CN112245578A

CN112245578A - 一种covid-19病毒预防性疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN112245578A
Application number: CN202011137052.5A
Authority: CN
Inventors: 王立良
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2020-10-20
Filing date: 2020-10-20
Publication date: 2021-01-22
Anticipated expiration: 2040-10-20
Also published as: CN112245578B

Abstract

本发明提供了一种COVID‑19病毒预防性疫苗及其制备方法，所述COVID‑19病毒预防性疫苗的制备方法，包括步骤一、获取SARS‑CoV‑2‑S1的氨基酸序列，步骤二、由SARS‑CoV‑2‑S1的氨基酸序列设计SARS‑CoV‑2 S1编码基因，步骤三、设计IL12信号肽编码基因，步骤四、合成IL12ss‑SARS‑CoV‑2 S1编码基因，步骤五、然后构建质粒pAAV‑SARS‑CoV‑2 S1，步骤六、合成粗制COVID‑19病毒预防性疫苗；步骤七、纯化后获得所述的COVID‑19病毒预防性疫苗。本发明实施例提供的COVID‑19病毒预防性疫苗通过利用AAV作为载体疫苗具有免疫稳定、持久、安全等特点，克服了目前机体产生的抗SARS‑CoV‑2抗体维持时间不长，通常1～3个月的问题。

Description

一种COVID-19病毒预防性疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其是涉及一种COVID-19病毒预防性疫苗及其制备方法。

背景技术

冠状病毒(Coronavirus)自被发现以来已经有50多年历史，在自然界中广泛存在。冠状病毒属(Coronavirus)属于冠状病毒科(Coronaviridae)，基因组为完整的单股正链RNA，长约30Kb，具有正链RNA病毒所具有的重要特征：5’端有甲基化“帽”，3’端有PolyA“尾”结构。病毒有4种结构蛋白：S蛋白(Spike protein，刺突蛋白)，M蛋白(membraneprotein膜蛋白)， E蛋白(envelope protein，包膜蛋白)，N蛋白(nucleocapsid，核衣壳蛋白)。其中S蛋白在病毒结构中是三聚体糖蛋白，为I类融合蛋白，和SARS-CoV 一样，SARS-CoV-2侵入人体的机理也是通过S蛋白内部的受体结合区 (receptor binding domain，RBD)可与宿主细胞的病毒受体血管紧张素 ACE2结合，为决定病毒入侵易感细胞的关键蛋白。S蛋白可被宿主的furin 蛋白酶裂解为S1与S2两条多肽。S1多肽内部的RBD与宿主受体结合，而S2多肽则形成皇冠状突起的茎部。冠状病毒的免疫标为集中在S蛋白上，为疫苗研发的靶点。

SARS-CoV-2感染性极强、潜伏期很长，可以达到2周～1个月，一旦在人群中发现个例感染就已经在人群中广泛传播开了。SARS-CoV-2能引起严重急性呼吸综合征、肺炎，更多的是无症状感染，危害极大。研发安全性好、保护期长的有效疫苗，对遏制新冠病毒对人类健康及人类生产和社交、生活的正常化具有重要的意义。

新冠病毒疫苗的研发有多种管线，如灭火疫苗、重组腺病毒疫苗、mRNA 疫苗、重组蛋白疫苗、DNA疫苗、基于免疫细胞的疫苗等。主要是基于 SARS-CoV-2的S蛋白/基因为靶点，包括全长和受体结合区(RBD)。目前的研究发现机体产生的抗SARS-CoV-2抗体维持时间不长，通常1～3个月，这给疫苗的有效性带来了难题。

腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)，属于微小病毒科，是目前发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒，需要辅助病毒(通常为腺病毒)参与复制，病毒直径约20nm。两侧末端有反向重复序列(ITR)，基因组编码cap和rep基因。ITRs对于病毒的复制和包装具有决定性作用。cap 基因编码病毒衣壳蛋白，rep基因参与病毒的复制和整合。AAV能感染多种细胞。重组腺相关病毒载体(rAAV)源于非致病的野生型腺相关病毒，其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，作为转移载体之一被广为重视，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。AAV载体疫苗，具有免疫稳定、持久、安全等特点。

因此，提供一种AAV载体疫苗能够对COVID-19病毒进行预防成为人们亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种COVID-19病毒预防性疫苗及其制备方法，能够在预防COVID-19病毒的同时，拥有AAV载体的优点。

为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：

根据本发明实施例的第一方面，提供一种COVID-19病毒预防性疫苗的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、获取SARS-CoV-2-S1的氨基酸序列，该氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

步骤二、由SARS-CoV-2-S1的氨基酸序列设计SARS-CoV-2S1编码基因，所述SARS-CoV-2S1编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

步骤三、设计IL12信号肽编码基因，所述IL12信号肽编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

