CZ2000444A3 - Způsob výroby C-Peptidu insulinu - Google Patents

Abstract

Způsob produkce C-peptidu insulinu, kteiý zahrnuje expresi multimemího polypeptidu, obsahujícího mnohočetné kopie Cpeptidu insulinu, v hostitelských buňkách, a štěpení tohoto exprimovaného polypeptidu, při kterém se uvolníjednotlivé kopie C-peptidu insulinu. Molekuly nukleových kyselin, expresní vektory a hostitelské buňky pro použití v takovémto postupu, a multimemí polypeptid C-peptidu insulinu exprimovaný a štěpený tímto postupem.

Description

Způsob výroby C-peptidu insulinu

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká produkce C-peptidu insulinu z rekombinantních DNA molekul, jež obsahují multimerní kopie genové sekvence kódující řečený C-peptid insulinu.

Dosavadní stav techniky

Insulin je proteinový hormon, který se podílí na regulaci hladiny cukru v krvi. Insulin je produkován v játrech ve formě prekursoru proinsulinu, který sestává z řetězců insulinu B a A spojených navzájem prostřednictvím C-peptidu (dále v textu je tento C-peptid odvozený z molekuly proinsulinu označován jako “C-peptid insulinu“. Vlastní insulin obsahuje pouze řetězec B a A. Několik nedávných studií ukazuje, že C-peptid je klinicky významný (Johansson et al., Diabetologia (1992) 35, 121-128 a J.CIin.Endocrinol.Metab. (1993) 77, 976-981). U pacientů trpících diabetem I. typu, kterým chybí endogenní C-peptid, podání tohoto peptidu zlepšuje renální funkci, stimuluje svaly a utilizaci glukosy, a zlepšuje funkci hematoretinální bariéry (Johansson et al., 1992 a 1993 supra).

I když ještě nejde o široce uznávaný fakt, lékařské kruhy si stále více uvědomují terapeutickou užitečnost C-peptidu insulinu. Proto vyvstává potřeba snadné, ekonomické a účinné syntézy C-peptidu insulinu. Zatímco postupy chemické syntézy peptidů, např. postupným přidáváním aminokyselin na pevném nosiči jsou nyní dobře rozvinuté, jsou tyto metody, navzdory automatizaci, časově náročné a co je důležitější, nákladné; určité omezení se rovněž týká maximální délky • · • · • · · · ··· «··· • · ···· ···· • · · · ······» ·· · • /Λ · · · · ···· • •-•£2 * · · ·· · ·· ·· peptidu, jež je ekonomicky a spolehlivě možné syntetizovat. Jako alternativní způsob výroby peptidů se jeví exprese rekombinantní DNA, avšak i tento způsob má své nevýhody, např. co se týká výtěžku.

Současný postup výroby C-peptidu insulinu je založen na zpracování proinsulinu, tedy prekursoru insulinu a C-peptidu, obvykle použitím trypsinu a karboxypeptidasy B (Nilsson et al. (1996), J. Biotechnol. 48, 241-250; Jonasson et al., (1996) Eur. J. Biochem. 236, 656-661). Proinsulin byl exprimován ve formě fúzovaného proteinu umožňujícího vysokou hladinu exprese v E. coli, přičemž fúzovaný protein byl konstruován takovým způsobem, aby se při proteolytickém zpracování proinsulinu na insulin a C-peptid současně odštěpil i partner, k němuž byl proinsulin fúzován. Proinsulin byl připraven jako fúzovaný protein se segmentem ZZ odvozeným ze stafylokokového proteinu A, který váže IgG (imunoglobulin G) (Nilsson et al., (1987), Prot. Eng. 1, 107-113). Tato značka (tag) byla pro fúzi zvolena z důvodů stability vůči proteolýze, schopnosti vázat se k IgG, vysoké dosažitelné hladiny exprese a solubilizujícím vlastnostem. Zvolená strategie produkce umožnila využití afinitní značky k účinné purifikaci po solubilizaci inkluzních tělísek a následné renaturaci, aniž by byly zapotřebí další samostatné operace pro odštěpení a odstranění ZZ afinitní značky; ta byla odštěpena současně s digescí proinsulinu párem trypsin/karboxypeptidasa B za vzniku insulinu a C-peptidu. Avšak výroba malých peptidů prostřednictvím exprese velkých fúzovaných proteinů poskytuje obecně spíše nízké výtěžky, neboť výsledný produkt představuje pouze malou část exprimovaného genového produktu.

Shen popisuje v Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 81, 4627-4631 (1984) způsob přípravy lidského proinsulinu pomocí exprese fúzovaného nebo nefúzovaného genového produktu obsahujícího • · • ··· ·· · · ···· · · · ···» • · ···· ···· • · ·· ······· · · · • Q · ·· · ···· ·9·& *· · · *( * «· _<a mnohočetné tandemově spojené kopie polypeptidové domény proinsulinu. Z tohoto genového produktu se jednotlivé proinsulinové jednotky získají štěpením bromkyanem. Další postup předpokládá generování insulinu štěpením proinsulinových jednotek trypsinem a kaboxypeptidasou. Otázka zlepšení výtěžku C-peptidu insulinu však není řešena.

Zůstává proto požadavek na způsob rekombinantní exprese, který by zvýšil výtěžek C-peptidu insulinu jako nefúzovaného produktu. Předkládaný vynález odpovídá na tuto potřebu.

Vynález usiluje o zlepšení současných způsobů rekombinantní exprese peptidů a je v zásadě založen na myšlence zvýšení množství exprimovaného cílového peptidů (v tomto případě C-peptidu insulinu) tím, že by se exprimoval jako součást jednoho genového produktu, multimeru (tj. multimerního polypeptidů), obsahujícího mnohočetné kopie cílového peptidů (C-peptidu insulinu), a následně by se takovýto multimerní genový produkt (tj. multimerní polypeptid) štěpil, aby se cílový peptid uvolnil jako samostatné monomerní jednotky.

Podstata vynálezu

V jednom aspektu tak vynález poskytuje způsob produkce Cpeptidu insulinu spočívajícího v expresi multimerního polypeptidů, obsahujícího mnohočetné kopie řečeného C-peptidu insulinu, v hostitelské buňce, a v štěpení exprimovaného polypeptidů za uvolnění jednotlivých kopií C-peptidu insulinu (tj. uvolnění monomerů C-peptidu insulinu z multimeru).

Multimerní polypetid (genový produkt) je kódován genetickým konstruktem (jinými slovy molekulou nukleové kyseliny), která obsahuje mnohočetné kopie nukleotidové sekvence, jež kóduje C-

• · · · ·······

peptid insulinu. Mnohočetné kopie, nebo tandemové repetice, jsou v rekombinantní molekule spojeny takovým způsobem, že jsou transkribovány a překládány společně v jediném multimerním genovém produktu (tj. multimerním polypeptidů) tj. v “pročítaném formátu“; například mnohočetné nukleotidové sekvence jsou v rekombinantní molekule spojeny v jednom, shodném čtecím rámci. V podstatě je výhodné, když genetický konstrukt obsahuje konkatemer nukleotidové sekvence kódující C-peptid insulinu. Výhodné je, když genetický konstrukt obsahuje tandemové kopie kódující nukleotidové sekvence. Takto konstruovaná rekombinantní molekula je pak standardním postupem vnesena do hostitelské buňky a exprimována. Exprimovaný genový produkt (polypeptid) může být potom izolován a štěpen, aby se uvolnily monomery C-peptidu insulinu.

V dalším aspektu tedy vynález poskytuje způsob produkce C15 peptidů insulinu, který zahrnuje kultivaci hostitelské buňky, jež obsahuje molekulu nukieové kyseliny obsahující mnohočetné kopie nukleotidové sekvence kódující řečený C-peptid insulinu, přičemž kultivace probíhá za podmínek, kdy je z řečené molekuly nukieové kyseliny exprimován multimerní polypeptid, a štěpení tohoto exprimovaného polypeptidů, aby se uvolnily jednotlivé kopie řečeného C-peptidu insulinu.

Termín “mnohočetný“ nebo “multimerní“, jak se zde užívá, se týká dvou nebo více kopií C-peptidu insulinu nebo nukieové kyseliny, jež ho kóduje, s výhodou 2 až 50, 2 až 30 nebo 2 až 20, výhodněji 2 až 15, nebo 2 až 10. Další příkladné rozsahy též zahrnují 3 až 20, 3 až 15 nebo 3 až 10.

Konstrukt může výhodně obsahovat 3 nebo více kopií, např. 3 až 7, nebo 5 až 7 kopií nukleotidové sekvence kódující C-peptid • · • c * ·· · · · · · • »·3> -··· ·· · ·· ·· insulinu. Rozsah 7 kopií nebo více, například 7 až 30, 7 až 20 nebo 7 až 15 může být rovněž užitečný.

Termín “C-peptid insulinu“, jak se zde užívá, zahrnuje všechny formy C-peptidu insulinu, včetně přirozených nebo syntetických peptidů. Takovéto C-peptidy insulinu mohou být lidské peptidy nebo mohou pocházet z jiných živočišných druhů a rodů, s výhodou savců. Zahrnuty jsou tedy varianty a modifikace přirozeného C-peptidu insulinu, pokud mají zachovanou aktivitu C-peptidu insulinu. C-peptidy insulinu mohou být exprimovány v přirozené formě, tzn. jako různé alelické varianty, tak jak se v přírodě vyskytují v různých druzích nebo v důsledku geografických odchylek atd., nebo jako jejich funkčně ekvivalentní varianty nebo deriváty, jež se mohou lišit v aminokyselinové sekvenci, například zkrácením (např. na N- nebo Ckonci nebo na obou koncích) nebo jinými aminokyselinovými delecemi, insercemi nebo substitucemi. Modifikace sekvencí proteinů nebo peptidů při zachování jejich užitečných aktivit jsou známy v oboru; k tomuto účelu se používají standardní techniky, běžné v oboru a popsané v literatuře, např. náhodná nebo místně cílená mutageneze, štěpení a ligace nukleových kyselin atd. Funkčně ekvivalentní varianty nebo deriváty sekvencí přirozeného C-peptidu insulinu mohou tedy být snadno připraveny technikami dobře známými v oboru, a zahrnují peptidové sekvence, jež mají funkční, např. biologickou aktivitu přirozeného C-peptidu insulinu. Mezi takovéto aktivity C-peptidu insulinu patří například stimulace Na⁺K⁺ATPasy, která může být základem různých terapeutických aktivit připisovaných C-peptidu, např. při léčbě diabetů nebo při léčbě nebo prevenci komplikací provázejících diabetes, jako jsou diabetická neuropatie, nefropatie a retinopatie. Fragmenty přirozených nebo syntetických Cpeptidů insulinu mohou mít taktéž žádoucí funkční vlastnosti peptidů, z nichž jsou odvozeny, a jsou proto také zahrnuty. Zejména lze zmínit • · · · · · · •S fragmenty C-peptidu insulinu, které popisuje Wahren et al., ve WO98/13384. Všechny takovéto analogy, varianty, deriváty nebo fragmenty C-peptidu insulinu jsou zahrnuty do rozsahu vynálezu a spadají pod termín “C-peptid insulinu“.

