- 20 nyékét kaptuk.

Az eredmények alapján nyilvánvaló, hogy a vad típusú enzim nagy koncentrációjú aszparaginsav jelenlétében elveszíti aktivitását, míg a találmány szerinti mutáns foszfo-enolpiruvát-karboxiláz lényegében folyama- 25 tosan megtartja aktivitását.

(4) Mutáns foszfo-enolpiruvát-karboxiláz-gén előállítása (11)

Annak érdekében, hogy a pT2 plazmidban lévő foszfo-enolpiruvát-karboxiláz-gén 620. lizint kódoló ko- 30 donját szerint kódoló kodonnal helyettesítsük, PCRreakció alkalmazásával az átfedőextenzió-eljárást (Ho,

S. N., Hunt, H. D., Horton, R. M., Pulién, J. K. és Pease, L. R., Gene, 77, 51-59, 1989) használtuk.

A konkrét eljárást az (1) pontban leírtak szerint végez- 35 tűk. A kívánt báziscserét tartalmazó mutáns génnel rendelkező plazmidot pT2K620S-nek neveztük el.

(5) A mutáns foszfo-enolpiruvát-karboxiláz aszparaginsav által kiváltott gátlása deszenzibilizálásának igazolása

A pT2K620S plazmid fentebb említett Escherichia coli FI5 törzsbe történő bevitelével előállított transzformáns által termelt foszfo-enolpiruvát-karboxiláz aszparaginsavra mutatott érzékenységét vizsgáltuk. Amint fentebb említettük, mivel az Escherichia coli F15 nem 45 tartalmaz foszfo-enolpiruvát-karboxilázt, a transzformáns által termelt foszfo-enolpiruvát-karboxiláz a plazmidból származik.

Az aszparaginsavra mutatott érzékenységet ismert eljárással vizsgáltuk (Yoshinaga, T., ízűi, K. és Katsuki, H. J. Biochem., 68, 47-50, 1970). Az enzimaktivitás 1 mM, illetve 2 mM acetil-koenzim A jelenlé5 tében (melyről ismert, hogy aktivitásmérési rendszerben befolyásolja az aktivitást) végzett mérésével az aszparaginsavra mutatott érzékenységre a 13. ábrán látható eredményeket kaptuk.

Az eredmények szerint nyilvánvaló, hogy a vad típusú enzim nagy koncentrációjú aszparaginsav jelenlétében elveszíti aktivitását, míg a találmány szerinti mutáns foszfo-enolpiruvát-karboxiláz lényegében folyamatosan megtartja aktivitását.

A 13. ábrán az aszparaginsavra mutatott érzékenysé15 get két mutáns foszfo-enolpiruvát-karboxiláz esetében is ábrázoltuk; az egyikben a 650. lizint szerin helyettesíti (K650A mutáns enzim), míg a másikban a 491. lizin helyén áll szerin (K491A mutáns enzim). E mutáns enzimek az aszparaginsav által kiváltott gátlással szemben nem deszenzibilizálódtak.

Nagyüzemi alkalmazhatóság

A találmány szerinti DNS-szekvencia mutáns foszfoenolpiruvát-karboxilázt kódol, s az e DNS-szekvenciát tartalmazó mikroorganizmusok ezt az enzimet termelik.

A találmány szerinti mutáns foszfo-enolpiruvát-karboxiláz aktivitását az aszparaginsav nem gátolja jelentős mértékben, így felhasználható olyan aminosavak fermentációs termeléséhez, amelyek bioszintézisét az aszparaginsav és hasonlók szabályozzák. SZEKVENCIALISTA

SZEKVENCIÁK SZÁMA: 12 TUDNIVALÓK AZ 1. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 5186 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: kétszálú (D) ALAK: cirkuláris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: genom-DNS és vektor-DNS (iii) HIPOTETIKUS: nem (iv) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS (A) ORGANIZMUS: Escherichia coli (ix) SAJÁTOS JELLEGZETESSÉG:

(A) NÉV/KÓD: kódolószekvencia/CDS (B) ELHELYEZKEDÉS: 237.. .2888 (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 1. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

TCGACCGGCG ATTTTTTAAC ATTTCCATAA GTTACGCTTA TTTAAAGCGT CGTGAATTTA 60 ATGACGTAAA TTCCTGCTAT TTATTCGTTT GCTGAAGCGA TTTCGCAGCA TTTGAOGTCA 120 CCGCTTTTAC GTGGCTTTAT AAAAGACGAC GAAAAGCAAA GOOCGAGCAT ATTCGCGCCA 180 ATGCGACGTG AAGGATACAG GGCTATCAAA CGATAAGATG GGGTGTCTGG GGTAAT 236 ATG AAC GAA CAA TAT TOC GCA TTG CGT AGT AAT GTC AGT ATG CTC GGC 284 Met Asn Glu Gin Tyr Ser Alá Leu Arg Ser Asn Val Ser Met Leu Gly

10 15

HU 219 600 Β

AAA GTG CTG GGA	GAA ACC ATC AAG GAT	GCG TTG GGA GAA CAC ATT CTT	332
Lys Val Leu Gly	Glu Thr Ile Lys Asp	Alá Leu Gly Glu His Ile Leu
20	25	30
GAA CGC GTA GAA	ACT ATC CGT AAG TTG	TCG AAA TCT TCA CGC GCT GGC	380
Glu Arg Val Glu	Thr Ile Arg Lys Leu	Ser Lys Ser Ser Arg Alá Gly
35	40	45
AAT GAT GCT AAC	CGC CAG GAG TTG CTC	ACC ACC TTA CAA AAT TTG TCG	428
Asn Asp Alá Asn	Arg Gin Glu Leu Leu	Thr Thr Leu Gin Asn Leu Ser
50	55	60
AAC GAC GAG CTG	CTG OCC GTT GCG CGT	GCG TTT AGT CAG TTC CTG AAC	476
Asn Asp Glu Leu	Leu Pro Val Alá Arg	Alá Phe Ser Gin Phe Leu Asn
65	70	75 80
CTG GÓC AAC ACC	GCC GAG CAA TAC CAC	AGC ATT TCG CCG AAA GGC GAA	524
Leu Alá Asn Thr	Alá Glu Gin Tyr His	Ser Ile Ser Pro Lys Gly Glu
	85	90 95
GCT GCC AGC AAC	CCG GAA GTG ATC GCC	CGC ACC CTG CGT AAA CTG AAA	572
Alá Alá Ser Asn	Pro Glu Val Ile Alá	Arg Thr Leu Arg Lys Leu Lys
100	105	110
AAC CAG CCG GAA	CTG AGC GAA GAC ACC	ATC AAA AAA GCA GTG GAA TCG	620
Asn Gin Pro Glu	Leu Ser Glu Asp Thr	Ile Lys Lys Alá Val Glu Ser
115	120	125
CTG TCG CTG GAA	CTG GTC CTC AGG GCT	CAC CCA ACC GAA ATT ACC CGT	668
Leu Ser Leu Glu	Leu Val Leu Thr Alá	His Pro Thr Glu Ile Thr Arg
130	135	140
CGT ACA CTG ATC	CAC AAA ATG GTG GAA	GTG AAC GCC TGT TTA AAA CAG	716
Arg Thr Leu Ile	His Lys Met Val Glu	Val Asn Alá Cys Leu Lys Gin
145	150	155 160
CTC GAT AAC AAA	GAT ATC GCT GAC TAC	GAA CAC AAC CAG CTG ATG CGT	764
Leu Asp Asn Lys Asp Ile Alá Asp Tyr	Glu His Asn Gin Leu Met Arg
	165	170 175
CGC CTG CGC CAG	TTG ATC GCC CAG TCA	TGG CAT ACC GAT GAA ATC CGT	812
Arg Leu Arg Gin	Leu Ile Alá Gin Ser	Trp His Thr Asp Glu Ile Arg
180	185	190
AAG CTG CGT CCA	AGC CCG GTA GAT GAA	GCC AAA TGG GGC TTT GCC GTA	860
Lys Leu Arg Pro	Ser Pro Val Asp Glu	Alá Lys Trp Gly Phe Alá Val
195	200	205
GTG GAA AAC AGC	CTG TGG CAA GGC GTA	CCA AAT TAC CTG CGC GAA CTG	908
Val Glu Asn Ser	Leu Trp Gin Gly Val	Pro Asn Tyr Leu Arg Glu Leu
210	215	220
AAC GAA CAA CTG	GAA GAG AAC CTC GGC	TAC AAA CTG OCC GTC GAA TTT	956
Asn Glu Gin Leu	Glu Glu Asn Leu Gly	Tyr Lys Leu Pro Val Glu Phe
225	230	235 240
GTT CCG GTC CGT	TTT ACT TCG TGG ATG	GGC GGC GAC CGC GAC GGC AAC	1004
Val Pro Val Arg	Phe Thr Ser Trp Met	Gly Gly Asp Arg Asp Gly Asn
	245	250 255
CCG AAC GTC ACT	GCC GAT ATC ACC CGC	CAC GTC CTG CTA CTC AGC CGC	1052
Pro Asn Val Thr	Alá Asp Ile Thr Arg	His Val Leu Leu Leu Ser Arg
260	265	270

