CN109316464B

CN109316464B - 包含胰岛样细胞团的制剂

Info

Publication number: CN109316464B
Application number: CN201811295075.1A
Authority: CN
Inventors: 王立坚; 赵钢; 王竑婷
Original assignee: Changchun Wan Cheng Bio Electron Co ltd
Current assignee: Changchun Wan Cheng Bio Electron Co ltd
Priority date: 2018-11-01
Filing date: 2018-11-01
Publication date: 2020-12-11
Anticipated expiration: 2038-11-01
Also published as: CN109316464A

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及包含胰岛样细胞团的制剂。本发明提供了包含胰岛样细胞团的制剂及其制备方法，该制剂可降解，在显微镜下可见微球形态完整，粒径分布均匀。将该微球在体外培养，可发现微囊内干细胞扩增，并开始逐渐形成胚体类组织形态，同时进行检测，可在囊体外培养基检测到Pdx‑1‑Linker‑IGF‑1和胰岛素存在，证明该细胞逐渐向类胰腺组织演变并可以释放胰岛素，其最终可用于体内移植修复胰岛功能。

Description

包含胰岛样细胞团的制剂

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及包含胰岛样细胞团的制剂。

背景技术

糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)是一组以高血糖为特征的代谢性疾病。高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有引起。糖尿病时长期存在的高血糖，导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。

据世界卫生组织推荐的分型，可将糖尿病分为以胰岛素绝对不足为主的I型糖尿病和以胰岛素相对不足且胰岛素抵抗为主的II型糖尿病两种类型。其中，约10％的患者属于I型糖尿病，遗传因素在该型糖尿病中的重要性高达50％，发病常见于儿童和青少年人群。另外，90％的患者属于II型糖尿病，是一种多基因遗传因素、环境因素联合作用引起的代谢性疾病，具有很高的遗传倾向，多见于40岁以上的成年患者。

目前在糖尿病的临床治疗上，通过注射胰岛素来控制血糖虽然是一种有效的缓解措施，但并不能彻底治愈糖尿病，还有可能造成低血糖等风。真正根治糖尿病将是恢复机体内功能性胰岛β细胞的数量和消除糖尿病引发的各种并发症。其中，进行胰岛移植是治疗I型糖尿病和部分II型糖尿病最有效的方法之一。但是，由于供体来源严重不足以及器官移植将面临终身免疫抑制治疗等问题，极大地限制了胰岛移植在临床治疗上的广泛应用。

近年来，由干细胞体外定向诱导分化成胰腺祖细胞和功能性胰岛来进行移植，为我们提供了一个全新的细胞替代疗法。但是，目前细胞在体内的修复效果欠佳，尚无法满足临床的应用。因此，应进一步研究，提高胰岛样细胞团在体内的。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供包含胰岛样细胞团的制剂，该制剂具有良好的体内移植修复胰岛的功能。

本发明提供了包含胰岛样细胞团的制剂的制备方法，包括：

步骤1：将壳聚糖溶解于乙酸溶液，灭菌制得壳聚糖溶液；将胶原蛋白溶解于乙酸溶液，灭菌制得胶原蛋白溶液；

步骤2：将壳聚糖溶液与胶原蛋白溶液混合，以京尼平为交联剂进行交联制得降解材料；

步骤3：将降解材料与胰岛样细胞团混合，然后与含有乳化剂的植物油混合，加入固化剂于0～4℃搅拌2～5min，然后升温至35～40℃固化20～30min，制得所述制剂。

