PL181380B1 - zmutowana karboksylaze, zrekombinowany DNA, mikroorganizm zawierajacy DNA kodujacy zmutowana karboksylaze, sposób wytwarzania aminokwasu, sposób selekcji E. coli, oraz sposób wytwarzania zmutowanej karboksylazy PL PL PL PL PL PL - Google Patents

Abstract

1. Zmutowana karboksylaza fosfoenolopirogronianowa pochodzaca z mikroorganizmu nalezacego do rodzaju Escherichia, znamienna tym, ze liczac od konca N zawiera zmiane w tej sekwencji aminokwasowej dobrana sposród grupy obejmujacej zmiane zastepujaca: (1) kwas glutaminowy w pozycji 625 lizyna, (2) argimne w pozycji 222 histydyna i kwas glutaminowy w pozycji 223 lizyna, oraz (3) alanine w pozycji 867 treonina, i nie jest hamowana na zasadzie sprzezenia zwrotnego przez kwas asparaginowy. 5. Fragment DNA kodujacy zmutowana karboksylaze fosfoenolopirogronianowa po- chodzacy z mikroorganizmu nalezacego do rodzaju Escherichia, znamienny tym, ze zawiera mutacje wybrana z grupy obejmujacej: (1) mutacje zastepujaca kwas glutaminowy w pozycji 625 lizyna, (2) mutacje zastepujaca odpowiednio arginine w pozycji 222 histydynai kwas glutami- nowy w pozycji 223 lizyna, oraz (3) mutacje zastepujaca alanine w pozycji 867 treonina, liczac od konca N karboksylazy fosfoenolopirogronianowej, po której kodowana przez ten DNA karboksylaza fosfoenolopi- rogronianowa nie jest hamowana na zasadzie sprzezenia zwrotnego przez kwas asparaginowy. PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest zmutowana karboksylaza fosfoenolopirogronianową, fragment DNA kodujący zmutowaną karboksylazę, zrekombinowany DNA, mikroorganizm zawierający DNA kodujący zmutowaną karboksylazę, sposób wytwarzania aminokwasu, sposób selekcji E.coli oraz sposób wytwarzania zmutowanej karboksylazy. Zmutowana karboksylaza zawiera mutację, w wyniku której, nie jest hamowana na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez kwas asparaginowy.

Karboksylaza fosfoenolopirogronianową jest enzymem występującym w prawie wszystkich bakteriach i we wszystkich roślinach. Rola tego enzymu polega na biosyntezie kwasu asparaginowego i kwasu glutaminowego oraz dostarczaniu kwasu dikarboksylowego o czterowęglowym łańcuchu do cyklu kwasu cytrynowego do utrzymania jego obiegu. Jednakże, jeśli chodzi o fermentacyjne wytwarzanie aminokwasu z zastosowaniem mikroorganizmów, jest kilka prac dotyczących wpływu tego enzymu, ale nie został on wyjaśniony (Atsushi Yokota i Isamu Shno, Agric. Biol. Chem., 52,455-463 (1988), Josef Cremer i in., Appl. Environ. Microbiol., 57, 1746-1752 (1991), Petra, G. Peters Weinstisch, FEMS Microbiol. Letters, 112,269-274 (1993)).

Mówiąc ogólnie, aminokwas jest związkiem, który powszechnie występuje w komórkach j ako składnik białek, jednakże, ze względów ekonomicznych metabolizmu energetycznego, j ego wytwarzanie jest ściśle kontrolowane. Kontrola ta polega głównie na kontroli przez sprzężenie zwrotne, w którym produkt końcowy szlaku metabolicznego hamuje aktywność enzymu katalizującego wcześniejszy etap szlaku. Ekspresja aktywności karboksylazy fosfoenolopirogronianowej także podlega różnej regulacji.

Na przykład, w przypadku karboksylazy fosfoenolopirogronianowej mikroorganizmów należących do rodzaju Corynebacterium lub rodzaju Escherichia, aktywność jest hamowana przez kwas asparaginowy. Dlatego też, wspomniana powyżej biosynteza aminokwasów, w której uczestniczy karboksylaza fosfoenolopirogronianową, jest również hamowana przez kwas asparaginowy.

Uprzednio opracowano różne techniki wydajnego wytwarzania na drodze fermentacji aminokwasowej, i fermentacyjne wytwarzanie przeprowadzono dla leucyny, izoleucyny, tryptofanu, fenyłoalaniny i podobnych przez użycie szczepów mutantów tak przekształconych, że były nie

181 380 wrażliwe na kontrolę na zasadzie sprzężenia zwrotnego. Jednakże, nie był znany ani żaden mutant karboksylazy fosfoenolopirogromanowej przekształcony tak, żeby był niewrażliwy na kontrolę przez kwas asparaginowy, ani próba wykorzystania go do fermentacyjnego wytwarzania aminokwasów z rodziny kwasu asparaginowego i rodziny kwasu glutaminowego.

Z drugiej strony, sklonowane już gen ppc, który jest genem kodującym karboksylazę fosfoenolopirogromanową Lscńericńza coli, i określono również jego sekwencję nukleotydową (Fujita, N.,Miwa, T.,Ishijima, S.,Izui, K. iKatsuki,‘H . J. Blochem., 95.909-916 (1984)). Jednakże, nie ma doniesień na temat mutanta, w którym zniesiona jest wrażliwość na hamowanie przez kwas asparaginowy.

Podstawą niniejszego wynalazku są wyżej wspomniane przesłanki; jego celem jest dostarczenie zmutowanej karboksylazy fosfoenolopirogromanowej o zasadniczo zniesionej wrażliwości na hamowanie na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez kwas asparaginowy, genu ją kodującego oraz sposobu jej wykorzystania.

W wyniku skrupulatnych badań mających prowadzić do osiągnięcia wspomnianego powyżej celu, twórcy niniejszego wynalazku stwierdzili, że wrażliwość na hamowanie przez kwas asparaginowy ulega zasadniczemu zniesieniu przez zastąpienie aminokwasu w konkretnym miejscu karboksylazy fosfoenolopirogromanowej Escherichia coli innym aminokwasem i udało im się otrzymać gen kodujący taki zmutowany enzym i zrealizować wynalazek.

Mianowicie, wynalazek obejmuje zmutowaną karboksylazę fosfoenolopirogromanową która pochodzi z mikroorganizmu należącego do rodzaju Escherichia i posiada mutację znoszącą wrażliwość na hamowanie na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez kwas asparaginowy, oraz sekwencji DNA kodującej zmutowaną karboksylazę fosfoenolopirogromanową.

Niniejszy wynalazek obejmuje ponadto mikroorganizmy należące do rodzaju Escherichia lub maczugowców zawierające fragment DNA oraz sposób wytwarzania aminokwasu, zgodnie z którą którykolwiek z tych mikroorganizmów hoduje się w korzystnym podłożu i aminokwas wybrany spośród L-lizyny, L-treoniny, L-metioniny, L-izoleucyny, kwasu L-glutaminowego, L-argininy, i L-proliny wydziela się z podłoża.

W tym opisie sekwencję DNA kodującą zmutowaną karboksylazę fosfoenolopirogromanową bądź sekwencję DNA zawierającąpoza niąpromotor, nazywa się czasami po prostu, „sekwencją DNA według niniejszego wynalazku”, „zmutowanym genem” lub genem karboksylazy fosfoenolopirogromanowej”.

Niniejszy wynalazek zostanie szczegółowo wyjaśniony poniżej.

< 1 > Zmutowana karboksylaza fosfoenolopirogromanową

Zmutowana karboksylaza fosfoenolopirogromanową według wynalazku (w dalszym ciągu nazywana po prostu „zmutowanym enzymem”) jest karboksylazą fosfoenolopirogronianowąmikroorganizmu należącego do rodzaju Escherichia, która posiada mutację znoszącą wrażliwość na hamowanie na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez kwas asparaginowy.

Mutacja taka może być dowolna, pod warunkiem, że w jej wyniku nastąpi zasadnicze zniesienie wrażliwości na wspomniane powyżej hamowanie na zasadzie sprzężenia zwrotnego bez utraty aktywności enzymatycznej karboksylazy fosfoenolopirogromanowej; przykładem takiej mutacji może być mutacja karboksylazy fosfoenolopirogromanowej, która komórkom mikroorganizmu należącego do rodzaju Escherichia zawierającym tak zmutowaną karboksylazę fosfoenolopirogromanową, nadaje oporność na związek posiadający następujące właściwości:

wyk azuje działanie hamujące wzrost wobec mikroorganizmu należącego do rodzaju Escherichia, który wytwarza karboksylazę fosfoenolopirogromanową typu dzikiego;

wyżej wspomniane działanie hamujące wzrost ulega zniesieniu w obecności kwasu L-glutammowego lub kwasu L-asparagmowego; i hamuje aktywność karboksylazy fosfoenolopirogromanowej typu dzikiego.

Bardziej konkretnie, przykładowymi mutacjami, mogąbyć, licząc od końca N karboksylazy fosfoenolopirogromanowej.

(1) mutacja zastąpienia kwasu glutaminowego w pozycji 625 lizyną

181 380 (2) mutacja zastąpienia argininy w pozycji 222 histydynąi kwasu glutaminowego w pozycji 223 lizyną;

(3) mutacja zastąpienia seryny w pozycji 228 fenyloalaniną, kwasu glutaminowego w pozycji 289 lizyną metioniny w pozycji 551 izoleucynąi kwasu glutaminowego w pozycji 804 lizyną (4) mutacja zastąpienia alaniny w pozycji 867 treonmą (5) mutacja zastąpienia argininy w pozycji 438 cysteiną i (6) mutacja zastąpienia lizyny w pozycji 620 seryną

Przykładowo, jako karboksylazę fosfoenolopirogronianowąmikroorganizmu należącego do rodzaju Escherichia, w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2 w Liście Sekwencji przedstawiono sekwencję aminokwasową przewidzianą na podstawie genu karboksylazy fosfoenolopirogromanowej Escherichia coli (Fujita, N., Miwa, T., Ishijima, S., Izui, K. i Katsuki, H., L Biochem, 95,909-916(1984). Ponadto, całąsekwencjęnukleotydowąplazmidupT2, który zawiera gen karboksylazy fosfoenolopirogronianowej Escherichia coli, wraz z sekwencją aminokwasową przedstawiono w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 1.

Wyżej wspomniane zmutowane enzymy kodowane są przez opisaną poniżej sekwencję DNA według niniejszego wynalazku i wytwarzane w wyniku ekspresji sekwencji DNA wEscherichia coli i w podobnych mikroorganizmach.

<2 > Sekwencja DNA według wynalazku i zawierające ją mikroorganizmy

SekwencjąDNA według mniejszego wynalazku jest sekwencja DNA kodująca wyżej wspomniane zmutowane enzymy i posiadająca, w regionach kodujących fragmentów DNA kodujących karboksylazę fosfoenolopirogronianową mikroorganizmu należącego do rodzaju Escherichia, mutację znoszącą wrażliwość na hamowanie karboksylazy fosfoenolopirogronianowej przez kwas asparaginowy na zasadzie sprzężenia zwrotnego.

Konkretnie, przykładem takiej sekwencji może być sekwencja DNA kodującąkarboksylazę fosfoenolopirogronianową posiadająca jakąkolwiek z wyżej wspomnianych mutacji (1) do (6); na przykład, odnosząc się do sekwencji nukleotydowej o numerze identyfikacyjnym: 1, może ona stanowić przykład sekwencji DNA posiadającej którąkolwiek z mutacji:

i) mutację zmieniającą zasady GAA o numerach 2109-2111 w AAA lub AAG;

u) mutację zmieniającą zasady CGC o numerach 900-902 w CAT lub CAC, a zasady GAA o numerach 903-905 w AAA lub AAG;

iii) mutację zmieniającą zasady TCT o numerach 1098-1100 w TTT lub TTC, zasady GAA o numerach 1101-1103 w AAA lub AAG, zasady ATG o numerach 1887-1889 w ATT, ATC lub ATA i zasady GAA o numerach 2646-2648 w AAA lub AAG;

iv) mutację zmieniającą zasady GCG o numerach 2835-2837 w którekolwiek spośród ACT, ACC, ACA i ACG; i

v) mutację zmieniającą zasady CGT o numerach 1548-1550 w TGT lub TGC; i vi) mutację zmieniającą zasady AAA o numerach 2094-2096 w TCT, TCC, TCA lub TCG.

Taki zmutowany gen otrzymuje się w taki sposób, że zrekombinowany DNA, który uzyskuje się przez hgację genu karboksylazy fosfoenolopirogronianowej w postaci genu enzymu typu dzikiego lub posiadającego inną mutację, z DNA wektora przystosowanego do gospodarza, poddaje się mutagenezie, aby przeprowadzić przeszukiwanie bakterii stransformowanych zrekombinowanym DNA. Alternatywnie, dopuszczalne jest również, że mutagenezie poddaje się mikroorganizm wytwarzający enzym typu dzikiego, tworząc szczep wytwarzający enzym zmutowany, a następnie zmutowany szczep przeszukuje się pod kątem zmutowanego genu. Do mutagenezy zrekombinowanego DNA można zastosować hydroksyloaminę i podobne czynniki. Ponadto, gdy mutagenezie poddaje się sam mikroorganizm, można stosować związek lub metodę zazwyczaj stosowane w przypadku mutacji indukowanych.

Ponadto, zgodnie z takimi sposobami, jak spośród wydłużania regionów zachodzących (Ho, S.N., Hunt, H.D., Horton, R.M., Pullen, J.K. i Pease, L.R., Gene, 77,51-59 (1989)), metoda mutagenezy ukierunkowanej (Kramer, W. iFrits, H. J.,Meth.mEnzymol„ 154.350 (1987); Kunkel, T.A. i in. Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)) i podobne, wyżej wspomniany zmutowany gen można również otrzymać przez wprowadzenie mutacji, takiej jak zastąpienie, insercja, dele cja aminokwasu i podobne, do genu karboksylazy fosfoenolopirogronianowej będącego genem enzymu typu dzikiego lub posiadającym innąmutację. Sposoby te oparte sąna zasadzie, że DNA genu me zmutowanego stosuje się jako matrycę, a syntetyczny DNA, zawierający niekomplementame zasady jako mutację punktową, stosuje się jako jeden ze starterów do syntezy komplementarnej nici wyżej wspomnianego DNA genu, i w ten sposób wprowadza się mutację. Stosując te metody możliwe jest spowodowanie zamierzonej mutacji w docelowym miejscu.

Alternatywnie, syntetyzuje się sekwencję, która posiada na obu końcach końce powstające przez rozszczepienie enzymem restrykcyjnym, i wymienia się na nią odpowiednią część genu nie zmutowanego, w ten sposób wprowadzając mutację (metoda kasetki mutacyjnej).

Gen karboksylazy fosfoenolopirogronianowej, który jest genem enzymu typu dzikiego lub posiada innąmutację, przeznaczony do wprowadzenia mutacji, może być jakikolwiek, pod warunkiem, że jest on genem kodującym karboksylazę fosfoenolopirogronianową mikroorganizmu należącego do rodzaju Escherichia, korzystnie dla którego określono sekwencję zasad i sklonowane go. Jeśli nie został on sklonowany, fragment DNA zawierający gen można zamplifikować i wyizolować stosując metodę PCR i podobne, a następnie stosując odpowiedni wektor uzyskać sklonowanie.

Przykładem opisanego powyżej genu może być sklonowany mający określoną sekwencję, zasad gen Escherichia coli (Fujita, N., Miwaq, T., Ishijima, S., Izui, K. i Katsuki, H., J. Blochem.. 95,909-916 (1984)). Sekwencja regionu kodującego tego genujest taka, jak przedstawiono w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 1 (zasady o numerach 237-2888).

Przeszukiwanie pod kątem gospodarza zawierającego zmutowany gen można prowadzić stosując związek będący analogiem kwasu asparaginowego. Analog korzystnie posiada następujące właściwości. Mianowicie, wykazuje on działanie hamujące wzrost wobec mikroorganizmu należącego do rodzaju Escherichia, który wytwarza karboksylazę fosfoenolopirogronianową typu dzikiego, wyżej wspomniane działanie hamujące wzrost ulega zniesieniu w obecności kwasu L-glutaminowego lub kwasu L-asparaginowego oraz hamuje on aktywność karboksylazy fosfoenolopirogronianowej typu dzikiego.

Jeśli zmutowany szczep oporny na wspomniany powyżej analog selekcjonuje się z mikroorganizmu należącego do rodzaju Escherichia, na przykład Escherichia coli HB101, wytwarzającego karboksylazę fosfoenolopirogronianową typu dzikiego, stosując hamowanie wzrostu mikroorganizmu jako wskaźnik, otrzymanie mikroorganizmu gospodarza wytwarzającego karboksylazę fosfoenolopirogromanowąpozbawioną wrażliwości na hamowanie na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez kwas asparaginowy jest bardziej prawdopodobne.

Jako ogólną strukturę inhibitora karboksylazy fosfoenolopirogronianowej proponuje się zasadniczo strukturę kwasu dikarboksylowego o czterowęglowym łańcuchu. Wychodząc z takiego założenia twórcy nmiej szego wynalazku poddali testowaniu różne związki. Escherichia coli hodowano w podłożu LB i przenoszono do podłoża M9 (zawierającego 9 pg/ml tiaminy i po 3 pg/ml Leu i Pro) zawierającego którykolwiek z kwasu DL-2-amino-4-fosfonomasłowego, kwasu bromobursztynowego, kwasu mezo-2,3-dibromobursztynowego, kwasu 2,2-difluorobursztynowego, kwasu 3-bromopirogronowego, kwasu α-ketomasłowego, kwasu α-ketoadypinowego, kwasu DL-treo-P-hydroksyasparaginowego, estru β-metylowego kwasu L-asparaginowego, kwasu α-metylo-DL-asparaginowego, kwasu 2,3-diaminobursztynowego lub β-hydrazydu kwasu asparaginowego i po różnych czasach mierzono absorbancję podłoża przy długości fali 660 nm, w ten sposób monitorując wzrost.

Ponadto, gdy związki te były obecne w ich stężeniach hamujących wzrost, badano, czy hamowanie ulega zniesieniu przez dodanie kwasów nukleinowych (po 10 mg/dl urydyny i adenozyny), kwasu glutaminowego lub aminokwasów z rodziny kwasu asparaginowego (Asp 0,025%, każdy z Met, Thr, Lys: 0,1%).

W rezultacie, wybrano trzy związki: 3-bromopirogronian (3BP) (wzór 1), β-hydrazyd asparagmianu (AHY) (wzór) 2) i DL-treo-p-hydroksyasparaginian (βΗΑ) (wzór 3).

181 380

COOH

I c=o

I CH₂Br

CONHNH₂

HCH I h₃nch

COOH

COOH I HCOH

I

H₃NCH

I

COOH wzór 1 wzór 2 wzór 3

Hamowanie wzrostu Escherichia coli przez te analogi przedstawiono na fig. 1-3. Ponadto, przywracanie wzrostu Escherichia coli w przypadku dodania wyżej wspomnianych substancji znoszących hamowanie, samych lub w postaci mieszanin 2 lub 3 rodzajów, przedstawiono na fig. 4-6. Ponadto, jako kontrolę, na fig. 7 przedstawiono wzrost w przypadku dodania substancji znoszącej hamowanie w nieobecności substancji hamującej. Na fig. 4-7 dodane substancje 1,2 i 3 wskazująodpowiednio kwasy nukleinowe, kwas glutaminowy lub aminokwasy z rodziny kwasu asparaginowego.