HU 219 600 Β

TGG

AAA

GCC

ACC

GAT

TTG

TTC

CTG

AAA GAT

ATT

CAG GTG

CTG

GTT

TCT

1100

Trp

Lys

Alá 275

Thr

Asp

Leu

Phe

Leu 280

Lys Asp

Ile

Gin Val 285

Leu

Val

Ser

GAA

CTG

TCG

ATG

GTT

GAA

GCG

ACC

CCT

GAA

CTG

CTG

GCG

CTG

GTT

GGC

1148

Glu

Leu 290

Ser

Met

Val

Glu

Alá 295

Thr

Pro

Glu

Leu

Leu 300

Alá

Leu

Val

Gly

GAA

GAA

GGT

GCC

GCA

GAA

CCG

TAT

CGC

TAT

CTG

ATG

AAA

AAC

CTG

CGT

1196

Glu 305

Glu

Gly

Alá

Alá

Glu 310

Pro

Tyr Arg

Tyr

Leu 315

Met

Lys

Asn

Leu

Arg 320

TCT

CGC

CTG

ATG

GCG

ACA

CAG

GCA

TGG

CTG

GAA

GCG

CGC

CTG

AAA

GGC

1244

Ser

Arg

Leu

Met

Alá 325

Thr

Gin

Alá

Trp

Leu 330

Glu

Alá

Arg

Leu

Lys 335

Gly

GAA

GAA

CTG

CCA

AAA

CCA

GAA

GGC

CTG

CTG

ACA

CAA

AAC

GAA

GAA

CTG

1292

Glu

Glu

Leu

Pro 340

Lys

Pro

Glu

Gly

Leu 345

Leu

Thr

Gin

Asn

Glu 350

Glu

Leu

TGG

GAA

CCG

CTC

TAC

GCT

TGC

TAC

CAG

TCA

CTT

CAG

GCG

TGT

GGC

ATG

1340

Trp

Glu

Pro 355

Leu

Tyr

Alá

Cys

Tyr 360

Gin

Ser

Leu

Gin

Alá 365

Cys

Gly

Met

GGT

ATT

ATC

GCC

AAC

GGC

GAT

CTG

CTC

GAC

ACC

CTG

CGC

CGC

GTG

AAA

1388

Gly

Ile 370

Ile

Alá

Asn

Gly Asp 375

Leu

Leu

Asp

Thr

Leu 380

Arg Arg

Val

Lys

TGT

TTC

GGC

GTA

CCG

CTG

GTC

OGT

ATT

GAT

ATC

CGT

CAG

GAG

AGC

ACG

1436

Cys 385

Phe

Gly Val

Pro

Leu 390

Val

Arg

Ile

Asp

Ile 395

Arg

Gin

Glu

Ser

Thr 400

OGT

CAT

ACC

GAA

GCG

CTG

GGC

GAG

CTG

ACC

CGC

TAC

CTC

GGT

ATC

GGC

1484

Arg

Kis

Thr

Glu

Alá 405

Uett

Gly

Glu

Leu

Thr 410

Arg

Tyr

Leu

Gly

Ile 415

Gly

GAC

TAC

GAA

AGC

TGG

TCA

GAG

GCC

GAC

AAA

CAG

GCG

TTC

CTG

ATC

CGC

1532

Asp

Tyr

Glu

Ser 420

Trp

Ser

Glu

Alá

Asp 425

Lys

Gin

Alá

Phe

Leu 430

Ile

Arg

GAA

CTG

AAC

TOC

AAA

CGT

CCG

CTT

CTG

CCG

CGC

AAC

TGG

CAA

CCA

AGC

1580

Glu

Leu

Asn 435

Ser

Lys Arg

Pro

Leu 440

Leu

Pro

Arg

Asn

Trp 445

Gin

Pro

Ser

GCC

GAA

ACG

CGC

GAA

GTG

CTC

GAT

ACC

TGC

CAG

GTG

ATT

GCC

GAA

GCA

1628

Alá

Glu 450

Thr

Arg

Glu

Val

Leu 455

Asp

Thr

Cys

Gin Val 460

Ile

Alá

Glu

Alá

CCG

CAA

GGC

TCC ATT

GÓC

GCC

TAC

GTG

ATC

TCG ATG GCG AAA ACG CCG

1676

Pro 465

Gin

Gly

Ser

Ile

Alá 470

Alá

Tyr

Val

Ile

Ser 475

Met

Alá

Lys

Thr

Pro 480

TCC

GAC

GTA

CTG

GCT

GTC

CAC

CTG

CTG CTG

AAA

GAA

GCG

GGT

ATC

GGG

1724

Ser

Asp

Val

Leu

Alá 485

Val

His

Leu

Leu

Leu 490

Lys

Glu

Alá

Gly

Ile 495

Gly

TTT

GCG

ATG

CCG

GTT

GCT

CCG

CTG

TTT

GAA ACC

CTC

GAT

GAT

CTG

AAC

1772

Phe

Alá

Met

Pro 500

Val

Alá

Pro

Leu

Phe 505

Glu

Thr

Leu

Asp Asp 510

Leu

Asn

HU 219 600 Β

AAC	GÓC AAC GAT	GTC ATG AOC CAG CTG	CTC	AAT ATT	GAC TGG TAT CGT	1820
Asn	Alá Asn Asp	Val Met Thr Gin Leu	Leu	Asn lle	Asp Trp Tyr Arg
	515	520			525
GGC	CTG ATT CAG	GGC AAA CAG ATG GTG	ATG	ATT GGC	TAT TCC GAC TCA	1868
Gly	Leu lle Gin	Gly Lys Gin Met Val	Met	lle Gly Tyr Ser Asp Ser
	530	535		540
GCA	AAA GAT GCG	GGA GTG ATG GCA GCT	TCC	TGG GCG	CAA TAT CAG GCA	1916