本发明实施例中，所述壳聚糖为90％脱乙酰化的低分子量壳聚糖。

本发明实施例中，所述壳聚糖溶液中，乙酸的质量分数为1％，壳聚糖的质量分数为1％。

本发明实施例中，所述壳聚糖溶液的灭菌为高温灭菌，120℃灭菌20min。

本发明实施例中，所述胶原蛋白为I型胶原蛋白。

本发明实施例中，所述胶原蛋白溶液中，乙酸的质量分数为1％，胶原蛋白的质量分数为3％。

本发明实施例中，所述胶原蛋白溶液的灭菌为高温灭菌，120℃灭菌20min。

本发明实施例中，步骤2中所述壳聚糖溶液与胶原蛋白溶液的体积比为1:1。

本发明实施例中，所述京尼平与壳聚糖溶液的质量-体积比为1g:100mL；所述交联的条件为常温反应1小时。

本发明实施例中，步骤3中所述胰岛样细胞团在降解材料中的密度为1×10⁶cell/mL。

本发明实施例中，所述乳化剂为Span80，在植物油中的质量分数为15％。

本发明实施例中，所述固化剂为京尼平，在植物油中的质量分数为1％。

本发明实施例中，加入固化剂后，0℃搅拌3min，然后升温至37℃固化25min。

本发明实施例中，所述固化后还包括离心取沉淀、生理盐水清洗的步骤。

一些实施例中，所述离心的条件为200g，5min。

一些实施例中，所述生理盐水清洗的次数为3次。

本发明实施例中，所述胰岛样细胞团由骨髓干细胞诱导分化制得。

本发明实施例中，所述骨髓干细胞为表达融合蛋白Pdx-1-Linker-IGF-1的骨髓干细胞；所述诱导分化的培养基为含有30mmol/L葡萄糖和10mmol/LC肽的完全培养基。

表达融合蛋白Pdx-1-Linker-IGF-1的骨髓干细胞的制备方法，其以慢病毒感染骨髓干细胞获得。所述慢病毒由含有表达融合蛋白Pdx-1-Linker-IGF-1的DNA分子的质粒载体与慢病毒包装质粒共转染293T细胞构建获得。

所述慢病毒包装质粒为pMD2G(表达VSV G包膜蛋白)和pCMVR8.74(表达HIV-1Gag,Pol,Tat and Rev蛋白)。所述共转染采用CaCl₂转染。

所述慢病毒的制备方法为：将293T细胞与本发明所述的质粒载体和pMD2G、pCMVR8.74质粒混合，以含有CaCl₂的HeBS缓冲液，37℃，5％CO₂培养后收集上清液，经过滤、离心收集病毒。

所述感染为：将病毒悬液和完全培养基混合后加入含有干细胞的培养皿中，37℃孵育。4小时后，再加入一定量的完全培养基，37℃孵育，继续培养24小时，用新鲜培养基替换含有病毒的培养基，继续培养获得所述干细胞。

本发明制备方法制得的包含胰岛样细胞团的制剂。

本发明制备方法制得的包含胰岛样细胞团的制剂在制备治疗糖尿病的药物中的应用。

本发明还提供了一种糖尿病的制备方法，其为给予本发明提供的包含胰岛样细胞团的制剂。

本发明提供了包含胰岛样细胞团的制剂及其制备方法，该制剂可降解，在显微镜下可见微球形态完整，粒径分布均匀。将该微球在体外培养，可发现微囊内干细胞扩增，并开始逐渐形成胚体类组织形态，同时进行检测，可在囊体外培养基检测到Pdx-1-Linker-IGF-1和胰岛素存在，证明该细胞逐渐向类胰腺组织演变并可以释放胰岛素，其最终可用于体内移植修复胰岛功能。

附图说明

图1示微球的显微镜检测结果；

图2示10天内胰岛素分泌量检测结果；

图3示10天干细胞转化效率结果；

图4示10天干细胞成团效率结果；

图5示10天干细胞成团的组织形态。

具体实施方式

本发明提供了包含胰岛样细胞团的制剂，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

1、质粒制备：

人工合成SEQ ID NO:2所示的DNA片段，以BamH I，Sal I，酶切位点BamH I：G^GATCC，4021，Sal I：G^TCGAC，4049位点连接入载体pRRLSIN.cPPT.PGK-WPRE，构建获得表达融合蛋白Pdx-1-Linker-IGF-1的质粒载体(全序列如SEQ ID NO:3所示)。