Ponadto, badano hamowanie aktywności karboksylazy fosfoenolopirogronianowej przez analog. Nieoczyszczony enzym przygotowywano ze szczepu HB101 Escherichia coli zgodnie z metodą opisaną w The Journal of Biochemistry. tom 67, nr 4, (1970) i aktywność enzymu mierzono zgodnie z metoda opisana w Eur. J. Biochem., 202, 797-803 (1991).

Escherichia coli HB101 hodowano w podłożu LB zhomogenizowano i zawiesinę wirowano dla otrzymania supematantu, który stosowano jako roztwór nieoczyszczonego enzymu. Pomiar aktywności enzymu prowadzono przez pomiar zmniej szenia się absorbancj i przy długości fali 340 nm w układzie pomiarowym zawierającym 2 mM fosfoenolopirogronian, 0,1 mM NADH, 0, IM Tris-octan (pH 8,5), 1,5 U dehydrogenazy jabłczanowej i nieoczyszczony enzym, w obecności acetylo-koenzymu A o stężeniu 0,1 mM, o którym wiadomo, że wpływa na aktywność.

Na podstawie powyższych wyników, okazało się, że wyżej wspomniane trzy związki hamują wzrost Escherichia coli, hamowanie to nie ulega zniesieniu w wyniku dodania samych kwasów nukleinowych, ale hamowanie może ulec zniesieniu przez dodanie kwasu glutaminowego lub aminokwasów z rodziny kwasu asparaginowego. Dlatego też, postulowano, że te analogi są selektywnymi inhibitorami karboksylazy fosfoenolopirogronianowej. Jak wykazano w opisanych poniżej przykładach, stosując te związki twórcom niniejszego wynalazku udało się wyselekcjonować E.coli, która wytwarza zmutowaną karboksylazę fosfoenolopirogromanową.

Gdy transformant posiadający zamierzony gen zmutowanego enzymu selekcjonuje się przy użyciu wyżej wspomnianych związków, i odzyskuje się zrekombinowany DNA, otrzymuje się gen zmutowanego enzymu. Alternatywnie, w przypadku mutagenezy, samego mikroorganizmu, gdy zmutowany szczep posiadający zamierzony gen zmutowanego enzymu selekcjonuje się przy zastosowaniu wyżej wspomnianych związków, ze szczepu izoluje się fragment DNA zawierający zamierzony gen zmutowanego enzymu, i liguje się go z odpowiednim wektorem, otrzymując gen zmutowanego enzymu.

Z drugiej strony, w wyniku skrupulatnych badań twórców niniejszego wynalazku, zwracających uwagę na ważność reszty arginmy w białku wiążącym asparagiman Escherichia coli

181 380 (Knkos, A., Mouth. N., Boyd, A. i Simon, M.I. Celi, 33, 615-622 (1983), Mowbray, S.L. i Koshland, D.E. J.Biol Chem . 264,15638-15643 (1990), Milbum, M.V., Pnve, G.G., Milhgan, D.L., Scott, W.G., Yeh, J., Jancarik, J., Koshland, D.E. i Kim, S.H., Science, 254, 1342-1347 (1991), stwierdzono, że wrażliwość na hamowanie przez kwas asparaginowy ulega zasadniczemu zniesieniu przez zamianę argininy w pozycji 438 karboksylazy fosfoenolopirogronianowej w cysteinę. W celu zamiany argininy w pozycji 438 w cysteinę, kodon argininy w pozycji 438 genu kodującego karboksylazę fosfoenolopirogronianową można zmienić w kodon cysteiny. Na przykład, w sekwencji o numerze identyfikacyjnym· 1, CGT w pozycjach 1548-1550 można zmienić w TGT lub TGC.

Ponadto, twórcy niniejszego wynalazku przeprowadzili chemicznąmodyfikację reszt lizyny karboksylazy fosfoenolopirogronianowej przy użyciu kwasu 2,4,6-trinitrobenzenosulfonowego (TNBS), który jest związkiem do chemicznego modyfikowania reszt hzyny białek. Podczas reakcji modyfikacji, jednocześnie był obecny kwas jabłkowy, który może służyć jako inhibitor karboksylazy fosfoenolopirogronianowej. Mianowicie, założono, że reszta lizyny w pobliżu pozycji wiązania karboksylazy fosfoenolopirogronianowej powinna być ochraniana przez związany kwas jabłkowy i nie zostać poddana chemicznej modyfikacji. W rezultacie, sugerowano, że reszta lizyny w pozycji 620 była ważna dla wiązania kwasu jabłkowego z karboksylazą fosfoenolopirogronianową i stwierdzono, że wrażliwość na hamowanie na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez kwas asparaginowy ulega zniesieniu przy utrzymaniu aktywności enzymatycznej karboksylazy fosfoenolopirogronianowej przez zamianę reszty lizyny w pozycji 620 w resztę seryny. W celu zamiany reszty hzyny w pozycji 620 w resztę seryny, kodon hzyny w pozycji 620 genu kodującego karboksylazę fosfoenolopirogronianowąmożna zamienić w kodon seryjny. Na przykład, w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 1, AAA w pozycjach 2094-2096 można zastąpić TCT, TCC, TCG, AGT lub AGC.

Zgodnie z takimi sposobami, jak sposób wydłużania regionów zachodzących (Ho, S.N., Hunt, H.D., Horton, R.M , Pullen, J.K. i Pease, L.R., Gene, 77,51-59 (1989)), sposób mutagenezy ukierunkowanej (Kramer, W. i Frits, H.J., Meth. in Enzymol.. 154,350 (1987); Kunkel, TA. i in. Meth. in Enzymol.. 154, 367 (1987)) i podobne, zmianę tego kodonu można także osiągnąć przez wprowadzenie mutacji, takiej jak zastąpienie, insercja, delecja i podobne, do genu karboksylazy fosfoenolopirogronianowej będącego genem eznymu typu dzikiego lub posiadającego inną mutację. Metody te opierająsię na zasadzie, że DNA genu nie zmutowanego stosuje się jako matrycę, a syntetyczny DNA, zawierający zasady niekomplementame jako mutację punktową stosuje się jako jeden ze starterów do syntezy komplementarnych nici wyżej wspomnianego DNA genu, w ten sposób wprowadzając mutację. Stosując te metody możliwe jest spowodowanie zamierzonej mutacji w miejscu docelowym.

Alternatywnie, syntetyzuje się sekwencję, która posiada na obu końcach powstające przez rozszczepienie enzymem restrykcyjnym, i wymienia się na nią odpowiadającą część genu nie zmutowanego, w ten sposób wprowadzając mutację (metoda kasetki mutacyjnej).

Fragment DNA kodujący karboksylazę fosfoenolopirogronianową z mutacją wprowadzonąjak opisano powyżej ulega ekspresji przez użycie odpowiedniego układu wektor-gospodarz, i w ten sposób możliwe jest wytworzenie zmutowanego enzymu. Alternatywnie, zamierzony zmutowany enzym można wytworzyć w wyniku transformacji przez integrację fragmentu DNA według niniejszego wynalazku z chromosomalnym DNA gospodarza.

Przykładowymi gospodarzami mogą być mikroorganizmy należące do rodzaju Escherichia na przykład Escherichia coli, maczugowce i podobne. Maczugowce obejmują bakterie należące do rodzaju Corynebacterium, bakterie należące do rodzaju Brevibacterium klasyfikowane dotychczas w rodzaju Brevibacterium, ale obecnie zaliczane do rodzaju Corynebacterium, oraz bakterie należące do rodzaju Brevibacterium, ściśle zbhzone do bakterii należących do rodzaju Corynebacterium. Ogólnie mówiąc, gospodarze preferowani do wytwarzania aminokwasów zostaną opisani poniżej.

Z drugiej strony, jako wektor DNA korzystny jest wektor plazmidowy i wektory zdolne do samoreplikacji w komórce gospodarza. Gdy gospodarzem jest Escherichia coli, przykładowo

181 380 mogą to być pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG399, RSF10101 podobne. Alternatywnie, wykorzystać można wektor będący fagowym DNA.

Ponadto, jeśli gospodarzem jest bakteria należąca do maczugowców, przykłady wektorów, które można zastosować i gospodarzy zawierających je podano poniżej. Numery depozytowe w międzynarodowych kolekcjach podano w nawiasach.

pAJ655 Escherichia coli AJ11882 (FERM BP-136)

Corynebacterium glutamicum SR8201 (ATCC 39135) pAJ1844 Escherichia coli AJ11883 (FERM BP-137)

Corynebacterium glutamicum SR8202 (ATCC 39136) pAJ611 Escherichia coli AJ11884 (FERM BP-138) pAJ3148 Corynebacterium glutamicum SR8203 (ATCC 39137) pAJ440 Bacillus subtilis AJ 11901 (FERM BP-140).

Wektory te można otrzymać ze zdeponowanych mikroorganizmów w następujący sposób. Komórki zebrane w fazie wzrostu logarytmicznego poddaje się baktenolizie przez zastosowanie hzozymu i SDS i wiruje przy 30000 x g dla otrzymania roztworu supematantu lizatu, do którego dodaje się glikolu polietylenowego w celu dokonania rozdziału i oczyszczenia wektorów przez równowagowe wirowanie w gradiencie gęstości chlorku cezu-bromku etydyny.

W celu transformacji Escherichia coli zrekombinowanym wektorem otrzymanym przez wstawienie sekwencji DNA według niniejszego wynalazku do wyżej wspomnianego wektora, możliwe jest zastosowanie metody zazwyczaj stosowanej do transformacji Escherichia coli, takiej jak sposób, w którym komórki traktuje się chlorkiem wapnia dla wzmocnienia przepuszczalności DNA (Mandel, M. i Higa, A., J.Mol. Biol., 53, 159 (1977), i podobnych.

Ponadto, sposobem transformowania maczugowców jest wyżej wspomniany sposób, w którym komórki traktuje się chlorkiem wapnia lub sposób, w którym inkorporację prowadzi się w określonym okresie wzrostu, w którym komórki mogą inkorporować DNA (praca dotycząca Bacillus subtilis Duncana, C.H. i in.). Ponadto, inkorporację komórek bakteryjnych można uzyskać poprzez tworzenie protoplastów lub sferoplastów biorców DNA, które łatwo inkorporują plazmidowy DNA. Są one znane dla Bacillus subtilis, Actinomycetes i drożdży (Chang, S. i in., Molec. Gen. Genet. 168,111 (1979), Bibb i in., Naturę, 274, 398 (1978), Hinnen, A. i m., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929 (1978)). Ponadto, sposób transformowania maczugowców ujawniono w japońskim wyłożemowym opisie patentowym numer 2-207791.

W celu ekspresji sekwencji DNA według niniejszego wynalazku w wyżej wspomnianych gospodarzach można zastosować taki promotor, jak lac, trp, PL i podobne, które efektywnie działają w mikroorganizmach lub, gdy sekwencja DNA według niniejszego wynalazku zawiera promotor genu karboksylazy fosfoenolopirogronianowej, można zastosować ją samą. Alternatywnie, gdy jako gospodarza stosuje się maczugowiec, możliwe jest także użycie znanego promotora trp pochodzącego z bakterii należącej do rodzaju Brevibacterium (japoński wyłożemowy opis patentowy numer 62-244382) i podobnych.

Ponadto, jak opisano powyżej, dopuszczalne jest, że sekwencję DNA według niniejszego wynalazku wstawia się do DNA wektora zdolnego do samoreplikacji i wprowadza do gospodarza, gdzie występuje ona w postaci plazmidu; dopuszczalne jest również, że sekwencję DNA według mniejszego wynalazku integruje się z chromosomem mikroorganizmu przez zastosowanie transpozonu (Berg., D.E. i Berg, C.M., Bio/Technol.. 1. 417 (1983)), faga Mu (japoński wyłożemowy opis patentowy numer 2-109985) lub rekombinacji homologicznej (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. (1972). Ponadto, w celu wprowadzenia DNA według niniejszego wynalazku do maczugowców, możliwe jest wykorzystanie wrażliwego na temperaturę plazmidu ujawnionego w japońskim wyłożeniowym opisie patentowym numer 5-7491.

Gdy hoduje się mikroorganizm stransformowany jak opisano powyżej sekwencją DNA według niniejszego wynalazku i ta sekwencja DNA ulega ekspresji, to otrzymuje się zmutowamy enzym. Dzięki pomiarowi aktywności z dodaniem kwasu asparaginowego do układu reakcji enzymatycznej staje się oczywiste, czy tak otrzymany zmutowany enzym wykazuje zniesienie wrażliwości na hamowanie na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez kwas asparaginowy. Możh

181 380 we jest zastosowanie do pomiaru aktywności enzymu metody spektrofotometrycznej (Yoshinage, T., Izui, K, i Katsuki, H., J.Biochem. 68, 747-750 (1970)) i podobnych.

Ponadto, sekwencja DNA według niniejszego wynalazku koduje zmutowany enzym, którego wrażliwość na hamowanie na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez kwas asparaginowy uległa zniesieniu, tak że mikroorganizm zawierający tę sekwencję DNA może zostać wykorzystany do wydajnego fermentacyjnego wytwarzania aminokwasów z rodziny kwasu asparaginowego i rodziny kwasu glutaminowego w sposób opisany poniżej.

Eschenchia coli AJ12907, AJ12908, AJ12909 i AJ 12910 zawierające geny zmutowanych enzymów, otrzymane w opisanych poniżej przykładach zdeponowano w National Institute of Bioscience and Humań Technology of Agency of Industrial Science and Technology (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonia; kod pocztowy 305) 3 sierpnia 1993 r. pod numerami depozytowymi FERM P-13774, FERM P-13775, FERM P-13776 i FERM P-13777, przeniesiono z pierwotnego depozytu do depozytu międzynarodowego działającego na warunkach Porozumienia Budapesztańskiego 11 lipca 1994 r i zdeponowano odpowiednio w tej kolejności pod następującymi numerami depozytowymi FERM-BP4734, FERM BP-4735, FERM BP-4736 i FERM BP-4737.

< 3 > Sposób wytwarzania aminokwasów

Aminokwasy można wytwarzać przez hodowanie mikroorganizmu zawierającego sekwencję DNA według niniejszego wynalazku w odpowiednim podłożu i wydzielanie tworzonych aminokwasów. Jako przykłady takich aminokwasów można wymienić L-lizynę, L-treoninę, L-metioninę, L-izoleucynę, kwas L-glutaminowy, L-argininę i L-prolinę.

Korzystni gospodarze, do których wprowadzono sekwencję DNA według niniejszego wynalazku w celu użycia do wytwarzania każdego z aminokwasów oraz metoda hodowli będą przykładowo przedstawione poniżej.

(1) Gospodarze korzystni dla sposobu wytwarzania aminokwasów według niniejszego wynalazku (i) Gospodarze korzystni przy wytwarzaniu L-lizyny

Jako przykłady gospodarzy przeznaczonych do stosowania do wytwarzania L-lizyny według niniejszego wynalazku można wymienić bakterie należące do rodzaju Eschenchia, korzystnie wytwarzające L-lizynę Escherichia coli. Konkretnie, przykład może stanowić zmutowany szczep wykazujący oporność na analog lizyny. Takim analogiem lizyny jest analog, który hamuje wzrost mikroorganizmów należących do rodzaju Escherichia, jednakże, wrażliwość na hamowanie ulega całkowitemu lub częściowemu zniesieniu pod warunkiem, że L-lizyna współwystępuje w podłożu. Na przykład, są to oksalizyna, 1,5-diaminokaprohydroksamian, S-(2-ammoetylo)-cysteina (oznaczona w dalszym ciągu niniejszego opisu skrótem „AEC”), γ-metylohzyna, α-chlorokaprolaktam i podobne. Zmutowane szczepy posiadające oporność na te analogi lizyny można otrzymać przez zwyczajną mutagenezę indukowaną mikroorganizmów należących do rodzaju Escherichia. Konkretnie, jako przykład szczepu bakteryjnego wykorzystywanego do wytwarzania L-lizyny można podać Escherichia coli AJ 11442 (zdeponowany jako FERM P-5084, patrz dolna kolumna po lewej stronie na stronie 471 japońskiego wyłożeniowego opisu patentowego numer 56-18596.

Z drugiej strony, do celów niniejszego wynalazku można stosować różne sztuczne zmutowane szczepy maczugowców, które stosowano jako bakterie wytwarzające L-hzynę. Takie sztuczne zmutowane szczepy są następujące: zmutowany szczep oporny na AEC, zmutowany szczep, który wymaga do wzrostu takiego aminokwasu, jak L-homoseryna (publikacje japońskich opisów patentowych o numerach 48-28078 i 56-6499), zmutowany szczep, który wykazuje oporność na AEC i wymaga takich aminokwasów, jak L-leucyna, L-homoseryna, L-prohna, L-seryna, L-arginina, L-alanina, L-walina, i podobne (opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach 370839513825472), wytwarzający L-hzynę zmutowany szczep, który wykazuje oporność na DL-a-amino-s-kaprolaktam, α-amino-laurylolaktam, chmoid, i N-lauroiloleucynę, wytwarzający L-lizynę zmutowany szczep, który wykazuje oporność na inhibitor dekarboksylazy szczawiooctanowej lub enzymów łańcucha oddechowego (japońskie wyłożę14

181 380 niowe opisy patentowe o numerach 50-53588, 50-31093, 52-102498, 53-86089, 55-9783, 55-9759, 56-32995 i 56-39778 oraz publikacje japońskich opisów patentowych o numerach 53-43591 i 53-1833), wytwarzający L-lizynę zmutowany szczep, który wymaga inozytolu lub kwasu octowego (japońskie wyłożemowe opisy patentowe o numerach 55-9784 i 56-8692), wytwarzający L-hzynę zmutowany szczep, który wykazuje wrażliwość na fluoropirogronian lub temperaturę nie niższą niż 34°C (japońskie wyłożemowe opisy patentowe o numerach 55-9783 i 53-86090) oraz zmutowany szczep Brevibacterium lub Corynebacterium, który wykazuje oporność na glikol polietylenowy i wytwarza L-lizynę (patrz zgłoszenie patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki numer kolejny 333455).

Poniżej znajdują się przykłady konkretnych bakterii należących do maczugowców wykorzystywanych do wytwarzania lizyny:

Brevibacterium lactofermentum AJ12031 (FERM-BP277), patrz strona 525 w japońskim wyłożeniowym opisie patentowym numer 60-62994;

Brevibacterium lactofermentum ATCC 39134, patrz dolna kolumna po prawej stronie, na stronie 473 w japońskim wyłożeniowym opisie patentowym numer 60-62994;

Brevibacterium lactofermentum AJ3463 (FERM-P1987), patrz publikacja japońskiego opisu patentowego numer 51-34477.

Ponadto, dla celów mniejszego wynalazku można również w taki sam sposób stosować opisane poniżej dzikie szczepy maczugowców.

