KR20150025898A - 효모에 내산성을 부여하는 폴리펩티드, 그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 그 양이 증가되어 있는 효모 세포, 상기 효모 세포를 이용한 산물의 생산 방법 및 내산성 효모 세포를 생산하는 방법 - Google Patents

Abstract

효모에 내산성을 부여하는 폴리펩티드, 그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 그 양이 증가되어 있는 효모 세포, 상기 효모 세포를 이용한 산물의 생산 방법 및 내산성 효모 세포를 생산하는 방법을 제공한다.

Description

효모에 내산성을 부여하는 폴리펩티드, 그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 그 양이 증가되어 있는 효모 세포, 상기 효모 세포를 이용한 산물의 생산 방법 및 내산성 효모 세포를 생산하는 방법{A polypeptide confering acid tolerant property to a yeast cell, polynucleotide encoding the same, a yeast cell having increased amount of the polypeptide, a method of producing a product using the yeast cell and a method of producing acid tolerant yeast cell}

효모에 내산성을 부여하는 폴리펩티드, 그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 그 양이 증가되어 있는 효모 세포, 상기 효모 세포를 이용한 산물의 생산 방법 및 내산성 효모 세포를 생산하는 방법에 관한 것이다.

유기산은 산업적으로 널리 이용된다. 예를 들면, 락테이트는 식품, 제약, 화학, 전자 등 다양한 산업 분야에서 폭넓게 사용되는 유기산이다. 락테이트는 무색, 무취이고 물에 잘 용해되는 저휘발성 물질이다. 락테이트는 인체에 독성이 없어 향미제, 산미제, 보존제 등으로 활용되고 있고, 또한 환경친화적으로 대체 고분자 물질이고, 생분해성 플라스틱인 폴리락틱산 (polylactic acid: PLA)의 원료이다.

유기산은 그의 Pka 값보다 높은 산도, 예를 들면, 중성 조건에서 수소 이온과 유기산의 음이온으로 분리된다. 그러나, 유기산, 예를 들면, 젖산은 Pka 값보다 낮은 산성 조건에서는 전자기력을 가지지 않는 유리산 (free acid) 형태로 존재한다. 음이온 형태는 세포막을 투과하지 못하나, 유리산 형태는 세포막을 투과할 수 있으므로, 유기산의 농도가 높은 환경에서 세포막 외부의 유기산이 세포 내부로 유입되어 세포 내 pH가 떨어지는 현상이 일어날 수 있다. 또한, 음이온 형태의 유기산은 분리시에 염을 첨가하여 염의 형태로 분리하여야 하는 단점이 있다. 그 결과, 내산성 (acid resistance)이 결여된 세포는 젖산이 포함된 산성 조건에서 세포의 활성을 잃고 사멸할 수 있다.

따라서, 산성에 대한 내성을 갖는 미생물에 대한 요구가 있다.

일 양상은 효모에 내산성을 부여하는 특성을 가진, 서열번호 1과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 제공하는 것이다.

다른 양상은 효모에 내산성을 부여하는 특성을 가진, 서열번호 1과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

다른 양상은 서열번호 1과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 양이 증가되어 있고 내산성을 갖는 효모 세포를 제공하는 것이다.

다른 양상은 상기 효모 세포를 이용하여 산물을 효율적으로 생산하는 방법에 관한 것이다.

다른 양상은 내산성 효모 세포를 효율적으로 생산하는 방법에 관한 것이다.

일 양상은 효모에 내산성을 부여하는 특성을 가진, 서열번호 1과 65% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 제공한다.

상기 효모는 아스코미코타 필럼 (Ascomycota phylum)에 속하는 것일 수 있다. 아스코미코타 필럼은 사카로미코티나 (Saccharomycotina) 또는 타프리노미코티나 (Taphrinomycotina) 서브필럼을 포함할 수 있다. 상기 효모는 사카로미세테스 (Saccharomycetes) 또는 스키조사카로미세테스 (Schizosaccharomycetes) 클라스를 포함할 수 있다. 상기 효모는 사카로미세타세 (Saccharomycetaceae) 패밀리에 속하는 것일 수 있다. 사카로미세타세 (Saccharomycetaceae) 패밀리는 브레타노미세스 (Brettanomyces), 칸디다 (Candida), 씨테로미세스 (Citeromyces), 씨니클로미세스 (Cyniclomyces), 데바이로미세스 (Debaryomyces), 이삿첸키아 (Issatchenkia), 카작스타니아 (Kazachstania), 클루이베로미세스 (Kluyveromyces), 코마가타엘라 (Komagataella), 쿠라이시아 (Kuraishia), 라찬세아 (Lachancea), 로데로미세스 (Lodderomyces), 나카세오미세스 (Nakaseomyces), 파키솔렌 (Pachysolen), 피치아 (Pichia), 사카로미세스 (Saccharomyces), 스파타스포라 (Spathaspora), 테르라피시스포라 (Tetrapisispora), 반데르왈토지마 (Vanderwaltozyma), 토룰라스포라 (Torulaspora), 윌리옵시스 (Williopsis), 지고사카로미세스(Zygosaccharomyces), 또는 지고토룰라스포라 (Zygotorulaspora)를 포함할 수 있다. 상기 효모는 예를 들면, 칸디다 (Candida), 이삿첸키아 (Issatchenkia), 클루이베로미세스 (Kluyveromyces), 피치아 (Pichia), 사카로미세스 (Saccharomyces), 토룰라스포라 (Torulaspora), 지고사카로미세스(Zygosaccharomyces), 지고토룰라스포라 (Zygotorulaspora), 또는 스키조사카로미세스일 수 있다.