2、病毒制备：

A：293T细胞使用含10％FBS，+penicillin-streptomycin抗生素的DMEM培养基(完全培养基)进行培养，按15ml培养皿为例，加入8×10⁶细胞，22.5ml完全培养基，37℃，5％CO₂进行培养。B：过夜培养后，更换为无血清培养基DMEM。C：按一定比例将3个质粒(pMD2G、pCMVR8.74、pRRLSIN.cPPT.PGK-WPRE-Pdx-1-Linker-IGF-1)进行混合，缓冲液为HeBS。D：转染方法采用CaCl₂转染方案，将CaCl₂按一定比例和含有3质粒的HeBS缓冲液混合，充分混匀后，加入到293T培养皿中，37℃，5％CO₂进行培养。E：过夜培养后，将培养基吸出，重新更换完全培养基继续培养，37℃，5％CO₂进行培养。F：培养24小时后，轻轻的吸尘细胞培养基，4℃保存，再更换新鲜完全培养基。G：培养24小时后，轻轻的吸出细胞培养基，4℃保存。H：将两次收集到的细胞培养上清，通过0.45um滤膜进行过滤，去除杂质，4℃保存。I：将过滤后的培养上清，移入离心管中，25000转，4℃，离心120分钟，离心后去除上清，沉淀即为病毒，用PBS重悬，-80℃保存。

3、细胞转染：

离心提取骨髓组织的MNC(单核细胞)，PBS清洗后，将细胞悬浮在8-10ml生理盐水(2.2-3.8×10⁸cells)。使用完全培养基：含10％FBS(胎牛血清)的干细胞培养基(北京达科为生物技术有限公司：Mesenchymal Stem Cell Basal Medium(MSCBM)，人间充质干细胞基础培养基)，加青大霉素和青霉素，37度，5％CO₂的条件下进行贴壁培养，扩增传代2次后，细胞扩增效率平稳并且活率达到98％时，用于细胞转染。

4、干细胞感染：

将培养好的干细胞重新贴壁培养，加完全培养基，过夜培养，第二天将培养基吸出，将一定量的病毒悬液和完全培养基混合后加入培养皿中，37℃孵育。4小时后，再加入一定量的完全培养基，37℃孵育，继续培养24小时，用新鲜完全培养基替换含有病毒的培养基，继续培养10d，获得胰岛样细胞团。

实施例2

把90％脱乙酰化的低分子量的壳聚糖溶解于1％醋酸中，得到最终2％比重的溶液；120℃灭菌处理20分钟。

取1型胶原蛋白，溶解在乙酸1％中得到4％比重溶液，120℃灭菌处理20分钟。

按照1:1体积比混合壳聚糖溶液和胶原蛋白溶液，采用京尼平作为交联剂，促使壳聚糖和胶原蛋白发生交联反应，制得可降解材料，交联条件为室温(18～30℃)反应1小时。

以1×10⁶cell/ml的浓度在可降解材料后中加入实施例1制得的胰岛样细胞团4℃下混合均匀，加入0℃的含有15％Span80的无菌植物油中，然后保持0℃加入固化剂京尼平，充分搅拌3分钟。

再将温度升高至室温，反应60min，充分固化后，形成包含分泌胰岛细胞的壳聚糖/胶原的微球。最后进行离心(200g，5分钟)，提取沉淀(细胞微球)，再用生理盐水清洗三次，离心沉淀后将微球悬浮于生理盐水中，显微镜下观察，结果如图1。

对比例1

Pdx-1-Linker-IGF-1融合蛋白表达

利用Pet32表达系统，采用大肠杆菌BL21进行Pdx-1-Linker-IGF-1融合蛋白表达，并利用分子筛进行纯化，纯化后的蛋白在-80度冷冻保存，用于后期实验。

将大肠杆菌表达外源Pdx-1-Linker-IGF-1融合蛋白(浓度为100pg/ml)每两天更换培养基并同时补充Pdx-1-Linker-IGF-1融合蛋白，连续培养10天，获得胰岛样细胞团。将该细胞团按照实施例2的方法制备包含分泌胰岛细胞的壳聚糖/胶原的微球。

对比例2

Pdx-1-Linker-IGF-1融合蛋白表达

将大肠杆菌表达外源Pdx-1-Linker-IGF-1融合蛋白(浓度为100pg/ml)每两天更换培养基并同时补充Pdx-1-Linker-IGF-1融合蛋白，连续培养5天后，继续培养同时，只加入培养基，不添加Pdx-1-Linker-IGF-1融合蛋白，继续培养5天，获得胰岛样细胞团。将该细胞团按照实施例2的方法制备包含分泌胰岛细胞的壳聚糖/胶原的微球。