Corynebacterium acetoacidophilum ATTC13870

Corynebacterium acetoglutamicum ATTC15806

Corynebacterium callunae ATTC15991

Corynebacterium glutamicum ATTC13032

ATCC 13060 (Brevibacterium divaricatum) ATCC14020 (Brevibacterium lactofermentum) ATCC13869 (Corynebacterium lilium) ATCC15990

Corynebacterium melassecola ATCC17965

Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066

Brevibacterium immariophilum ATCC14068

Brevibacterium roseum ATCC13825

Brevibacteriumflavum ATCC 13826

Brevibacterium thiogenitalis ATCC19240

Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354 (ii) Gospodarze korzystni dla wytwarzania L-treoniny Escherichia coli B-3996 (RIA 1867) patrz japoński wyłożeniowy opis patentowy numer 3-501682 (PCT);

Escherichia coli AJ 12349 (FERM P-9574), patrz górna kolumna po lewej stronie, na stronie 887 w japońskim wyłożeniowym opisie patentowym numer 2-458;

Escherichia coli AJ12351 (FERM P-9576), patrz dolna kolumna po prawej stronie, na stronie 887 w japońskim wyłożeniowym opisie patentowym numer 2-458;

Escherichia coli AJ12352 (FERM P-9577), patrz górna kolumna po lewej stronie, na strome 888 w japońskim wyłożeniowym opisie patentowym numer 2-458;

Escherichia coli AJ11332 (FERM P-4898), patrz górna kolumna po lewej stronie, na stronie 889 w japońskim wyłożeniowym opisie patentowym numer 2-458;

Escherichia coli AJ 12350 (FERM P-9575), patrz górna kolumna po lewej stronie, na stronie 889 w japońskim wyłożeniowym opisie patentowym numer 2-458;

Escherichia coli AJ12353 (FERM P-9578), patrz górna kolumna po prawej stronie, na stronie 889 w japońskim wyłożeniowym opisie patentowym numer 2-458;

Escherichia coli AJ12358 (FERM P-9764), patrz górna kolumna po lewej stronie, na stronie 890 w japońskim wyłożeniowym opisie patentowym numer 2-458;

Escherichia coli AJ 123 59 (FERM P-9765), patrz górna kolumna po lewej stronie, na stronie 890 w japońskim wyłożeniowym opisie patentowym numer 2-458;

181 380

Escherichia coli AJ11334 (FERM P-4900), patrz kolumna 6 na stronie 201 w publikacji japońskiego opisu patentowego numer 1-29559;

Escherichia coli AJ11333 (FERM P-4899), patrz kolumna 6 na stronie 201 w publikacji japońskiego opisu patentowego numer 1-29559;

Escherichia coli AJ1133 5 (FERM P-4901), patrz kolumna 7 na stronie 202 w publikacji japońskiego opisu patentowego numer 1-29559;

Następujące szczepy bakteryjne są przykładami maczugowców:

Brevibacterium lactofermentum AJ 1118 8 (FERM P-4190), patrz górna kolumna po prawej stronie, na stronie, 473 w japońskim wyłożemowym opisie patentowym numer 60-87788;

Corynebacterium glutamicum AJ11682 (FERM BP-118), patrz kolumna 8 na stronie 230 w publikacji japońskiego opisu patentowego numer 2-31956.

Brevibacterium flavum AJ11683 (FERM BP-119), patrz kolumna 10 na stronie 231 w publikacji japońskiego opisu patentowego numer 2-31956.

(m) Gospodarze korzystni dla wytwarzania L-metionmy

Następujące szczepy bakteryjne sąprzykładowymi szczepami do wytwarzania L-metioniny:

Escherichia coli AJ11457 (FERM P-5175), patrz górna kolumna po prawej stronie, na stronie 552 w japońskim wyłożeniowym opisie patentowym numer 56-35992;

Escherichia coli AJ11458 (FERM P-5176), patrz górna kolumna po prawej stronie, na stronie 552 w japońskim wyłożeniowym opisie patentowym numer 56-35992;

Escherichia coli AJ11459 (FERM P-5177), patrz górna kolumna po prawej stronie, na stronie 552 w japońskim wyłożeniowym opisie patentowym numer 56-35992;

Escherichia coli AJ11539 (FERM P-5479), patrz dolna kolumna po lewej stronie, na stronie 435 w japońskim wyłożeniowym opisie patentowym numer 56-144092;

Escherichia coli AJ11540 (FERM P-5480), patrz dolna kolumna po lewej stronie, na stronie 435 w japońskim wyłożeniowym opisie patentowym numer 56-144092;

Escherichia coli AJ 11541 (FERM P-5481), patrz dolna kolumna po lewej stronie, na stronie 435 w japońskim wyłożeniowym opisie patentowym numer 56-144092;

Escherichia coli AJ11542 (FERM P-5482), patrz dolna kolumna po lewej stronie, na stronie 435 w japońskim wyłożeniowym opisie patentowym numer 56-144092;

(iv) Gospodarze korzystni dla wytwarzania kwasu L-asparaginowego

Następujące szczepy bakteryjne sąprzykładowymi szczepami do wytwarzania kwasu L-asparaginowego:

Brevibacterium flavium AJ3859 (FERM P-2799), patrz górna kolumna po lewej stronie, na stronie 524 w japońskim wyłożeniowym opisie patentowym numer 51-61689;

Brevibacterium lactofermentum AJ3860 (FERM P-2800), patrz górna kolumna po lewej stronie, na stronie 524 w japońskim wyłożeniowym opisie patentowym numer 51-61689;

Corynebacterium acetoacidophilum AJ3877 (FERM P-2803), patrz górna kolumna po lewej stronie, na stronie 524 w japońskim wyłożeniowym opisie patentowym numer 51-61689;

Corynebacterium glutamicum AJ3876 (FERM P-2802), patrz górna kolumna po lewej stronie, na stronie 524 w japońskim wyłożeniowym opisie patentowym numer 51-61689;

(v) Gospodarze korzystni dla wytwarzania L-izoleucyny

Escherichia coli¥DC\A \ (VKPM-B4781) patrz 45 akapit w japońskim wyłożeniowym opisie patentowym numer 4-33027) stanowi przykład bakterii należących do rodzaju Escherichia, a Brevibacterium lactofermentum AJ 12404 (FERM P-10141) (patrz dolna kolumna po lewej stronie, na stronie 603 w japońskim wyłożeniowym opisie patentowym 2-42988) i Brevibacterium flavum AJ12405 (FERM P-10142) (patrz dolna kolumna po lewej stronie, na stronie 524 w j apońskim wyłożeniowym opisie patentowym 2-42988) stanowią przykład bakterii należących do maczugowców.

(vi) Gospodarze korzystni dla wytwarzania kwasu L-glutaminowego

Następujące szczepy bakteryjne stanowią przykłady bakterii należących do rodzaju Escherichia'

181 380

Escherichia coli AJ12628 (FERM P-12380), patrz publikacja francuskiego opisu patentowego numer 2 680 178 (1993);

Escherichia coli AJ12624 (FERM P-12379), patrz publikacja francuskiego opisu patentowego numer 2 680 178 (1993);

Następujące szczepy bakteryjne stanowiąprzykładbakterii należących do maczugowców.

Brevibacterium lactofermentum AJ12745 (FERM BP-2922), patrz dolna kolumna po prawej stronie, na stronie 561 w japońskim wyłożeniowym opisie patentowym numer 3-49690;

Brevibacterium lactofermentum AJ12746 (FERM BP-2923), patrz górna kolumna po lewej stronie, na stronie 562 w japońskim wyłożeniowym opisie patentowym numer 3-49690;

Brevibacterium lactofermentum AJ 12747 (FERM BP-2924), patrz górna kolumna po lewej stronie, na stronie 562 w japońskim wyłożeniowym opisie patentowym numer 3-49690;

Brevibacterium lactofermentum AJ 12748 (FERM BP-2925), patrz górna kolumna po lewej stronie, na stronie 562 w japońskim wyłożeniowym opisie patentowym numer 3-49690;

Brevibacterium flavum ATCC 14067, patrz tabela 1, na stronie 3 w japońskim wyłożeniowym opisie patentowym numer 5-3793;

Corynebacterium glutamicum ATCC 21492, patrz tabela 1 na stronie 3 w japońskim wyłożeniowym opisie patentowym numer 5-3793.

(vii) Gospodarze korzystni dla wytwarzania L-argininy

Następujące szczepy bakteryjne stanowiąprzykłady bakterii należących do rodzaju Escherichia.

Escherichia coli AJ11593 (FERM P-5616), patrz górna kolumna po lewej stronie, na stronie 468 w japońskim wyłożeniowym opisie patentowym numer 57-5693;

Escherichia coli AJ 11594 (FERM P-5617), patrz górna kolumna po prawej stronie, na stronie 468 w japońskim wyłożeniowym opisie patentowym numer 57-5693.

Następujące szczepy bakteryjne stanowiąprzykłady bakterii należących do maczugowców:

Brevibacterium flavum AJ12144 (FERM P-7642), patrz kolumna 4, na strome 174 w japońskim wyłożeniowym opisie patentowym numer 5-27388;

Corynebacterium glutamicum AJ 12145 (FERM P-7643), patrz kolumna 4 na stronie 174 w japońskim wyłożeniowym opisie patentowym numer 5-27388;

Brevibacterium flavum ATCC 21493, patrz tabela 1, na stronie 3 w japońskim wyłożeniowym opisie patentowym numer 5-3793;

Corynebacterium glutamicum ATCC 21659, patrz tabela 1 na stronie 3 w japońskim wyłożeniowym opisie patentowym numer 5-3793.

(vni) Gospodarze korzystni dla wytwarzania L-proliny

Następujące szczepy bakteryjne stanowiąprzykłady bakterii należących do rodzajuEscherichia.

Escherichia coli AJ11543 (FERM P-5483), patrz dolna kolumna po lewej stronie, na stronie 435 w japońskim wyłożeniowym opisie patentowym numer 56-144093.

Escherichia coli AJ11544 (FERM P-5484), patrz dolna kolumna po lewej stronie, na strome 435 w japońskim wyłożeniowym opisie patentowym numer 56-144093.

Następujące szczepy bakteryjne stanowiąprzykłady bakterii należących do maczugowców:

Brevibacterium lactofermentum AJ11225 (FERM P-4370), patrz górna kolumna po lewej stronie, na stronie 473 w japońskim wyłożeniowym opisie patentowym numer 60-87788;

Brevibacteriumflavum AJ11512 (FERM P-5332), patrz kolumna 2, na stronie 185 w publikacji japońskiego opisu patentowego numer 62-36679;

Brevibactenum flavum AJ11513 (FERM P-5333), patrz kolumna 2 na stronie 185 w publikacji japońskiego opisu patentowego numer 62-36679;

Brevibacterium flavum AJ11514 (FERM P-5334), patrz kolumna 2 na stronie 185 w publikacji japońskiego opisu patentowego numer 62-36679;

Corynebacterium glutamicum AJ 11522 (FERM P-5342), patrz kolumna 2 na stronie 185 w publikacji japońskiego opisu patentowego numer 62-36679;

181 380

Corynebacterium glutamicurn AJ 11523 (FERM P-5343), patrz kolumna 2 na stronie 185 w publikacji japońskiego opisu patentowego numer 62-36679;

(2) Sposób hodowli

Sposób hodowli wyżej wspomnianych gospodarzy nie różni się specjalnie od sposobów, z wcześniejszych prac, hodowli mikroorganizmów wytwarzających aminokwasy. Mianowicie, wykorzystuje się zwykłe podłoże zawierające źródło węgla, źródło azotu i jony nieorganiczne, oraz ewentualnie organiczne śladowe składniki odżywcze, takie jak aminokwasy, witaminy i podobne.

Jako źródła węgla można użyć glukozy, sacharozy, laktozy i podobnych, jak również zawierających je hydrolizatu skrobiowego, serwatki, melasy i podobnych. Jako źródła azotu można użyć gazowego amoniaku, wodnego roztworu amoniaku, soli amonowych i podobnych. Gdy jako gospodarza stosuje się zmutowany szczep wymagający jakiegoś składnika odżywczego, konieczne jest dodanie do podłoża takiego składnika, jak aminokwas lub podobne składniki konieczne do szczepu. Przykład podłoża do wytwarzania lizyny, jako podłoża wykorzystywanego do wytwarzania aminokwasu, przedstawiono w tabeli 1 poniżej. Niekiedy do innych składników dodaje się węglan wapnia, po uprzedniej oddzielnej sterylizacji.

Tabela 1

Składnik podłoża	Ilość w mieszance
Glukoza	5 g/dl
(NH4)2SO4	2,5 g/dl
KH2PO4	0,2 g/dl
MgSO4 7H2O	0,1 g/dl
Ekstrakt drozdzowy	0,05 g/dl
Chlorowodorek tiaminy	1 pg/htr
Biotyna	300 pg/litr
FeSO4-7H2O	1 mg/dl
MnSO4 4H2O	1 mg/dl
Węglan wapnia	2,5 g/dl
	(pH 7,0)

Hodowlę prowadzono dopóki tworzenie i akumulacja aminokwasów nie ulegały zasadniczemu zatrzymaniu, z jednoczesnym kontrolowaniem pH i temperatury podłoża w warunkach tlenowych. W celu zebrania tak zgromadzonych aminokwasów w podłożu hodowlanym można zastosować sposób standardowy.

Krótki opis rysunków

Figura 1 przedstawia hamowanie wzrostu przez 3-bromopirogroman. Fig. 2 przedstawia hamowanie wzrostu, przez β-hydrazyd asparaginianu. Fig. 3 przedstawia hamowanie wzrostu przez DL-treo-p-hydroksyasparagiman. Fig. 4 przedstawia wpływy substancji znoszących hamowanie 3-bromopirogronianem. Fig. 5 przedstawia wpływy substancji znoszących hamowanie β-hydrazydem asparaginianu. Fig 6 przedstawia wpływy substancji znoszących hamowanie DL-treo-p-hydroksyasparaginianem. Fig. 7 przedstawia wpływy wywierane na wzrost przez czynniki przywracające wzrost. Fig. 8 przedstawia hamowanie karboksylazy fosfoenolopirogronianowej przez substancje hamujące wzrost. Fig. 9 przedstawia hamowanie karboksylazy fosfoenolopirogronianowej według mniejszego wynalazku przez kwas asparaginowy. Fig 10 przedstawia hamowanie karboksylazy fosfoenolopirogronianowej według mniejszego wynalazku przez kwas asparaginowy. Fig. 11 przedstawia sposób wprowadzania mutacji do genu karboksylazy fosfoenolopirogronianowej. Fig. 12 przedstawia wpływy wywierane przez kwas asparaginowy na aktywności karboksylazy fosfoenolopirogronianowej typu dzikiego i zmuto

181 380 waną, w której argmmę w pozycji 438, licząc od końca N, podstawiono cysteiną. Fig. 13 przedstawia wpływy wywierane przez kwas asparaginowy na aktywności karboksylazy fosfoenolopirogronianowej typu dzikiego i zmutowanej, w której lizynę w pozycji 620, licząc od końca N, podstawiono seryną.

Najkorzystniejsze przykłady realizacji wynalazku

Niniejszy wynalazek zostanie wyjaśniony bardziej szczegółowo poniżej w odniesieniu do przykładów.

Przykład 1: Przygotowanie genu zmutowanej karboksylazy fosfoenolopirogromanowej

Zmutowany gen przygotowano stosując plazmid pS2 otrzymany przez wstawienie sklonowanego i o określonej sekwencji zasad genu karboksylazy fosfoenolopirogromanowej w miejscu Sal I plazmidowego wektora pBR322. pS2 posiada gen oporności na ampicylinę, jako gen markerowy oporności na lek (Sabę, H. i in., Gene, 31, 279-283 (1984)). Sekwencja nukleotydowa genu karboksylazy fosfoenolopirogromanowej zawartego w pS2 jest taka sama, jak ta zawarta w wyżej wspomnianym plazmidzie pT2.

DNA pS2 traktowano w temperaturze 75°C przez 2 godziny roztworem hydroksyloaminy (20 pg/ml DNA pS2,0,05 M fosforan sodowy (pH 6,0), 1 mM EDTA, 0,4 M hydroksyloamina). Z powodu wpływu pH na działanie hydroksyloaminy, zmieszano 80 pl roztworu 1M hydroksyloaminy HC11 1 mM EDTA o pH doprowadzonym do 6,0 wodorotlenkiem sodowym, 100 pl roztworu 0,1 M fosforanu sodowego (pH 6,0) 11 mM EDTA oraz bufor TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) zawieraj ącego 2 pg DNA pS2, ostatecznie dodając 200 pl wody.

Wyżej wspomniane warunki'są warunkami, w których, gdy po traktowaniu transformuje się pS2 Escherichia coli HB101, transformanty wykazują w podłożu zawierającym ampicylinę 0,2% przeżywalność w stosunku do stanu przed traktowaniem.

Escherichia coli HB101 stransformowano pS2 działając hydroksyloaminą, a następnie wysiano na płytki za stałym podłożem zawierającym ampicylinę uzyskując około 10000 kolonii transformantów. Zawieszono je w podłożu płynnym i wysiano na płytki za stałym podłożem zawierającym którykolwiek z następujących związków: 3-bromopirogronian (3BP), asparaginiaηο-β-hydroksamian (ΑΗΧ), β-hy draży d asparagimanu (AHY) i DL- treo -β-hydro- ksyasparaginian (βΗΑ), jako związków będących analogami kwasu asparaginowego, w stężeniu bliskim minimalnemu stężeniu hamującemu, otrzymując 10³ do 10⁵ komórek na jednąpłytkę, i selekcjonowano rosnące kolonie.

Ze 100 szczepów opornych na analog częściowo oczyszczono wytwarzaną przez każdy z nich karboksylazę fosfoenolopirogronianową zgodnie z metodą opisaną w The Journal of Biochemistry, tom 67, nr 4 (1970) i badano hamowanie aktywności enzymatycznej przez analogi. Pomiar aktywności enzymu prowadzono w taki sam sposób, jak opisano powyżej.

Ponadto, plazmidy ze szczepów bakteryjnych wytwarzających zmutowane enzymy o aktywnościach me hamowanych przez związki analogowe wyizolowano plazmidy i wprowadzono do Eschenchia coli PCR1 jako szczepu pozbawionego karboksylazy fosfoenolopirogromanowej (Sabę, H. i in., Gene, 31, 279-283 (1984)) w celu potwierdzenia wytwarzania zmutowanych enzymów.

W ten sposób otrzymano pięć transformantów zawierających geny zmutowanego enzymu. W wyniku określenia sekwencji zasad tych genów stwierdzono, że dwa szczepy mają tę samą mutację i otrzymano 4 rodzaje zmutowanych genów. Transformanty zawierające je oznaczono jako AJ12907, AJ12908, AJ12909, AJ12910 i zdeponowano w National Institute of Bioscience and Humań Technology of Agency of Industrial Science and Technology l-3,Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Japonia; kod pocztowy 305) 3 sierpnia 1993 r. pod numerami depozytowymi, FERM P-13774, FERM P-13775, FERM P-13776 i FERM P-13777, przeniesiono z pierwotnego depozytu do depozytu międzynarodowego działającego na warunkach Porozumienia Budapesztańskiego 11 lipca 1994 r. i zdeponowano odpowiednio w tej kolejności pod numerami depozytowymi FERM BP-4734, FERM BP-4735, FERM BP-4736, FERM BP-4737. Ponadto, zawarte w nich plazmidy oznaczono odpowiednio w tej samej kolejności jako pBP5, pHA19, pBP122 i pR6. Mutacje obecne w genach karboksylazy fosfoenolopirogromanowej zawarte w każdym z

181 380 plazmidów przedstawiono w tabeli 2. Wartości liczbowe w tabeli wskazują numery nukleotydu lub aminokwasu w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 1.

Tabela 2

Transformant	Plazmid	Mutacja	Związane z mutacją zastąpienie aminokwasowe
AJ 12907	pBP5	2109 G->A	625Glu->Lys
AJ 12908	pHA19	9<i'G^A	222Arg->His
	mG^A	223G1u—>Lys
AJ 12909	pBP122	l099C-^T	288Ser->Phe
	°'G->A	289Glu^Lys
1889G-*A	551Met—>Ile
264Sg->a	804Glu->Lys
AJ12910	pR6	2835g->a	667Ala->Thr

Prowadzono selekcję pod kątem AJ129071AJ12909 w podłożu zawierającym 500 pg/ml 3PB, pod kątem AJ12908 w podłożu zawierającym 1000 pg/ml ccHA i pod kątem AJ12901 w podłożu zawierającym 500 pg/ml AHY.