Alá	Lys Asp Alá	Gly Val Met Alá Alá	Ser	Trp Alá	Gin Tyr Gin Alá
545		550		555	560
CAG	GAT GCA TTA	ATC AAA ACC TGC GAA	AAA	GCG GGT	ATT GAG CTG ACG	1964
Gin	Asp Alá Leu	lle Lys Thr Cys Glu	Lys	Alá Gly	lle Glu Leu Thr
		565	570		575
TTG	TTC CAC GGT	CGC GGC GGT TCC ATT	GGT	CGC GGC	GGC GCA CCT GCT	2012
Leu	Phe His Gly Arg Gly Gly Ser lle	Gly Arg Gly Gly Alá Pro Alá
	580	585			590
CAT	GCG GCG CTG	CTG TCA CAA CCG CCA	GGA	AGC CTG	AAA GGC GGC CTG	2060
HÍS	Alá Alá Leu	Leu Ser Gin Pro Pro	Gly	Ser Leu	Lys Gly Gly Leu
	595	600			605
CGC	GTA ACC GAA	CAG GGC GAG ATG ATC	CGC	TTT AAA	TAT GGT CTG CCA	2108
Arg	Val Thr Glu	Gin Gly Glu Met He	Arg	Phe Lys	Tyr Gly Leu Pro
	610	615		620
GAA	ATC AOC GTC	AGC AGC CTG TCG CTT	TAT	ACC GGG	GCG ATT CTG GAA	2156
Glu	lle Thr Val	Ser Ser Leu Ser Leu	Tyr	Thr Gly Alá lle Leu Glu
625		630		635	640
GÓC	AAC CTG CTG	CCA CCG OCG GAG CCG	AAA	GAG AGC	TGG CGT CGC ATT	2204
Alá	Asn Leu Leu	Pro Pro Pro Glu Pro	Lys	Glu Ser	Trp Arg Arg lle
		645	650		655
ATG	GAT GAA CTG	TCA GTC ATC TCC TGC	GAT	GTC TAC	CGC GGC TAC GTA	2252
Met	Asp Glu Leu	Ser Val lle Ser Cys Asp	Val Tyr Arg Gly Tyr Val
	660	665			670
CGT	GAA AAC AAA	GAT TTT GTG CCT TAC	TTC	CGC TCC	GCT ACG CCG GAA	2300
Arg	Glu Asn Lys Asp Phe Val Pro Tyr	Phe	Arg Ser	Alá Thr Pro Glu
	675	680			685
CAA	GAA CTG GGC AAA CTG OCG TTG GGT	TCA	CGT CCG	GCG AAA CGT CGC	2348
Gin	Glu Leu Gly Lys Leu Pro Leu Gly	Ser	Arg Pro	Alá Lys Arg Arg
	690	695		700
CCA	ACC GGC GGC CTC GAG TCA CTA CGC	GCC	ATT CCG	TGG ATC TTC GCC	2396
Pro	Thr Gly Gly Val Glu Ser Leu Arg	Alá	lle Pro	Trp lle Phe Alá
705		710		715	720
TGG	ACG CAA AAC	CGT CTG ATG CTC OCC	GCC	TGG CTG	GGT GCA GGT ACG	2444
Trp	Thr Gin Asn	Arg Leu Met Leu Pro	Alá	Trp Leu	Gly Alá Gly Thr
		725	730		735
GCG	CTG CAA AAA	GTG GTC GAA GAC GGC	AAA	CAG AGC	GAG CTG GAG GCT	2492
Alá	Leu Gin Lys	Val Val Glu Asp Gly Lys	Gin Ser	Glu Leu Glu Alá
	740	745			750
ATG	TGC CGC GAT	TGG CCA TTC TTC TCG	ACG	CGT CTC	GGC ATG CTG GAG	2540
Met	Cys Arg Asp Trp Pro Phe Phe Ser	Thr	Arg Leu	Gly Met Leu Glu

755 760 765

HU 219 600 Β

ATG GTC	TTC GCC AAA GCA	GAC CTG TGG CTG GCG GAA TAC TAT GAC CAA	2588
Met	Val 770	Phe Alá	Lys	Alá	Asp 775	Leu	Trp Leu	Alá Glu Tyr 780	Tyr Asp Gin
CGC	CTG	GTA GAC	AAA	GCA	CTG	TGG	CCG TTA	GGT AAA GAG	TTA CGC AAC	2636
Arg	Leu	Val Asp	Lys	Alá	Leu	Trp	Pro Leu	Gly Lys Glu	Leu Arg Asn
785				790				795	800
CTG	CAA	GAA GAA	GAC	ATC	AAA	GTG	GTG CTG	GCG ATT GCC	AAC GAT TCC	2684
Leu	Gin	Glu Glu	Asp	Ile	Lys	Val	Val Leu	Alá Ile Alá	Asn Asp Ser
			805				810		815
CAT	CTG	ATG GCC	GAT	CTG	CCG	TGG	ATT GCA	GAG TCT ATT	CAG CTA CGG	2732
Hls	Leu	Met Alá	Asp	Leu	Pro	Trp	Ile Alá	Glu Ser Ile	Gin Leu Arg
		820					825		830
AAT	ATT	TAC ACC	GAC	CCG	CTG	AAC	GTA TTG	CAG GCC GAG	TTG CTG CAC	2780
Asn	Ile	Tyr Thr	Asp	Pro	Leu	Asn	Val Leu	Gin Alá Glu	Leu Leu Hls
		835				840		845
CGC	TCC	CGC CAG	GCA	GAA	AAA	GAA	GGC CAG	GAA CCG GAT	CCT CGC GTC	2828
Arg	Ser	Arg Gin	Alá	Glu	Lys	Glu	Gly Gin	Glu Pro Asp Pró Arg Val
	850				855			860
GAA	CAA	GCG TTA	ATG	GTC	ACT	ATT	GCC GGG	ATT GCG GCA GGT ATG CGT	2876
Glu	Gin	Alá Leu	Met	Val	Thr	Ile	Alá Gly	Ile Alá Alá Gly Met Arg
865				870				875	880