步骤四、通过步骤二设计的SARS-CoV-2-S1编码基因和步骤三设计的 IL12信号肽编码基因合成IL12ss-SARS-CoV-2S1编码基因，所述 IL12ss-SARS-CoV-2S1编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

步骤五、根据步骤四的IL12ss-SARS-CoV-2S1编码基因合成全序列，之后克隆于载体中，然后构建质粒pAAV-SARS-CoV-2S1，所述 pAAV-SARS-CoV-2-S1的序列如SEQ IDNO.5所示；

步骤六、提取重组腺相关病毒辅助质粒，将辅助质粒和 pAAV-SARS-CoV-2-S1混匀后加入到无血清培养基中，之后将转染剂加入到无血清培养基中，转染剂、辅助质粒和pAAV-SARS-CoV-2-S1混匀后加入到装有细胞培养基的容器中继续培养，收集细胞后离心，去除上清液后重悬细胞沉淀，之后反复冻融再次离心并收集上清液，即为粗制COVID-19病毒预防性疫苗；

步骤七、将粗制COVID-19病毒预防性疫苗用缓冲液稀释，之后加入碘克沙醇，离心后收集上层组分，即获得所述的COVID-19病毒预防性疫苗。

进一步的，所的步骤五包括根据步骤四的IL12ss-SARS-CoV-2S1编码基因合成全序列，之后克隆于PUC57载体中，记为质粒pUC57S1，对质粒 pUC57S1进行BsaI酶切并切胶回收，之后溶于去离子水中，得混合物Ⅰ；对 pAAV-MCS进行EcoRI-BglII双酶切并切胶回收，之后溶于去离子水中，得混合物Ⅱ，将混合物Ⅰ和混合物Ⅱ放于同一个离心管中，加入T4 DNALigase 缓冲液、T4 DNA Ligase、去离子水，之后转化DH5α感受态细胞，涂布含氨苄青霉素的LB平板，挑取单克隆于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，培养结束后，提取质粒DNA，PCR鉴定获得pAAV-SARS-CoV-2-S1。

进一步的，对质粒pUC57S1进行BsaI酶切，切胶回收2kb片段。

进一步的，对质粒pUC57S1进行BsaI酶切并切胶回收后溶于50μL去离子水中，得混合物Ⅰ；对pAAV-MCS进行EcoRI-BglII双酶切并切胶回收，之后溶于50μL去离子水中，得混合物Ⅱ，将混合物Ⅰ和混合物Ⅱ各取5μL放于同一个1.5mL的离心管中，加入2μL T4 DNALigase缓冲液、0.5μL T4 DNA Ligase，7.5μL去离子水，于16℃连接1h，转化DH5α感受态细胞，涂布含氨苄青霉素的LB平板，15h后挑取单克隆于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃、200RPM培养15h，提取质粒DNA，PCR鉴定获得 pAAV-SARS-CoV-2-S1。

进一步的，步骤六中所述的辅助质粒包括质粒pHelper和质粒 P5E18RXC1。

进一步的，所述的步骤六包括转染传代细胞于多个培养瓶中，将质粒 pHelper、质粒P5E18RXC1及质粒PAAV-SARS-CoV-2-S1各30μg混匀加到 500μL无血清培养基中，取160μL转染试剂加到500μL无血清培养基中，将质粒pHelper、质粒P5E18RXC1、质粒PAAV-SARS-CoV-2-S1和转染试剂混匀后加入到培养瓶的传代细胞中，置于温度为37℃、体积百分比浓度为5％的CO₂继续培养。转染后72小时，用细胞刮将细胞刮下，1000rpm 离心5min，弃上清，用4ml无菌PBS重悬细胞沉淀；-80℃和37℃反复冻融3次，3000rpm取上清，获得粗制COVID-19病毒预防性疫苗。

进一步的，所述的步骤七包括将步骤六制备的粗制COVID-19病毒预防性疫苗用10mM Tris-HCl缓冲液稀释至10ml，然后在39ml超速离心管中加入碘克沙醇，在温度为4℃、离心力为40000×g的环境下离心1小时，收集4ml的40％下层组分和1ml的60％上层组分，即获得所述的COVID-19 病毒预防性疫苗。