S výhodou se dá použít přirozený lidský C-peptid insulinu a tento je ukázán na Obr. 2C (SEQ ID NO: 1).

V dalším výhodném provedení způsobu podle vynálezu obsahuje genový konstrukt dále sekvenci kódující partnera, s nímž je produkt fúzován, například partnera (afinitní značku), který je schopný vázat se k nosičům používaným při zpracování produktu genové exprese.

Termín “partner ve fúzi“ se týká jakéhokoli proteinu nebo peptidu nebo jeho derivátu či fragmentu, který je překládán návazně s Cpeptidem insulinu a jehož vlastnosti mohou být využity při dalším zpracování exprimovaného fúzovaného produktu.

Interakce partnera, k němuž je C-peptid insulinu fúzován, s nosičem může být založena na afinitě, chelatujících peptidech, hydrofobních nebo elektrostatických interakcích, nebo jakémkoli jiném mechanismu známém v oboru. Partner, k němuž je C-peptid insulinu fúzován, je s výhodou jeden z dvojice afinitně se vázajících molekul nebo ligandů, např. protein, polypeptid nebo peptid, schopný selektivně nebo specificky se vázat nebo reagovat s ligandem. Vhodné molekuly partnerů pro fúzi zahrnují například streptokokový protein G a stafylokokový protein A a jejich deriváty, β-galaktosidasu, glutathion-S-transferasu a avidin nebo streptavidin, nebo fragment či derivát kteréhokoli z uvedených proteinů, které mají silnou afinitu k imunoglobulinu G, respektive analogům substrátů nebo protilátkám, respektive biotinu. Takovéto interakce mohou být využity při purifikaci fúzovaných proteinových produktů z komplexní směsi. Fragment ZZ proteinu A (viz Nilsson et al., supra) je příkladem proteinového • ·· ·· • · · · · ♦ • · · · · · · ····«·· · · i • · · I · » • · · · · fragmentu, který by mohl být použit. Do fúze lze použít histidinové peptidy, neboť tyto se vážou k iontům kovů, např. Zn²⁺, Cu²⁺ nebo Ni²⁺ a eluce se dosáhne snížením pH nebo pomocí EDTA (Ljungquist et al. (1989) Eur. J. Biochem. 186, 563-569). Obzvláště výhodným polypeptidovým partnerem pro fúzi je 25 kDa oblast vázající serumalbumin (BB) odvozená ze streptokokového proteinu G (SpG) (Nygren et al. (1988) J. Mol. Recogn. 1, 69-74) nebo jiné SpGodvozené albumin-vázající značky ( Stáhl a Nygren (1997) Path. Bio. 45, 66-76). Oberg et al., popisuje expresní vektor pTrp BB (SEQ ID NO: 14) vhodný pro inserci genových fragmentů k expresi požadovaného produktu ve fúzí s BB (Proceedings of the 6^th European Congress on Biotechnology, 1994, 179-182). Tyto polypeptidy mají silnou afinitu k albuminu, a proto může být purifikace exprimovaného fúzovaného proteinu založena na afinitní chromatografii, např. s použitím kolony nesoucí albumin. Albumin je s výhodou imobilizován na pevném nosiči.

Štěpící krok, tj. vyštěpení monomerních C-peptidů insulinu z multimerního polypeptidu, tj. z exprimovaného genového produktu a popřípadě od partnera k němuž je produkt fúzován, je-li přítomen, lze provést libovolnými výhodnými prostředky. Výhodné je k tomuto účelu použití enzymů. Primární produkt genové exprese, tj. multimerní polypeptid nebo fúzovaný produkt nebo fúzovaný protein, který obsahuje mnohočetné kopie (monomery) C-peptidu insulinu fúzované s partnerem, je s výhodou štěpen v jednom kroku jedním nebo více proteolytickými enzymy za vzniku nefúzovaných jednotlivých kopií C-peptidu insulinu. Obzvláště výhodným způsobem jak získat požadované produkty štěpení je společné působení trypsinem a karboxypeptidasou B (např. hovězí, prasečí nebo z jiných zdrojů). Trypsin štěpí proteiny za každým argininovým zbytkem (C-koncově) a karboxypeptidasa B odstraňuje C-koncový arginin přítomný na • ·

každém tryptickém peptidu vzešlém po štěpení trypsinem. Podmínky pro dosažení proteolytického štěpení jsou v oboru dobře známy, právě tak jako paleta dalších vhodných proteolytických enzymů jako jsou subtilisin (včetně jeho mutantů), enterokinasa, faktor Xa, thrombin, IgA proteasa, proteasa 3C, a inteiny. Bylo například zjištěno, že k úplnému zpracování exprimovaného proteinu postačuje 60 min inkubace exprimovaného genového produktu s proteolytickými enzymy (např. trypsinem a karboxypeptidasou B). S výhodou může inkubační doba 5 minut dostačovat na adekvátní zpracování fúzovaného proteinu tak, že obvyklou SDS-PAGE není detegovatelný žádný fúzovaný nebo multimerní protein. V alternativním postupu se výchozí produkt genové exprese štěpí chemickými činidly jako CNBr, hydroxylamin nebo kyselina mravenčí.

V závislosti na přesné povaze použité molekuly nukleové kyseliny a C-peptidu insulinu (genetického konstruktu) mohou být štěpící místa, např. pro proteolysu, přítomna přirozeně, nebo mohou být zavedena uměle vhodnou manipulací genetického konstruktu s použitím známých technik, např. místně cílenou mutagenezou, ligací nukleotidových sekvencí kódujících příslušné štěpící místo atd.

Multimerní exprimovaný polypeptid může s výhodou obsahovat spojovací oblast (linker), tzn. spojovací aminokyselinový zbytek nebo spojovací peptid zahrnující nebo poskytující štěpící místo. Štěpící místo s výhodou obsahuje štěpitelný motiv, jenž je rozpoznáván a štěpen proteolytickým enzymem. Linkerové oblasti mohou být zařazeny mezi jednotlivé “monomerové“ peptidy v multimerním produktu a/nebo popřípadě též mezi partnerem pro fúzi, je-li přítomen, a monomerovým peptidem. Každý monomer peptidu může být s výhodou tandemově uspořádán s linkerovou oblastí. Monomery C-peptidu insulinu jsou v multimeru s výhodou lemovány vhodnými • · • ·

linkerovými sekvencemi zajišťujícími štěpení a uvolnění C-peptidu insulinu bez jakýchkoli zbytků linkerové oblasti. Linkerová oblast může obsahovat 1 až 15, např. 1 až 12 nebo 1 až 10 aminokyselinových zbytků, délka však není kritická a může být vybrána podle libosti. Výhodné mohou být linkerové oblasti v délce 1 až 8, např. 1, 5 a 7 zbytků. Jednotlivé linkerové oblasti vdaném konstruktu mohou být stejné nebo odlišné, i když obvykle jsou z praktických ohledů stejné. Takže například pro štěpení kombinovaným účinkem trypsinu a karboxypeptidasy B mohou být použity linkery začínající nebo končící argininovými zbytky.

Jinou možností je, že linker obsahuje aminokyselinu lysin, buď samotnou nebo jako součást delší sekvence, a může být rovněž štěpen kombinací trypsin/karboxypeptidasa B.

Takovéto linkery pro zařazení mezi monomery C-peptidu insulinu mohou s výhodou začínat a končit takovým štěpícím místem, např. argininovým zbytkem na N- i C-koncích, aby by se umožnilo uvolnění monomeru C-peptidu insulinu bez dalších aminokyselin. Při zařazení linkeru mezi partnera ve fúzi a/nebo konec multimeru C-peptidu insulinu může být jediné štěpící místo (např. Arg) přítomno na příslušném konci linkeru (nebo analogicky v příslušném místě pro štěpení, v závislosti na přesné sekvenci linkeru a používaných štěpících enzymů).

Ukázkové typické linkerové oblasti zahrnují -RTASQAR- (SEQ ID NO: 2) pro zařazení mezi monomery C-peptidu, -ASQAR- (SEQ ID NO: 3) mezi multimer C-peptidu a partnera ve fúzi, a -RTASQAVD(SEQ ID NO: 4) na konec multimeru.

Jak bylo zmíněno výše, pro zavedení linkerových sekvencí se mohou použít standardní postupy, dobře známé v oboru.

• ·

Dalším aspektem vynálezu je molekula nukleové kyseliny, která obsahuje mnohočetné kopie nukleotidové sekvence kódující C-peptid insulinu, kde tato molekula nukleové kyseliny kóduje multimerní polypeptid schopný štěpení na jednotlivé kopie řečeného C-peptidu insulinu.

Z jiného pohledu lze tento aspekt vynálezu vnímat tak, že poskytuje molekulu nukleové kyseliny, jež obsahuje konkatemer nukleotidové sekvence, jež kóduje C-peptid insulinu.

Různé aspekty vynálezu vyložené výše (a níže) zahrnují provedení, ve kterých multimerní polypeptid (genový produkt) neobsahuje peptid insulinu A a insulinu B, nebo ve kterých molekula nukleové kyseliny nekóduje peptidy insulinu A a insulinu B. Obzvláště, v takových provedeních, ve kterých je počet kopií C-peptidu insulinu v multimerním polypeptidu, nebo kódovaných molekulou nukleové kyseliny roven dvěma, multimerní polypeptid nezahrnuje, nebo molekula nukleové kyseliny nekóduje peptidy insulinu A a B.

V obzvláště výhodném provedení vynálezu bude molekula nukleové kyseliny obsahovat navíc nukleotidovou sekvenci, jež kóduje partnera pro fúzi, který napomáhá v dalším zpracování kódovaného multimerního polypeptidu, například který je užitečný při purifikaci exprimovaného proteinového produktu. Gen kódující partnera pro fúzi bude ve správné pozici a orientaci, aby mohl být překládán společně s mnohočetnými kopiemi C-peptidu insulinu a vytvářel zpočátku jediný fúzovaný peptid. Vhodné proteiny pro fúzí jsou diskutovány shora.

Molekula nukleové kyseliny bude s výhodou rovněž obsahovat jednu nebo více nukleotidových sekvencí, jež kódují linkerové oblasti, jež obsahují štěpící místa, jak bylo diskutováno shora.

Jako ukázka molekul nukleových kyselin podle vynálezu tak mohou být uvedeny ty, které kódují polypeptid podle vozrce (I) • · • ·

H₂N - A - (C-X)n - COOH (I) kde

C je C-peptid insulinu;

A je vazba, nebo skupina F, kde F je partner pro fúzi, nebo skupina - (F-X) -;

X je linkerová oblast obsahující alespoň jedno štěpící místo, přičemž každé X je stejné nebo odlišné; a n je celé číslo od 2 do 50.

Tento aspekt vynálezu zahrnuje provedení, ve kterém vzorec (I) zahrnuje podmínku, že pro n=2 řečený polypeptid (I) neobsahuje řetězec insulinu A a B.

C-peptidy insulinu (skupina C), partneři pro fúzi (skupina F) a linkerové oblasti (skupina X) mohou být jak bylo definováno shora. Podobně n může být jak bylo definováno shora ve vztahu k termínům “mnohočetný“ a “multimerní“.