Przykład 2: Zmutowanakarboksylazafosfoenolopirogronianową

Badano wrażliwość na kwas asparaginowy karboksylaz fosfoenolopirogronianowych wytwarzanych przez wyżej wspomniane 4 transformanty. Te szczepy bakteryjne są pozbawione genu karboksylazy fosfoenolopirogronianowej pochodzącego od gospodarza, tak że wytwarzana karboksylaza fosfoenolopirogronianową pochodzi z plazmidu.

Wrażliwość na kwas asparaginowy badano zgodnie ze znaną metodą (Yoshinaga, T., Izui, K. i Katsuki, H., J. Biochem., 68,747-750 (1970)). Mianowicie, wrażliwość na kwas asparaginowy przedstawiona na fig. 9 i 10 stanowi wynik pomiaru aktywności wytwarzanego przez każdy z transformantów lub Escherichia coli zawierającąpS2, w obecności acetylo-koenzymu A, o którym wiadomo, że wpływa na aktywność w układzie pomiaru aktywności w stężeniu 0,1 mM lub 1 mM.

Na podstawie wyników jest oczywiste, że enzym typu dzikiego traci swoją aktywność, gdy kwas asparaginowy występuje w wysokim stężeniu, podczas gdy zmutowana karboksylaza fosfoenolopirogronianowa według niniejszego wynalazku zasadniczo utrzymuje swoją aktywność.

Przykład 3: Fermentacyjne wytwarzanie L-treoniny przez Escherichia coli z wprowadzoną zmutowaną karboksylazą fosfoenolopirogronianową.

Wśród znanych obecnie szczepów Escherichia coli, szczep B-3996 (japoński wyłozeniowy opis patentowy numer 3-501682 (PCT)) posiada najwyższą zdolność wytwarzania treomny. Dlatego też do oceny zmutowanej karboksylazy fosfoenolopirogronianowej, jako gospodarza zastosowano B-3996. Ten szczep B-3996 zdeponowano w Research Institute for Genetics and Industrial Microorganism Breeding pod numerem rejestracyjnym RIA 1867. Ponadto, jako zmutowaną karboksylazę fosfoenolopirogronianową do oceny wybrano pBP5, którą poddano doświadczeniu.

Plazmid pBP5 posiadający zmutowanąkarboksylazę fosfoenolopirogronianową wprowadzono do Escherichia coli B-3996 zgodnie z metodąHanahana (J.Mol. Biol., tom 106, str. 577 (1983)) i wyizolowano transformant. Jako kontrolę, Escherichia coli B-3996 stransformowano w ten sam sposób pB2 jako plazmidem do ekspresji genu karboksylazy fosfoenolopirogronianowej typu dzikiego.

Gdy Escherichia coli B-3996 i jej transformantami zaszczepiono 500 ml kolby Sakaguchi zawierające 20 ml podłoża o składzie podanym w tabeli 3 i hodowano w temperaturze 37°C w

181 380 ciągu 40 godzin w celu sprawdzenia ilości wytworzonej L-treoniny, uzyskano wyniki przedstawione w tabeli 4.

Wyżej wspomniane podłoże podzielono na dwie części: glukozę i MgSO₄-7H₂O oraz inne składniki, pH doprowadzono do wartości 7,0 stosując KOH i autoklawowano w temperaturze 115°C w ciągu 10 minut, a następnie po ich zmieszaniu dodano oddzielnie wysterylizowany CaCO₃ w ilości 30 g/litr.

Tabela 3

Składnik	Ilość w mieszance (g/litr)
Glukoza	40
(NH4)2SO4	16
kh2po4	1
MgSO4 7H2O	1
FeSO4 7H2O	0,01
MnSO4-5H2O	0,01
Ekstrakt drożdżowy (Difco)	2
L-Met	0,5
CaCOj	30

Tabela 4

Szczep bakteryjny	Ilość wytworzonej treoniny (g/litr)
Escherichia coli B-3996	15,7
Escherichia coli B-3996/pS2	15,8
Escherichia coli B-3996/pBP5	16,8

Jak widać na podstawie wyników, Escherichia coh B-3996/pBP5 zawierająca plazmid ekspresyjny zmutowanego enzymu, obejmujący sekwencję DNA według mniejszego wynalazku, wykazuje ulepszoną zdolność wytwarzania treoniny w porównaniu z Escherichia coli B-3996/pS2 zawierającą plazmid do ekspresji enzymu typu dzikiego.

Przykład 4: Fermentacyjne wytwarzanie kwasu L-glutammowego przez Escherichia coli z wprowadzoną zmutowaną karboksylazą fosfoenolopirogronianową.

W śród znanych obecnie szczepów Escherichia coli, Escherichia coli AJ-12628 opisana w japońskim wyłożemowym opisie patentowym numer 4-11461 posiada najwyższą zdolność wytwarzania kwasu glutaminowego. Dlatego też do oceny zmutowanej karboksylazy fosfoenolopirogronianowej, jako gospodarza zastosowano AJ-12628.

Szczep AJ-12628 zdeponowano w National Institute of Bioscience and Humen Technology of Agency of Industrial Science and Technology pod numerem rejestracyjnym FERM BP-385. Ponadto, jako zmutowaną karboksylazę fosfoenolopirogronianową do oceny wybrano pBP5, którą poddano doświadczeniu.

Plazmid pBP5 posiadający zmutowanąkarboksylazę fosfoenolopirogronianowąwprowadzono do Escherichia coli AJ-12628 zgodnie z metodąHanahana (J. Mol. Biol.. tom 106, str. 577 (1983)) i wyizolowano transformant. W ten sam sposób wyizolowano transformant Escńerzc/na coli AJ-12628 otrzymany przez transformację pS2.

Gdy Escherichia coli AJ-12628 i jej transformanty zaszczepiono odpowiednio w 500 ml kolbach Sakaguchi zawierających 20 ml podłoża o składzie podanym w tabeli 5 i hodowano w

181 380 temperaturze 37°C w ciągu 36 godzin w celu sprawdzenia ilości wytworzonego kwasu L-glutaminowego, uzyskano wyniki przedstawione w tabeli 6. Wyżej wspomniane podłoże podzielono na dwie części: glukozę i MgSO₄ · 7H₂O oraz inne składniki, pH prowadzono do wartości 7,0 stosując KOH i autoklawowano w temperaturze 115°C w ciągu 10 minut, a następnie po ich zmieszaniu dodano oddzielnie wy sterylizowany CaCO₃ w ilości 30 g/htr.

Tabela 5

Składnik	Ilość w mieszance (g/htr)
Glukoza	40
(NH4)2SO4	16
KH2PO4	1
MgSO4 7H2O	1
FeSO4 7H2O	0,01
MnSO4 5H2O	0,01
Ekstrakt drozdżowy (Difco)	2
CaCO3	30

Tabela 6

Szczep bakteryjny	Ilość wytworzonego kwasu glutaminowego (g/htr)
Escherichia coli AJ-12628	18,0
Escherichia coli AJ-12628yS2	18,3
Escherichia coli AJ-I2628/pBP5	19,6

Jak widać na podstawie wyników, Escherichia coli AJ-12628/pBP5 zawierająca plazmid ekspresyjny zmutowanego enzymu, obejmujący sekwencję DNA według niniejszego wynalazku, wykazuje ulepszoną zdolność wytwarzania glutaminianu w porównaniu z Escherichia coli AJ-12628/pS2 zawierającą plazmid do ekspresji enzymu typu dzikiego.

Przykład5: Wytwarzanie L-lizyny przez maczugowca z wprowadzoną zmutowaną karboksylazą fosfoenolopirogromanową.

W celu wprowadzenia i ekspresji zmutowanego genu w maczugowcu, otrzymano promotor pochodzący z bakterii należącej do rodzaju Brevibacterium i zligowano go ze zmutowanym genem, otrzymując w ten sposób plazmid ekspresyjny. Następnie plazmid ten wprowadzono do bakterii należącej do rodzaju Brevibacterium w celu przeprowadzenia wytwarzania L-hzyny.

< 1 > Przygotowanie genu aspartokinazy (AK) pochodzącego z bakiem należącej do rodzaju Brevibacterium

Chromosomalny DNA przygotowano zgodnie ze standardową metodą z szczepu dzikiego Brevibactenum lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) (ATCC 13869) Gen AKzamplifikowano z chromosomalnego DNA metodą PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy; patrz White, T.J. i in. Trends Genet., 5, 185 (1989)). Jako statery DNA stosowane do amphfikacji, w oparciu o znaną sekwencję Corynebacterium glutamicum (patrz, Molecular Microbiology (1991) 5 (5), 1197-1204, Mol. Gen. Genet. (1990), 224,317-324), zsyntetyzowano oligonukleotyd o długości 23 zasad (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 3) i oligonukleotyd o długości 21 zasad (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 4), aby zamplifikować kodujący gen AK region o długości około 1643 par zasad.

181 380

Syntezę DNA przeprowadzono zgodnie ze standardową metodą wykorzystuj ącą fosfory noamidy (patrz Tetrahedron Letters (1981), 22,1859) stosując syntetyzer DNA model 380B produkowany przez Applied Biosystems Co. W reakcji PCR zastosowano DNA Thermal Cycler typ PJ 2000 produkowany przez Takara Shuzo Co., Ltd., a amplifikację genu przeprowadzono stosując pohmerazę DNA Tag zgodnie z metodą podaną przez producenta.

/amplifikowanie fragmentu genu o długości 1643 kb potwierdzono przez elektroforezę na żelu agarozowym, następnie fragment wycięty z żelu oczyszczono standardowymi metodami i trawiono enzymami restrykcyjnymi Nrul (produkowanym przez Takara Shuzo Co., Ltd.) i EcoRI (produkowanym przez Takara Shuzo Co., Ltd). Jako wektor klonujący dla fragmentu genowego zastosowano pHSG399(patrzTakeshita, S. im., Gene(1987,61,63-74). pHSG399 strawiono enzymem restrykcyjnym Smal (produkowanym przez Takara Shuzo Co., Ltd.) i enzymem restrykcyjnym EcoRI, i zhgowano ze zamplifikowanym fragmentem genu AK.

Ligację DNA przeprowadzono stosując metodę wykorzystującą zestaw do ligacji DNA (produkowany przez Takara Shuzo Co., Ltd.). W ten sposób utworzono plazmid obejmujący pHSG399 zligowany z fragmentem genu AK zamplifikowanym z chromosomu Brevibacterium Plazmid zawierający gen AK pochodzący ze szczepu dzikiego ATCC 13869 oznaczono jako p3999AKY.

< 2> Określenie sekwencji zasad genu AK Brevibacterium lactofermentum

Przygotowano plazmid zawierający AK, p399AKY, i określono sekwencję zasad genu AK. Określenie sekwencji zasad przeprowadzono zgodnie z metodą Sangera i m (F. Sanger i in. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977) itd). Wyniki przedstawiono w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 5 i sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 7. Fragmenty DNA posiadają dwie otwarte ramki odczytu, odpowiadające odpowiednio podjednostce a i podjednostce β AK. W sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 5 i sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 7, sekwencje aminokwasowe odpowiadające każdej z otwartych ramek odczytu przedstawiono razem z sekwencjami nukleotydowymi. Ponadto, same sekwencje aminokwasowe odpowiadające każdej z otwartych ramek odczytu przedstawiono w sekwencji o numerze identyfikacyjnym. 6 oraz w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 8.

< 3 > Przygotowanie plazmidu ekspresyjnego karboksylazy fosfoenolopirogronianowej

Z pS2 plazmidu zawierającego gen karboksylazy fosfoenolopirogronianowej typu dzikiego i pBP5, plazmidu zawierającego zmutowany gen karboksylazy fosfoenolopirogronianowej, wycięto fragmenty Sali o długości około 4,4 kb zawierające geny karboksylazy fosfoenolopirogronianowej i wstawiono w miejsce Sali wektora plazmidowego pHSG399, powszechnie stosowanego dla Escherichia coli. Utworzone plazmidy nazwano pHS2 dla typu dzikiego i pHBP5 dla mutanta.

W celu przekształcenia pHS2 i pHPB5 w plazmidy do ekspresji w Brevibacterium, wprowadzono promotor i miejsce początku replikacji plazmidu działające w Brevibacterium Jako promotor wycięto z p399AKY fragment genu obejmujący sekwencję zasad od pierwszego miej sca Nrul do 207 miejsca ApaLI. który uważa się za region promotorowy sklonowanego genu AK i wstawiono w miejscu Aval położonym około 60 bp przed genami struktury pHS21 pHBP5, umożliwiając zachodzenie transkrypcji we właściwym kierunku.

Następnie w miejsce położone w wektorze wprowadzono fragment genu umożliwiający autonomiczną rep hkację plamizdu w Brevibacterium, a mianowicie miejsce początku replikacji plazmidu. Fragment genu zawierający miejsce początku replikacji plazmidu wycięto z wektora pHC4 dla Brevibacterium (patrz, akapit numer 10 w japońskim wyłożeniowym opisie patentowym numer 5-7491; Escherichia coli AJ12039 zawierającą ten sam plazmid zdeponowano w National Institute of Bioscience and Humen Technology i nadano jej numer depozytowy FERM P12215) i, przez wprowadzenie łączników, przekształcono miejsca enzymów restrykcyjnych przy obu końcach w miejsca Pstl.

Fragment ten wprowadzono, łącznie z promotorem pochodzącym z Brevibacterium, w miejscu Pstl w wektorowej części plazmidu. Skonstruowane plazmidy ekspresyjne karboksylazy fosfoenolopirogronianowej nazwano, odpowiednio, pHS2B dla plazmidu pochodzącej z pS2

181 380 karboksylazy fosfoenolopirogromanowej typu dzikiego oraz pHBP5B dla plazmidu zmutowanej karboksylazy fosfoenolopirogromanowej, pochodzącej z pBP5.

< 4 > Wytwarzanie L-lizyny przez zastosowanie plazmidu ekspresyjnego karboksylazy fosfoenolopirogromanowej

Przygotowane pHS2B i pHBP5B wprowadzono odpowiednio do szczepu AJ3463 jako wytwarzającej L-lizynę bakterii Brevibacterium lactofermentum (patrz publikacja japońskiego opisu patentowego numer 51-34477). Do wprowadzenia.genu, zastosowano metodę transformacji wykorzystującą impuls elektryczny (patrz japoński wyłożeniowy opis patentowy numer 2-207791). Szczep gospodarza i transformanty hodowano, mieszając, w ciągu 72 godzin w temperaturze 31,5°C w podłożu do wytwarzania lizyny o składzie przedstawionym w tabeli 7. Wyżej wspomniane podłoże przygotowano w taki sposób, że wszystkie jego składniki wymienione w tabeli, poza CaCO₃, dodano do 1 litra wody, pH doprowadzono do wartości 8,0 stosując KOH, a następnie autoklawowano w temperaturze 115°C w ciągu 15 minut. Następnie dodano CaCO₃, poddany uprzednio sterylizacji przez ogrzewanie. Zakumulowane w podłożu ilości L-lizyny po hodowli przedstawiono w tabeli 8.

Tabela 7

Składnik	Ilość w mieszance w 1 litrze
Glukoza	100 g
(NH4)2SO4	55 g
Koncentrat sojowy*	35 ml
KH2PO4	1 g
MgSO4 7H2O	1 g
Witamina Bi	20 g
Biotyna	5g
Amid kwasu nikotynowego	5 mg
FeSO4-7H2O	0,01 g
MnSO4 5H2O	0,01
CaCCb	50 g

* produkt Ajmomoto Co., Ltd. (nazwa handlowa: Mamenou)

Tabela 8

Szczep bakteryjny	Ilość wytworzonej lizyny (g/litr)
Brevibacterium lactofermentum AJ3463	20,0
Brevibacterium lactofermentum AJ3463/pHS2B	22,0
Brevibacterium lactofermentum AJ3463/pHBP5B	25,0

Jak pokazują wyniki, Brevibactenum lactofermentum AJ3463/pHBP5B zawierające plazmid ekspresyjny zmutowanego enzymu, obejmujący DNA według niniejszego wynalazku, wykazuje ulepszoną zdolność wytwarzania lizyny w porównaniu z Brevibacterium lactofermentum AJ3463/pHS2B zawierającym plazmid do ekspresji enzymu typu dzikiego.

Przykład 6: Inny przykład zmutowanej karboksylazy fosfoenolopirogromanowej według mniejszego wynalazku i jej gen < 1 > Przygotowywanie genu zmutowanej karboksylazy fosfoenolopirogromanowej

181 380

Do przygotowania DNA kodującego zmutowaną karboksylazę fosfoenolopirogronianową jako materiał zastosowano gen karboksylazy fosfoenolopirogronianowej sklonowany w plazmidzie pT2.

Dla wykrywania aktywności karboksylazy fosfoenolopirogronianowej pochodzącej tylko z plazmidu, korzystne jest, aby gospodarz zawierający plazmid pT2 był pozbawiony genu karboksylazy fosfoenolopirogronianowej. Jako taki pozbawiony genu karboksylazy fosfoenolopirogronianowej szczep użyto Escherichia coli FI5 (Hfr, recAl, met, A(ppc-argECBH), TnlO). Escherichia coli AJ-12873, zawierającą pT2 w szczepie F15, zdeponowano pod numerem FERM P-13752 w National Institute of Bioscience and Humań Technology of Agency of Industnal Science of Technology (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonia, kod pocztowy 305) 15 lipca 1993 r., przeniesiono z pierwotnego depozytu do depozytu międzynarodowego działającego na warunkach Porozumienia Budapesztańskiego 11 lipca 1994r. i zdeponowano pod numerem depozytowym FERM BP-4732. Ponadto, całą sekwencję zasad pT2 przedstawiono w sekwencji o numerze identyfikacyjnym:!.

W celu zastąpienia kodonu argininy w pozycji 438 karboksylazy fosfoenolopirogronianowej kodonem cysteiny przez wykorzystanie pT2, zastosowano metodę wydłużania regionów zachodzących (Ho, S.N., Hunt, H D., Horton, R.M., Pullen, J.K. i Pease, L.R., Gene. 77, 51-59 (1989)) wykorzystując metodą PCR (reakcji łańcuchowej polimerazy).

Nawiasem mówiąc, metoda PCR jest metodą w której powtarzany jest cykl amphfikacji składający się z termicznej denaturacji dwumciowego DNA w jednoniciowy DNA, łączenia ohgonukleotydowych starterów odpowiadających sekwencjom na obu końcach miejsca przeznaczonego do amplifikacji i wspomnianego powyżej zdenaturowanego termicznie DNA oraz reakcji pohmerazy wykorzystującej wyżej wspomniane oligonukleotydy jako startery, dzięki czemu wspomniana powyżej sekwencja DNA ulega amplifikowaniu w sposób wykładniczy.

Region poddany mutagenezie ukierunkowanej metodąPCR przedstawiono na fig. 11. Starterami użytymi w niniejszym wynalazku były 4 rodzaje startera c (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 11, odpowiadająca zasadom o numerach 1535-1554 w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 1) posiadającego sekwencję znajdującą się w pobliżu kodonu 438 argininy, starter b (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 10) posiadający sekwencję komplementarną do sekwencji startera c, starter a (sekwencja o numerze identyfikacyjnym. 9, odpowiadająca zasadom o numerach 1185-1200 w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 1) posiadający sekwencję leżącą przed nim oraz starter d (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 12, odpowiadająca zasadom o numerach 2327-2342 w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 1) posiadający sekwencję komplementarną do sekwencji leżącej w kierunku zgodnym z kierunkiem transkrypcji.