AAT ACC GGC TAATCTTCCT CTTCTGCAAA COCTCGTGCT TTTGOGCGAG 2925

Asn Thr Gly

GGTTTTCTGA AATACTTCTG TTCTAACAOC CTCGTTTTCA ATATATTTCT GTCTGCATTT 2985 TATTCAAATT CTGAATATAC CTTCAGATAT CCTTAAGGGC CTCGTGATAC GCCTATTTTT 3045 ATAGGTTAAT GTCATGATAA TAATGGTTTC TTAGACGTCA GGTGGCACTT TTOGGGGAAA 3105 TGTGOGCGGA AOCCCTATTT GTTTATTTTT CTAAATACAT TCAAATATGT ATCCGCTCAT 3165 GAGACAATAA CCCTGATAAA TGCTTCAATA ATATTGAAAA AGGAAGAGTA TGAGTATTCA 3225 ACATTTCOGT GTCGCCCTTA TTOCCTTTTT TGOGGCATTT TGCCTTCCTG TTTTTGCTCA 3285 CCCAGAAACG CTGGTGAAAG TAAAAGATGC TGAAGATCAG TTGGGTGCAC GAGTGGGTTA 3345 CATCGAACTG GATCTCAACA GOGGTAAGAT CCTTGAGAGT TTTCGCCCCG AAGAACGTTT 3405 TCCAATGATG AGCACTTTTA AAGTTCTGCT ATGTGGCGCG GTATTATCCC GTATTGACGC 3465 CGGGCAAGAG CAACTOGGTC GCOGCATACA CTATTCTCAG AATGACTTGG TTGAGTACTC 3525 ACCAGTCACA GAAAAGCATC TTAOGGATGG CATGACAGTA AGAGAATTAT GCAGTGCTGC 3585 CATAACCATG AGTGATAACA CTGCGGCCAA CTTACTTCTG ACAACGATCG GAGGACCGAA 3645 GGAGCTAACC GCTTTTTTGC ACAACATGGG GGATCATGTA ACTCGCCTTG ATCGTTGGGA 3705 ACCGGAGCTG AATGAAGCCA TACCAAACGA CGAGCGTGAC ACCACGATGC CTGTAGCAAT 3765 GGCAACAACG TTGCGCAAAC TATTAACTGG CGAACTACTT ACTCTAGCTT CCCGGCAACA 3825 ATTAATAGAC TGGATGGAGG CGGATAAAGT TGCAGGACCA CTTCTGCGCT CGGCCCTTCC 3885 GGCTGGCTGG TTTATTGCTG ATAAATCTGG AGCCGGTGAG CGTGGGTCTC GOGGTATCAT 3945 TGCAGCACTG GGGCCAGATG GTAAGCCCTC CCGTATCGTA GTTATCTACA CGACGGGGAG 4005 TCAGGCAACT ATGGATGAAC GAAATAGACA GATCGCTGAG ATAGGTGCCT CACTGATTAA 4065 GCATTGGTAA CTGTCAGACC AAGTTTACTC ATATATACTT TAGATTGATT TAAAACTTCA 4125 TTTTTAATTT AAAAGGATCT AGGTGAAGAT CCTTTTTGAT AATCTCATGA CCAAAATCCC 4185 TTAACGTGAG TTTTCGTTCC ACTGAGCGTC AGAOOCCGTA GAAAAGATCA AAGGATCTTC 4245 TTGAGATCCT TTTTTTCTGC GCGTAATCTG CTGCTTGCAA ACAAAAAAAC CAOCGCTACC 4305 AGCGGTGGTT TGTTTGCCGG ATCAAGAGCT ACCAACTCTT TTTCCGAAGG TAACTGGCTT 4365 CAGCAGAGOG CAGATAOCAA ATACTGTCCT TCTAGTGTAG OCGTAGTTAG GCCACCACTT 4425

HU 219 600 Β

CAAGAACTCT GTAGCACCGC CTACATACCT CGCTCTGCTA ATCCTGTTAC CAGTGGCTGC 4485 TGCCAGTGGC GATAAGTCGT GTCTTACCGG GTTGGACTCA AGACGATAGT TACCGGATAA 4545

GGOGCAGOQG TCGGGCTGAA OGGGGGGTTC GTGCACACAG CCCAGCTTGG AGCGAACGAC 4605 CTACACCGAA CTGAGATACC TACAGCGTGA GCATTGAGAA AGCGCCACGC TTCCCGAAGG 4665 GAGAAAGGCG GACAGGTATC CGGTAAGCGG CAGGGTCGGA ACAGGAGAGC GCACGAGGGA 4725 GCTTCCAGGG GGAAACGCCT GGTATCTTTA TAGTCCTGTC GGGTTTCGCC ACCTCTGACT 4785 TGAGCGTCGA TTTTTGTGAT GCTCGTCAGG GGGGCGGAGC CTATGGAAAA ACGCCAGCAA 4845 CGCGGCCTTT TTAOGGTTCC TGGCCTTTTG CTGGCCTTTT GCTCACATGT TCTTTCCTGC 4905 GTTATCCCCT GATTCTGTGG ATAAOCGTAT TACCGCCTTT GAGTGAGCTG ATAOCGCTOG 4965 CCGCAGCCGA ACGACCGAGC GCAGCGAGTC AGTGAGCGAG GAAGCGGAAG AGCGCCCAAT 5025 ACGCAAAOOG CCTCTCCCCG OGOGTTGGOC GATTCATTAA TGCAGAAGGG TTGGTTTGCG 5085 CATTCACAGT TCTCCGCAAG AATTGATTGG CTCCAATTCT TGGAGTGGTG AATCCGTTAG 5145 CGAGGTGCCG CCGGCTTCCA TTCAGGTCGA GGTGGCCCGG G 5186

TUDNIVALÓK A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ: 20 (D) ALAK: lineáris (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK: (ii) MOLEKULA TÍPUSA: protein (A) HOSSZÚSÁG: 883 aminosav (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 2. SZÁMÚ SZEK-

(B) TÍPUS:	aminosav	VENCIA:
Met Asn 1	Glu Gin Tyr Ser Alá Leu Arg 5	Ser Asn Val Ser Met Leu Gly 10 15
Lys Val	Leu Gly Glu Thr Ile Lys Asp 20 25	Alá Leu Gly Glu His Ile Leu 30
Glu Arg	Val Glu Thr Ile Arg Lys Leu 35 40	Ser Lys Ser Ser Arg Alá Gly 45
Asn Asp 50	Alá Asn Arg Gin Glu Leu Leu 55	Thr Thr Leu Gin Asn Leu Ser 60
Asn Asp 65	Glu Leu Leu Pro Val Alá Arg 70	Alá Phe Ser Gin Phe Leu Asn 75 80
Leu Alá	Asn Thr Alá Glu Gin Tyr His 85	Ser Ile Ser Pro Lys Gly Glu 90 95
Alá Alá	Ser Asn Pro Glu Val Ile Alá 100 105	Arg Thr Leu Arg Lys Leu Lys 110
Asn Gin	Pro Glu Leu Ser Glu Asp Thr 115 120	Ile Lys Lys Alá Val Glu Ser 125
Leu Ser 130	Leu Glu Leu Val Leu Thr Alá 135	His Pro Thr Glu Ile Thr Arg 140
Arg Thr 145	Leu Ile His Lys Met Val Glu 150	Val Asn Alá Cys Leu Lys Gin 155 160
Leu Asp	Asn Lys Asp Ile Alá Asp Tyr 165	Glu His Asn Gin Leu Met Arg 170 175