Molekula nukieové kyseliny nebo genetický konstrukt užitečný v použití podle vynálezu bude s výhodou obsahovat vhodné regulační sekvence, které budou regulovat expresi v hostitelské buňce. Takovéto regulační sekvence, kontrolující expresi, zahrnují například transkripční regulační elementy (např. promotor-operátorové oblasti, vazebná místa pro ribosom, terminační signály, enhancerové sekvence atd) a translační regulační elementy (např. iniciační a stop kodony), připojené v odpovídajícím čtecím rámci ke kódujícím sekvencím.

Použitelné jsou jakékoli vhodné hostitelské buňky, včetně prokaryotických a eukaryotických buněk a vybírají se podle zvoleného expresního systému, např. bakteriálního, kvasinkového, hmyzího ·-* 42 *-· · (např. na bázi bakuloviru) nebo savčího. V oboru je známo a v literatuře popsáno velmi mnoho různých expresních systémů. Jako hostitelské buňky pro produkci peptidů mohou být například použity E. coli, přičemž v tomto případě mohou regulační sekvence obsahovat například E. coli trp promotor. Mezi další vhodné hostitele patří Gramnegativní bakterie jiné než E. coli, Gram-pozitivní bakterie, kvasinky, hmyzí, rostlinné nebo živočišné buňky, např. geneticky manipulované buněčné linie.

Expresní vektory obsahující molekuly nukleové kyseliny popsané shora představují další aspekt vynálezu.

K dosažení exprese způsobem podle vynálezu lze použít libovolný výhodný vektor, z nichž velké množství je známo v oboru a popsáno v literatuře. Vhodné vektory tak zahrnují plasmidy, kosmidy nebo vektory odvozené z virů. Tyto vektory, které se vnášejí do hostitelských buněk k expresi, jsou však s výhodou plasmidové, fágové nebo virové vektory. Vektory mohou obsahovat vhodné regulační sekvence spojené v odpovídajícím čtecím rámci s molekulami nukleové kyseliny podle vynálezu. Další genetické elementy, např. replikony nebo sekvence ulehčující nebo napomáhající přenosu vektoru do hostitelské buňky, stabilizační funkce např. napomáhající udržení vektoru v hostitelské buňce, klonovací místa, štěpící místa restrikčních endonukleas nebo sekvence kódující markéry mohou být též zahrnuty pomocí technik dobře známých v oboru. Vektory mohou v hostitelské buňce přetrvávat jako samostatné entity anebo mohou být, jako je tomu v případě plasmidových inserčních vektorů nebo jiných inserčních vektorů, zabudovány do chromosomu hostitelské buňky. Do úvahy přichází náhodná nespecifická integrace do hostitelského chromosomu, avšak specifická homologní integrace je výhodnější. Techniky vhodné pro • · · 4 tento účel jsou známé v oboru (viz např. Pozzi et al. (1992) J. Res. Microbiol. 143, 449-457 a (1996) Gene 169, 85-90). Integrace je “homologní“, protože plasmidový inserční vektor obsahuje segment chromosomální DNA hostitelské buňky.

Ukázkové typické plasmidy vhodné k expresi genetických konstruktů nebo molekul nukleových kyselin podle vynálezu zahrnují pTrpBB (Óberg et al., supra) nebo jeho deriváty. Takovéto plasmidy mohou být případně, je-li to žádoucí, modifikovány, aby se odstranily sekvence kódující partnera pro fúzi. Lze použít jakýkoli vektor s vysokým počtem kopií, který obsahuje Trp-promotor nebo podobný.

K zavedení takovýchto vektorů za účelem exprese do prokaryotických nebo eukaryotických buněk lze použít řadu technik dobře známých v oboru, např. techniky bakteriální transformace, transfekci, elektroporaci. Transformované nebo transfekované eukaryotické nebo prokaryotické hostitelské buňky, tj. hostitelské buňky obsahující molekulu nukleové kyseliny podle vynálezu a jak definováno shora, představují další aspekt vynálezu.

Jak je podrobněji popsáno v Příkladech, expresní vektory, konkrétně plasmidy nesoucí molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu jsou výhodné v tom, že ve svých hostitelích vykazují genetickou stabilitu; posuzováno pomocí restrikčního mapování, nebyla v plasmidech připravených z buněčných kultur narostlých do vysokých hustot detegována žádná genetická nestabilita.

Další aspekt vynálezu poskytuje způsob produkce molekuly nukleové kyseliny, jež kóduje multimerní polypeptid obsahující mnohočetné kopie C-peptidu insulinu, kde exprimovaný multimerní polypeptid je schopen dát po štěpení vznik jednotlivým kopiím C-peptidu insulinu, přičemž řečený způsob zahrnuje vytvoření molekuly nukleové kyseliny, jež obsahuje mnohočetné kopie nukleotidové sekvence kódující C-peptid insulinu, spojené v odpovídajícím čtecím rámci.

V oboru je známa řada technik na vytvoření multimerních kopií genu nebo genového fragmentu, které mohou být použity v metodách podle vynálezu. Syntetické DNA fragmenty mohou být například polymerizovány způsobem hlava-k-ocasu, k čemuž se využijí, pro tento účel navržené, jednořetězcové nepalindromické přečnívající konce. Polymerizované DNA fragmenty pak mohou být přímo ligovány s odpovídajícími přečnívajícími konci, jež jsou výsledkem štěpení restrikčními enzymy (Ljungquist et al. (1989) Eur. J. Biochem. 186, 563-569). Další metody k dosažení mutimerizace genových fragmentů jsou založeny na použití restrikčních enzymů typu IÍS, jako jsou Bsp Ml (Stáhl et al. (1990) Gene 89, 187-193) nebo Bsm I (Haydn a Mandecki (1988) DNA 7, 571-577). Alternativní strategie využívají polymerizaci genového fragmentu a ligaci adapterových molekul obsahujících restrikční místa, která umožňují další subklonování (Aslund et al. (1987) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84, 1399-1403 a Irving et al. (1988) v Technological Advances in Vaccine Development, A.R. Liss lne., New York, str. 97-105). Metody využívající polymerasovou řetězovou reakci (PCR) pro de novo syntézu genů, jež by byly vhodné pro přípravu multimerních genových fragmentů jsou rovněž známy (Majumder (1992) Gene 110, 89-94 a Nguyen et al. (1994) v Advances in Biomagnetic Separation, Eaton Publishing Co., Natick, str. 73-78).

Ve výhodném provedení metody podle vynálezu se purifikované genové fragmenty (tj. nukleotidové sekvence kódující C-peptid insulinu) nechají polymerizovat způsobem hlava-k-ocasu (multimerizovat) prostřednictvím navržených nepalindromických • ·

-15·*· i • · ► · · « » · · « » · · I

I · · I • · · · přečnívajících konců a pak se ligují do plasmidu otevřeného restrikčním enzymem, s výhodou enzymem Sfi I.

V obzvláště výhodném provedení se plasmid obsahující nukleotidovou sekvenci (např. genový fragment) kódující C-peptid insulinu štěpí restrikčním enzymem a řečená sekvence nebo genový fragment se vyjmou a po multimerizaci sekvence nebo genového fragmentu se ligují zpět do štěpeného plasmidu. Kolonie transformantů se mohou výhodně analyzovat pomocí PCR techniky (Stahi et al. (1993) Biotechniques 14, 424-434), při které se io amplifikuje segment kódující jednu nebo více kopií C-peptidu insulinu. Velikost fragmentů amplifikovaných v PCR reakci se může porovnat pomocí elektroforesy v agarosovém gelu. V dalším výhodném provedení se genové fragmenty, kódující požadovaný počet konkatemerizovaných C-peptidů insulinu, např. tři nebo sedm, izolují a ligují do dalšího plasmidu, který byl štěpen stejným restrikčním enzymem, kterého bylo použito k vyštěpení fragmentu kódujícího C-peptid insulinu. Tento plasmid, který bude použit k transformaci hostitelských buněk, nejvýhodněji obsahuje vhodný promotor a sekvence kódující vhodného partnera pro fúzi s C-peptidem insulinu.

Další aspekty vynálezu zahrnují produkty shora zmíněných metod, a to multimer C-peptidu insulinu a jednotlivé C-peptidy uvolněné štěpením z tohoto multimeru.

Tento aspekt vynálezu poskytuje zejména multimerní polypeptid obsahující mnohočetné kopie C-peptidu insulinu, který je štěpitelný za vzniku jednotlivých kopií řečeného C-peptidu insulinu. Multimerní polypeptid může popřípadě obsahovat navíc partnera pro fúzi a/nebo linkerové oblasti, obsahující štěpící místo, jež lemují každý řečený monomer C-peptidu.

• · • · ···· · · · · * · · • · ···· · ♦ · · • · ·· ······· ·· · • · 4 £ · · ···· ···· ···>(□·· · ·· ··

Rovněž je poskytován způsob produkce multimerního polypeptidu obsahujícího mnohočetné kopie C-peptidu insulinu, který je štěpitelný na jednotlivé kopie řečeného C-peptidu insulinu, přičemž tento způsob zahrnuje kultivaci hostitelské buňky, jež obsahuje molekulu nukleové kyseliny kódující uvedený multimerní polypeptid, za podmínek kdy je řečený multimerní polypeptid exprimován, a získání exprimovaného multimerního polypeptidu.

Hostitelské buňky se mohou kultivovat technikami známými v oboru, např. vsádkově nebo kontinuálním způsobem.

Multimerní genový produkt nebo polypetid se může získat z kultury hostitelských buněk standardními technikami, jež jsou dobře známé v oboru, např. standardními technikami lýzy buněk a purifikace proteinů. Jak bylo zmíněno shora, je-li v multimerním polypeptidu zahrnut partner pro fúzi, lze dosáhnout snadné purifikace na základě afinitní vazby tohoto partnera.

V oboru je známa řada technik na izolaci proteinů nebo polypeptidů z buněk nebo z kultivačního média, přirozených i rekombinantně exprimovaných, a lze použít kteroukoli z nich. Buněčná lýza k uvolnění intraceluiárních proteinů/polypeptidů se může provést kteroukoli z mnoha metod známých v oboru a popsaných v literatuře, a je-li to nutné, lze použít další purifikační kroky, opět na základě technik známých v oboru, v závislosti na tom, zda se použily vsádkové nebo kontinuální kultivační metody.

V případě multimerních polypeptidů C-peptidu insulinu podle vynálezu se jako obzvláště účinné ukázaly metody lýzy buněk a získání polypeptidů tepelným působením, například způsob popsaný v W090/00200 a jeho modifikace. Takovéto metody zahrnují zahřívání kultivačního média s hostitelskými buňkami např. na teplotu 50-100°C po určitou dobu, zpravidla nepřesahující 1 hodinu, přičemž se • · • · · · · · ···· · · · · • · · · · · · • · ·· ······· • · ή 7 · · · exprimovaný polypeptid uvolní do média, s výhodou v podstatě v čisté formě. Předpokládá se, že k tomu dochází v důsledku selektivního uvolňování exprimovaného polypeptidu. Bylo pozorováno, že tato metoda dobře funguje v případě solubilních polypeptidových produktů, jež jsou stálé vůči tepelnému působení, ať jde o produkty rekombinantní nebo nikoli (metoda tak může mít obecnou použitelnost), ale speciálně se osvědčila v případě multimerních polypeptidů C-peptidu insulinu podle vynálezu, kde lze získat překvapivě vysoké výtěžky produktu ve vysoké čistotě. Takovéto tepelné působení se tak například může uskutečnit zahříváním na 80100°C, např. 85-99°C nebo 90-95°C, po dobu 5-20 minut, např. 8-10 minut, a následným ochlazením, např. na teplotu 0-4°C nebo ochlazením na ledu.