效果验证

对实施例2(MSCT组)、对比例1(MSC-1)和对比例2(MSC-2)制得的微球进行检测。

1、胰岛素分泌量鉴定

将实施例2(MSCT组)、对比例1(MSC-1)和对比例2(MSC-2)制得的微球，在培养期间，每隔两天提取一次微球，大约为总量的5％，进行双硫腙检测以及显微镜下检测，同时每天提取培养基进行胰岛素分泌鉴定。结果如图2～4。

MSC-1组微球的测量结果显示，10天培养过程中，胰岛素分泌量持续升高，最终达到65±20pg/ml，但是双硫腙染色实验表明，转化效率没用明显提高同时成团效果保持不变。MSC-2组微球组，在前五天的检测中表明胰岛素分泌量持续提高可到达59±17pg/ml左右，但是停止加入Pdx-1-Linker-IGF-1融合蛋白后，分泌量无明显变化：57±17pg/ml，同时10天的检测结果表明转化率和成团率基本无差别。MSCT微球组，10天的检测结果显示，胰岛素分泌量升高明显：85±15pg/ml左右，同时双硫腙染色实验表明其转化率和成团效果也明显提高：75％±5％，80％±12％。因此拥有内源表达的干细胞具有更强的转化效率和胰岛素分泌能力，在外源蛋白停止加入后，干细胞的诱导进程停止，表明内源表达的融合蛋白相对外源具有非常强的活性，并对促进干细胞的转化具有更好的效用。

2、利用MSCT组的细胞制备出载有干细胞的微球，提取总量相当于1×10⁷细胞总量制备的微球，加含有葡萄糖(浓度为30mmol/L)的完全培养基，进行培养，培养24小时，提取培养上清液，检测胰岛素和Pdx-1-Linker-IGF-1融合蛋白分泌效果，检测合格标准为胰岛素：95±22pg/ml，Pdx-1-Linker-IGF-1融合蛋白50±10pg/ml，如检测分泌效果未达标，则视为微球制备失败，需要重新制备。

3、对MSCT组的微球，在微球检测合格后，继续培养10d并观察，在显微镜下观察，可发现微囊内干细胞扩增，并开始逐渐形成胚体类组织形态(如图5)，同时进行检测，可在囊体外培养基发现Pdx-1-Linker-IGF-1和胰岛素，说明细胞逐渐向类胰腺组织演变并可以释放胰岛素，其最终可用于体内移植修复胰岛功能。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 长春万成生物电子工程有限公司

<120> 包含胰岛样细胞团的制剂

<130> MP1806682

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 463

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Asn Gly Glu Glu Gln Tyr Tyr Ala Ala Thr Gln Leu Tyr Lys Asp

1 5 10 15

Pro Cys Ala Phe Gln Arg Gly Pro Ala Pro Glu Phe Ser Ala Ser Pro

20 25 30

Pro Ala Cys Leu Tyr Met Gly Arg Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro His