进一步的，所述的步骤七还包括将COVID-19病毒预防性疫苗用50kDa 超滤管超滤置换病毒保存液。

进一步的，所述病毒保存液为pH值7.4的PBS磷酸缓冲液。

根据本发明实施例的第二方面，提供一种由上述方法制备的COVID-19 病毒预防性疫苗。

本发明实施例具有如下优点：本发明实施例提供一种COVID-19病毒预防性疫苗及其制备方法，本发明的COVID-19病毒预防性疫苗通过利用 AAV作为载体疫苗具有免疫稳定、持久、安全等特点，克服了目前机体产生的抗SARS-CoV-2抗体维持时间不长，通常1～3个月的问题。此外，本申请制备方法采用密码子经过优化的SARS-CoV-2刺突蛋白S的S1结构域的基因编码序列，以及含有该优化基因的重组腺相关病毒，克服了新冠病毒S蛋白及S1蛋白比较长，很难高表达的问题。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实验1中酶标仪于450nm波长下检测抗体吸光度(OD)值为纵坐标，不同实验组为横坐标的柱状图；

图2为本发明实验2中和试验的柱状图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例提供一种COVID-19病毒预防性疫苗的制备方法，包括以下步骤：

步骤六、提取重组腺相关病毒辅助质粒，将辅助质粒和 pAAV-SARS-CoV-2-S1混匀后加入到无血清培养基中，之后将转染剂加入到无血清培养基中，转染剂、辅助质粒和pAAV-SARS-CoV-2-S1混匀后加入到装有细胞培养基的容器中继续培养，收集细胞后离心，去除上清液后重悬细胞沉淀，之后反复冻融再次离心并收集上清液，即为粗制COVID-19病毒预防性疫苗，-80℃保存备用；所述的辅助质粒包括质粒pHelper和质粒P5E18RXC1；

步骤七、将粗制COVID-19病毒预防性疫苗用缓冲液稀释，之后加入碘克沙醇，离心后收集上层组分，即获得所述的COVID-19病毒预防性疫苗，-80℃保存备用。

实施例2

在采取实施例1技术方案的基础上，本实施例提供获得 pAAV-SARS-CoV-2-S1的构建方法包括根据步骤四的IL12ss-SARS-CoV-2 S1编码基因合成全序列，之后克隆于PUC57载体中，记为质粒pUC57S1，对质粒pUC57S1进行BsaI酶切切胶回收2kb片段后溶于50μL去离子水中，得混合物Ⅰ；对pAAV-MCS进行EcoRI-BglII双酶切并切胶回收，之后溶于 50μL去离子水中，得混合物Ⅱ，将混合物Ⅰ和混合物Ⅱ各取5μL放于同一个 1.5mL的离心管中，加入2μL T4 DNA Ligase缓冲液、0.5μL T4 DNA Ligase， 7.5μL去离子水，于16℃连接1h，转化DH5α感受态细胞，涂布含氨苄青霉素的LB平板，15h后挑取单克隆于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃、200RPM培养15h，提取质粒DNA，PCR鉴定获得 pAAV-SARS-CoV-2-S1。

实施例3

在采取实施例1技术方案的基础上，所述的步骤六包括转染传代细胞于多个培养瓶中，将质粒pHelper、质粒P5E18RXC1及质粒 PAAV-SARS-CoV-2-S1各30μg混匀加到500μL无血清培养基中，取160μL 转染试剂加到500μL无血清培养基中，将质粒pHelper、质粒P5E18RXC1、质粒PAAV-SARS-CoV-2-S1和转染试剂混匀后加入到培养瓶的传代细胞中，置于温度为37℃、体积百分比浓度为5％的CO₂继续培养。转染后72小时，用细胞刮将细胞刮下，1000rpm离心5min，弃上清，用4ml无菌PBS重悬细胞沉淀；-80℃和37℃反复冻融3次，3000rpm取上清，获得粗制COVID-19 病毒预防性疫苗。

实施例4

在采取实施例1技术方案的基础上，所述的步骤七包括将步骤六制备的粗制COVID-19病毒预防性疫苗用10mM Tris-HCl缓冲液稀释至10ml，然后在39ml超速离心管中加入碘克沙醇，在温度为4℃、离心力为40000×g 的环境下离心1小时，收集4ml的40％下层组分和1ml的60％上层组分，即获得所述的COVID-19病毒预防性疫苗。

实施例5

在采取实施例1技术方案的基础上，步骤七还包括将COVID-19病毒预防性疫苗用50kDa超滤管超滤置换病毒保存液。优选的，所述病毒保存液为pH值7.4的PBS磷酸缓冲液。

实施例6

本实施例提供一种由实施例1-5中任一项所述方法制备的COVID-19 病毒预防性疫苗。

实验1

选取10只4～6周龄的SPF级的健康雌BALB/c雌性小鼠随机分为2 组，每组5只，在第一周大腿肌肉注射免疫，实验组每只打100μl 1x1011vg，对照组每只打100μl PBS。免疫四周后采集小鼠的静脉血，分离血清，检测免疫反应。