Po izolaci multimerního polypeptidu může být tento štěpen, aby se uvolnily jednotlivé monomery C-peptidu insulinu. Další aspekt vynálezu tedy poskytuje způsob produkce C-peptidu insulinu, přičemž tento způsob zahrnuje štěpení multimerního polypeptidu jak definováno shora, aby se uvolnily jednotlivé kopie řečeného Cpeptidu insulinu.

Po štěpení multimerního polypeptidu, aby se uvolnily jednotlivé monomery C-peptidu jak bylo diskutováno shora, mohou být tyto také dále purifikovány, např. do homogenity (např. podle SDS-PAGE) pomocí dobře známých standardních purifikačních technik, jako např. ultrafiltrace, gelová filtrace, vyčeření, chromatografie na reversní fázi atd.

Dalším aspektem vynálezu je terapeutické použití štěpených peptidových produktů získaných shora popsanými metodami. Štěpený C-peptid insulinu může být využit při léčbě diabetů l.typu a/nebo komplikací provázejících diabetes. Do rozsahu vynálezu proto rovněž

- 18«·’ spadá i způsob léčby diabetů l.typu nebo jeho komplikací, který zahrnuje podávání C-peptidu insulinu, připraveného kteroukoli z metod shora popsaných.

Vynález bude nyní podrobněji popsán prostřednictvím neomezujících Příkladů a s odkazem na následující obrázky.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 - schematicky znázorňuje konstrukci rekombinantních plasmidů podle vynálezu, včetně multimerizace genového fragmentu kódujícího C-peptid.

Obrázek 2A a B - schematicky znázorňují dva genové produkty, BB-C3 (A) a BB-C7 (B). Pomocí jednopísmenového kódu jsou označeny linkerové oblasti, které ohraničují C-peptid. Argininové zbytky (vytištěny tučně) lemují každý C-peptid.

Obrázek 2C - znázorňuje aminokyselinovou sekvenci C-peptidu v jednopísmenovém kódu (SEQ ID NO; 1).

Obrázek 3 - je kopií fotografie SDS-PAGE (10-15%) gelu za redukujících podmínek a ukazuje fúzovaný protein BB-C3 (dráha 1) a fúzovaný protein BB-C7 (dráha 2) po afinitní purifikaci na HSASepharose. Standardy molekulových hmotností, 94, 67, 43, 30, 20 a 14 kDa, jsou v dráze M.

Obrázek 4A - je kopií fotografie SDS-PAGE (10-15%) gelu za redukujících podmínek a ukazuje BB-C3 po inkubaci s trypsinem a karboxypeptidasou Β. V dráze 1 jsou neštěpené fúzované proteiny, v dráze 2 jsou proteinové digesty po 5 minutách působení trypsinu a karboxypeptidasy Β. V dráze M jsou standardy molekulových hmotností 94, 67, 43, 30, 20 a 14 kDa.

• · • · ΊΠ · * ···· ···· · · ·- I ·> · ·· ··

Obrázek 4Β - je stejný jako Obrázek 4A s tím, že se týká fúzovaného produktu BB-C7.

Obrázek 5 - znázorňuje analytické dělení produktů štěpení ekvimolárních množství BB-C7 (nahoře) a BB-C3 (uprostřed) trypsinem a karboxypeptidasou B v chromatografii na reversní fázi (RPC). Jako kontrola (dole) byl použit C-peptid insulinu (Sigma).

Obrázek 6 - ukazuje superponované chromatogramy gelové filtrace (Superdex Peptide, Pharmacia Biotech, Uppsala, Švédsko) fúzovaného produktu BB-C7 štěpeného po vyznačenou dobu trypsinem (hmotnostní poměr 5000:1) a karboxypeptidasou B (hmotnostní poměr 2000:1).

Obrázek 7 - znázorňuje analýzu C-peptidu insulinu pocházejícího z BB-C7 (A) ve srovnání se standardy C-peptidu insulinu od Eli Lilly (B) nebo Sigmy (C) v chromatografii na reversní fázi.

Obrázek 8 - znázorňuje aminokyselinovou sekvenci (v jednopísmenovém kódu) peptidového produktu obsahujícího partnera pro fúzi BB, a sedm kopií C-peptidu insulinu (SEQ ID NO: 5).

Obrázek 9 - ukazuje SDS-PAGE (10-15%) analýzu syntetizovaných fúzovaných proteinů BB-C1 (dráha 1), BB-C3 (dráha 2) a BB-C7 (dráha 3) po afinitní purifikaci na HSA-Sepharose. Velikosti standardů molekulových hmotností jsou vyznačeny v kDa.

Obrázek 10 - znázorňuje RPC (chromatografie na reversní fázi) analýzu produktů štěpení ekvimolárních množství BB-C1, respektive BB-C3, respektive BB-C7, trypsinem + karboxypeptidasou B. Jako kontrola (viz dole) byl použit komerčně dostupný standard C-peptidu (Sigma).

- 20..·

Obrázek 11 - ukazuje elektroforetickou analýzu (v agarosovém gelu, 1%) Kpnl-Pstl štěpů preparátů plasmidu pTrpBB-C7 získaných z E. coli kultivovaných 0 (dráhal), 7 (dráha 2), 27 (dráha 3) nebo 31 hodin (dráha 4). V dráze 5 je ukázán Kpnl-Pstl digest původního pTrpBB-C7 plasmidu použitého k transformaci E. coli buněk, a v dráze 6 je neštěpený pTrpBB-C7 po 31 hodinách kultivace. V drahách M (standardy velikosti) je DNA fága lambda štěpená Pstl. Šipka označuje pozici C7 fragmentu.

Obrázek 12 - znázorňuje SDS-PAGE analýzu (za redukujících io podmínek) vzorků z kultivace BB-C7. Dráha 1: 2μ( kultivačního média. Dráha 2: 0,5 μΙ sonikované kultury. Dráha 3: 0,5 μΙ média po tepelném zpracování kultury. Šipka označuje pozici BB-C7 fúzovaného proteinu. V dráze M jsou standardy molekulových hmotností 94, 67, 43, 30, 20 a 14 kDa.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1 - Konstrukce rekombinantní DNA

Čtyři syntetické oligonukleotidy Jope 10 (5'-CGGCCTCCCA GGCCCGCGAA GCTGAGGACC TGCAAGTTGG TCAGGTTGAA

CTGGGCGGTG GCCCGGGTGC AGGC-3') (SEQ ID NO; 6), Jope 11 (5'-TCTTTGCAGC CGCTGGCTTT AGAAGGTTCT CTTCAGCGTA CGGCCTCCCA GGCCGTCGAC TAACTGCA-3') (SEQ ID NO: 7), Jope 12 (3'-CATGGCCGGA GGGTCCGGGC GCTTCGACTC

CTGGACGTTC AACCAGTCCA ACTTGACCCG CCACCGGG-5') (SEQ

ID NO: 8) a Jope 13 (3'-CCCACGTCCG AGAAACGTCG

GCGACCGAAA TCTTCCAAGA GAAGTCGCAT GCCGGAGGGT CCGGCAGCTG ATTG-5') (SEQ ID NO: 9) byly fosforylovány a páry Jope 10:Jope 12 a Jope 11:Jope 13 ponechány hybridizovat inkubací ·· · ··· ·· · · ••«a « · * *«·· • · ···· · · · · • · · · ······· ·· · • · · ♦ · ·· · ···· ··»- 2Ί ·-· ♦ ·· ·· při 70°C 10 min s následným ochlazením k pokojové teplotě. Dva takto vytvořené linkery byly smíchány a ligovány do plasmidu pUC18 (Yanish-Perron et al., 1985, Gene 33, 103-106) otevřeného štěpením restrikčními enzymy Κρη I -Pst I (Obr. 1) a ligační směsí byly transformovány buňky dcm' kmene Escherichia coli GM31 (Marinus, 1973, Mol. Gen. Genet. 127, 47-55). Transformant (pUC-C1) obsahující správnou nukleotidovou sekvenci v zaklonovaném genovém fragmentu kódujícím C-peptid insulinu byl identifikován pomocí techniky DNA sekvenace na pevné fázi využívající PCR (Hultman et al. io (1989) Nucl. Acids Res. 17, 4937-4946). Z pUC-C1 byla připravena plasmidová DNA a po štěpení enzymem Sfi I byly oba fragmenty, vyštěpený fragment kódující C-peptid insulinu i vektorová část, purifikovány s použitím soupravy Mermaid (“glass-milk“) (BIO 101 lne., CA, USA) respektive soupravy GeneClean (BIO 101 lne., CA, USA).

Purifikované genové fragmenty C-peptidu insulinu byly polymerizovány způsobem hlava-k-ocasu prostřednictvím navržených nepalindromických přečnívajících konců a poté byly ligovány zpět do purifikovaného Sfi I otevřeného vektoru. Ligační směsí byly transformovány buňky E. coli RRIAM15 (Ruther (1982) Nucl. Acids Res. 10, 5765-5772) a výsledné transformanty byly analyzovány s použitím adaptované PCR techniky (Stáhl et al. (1993) supra). Ve stručnosti, jednotlivé kolonie byly odebrány do PCR mikrozkumavek obsahujících 50 μΙ PCR reakční směsi (20 mM TAPS, pH 9,3 při 20°C,

2 mM MgCI₂, 50 mM KCI, 0,1% Tween-20, 0,2 mM dNTP, po 6 pmolech obou primerů (RIT27: 5'-GCTTCCGGCTCGTATGTGTG-3' (SEQ ID NO: 10) a RIT28: 5'-AAAGGGGGATGTGCTGCAAG GCG-3' (SEQ ID NO: 11) a 1,0 jednotku Taq polymerasy). Oba PCR primery RIT27 a RIT28 mají hybridizační místa v pUC18 a ohraničují místo, do • · kterého jsou vneseny fragmenty C-peptidu insulinu. PCR amplifikované fragmenty z klonů obsahujících různý počet vnesených oligonukleotidů byly navzájem porovnány (oproti pUC18) s použitím elektroforesy v agarosovém gelu a takto byly identifikovány transformanty nesoucí jeden až sedm insertů. Výsledné plasmidy byly označeny pUC-C1, pUC-C2 atd.

Z preparátů plasmidů byly pomocí enzymů Κρη I - Pst I vyštěpeny genové fragmenty obsahující požadovaný počet insertů. Fragmenty kódující jeden, tři nebo sedm konkatemerizovaných C-peptidů insulinu byly izolovány a ligovány do podobně štěpeného pTrpBBT1T2 a výsledné plasmidy byly označeny pTrpBB-C1, respektive pTrpBB-C3, respektive pTrpBB-C7. Plasmid pTrpBBT1T2 byl konstruován z plasmidu pTrpBB (Óberg et al. (1994) v Proč. 6^th Eur. Congress

Biotechnol., Elsevier Science B.V., str. 179-182) vnesením sekvence terminátoru transkripce odvozené z plasmidu pKK223-3 (Pharmacia Biotech, Uppsala, Švédsko). Sekvence terminátoru transkripce byla získána z pKK223-3 s použitím standardního protokolu PCR amplifikace (Hultman et al. (1989) supra} a oligonukleotidů HEAN-19,

5'-CCCCCTGCAGCTCGAGCGCCTTTA ACCTGTTTTGGCGGATG-3' (SEQ ID NO: 12) a HEAN-20, 5'-CCCCAAGCTTAGAGTTTGTAG AAACGC-3' (SEQ ID NO: 13).