Arg Leu Arg Gin Leu Ile Alá Gin Ser Trp His Thr Asp Glu Ile Arg 180 185 190

Lys Leu Arg Pro Ser Pro Val Asp Glu Alá Lys Trp Gly Phe Alá Val 195 200 205

Val Glu Asn Ser Leu Trp Gin Gly Val Pro Asn Tyr Leu Arg Glu Leu 210 215 220

HU 219 600 Β

Asn Glu Gin Leu	Glu Glu Asn Leu Gly	Tyr Lys Leu Pro Val Glu Phe
225	230	235 240
Val Pro Val Arg	Phe Thr Ser Trp Met	Gly Gly Asp Arg Asp Gly Asn
	245	250 255
Pro Asn Val Thr	Alá Asp Ile Thr Arg	His Val Leu Leu Leu Ser Arg
260	265	270
Trp Lys Alá Thr	Asp Leu Phe Leu Lys Asp Ile Gin Val Leu Val Ser
275	280	285
Glu Leu Ser Met	Val Glu Alá Thr Pro Glu Leu Leu Alá Leu Val Gly
290	295	300
Glu Glu Gly Alá	Alá Glu Pro Tyr Arg Tyr Leu Met Lys Asn Leu Arg
305	310	315 320
Ser Arg Leu Met	Alá Thr Gin Alá Trp	Leu Glu Alá Arg Leu Lys Gly
	325	330 335
Glu Glu Leu Pro	Lys Pro Glu Gly Leu	Leu Thr Gin Asn Glu Glu Leu
340	345	350
Trp Glu Pro Leu	Tyr Alá Cys Tyr Gin	Ser Leu Gin Alá Cys Gly Met
355	360	365
Gly He ile Alá	Asn Gly Asp Leu Leu	Asp Thr Leu Arg Arg Val Lys
370	375	380
Cys Phe Gly Val	Pro Leu Val Arg Ile	Asp Ile Arg Gin Glu Ser Thr
385	390	395 400
Arg His Thr Glu	Alá Leu Gly Glu Leu	Thr Arg Tyr Leu Gly Ile Gly
	405	410 415
Asp Tyr Glu Ser	Trp Ser Glu Alá Asp	Lys Gin Alá Phe Leu Ile Arg
420	425	430
Glu Leu Asn Ser	Lys Arg Pro Leu Leu	Pro Arg Asn Trp Gin Pro Ser
435	440	445
Alá Glu Thr Arg	Glu Val Leu Asp Thr	Cys Gin Val Ile Alá Glu Alá
450	455	460
Pro Gin Gly Ser	Ile Alá Alá Tyr Val	Ile Ser Met Alá Lys Thr Pro
465	470	475 480
Ser Asp Val Leu	Alá Val His Leu Leu	Leu Lys Glu Alá Gly Ile Gly
	485	490 495
Phe Alá Met Pro	Val Alá Pro Leu Phe	Glu Thr Leu Asp Asp Leu Asn
500	505	510
Asn Alá Asn Asp	Val Met Thr Gin Leu	Leu Asn Ile Asp Trp Tyr Arg
515	520	525
Gly Leu Ile Gin	Gly Lys Gin Met Val	Met Ile Gly Tyr Ser Asp Ser
530	535	540
Alá Lys Asp Alá	Gly Val Met Alá Alá	Ser Trp Alá Gin Tyr Gin Alá
545	550	555 560
Gin Asp Alá Leu	Ile Lys Thr Cys Glu	Lys Alá Gly Ile Glu Leu Thr
	565	570 575
Leu Phe His Gly Arg Gly Gly Ser Ile	Gly Arg Gly Gly Alá Pro Alá
580	585	590
His Alá Alá Leu	Leu Ser Gin Pro Pro	Gly Ser Leu Lys Gly Gly Leu
595	600	605

HU 219 600 Β

Arg Val	Thr Glu Gin Gly Glu Met Ile Arg Phe Lys Tyr Gly Leu Pro
	610	615	620
Glu	He	Thr Val Ser Ser Leu Ser Leu	Tyr Thr Gly Alá Ile Leu Glu
625		630	635 640
Alá	Asn	Leu Leu Pro Pro Pro Glu Pro	Lys Glu Ser Trp Arg Arg Ile
		645	650 655
Met	Asp	Glu Leu Ser Val Ile Ser Cys Asp Val Tyr Arg Gly Tyr Val
		660 665	670
Arg	Glu	Asn Lys Asp Phe Val Pro Tyr Phe Arg Ser Alá Thr Pro Glu
		675 680	685
Gin	Glu	Leu Gly Lys Leu Pro Leu Gly Ser Arg Pro Alá Lys Arg Arg
	690	695	700
Pro	Thr	Gly Gly Val Glu Ser Leu Arg Alá Ile Pro Trp Ile Phe Alá
705		710	715 720
Trp	Thr	Gin Asn Arg Leu Met Leu Pro Alá Trp Leu Gly Alá Gly Thr
		725	730 735
Alá	Leu	Gin Lys Val Val Glu Asp Gly Lys Gin Ser Glu Leu Glu Alá
		740 745	750
Met	Cys Arg Asp Trp Pro Phe Phe Ser	Thr Arg Leu Gly Met Leu Glu
		755 760	765
Met	Val	Phe Alá Lys Alá Asp Leu Trp	Leu Alá Glu Tyr Tyr Asp Gin
	770	775	780
Arg	Leu	Val Asp Lys Alá Leu Trp Pro	Leu Gly Lys Glu Leu Arg Asn
785		790	795 800
Leu	Gin	Glu Glu Asp Ile Lys Val Val	Leu Alá Ile Alá Asn Asp Ser
		805	810 815
His	Leu	Met Alá Asp Leu Pro Trp Ile	Alá Glu Ser Ile Gin Leu Arg
		820 825	830
Asn	Ile	Tyr Thr Asp Pro Leu Asn Val	Leu Gin Alá Glu Leu Leu His
		835 840	845
Arg	Ser	Arg Gin Alá Glu Lys Glu Gly	Gin Glu Pro Asp Pro Arg Val
	850	855	860
Glu	Gin	Alá Leu Met Val Thr Ile Alá	Gly Ile Alá Alá Gly Met Arg
865		870	875 880
Asn	Thr	Gly

TUDNIVALÓK A 3. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 23 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú 50 (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: szintetikus DNS (iii) HIPOTETIKUS: nem (xi) SZÉKVENCIALEÍRAS: 3. SZÁMÚ SZEKVENCIA: 55

TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTT 23

TUDNIVALÓK A 4. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 21 (B) TÍPUS: nukleinsav 60 (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: szintetikus DNS (iii) HIPOTETIKUS: nem (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 4. SZÁMÚ SZÉK VENCIA:

ACGGAATTCA ATCTTACGGC C 21

TUDNIVALÓK AZ 5. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 1643 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: kétszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: genom-DNS (iii) HIPOTETIKUS: nem

HU 219 600 Β (iv) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS:

(A) ORGANIZMUS: Corynebacterium glutamicum (C) TÖRZS: ATCC 13869 5 (ix) SAJÁTOS JELLEGZETESSÉG:

(A) NÉV/KÓD: érett peptid (B) ELHELYEZKEDÉS: 217...1482 (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 5. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC TGTTTATTGG AAOGCATOOC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCOOCA GGAAOCCTGT GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAG GTG GÓC CTG GTC GTA CAG

Met Alá Leu Val Val Gin 1 5

AAA TAT	GGC GGT TCC TCG CTT	GAG AGT GCG GAA CGC	ATT AGA AAC GTC
Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu 10	Glu Ser Alá Glu Arg 15	lle Arg Asn Val 20
GCT GAA	CGG ATC GTT GCC ACC	AAG AAG GCT GGA AAT	GAT GTC GTG GTT
Alá Glu	Arg lle Val Alá Thr 25	Lys Lys Alá Gly Asn 30	Asp Val Val Val 35
GTC TGC	TCC GCA ATG GGA GAC	ACC ACG GAT GAA CTT	CTA GAA CTT GCA
Val Cys 40	Ser Alá Met Gly Asp 45	Thr Thr Asp Glu Leu 50	Leu Glu Leu Alá
GCG GCA	GTG AAT CCC GTT CCG	CCA GCT OGT GAA ATG	GAT ATG CTC CTG
Alá Alá 55	Val Asn Pro Val Pro 60	Pro Alá Arg Glu Met 65	Asp Met Leu Leu 70
ACT GCT	GGT GAG CGT ATT TCT	AAC GCT CTC GTC GÓC	ATG GCT ATT GAG
Thr Alá	Gly Glu Arg lle Ser 75	Asn Alá Leu Val Alá 80	Met Alá lle Glu 85
TCC CTT	GGC GCA GAA GCT CAA	TCT TTC ACT GGC TCT	CAG GCT GGT GTG
Ser Leu	Gly Alá Glu Alá Gin 90	Ser Phe Thr Gly Ser 95	Gin Alá Gly Val 100
CTC ACC	ACC GAG CGC CAC GGA	AAC GCA CGC ATT GTT	GAC GTC ACA CCG
Leu Thr	Thr Glu Arg His Gly	Asn Alá Arg lle Val	Asp Val Thr Pro
GGT OGT	GTG CGT GAA GCA CTC	GAT GAG GGC AAG ATC	TGC ATT GTT GCT
Gly Arg 120	Val Arg Glu Alá Leu 125	Asp Glu Gly Lys lle 130	cys He Val Alá
GGT TTT	CAG GGT GTT AAT AAA	GAA ACC CGC GAT GTC	ACC ACG TTG GGT
Gly Phe 135	Gin Gly Val Asn Lys 140	Glu Thr Arg Asp Val 145	Thr Thr Leu Gly 150
CGT GGT	GGT TCT GAC ACC ACT	GCA GTT GCG TTG GCA	GCT GCT TTG AAC
Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr 155	Alá Val Alá Leu Alá 160	Alá Alá Leu Asn 165
GCT GAT	GTG TGT GAG ATT TAC	TCG GAC GTT GAC GGT	GTG TAT ACC GCT
Alá Asp	Val Cys Glu lle Tyr 170	Ser Asp Val Asp Gly 175	Val Tyr Thr Alá 180
GAC CCG	CGC ATC GTT CCT AAT	GCA CAG AAG CTG GAA	AAG CTC AGC TTC
Asp Pro	Arg lle Val Pro Asn 185	Alá Gin Lys Leu Glu 190	Lys Leu Ser Phe 195
GAA GAA	ATG CTG GAA CTT GCT	GCT GTT GGC TCC AAG	ATT TTG GTG CTG
GlU Glu 200	Met Leu Glu Leu Alá 205	Alá Val Gly Ser Lys 210	lle Leu Val Leu