用0.1M Na₂CO₃缓冲液(pH9.6)溶解重组蛋白S1，配制成1μg/mL，以每孔100μL加入96孔板，于4℃过夜孵育；用PBST(PBS+0.1％吐温-20) 洗板3次(300μL/孔/次)。每孔加入250μL 5％脱脂奶粉；室温温孵育1h，用 PBST洗板3次。小鼠血清样品分别用PBS稀释1000倍，以每孔100μL加入96孔板，每个稀释梯度平行做二个副孔；37℃培养箱孵育2h，洗板3次。将HRP(辣根过氧化物酶)标记的IgG二抗5000倍，每孔加入100μL，室温孵育1h；洗板3次。加入TMB溶液，每孔加入100μL，温避光显色 20分钟。每孔加100μL加入0.5M H₂SO₄终止液。立即用酶标仪于450nm 波长下检测吸光度，结果如图1所示。

实验2

在实验1的基础上进行中和抗体检测。

步骤①、假病毒制备，用PEI转染293T细胞，加入pcDNA3.1S2 30μg，于37℃CO₂孵箱中孵育24h，用VSVΔG-GFP病毒感染4h，弃液体，使用无菌PBS洗3次，加入培养基，在CO₂孵箱中37℃孵育48h，2000rpm离心3m后收集上清保存于-80℃冰箱。在293T细胞下进行假型病毒测定，在六孔板上生长的293T细胞用200μL病毒原液感染，1h吸附后，除去接种物，加入新鲜培养基，并将细胞在CO₂孵箱中37℃孵育16h于荧光显微镜下进行检测，记录细胞图像。

步骤②、取96孔板，每孔接种104个293T细胞，将实验1中系列稀释的小鼠血清于37℃孵箱1h，然后加入到96孔板293T细胞。于37℃CO₂孵箱中孵育24h，弃上清，加入新鲜培养基，72h后检测。结果如图2所示。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

序列表

<110> 王立良

<120> 一种COVID-19病毒预防性疫苗及其制备方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 669

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ser Gln Cys Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr

1 5 10 15

Thr Asn Ser Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg

20 25 30

Ser Ser Val Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser

35 40 45

Asn Val Thr Trp Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr

50 55 60

Lys Arg Phe Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe

65 70 75 80

Ala Ser Thr Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr

85 90 95

Thr Leu Asp Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr

100 105 110

Asn Val Val Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe

115 120 125

Leu Gly Val Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu

130 135 140

Phe Arg Val Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser

145 150 155 160

Gln Pro Phe Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn

165 170 175

Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr

180 185 190

Ser Lys His Thr Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe

195 200 205

Ser Ala Leu Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr

210 215 220

Arg Phe Gln Thr Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly

225 230 235 240

Asp Ser Ser Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly

245 250 255

Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr

260 265 270

Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys

275 280 285

Cys Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser

290 295 300

Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile

305 310 315 320

Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala

325 330 335

Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp

340 345 350

Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr

355 360 365

Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr

370 375 380

Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro

385 390 395 400

Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp

405 410 415

Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys

420 425 430

Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn

435 440 445

Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly

450 455 460

Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu

465 470 475 480

Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr

485 490 495

Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val

500 505 510

Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn

515 520 525

Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn

530 535 540

Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr

545 550 555 560

Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr

565 570 575

Pro Cys Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr

580 585 590

Ser Asn Gln Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val

595 600 605

Pro Val Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr

610 615 620

Ser Thr Gly Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly

625 630 635 640

Ala Glu His Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala

645 650 655

Gly Ile Cys Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro

660 665

<210> 2

<211> 75

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gccaccatgt acaggatgca actcctgtct tgcattgcac taagtcttgc acttgtcacg 60

aattcgatat cggcc 75

<210> 3

<211> 2013

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgtctcagt gcgtgaacct gaccaccaga acccagctgc caccagctta caccaactct 60