35 40 45

Pro Phe Pro Gly Ala Leu Gly Ala Leu Glu Gln Gly Ser Pro Pro Asp

50 55 60

Ile Ser Pro Tyr Glu Val Pro Pro Leu Ala Asp Asp Pro Ala Val Ala

65 70 75 80

His Leu His His His Leu Pro Ala Gln Leu Ala Leu Pro His Pro Pro

85 90 95

Ala Gly Pro Phe Pro Glu Gly Ala Glu Pro Gly Val Leu Glu Glu Pro

100 105 110

Asn Arg Val Gln Leu Pro Phe Pro Trp Met Lys Ser Thr Lys Ala His

115 120 125

Ala Trp Lys Gly Gln Trp Ala Gly Gly Ala Tyr Ala Ala Glu Pro Glu

130 135 140

Glu Asn Lys Arg Thr Arg Thr Ala Tyr Thr Arg Ala Gln Leu Leu Glu

145 150 155 160

Leu Glu Lys Glu Phe Leu Phe Asn Lys Tyr Ile Ser Arg Pro Arg Arg

165 170 175

Val Glu Leu Ala Val Met Leu Asn Leu Thr Glu Arg His Ile Lys Ile

180 185 190

Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Glu Glu Asp Lys Lys

195 200 205

Arg Gly Gly Gly Thr Ala Val Gly Gly Gly Gly Val Ala Glu Pro Glu

210 215 220

Gln Asp Cys Ala Val Thr Ser Gly Glu Glu Leu Leu Ala Leu Pro Pro

225 230 235 240

Pro Pro Pro Pro Gly Gly Ala Val Pro Pro Ala Ala Pro Val Ala Ala

245 250 255

Arg Glu Gly Arg Leu Pro Pro Gly Leu Ser Ala Ser Pro Gln Pro Ser

260 265 270

Ser Val Ala Pro Arg Arg Pro Gln Glu Pro Arg Gly Gly Gly Gly Ser

275 280 285

Gly Gly Gly Gly Ser Met Cys Gln Ser Pro Glu Ser His Val Glu Lys

290 295 300

Lys Lys Lys Lys Lys Phe Lys Val Gln Val Ile Ser Thr Thr Pro Gly

305 310 315 320

Lys Pro Gly Leu Glu Ser Ser Leu Gly Lys Glu Val Lys Met His Thr

325 330 335

Met Ser Ser Ser His Leu Phe Tyr Leu Ala Leu Cys Leu Leu Thr Phe

340 345 350

Thr Ser Ser Ala Thr Ala Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu

355 360 365

Val Asp Ala Leu Gln Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn

370 375 380

Lys Pro Thr Gly Tyr Gly Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly

385 390 395 400

Ile Val Asp Glu Cys Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu

405 410 415

Met Tyr Cys Ala Pro Leu Lys Pro Ala Lys Ser Ala Arg Ser Val Arg

420 425 430

Ala Gln Arg His Thr Asp Met Pro Lys Thr Gln Lys Glu Val His Leu

435 440 445

Lys Asn Ala Ser Arg Gly Ser Ala Gly Asn Lys Asn Tyr Arg Met

450 455 460

<210> 2

<211> 1392

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaacggcg aggagcagta ctacgcggcc acgcagcttt acaaggaccc atgcgcgttc 60