W starterze b i starterze c kodon (CGT) argininy w pozycji 438 zastąpiono kodonem (TGT) cysteiny. W zastąpieniu tym można wykorzystać kodon TGC, który jest innym kodonem cysteiny. Ponadto, C trzeciej litery kodonu (AAC) 435 asparaginy zastąpiono T, i tym samym wprowadzono wewnętrzne miejsce EcoRI bez zastąpienia aminokwasu, tak że zmutowany plazmid można selekcjonować selekcjonowany przez używanie go jako wskaźnika Ta mutacja nie ma jednak zasadniczego znaczenia dla niniejszego wynalazku.

Gdy przeprowadzono reakcję PCR przy zastosowaniu DNA pT2 jako matrycy i startera a oraz startera b jako starterów, zamplifikowano fragment od miejsca leżącego przed miejscem mutacji do miejsca mutacji (fragment AB na fig. 11). Ponadto, gdy przeprowadzono reakcję PCR przy zastosowaniu startera c i startera d, zamplifikowano fragment leżący za miejscem mutacji (fragment CD na fig. 11). Gdy każdy ze zamplifikowanych produktów (AB, CD) ponownie połączono z matrycą po denaturacji termicznej przeprowadzając reakcji polimerazy, uległy one ligacji z otrzymaniem fragmentu (fragment AD na fig. 11). Reakcję PCR prowadzono przez powtarzanie 30 cykli, z których każdy obejmował ogrzewanie w temperaturze 94°C w ciągu 1 minuty, po którym następowały denaturacja (94°C, 1,5 minuty), łączenie (50°C, 2 minuty) i reakcja elongacji przez polimeryzację (72°C, 3,5 minuty). Ponadto w tabeli 9 przedstawiono składy mieszanin reakcyjnych.

181 380

Tabela 9

Skład	Fragment PCR
((). stężenie końcowe	AB	CD	AD
H2O	53,5	53,5	53,5
10 x stężony bufor reakcyjny	10	10	10
Mieszanina 1,25 mM dNTP	16	16	16
20 μΜ starter a (1 μΜ)	5	-	5
20 μΜ starter b (1 μΜ)	5	-	-
20 μΜ starter c (1 μΜ)	-	5	-
20 μΜ starter d (1 μΜ)	-	5	5
10 μg/ml pT2 (0,1 μg)	10	10	-
Fragment PCR AB*	-	-	5
Fragment PCR CD*	-	-	5
2,5 U/μΙ polimerazy Tag	0,5	0,5	0,5
Objętość całkowita	100 μΐ	100 μΐ	100 μΐ

*: fragmenty PCR AB i CD przygotowano, po reakcji PCR, przez odzyskanie ich 10 μΐ z żelu pohakryloamidowego i rozpuszczenie z 5 μΐ TE (10 mM Tns-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA (pH 8,0)).

W otrzymanym jak opisano powyżej fragmencie AD obecne były miejsce BssHfl (1231-1236 w sekwencji o numerze identyfikacyjnym. 1) po strome leżącej w kierunku przeciwnym do kierunku transkrypcji i miejsce Spił (2249-2254) w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 1) po stronie leżącej w kierunku zgodnym z kierunkiem transkrypcji, tak że przeprowadzono całkowite trawienie tymi enzymami w celu zastąpienia odpowiadającego regionu plazmidu pT2 (fig. 11).

< 2> Selekcja karboksylazy fosfoenolopirogronianowej pozbawionej wrażliwości na hamowanie

Otrzymanym jak opisano powyżej plazmidem stransformowano Escherichia coli i stransformowany szczep hodowano dla odzyskania plazmidu, prowadząc selekcj ę pod kątem tego trawionego przez EcoRI. W odniesieniu do wyselekcjonowanego DNA określono sekwencję zasad regionu zamphfikowanego wyżej wspomnianą metodą PCR przez metodę z wykorzystaniem dideoksynukleotydów dla potwierdzenia, że wprowadzono dokładnie zamierzone zastąpienie zasady. Plazmid ten oznaczono pT2R438C. Szczep otrzymany przez wprowadzenie tego plazmidu do wyżej wspomnianej Escherichia coli FI5 (AJ 12874) zdeponowano pod numerem FERM P-13753 w National Institute of Bioscence and Humań Technology of Agency of Industnal Science and Technology (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japonia; kod pocztowy 305) 15 lipca 1993 r., przeniesiono z pierwotnego depozytu do depozytu międzynarodowego działającego na warunkach’Porozumienia Budapesztańskiego 11 lipca 1994r. i zdeponowano pod numerem depozytowym FERM BP-4733.

Sekwencja zasad pT2R38C jest sekwencją w której nukleotydy w pozycjach 1541 1 1550 w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 1 zastąpiono z C na T.

< 3 > Potwierdzenie zniesienia hamowania zmutowanej karboksylazy fosfoenolopirogronianowej przez kwas asparaginowy

Badano wrażliwość karboksylazy fosfoenolopirogronianowej, wytworzonej przez wyżej wspomnianąEscńerzc/ria coli AJ 12874 zawierającąpT2R438C, na kwas asparaginowy. Jak opisano powyżej, ponieważ Escherichia coh FI 5 jest pozbawiona genu karboksylazy fosfoenolopirogronianowej , karboksylaza fosfoenolopirogronianową wytwarzana przez AJ12874 pochodzi z plazmidu.

181 380

Wrażliwość na kwas asparaginowy badano zgodnie ze znaną metodą (Yoshinaga, T., Izui, K i Katsuki, H., J.Biochem., 68, 747-750 (1970)). Mianowicie, wrażliwość na kwas asparaginowy przedstawiona na fig. 12 stanowi wynik pomiaru aktywności w obecności acetylo-koenzymu A, o którym wiadomo, ze wpływa na aktywność w układzie pomiaru aktywności w stężeniu 0,1 mM lub 1 mM.

Okazało się, że enzym typu dzikiego zasadniczo traci swoją aktywność, gdy kwas asparaginowy jest obecny w wysokim stężeniu, podczas gdy zmutowana karboksylaza fosfoenolopirogronianowa według niniejszego wynalazku nadal utrzymuje swoją aktywność.

< 4 > Przygotowywanie genu zmutowanej karboksylazy fosfoenolopirogronianowej (Π)

W celu zastąpienia kodonu lizyny w pozycji 620 kodonem seryny w genie karboksylazy fosfoenolopirogronianowej zawartym w plazmidzie pT2, użyto metody wydłużenia regionów zachodzących (Ho, S.N., Hunt, H.D., Horton, R.M., Pullen, J.K. i Pease, L.R., Gene, 77, 51-59 (1989)) wykorzystując metodę PCR (reakcji łańcuchowej pohmerazy). Konkretne procedury zgodne były z metodą opisaną w < 1 >. Plazmid niosący zmutowany gen skonstruowany z zamierzonym zastąpienim oznaczono pT2K620S. Ponadto, otrzymany zmutowany enzym oznaczono jako zmutowany enzym K620S.

< 5 > Potwierdzenie zniesienia hamowania zmutowanej karboksylazy fosfoenolopirogronianowej przez kwas asparaginowy.

Badano wrażliwość na kwas asparaginowy w odniesieniu do karboksylazy fosfoenolopirogronianowej wytworzonej przez transformant otrzymany przez wprowadzenie plazmidu pT2K620S do wyżej wspomnianej Escherichia coli FI 5. Jak opisano powyżej, ponieważEscherichia coli FI 5 pozbawiona jest karboksylazy fosfoenolopirogronianowej, jakakolwiek karboksylaza fosfoenolopirogronianowa wytwarzana przez transformanta pochodzi z plazmidu.

Wrażliwość na kwas asparaginowy badano zgodnie ze znaną metodą (Yoshinaga, T, Izui, K. i Katsuki, H., J.Biochem., 68, 747-750 (1970)). Mianowicie, wrażliwość na kwas asparaginowy przedstawiona na fig. 13 stanowi wynik pomiaru aktywności w obecności acetylo-koenzymu A, o którym wiadomo, że wpływa na aktywność w układzie pomiaru aktywności w stężeniu 0,1 mM lub 1 mM.

Okazało się, że enzym typu dzikiego zasadniczo traci swoją aktywność, gdy kwas asparaginowy jest obecny w wysokim stężeniu, podczas gdy zmutowana karboksylaza fosfoenolopirogronianowa według niniejszego wynalazku utrzymuje nadal swoją aktywność.

Na figurze 13 przedstawiono również wrażliwość na kwas asparaginowy dla zmutowanej karboksylazy fosfoenolopirogronianowej, w której seryną zastąpiono lizynę w pozycji 650 (zmutowany enzym K650A) i zmutowanej karboksylazy fosfoenolopirogronianowej, w której serynązastąpiono lizynę w pozycji 491 (zmutowany enzym K491 A). W przypadku tych zmutowanych enzymów wrażliwość na hamowanie przez kwas asparaginowy me ulega zniesieniu.

Możliwości zastosowania przemysłowego

Sekwencja DNA według niniejszego wynalazku koduje zmutowanąkarboksylazę fosfoenolopirogronianową, a mikroorganizmy zawierające tę sekwencję DNA wytwarzają wyżej wspomniany enzym.

Zmutowana karboksylaza fosfoenolopirogronianowa według niniejszego wynalazku zasadniczo nie podlega hamowaniu aktywności przez kwas asparaginowy, tak że można ją zastosować do fermentacyjnego wytwarzania aminokwasów, których biosynteza podlega regulacji przez kwas asparaginowy i podobne.

181 380

LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJA OGÓLNA:

(i) ZGŁASZAJĄCY: Ajinomoto Co. Inc.

(ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Zmutowana karboksylaza fosfoenolopirogronianową, jej gen i metoda wytwarzania aminokwasu (iii) LICZBA SEKWENCJI: 12 (iv) ADRES DO KORESPONDENCJI:

(A) ADRESAT:

(B) ULICA:

(C) MIEJSCOWOŚĆ:

(D) STAN:

(E) KRAJ:

(F) KOD POCZTOWY:

(v) ZAPIS KOMPUTEROWY:

(A) TYP NOŚNIKA: dyskietka (B) KOMPUTER: PC kompatybilny z IBM (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentln Release #1.0, wersja #1.25 (vi) DANE DOTYCZĄCE AKTUALNEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA:

(B) DATA ZŁOŻENIA:

(C) KLASYFIKACJA:

(vii) DANE DOTYCZĄCE UPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA:

(B) DATA ZŁOŻENIA:

(viii) INFORMACJA O PEŁNOMOCNIKU/PRZEDSTAWICIELU:

(A) NAZWISKO:

(B) NUMER REJESTRACYJNY:

(C) NUMER, NA KTÓRY NALEŻY SIĘ POWOŁYWAĆ/NUMER W REJESTRZE:

(ix) INFORMACJA TELEKOMUNIKACYJNA:

(A) TELEFON:

(H) TELEFAX:

(2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 5186 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: dwie (D) TOPOLOGIA: kołowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inne..DNA genomowy lub DNA wektora (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:

(A) ORGANIZM: Escherichia coli

181 380 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POŁOŻENIE: 237...2888 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE

IDENTYFIKACYJNYM 2:

TCGACCGGCG ATTTTTTAAC ATTTCCATAA GTTACGCTTA TTTAAAGCGT CGTGAATTTA60

ATGACGTAAA TTCCTGCTAT TTATTCGTTT GCTGAAGCGA TTTCGCAGCA TTTGACGTCA120

CCGCTTTTAC GTGGCTTTAT AAAAGACGAC GAAAAGCAAA GCCCGAGCAT ATTCGCGCCA180

ATGCGACGTG AAGGATACAG GGCTATCAAA CGATAAGATG GGGTGTCTGG GGTAAT236

ATG AAC GAA CAA TAT TCC GCA TTG CGT AGT AAT GTC AGT ATG CTC GGC 284 Met Asn Glu Gin Tyr Ser Ala Leu Arg Ser Asn Val Ser Met Leu Gly 15 1015

AAA GTG CTG GGA GAA ACC ATC AAG GAT GCG TTG GGA GAA CAC ATT CTT332

Lys Val Leu Gly Glu Thr Ile Lys Asp Ala Leu Gly Glu His IleLeu

2530

GAA CGC GTA GAA ACT ATC CGT AAG TTG TCG AAA TCT TCA CGC GCT GGC380

Glu Arg Val Glu Thr Ile Arg Lys Leu Ser Lys Ser Ser Arg AlaGly

4045

AAT GAT GCT AAC CGC CAG GAG TTG CTC ACC ACC TTA CAA AAT TTG TCG428

Asn Asp Ala Asn Arg Gin Glu Leu Leu Thr Thr Leu Gin Asn Leu Ser 50 5560

AAC GAC GAG CTG CTG CCC GTT GCG CGT GCG TTT AGT CAG TTC CTG AAC476

Asn Asp Glu Leu Leu Pro Val Ala Arg Ala Phe Ser Gin Phe Leu Asn

70 7580

CTG GCC AAC ACC GCC GAG CAA TAC CAC AGC ATT TCG CCG AAA GGC GAA524

Leu Ala Asn Thr Ala Glu Gin Tyr His Ser Ile Ser Pro Lys Gly Glu 85 9095

GCT GCC AGC AAC CCG GAA GTG ATC GCC CGC ACC CTG CGT AAA CTG AAA572

Ala Ala Ser Asn Pro Glu Val Ile Ala Arg Thr Leu Arg Lys Leu Lys 100 105110

AAC CAG CCG GAA CTG AGC GAA GAC ACC ATC AAA AAA GCA GTG GAA TCG620

Asn Gin Pro Glu Leu Ser Glu Asp Thr Ile Lys Lys Ala Val Glu Ser 115 120125

CTG TCG CTG GAA CTG GTC CTC ACG GCT CAC CCA ACC GAA ATT ACC CGT668

Leu Ser Leu Glu Leu Val Leu Thr Ala His Pro Thr Glu Ile Thr Arg 130 135140

CGT ACA CTG ATC CAC AAA ATG GTG GAA GTG AAC GCC TGT TTA AAA CAG716

Arg Thr Leu Ile His Lys Met Val Glu Val Asn Ala Cys Leu Lys Gin 145 150 155160

CTC GAT AAC AAA GAT ATC GCT GAC TAC GAA CAC AAC CAG CTG ATG CGT764

Leu Asp Asn Lys Asp Ile Ala Asp Tyr Glu His Asn Gin Leu Met Arg 165 170175

CGC CTG CGC CAG TTG ATC GCC CAG TCA TGG CAT ACC GAT GAA ATC CGT812

Arg Leu Arg Gin Leu Ile Ala Gin Ser Trp His Thr Asp Glu Ile Arg

180 185190

181 380

AAG CTG CGT CCA AGC CCG GTA GAT GAA GCC AAA TGG GGC TTT GCC GTA860

Lys Leu Arg Pro Ser Pro Val Asp Glu Ala Lys Trp Gly Phe AlaVal

195 200205

GTG GAA AAC AGC CTG TGG CAA GGC GTA CCA AAT TAC CTG CGC GAA CTG908

Val Glu Asn Ser Leu Trp Gin Gly Val Pro Asn Tyr Leu Arg GluLeu

210 215220

AAC GAA CAA CTG GAA GAG AAC CTC GGC TAC AAA CTG CCC GTC GAA TTT956

Asn Glu Gin Leu Glu Glu Asn Leu Gly Tyr Lys Leu Pro Val GluPhe

225 230 235240

GTT CCG GTC CGT TTT ACT TCG TGG ATG GGC GGC GAC CGC GAC GGC AAC1004

Val Pro Val Arg Phe Thr Ser Trp Met Gly Gly Asp Arg Asp GlyAsn

245 250255

CCG AAC GTC ACT GCC GAT ATC ACC CGC CAC GTC CTG CTA CTC AGC CGC1052

Pro Asn Val Thr Ala Asp Ile Thr Arg His Val Leu Leu Leu SerArg

260 265270

TGG AAA GCC ACC GAT TTG TTC CTG AAA GAT ATT CAG GTG CTG GTT TCT1100

Trp Lys Ala Thr Asp Leu Phe Leu Lys Asp Ile Gin Val Leu ValSer

275 280285

GAA CTG TCG ATG GTT GAA GCG ACC CCT GAA CTG CTG GCG CTG GTT GGC1148

Glu Leu Ser Met Val Glu Ala Thr Pro Glu Leu Leu Ala Leu ValGly

290 295300

GAA GAA GGT GCC GCA GAA CCG TAT CGC TAT CTG ATG AAA AAC CTG CGT1196

Glu Glu Gly Ala Ala Glu Pro Tyr Arg Tyr Leu Met Lys Asn LeuArg

305 310 315320

TCT CGC CTG ATG GCG ACA CAG GCA TGG CTG GAA GCG CGC CTG AAA GGC1244

Ser Arg Leu Met Ala Thr Gin Ala Trp Leu Glu Ala Arg Leu LysGly

325 330335

GAA GAA CTG CCA AAA CCA GAA GGC CTG CTG ACA CAA AAC GAA GAA CTG1292

Glu Glu Leu Pro Lys Pro Glu Gly Leu Leu Thr Gin Asn Glu GluLeu

340 345350

TGG GAA CCG CTC TAC GCT TGC TAC CAG TCA CTT CAG GCG TGT GGC ATG1340

Trp Glu Pro Leu Tyr Ala Cys Tyr Gin Ser Leu Gin Ala Cys GlyMet

355 360365

GGT ATT ATC GCC AAC GGC GAT CTG CTC GAC ACC CTG CGC CGC GTG AAA1388

Gly Ile Ile Ala Asn Gly Asp Leu Leu Asp Thr Leu Arg Arg ValLys

370 375380

TGT TTC GGC GTA CCG CTG GTC CGT ATT GAT ATC CGT CAG GAG AGC ACG1436

Cys Phe Gly Val Pro Leu Val Arg Ile Asp Ile Arg Gin Glu SerThr

385 390 395400

CGT CAT ACC GAA GCG CTG GGC GAG CTG ACC CGC TAC CTC GGT ATC GGC1484

Arg His Thr Glu Ala Leu Gly Glu Leu Thr Arg Tyr Leu Gly IleGly

405 410415

181 380

GAC TAC GAA AGC TGG TCA GAG	GCC GAC AAA CAG GCG TTC CTG ATC CGC	1532
Asp Tyr Glu Ser Trp Ser Glu 420	Ala Asp Lys Gin Ala Phe Leu Ile Arg 425 430
GAA CTG AAC TCC AAA CGT CCG	CTT CTG CCG CGC AAC TGG CAA CCA AGC	1580
Glu Leu Asn Ser Lys Arg Pro 435	Leu Leu Pro Arg Asn Trp Gin Pro Ser 440 445
GCC GAA ACG CGC GAA GTG CTC	GAT ACC TGC CAG GTG ATT GCC GAA GCA	1628
Ala Glu Thr Arg Glu Val Leu 450 455	Asp Thr Cys Gin Val Ile Ala Glu Ala 460
CCG CAA GGC TCC ATT GCC GCC	TAC GTG ATC TCG ATG GCG AAA ACG CCG	1676
Pro Gin Gly Ser Ile Ala Ala 465 470	Tyr Val Ile Ser Met Ala Lys Thr Pro 475 480
TCC GAC GTA CTG GCT GTC CAC	CTG CTG CTG AAA GAA GCG GGT ATC GGG	1724
Ser Asp Val Leu Ala Val His	Leu Leu Leu Lys Glu Ala Gly Ile Gly