ttcaccagag gagtgtacta cccagacaag gtgttcagat cttctgtgct gcactctacc 120

caggacctgt tcctgccatt cttctctaac gtgacctggt tccacgctat ccacgtgtct 180

ggaaccaacg gaaccaagag attcgacaac ccagtgctgc cattcaacga cggagtgtac 240

ttcgcttcta ccgagaagtc taacatcatc agaggatgga tcttcggtac caccctggac 300

tctaagaccc agtctctgct gatcgtgaac aacgctacca acgtggtgat caaggtgtgc 360

gagttccagt tctgcaacga cccattcctg ggagtgtact accacaagaa caacaagtct 420

tggatggagt ctgagttcag agtgtactct tctgctaaca actgcacctt cgagtacgtg 480

tctcagccat tcctgatgga cctggaggga aagcagggaa acttcaagaa cctgagagag 540

ttcgtgttca agaacatcga cggatacttc aagatctact ctaagcacac cccaatcaac 600

ctggtgagag atctgccaca gggattctct gctctggagc cactggtgga cctgccaatc 660

ggaatcaaca tcaccagatt ccagaccctg ctggctctgc acagatctta cctgacccca 720

ggagactctt cttctggatg gaccgctgga gctgctgctt actacgtggg atacctgcag 780

ccaagaacct tcctgctgaa gtacaacgag aacggaacca tcaccgacgc tgtggactgc 840

gctctggacc cactgtctga aaccaagtgc accctgaagt ctttcaccgt ggagaaggga 900

atctaccaga cctctaactt cagagtgcag ccaaccgagt ctatcgtgag attcccaaac 960

atcaccaacc tgtgcccatt cggagaggtg ttcaacgcta ccagattcgc ttctgtgtac 1020

gcttggaaca gaaagagaat ctctaactgc gtggctgact actctgtgct gtacaactct 1080

gcttctttct ctaccttcaa gtgctacgga gtgtctccaa ccaagctgaa cgacctgtgc 1140

ttcaccaacg tgtacgctga ctctttcgtg atcagaggag acgaggtgag acagatcgct 1200

ccaggacaga ccggaaagat cgctgactac aactacaagc tgccagacga cttcaccgga 1260

tgcgtgatcg cttggaactc taacaacctg gactctaagg tgggaggaaa ctacaactac 1320

ctgtacagac tgttcagaaa gtctaacctg aagccattcg agagagacat ctctaccgag 1380

atctaccagg ctggatctac cccatgcaac ggagtggagg gattcaactg ctacttccca 1440

ctgcagtctt acggattcca gccaaccaac ggagtgggat accagccata cagagtggtg 1500

gtgctgtctt tcgagctgct gcacgctcca gctaccgtgt gcggaccaaa gaagtctacc 1560

aacctggtga agaacaagtg cgtgaacttc aacttcaatg gcctcaccgg aaccggagtg 1620

ctgaccgagt ctaacaagaa gttcctgcca ttccagcagt tcggaagaga catcgctgac 1680

accaccgacg ctgtgagaga tccacagacc ctggagatcc tggacatcac cccatgctct 1740

ttcggaggag tgtctgtgat caccccagga accaacacct ctaaccaggt ggctgtgctg 1800

taccaggacg tgaactgcac cgaggtgcca gtggctatcc acgctgacca gctgacccca 1860

acctggagag tgtactctac cggatctaac gtgttccaga ccagagctgg atgcctgatc 1920

ggagctgagc acgtgaacaa ctcttacgag tgcgacatcc caatcggagc tggaatctgc 1980

gcttcttacc agacccagac caactctcca tga 2013

<210> 4

<211> 2117

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gggggtctcg aattcgccac catgtacagg atgcaactcc tgtcttgcat tgcactaagt 60