cagcgaggcc cggcgccgga gttcagcgcc agcccccctg cgtgcctgta catgggccgc 120

cagcccccgc cgccgccgcc gcacccgttc cctggcgccc tgggcgcgct ggagcagggc 180

agccccccgg acatctcccc gtacgaggtg ccccccctcg ccgacgaccc cgcggtggcg 240

caccttcacc accacctccc ggctcagctc gcgctccccc acccgcccgc cgggcccttc 300

ccggagggag ccgagccggg cgtcctggag gagcccaacc gcgtccagct gcctttccca 360

tggatgaagt ctaccaaagc tcacgcgtgg aaaggccagt gggcaggcgg cgcctacgct 420

gcggagccgg aggagaacaa gcggacgcgc acggcctaca cgcgcgcaca gctgctagag 480

ctggagaagg agttcctatt caacaagtac atctcacggc cgcgccgggt ggagctggct 540

gtcatgttga acttgaccga gagacacatc aagatctggt tccaaaaccg ccgcatgaag 600

tggaaaaagg aggaggacaa gaagcgcggc ggcgggacag ctgtcggggg tggcggggtc 660

gcggagcctg agcaggactg cgccgtgacc tccggcgagg agcttctggc gctgccgccg 720

ccgccgcccc ccggaggtgc tgtgccgccc gctgcccccg ttgccgcccg agagggccgc 780

ctgccgcctg gccttagcgc gtcgccacag ccctccagcg tcgcgcctcg gcggccgcag 840

gaaccacgag gtggcggagg gagtgggggt ggaggctcta tgtgtcagtc ccctgagagt 900

catgtggaaa aaaaaaaaaa gaaaaaattc aaggtccagg ttatttccac cactcctggg 960

aaaccaggcc tggagagctc tctagggaaa gaggtgaaga tgcacaccat gtcctcctcg 1020

catctcttct acctggcgct gtgcctgctc accttcacca gctctgccac ggctggaccg 1080

gagacgctct gcggggctga gctggtggat gctcttcagt tcgtgtgtgg agacaggggc 1140

ttttatttca acaagcccac agggtatggc tccagcagtc ggagggcgcc tcagacaggc 1200

atcgtggatg agtgctgctt ccggagctgt gatctaagga ggctggagat gtattgcgca 1260

cccctcaagc ctgccaagtc agctcgctct gtccgtgccc agcgccacac cgacatgccc 1320

aagacccaga aggaagtaca tttgaagaac gcaagtagag ggagtgcagg aaacaagaac 1380

tacaggatgt ag 1392

<210> 3

<211> 8060

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agcttaatgt agtcttatgc aatactcttg tagtcttgca acatggtaac gatgagttag 60

caacatgcct tacaaggaga gaaaaagcac cgtgcatgcc gattggtgga agtaaggtgg 120

tacgatcgtg ccttattagg aaggcaacag acgggtctga catggattgg acgaaccact 180

gaattgccgc attgcagaga tattgtattt aagtgcctag ctcgatacat aaacgggtct 240

ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct aactagggaa cccactgctt 300

aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct gttgtgtgac 360

tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagtggc 420

gcccgaacag ggacttgaaa gcgaaaggga aaccagagga gctctctcga cgcaggactc 480

ggcttgctga agcgcgcacg gcaagaggcg aggggcggcg actggtgagt acgccaaaaa 540

ttttgactag cggaggctag aaggagagag atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg 600

ggagaattag atcgcgatgg gaaaaaattc ggttaaggcc agggggaaag aaaaaatata 660

aattaaaaca tatagtatgg gcaagcaggg agctagaacg attcgcagtt aatcctggcc 720

tgttagaaac atcagaaggc tgtagacaaa tactgggaca gctacaacca tcccttcaga 780

caggatcaga agaacttaga tcattatata atacagtagc aaccctctat tgtgtgcatc 840

aaaggataga gataaaagac accaaggaag ctttagacaa gatagaggaa gagcaaaaca 900

aaagtaagac caccgcacag caagcggccg ctgatcttca gacctggagg aggagatatg 960

agggacaatt ggagaagtga attatataaa tataaagtag taaaaattga accattagga 1020

gtagcaccca ccaaggcaaa gagaagagtg gtgcagagag aaaaaagagc agtgggaata 1080

ggagctttgt tccttgggtt cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcgtcaatg 1140

acgctgacgg tacaggccag acaattattg tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg 1200

ctgagggcta ttgaggcgca acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag 1260

ctccaggcaa gaatcctggc tgtggaaaga tacctaaagg atcaacagct cctggggatt 1320

tggggttgct ctggaaaact catttgcacc actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt 1380