	485	490	495
TTT GCG ATG	CCG GTT	GCT CCG CTG TTT GAA	ACC CTC GAT GAT CTG AAC 1772
Phe Ala Met	Pro Val	Ala Pro Leu Phe Glu	Thr Leu Asp Asp Leu Asn
	500	505	510
AAC GCC AAC	GAT GTC	ATG ACC CAG CTG CTC	AAT ATT GAC TGG TAT CGT 1820
Asn Ala Asn	Asp Val	Met Thr Gin Leu Leu	Asn Ile Asp Trp Tyr Arg
515		520	525
GGC CTG ATT	CAG GGC	AAA CAG ATG GTG ATG	ATT GGC TAT TCC GAC TCA 1868
Gly Leu Ile	Gin Gly	Lys Gin Met Val Met	Ile Gly Tyr Ser Asp Ser
530		535	540
GCA AAA GAT	GCG GGA	GTG ATG GCA GCT TCC	TGG GCG CAA TAT CAG GCA 1916
Ala Lys Asp	Ala Gly	Val Met Ala Ala Ser	Trp Ala Gin Tyr Gin Ala
545		550	555 560
CAG GAT GCA	TTA ATC	AAA ACC TGC GAA AAA	GCG GGT ATT GAG CTG ACG 1964
Gin Asp Ala	Leu Ile	Lys Thr Cys Glu Lys	Ala Gly Ile Glu Leu Thr
	565	570	575
TTG TTC CAC	GGT CGC	GGC GGT TCC ATT GGT	CGC GGC GGC GCA CCT GCT 2012
Leu Phe His	Gly Arg	Gly Gly Ser Ile Gly	Arg Gly Gly Ala Pro Ala

580 585 590

CAT

GCG

GCG

CTG

CTG

TCA

CAA

CCG

CCA

GGA

AGC

CTG

AAA

GGC

GGC

CTG

2060

His

Ala

Ala

Leu

Leu

Ser

Gin

Pro

Pro

Gly

Ser

Leu

Lys

Gly

Gly

Leu

595

600

605

CGC

GTA

ACC

GAA

CAG

GGC

GAG

ATG

ATC

CGC

TTT

AAA

TAT

GGT

CTG

CCA

2108

Arg

Val

Thr

Glu

Gin

Gly

Glu

Met

Ile

Arg

Phe

Lys

Tyr

Gly

Leu

Pro

610

615

620

GAA

ATC

ACC

GTC

AGC

AGC

CTG

TCG

CTT

TAT

ACC

GGG

GCG

ATT

CTG

GAA

2156

Glu

Ile

Thr

Val

Ser

Ser

Leu

Ser

Leu

Tyr

Thr

Gly

Ala

Ile

Leu

Glu

625

630

635

640

GCC

AAC

CTG

CTG

CCA

CCG

CCG

GAG

CCG

AAA

GAG

AGC

TGG

CGT

CGC

ATT

2204

Ala

Asn

Leu

Leu

Pro

Pro

Pro

Glu

Pro

Lys

Glu

Ser

Trp

Arg

Arg

Ile

645

650

655

181 380

ATG GAT GAA CTG TCA GTC ATC TCC TGC GAT GTC TAC CGC GGC TAC GTA	2252
Met Asp Glu Leu Ser Val Ile Ser Cys Asp Val Tyr Arg Gly Tyr Val
660 665 670 CGT GAA AAC AAA GAT TTT GTG CCT TAC TTC CGC TCC GCT ACG CCG GAA	2300
Arg Glu Asn Lys Asp Phe Val Pro Tyr Phe Arg Ser Ala Thr Pro Glu
675 680 685 CAA GAA CTG GGC AAA CTG CCG TTG GGT TCA CGT CCG GCG AAA CGT CGC	2348
Gin Glu Leu Gly Lys Leu Pro Leu Gly Ser Arg Pro Ala Lys Arg Arg
690 695 700 CCA ACC GGC GGC GTC GAG TCA CTA CGC GCC ATT CCG TGG ATC TTC GCC	2396
Pro Thr Gly Gly Val Glu Ser Leu Arg Ala Ile Pro Trp Ile Phe Ala
705 710 715 720 TGG ACG CAA AAC CGT CTG ATG CTC CCC GCC TGG CTG GGT GCA GGT ACG	2444
Trp Thr Gin Asn Arg Leu Met Leu Pro Ala Trp Leu Gly Ala Gly Thr
725 730 735 GCG CTG CAA AAA GTG GTC GAA GAC GGC AAA CAG AGC GAG CTG GAG GCT	2492
Ala Leu Gin Lys Val Val Glu Asp Gly Lys Gin Ser Glu Leu Glu Ala
740 745 750 ATG TGC CGC GAT TGG CCA TTC TTC TCG ACG CGT CTC GGC ATG CTG GAG	2540
Met Cys Arg Asp Trp Pro Phe Phe Ser Thr Arg Leu Gly Met Leu Glu
755 760 765 ATG GTC TTC GCC AAA GCA GAC CTG TGG CTG GCG GAA TAC TAT GAC CAA	2588
Met Val Phe Ala Lys Ala Asp Leu Trp Leu Ala Glu Tyr Tyr Asp Gin
770 775 780 CGC CTG GTA GAC AAA GCA CTG TGG CCG TTA GGT AAA GAG TTA CGC AAC	2636
Arg Leu Val Asp Lys Ala Leu Trp Pro Leu Gly Lys Glu Leu Arg Asn
785 790 795 800 CTG CAA GAA GAA GAC ATC ΆΑΑ GTG GTG CTG GCG ATT GCC AAC GAT TCC	2684
Leu Gin Glu Glu Asp Ile Lys Val Val Leu Ala Ile Ala Asn Asp Ser
805 810 815 CAT CTG ATG GCC GAT CTG CCG TGG ATT GCA GAG TCT ATT CAG CTA CGG	2732
His Leu Met Ala Asp Leu Pro Trp Ile Ala Glu Ser Ile Gin Leu Arg
820 825 830 AAT ATT TAC ACC GAC CCG CTG AAC GTA TTG CAG GCC GAG TTG CTG CAC	2780

Asn. Ile Tyr Thr Asp Pro Leu. Asn Val Leu Gin Ala Glu Leu Leu His 835 840845

CGC TCC CGC CAG GCA GAA AAA GAA GGC CAG GAA CCG GAT CCT CGC GTC2828

Arg Ser Arg Gin Ala Glu Lys Glu Gly Gin Glu Pro Asp Pro ArgVal

850 855860

GAA CAA GCG TTA ATG GTC ACT ATT GCC GGG ATT GCG GCA GGT ATG CGT2876

Glu Gin Ala Leu Met Val Thr Ile Ala Gly Ile Ala Ala Gly MetArg

865 870 875880

AAT ACC GGC TAATCTTCCT CTTCTGCAAA CCCTCGTGCT TTTGCGCGAG2925

Asn Thr Gly

181 380

GGTTTTCTGA AATACTTCTG TTCTAACACC CTCGTTTTCA ATATATTTCT GTCTGCATTT 2985 TATTCAAATT CTGAATATAC CTTCAGATAT CCTTAAGGGC CTCGTGATAC GCCTATTTTT 3045 ATAGGTTAAT GTCATGATAA TAATGGTTTC TTAGACGTCA GGTGGCACTT TTCGGGGAAA 3105 TGTGCGCGGA ACCCCTATTT GTTTATTTTT CTAAATACAT TCAAATATGT ATCCGCTCAT 3165 GAGACAATAA CCCTGATAAA TGCTTCAATA ATATTGAAAA AGGAAGAGTA TGAGTATTCA 3225 ACATTTCCGT GTCGCCCTTA TTCCCTTTTT TGCGGCATTT TGCCTTCCTG TTTTTGCTCA 3285 CCCAGAAACG CTGGTGAAAG TAAAAGATGC TGAAGATCAG TTGGGTGCAC GAGTGGGTTA 3345 CATCGAACTG GATCTCAACA GCGGTAAGAT CCTTGAGAGT TTTCGCCCCG AAGAACGTTT 3405 TCCAATGATG AGCACTTTTA AAGTTCTGCT ATGTGGCGCG GTATTATCCC GTATTGACGC 3465 CGGGCAAGAG CAACTCGGTC GCCGCATACA CTATTCTCAG AATGACTTGG TTGAGTACTC 3525 ACCAGTCACA GAAAAGCATC TTACGGATGG CATGACAGTA AGAGAATTAT GCAGTGCTGC 3585 CATAACCATG AGTGATAACA CTGCGGCCAA CTTACTTCTG ACAACGATCG GAGGACCGAA 3645 GGAGCTAACC GCTTTTTTGC ACAACATGGG GGATCATGTA ACTCGCCTTG ATCGTTGGGA 3705 ACCGGAGCTG AATGAAGCCA TACCAAACGA CGAGCGTGAC ACCACGATGC CTGTAGCAAT 3765 GGCAACAACG TTGCGCAAAC TATTAACTGG CGAACTACTT ACTCTAGCTT CCCGGCAACA 3825 ATTAATAGAC TGGATGGAGG CGGATAAAGT TGCAGGACCA CTTCTGCGCT CGGCCCTTCC 3885 GGCTGGCTGG TTTATTGCTG ATAAATCTGG AGCCGGTGAG CGTGGGTCTC GCGGTATCAT 3945 TGCAGCACTG GGGCCAGATG GTAAGCCCTC CCGTATCGTA GTTATCTACA CGACGGGGAG 4005 TCAGGCAACT ATGGATGAAC GAAATAGACA GATCGCTGAG ATAGGTGCCT CACTGATTAA 4065 GCATTGGTAA CTGTCAGACC AAGTTTACTC ATATATACTT TAGATTGATT TAAAACTTCA 4125 ΤΤΤΤΤΤΆΤΤΤ AAAAGGATCT AGGTGAAGAT CCTTTTTGAT AATCTCATGA CCAAAATCCC 4185 TTAACGTGAG TTTTCGTTCC ACTGAGCGTC AGACCCCGTA GAAAAGATCA AAGGATCTTC 4245 TTGAGATCCT TTTTTTCTGC GCGTAATCTG CTGCTTGCAA ACAAAAAAAC CACCGCTACC 4305

AGCGGTGGTT TGTTTGCCGG ATCAAGAGCT ACCAACTCTT TTTCCGAAGG TAACTGGCTT 4365

CAGCAGAGCG CAGATACCAA ATACTGTCCT TCTAGTGTAG CCGTAGTTAG GCCACCACTT 4425 CAAGAACTCT GTAGCACCGC CTACATACCT CGCTCTGCTA ATCCTGTTAC CAGTGGCTGC 4485 TGCCAGTGGC GATAAGTCGT GTCTTACCGG GTTGGACTCA AGACGATAGT TACCGGATAA 4545 GGCGCAGCGG TCGGGCTGAA CGGGGGGTTC GTGCACACAG CCCAGCTTGG AGCGAACGAC 4605 CTACACCGAA CTGAGATACC TACAGCGTGA GCATTGAGAA AGCGCCACGC TTCCCGAAGG 4665 GAGAAAGGCG GACAGGTATC CGGTAAGCGG CAGGGTCGGA ACAGGAGAGC GCACGAGGGA 4725 GCTTCCAGGG GGAAACGCCT GGTATCTTTA TAGTCCTGTC GGGTTTCGCC ACCTCTGACT 4785 TGAGCGTCGA TTTTTGTGAT GCTCGTCAGG GGGGCGGAGC CTATGGAAAA ACGCCAGCAA 4845 CGCGGCCTTT TTACGGTTCC TCGCX7TTTTG CTGGCCTTTT GCTCACATGT TCITTCCTGC 4905 GTTATCCCCT GATTCTGTGG ATAACCGTAT TACCGCCTTT GAGTGAGCTG ATACCGCTCG 4965 CCGCAGCCGA ACGACCGAGC GCAGCGAGTC AGTGAGCGAG GAAGCGGAAG AGCWOCAAT 5025 ACGCAAACCG CCTCTCCCCG CGCGTTGGCC GATTCATTAA TGCAGAAGGG TTGGTTTGCG 5085 CATTCACAGT TCTCCGCAAG AATTGATTGG CTCCAATTCT TGGAGTGGTG AATCCGTTAG 5145 CGAGGTGCCG CCGGCTTCCA TTCAGGTCGA GGTGGCCCGG G 5186 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 2:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 883 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko

181 380

	(xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKACYJNYM 2:	SEKWENCJA 0 NUMERZE
Met 1	Asn Glu Gin Tyr Ser Ma Leu 5	Arg Ser Asn Val Ser Met Leu Gly 10 15
Lys	Val Leu Gly Glu Thr Ile Lys 20	Asp Ala Leu Gly Glu His Ile Leu 25 30
Glu	Arg Val Glu Thr Ile Arg Lys 35 40	Leu Ser Lys Ser Ser Arg Ala Gly 45
Asn	Asp Ala Asn Arg Gin Glu Leu 50 55	Leu Thr Thr Leu Gin Asn Leu Ser 60
Asn 65	Asp Glu Leu Leu Pro Val Ala 70	tag Ala Phe Ser Gin Phe Leu Asn 75 80
Leu	Ala Asn Thr Ala Glu Gin Tyr	His Ser Ile Ser Pro Lys Gly Glu

90 95

Ala Ala Ser Asn

Pro Glu Val Ile Ala Arg Thr Leu Arg Lys Leu Lys

100

105

110

Asn

Gin

Pro

Glu

Leu

Ser

Glu

Asp

Thr

Ile

Lys

Lys

Ma

Val

Glu

Ser

115

120

125

Leu

Ser

Leu

Glu

Leu

Val

Leu

Thr

Ma

His

Pro

Thr

Glu

Ile

Thr

Arg

130

135

140

Arg

Thr

Leu

Ile

His

Lys

Met

Val

Glu

Val

Asn

Ma

Cys

Leu

Lys

Gin

145

150

155

160

Leu

Asp

Asn

Lys

Asp

Ile

Ala

Asp

Tyr

Glu

His

Asn

Gin

Leu

Met

Arg

165

170

175

Arg

Leu

Arg

Gin

Leu

Ile

Ala

Gin

Ser

Trp

His

Thr

Asp

Glu

Ile

Arg

180

185

190

Lys

Leu

Arg

Pro

Ser

Pro

Val

Asp

Glu

Ma

Lys

Trp

Gly

Phe

Ma

Val

195

200

205

Val

Glu

Asn

Ser

Leu

Trp

Gin

Gly

Val

Pro

Asn

Tyr

Leu

Arg

Glu

Leu

210

215

220

Asn

Glu

Gin

Leu

Glu

Glu

Asn

Leu

Gly

Tyr

Lys

Leu

Pro

Val

Glu

Phe

225

230

235

240

Val

Pro

Val

Arg

Phe

Thr

Ser

Trp

Met

Gly Gly Asp

Arg

Asp

Gly

Asn

245 250 255

Pro Asn Val Thr Ala Asp Ile Thr Arg His Val Leu Leu Leu Ser Arg 260 265270

Trp Lys Ala Thr Asp Leu Phe Leu Lys Asp Ile Gin Val Leu Val Ser 275 280285

Glu Leu Ser Met Val Glu Ala Thr Pro Glu Leu Leu Ala Leu Val Gly 290 295300

Glu Glu Gly Ala Ala Glu Pro Tyr Arg Tyr Leu Met Lys Asn LeuArg

305 310 315320

Ser Arg Leu Met Ala Thr Gin Ala Trp Leu Glu Ala Arg Leu LysGly

325 330335

Glu Glu Leu Pro Lys Pro Glu Gly Leu Leu Thr Gin Asn Glu Glu Leu 340 345350

181 380

Trp Glu Pro Leu Tyr Ala Cys Tyr Gin Ser Leu Gin Ala Cys Gly Met 355 360365

Gly Ile Ile Ala Asn Gly Asp Leu Leu Asp Thr Leu Arg Arg Val Lys 370 375380

Cys Phe Gly Val Pro Leu Val Arg Ile Asp Ile Arg Gin Glu SerThr

385 390 395400

Arg His Thr Glu Ala Leu Gly Glu Leu Thr Arg Tyr Leu Gly IleGly

405 410415

Asp Tyr Glu Ser Trp Ser Glu Ala Asp Lys Gin Ala Phe Leu Ile Arg 420 425430

Glu Leu Asn Ser Lys Arg Pro Leu Leu Pro Arg Asn Trp Gin Pro Ser 435 440445

Ala Glu Thr Arg Glu Val Leu Asp Thr Cys Gin Val Ile Ala Glu Ala 450 455460

Pro Gin Gly Ser Ile Ala Ala Tyr Val Ile Ser Met Ala Lys ThrPro

465 470 475480

Ser Asp Val Leu Ala Val His Leu Leu Leu Lys Glu Ala Gly IleGly

485 490495

Phe Ala Met Pro Val Ala Pro Leu Phe Glu Thr Leu Asp Asp Leu Asn 500 505510

Asn Ala Asn Asp Val Met Thr Gin Leu Leu Asn Ile Asp Trp Tyr Arg 515 520525

Gly Leu Ile Gin Gly Lys Gin Met Val Met Ile Gly Tyr Ser Asp Ser 530 535540

Ala Lys Asp Ala Gly Val Met Ala Ala Ser Trp Ala Gin Tyr Gin Ala 545 550 555560

Gin Asp Ala Leu	Ile Lys Thr Cys Glu Lys Ala Gly Ile Glu Leu Thr
565	570	575
Leu Phe His Gly	Arg Gly Gly	Ser Ile Gly Arg	Gly Gly Ala Pro Ala
580		585	590
His Ala Ala Leu	Leu Ser Gin	Pro Pro Gly Ser	Leu Lys Gly Gly Leu
595		600	605
Arg Val Thr Glu	Gin Gly Glu	Met Ile Arg Phe	Lys Tyr Gly Leu Pro
610	615		620
Glu Ile Thr Val	Ser Ser Leu	Ser Leu Tyr Thr	Gly Ala Ile Leu Glu
625	630	635	640
Ala Asn Leu Leu	Pro Pro Pro	Glu Pro Lys Glu	Ser Trp Arg Arg Ile
	645	650	655
Met Asp Glu Leu	Ser Val Ile	Ser Cys Asp Val	Tyr Arg Gly Tyr Val
660		665	670
Arg Glu Asn Lys	Asp Phe Val	Pro Tyr Phe Arg	Ser Ala Thr Pro Glu
675		680	685
Gin Glu Leu Gly	Lys Leu Pro	Leu Gly Ser Arg	Pro Ala Lys Arg Arg
690	695		700

181 380

Pro Thr Gly Gly Val	Glu Ser Leu Arg Ala Ile Pro Trp Ile Phe	Ala
705 Trp Thr Gin Asn Arg	710 715 Leu Met Leu Pro Ala Trp Leu Gly Ala Gly	720 Thr
725 Ala Leu Gin Lys Val	730 735 Val Glu Asp Gly Lys Gin Ser Glu Leu Glu	Ala
740 Met Cys Arg Asp Trp	745 750 Pro Phe Phe Ser Thr Arg Leu Gly Met Leu	Glu
755 Met Val Phe Ala Lys	760 765 Ala Asp Leu Trp Leu Ala Glu Tyr Tyr Asp	Gin
770 Arg Leu Val Asp Lys	775 780 Ala Leu Trp Pro Leu Gly Lys Glu Leu Arg	Asn
785 Leu Gin Glu Glu Asp	790 795 Ile Lys Val Val Leu Ala Ile Ala Asn Asp	800 Ser
805 His Leu Met Ala Asp	810 815 Leu Pro Trp Ile Ala Glu Ser Ile Gin Leu	Arg
820 Asn Ile Tyr Thr Asp	825 830 Pro Leu Asn Val Leu Gin Ala Glu Leu Leu	His
835 Arg Ser Arg Gin Ala	840 845 Glu Lys Glu Gly Gin Glu Pro Asp Pro Arg	Val
850 Glu Gin Ala Leu Met	855 860 Val Thr Ile Ala Gly Ile Ala Ala Gly Met	Arg
865 Asn Thr Gly	870 875	880

(2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 3:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 23 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa , (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inne..syntetyczny DNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE

IDENTYFIKACYJNYM 3:

TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTT (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 4:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inne..syntetyczny DNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE

IDENTYFIKACYJNYM 3:

ACGGAATTCA ATCTTACGGC C 21

181 380 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 5:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1643 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: dwie (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: genomowy DNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:

(A) ORGANIZM: Corynebacterium glutamicum (C) SZCZEP: ATCC13869 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: białko mat (B) POŁOŻENIE: 217...1482 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE

IDENTYFIKACYJNYM 5:

TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC60

TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT120

GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG180

GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAG GTG GCC CTG GTC GTA CAG Met Ala Leu Val Val Gin	234
	1	5
AAA TAT GGC GGT 1	TCC TCG CTT GAG AGT GCG GAA CGC	ATT AGA AAC GTC	282
Lys Tyr Gly Gly 10	Ser Ser Leu Glu Ser Ala Glu Arg 15	Ile Arg Asn Val 20
GCT GAA CGG ATC	GTT GCC ACC AAG AAG GCT GGA AAT	GAT GTC GTG GTT	330
Ala Glu Arg Ile 25	Val Ala Thr Lys Lys Ala Gly Asn 30	Asp Val Val Val 35
GTC TGC TCC GCA	ATG GGA GAC ACC ACG GAT GAA CTT	CTA GAA CTT GCA	378
Val Cys Ser Ala 40	Met Gly Asp Thr Thr Asp Glu Leu 45 50	Leu Glu Leu Ala
GCG GCA GTG AAT	CCC GTT CCG CCA GCT CGT GAA ATG	GAT ATG CTC CTG	426
Ala Ala Val Asn 55	Pro Val Pro Pro Ala Arg Glu Met 60 65	Asp Met Leu Leu 70
ACT GCT GGT GAG	CGT ATT TCT AAC GCT CTC GTC GCC	ATG GCT ATT GAG	474
Thr Ala Gly Glu	Arg Ile Ser Asn Ala Leu Val Ala 75 80	Met Ala Ile Glu 85
TCC CTT GGC GCA	GAA GCT CAA TCT TTC ACT GGC TCT	CAG GCT GGT GTG	522
Ser Leu Gly Ala 90	Glu Ala Gin Ser Phe Thr Gly Ser 95	Gin Ala Gly Val 100
CTC ACC ACC GAG	CGC CAC GGA AAC GCA CGC ATT GTT	GAC GTC ACA CCG	570
Leu Thr Thr Glu 105	Arg His Gly Asn Ala Arg Ile Val 110	Asp Val Thr Pro 115

181 380

GGT CGT GTG CGT GAA GCA CTC GAT GAG GGC AAG ATC TGC ATT GTT GCT

618

Gly .