cttgcacttg tcacgaattc gatatcggcc atgtctcagt gcgtgaacct gaccaccaga 120

acccagctgc caccagctta caccaactct ttcaccagag gagtgtacta cccagacaag 180

gtgttcagat cttctgtgct gcactctacc caggacctgt tcctgccatt cttctctaac 240

gtgacctggt tccacgctat ccacgtgtct ggaaccaacg gaaccaagag attcgacaac 300

ccagtgctgc cattcaacga cggagtgtac ttcgcttcta ccgagaagtc taacatcatc 360

agaggatgga tcttcggtac caccctggac tctaagaccc agtctctgct gatcgtgaac 420

aacgctacca acgtggtgat caaggtgtgc gagttccagt tctgcaacga cccattcctg 480

ggagtgtact accacaagaa caacaagtct tggatggagt ctgagttcag agtgtactct 540

tctgctaaca actgcacctt cgagtacgtg tctcagccat tcctgatgga cctggaggga 600

aagcagggaa acttcaagaa cctgagagag ttcgtgttca agaacatcga cggatacttc 660

aagatctact ctaagcacac cccaatcaac ctggtgagag atctgccaca gggattctct 720

gctctggagc cactggtgga cctgccaatc ggaatcaaca tcaccagatt ccagaccctg 780

ctggctctgc acagatctta cctgacccca ggagactctt cttctggatg gaccgctgga 840

gctgctgctt actacgtggg atacctgcag ccaagaacct tcctgctgaa gtacaacgag 900

aacggaacca tcaccgacgc tgtggactgc gctctggacc cactgtctga aaccaagtgc 960

accctgaagt ctttcaccgt ggagaaggga atctaccaga cctctaactt cagagtgcag 1020

ccaaccgagt ctatcgtgag attcccaaac atcaccaacc tgtgcccatt cggagaggtg 1080

ttcaacgcta ccagattcgc ttctgtgtac gcttggaaca gaaagagaat ctctaactgc 1140

gtggctgact actctgtgct gtacaactct gcttctttct ctaccttcaa gtgctacgga 1200

gtgtctccaa ccaagctgaa cgacctgtgc ttcaccaacg tgtacgctga ctctttcgtg 1260

atcagaggag acgaggtgag acagatcgct ccaggacaga ccggaaagat cgctgactac 1320

aactacaagc tgccagacga cttcaccgga tgcgtgatcg cttggaactc taacaacctg 1380

gactctaagg tgggaggaaa ctacaactac ctgtacagac tgttcagaaa gtctaacctg 1440

aagccattcg agagagacat ctctaccgag atctaccagg ctggatctac cccatgcaac 1500

ggagtggagg gattcaactg ctacttccca ctgcagtctt acggattcca gccaaccaac 1560

ggagtgggat accagccata cagagtggtg gtgctgtctt tcgagctgct gcacgctcca 1620

gctaccgtgt gcggaccaaa gaagtctacc aacctggtga agaacaagtg cgtgaacttc 1680

aacttcaatg gcctcaccgg aaccggagtg ctgaccgagt ctaacaagaa gttcctgcca 1740

ttccagcagt tcggaagaga catcgctgac accaccgacg ctgtgagaga tccacagacc 1800

ctggagatcc tggacatcac cccatgctct ttcggaggag tgtctgtgat caccccagga 1860

accaacacct ctaaccaggt ggctgtgctg taccaggacg tgaactgcac cgaggtgcca 1920

gtggctatcc acgctgacca gctgacccca acctggagag tgtactctac cggatctaac 1980

gtgttccaga ccagagctgg atgcctgatc ggagctgagc acgtgaacaa ctcttacgag 2040

tgcgacatcc caatcggagc tggaatctgc gcttcttacc agacccagac caactctcca 2100

tgagatctga gaccccc 2117

<210> 5

<211> 6680

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60

gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120

actccatcac taggggttcc tgcggccgca cgcgtggagc tagttattaa tagtaatcaa 180

ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa 240

atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg 300

ttcccatagt aacgtcaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt 360

aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg 420

tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc 480

ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc 540

agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca 600

ttgacgtcaa tgggagtttg ttttgcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa 660

caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag 720

cagagctcgt ttagtgaacc gtcagatcgc ctggagacgc catccacgct gttttgacct 780

ccatagaaga caccgggacc gatccagcct ccgcggattc gaatcccggc cgggaacggt 840

gcattggaac gcggattccc cgtgccaaga gtgacgtaag taccgcctat agagtctata 900

ggcccacaaa aaatgctttc ttcttttaat atactttttt gtttatctta tttctaatac 960

tttccctaat ctctttcttt cagggcaata atgatacaat gtatcatgcc tctttgcacc 1020

attctaaaga ataacagtga taatttctgg gttaaggcaa tagcaatatt tctgcatata 1080

aatatttctg catataaatt gtaactgatg taagaggttt catattgcta atagcagcta 1140

caatccagct accattctgc ttttatttta tggttgggat aaggctggat tattctgagt 1200

ccaagctagg cccttttgct aatcatgttc atacctctta tcttcctccc acagctcctg 1260

ggcaacgtgc tggtctgtgt gctggcccat cactttggca aagaattggg attcgaacat 1320

cgattgaatt cgccaccatg tacaggatgc aactcctgtc ttgcattgca ctaagtcttg 1380

cacttgtcac gaattcgata tcggccatgt ctcagtgcgt gaacctgacc accagaaccc 1440

agctgccacc agcttacacc aactctttca ccagaggagt gtactaccca gacaaggtgt 1500

tcagatcttc tgtgctgcac tctacccagg acctgttcct gccattcttc tctaacgtga 1560

cctggttcca cgctatccac gtgtctggaa ccaacggaac caagagattc gacaacccag 1620

tgctgccatt caacgacgga gtgtacttcg cttctaccga gaagtctaac atcatcagag 1680

gatggatctt cggtaccacc ctggactcta agacccagtc tctgctgatc gtgaacaacg 1740

ctaccaacgt ggtgatcaag gtgtgcgagt tccagttctg caacgaccca ttcctgggag 1800

tgtactacca caagaacaac aagtcttgga tggagtctga gttcagagtg tactcttctg 1860

ctaacaactg caccttcgag tacgtgtctc agccattcct gatggacctg gagggaaagc 1920

agggaaactt caagaacctg agagagttcg tgttcaagaa catcgacgga tacttcaaga 1980

tctactctaa gcacacccca atcaacctgg tgagagatct gccacaggga ttctctgctc 2040

tggagccact ggtggacctg ccaatcggaa tcaacatcac cagattccag accctgctgg 2100

ctctgcacag atcttacctg accccaggag actcttcttc tggatggacc gctggagctg 2160

ctgcttacta cgtgggatac ctgcagccaa gaaccttcct gctgaagtac aacgagaacg 2220

gaaccatcac cgacgctgtg gactgcgctc tggacccact gtctgaaacc aagtgcaccc 2280

tgaagtcttt caccgtggag aagggaatct accagacctc taacttcaga gtgcagccaa 2340

ccgagtctat cgtgagattc ccaaacatca ccaacctgtg cccattcgga gaggtgttca 2400

acgctaccag attcgcttct gtgtacgctt ggaacagaaa gagaatctct aactgcgtgg 2460

ctgactactc tgtgctgtac aactctgctt ctttctctac cttcaagtgc tacggagtgt 2520

ctccaaccaa gctgaacgac ctgtgcttca ccaacgtgta cgctgactct ttcgtgatca 2580

gaggagacga ggtgagacag atcgctccag gacagaccgg aaagatcgct gactacaact 2640

acaagctgcc agacgacttc accggatgcg tgatcgcttg gaactctaac aacctggact 2700

ctaaggtggg aggaaactac aactacctgt acagactgtt cagaaagtct aacctgaagc 2760

cattcgagag agacatctct accgagatct accaggctgg atctacccca tgcaacggag 2820

tggagggatt caactgctac ttcccactgc agtcttacgg attccagcca accaacggag 2880

tgggatacca gccatacaga gtggtggtgc tgtctttcga gctgctgcac gctccagcta 2940

ccgtgtgcgg accaaagaag tctaccaacc tggtgaagaa caagtgcgtg aacttcaact 3000

tcaatggcct caccggaacc ggagtgctga ccgagtctaa caagaagttc ctgccattcc 3060

agcagttcgg aagagacatc gctgacacca ccgacgctgt gagagatcca cagaccctgg 3120

agatcctgga catcacccca tgctctttcg gaggagtgtc tgtgatcacc ccaggaacca 3180

acacctctaa ccaggtggct gtgctgtacc aggacgtgaa ctgcaccgag gtgccagtgg 3240

ctatccacgc tgaccagctg accccaacct ggagagtgta ctctaccgga tctaacgtgt 3300

tccagaccag agctggatgc ctgatcggag ctgagcacgt gaacaactct tacgagtgcg 3360

acatcccaat cggagctgga atctgcgctt cttaccagac ccagaccaac tctccatgag 3420

atctacgggt ggcatccctg tgacccctcc ccagtgcctc tcctggccct ggaagttgcc 3480

actccagtgc ccaccagcct tgtcctaata aaattaagtt gcatcatttt gtctgactag 3540

gtgtccttct ataatattat ggggtggagg ggggtggtat ggagcaaggg gcaagttggg 3600

aagacaacct gtagggcctg cggggtctat tgggaaccaa gctggagtgc agtggcacaa 3660

tcttggctca ctgcaatctc cgcctcctgg gttcaagcga ttctcctgcc tcagcctccc 3720

gagttgttgg gattccaggc atgcatgacc aggctcagct aatttttgtt tttttggtag 3780

agacggggtt tcaccatatt ggccaggctg gtctccaact cctaatctca ggtgatctac 3840

ccaccttggc ctcccaaatt gctgggatta caggcgtgaa ccactgctcc cttccctgtc 3900

cttctgattt tgtaggtaac cacgtgcgga ccgagcggcc gcaggaaccc ctagtgatgg 3960

agttggccac tccctctctg cgcgctcgct cgctcactga ggccgggcga ccaaaggtcg 4020

cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agctgcctgc 4080

aggggcgcct gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg cggtatttca caccgcatac 4140

gtcaaagcaa ccatagtacg cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt 4200

tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt 4260

cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc gggggctccc 4320

tttagggttc cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg atttgggtga 4380

tggttcacgt agtgggccat cgccctgata gacggttttt cgccctttga cgttggagtc 4440

cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca aactggaaca acactcaacc ctatctcggg 4500

ctattctttt gatttataag ggattttgcc gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct 4560

gatttaacaa aaatttaacg cgaattttaa caaaatatta acgtttacaa ttttatggtg 4620

cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc cagccccgac acccgccaac 4680

acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt 4740

gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag 4800

acgaaagggc ctcgtgatac gcctattttt ataggttaat gtcatgataa taatggtttc 4860

ttagacgtca ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt 4920

ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata 4980

atattgaaaa aggaagagta tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt 5040

tgcggcattt tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc 5100

tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat 5160

ccttgagagt tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct 5220

atgtggcgcg gtattatccc gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca 5280

ctattctcag aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg 5340

catgacagta agagaattat gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa 5400

cttacttctg acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg 5460

ggatcatgta actcgccttg atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga 5520

cgagcgtgac accacgatgc ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg 5580

cgaactactt actctagctt cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt 5640

tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg 5700

agccggtgag cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc 5760

ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca 5820

gatcgctgag ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc 5880

atatatactt tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat 5940

cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc 6000

agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg 6060

ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct 6120

accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct 6180

tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct 6240

cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg 6300

gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc 6360

gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga 6420

gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg 6480

cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta 6540

tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg 6600

ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg 6660

ctggcctttt gctcacatgt 6680

Claims

1.一种COVID-19病毒预防性疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤二、由SARS-CoV-2-S1的氨基酸序列设计SARS-CoV-2 S1编码基因，所述SARS-CoV-2 S1编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