120

180

234

282

330

378

426

474

522

570

618

666

714

762

810

858

HU 219 600 Β

CGC	AGT GTT GAA	TAC GCT	CGT	GCA TTC AAT GTG CCA CTT CGC GTA CGC	906
Arg 215	Ser Val Glu	Tyr Alá 220	Arg	Alá Phe Asn Val Pro Leu Arg Val Arg 225 230
TCG	TCT TAT AGT	AAT GAT	CCC	GGC ACT TTG ATT GCC GGC TCT ATG GAG	954
Ser	Ser Tyr Ser	Asn Asp 235	Pro	Gly Thr Leu Ile Alá Gly Ser Met Glu 240 245
GAT	ATT CCT GTG	GAA GAA	GCA	GTC CTT ACC GGT GTC GCA ACC GAC AAG	1002
Asp	Ile Pro Val 250	Glu Glu	Alá	Val Leu Thr Gly Val Alá Thr Asp Lys 255 260
TCC	GAA GCC AAA	GTA ACC	GTT	CTG GGT ATT TCC GAT AAG CCA GGC GAG	1050
Ser	Glu Alá Lys 265	Val Thr	Val	Leu Gly Ile Ser Asp Lys Pro Gly Glu 270 275
GCT	GCC AAG GTT	TTC CGT	GCG	TTG GCT GAT GCA GAA ATC AAC ATT GAC	1098
Alá	Alá Lys Val 280	Phe Arg	Alá 285	Leu Alá Asp Alá Glu Ile Asn Ile Asp 290
ATG	GTT CTG CAG	AAC GTC	TCC	TCT GTG GAA GAC GGC ACC ACC GAC ATC	1146
Met 295	Val Leu Gin	Asn Val 300	Ser	Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp Ile 305 310
AGG	TTC ACC TGC	CCT CGC	GCT	GAC GGA CGC CGT GCG ATG GAG ATC TTG	1194
Thr	Phe Thr Cys	Pro Arg 315	Alá	Asp Gly Arg Arg Alá Met Glii Ile Leu 320 325
AAG	AAG CTT CAG	GTT CAG	GGC	AAC TGG ACC AAT GTG CTT TAC GAC GAC	1242
Lys	Lys Leu Gin 330	Val Gin	Gly	Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp 335 340
CAG	GTC GGC AAA	GTC TCC	ere	GTG GGT GCT GGC ATG AAG TCT CAC CCA	129G
Gin	Val Gly Lys 345	Val Ser	Leu	Val Gly Alá Gly Met Lys Ser His Pro 350 355
GGT	GTT ACC GCA	GAG TTC	ATG	GAA GCT CTG CGC GAT GTC AAC GTG AAC	1338
Gly	Val Thr Alá 360	Glu Phe	Met 365	Glu Alá Leu Arg Asp Val Asn Val Asn 370
ATC	GAA TTG ATT	TCC ACC	TCT	GAG ATC CGC ATT TCC GTG CTG ATC CGT	1386
Ile 375	Glu Leu Ile	Ser Thr 380	Ser	Glu Ile Arg Ile Ser Val Leu Ile Arg 385 390
GAA	GAT GAT CTG	GAT GCT	GCT	GCA CGT GCA TTG CAT GAG CAG TTC CAG	1434
Glu	Asp Asp Leu	Asp Alá 395	Alá	Alá Arg Alá Leu His Glu Gin Phe Gin 400 405
CTG Leu	GGC GGC GAA Gly Gly Glu 410	GAC GAA Asp Glu	GCC Alá	GTC GTT TAT GCA GGC ACC GGA CGC TAA Val Val Tyr Alá Gly Thr Gly Arg 415 420	1482

AGTTTTAAAG GAGTAGTTTT ACAATGACCA TCGGCCAGGT TATGCGCACC CTTTTGGAAG TCTTTGCTTC CCCGCGTTCC GCAGGCCGTA

CCATCGCAGT

AGCGCAATTT

AGATTGAATT

TGTTGGTQCA ACCGGCCAGG CCCAGCTGAC ACTGTTCGTT C

1542

1602

1643

HU 219 600 Β

TUDNIVALÓK A 6. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ: (D) ALAK: lineáris (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK: (ii) MOLEKULA TÍPUSA: protein (A) HOSSZÚSÁG: 421 aminosav (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 6. SZÁMÚ SZÉK (B) TÍPUS: aminosav VENCIA:

Met 1	Alá Leu Val	Val Gin Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Alá
5	10	15
Glu	Arg Ile Arg	Asn Val Alá Glu Arg	Ile	Val Alá Thr Lys Lys Alá
	20	25		30
Gly	Asn Asp Val	Val Val Val Cys Ser	Alá	Met Gly Asp Thr Thr Asp
	35	40		45
Glu	Leu Leu Glu	Leu Alá Alá Alá Val	Asn	Pro Val Pro Pro Alá Arg
	50	55		60
Glu	Met Asp Met	Leu Leu Thr Alá Gly	Glu	Arg Ile Ser Asn Alá Leu
65		70		75 80
Val	Alá Met Alá	Ile Glu Ser Leu Gly	Alá	Glu Alá Gin Ser Phe Thr
		85	90	95
Gly	Ser Gin Alá	Gly Val Leu Thr Thr	Glu	Arg His Gly Asn Alá Arg
	100	105		110
Ile	Val Asp Val	Thr Pro Gly Arg Val	Arg	Glu Alá Leu Asp Glu Gly
	115	120		125
Lys	Ile Cys Ile	Val Alá Gly Phe Gin	Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg
	130	135		140
Asp	Val Thr Thr	Leu Gly Arg Gly Gly	Ser	Asp Thr Thr Alá Val Alá
145		150		155 160
Leu	Alá Alá Alá	Leu Asn Alá Asp Val	Cys	Glu Ile Tyr Ser Asp Val
		165	170	175
Asp Gly Val Tyr	Thr Alá Asp Pro Arg	Ile	Val Pro Asn Alá Gin Lys
	180	185		190
Leu	Glu Lys Leu	Ser Phe Glu Glu Met	Leu	Glu Leu Alá Alá Val Gly
	195	200		205
Ser	Lys Ile Leu	Val Leu Arg Ser Val	Glu	Tyr Alá Arg Alá Phe Asn
	210	215		220
Val	Pro Leu Arg	Val Arg Ser Ser Tyr	Ser	Asn Asp Pro Gly Thr Leu
225		230		235 240
Ile	Alá Gly Ser	Met Glu Asp Ile Pro	Val	Glu Glu Alá Val Leu Thr
		245	250	255
Gly	Val Alá Thr	Asp Lys Ser Glu Alá	Lys	Val Thr Val Leu Gly Ile
	260	265		270
Ser	Asp Lys Pro	Gly Glu Alá Alá Lys	Val	Phe Arg Alá Leu Alá Asp
	275	280		285
Alá	Glu Ile Asn	Ile Asp Met Val Leu	Gin	Asn Val Ser Ser Val Glu
	290	295		300
Asp Gly Thr Thr	Asp Ile Thr Phe Thr	Cys	Pro Arg Alá Asp Gly Arg
305		310		315 320
Arg Alá Met Glu	Ile Leu Lys Lys Leu	Gin	Val Gin Gly Asn Trp Thr
		325	330	335
Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gin Val Gly	Lys	Val Ser Leu Val Gly Alá
	340	345		350