Arg ’

Val .

Arg

Glu

Ala

Leu .

Asp '

Glu

Gly

Lys

Ile

Cys

Ile

Val

Ala

120

125

130

GGT

TTT

CAG

GGT

GTT

AAT

AAA

GAA

ACC

CGC

GAT

GTC

ACC

ACG

TTG

GGT

666

Gly

Phe

Gin

Gly

Val

Asn

Lys

Glu

Thr

Arg

Asp

Val

Thr

Thr

Leu

Gly

135

140

145

150

CGT

GGT

GGT

TCT

GAC

ACC

ACT

GCA

GTT

GCG

TTG

GCA

GCT

GCT

TTG

AAC

714

Arg

Gly

Gly

Ser

Asp

Thr

Thr

Ala

Val

Ala

Leu

Ala

Ala

Ala

Leu

Asn

155

160

165

GCT

GAT

GTG

TGT

GAG

ATT

TAC

TCG

GAC

GTT

GAC

GGT

GTG

TAT

ACC

GCT

762

Ala

Asp

Val

Cys

Glu

Ile

Tyr

Ser

Asp

Val

Asp

Gly

Val

Tyr

Thr

Ala

170

175

180

GAC

CCG

CGC

ATC

GTT

CCT

AAT

GCA

CAG

AAG

CTG

GAA

AAG

CTC

AGC

TTC

810

Asp

Pro

Arg

Ile

Val

Pro

Asn

Ala

Gin

Lys

Leu

Glu

Lys

Leu

Ser

Phe

185

190

195

GAA

GAA

ATG

CTG

GAA

CTT

GCT

GCT

GTT

GGC

TCC

AAG

ATT

TTG

GTG

CTG

858

Glu

Glu

Met

Leu

Glu

Leu

Ala

Ala

Val

Gly

Ser

Lys

Ile

Leu

Val

Leu

200

205

210

CGC

AGT

GTT

GAA

TAC

GCT

CGT

GCA

TTC

AAT

GTG

CCA

CTT

CGC

GTA

CGC

906

Arg

Val

Glu

Tyr

Ala

Arg

Ala

Phe

Asn

Val

Pro

Leu

Arg

Val

Arg

215

220

225

230

TCG

TCT

TAT

AGT

AAT

GAT

CCC

GGC

ACT

TTG

ATT

GCC

GGC

TCT

ATG

GAG

954

Ser

Ser

Tyr

Ser

Asn

Asp

Pro

Gly

Thr

Leu

Ile

Ala

Gly

Ser

Met

Glu

235

240

245

GAT

ATT

CCT

GTG

GAA

GAA

. GCA

. GTC

CTT

ACC

GGT

GTC

GCA

ACC

GAC

AAG

1002

Asp

> Ile

: Pro

. Val

Glu

. Glu

. Ala

. Val

Leu

. Thr

Gly

• Val

Ala

. Thr

Asp

Lys

250 255 260

TCC GAA GCC AAA GTA ACC GTT CTG GGT ATT TCC GAT AAG CCA GGC GAG 1050

Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile Ser Asp Lys Pro Gly Glu 265 270275

GCT GCC AAG GTT TTC CGT GCG TTG GCT GAT GCA GAA ATC AAC ATT GAC1098

Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu Ile Asn IleAsp

280 285290

ATG GTT CTG CAG AAC GTC TCC TCT GTG GAA GAC GGC ACC ACC GAC ATC1146

Met Val Leu Gin Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr AspIle

295 300 305310

ACG TTC ACC TGC CCT CGC GCT GAC GGA CGC CGT GCG ATG GAG ATC TTG1194

Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu IleLeu

315 320325

AAG AAG CTT CAG GTT CAG GGC AAC TGG ACC AAT GTG CTT TAC GAC GAC1242

Lys Lys Leu Gin Val Gin Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr AspAsp

330 335340

CAG GTC GGC AAA GTC TCC CTC GTG GGT GCT GGC ATG AAG TCT CAC CCA1290

Gin Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser HisPro

345 350355

181 380

GGT	GTT ACC	GCA GAG TTC ATG	GAA GCT	CTG CGC	GAT GTC	AAC	GTG AAC	1338
Gly	Val Thr	Ala Glu Phe Met	Glu Ala	Leu Arg	Asp Val	Asn	Val Asn
	360	365			370
ATC	GAA TTG	ATT TCC ACC TCT	GAG ATC	CGC ATT	TCC GTG	CTG	ATC CGT	1386
Ile	Glu Leu	Ile Ser Thr Ser	Glu Ile	Arg Ile	Ser Val	Leu	Ile Arg
375		380		385			390
GAA	GAT GAT	CTG GAT GCT GCT	GCA CGT	GCA TTG	CAT GAG	CAG	TTC CAG	1434
Glu	Asp Asp	Leu Asp Ala Ala	Ala Arg	Ala Leu	His Glu	Gin	Phe Gin
		395		400			405
CTG	GGC GGC	GAA GAC GAA GCC	GTC GTT	TAT GCA	GGC ACC	GGA	CGC TAA	1482
Leu	Gly Gly	Glu Asp Glu Ala	Val Val	Tyr Ala	Gly Thr	Gly Arg

410 415 420

AGTTTTAAAG GAGTAGTTTT ACAATGACCA CCATCGCAGT TGTTGGTGCA ACCGGCCAGG 1542 TCGGCCAGGT TATGCGCACC CTTTTGGAAG AGCGCAATTT CCCAGCTGAC ACTGTTCGTT 1602 TCTTTGCTTC CCCGCGTTCC GCAGGCCGTA AGATTGAATT C 1643

	(2)	INFORMACJA	O SEKWENCJI O	NUMERZE	IDENTYFIKACYJNYM 6
		(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI: (A) DŁUGOŚĆ: 421 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE
Met 1	Ala	Leu Val Val ' 5	Gin Lys Tyr Gly	Gly Ser 10	Ser Leu Glu Ser Ala 15
Glu	Arg	Ile Arg Asn 20	Val Ala Glu Arg 25	Ile Val	Ala Thr Lys Lys Ala 30
Gly	Asn	Asp Val Val 35	Val Val Cys Ser 40	Ala Met	Gly Asp Thr Thr Asp 45
Glu	Leu 50	Leu Glu Leu	Ala Ala Ala Val 55	Asn Pro	Val Pro Pro Ala Arg 60
Glu 65	Met	Asp Met Leu	Leu Thr Ala Gly 70	Glu Arg 75	Ile Ser Asn Ala Leu 80
Val	Ala	Met Ala Ile 85	Glu Ser Leu Gly	Ala Glu 90	Ala Gin Ser Phe Thr 95
Gly	Ser	Gin Ala Gly 100	Val Leu Thr Thr 105	Glu Arg	His Gly Asn Ala Arg 110
Ile	Val	Asp Val Thr 115	Pro Gly Arg Val 120	Arg Glu	Ala Leu Asp Glu Gly 125
Lys	Ile 130	Cys Ile Val	Ala Gly Phe Gin 135	Gly Val	Asn Lys Glu Thr Arg 140
145	Val	Thr Thr Leu	Gly Arg Gly Gly 150	Ser Asp 155	Thr Thr Ala Val Ala 160
Leu	Ala	Ala Ala Leu 165	Asn Ala Asp Val	Cys Glu 170	Ile Tyr Ser Asp Val 175

181 380

Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gin Lys 180 185190

Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly 195 200205

Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn 210 215220

Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly ThrLeu

225 230 235240

Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val LeuThr

245 250255

Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile 260 265270

Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp 275 280285

Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gin Asn Val Ser Ser Val Glu 290 295300

Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ala Asp GlyArg

305 310 315320

Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gin Val Gin Gly Asn TrpThr

325 330335

Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gin Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala 340 345350

Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu 355 360365

Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg 370 375380

Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala ArgAla

385 390 395400

Leu His Glu Gin Phe Gin Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val ValTyr

405 410415

Ala Gly Thr Gly Arg

420 (2) INFORMACJA 0 SEKWENCJI 0 NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 7:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1643 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: dwie (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: genomowy DNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:

(A) ORGANIZM: Corynebacterium glutamicum (C) SZCZEP: ATCC13869

181 380 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: białko mat (B) POŁOŻENIE: 964...1482 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 7:

TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC60

TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT120

GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG180

GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAGGTGG CCCTGGTCGT ACAGAAATAT240

GGCGGTTCCT CGCTTGAGAG TGCGGAACGC ATTAGAAACG TCGCTGAACG GATCGTTGCC300

ACCAAGAAGG CTGGAAATGA TGTCGTGGTT GTCTGCTCCG CAATGGGAGA CACCACGGAT360

GAACTTCTAG AACTTGCAGC GGCAGTGAAT CCCGTTCCGC CAGCTCGTGA AATGGATATG420

CTCCTGACTG CTGGTGAGCG TATTTCTAAC GCTCTCGTCG CCATGGCTAT TGAGTCCCTT480

GGCGCAGAAG CTCAATCTTT CACTGGCTCT CAGGCTGGTG TGCTCACCAC CGAGCGCCAC540

GGAAACGCAC GCATTGTTGA CGTCACACCG GGTCGTGTGC GTGAAGCACT CGATGAGGGC600

AAGATCTGCA TTGTTGCTGG TTTTCAGGGT GTTAATAAAG AAACCCGCGA TGTCACCACG660

TTGGGTCGTG GTGGTTCTGA CACCACTGCA GTTGCGTTGG CAGCTGCTTT GAACGCTGAT720

GTGTGTGAGA TTTACTCGGA CGTTGACGGT GTGTATACCG CTGACCCGCG CATCGTTCCT780

AATGCACAGA AGCTGGAAAA GCTCAGCTTC GAAGAAATGC TGGAACTTGC TGCTGTTGGC840

TCCAAGATTT TGGTGCTGCG CAGTGTTGAA TACGCTCGTG CATTCAATGT GCCACTTCGC900

GTACGCTCGT CTTATAGTAA TGATCCCGGC ACTTTGATTG CCGGCTCTAT GGAGGATATT960

CCT GTG GAA GAA GCA GTC CTT ACC GGT GTC GCA ACC GAC AAG TCC GAA 1008 Met Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu

	1	5	10	15
GCC	AAA GTA ACC	GTT CTG GGT ATT	TCC GAT AAG CCA GGC GAG	GCT GCC 1056
Ala	Lys Val Thr	Val Leu Gly Ile 20	Ser Asp Lys Pro Gly Glu 25	Ala Ala 30
AAG	GTT TTC CGT	GCG TTG GCT GAT	GCA GAA ATC AAC ATT GAC	ATG GTT 1104
Lys	Val Phe Arg 35	Ala Leu Ala Asp	Ala Glu Ile Asn Ile Asp 40 45	Met Val
CTG	CAG AAC GTC	TCC TCT GTG GAA	GAC GGC ACC ACC GAC ATC	ACG TTC 1152
Leu	Gin Asn Val 50	Ser Ser Val Glu 55	Asp Gly Thr Thr Asp Ile 60	Thr Phe
ACC	TGC CCT CGC	GCT GAC GGA CGC	CGT GCG ATG GAG ATC TTG	AAG AAG 1200
Thr	Cys Pro Arg 65	Ala Asp Gly Arg 70	Arg Ala Met Glu Ile Leu 75	Lys Lys
CTT	CAG GTT CAG	GGC AAC TGG ACC	AAT GTG CTT TAC GAC GAC	CAG GTC 1248
Leu 80	Gin Val Gin	Gly Asn Trp Thr 85	Asn Val Leu Tyr Asp Asp 90	Gin Val 95
GGC	AAA GTC TCC	CTC GTG GGT GCT	GGC ATG AAG TCT CAC CCA	GGT GTT 1296
Gly	Lys Val Ser	Leu Val Gly Ala 100	Gly Met Lys Ser His Pro 105	Gly Val 110
ACC	GCA GAG TTC	ATG GAA GCT CTG	CGC GAT GTC AAC GTG AAC	ATC GAA 1344
Thr	Ala Glu Phe 115	Met Glu Ala Leu	Arg Asp Val Asn Val Asn 120 125	Ile Glu

181 380

TTG ATT TCC ACC	TCT GAG ATC	CGC ATT TCC GTG	CTG	ATC CGT GAA	GAT	1392
Leu Ile Ser Thr	Ser Glu Ile	Arg Ile Ser Val	Leu	Ile Arg Glu	Asp
130		135		140
GAT CTG GAT GCT	GCT GCA CGT	GCA TTG CAT GAG	CAG	TTC CAG CTG	GGC	1440
Asp Leu Asp Ala	Ala Ala Arg	Ala Leu His Glu	Gin	Phe Gin Leu	Gly
145	150		155
GGC GAA GAC GAA	GCC GTC GTT	TAT GCA GGC ACC	GGA	CGC TAAAGTTTTAA	1490
Gly Glu Asp Glu	Ala Val Val	Tyr Ma Gly Thr	Gly	Arg
160	165	170		172

AGGAGTAGTT TTACAATGAC CACCATCGCA GTTGTTGGTG CAACCGGCCA GGTCGGCCAG 1550

GTTATGCGCA CCCTTTTGGA AGAGCGCAAT TTCCCAGCTG ACACTGTTCG TTTCTTTGCT 1610

TCCCCGCGTT CCGCAGGCCG TAAGATTGAA TTC 1643 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 8:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI :

(A) DŁUGOŚĆ: 172 aminokwasy (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE

IDENTYFIKACYJNYM 8:

Met Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala 15 1015

Lys Val Thr Val Leu Gly Ile Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys

2530

Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu

4045

Gin Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr

5560

Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu

70 7580

Gin Val Gin Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gin Val Gly 85 9095

Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr

100 105110

Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu

115 120125

Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp

130 135140

Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gin Phe Gin Leu Gly Gly

145 150 155160

Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg

165170 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 9:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:

181 380 (A) DŁUGOŚĆ: 16 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inne..syntetyczny DNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 9: AAAAACCTGC GTTCTC 16 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 10:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 20 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inne..syntetyczny DNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 10: TGACTTAAG GTTTACAGGCC 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 11:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 20 (Β) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inne..syntetyczny DNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 11: ACTGAATTCC AAATGTCCGC 20 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 12:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWECJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 16 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inne..syntetyczny DNA (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKWENCJA O NUMERZE IDENTYFIKACYJNYM 12: AAGTGCAGG CCGTTT 16

HAMOWANIE WZROSTU PRZEZ Ą-HYDROKSY-Asp

STĘŻENIE ZWIĄZKU (Ąg/ml)

--a— o ----·---- 500

---o--- 1000

----o--- 2000

---u--- 5000

Fig. 2

OD660

HAMOWANIE WZROSTU PRZEZ 0-HYDRAZYD Asp

STĘŻENIE

ZWIĄZKU

Cug/ml) —□— o ----·---- 500

----□--- 1000

----o--- 2000

---a--- 5000

---□--- 10000

F i g. 3

181 380

SUBSTANCJE ZNOSZĄCE HAMOWANIE WZROSTU 3-BROMOPIROGRONIANEM

Czas (godziny)

F i g. 4

SUBSTANCJE ZNOSZĄCE HAMOWANIE WZROSTU

F i g. 5

181 380

SUBSTANCJE ZNOSZĄCE HAMOWANIE WZROSTU ^-HYDRAZYDEM Asp

8-i_________________________________________.__

OD660 OD660

Czas (godziny)

Fig. 6

BADANIA CZYNNIKA PRZYWRACAJĄCEGO WZROST (BEZ DODATKU ZWIĄZKU) o-.________________________________ ______________________________________

SUBSTANCJE

ZNOSZĄCE HAMOWANIE

SUBSTANCJE

DODANE

Czas (godziny)

F i g. 7

181 380

HAMOWANIE AKTYWNOŚCI KARBOKSYLAZY FOSFOENOLOPIROGRONIANOWEJ PRZEZ WYBRANE ZWIĄZKI

STĘŻENIE DODANEGO ZWIĄZKU (mM)

DODANY ZWIĄZEK

---□--- Asp

----n--- β-hydrazyd Asp β-hydroksy-Asp

------- Tns

F i g. 8

181 380

HAMOWANIE ZMUTOWANEJ KARBOKSYLAZY FOSFOENOLOPIROGRONIANOWEJ PRZEZ Asp (AcCoA: 0.1 mM)

PCRl/pS2

PCRl/pBP5 PCRl/pBP122

PCRl/pHA19

PCRl/pR6

F i g. 9

HAMOWANIE ZMUTOWANEJ KARBOKSYLAZY FOSFOENOLOPIROGRONIANOWEJ PRZEZ Asp (AcCoA: 1 mM)

1 2 3 4 5 6

pS2(WT) pBP5 pBP122 pHA19 pR6

Asp(mM)

Fig. 10

181 380

PPC

AB 371bp

C D 807bp

BssHU

46bp

EcoRI l019bp

Spił

92bp

Fig. 11

KWAS L-ASPARAG1NOWY (mM)

KWAS L-ASPARAGINOWY (mM)

F i g. 12

181 380

a)

100 | 80

Q ur

O 60 $ ⁴⁰

O z

I 20

KWAS L-ASPARAGINOWY (mM)

KWAS L-ASPARAGINOWY (mM)

ENZYM TYPU DZIKIEGO (*)

K491A ZMUTOWANY ENZYM (□)

K650A ZMUTOWANY ENZYM (O)

K620S ZMUTOWANY ENZYM (O)

Fig. 13

181 380

HAMOWANIE WZROSTU PRZEZ 3-BROMOPIROGRONIAN

OD660

STĘŻENIE ZWIĄZKU (pg/ml) —□— o

----« 20

----π 50

----o 100

--- 200

---o 500

----4. 1000

---A 2000

---- 5000

Czas (godziny)

Fig. 1

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 6,00 zł.