Restrikční místa zavedená PCR reakcí byla štěpena Pst I a Hind III 25 a fragment byl vnesen do pTrpBB štěpeného stejnými enzymy.

Výsledný expresní vektor kóduje afinitní “držák“ sestávající z vedoucí sekvence osmi aminokyselin odvozené z trp operonu a z BB oblasti vázající serumalbumin (25 kDa) (Nygren et al. (1988) supra) odvozené • ·

- 23—* ze streptokokového proteinu G. Transkripce je regulována E. coli trp promotorem. Plasmid dále nese gen pro resistenci vůči kanamycinu.

Příklad 2 - Exprese a purifikace proteinu

Buňky E. coli nesoucí pTrpBB-C3, respektive pTrpBB-C7 a tedy kódující fúzované proteiny BB-C3 nebo BB-C7 byly pěstovány přes noc při 37°C na třepačce v baňkách, obsahujících 10 ml Tryptického sojového bujónu (Difco, USA) (30 g/l) s přídavkem kvasničného extraktu (Difco) (5 g/l) a kanamycin monosuifátu (50 mg/ml). Kultury io narostlé přes noc byly 10x zředěny a 100 ml této zředěné kultury bylo pěstováno na třepačce v baňkách s narážkou ve stejném médiu při 37°C. Genová exprese byla indukována ve střední logaritmické fázi (A₆oo = 1) přídavkem β-indolakrylové kyseliny do koncentrace 25 mg/l. Buňky se 20 hodin po indukci sklidily centrifugací 10 min při zhruba 6000 g. Buňky byly resuspendovány v 1/20 objemu kultury v TST (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 200 mM NaCl, 0,05% Tween 20, 1 mM EDTA), lyžovány sonikací a centrifugovány při zhruba 40,000 g. Vzorky pro sonikací se připravily centrifugací kultury a resuspendováním buněk v 30 ml studeného TST pufru. Vzorky se

2o během 2-minutových sonikačních pulsů držely na ledu, sonikace se prováděla na přístroji Vibra Cell (500W) firmy Sonics and Materials lne. (Danbury, Connecticut, USA) s použitím 13 mm standardního kónického nástavce, 70% provozního cyklu (20 kHz) a s výkonem nastaveným na hodnotu 6,5. Supernatanty obsahující solubilní proteiny byly zfiltrovány (0,45 μιη) a zředěny do 100 ml pufrem TST. Rozpustné fúzované proteiny byly izolovány afinitní chromatografií na HSA-Sepharose (lidský serumalbumin) (Nygren et al. (1988) supra) jak popsal Stáhl et al. (1989) J. Immunol. Meth. 124, 43-52. V eluovaných • 4

4·· ·

- 24. e’ frakcích byl stanoven obsah proteinu absorbancí při 280 nm a relevantní frakce byly lyofilizovány.

Na Obrázku 3 jsou ukázány afinitně purifikované proteiny BB-C3, respektive BB-C7, po jednom purifikačním kroku na HSA-Sepharose. U obou fúzovaných proteinů převládaly produkty plné délky, jejichž elektroforetická pohyblivost odpovídala jejich molekulovým hmotnostem, 39,1 respektive 54,2 kDa. Hladina exprese při kultivacích v protřepávaných baňkách byla pro oba fúzované proteiny téměř io identická: 130 mg/l pro BB-C3 a 120 mg/l pro BB-C7.

Příklad 3 - Proteolytické štěpení fúzovaných proteinů

Trypsin, který štěpí za bazickými aminokyselinovými zbytky (tzn. C-koncově vůči nim), se používá již dlouhou dobu ke štěpení fúzovaných proteinů. Navzdory očekáváné nízké specifitě se ukázalo, že trypsin je použitelný k specifickému štěpení fúzovaných proteinů, neboť bazické zbytky uvnitř složených proteinových domén ponechává bez štěpení (Wang et al. (1989) J. Biol. Chem. 264, 21116-21121). Trypsin má další výhodu v tom, že je levný a snadno dostupný. Zde byl trypsin použit v kombinaci s karboxypeptidasou B na zpracování fúzovaných BB-C3 resp. BB-C7 s cílem získat nativní lidský C-peptid insulinu. Trypsin tedy bude štěpit fúzované proteiny C-koncově za každým argininovým zbytkem a karboxypeptidasa B pak odstraní Ckoncový arginin přítomný na každém monomeru C-peptidu insulinu po štěpení trypsinem.

Abychom analyzovali účinnost štěpení, oba fúzované proteiny, BB-C3 a BB-C7, byly inkubovány s trypsinem a karboxypeptidasou B po • · • · · ·

různě dlouhou dobu a pak analyzovány pomocí SDS-PAGE. Bylo zjištěno, že oba fúzované proteiny byly opracovány rychle a po 5 minutách štěpení již v SDS-PAGE nebyl vidět žádný fúzovaný protein (Obr. 4A a B).

Vedle této analýzy bylo provedeno i srovnání relativních výtěžků monomeru C-peptidu insulinu po štěpení fúzovaných proteinů BB-C3, resp. BB-C7. Směsi po působení trypsinu a karboxypeptidasy B na ekvimolární množství BB-C3, resp. BB-C7 byly analyzovány HPLC chromatografií na reversní fázi (250 mm, Kromasil C8 kolona, vnitřní io průměr 4,6 mm, velikost částic 7 μιτι, Hewlett Packard 1090). K eluci byl použit 10-40% gradient acetonitrilu v 0,1% trifluoroctové kyselině během 30 min při 40°C. Jak ukazuje Obr. 5, štěpením fúzovaného proteinu BB-C7 byl dosažen podstatně vyšší poměr produktu C-peptidu insulinu (eluční čas ca. 25,4 min) vůči ostatním štěpným produktům (pocházejícím z BB části) ve srovnání se štěpením fúzovaného proteinu BB-C3. Integrace ploch vrcholů odpovídajících C-peptidu insulinu (C7:C3) dala poměr ploch vrcholů 2,43, což je hodnota blízká teoretické hodnotě 2.33.

Z uvedeného však neplyne žádná informace o úplnosti zpracování fúzovaných proteinů. Ke zjištění, kdy dosáhne působení trypsinem a karboxypeptidasou B úplnosti, byla provedena časová závislost enzymatického štěpení fúzovaného proteinu BB-C7. Lyofilizovaný fúzovaný protein BB-C7 byl rozpuštěn do výsledné koncentrace proteinu 1 mg/ml v 100 mM fosfátovém pufru pH 7,5, obsahujícím 0,1% (vol/vol) Tween 20. Trypsin (T-2395, Sigma, St. Louis, MO, USA) a karboxypeptidasa B (Boehringer Mannheim) byly přidány do výsledného hmotnostního poměru trypsin/fúzovaný protein 1/5000 a karboxypeptidasa B/fúzovaný protein 1/2000. Po 15, 30, 60 a 120 •« · • « · • · * · < · · · · · «

26-’ :

minutách byly ze štěpící směsi odebrány vzorky a štěpení v nich bylo zastaveno snížením pH na hodnotu 3 přídavkem kyseliny octové. Ke stabilizaci štěpných produktů byl přidán acetonitril do 20% (vol/vol) koncentrace.

Materiál po štěpení byl chromatograficky analyzován gelovou filtrací (Superdex Peptide Column, systém SMART™, Pharmacia Biotech, Uppsala, Švédsko) a chromatogramy byly superponovány (Obr.6). Z analýzy vyplynulo, že BB-C7 byl za těchto podmínek opracován do úplnosti po 60 minutách, neboť prodloužením inkubační doby nebyl již získán žádný další C-peptid insulinu. Tyto výsledky též naznačují, že z fúzovaných proteinů obsahujících multimerní formy C-peptidu insulinu by bylo možné získat kvantitativní výtěžky C-peptidu insulinu.

Příklad 4 - Charakterizace získaného C-peptidu insulinu:

Chromatografie na reversní fázi (RPC) a hmotová spektroskopie

K potvrzení, že získaný peptid skutečně odpovídá nativnímu lidskému C-peptidu insulinu byly provedeny dvě různé analýzy. V první byla použita chromatgrafie na reversní fázi (RPC) pro srovnání RPC-purifikovaného C-peptidu insulinu, získaného štěpením BB-C7, se standardy C-peptidu insulinu, přičemž jako standardy byly použity C-peptid získaný od Eli Lilly (CA, USA) a komerčně dostupný Cpeptid insulinu, fragment 3-33 (Sigma, USA). Preparáty C-peptidu • · ···· ·««· • · · · ······· * · · • · 0 7 · * ··«· ···· ····//·· · ·· ·· insulinu byly analyzovány pomocí RPC na koloně Sephasil C8 5qm SC2, 1/10 s použitím systému SMART™ (Pharmacia Biotech, Uppsala, Švédsko). K eluci byl použit 26-36% gradient acetonitrilu v 0,1% (vol/vol) trifluoroctové kyselině během 20 min při 25°C. Průtok byl 100 μΙ/min a absorbance byla měřena při 214 nm. Z analýzy vyplynulo, že všechny tři preparáty byly téměř identické, měly stejné retenční časy a stejný nízký obsah nečistot (Obr. 7). V druhé analýze byi C-peptid insulinu získaný z BB-C7 podroben hmotové spektroskopii (Tabulka 1) na JEOL SX102 hmotovém spektrometru (JEOL, Japonsko), w vybaveném elektrosprejem. Dobrý souhlas v hmotnostech (Tabulka 1), společně s pozorovanou podobností se standardy C-peptidu insulinu ve srovnávací RPC analýze naznačuje, že rekombinantním postupem byl připraven nativní lidský C-peptid insulinu.

Tabulka 1. Molekulové hmotnosti C-peptidu insulinu (Da)

Vypočtená 3020,3

Experimentální 3019,7 ±1,8

Příklad 5 - Charakterizace získaného monomeru C-peptidu insulinu: Radioimunoanalýza (RIA)

2o Monomer C-peptidu insulinu získaný štěpením fúzovaného proteinu BB-C7 byl analyzován s použitím komerčně dostupné soupravy pro radioimunostanovení, vyvinuté pro monitorování hladin lidského C-peptidu insulinu např. v krvi a moči (Euro-Diagnostica, Malmó, Švédsko; č. kat. MD 315). Pro srovnání byl rovněž analyzován preparát C-peptidu insulinu (Eli-Lilly Co., Indianapolis, Ind, USA), r 28, jehož biologická aktivita byla již dříve prokázána (Johansson et al. (1992) Diabetologia 35, 1151-1158). Vzorky pro analýzu byly připraveny odvážením obou preparátů C-peptidu a následným naředěním do konečné koncentrace 3,31, resp. 3,30 nmolů/l v roztoku

0,05 M Na-fosfátový pufr, pH 7,4, 5% lidský serumalbumin (HSA) a

0,02% Thimerosal. Ve stručnosti, souprava obsahuje králičí antisérum proti lidskému C-peptidu, ¹²⁵l-značený lidský C-peptid insulinu jako tracer, jako sekundární protilátku kozí antisérum proti králičímu Ig v prostředí PEG, standardy lidského C-peptidu insulinu a kontrolní w vzorky pro sestrojení kalibrační křivky pro kvantifikaci C-peptidu insulinu v testovaných vzorcích. Výsledky analýzy dvou vzorků jsou shrnuty v Tabulce 2 níže. Výsledky ukazují, že v RIA jsou tyto dva preparáty shodně rozpoznávány a kvantifikovány.