步骤三、设计IL 12信号肽编码基因，所述IL 12信号肽编码基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示；

步骤四、通过步骤二设计的SARS-CoV-2-S1编码基因和步骤三设计的IL 12信号肽编码基因合成IL 12ss-SARS-CoV-2 S1编码基因，所述IL 12ss-SARS-CoV-2 S1编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

步骤五、根据步骤四的IL 12ss-SARS-CoV-2 S1编码基因合成全序列，之后克隆于载体中，然后构建质粒pAAV-SARS-CoV-2 S1，所述pAAV-SARS-CoV-2-S1的序列如SEQ ID NO.5所示；

步骤六、提取重组腺相关病毒辅助质粒，将辅助质粒和pAAV-SARS-CoV-2-S1混匀后加入到无血清培养基中，之后将转染剂加入到无血清培养基中，转染剂、辅助质粒和pAAV-SARS-CoV-2-S1混匀后加入到装有细胞培养基的容器中继续培养，收集细胞后离心，去除上清液后重悬细胞沉淀，之后反复冻融再次离心并收集上清液，即为粗制COVID-19病毒预防性疫苗；

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所的步骤五包括根据步骤四的IL12ss-SARS-CoV-2 S1编码基因合成全序列，之后克隆于PUC57载体中，记为质粒pUC57S1，对质粒pUC57S1进行BsaI酶切并切胶回收，之后溶于去离子水中，得混合物Ⅰ；对pAAV-MCS进行EcoRI-BglII双酶切并切胶回收，之后溶于去离子水中，得混合物Ⅱ，将混合物Ⅰ和混合物Ⅱ放于同一个离心管中，加入T4 DNA Ligase缓冲液、T4 DNA Ligase、去离子水，之后转化DH5α感受态细胞，涂布含氨苄青霉素的LB平板，挑取单克隆于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，培养结束后，提取质粒DNA，PCR鉴定获得pAAV-SARS-CoV-2-S1。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：对质粒pUC57S1进行BsaI酶切，切胶回收2kb片段。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：对质粒pUC57S1进行BsaI酶切并切胶回收后溶于50μL去离子水中，得混合物Ⅰ；对pAAV-MCS进行EcoRI-BglII双酶切并切胶回收，之后溶于50μL去离子水中，得混合物Ⅱ，将混合物Ⅰ和混合物Ⅱ各取5μL放于同一个1.5mL的离心管中，加入2μL T4 DNA Ligase缓冲液、0.5μL T4 DNA Ligase，7.5μL去离子水，于16℃连接1h，转化DH5α感受态细胞，涂布含氨苄青霉素的LB平板，15h后挑取单克隆于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃、200RPM培养15h，提取质粒DNA，PCR鉴定获得pAAV-SARS-CoV-2-S1。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤六中所述的辅助质粒包括质粒pHelper和质粒P5E18RXC1。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的步骤六包括转染传代细胞于多个培养瓶中，将质粒pHelper、质粒P5E18RXC1及质粒PAAV-SARS-CoV-2-S1各30μg混匀加到500μL无血清培养基中，取160μL转染试剂加到500μL无血清培养基中，将质粒pHelper、质粒P5E18RXC1、质粒PAAV-SARS-CoV-2-S1和转染试剂混匀后加入到培养瓶的传代细胞中，置于温度为37℃、体积百分比浓度为5％的CO₂继续培养。转染后72小时，用细胞刮将细胞刮下，1000rpm离心5min，弃上清，用4ml无菌PBS重悬细胞沉淀；-80℃和37℃反复冻融3次，3000rpm取上清，获得粗制COVID-19病毒预防性疫苗。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的步骤七包括将步骤六制备的粗制COVID-19病毒预防性疫苗用10mM Tris-HCl缓冲液稀释至10ml，然后在39ml超速离心管中加入碘克沙醇，在温度为4℃、离心力为40000×g的环境下离心1小时，收集4ml的40％下层组分和1ml的60％上层组分，即获得所述的COVID-19病毒预防性疫苗。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的步骤七还包括将COVID-19病毒预防性疫苗用50kDa超滤管超滤置换病毒保存液。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：所述病毒保存液为pH值7.4的PBS磷酸缓冲液。

10.一种由权利要求1-9中任一项所述方法制备的COVID-19病毒预防性疫苗。