Claims (38)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Zmutowana karboksylaza fosfoenolopirogronianowa pochodząca z mikroorganizmu należącego do rodzaju Escherichia, znamienna tym, że hcząc od końca N zawiera zmianę w tej sekwencji aminokwasowej dobraną spośród grupy obejmującej zmianę zastępującą:

   (1) kwas glutaminowy w pozycji 625 lizyną (2) argininę w pozycji 222 histydyną i kwas glutaminowy w pozycji 223 lizyną oraz (3) alaninę w pozycji 867 treoniną i nie jest hamowana na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez kwas asparaginowy.
2. 2. Zmutowana karboksylaza według zastrz. 1, znamienna tym, że licząc od końca N zawiera zmianę w jej sekwencji aminokwasowej dobraną spośród grupy dodatkowo obejmującej zmianę zastępującą argininę w pozycji 438 cysteiną.
3. 3. Zmutowana karboksylaza według zastrz. 1, znamienna tym, że licząc od końca N zawiera zmianę w jej sekwencji aminokwasowej dobraną spośród grupy dodatkowo obejmującej zmianę zastępującą serynę w pozycji 288 fenyloalaniną kwas glutaminowy w pozycji 289 lizyną metioninę w pozycji 551 izoleucynąi kwas glutaminowy w pozycji 804 lizyną.
4. 4. Zmutowana karboksylaza według zastrz. 1, znamienna tym, że licząc od końca N zawiera zmianę w jej sekwencji aminokwasowej dobraną spośród grupy dodatkowo obejmującej zmianę zastępującą hzynę w pozycji 620 seryną.
5. 5. Fragment DNA kodujący zmutowaną karboksylazę fosfoenolopirogronianową pochodzący z mikroorganizmu należącego do rodzaju Escherichia, znamienny tym, że zawiera mutację wybraną z grupy obejmującej:

   (1) mutację zastępującą kwas glutaminowy w pozycji 625 lizyną (2) mutację zastępującą odpowiednio argininę w pozycji 222 histydyną i kwas glutaminowy w pozycji 223 lizyną oraz (3) mutację zastępującą alaninę w pozycji 867 treoniną hcząc od końca N karboksylazy fosfoenolopirogronianowej, po której kodowana przez ten DNA karboksylaza fosfoenolopirogronianowa nie jest hamowana na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez kwas asparaginowy.
6. 6. Fragment DNA według zastrz. 5, znamienny tym, że zawiera mutację wybranąz grupy dodatkowo obejmującej mutację zastępującąargininę w pozycji 438 cysterną.
7. 7. Fragment DNA według zastrz. 5, znamienny tym, że zawiera mutację wybranąz grupy dodatkowo obejmującej mutację zastępującą odpowiednio serynę w pozycji 288 fenyloalaniną kwas glutaminowy w pozycji 289 lizyną metioninę w pozycji 551 izoleucyną i kwas glutaminowy w pozycji 804 lizyną.
8. 8. Fragment DNA według zastrz. 5, znamienny tym, że zawiera mutację wybranąz grupy dodatkowo obejmującej mutację zastępującą hzynę w pozycji 620 seryną
9. 9. Mikroorganizm należący do rodzaju Escherichia lub bakterii typu maczugowców zawierający fragment DNA zintegrowany z jego chromosomalnym DNA, przy czym zintegrowany fragment DNA koduje zmutowaną karboksylazę fosfoenolopirogronianową pochodzącą z mikroorganizmu należącego do rodzaju Escherichia, znamienny tym, że zawiera zintegrowany fragment DNA zawierający mutację wybranąz grupy obejmującej·

   181 380 (1) mutację zastępującą kwas glutaminowy w pozycji 625 lizyną, (2) mutację zastępującą odpowiednio argininę w pozycji 222 histydynąi kwas glutaminowy w pozycji 223 lizyną, oraz (3) mutację zastępującą alaninę w pozycji 867 treomną, licząc od końca N karboksylazy fosfoenolopirogronianowej, po której kodowana przez ten DNA karboksylaza fosfoenolopirogronianowa nie jest hamowana na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez kwas asparaginowy.
10. 10 Mikroorganizm według zastrz. 9, znamienny tym, że zawiera zintegrowany fragment DNA zawierający mutację wybraną z grupy dodatkowo obejmującej mutację zastępuj ącąargminę w pozycji 438 cysteiną.
11. 11. Mikroorganizm według zastrz. 9, znamienny tym, że zawiera zintegrowany fragment DNA zawierający mutację wybranąz grupy dodatkowo obejmującej mutację zastępującą odpowiednio serynę w pozycji 288 fenyloalanmą, kwas glutaminowy w pozycji 289 lizyną, metioninę w pozycji 551 izoleucyną i kwas glutaminowy w pozycji 804 lizyną.
12. 12. Mikroorganizm według zastrz. 9, znamienny tym, że zawiera zintegrowany fragment DNA zawierający mutację wybranąz grupy dodatkowo obejmującej mutację zastępującą mutację zastępującą lizynę w pozycji 620 seryną.
13. 13. Zrekombinowany DNA zawierający fragment DNA zhgowany z wektorem DNA zdolnym do autonomicznej replikacji w komórkach bakterii należących do rodzaju Escherichia lub bakterii typu maczugowców, przy czym fragment DNA koduje zmutowaną karboksylazę fosfoenolopirogronianową pochodzącą z mikroorganizmu należącego do rodzaju Escherichia, znamienny tym, że zawiera zligowany fragment DNA zawierający mutację wybranąz grupy obejmującej:

    (1) mutację zastępującą kwas glutaminowy w pozycji 625 lizyną, (2) mutację zastępującą odpowiednio argininę w pozycji 222 histydyną i kwas glutaminowy w pozycji 223 lizyną, oraz (3) mutację zastępującą alaninę w pozycji 867 treomną, licząc od końca N karboksylazy fosfoenolopirogronianowej, po której kodowana przez ten DNA karboksylaza fosfoenolopirogronianowa nie jest hamowana na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez kwas asparaginowy.
14. 14. Zrekombinowany DNA według zastrz. 13, znamienny tym, że zawiera zligowany fragment DNA zawierający mutację wybranąz grupy dodatkowo obejmującej mutację zastępującą argininę w pozycji 438 cysteiną.
15. 15. Zrekombinowany DNA według zastrz. 13, znamienny tym, że zawiera zligowany fragment DNA zawierający mutację wybranąz grupy dodatkowo obejmującej mutację zastępującą odpowiednio serynę w pozycji 288 fenyloalaniną, kwas glutaminowy w pozycji 289 lizyną, metionmę w pozycji 551 izoleucyną i kwas glutaminowy w pozycji 804 lizyną
16. 16. Zrekombinowany DNA według zastrz. 13, znamienny tym, że zawiera zligowany fragment DNA zawierający mutację wybranąz grupy dodatkowo obejmującej mutację zastępującą lizynę w pozycji 620 seryną.
17. 17. Mikroorganizm należący do rodzaju Escherichia lub bakterii typu maczugowców zawierający fragment DNA zhgowany z wektorem DNA zdolnym do autonomicznej replikacji w komórkach bakterii należących do rodzaju Escherichia lub bakterii typu maczugowców, przy czym fragment DNA koduje zmutowaną karboksylazę fosfoenolopirogronianową pochodzącą z mikroorganizmu należącego do rodzaju Escherichia, znamienny tym, że zawiera zhgowany fragment DNA zawierający mutację wybranąz grupy obejmującej:

    (1) mutację zastępującą kwas glutaminowy w pozycji 625 lizyną, (2) mutację zastępującą odpowiednio argininę w pozycji 222 histydyną i kwas glutaminowy w pozycji 223 lizyną, oraz (3) mutację zastępującą alaninę w pozycji 867 treomną, licząc od końca N karboksylazy fosfoenolopirogronianowej, po której kodowana przez ten DNA karboksylaza fosfoenolopirogronianowa me jest hamowana na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez kwas asparaginowy.

    181 380
18. 18. Mikroorganizm według zastrz. 17, znamienny tym, że zawiera zligowany fragment DNA zawierający mutację wybranąz grupy dodatkowo obejmującej mutację zastępującąargininę w pozycji 438 cysteiną.
19. 19. Mikroorganizm według zastrz. 17, znamienny tym, że zawiera zligowany fragment DNA zawierający mutację wybranąz grupy dodatkowo obejmującej mutację zastępującą odpowiednio serynę w pozycji 288 fenyloalanmą kwas glutaminowy w pozycji 289 lizyną, metioninę w pozycji 551 izoleucyną i kwas glutaminowy w pozycji 804 lizyną.
20. 20. Mikroorganizm według zastrz. 17, znamienny tym, że zawiera zligowany fragment DNA zawierający mutację wybranąz grupy dodatkowo obejmującej mutację zastępującą lizynę w pozycji 620 seryną.
21. 21. Sposób wytwarzania aminokwasu, w którym integruje się chromosomalny DNA mikroorganizmu należącego do rodzaju Escherichia lub bakterii typu maczugowców z fragmentem DNA kodującym zmutowanąkarboksylazę fosfoenolopirogronianowąpochodzącąz mikroorganizmu należącego do rodzajuEscherichia, hoduje się mikroorganizm, po czym wydziela się z hodowli aminokwas wybrany z grupy składającej się z L-lizyny, L-treoniny, L-metioniny, L-izoleucyny, kwasu L-glutaminowego, L-argininy i L-proliny, znamienny tym, że integruje się fragment DNA kodujący zmutowanąkarboksylazę fosfoenolopirogronianową zawierający mutację wybraną spośród grupy obejmującej:

    (1) mutację zastępującą kwas glutaminowy w pozycji 625 lizyną, (2) mutację zastępującą odpowiednio argininę w pozycji 222 histydynąi kwas glutaminowy w pozycji 223 lizyną, oraz (3) mutację zastępującą alaninę w pozycji 867 treoniną, licząc od końca N karboksylazy fosfoenolopirogronianowej, po której kodowana przez ten DNA karboksylaza fosfoenolopirogronianowa nie jest hamowana na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez kwas asparaginowy.
22. 22. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że integruje się fragment DNA kodujący zmutowanąkarboksylazę fosfoenolopirogronianową zawierający mutację wybraną spośród grupy dodatkowo obejmującej mutację zastępującą argininę w pozycji 438 cysteiną.
23. 23. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że integruje się fragment DNA kodujący zmutowanąkarboksylazę fosfoenolopirogronianowązawierający mutację wybraną spośród grupy dodatkowo obejmującej mutację zastępującą odpowiednio serynę w pozycji 288 fenyloalamną, kwas glutaminowy w pozycji 289 lizyną, metioninę w pozycji 551 izoleucyną i kwas glutaminowy w pozycji 804 lizyną.
24. 24. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że integruje się fragment DNA kodujący zmutowanąkarboksylazę fosfoenolopirogronianową zawierający mutację wybraną spośród grupy dodatkowo obejmującej mutację zastępującą lizynę w pozycji 620 seryną.
25. 25. Sposób wytwarzania aminokwasu, w którym przeprowadza się ligację fragmentu DNA kodującego zmutowaną karboksylazę fosfoenolopirogronianową pochodzącą z mikroorganizmu należącego do rodzaju Escherichia z wektorem DNA zdolnym do autonomicznej replikacji w komórkach bakterii należących do rodzaju Escherichia lub maczugowców, następnie wprowadza się zrekombmowany DNA do komórki mikroorganizmu należącego do rodzaju Escherichia lub maczugowców, hoduje się mikroorganizm, po czym wydziela się z hodowli aminokwas wybrany z grupy składającej się z L-lizyny, L-treoniny, L-metioniny, L-izoleucyny, kwasu L-glutammowego, L-argininy i L-proliny, znamienny tym, że hguje się fragment DNA kodujący zmutowanąkarboksylazę fosfoenolopirogronianową zawierający mutację wybraną spośród grupy obejmującej.

    (1) mutację zastępującą kwas glutaminowy w pozycji 625 lizyną, (2) mutację zastępującą odpowiednio argininę w pozycji 222 histydynąi kwas glutaminowy w pozycji 223 lizyną, oraz .

    (3) mutację zastępującą alaninę w pozycji 867 treoniną, hcząc od końca N karboksylazy fosfoenolopirogronianowej, po której kodowana przez ten DNA karboksylaza fosfoenolopi- rogromanowa nie jest hamowana na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez kwas asparaginowy.

    181 380
26. 26. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że liguje się fragment DNA kodujący zmutowaną karboksylazę fosfoenolopirogronianową zawierający mutację wybraną spośród grupy dodatkowo obejmującej mutację zastępującą argininę w pozycji 438 cysteiną.
27. 27. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że liguje się fragment DNA kodujący zmutowaną karboksylazę fosfoenolopirogronianową zawierający mutację wybraną spośród grupy dodatkowo obejmującej mutację zastępującą odpowiednio serynę w pozycji 288 fenyloalaniną, kwas glutaminowy w pozycji 289 lizyną, metioninę w pozycji 551 izoleucyną i kwas glutaminowy w pozycji 804 lizyną.
28. 28. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że liguje się fragment DNA kodujący zmutowaną karboksylazę fosfoenolopirogronianową zawierający mutację wybraną spośród grupy dodatkowo obejmującej mutację zastępującą lizynę w pozycji 620 seryną.
29. 29. Sposób selekcji E. coli, która wytwarza zmutowanąkarboksylazę fosfoenolopirogronianową posiadającą mutację, po której karboksylaza fosfoenolopirogronianową nie jest hamowana na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez kwas asparaginowy, znamienny tym, że hoduje się E.coli wytwarzającą zmutowaną karboksylazę fosfoenolopirogronianową w obecności związku wybranego spośród 3-bromopirogronianu, β-hydrazydu kwasu asparaginowego i kwasu DL-treo-p-hydroksyasparaginowego.
30. 30. Sposób według zastrz. 29, znamienny tym, że hoduje się E.coli wytwarzającą zmutowaną karboksylazę fosfoenolopirogronianową pochodzącą z mikroorganizmu należącego do rodzaju Escherichia posiadającą mutację wybraną z grupy obejmującej:

    (1) mutację zastępującą kwas glutaminowy w pozycji 625 lizyną, (2) mutację zastępującą odpowiednio argininę w pozycji 222 histydynąi kwas glutaminowy w pozycji 223 lizyną, oraz (3) mutację zastępującą alaninę w pozycji 867 treoniną, licząc od końca N karboksylazy fosfoenolopirogronianowej.
31. 31. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, że hoduje się E.coli posiadającą mutację zastępującą argininę w pozycji 438 cysteiną.
32. 32. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, że hoduje się E.coli posiadającą mutację zastępującą odpowiednio serynę w pozycji 288 fenyloalaniną, kwas glutaminowy w pozycji 289 lizyną, metioninę w pozycji 551 izoleucyną i kwas glutaminowy w pozycji 804 lizyną.
33. 33. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, że hoduje się E.coli posiadającą mutację zastępującą lizynę w pozycji 620 seryną.
34. 34. Sposób wytwarzania aminokwasu, w którym przeprowadza się selekcję E.coli, następnie hoduje się ten mikroorganizm, po czym wydziela się z hodowli aminokwas wybrany z grupy składającej się z L-lizyny, L-treoniny, L-metioniny, L-izoleucyny, kwasu L-glutaminowego, L-argininy i L-proliny, znamienny tym, że przeprowadza się selekcję E.coli, która wytwarza zmutowanąkarboksylazę fosfoenolopirogronianowąposiadającąmutację, po której karboksylaza fosfoenolopirogronianową nie jest hamowana na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez kwas asparaginowy, polegającą na hodowli E.coli w obecności związku wybranego spośród 3-bromopirogronianu, β-hydrazydu kwasu asparaginowego i kwasu DL-treo-β-hydroksyasparaginowego.
35. 35. Sposób wytwarzania zmutowanej karboksylazy fosfoenolopirogronianowej, znamienny tym, że hoduje się E.coli wytwarzającązmutowanąkarboksylazę fosfoenolopirogronianowąposiadającąmutację, po której karboksylaza fosfoenolopirogronianową nie jest hamowana na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez kwas asparaginowy, w obecności związku wybranego spośród 3-bromopirogronianu, β-hydrazydu kwasu asparaginowego i kwasu DL-treo-β-hydroksyasparaginowego, a następnie izoluje się z E.coli zmutowanąkarboksylazę fosfoenolopirogronianową.
36. 36. Sposób wytwarzania fragmentu DNA, który koduje zmutowaną karboksylazę fosfoenolopirogronianową, znamienny tym, że hoduje się E.coli wytwarzającązmutowanąkarboksylazę fosfoenolopirogronianową posiadającą mutację, po której karboksylaza fosfoenolopirogronianową nie jest hamowana na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez kwas asparaginowy, w obecności

    181 380 związku wybranego spośród 3-bromopirogronianu, β-hydrazydu kwasu asparaginowego i kwasu DL-treo-p-hydroksyasparaginowego, a następnie wyodrębnia się z E.coli fragment DNA kodujący zmutowaną karboksylazę fosfoenolopirogronianową.
37. 37. Sposób wytwarzania mikroorganizmu zawierającego zmutowaną karboksylazę fosfo enolopirogromanową znamienny tym, że hoduje się E.coli wytwarzającą zmutowaną karboksylazę fosfoenolopirogronianową posiadającą mutację, po której karboksylaza fosfoenolopirogronianową nie jest hamowana na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez kwas asparaginowy, w obecności związku wybranego spośród 3-bromopirogronianu, β-hydrazydu kwasu asparaginowego i kwasu DL-treo-β-hydroksyasparagmowego, a następnie wyodrębnia się z E.coli fragment DNA kodujący zmutowaną karboksylazę fosfoenolopirogronianową po czym wprowadza się ten fragment DNA do mikroorganizmu należącego do rodzaju Escherichia lub bakterii typu maczugowców.
38. 38. Sposób wytwarzania aminokwasu, znamienny tym, że hoduje się E. coli wytwarzającą zmutowanąkarboksylazę fosfoenolopirogronianowąposiadającąmutację, po której karboksylaza fosfoenolopirogronianową nie jest hamowana na zasadzie sprzężenia zwrotnego przez kwas asparaginowy, w obecności związku wybranego spośród 3-bromopirogromanu, β-hydrazydu kwasu asparaginowego i kwasu DL-treo-β-hydroksyasparaginowego, a następnie wyodrębnia się z E.coli fragment DNA kodujący zmutowaną karboksylazę fosfoenolopirogronianową po czym wprowadza się ten fragment DNA do mikroorganizmu należącego do rodzaju Escherichia lub bakterii typu maczugowców, następnie hoduje się ten mikroorganizm i wydziela się z hodowli aminokwas wybrany spośród grupy składającej się z L-lizyny, L-treoniny, L-metiomny, L-izoleucyny, kwasu L-glutaminowego, L-argininy i L-proliny.

    * * *