HU 219 600 Β

Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Alá Glu Phe Met Glu Alá Leu 355 360 365

Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg 370 375 380

Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Alá Alá Alá Arg Alá

385 390 395 400

Leu His Glu Gin Phe Gin Leu Gly Gly Glu Asp Glu Alá Val Val Tyr

405 410 415

Alá Gly Thr Gly Arg

420

TUDNIVALÓK A 7. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ: 15 (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 1643 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: kétszálú (D) ALAK: lineáris 20 (ii) MOLEKULA TÍPUSA: genom-DNS (iv) ANTISZENSZ: nem (vi) EREDETI FORRÁS:

(A) ORGANIZMUS : Corynebacterium glutamicum (C) TÖRZS: ATCC 13869 (ix) SAJÁTOS JELLEGZETESSÉG:

(A) NÉV/KÓD: érett peptid (B) ELHELYEZKEDÉS: 964...1482 (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 7. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATAOGGTC 60 TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAAOCCTGT 120 GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG 180 GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAGGTGG CCCTGGTCGT ACAGAAATAT 240 GGCGGTTCCT CGCTTGAGAG TGCGGAACGC ATTAGAAAOG TCGCTGAACG GATCGTTGCC 300 ACCAAGAAGG CTGGAAATGA TGTCGTGGTT GTCTGCTCOG GAATGGGAGA CACCACGGAT 360 GAACTTCTAG AACTTGCAGC GGCAGTGAAT CCCGTTCCGC CAGCTOGTGA AATGGATATG 420 CTCCTGACTG CTGGTGAGCG TA1TTCTAAC GCTCTCGTCG CCATGGCTAT TGAGTCCCTT 480 GGCGCAGAAG CTCAATCTTT CACTGGCTCT CAGGCTGGTG TGCTCACCAC CGAGCGCCAC 540 GGAAACGCAC GCATTGTTGA CGTCACACCG GGTCGTGTGC GTGAAGCACT CGATGAGGGC 600 AAGATCTGCA TTGTTGCTGG TTTTCAGGGT GTTAATAAAG AAACCCGCGA TGTCACCACG 660 TTGGGTCGTG GTGGTTCTGA CACCACTGCA GTTGCGTTGG CAGCTGCTTT GAAOGCTGAT 720 GTGTGTGAGA TTTACTOGGA OGTTGACGGT GTGTATAOOG CTGACCCGCG CATOGTTOCT 780 AATGCACAGA AGCTGGAAAA GCTCAGCTTC GAAGAAATGC TGGAACTTGC TGCTGTTGGC 840 TCCAAGATTT TGGTGCTGCG CAGTGTTGAA TACGCTCGTG CATTCAATGT GOCACTTOGC 900 GTACGCTCGT CTTATAGTAA TGATCCCGGC ACTTTGATTG OOGGCTCTAT GGAGGATATT 960 CCT GTG GAA GAA GCA GTC CTT ACC GGT GTC GCA ACC GAC AAG TCC GAA 1008

Met Glu Glu Alá Val Leu Thr Gly Val Alá Thr Asp Lys Ser Glu

1

5

10

15

GCC

AAA

GTA

ACC

GTT

CTG GGT

ATT

TCC

GAT

AAG

CCA

GGC

GAG

GCT

GÓC

1056

Alá

Lys

Val

Thr

Val

Leu Gly

Ile

Ser

Asp

Lys

Pro

Gly

Glu

Alá

Alá

20

25

30

AAG

GTT

TTC

CGT

GCG

TTG GCT

GAT

GCA

GAA

ATC

AAC

ATT

GAC

ATG

GTT

1104

Lys

Val

Phe

Arg

Alá

Leu Alá

Asp

Alá

Glu

Ile

Asn

Ile

Asp

Met

Val

35

40

45

CTG

CAG

AAC

GTC

TCC

TCT GTG

GAA

GAC

GGC

ACC

ACC

GAC

ATC

ACG

TTC

1152

Leu

Gin

Asn

Val

Ser

Ser Val

Glu

Asp Gly

Thr

Thr

Asp

Ile

Thr

Phe

50

55

60

HU 219 600 Β

ACC TGC

CCT CGC GCT GAC

GGA CGC CGT GCG ATG GAG ATC TTG AAG AAG

1200

Thr

Cys 65

Pro Arg

Alá

Asp

Gly 70

Arg

Arg Alá

Met Glu 75

Ile

Leu

Lys Lys

CTT

CAG

GTT CAG

GGC

AAC

TGG

ACC

AAT GTG

CTT TAC

GAC

GAC

CAG GTC

1248

Leu

Gin

Val Gin

Gly

Asn

Trp

Thr

Asn Val

Leu Tyr Asp

Asp

Gin Val

80

85

90

95

GGC

AAA

GTC TCC

CTC

GTG

GGT

GCT

GGC ATG

AAG TCT

CAC

CCA

GGT GTT

1296

Gly

Lys

Val Ser

Leu

Val

Gly

Alá

Gly Met

Lys Ser

His

Pro

Gly Val

100

105

110

ACC

GCA

GAG TTC

ATG

GAA

GCT

CTG

CGC GAT

GTC AAC

GTG

AAC

ATC GAA

1344

Thr

Alá

Glu Phe

Met

Glu

Alá

Leu

Arg Asp

Val Asn

Val

Asn

Ile Glu

115

120

125

TTG

ATT

TCC ACC

TCT

GAG

ATC

CGC

ATT TCC

GTG CTG

ATC

CGT

GAA GAT

1392

Leu

Ile

Ser Thr

Ser

Glu

Ile

Arg

Ile Ser

Val Leu

Ile

Arg

Glu Asp

130

135

140

GAT

CTG

GAT GCT

GCT

GCA

CGT

GCA

TTG CAT

GAG CAG

TTC

CAG

CTG GGC

1440

ASp

Leu

Asp Alá

Alá

Alá

Arg

Alá

Leu His

Glu Gin

Phe

Gin

Leu Gly

145

150

155

GGC

GAA

GAC GAA

GCC

GTC

GTT

TAT

GCA GGC

ACC GGA

CGC

TAAAGTTTTAA

1490

Gly

Glu

Asp Glu

Alá

Val

Val

Tyr

Alá Gly

Thr Gly Arg

160

165

170

172

AGGAGTAGTT TTACAATGAC CAOCATCGCA GTTGTTGGTG CAACCGGCCA GGTCGGCCAG 1550 GTTATGCGCA CCCTTTTGGA AGAGCGCAAT TTOOCAGCTG ACACTGTTCG TTTCTTTGCT 1610 TCCCCGCGTT CCGCAGGCCG TAAGATTGAA TTC 1643