aataaatctc tggaacagat ttggaatcac acgacctgga tggagtggga cagagaaatt 1440

aacaattaca caagcttaat acactcctta attgaagaat cgcaaaacca gcaagaaaag 1500

aatgaacaag aattattgga attagataaa tgggcaagtt tgtggaattg gtttaacata 1560

acaaattggc tgtggtatat aaaattattc ataatgatag taggaggctt ggtaggttta 1620

agaatagttt ttgctgtact ttctatagtg aatagagtta ggcagggata ttcaccatta 1680

tcgtttcaga cccacctccc aaccccgagg ggacccgaca ggcccgaagg aatagaagaa 1740

gaaggtggag agagagacag agacagatcc attcgattag tgaacggatc tcgacggtat 1800

cggttaactt ttaaaagaaa aggggggatt ggggggtaca gtgcagggga aagaatagta 1860

gacataatag caacagacat acaaactaaa gaattacaaa aacaaattac aaaaattcaa 1920

aattttatcg atcacgagac tagcctcgag aagcttgata tcgaattcca cggggttggg 1980

gttgcgcctt ttccaaggca gccctgggtt tgcgcaggga cgcggctgct ctgggcgtgg 2040

ttccgggaaa cgcagcggcg ccgaccctgg gtctcgcaca ttcttcacgt ccgttcgcag 2100

cgtcacccgg atcttcgccg ctacccttgt gggccccccg gcgacgcttc ctgctccgcc 2160

cctaagtcgg gaaggttcct tgcggttcgc ggcgtgccgg acgtgacaaa cggaagccgc 2220

acgtctcact agtaccctcg cagacggaca gcgccaggga gcaatggcag cgcgccgacc 2280

gcgatgggct gtggccaata gcggctgctc agcagggcgc gccgagagca gcggccggga 2340

aggggcggtg cgggaggcgg ggtgtggggc ggtagtgtgg gccctgttcc tgcccgcgcg 2400

gtgttccgca ttctgcaagc ctccggagcg cacgtcggca gtcggctccc tcgttgaccg 2460

aatcaccgac ctctctcccc agggggatcc accggtcgcc accatgaacg gcgaggagca 2520

gtactacgcg gccacgcagc tttacaagga cccatgcgcg ttccagcgag gcccggcgcc 2580

ggagttcagc gccagccccc ctgcgtgcct gtacatgggc cgccagcccc cgccgccgcc 2640

gccgcacccg ttccctggcg ccctgggcgc gctggagcag ggcagccccc cggacatctc 2700

cccgtacgag gtgccccccc tcgccgacga ccccgcggtg gcgcaccttc accaccacct 2760

cccggctcag ctcgcgctcc cccacccgcc cgccgggccc ttcccggagg gagccgagcc 2820

gggcgtcctg gaggagccca accgcgtcca gctgcctttc ccatggatga agtctaccaa 2880

agctcacgcg tggaaaggcc agtgggcagg cggcgcctac gctgcggagc cggaggagaa 2940

caagcggacg cgcacggcct acacgcgcgc acagctgcta gagctggaga aggagttcct 3000

attcaacaag tacatctcac ggccgcgccg ggtggagctg gctgtcatgt tgaacttgac 3060

cgagagacac atcaagatct ggttccaaaa ccgccgcatg aagtggaaaa aggaggagga 3120

caagaagcgc ggcggcggga cagctgtcgg gggtggcggg gtcgcggagc ctgagcagga 3180

ctgcgccgtg acctccggcg aggagcttct ggcgctgccg ccgccgccgc cccccggagg 3240

tgctgtgccg cccgctgccc ccgttgccgc ccgagagggc cgcctgccgc ctggccttag 3300

cgcgtcgcca cagccctcca gcgtcgcgcc tcggcggccg caggaaccac gaggtggcgg 3360

agggagtggg ggtggaggct ctatgtgtca gtcccctgag agtcatgtgg aaaaaaaaaa 3420

aaagaaaaaa ttcaaggtcc aggttatttc caccactcct gggaaaccag gcctggagag 3480

ctctctaggg aaagaggtga agatgcacac catgtcctcc tcgcatctct tctacctggc 3540

gctgtgcctg ctcaccttca ccagctctgc cacggctgga ccggagacgc tctgcggggc 3600

tgagctggtg gatgctcttc agttcgtgtg tggagacagg ggcttttatt tcaacaagcc 3660

cacagggtat ggctccagca gtcggagggc gcctcagaca ggcatcgtgg atgagtgctg 3720

cttccggagc tgtgatctaa ggaggctgga gatgtattgc gcacccctca agcctgccaa 3780

gtcagctcgc tctgtccgtg cccagcgcca caccgacatg cccaagaccc agaaggaagt 3840

acatttgaag aacgcaagta gagggagtgc aggaaacaag aactacagga tgtagagcgg 3900

ccgcgtcgac aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa 3960

ctatgttgct ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat 4020

tgcttcccgt atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta 4080

tgaggagttg tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc 4140

aacccccact ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt 4200

ccccctccct attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg 4260

ggctcggctg ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc 4320

atggctgctc gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 4380

ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 4440

tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc 4500

tggaattcga gctcggtacc tttaagacca atgacttaca aggcagctgt agatcttagc 4560

cactttttaa aagaaaaggg gggactggaa gggctaattc actcccaacg aagacaagat 4620

ctgctttttg cttgtactgg gtctctctgg ttagaccaga tctgagcctg ggagctctct 4680

ggctaactag ggaacccact gcttaagcct caataaagct tgccttgagt gcttcaagta 4740

gtgtgtgccc gtctgttgtg tgactctggt aactagagat ccctcagacc cttttagtca 4800

gtgtggaaaa tctctagcag tagtagttca tgtcatctta ttattcagta tttataactt 4860

gcaaagaaat gaatatcaga gagtgagagg aacttgttta ttgcagctta taatggttac 4920

aaataaagca atagcatcac aaatttcaca aataaagcat ttttttcact gcattctagt 4980

tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct tatcatgtct ggctctagct atcccgcccc 5040