Tabulka 2. Srovnávací RIA analýza C-peptidu insulinu s prokázanou biologickou aktivitou a C-peptidu insulinu získaného štěpením rekombinantního fúzovaného proteinu BB-C7.

vzorek očekávaná koncentrace stanovená koncentrace (nM) (nM)

C-peptid insulinu (štěp. 3,31 2,34 (71%) fúz. proteinu BB-C7)

C-peptid insulinu (z Eli-Lilly)

3,30

2,41 (73%) ··· *·-·29 • · · · • · · · • · · · • · · · • · · ·

Příklad 6 - Exprese, purifikace a proteolytické štěpení fúzovaných proteinů BB-C1, BB-C3 a BB-C7

Tento Příklad uvádí další srovnávací výsledky k pokusům uvedeným v Příkladech 2 a 3, které se týkají fúzovaného proteinu BB-C1.

Buňky E. coli nesoucí plasmidy pTrp BB-C1 nebo pTrp BB-C3 nebo pTrp BB-C7 (viz Příklad 1) byly pěstovány, a fúzované proteiny exprimovány, izolovány, purifikovány a analyzovány jak bylo popsáno v Příkladu 2.

Analýza buněk E. co//'transformovaných pTrp BB-C1 nebo pTrp BB-C3 nebo pTrp BB-C7 ukázala, že kódované fúzované proteiny, BB-C1, BB-C3 a BB-C7 se akumulovaly intracelulárně jako solubilní genové produkty (data neukázána). Po rozbití buněk byly fúzované proteiny účinně purifikovány HSA-afinitní chromatografií. Obr. 9 ukazuje afinitně purifikované fúzované proteiny BB-C1, BB-C3 a BB-C7 po jednom purifikačním kroku na HSA-Sepharose. U všech tří fúzovaných proteinů převládaly produkty plné délky, jejichž elektroforetická pohyblivost byla v souladu s jejich molekulovými hmotnostmi: 31,5,

39,1 a 54,2 kDa. Hladiny exprese byly reprodukovatelné a podobné u všech tří různých fúzovaných proteinů, a to v rozsahu 40-60 mg/l.

K ověření účinnosti proteolytického zpracování těchto tří afinitně purifikovaných fúzovaných proteinů, byly BB-C1, BB-C3 a BB-C7 inkubovány s trypsinem a karboxypeptidasou B pro různě dlouhou dobu a pak podrobeny SDS-PAGE analýze. Všechny tři fúzované proteiny byly opracovány rychle, a po 5 minutách proteolytického působení nebyl v SDS-PAGE detegován již žádný fúzovaný protein plné délky (data neukázána).

Účinnost proteolytického štěpení byla dále analyzována jak bylo popsáno v Příkladu 3 a bylo zjištěno, že BB-C7 byl rozštěpen do úplnosti po 60 minutách.

K adekvátnějšímu srovnání relativních výtěžků monomerů C-peptidu po štěpení fúzovaných proteinů BB-C1, BB-C3 a BB-C7 byla provedena HPLC analýza na reversní fázi (jak bylo popsáno v Příkladu

3). Analyzovány byly štěpené směsi po 120 min působení trypsinu + karboxypeptidasy B na přibližně ekvimolární množství BB-C1, BB-C3 nebo BB-C7 (byla monitorována A220)· Výsledky (Obr. 10) prokázaly podstatně vyšší poměr C-peptidu k ostatním štěpným produktům v případě BB-C7 a BB-C3 fúzovaných proteinů, ve srovnání se štěpením BB-C1 fúzovaného proteinu. Na RPC kolonu byla nanesena přibližně ekvimolární množství od každého fúzovaného proteinu, což je patrné ze stejných výšek vrcholů odpovídajících tryptickému štěpení BB části fúzovaných proteinů, jež jsou vidět ve všech třech chromatogramech (Obr. 10). Integrace ploch vrcholů odpovídajících Cpeptidu (940, 2324 a 5647 jednotek absorbance x s x 10'³ pro BB-C1, resp. BB-C3, resp. BB-C7) poskytla poměr 2,5 pro C3:C1 a 6,0 pro C7:C1, což jsou výsledky blízké teoretickým hodnotám 3, resp. 7.

Výsledky dále ukazují lepší výtěžek monomerů C-peptidu insulinu z multimerů C-peptidu insulinu (C3, C7) ve srovnání s monomerním fúzovaným proteinem (C1).

• 4 • 4 « 4 4 · • 4 4 4 · 4 4 • · 4 4 · 4 • · 4* 4 4 4 4 * · _Λ .· 4 * • · · ♦ ··^ β ί «.♦ · ·· 4 4

Příklad 7 - Sledování genetické stability plasmidu pTrpBB-C7 kódujícího fúzovaný protein BB-C7

Tento Příklad popisuje jak se určovala genetická stabilita plasmidu pTrpBB-C7 kódujícího fúzovaný protein BB-C7. Buňky E. coli nesoucí plasmid pTrpBB-C7 byly pěstovány po různě dlouhou dobu a po 0, 7, 27 a 31 hodinách kultivace byly odebírány vzorky. 31 hodin by odpovídalo kultivační době při výrobě BB-C7 fermentací ve velkém měřítku. Ze vzorků byly podle standardních postupů (Sambrook et al., A Laboratory Manual, 2.vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) získány plasmidy a z nich se restričkními enzymy Κρη I a Pst I vyštěpil fragment kódující C7 konkatemer (viz Obr. 1). Jako kontrola sloužil původní plasmid pTrpBB-C7, použitý k transformaci buněk E. coli, který byl rovněž podroben štěpení Κρη I a Pst I. Jak je vidět z Obr. 11, vyštěpený fragment má stejnou velikost u všech vzorků, což dokládá, že plasmid pTrpBB-C7 zůstává geneticky stabilní i při déle trvajících kultivacích.

Příklad 8 - Tepelné působení vede k selektivnímu uvolnění BBC7 do kultivačního média

Příklad popisuje jak lze tepelným působením dosáhnout uvolnění fúzovaného proteinu BB-C7 do kultivačního média a tím výrazně zvýšit čistotu výchozího materiálu pro další purifikaci BB-C7. Ve srovnání s nejrozšířenějším postupem izolace rekombinantních proteinů produkovaných intraceiulárně v E. coli (yčetrtě jednotlivých operací sestávajících z centrifugace, resuspendování buněčné pelety ve vhodném pufru a rozbití buněk homogenizací při vysokém tlaku) má postup spočívající v uvolnění genového produktu účinkem tepelného působení mnoho výhod: (i) výrobní postup zahrnující tepelné působení má o jeden centrifugační krok méně, (ii) stabilita genového produktu se zvyšuje, neboť dochází k tepelné denaturaci hostitelských proteas, (iii) precipitací ostatních E. coli proteinů se dosahuje významné počáteční purifikace genového produktu, a (iv) je sníženo uvolnění nukleových kyselin ve srovnání s postupy zahrnujícími rozbití buněk. Postup by mohl být vhodný také pro uvolnění jiných intracelulárně exprimovaných rekombinantních proteinů, které zůstávají solubilní i při vysokých hladinách exprese a jsou stálé vůči tepelnému působení potřebnému k uvolnění proteinu.

Buňky E. coli nesoucí plasmid pTrpBB-C7, který kóduje BB-C7, byly pěstovány jak je popsáno v Příkladu 2. Namísto rozbití buněk sonikací (Příklad 2), lze využít tepelného působení k docílení selektivního a účinného uvolnění BB-C7 do kultivačního média. Po ukončení kultivace byla baňka s kulturou ponořena na 8-10 minut do vroucí vodní lázně. Po této době kultura dosáhla teplotu přibližně 90°C. Baňka pak byla umístěna do ledu. Z Obr. 12 (dráha 3) je patrné, že tepelným působením byl fúzovaný protein BB-C7 uvolněn do kultivačního média, aniž by se uvolnilo podstatné množství hostitelských proteinů. Ty jsou tímto půsbením pravděpodobně zcela denaturovány. Naproti tomu sonikace (Obr. 12, dráha 2) a jiné mechanické způsoby desintegrace buněk vedou k uvolnění všech hostitelských proteinů, jakož i nukleových kyselin, což způsobuje, že výchozí materiál pro další purifikaci BB-C7 proteinu je velice heterogenní. Za normálních okolností je buňkami E. coli secernováno do média velmi málo proteinu (Obr. 12, dráha 1). BB-C7 byl stálý vůči tepelnému působení a mohl být dále purifikován a dále zpracován na monomery C-peptidu, jak je popsáno v Příkladech 1-3.

4«

* · ♦ · • · · « • * * 4 • · · · · • » · 4

SEZNAM SEKVENCÍ (1) OBECNÉ INFORMACE:

(i) PŘIHLAŠOVATEL:

(A) JMÉNO: Creative Peptides Sweden AB (B) ULICE: Dahlbergsstigen 6 (C) MĚSTO: Djursholm (E) ZEMĚ: Švédsko (F) PSČ (ZIP): S-182 64 (i) PŘIHLAŠOVATEL:

(A) JMÉNO: Stefan Stáhl (B) ULICE: c/o Royal Institute of Technology (C) MĚSTO: Stockholm (E) ZEMĚ: Švédsko (F) PSČ (ZIP): S-100 44 (i) PŘIHLAŠOVATEL:

(A) JMÉNO: Mathias Uhlen (B) ULICE: c/o Royal Institute of Technology (C) MĚSTO: Stockholm (E) ZEMĚ: Švédsko (F) PSČ (ZIP): S-100 44 (i) PŘIHLAŠOVATEL:

(A) JMÉNO: Per-Ake Nygren (B) ULICE: e/o Royal Institute of Technology (C) MĚSTO: Stockholm (E) ZEMĚ: Švédsko (F) PSČ (ZIP): S-100 44 (i) PŘIHLAŠOVATEL:

(A) JMÉNO: Per Jonasson (B) ULICE: c/o Royal Institute of Technology (C) MĚSTO: Stockholm (E) ZEMĚ: Švédsko • a a aa • · · · · • « · · • · · · «

(F) PSČ (ZIP): S-100 44 (ii) NÁZEV VYNÁLEZU: Rekombinantní exprese C-peptidu insulinu (iii) POČET SEKVENCÍ: 14 (iv) POČÍTAČOVÝ FORMÁT:

(A) TYP MÉDIA: Floppy disk (B) POČÍTAČ: IBM PC compatible(C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOSZMS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (EPO) (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 31 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) TYP ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 1:

Glu Ala Glu Asp Leu Gin Val Gly Gin Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 15 10 15

Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin 20 25 30 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 7 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová • · • · ·· ·· • · · · • · · * * · * · · » · · » · a a · ♦· (C) TYP ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 2:

Arg Thr Ala Ser Gin Ala Arg 1 5 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 5 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) TYP ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 3:

Ala Ser Gin Ala Arg 1 5 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 8 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) TYP ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární • · • · • ·

- 36 • · · · • · · · · • · · · • · · · (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 4:

Arg Thr Ala Ser Gin Ala Val Asp 1 5 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 521 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) TYP ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 5:

Met Lys Ala Ile Phe Val Leu Asn Ala Gin His Asp Glu Ala Val Asp 15 10 15

Ala Asn Phe Asp Gin Phe Asn Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys 20 25 30

Asn Leu Xle Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Asp Leu Gin 35 40 45

Ala Gin Val Val Glu Ser Ala Lys Lys Ala Arg Ile Ser Glu Ala Thr 50 55 60

Asp Gly Leu Ser Asp Phe Leu Lys Ser Gin Thr Pro Ala Glu Asp Thr • · • · · ·

- 37 Val bys Ser Ile Glu Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu 35 90 95

Leu Asp Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr His Lys Asn Leu Ile Asn Asn 100 105 110

Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Asp Leu Gin Ala Gin Val Val Glu 115 120 125

Ser Ala Lys Lys· Ala Arg Ile Ser Glu Ala Thr Asp Gly Leu Ser Asp 130 135 140

Phe Leu Lys Ser Gin Thr Pro Ala Glu Asp Thr Val Lys Ser Ile Glu

145 150 155 ISO

Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly

165 170 175

Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu 180 185 190

Gly Val Lys Ala Leu Ile Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro Lys Thr 195 200 205

Asp Thr Tyr Lys Leu Ile Leu Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr 210 215 . 220

Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Arg Ser Phe Asn Phe Pro

225 230 235 240

Ile Leu Glu Asn Ser Ser Ser Val Pro Ala Ser Gin Ala Arg Glu Ala

245 250 255

Glu Asp Leu Gin Val Gly Gin Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala

260

265

270

- 38 • ·

Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Arg Thr Ala 275 280 285

Ser Gin Ala Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gin Val Gly Gin Val Glu Leu 290 295 300

Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly

305 310 315 320

Ser Leu Gin Arg Thr Ala Ser Gin Ala Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gin

325 330 335

Val Gly Gin Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gin 340 345 350

Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Arg Thr Ala Ser Gin Ala Arg 355 360 365

Glu Ala Glu Asp Leu Gin Val Gly Gin Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 370 375 380

Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Arg

385 390 395 400

Thr Ala Ser Gin Ala Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gin Val Gly Gin Val

405 410 , 415

Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu 420 425 430

Glu Gly Ser Leu Gin Arg Thr Ala Ser Gin Ala Arg Glu Ala Glu Asp 435 440 445

Leu Gin Val Gly Gin Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser 450 455 460 • · • · > · · · · • · · • · · · · · · ··· · · · · • Μ · · · · · « · · · • · · · · · » • · · · · · · ·

Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Arg Thr Ala Ser Gin

465 470 475 480

Ala Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gin Val Gly Gin Val Glu Leu Gly Gly

485 490 495

Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu 500 505 510

Gin Arg Thr Ala Ser Gin Ala Val Asp 515 520 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 74 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = “oligonukleotid‘ (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 6:

CGGCCTCCCA GGCCCGCGAA GCTGAGGACC TGCAAGTTGG TCAGGTTGAA CTGGGCGGTG

GCCCGGGTGC AGGC (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 68 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednořetězcová

-40 (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = “oligonukleotid“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 7:

TCTTTGCAGC CGCTGGCTTT AGAAGGTTCT CTTCAGCGTA CGGCCTCCCA GGCCGTCGAC 60

TAACTGCA 68 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 68 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = “oligonukleotid“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 8:

CATGGCCGGA GGGTCCGGGC GCTTCGACTC CTGGACGTTC AACCAGTCCA ACTTGACCCG SO

CCÁCCGGG ⁶⁸ (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 74 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = “oligonukleotid“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 9:

CCCACGTCCG AGAAACGTČG GCGACCGAAA TCTTCCAAGA GAAGTCGCAT GCCGGAGGGT 60

CCGGCAGCTG ATTG 74 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = “oligonukleotid“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 10:

GCTTCCGGCT CGTATGTGTG (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednořetězcová

- 42 (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = “oligonukleotid“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 11:

AAAGGGGGAT GTGCTGCAAG GCG (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 41 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = “oligonukleotid“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 12:

CCCCCTGCAG CTCGAGCGCC TTTAACCTGT TTTGGCGGAT G (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 27 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární

(ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = “oligonukleotid“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 13:

CCCCAAGCTT AGAGTTTGTA GAAACGC (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 4646 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = “vektor“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 14:

GCGGCCGCTA ATTCATGCTG TGGTGTCATG GTCGGTGATC GCCAGGGTGC CGACGCGCAT 60

CTCGACTGCA CGGTGCACCA ATGCTTCTGG CGTCAGGCAG CCAATCGGAA GCTGTGGTAT 120

GGCTGTGCAG GTCGTAAATC ACTGCATAAT TCGTGTCGCT CAAGGCGCAC TCCCGTTCTG 180

GÁTAATGTTT TTTGCGCCGA CATCATAACG GTTCTGGCAA ATATTCTGAA ATGAGCTGTT 240

GACAATTAAT CATCGAACTA GTTAACTAGT ACGCAAGTTC ACGTAAAAAG GGTATCTAGA 300

ATTATGAAAG CAATTTTCGT ACTGAATGCG CAACACGATG AAGCCGTAGA CGCGAATTTC 360

GACCAATTCA ACAAATATGG AGTAAGTGAC TATTACAAGA ATCTAATCAA CAATGCCAAA 420

ACTGTTGAAG GCGTAAAAGA CCTTCAAGCA CAAGTTGTTG AATCAGCGAA GAAAGCGCGT 4 80

ATTTCAGAAG CAACAGATGG CTTATCTGAT TTCTTGAAAT CACAAACACC TGCTGAAGAT 540

ACTGTTAAAT CAATTGAATT AGCTGAAGCT AAAGTCTTAG CTAACAGAGA ACTTGACAAA 600

TATGGAGTAA GTGACTATCA CAAGAACCTA ATCAACAATG CCAAAACTGT TGAAGGTGTA 660

AAAGACCTTC AAGCACAAGT TGTTGAATCA GCGAAGAAAG CGCGTATTTC AGAAGCAACA 720

GATGGCTTAT CTGATTTCTT GAAATCACAA ACACCTGCTG AAGATACTGT TAAATCAATT 780

GAATTAGCTG AAGCTAAAGT CTTAGCTAAC AGAGAACTTG ACAAATATGG AGTAAGTGAC 840

TATTACAAGA ACCTAATCAA CAATGCCAAA ACTGTTGAAG GTGTAAAAGC ACTGATAGAT 900

GAAATTTTAG CTGCATTACC TAAGACTGAC ACTTACAAAT TAATCCTTAA TGGTAAAACA 960

TTGAAAGGCG AAACAACTAC TGAAGCTGTT GATGCTGCTA CTGCAAGATC TTTCAATTTC 102 0

CCTATCCTCG AGAATTCGAG CTCGGTACCG GCCTCCCAGG CCCGCGAAGC TGAGGACCTG 10 8 0

CAAGTTGGTC AGGTTGAACT GGGCGGTGGC CCGGGTGCAG GCTCTTTGCA GCCGCTGGCT 114 0

TTAGAAGGTT CTCTTCAGCG TACGGCCTCC CAGGCCCGCG AAGCTGAGGA CCTGCAAGTT 1200

GGTCAGGTTG AACTGGGCGG TGGCCCGGGT GCAGGCTCTT TGCAGCCGCT GGCTTTAGAA 1260

GGTTCTCTTC AGCGTACGGC CTCCCAGGCC CGCGAAGCTG AGGACCTGCA AGTTGGTCAG 13 20

GTTGAACTGG GCGGTGGCCC GGGTGCAGGC TCTTTGCAGC CGCTGGCTTT AGAAGGTTCT 13 8 0

CTTCAGCGTA CGGCCTCCCA GGCCCGCGAA GCTGAGGACC TGCAAGTTGG TCAGGTTGAA 144 0

CTGGGCGGTG GCCCGGGTGC AGGCTCTTTG CAGCCGCTGG CTTTAGAAGG TTCTCTTCAG 1500

CGTACGGCCT CCGAGGCCCG GGAAGCTGAG GAGCTGCAAG TTGGTCAGGT TGAACTGGGC 1560

GGTGGCCCGG GTGCAGGCTC

GCCTCCCAGG CCCGCGAAGC

CCGGGTGCAG GCTCTTTGCA

CAGGCCCGCG AAGCTGAGGA

GCAGGCTCTT TGCAGCCGCT

GTCGACTAAC TGCAGCTCGA

TGATACAGAT TAAATCAGAA

GTAGCGCGGT GGTCCCACCT

ATGGTAGTGT GGGGTCTCCC

AAGGCTCAGT CGAAAGACTG

CTGAGTAGGA CAAATCCGCC

TGGCGGGCAG GACGCCCGCC

ACGGATGGCC TTTTTGCGTT

GCCACGTTGT GTCTCAAAAT

GAACAATAAA ACTGTCTGCT

AACGGGAAAC GTCTTGCTCG

GGTATAAATG GGCTCGCGAT

GGAAGCCCGA TGCGCCAGAG

TTACAGATGA GATGGTCAGA

TTTGCAGCCG

TGAGGACCTG

GCCGCTGGCT

CCTGCAAGTT ggctttagaa

GCGCTTAACT

CGCAGAAGCG

GACCCCATGC

CATGCGAGAG

GGCCTTTCGT

GGGAGCGGAT

ATAAACTGCC

TCTACAAACT

CTCTGATGTT

TACATAAACA

AGGCCGCGAT

AATGTCGGGC

TTGTTTCTGA

CTAAACTGGC

CTGGCTTTAG

CAAGTTGGTC

TTAGAAGGTT

GGTCAGGTTG

GGTTCTCTTC

GTTTTGGCGG

GTCTGATAAA

CGAACTCAGA

TAGGGAACTG

TTTATCTGTT

TTGAACGTT3

AGGCATCAAA

CTAAGCTTTG

ACATTGCACA

GTAATACAAG

TAAATTCCAA

AATCAGGTGC

AACATGGCAA

TGACGGAATT

AAGGTTCTCT

AGGTTGAACT

CTCTTCAGCG

AACTGGGCGG

AGCGTACGGC

ATGAGAGAAG

ACAGAATTTG

AGTGAAACGC

CCAGGCATCA

GTTTGTCGGT

CGAAGCAACG

TTAAGCAGAA

GTGCAGGGGG

AGATAAAAAT

GGGTGTTATG

CATGGATGCT

GACAATCTAT

AGGTAGCGTT

TATGCCTCTT

TCAGCGTACG

GGGCGGTGGC

TACGGCCTCC

TGGCCCGGGT

CTCCCAGGCC

ATTTTCAGCC

CCTGGCGGCA

CGTAGCGCCG

AATAAAACGA

GAACGCTCTC

GCCCGGAGGG

GGCCATCCTG

GGGGGGGAAA

ATATCATCAT

AGCCATATTC

GATTTATATG

CGATTGTATG

GCCAATGATG

CGGACCATCA

1620

1680

1740

1800

1860

1920

1980

2040

2100

2160

2220

2280

2340

2400

2460

2520

2580

2640

2700

				• · * 4 * t	» · · X 9 » * · · A t	• · • »
				♦ 1 · 1	* ······· ·	• ·
			- 46		» · · · ·	• ·
				• · · · « · ·	« · · b *	• ·
AGCATTTTAT	CCGTACTCCT	GATGATGCAT	GGTTACTCAC	CACTGCGATC	CCCGGGAAAA	2760
CAGCATTCCA	GGTATTAGAA	GAATATCCTG	ATTCAGGTGA	AAATATTGTT	GATGCGCTGG	2820
CAGTGTTCCT	GCGCCGGTTG	CATTCGATTC	CTGTTTGTAA	TTGTCCTTTT	AACAGCGATC	2880
GCGTATTTCG	TCTCGCTCAG	GCGCAATCAC	GAATGAATAA	CGGTTTGGTT	GATGCGAGTG	2940
ATTTTGATGA	CGAGCGTAAT	GGCTGGCCTG	TTGAACAAGT	CTGGAAAGAA	ATGCATAAAC	3000
TTTTGCCATT	CTCACCGGAT	TCAGTCGTCA	CTCATGGTGA	TTTCTCACTT	GATAACCTTA	3060
TTTTTGACGA	GGGGAAATTA	ATAGGTTGTA	TTGATGTTGG	ACGAGTCGGA	ATCGCAGACC	3120
GATACCAGGA	TCTTGCCATC	CTATGGAACT	GCCTCGGTGA	GTTTTCTCCT	TCATTACAGA	3180
AACGGCTTTT	TCAAAAATAT	GGTATTGATA	ATCCTGATAT	GAATAAATTG	CAGTTTCATT	3240
TGATGCTCGA	TGAGTTTTTC	TAATCAGAAT	TGGTTAATTG	GTTGTAACAC	TGGCAGAGCA	3300
TTACGCTGAC	TTGACGGGAC	GGCGGCTTTG	TTGAATAAAT	CGAACTTTTG	CTGAGTTGAA	3360
GGATCAGATC	ACGCATCTTC	CCGACAACGC	AGACCGTTCC	GTGGCAAAGC	AAAAGTTCAA	3420
AATCACCAAC	TGGTCCGGAT	CCCGGTGCCT	CACTGATTAA	GCATTGGTAA	CTGTCAGACC	3480
AAGTTTACTC	ATATATACTT	TAGATTGATT	TAAAACTTCA	ΤΊΤΤΤΑΑΤΤΤ	AAAAGGATCT	3540
AGGTGAAGAT	CCTTTTTGAT	aatctcatga	CCAAAATCCC	TTAACGTGAG	TTTTCGTTCC	3600
ACTGAGCGTC	AGACCCCGTA	GAAAAGATCA	AAGGATCTTC	TTGAGATCCT		3660
GCGTAATCTG	CTGCTTGCAA	ACAAAAAAAC	CACCGCTACC	AGCGGTGGTT	TGTTTGCCGG	3720
ATCAAGAGCT	ACCAACTCTT	TTTCCGAAGG	TAACTGGCTT	CAGCAGAGCG	CAGATACCAA	3780
ATACTGTCCT	' TCTAGTGTAG	CCGTAGTTAG	GCCACCACTT	' CAAGAACTCT	’ GTAGCACCGC	3840

- 47 • · · » • * · · · e ·» · ·

CTACATACCT CGCTCTGCTA ATCCTGTTAC CAGTGGCTGC TGCCAGTGGC GATAAGTCGT 3 900

GTCTTACCGG GTTGGACTCA AGACGATAGT TACCGGATAA GGCGCAGCGG TCGGGCTGAA 3960

CGGGGGGTTC GTGCACACAG CCCAGCTTGG AGCGAACGAC CTACACCGAA CTGAGATACC 4020

TACAGCGTGA GCTATGAGAA AGCGCCACGC TTCCCGAAGG GAGAAAGGCG GACAGGTATC 4080

CGGTAAGCGG CAGGGTCGGA ACAGGAGAGC GCACGAGGGA GCTTCCAGGG GGAAACGCCT 4140

GGTATCTTTA TAGTCCTGTC GGGTTTCGCC ACCTCTGACT TGAGCGTCGA TTTTTGTGAT 4200

GCTCGTCAGG GGGGCGGAGC CTATGGAAAA ACGCCAGCAA CGCGGCCTTT TTACGGTTCC 4260

TGGCCTTTTG CTGGCCTTTT GCTCACATGT TCTTTCCTGC GTTATCCCCT GATTCTGTGG 4320

ATAACCGTAT TACCGCCTTT GAGTGAGCTG ATACCGCTCG CCGCAGCCGA ACGACCGAGC 4380

GCAGCGAGTC AGTGAGCGAG GAAGCGGAAG AGCGCCCAAT ACGCAAACCG CCTCTCCCCG 444 0

CGCGTTGGCC GATTCATTAA TGCAGCTGGC ACGACAGGTT TCCCGACTGG AAAGCGGGCA 4500

GTGAGCGCAA CGCAATTAAT GTGAGTTAGC TCACTCATTA GGCACCCCAG GCTTTACACT 4560

TTATGCTTCC GGCTCGTATG TTGTGTGGAA TTGTGAGCGG ATAACAATTT CACACAGGAA 4620

ACAGCTATGA CCATGATTAC GAATTA 4646

Zastupuje:

« · ··« *»··

- 48 ^......*

Pl/ ZOOO- tftyty

Claims (21)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob produkce C-peptidu insulinu, vyznačující se t í m , ž e zahrnuje expresi multimerního poiypeptidu obsahujícího mnohočetné kopie řečeného C-peptidu insulinu v hostitelské buňce,

   5 a štěpení řečeného exprimovaného poiypeptidu vedoucí k uvolnění jednotlivých kopií C-peptidu insulinu.
2. 2. Molekula nukleové kyseliny obsahující mnohočetné kopie nukleotidové sekvence kódující C-peptid insulinu, kde řečená nukleová io kyselina kóduje multimerní polypeptid, který lze štěpit za vzniku jednotlivých kopií řečeného C-peptidu insulinu.
3. 3. Způsob produkce molekuly nukleové kyseliny, jež kóduje multimerní polypeptid obsahující mnohočetné kopie C-peptidu insulinu,

   15 kde exprimovaný multimerní polypeptid může být následně štěpen za vzniku jednotlivých kopií C-peptidu insulinu, kde řečený způsob s e vyznačuje tím, že zahrnuje vytvoření molekuly nukleové kyseliny obsahující mnohočetné kopie nukleotidové sekvence kódující C-peptid insulinu, jež jsou spojené v odpovídajícím čtecím rámci.
4. 4. Multimerní polypeptid, obsahující mnohočetné kopie C-peptidu insulinu, štěpitelný za vzniku jednotlivých kopií řečeného C-peptidu insulinu.

   25 5. Způsob produkce multimerního poiypeptidu, obsahujícího mnohočetné kopie C-peptidu insulinu, štěpitelného za vzniku ; i jednotlivých kopií řečeného C-peptidu insulinu, kde řečený způsob s e vyznačuje tím,že zahrnuje kultivaci hostitelských buněk, obsahujících molekulu nukieové kyseliny kódující řečený multimerní polypeptid, za podmínek kdy je tento multimerní polypeptid
5. 5 exprimován, a izolaci exprimovaného multimerního polypeptidů.
6. 6. Způsob produkce C-peptidu insulinu, vyznačující se t i m , ž e tento způsob zahrnuje štepení multimerního polypeptidů podle nároku 4.
7. 7. Způsob, molekula nukieové kyseliny nebo multimerní polypeptid podle kteréhokoli z nároků 1 až 6, vyznačující se t i m , ž e řečené mnohočetné kopie C-peptidu insulinu nebo nukleotidové sekvence kódující tento C-peptid insulinu jsou

   15 tandemově uspořádány.
8. 8. Způsob, molekula nukieové kyseliny nebo multimerní polypeptid podle kteréhokoli z nároků 1 až 7, vyznačující se t i m , ž e řečený multimerní polypeptid obsahuje 2 až 30 kopií

   20 řečeného C-peptidu insulinu.
9. 9. Způsob, molekula nukieové kyseliny nebo multimerní polypeptid podle kteréhokoli z nároků 1 až 8, vyznačující se t i m , ž e řečený multimerní polypeptid obsahuje 3 až 7 kopií

   25 řečeného C-peptidu insulinu.
10. 10. Způsob, molekula nukleové kyseliny nebo multimerní polypeptid podle kteréhokoli z nároků 1 až 9, vyznačující se t í m , ž e multimerní polypeptid dále obsahuje partnera, s nímž je fúzován.
11. 11. Způsob, molekula nukleové kyseliny nebo multimerní polypeptid podle nároku 10, vyznačující se tím,že řečený fúzovaný partner je jedním z dvojice afinitně se vázajících partnerů nebo ligandů.
12. 12. Způsob, molekula nukleové kyseliny nebo multimerní polypeptid podle nároku 10 nebo 11, vyznačující se t í m , ž e řečený fúzovaný partner je 25 kDa serumalbumin-vázající oblast (BB) odvozená ze streptokokového proteinu G.
13. 13. Způsob, molekula nukleové kyseliny nebo multimerní polypeptid podle kteréhokoli z nároků 1 až 12, vyznačující se t í m , ž e monomery C-peptidu insulinu v řečeném multimerním polypeptídu jsou ohraničeny linkerovými oblastmi obsahujícími štěpící

    20 místo.
14. 14. Způsob, molekula nukleové kyseliny nebo multimerní polypeptid podle kteréhokoli z nároků 1 až 13, vyznačující se t í m , ž e řečené štěpící místo je štěpitelné proteolytickým enzymem.
15. 15. Způsob, molekula nukleové kyseliny nebo multimerní polypeptid podle kteréhokoli z nároků 1 až 13, vyznačující se i:

    argininové zbytky pro

    -I i

    t í m , ž e řečené štěpící místo obsahuje štěpení trypsinem a karboxypeptidasou B.
16. 16. Způsob nebo molekula nukleové kyseliny podle kteréhokoli z 5 nároků 1-3 a 7-14, vyznačující se tím,že řečená molekula nukleové kyseliny dále obsahuje jednu nebo více regulačních, nebo expresi regulujících sekvencí.
17. 17. Expresní vektor obsahující molekulu nukleové kyseliny podle io kteréhokoli z nároků 2 a 7-16.
18. 18. Expresní vektor podle nároku 17, kde tento vektor je plasmid.
19. 19. Expresní vektor podle nároku 18, vyznačující se 15 t í m , ž e je odvozen z plasmidu pTrpBB (SEQ ID NO: 14) nebo jeho derivátu.
20. 20. Hostitelská buňka obsahující molekulu nukleové kyseliny podle kteréhokoli z nároků 2 a 7-16.
21. 21. C-peptid insulinu vyrobený způsobem podle nároků 1 nebo 6.