TUDNIVALÓK A 8. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ: (D) ALAK: lineáris (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK: 35 (ii) MOLEKULA TÍPUSA: protein (A) HOSSZÚSÁG: 172 aminosav (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 8. SZÁMÚ SZEK(B) TÍPUS: aminosav VENCIA:

Met Glu Glu Alá Val Leu Thr Gly Val Alá Thr Asp Lys Ser Glu Alá 15 10 15

Lys Val Thr Val Leu Gly Ile Ser Asp Lys Pro Gly Glu Alá Alá Lys 20 25 30

Val Phe Arg Alá Leu Alá Asp Alá Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu 35 40 45

Gin Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr 50 55 60

Cys Pro Arg Alá Asp Gly Arg Arg Alá Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu 65 70 75 80

Gin Val Gin Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gin Val Gly

90 95

Lys Val Ser Leu Val Gly Alá Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr 100 105 110

Alá Glu Phe Met Glu Alá Leu Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu 115 120 125

HU 219 600 Β

Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp 130 135 140

Leu Asp Alá Alá Alá Arg Alá Leu His Glu Gin Phe Gin Leu Gly Gly 145 150 155 160

Glu Asp Glu Alá Val Val Tyr Alá Gly Thr Gly Arg

165 170

TUDNIVALÓK A 9. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ: 10 (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 16 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris 15 (ii) MOLEKULA TÍPUSA: szintetikus DNS (iii) HIPOTETIKUS: nem (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 9. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

AAAAACCTGC GTTCTC 16 20

TUDNIVALÓK A 10. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú 25 (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: szintetikus DNS (iii) HIPOTETIKUS: nem (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 10. SZÁMÚ SZEKVENCIA: 30

TGACTTAAG GTTTACAGGCC 20

TUDNIVALÓK A 11. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav 35 (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: szintetikus DNS (iii) HIPOTETIKUS: nem (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 11. SZÁMÚ SZÉK- 40 VENCIA:

ACTGAATTCC AAATGTCCGC 20

TUDNIVALÓK A 12. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 16 45 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: szintetikus DNS (iii) HIPOTETIKUS: nem 50 (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 12. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

AAGTGCAGG CCGTTT 16

Claims (14)

SZABADALMI IGÉNYPONTOK
1. (1) a 625. helyzetben levő glutaminsav helyett lizin, (2) a 222. helyzetben levő arginin helyett hisztidin és a 223. helyzetben levő glutaminsav helyett lizin, (3) a 288. helyzetben levő szerin helyett fenil-alanin, a 289. helyzetben levő glutaminsav helyett lizin, az 551. helyzetben levő metionin helyett izoleucin és a 804. helyzetben levő glutaminsav helyett lizin, (4) a 867. helyzetben levő alanin helyett treonin, (5) a 438. helyzetben levő arginin helyett cisztein, (6) a 620. helyzetben levő lizin helyett szerin.

   (1) a 625. helyzetben levő glutaminsavat ettől eltérő aminosavval helyettesítő mutáció, (2) a 222. helyzetben levő arginint ettől eltérő aminosavval, valamint a 223. helyzetben levő glutaminsavat ettől eltérő aminosavval helyettesítő mutáció, (3) a 288. helyzetben levő szerint ettől eltérő aminosavval, a 289. helyzetben levő glutaminsavat ettől eltérő aminosavval, az 551. helyzetben levő metionint ettől eltérő aminosavval, valamint a 804. helyzetben levő glutaminsavat ettől eltérő aminosavval helyettesítő mutáció, (4) a 867. helyzetben levő alanint ettől eltérő aminosavval helyettesítő mutáció, (5) a 438. helyzetben levő arginint ettől eltérő aminosavval helyettesítő mutáció, (6) a 620. helyzetben levő lizint ettől eltérő aminosavval helyettesítő mutáció.

   1. Mutáns foszfo-enolpiruvát-karboxiláz, amely az Escherichia nemzetségbe tartozó mikroorganizmusból származik, és olyan mutációval rendelkezik, amely de- 60 szenzibilizálja az enzimet az aszparaginsav által kiváltott feedback gátlással szemben, és amely mutációként az alábbiak valamelyikét tartalmazza a foszfo-enolpiruvát-karboxiláz N-terminálisától számított megadott helyzetben:
2. 2. Az 1. igénypont szerinti foszfo-enolpiruvát-karboxiláz, amely mutációként az alábbi aminosavcserék valamelyikét tartalmazza:
3. 3. DNS-fragmens, amely az 1. vagy 2. igénypont szerinti foszfo-enolpiruvát-karboxilázt kódolja.
4. 4. Escherichia vagy Corynebacterium nemzetségbe tartozó mikroorganizmus, amely egy, a 3. igénypont szerinti DNS-fragmenssel, a kromoszomális DNS-be integrált formában van transzformálva.
5. 5 hogy egy, a 8. igénypont szerinti eljárással szelektált E. coliból mutáns foszfo-enolpiruvát-karboxilázt kódoló DNS-fragmenst izolálunk.

   5. Rekombináns DNS, amely egy, a 3. igénypont szerinti DNS-fragmens és egy, az Escherichia vagy Corynebacterium nemzetségbe tartozó mikroorganizmus sejtjeiben autonóm replikációra képes vektor ligálásával van kialakítva.
6. 6. Escherichia vagy Corynebacterium nemzetségbe tartozó mikroorganizmus, amely egy, az 5. igénypont szerinti rekombináns DNS-sel van transzformálva.
7. 7. Eljárás aminosav előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely a 4. vagy 6. igénypont szerinti mikroorganizmust alkalmas tápközegen tenyésztünk, és a tápkö27

   HU 219 600 Β zegból L-lizint, L-treonint, L-metionint, L-izoleucint, Lglutaminsavat, L-arginint vagy L-prolint különítünk el.
8. 8. Eljárás olyan mutáns foszfo-enolpiruvát-karboxilázt termelő E. coli szelektálására, amely az enzimet az aszparaginsav által kiváltott feedback gátlással szemben deszenzibilizáló mutációval rendelkezik, azzal jellemezve, hogy az E. colit 3-bróm-piroszőlősav, aszpartinsav-|3-hidrazid vagy DL-treo-p-hidroxi-aszpartinsav jelenlétében tenyésztjük.
9. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az 1. vagy 2. igénypont szerinti mutáns foszfoenolpiruvát-karboxilázt termelő E. colit szelektálunk.
10. 10. Eljárás aminosav előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, a 8. igénypont szerinti eljárással szelektált E. colit alkalmas tápközegen tenyésztünk, és a tápközegből L-lizint, L-treonint, L-metionint, L-izoleucint, Lglutaminsavat, L-arginint vagy L-prolint különítünk el.
11. 11. Eljárás mutáns foszfo-enolpiruvát-karboxiláz előállítására, azzaljellemezve, hogy egy, a 8. igénypont szerinti eljárással szelektált E. coliból foszfo-enolpiruvátkarboxilázt különítünk el.
12. 12. Eljárás mutáns foszfo-enolpiruvát-karboxilázt kódoló DNS-fragmens előállítására, azzal jellemezve,
13. 13. Eljárás mutáns foszfo-enolpiruvát-karboxilázt termelő mikroorganizmus előállítására, azzal jellemezik ve, hogy egy Escherichia vagy Corynebacterium nemzetségbe tartozó mikroorganizmusba egy, a 12. igénypont szerinti eljárással előállított DNS-fragmenst viszünk be.
14. 14. Eljárás aminosav előállítására, azzal jellemezve, 15 hogy egy, a 13. igénypont szerinti eljárással előállított mikroorganizmust alkalmas tápközegen tenyésztünk, és a tápközegből L-lizint, L-treonint, L-metionint, L-izoleucint, L-glutaminsavat, L-arginint vagy L-prolint különítünk el.