taactccgcc catcccgccc ctaactccgc ccagttccgc ccattctccg ccccatggct 5100

gactaatttt ttttatttat gcagaggccg aggccgcctc ggcctctgag ctattccaga 5160

agtagtgagg aggctttttt ggaggcctag ggacgtaccc aattcgccct atagtgagtc 5220

gtattacgcg cgctcactgg ccgtcgtttt acaacgtcgt gactgggaaa accctggcgt 5280

tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc ccctttcgcc agctggcgta atagcgaaga 5340

ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg aatggcgaat gggacgcgcc 5400

ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact 5460

tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc 5520

cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat ttagtgcttt 5580

acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc 5640

ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt 5700

gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt tataagggat 5760

tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa 5820

ttttaacaaa atattaacgc ttacaattta ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga 5880

acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa 5940

ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta tgagtattca acatttccgt 6000

gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg 6060

ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg 6120

gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg 6180

agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc gtattgacgc cgggcaagag 6240

caactcggtc gccgcataca ctattctcag aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca 6300

gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta agagaattat gcagtgctgc cataaccatg 6360

agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc 6420

gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta actcgccttg atcgttggga accggagctg 6480

aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc ctgtagcaat ggcaacaacg 6540

ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt actctagctt cccggcaaca attaatagac 6600

tggatggagg cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg 6660

tttattgctg ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg 6720

gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag tcaggcaact 6780

atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa 6840

ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt taaaacttca tttttaattt 6900

aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag 6960

ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct 7020

ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt 7080

tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg 7140

cagataccaa atactgttct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct 7200

gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc 7260

gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg 7320

tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa 7380

ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg 7440

gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg 7500

ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga 7560

tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt 7620

ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct 7680

gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga 7740

acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag agcgcccaat acgcaaaccg 7800

cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc acgacaggtt tcccgactgg 7860

aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc tcactcatta ggcaccccag 7920

gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt 7980

cacacaggaa acagctatga ccatgattac gccaagcgcg caattaaccc tcactaaagg 8040

gaacaaaagc tggagctgca 8060

Claims

1.包含胰岛样细胞团的制剂的制备方法，包括：

步骤3：将降解材料与胰岛样细胞团混合，然后与含有乳化剂的植物油混合，加入固化剂于0～4℃搅拌2～5min，然后升温至35～40℃固化20～30min，制得所述制剂；

所述胰岛样细胞团由骨髓干细胞诱导分化制得；所述骨髓干细胞为表达融合蛋白Pdx-1-Linker-IGF-1的骨髓干细胞；所述诱导分化的培养基为含有30mmol/L葡萄糖和10mmol/LC肽的完全培养基。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，

所述壳聚糖为90％脱乙酰化的低分子量壳聚糖；

所述壳聚糖溶液中，乙酸的质量分数为1％，壳聚糖的质量分数为1％；

所述胶原蛋白为I型胶原蛋白；

所述胶原蛋白溶液中，乙酸的质量分数为1％，胶原蛋白的质量分数为3％。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤2中所述壳聚糖溶液与胶原蛋白溶液的体积比为1:1。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述京尼平与壳聚糖溶液的质量-体积比为1g:100mL；所述交联的条件为室温反应1小时。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3中所述胰岛样细胞团在降解材料中的密度为1×10⁶cell/mL。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，

所述乳化剂为Span80，在植物油中的质量分数为15％；

所述固化剂为京尼平，在植物油中的质量分数为1％。

7.由权利要求1～6任一项所述制备方法制得的包含胰岛样细胞团的制剂。

8.权利要求1～6任一项所述制备方法制得的包含胰岛样细胞团的制剂在制备治疗糖尿病的药物中的应用。