상기 사카로미세스 속은 예를 들면, 사카로미세스 세레비지애 (S. cerevisiae), 사카로미세스 바야누스 (S. bayanus), 사카로미세스 보울라디 (S. boulardii), 사카로미세스 불데리 (S. bulderi), 사카로미세스 카리오카누스 (S. cariocanus), 사카로미세스 카리오쿠스 (S. cariocus), 사카로미세스 체발리에리 (S. chevalieri), 사카로미세스 다이레넨시스 (S. dairenensis), 사카로미세스 엘립소이데우스 (S. ellipsoideus), 사카로미세스 유바야뉴스 (S. eubayanus), 사카로미세스 엑시거스 (S. exiguus), 사카로미세스 플로렌티누스 (S. florentinus), 사카로미세스 클루이베리 (S. kluyveri), 사카로미세스 마티니에 (S. martiniae), 사카로미세스 모나센시스 (S. monacensis), 사카로미세스 노르벤시스 (S. norbensis), 사카로미세스 파라독서스 (S. paradoxus), 사카로미세스 파스토리아누스 (S. pastorianus), 사카로미세스 스펜서로룸 (S. spencerorum), 사카로미세스 투리센시스 (S. turicensis), 사카로미세스 우니스포루스 (S. unisporus), 사카로미세스 우바룸 (S. uvarum), 또는 사카로미세스 조나투스 (S. zonatus)일 수 있다.

또한, 상기 효모 세포는 천연 효모 세포뿐만 아니라, 산물, 예를 들면, 락테이트와 같은 유기산 생산용 변이 효모 세포도 포함할 수 있다. 이러한 변이 효모 세포는 예를 들면, 우라실, 설파구아니딘, 설파티아졸, 아자세린, 트리메토프림, 또는 모노플루오로아세테이트에 대하여 내성을 가질 수 있다. 상기 유기산은 C1 내지 C20를 갖는 유기산일 수 있다. 상기 유기산은 아세트산, 젖산, 프로피온산, 3-히드록시프로피온산, 부티르산, 4-히드록시부티르산, 숙신산, 푸마르산, 말산, 옥살산, 아디프산, 또는 그 조합일 수 있다.

상기 폴리펩티드는 서열번호 1과 65% 이상, 예를 들면, 70%이상, 80%이상, 90%이상, 91%이상, 92%이상, 93%이상, 94%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

본 명세서에 있어서, 핵산 또는 폴리펩티드의 "서열 동일성 (sequence identity)"는 특정 비교 영역에서 양 서열을 최대한 일치되도록 정렬(align)시킨 후 서열간의 염기 또는 아미노산 잔기의 동일한 정도를 의미한다. 서열 동일성은 특정 비교 영역에서 2개의 서열을 최적으로 정렬하여 비교함으로써 측정되는 값으로써, 비교 영역 내에서 서열의 일부는 대조 서열 (reference sequence)과 비교하여 부가, 삭제되어 있을 수 있다. 서열 동일성 백분율은 예를 들면, 비교 영역 전체에서 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하는 단계, 두 서열 모두에서 동일한 아미노산 또는 염기가 나타나는 위치의 갯수를 결정하여 일치된 (matched) 위치의 갯수를 수득하는 단계, 상기 일치된 위치의 갯수를 비교 범위 내의 위치의 총 갯수 (즉, 범위 크기)로 나누는 단계, 및 상기 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 수득하는 단계에 의해 계산될 수 있다. 상기 서열 동일성의 백분율은 공지의 서열 비교 프로그램을 사용하여 결정될 수 있으며, 일례로 BLASTN (NCBI), CLC MAIN WORKBENCH (CLC BIO), MegAlign^TM (DNASTAR INC.) 등을 들 수 있다.

여러 종의 동일하거나 유사한 기능이나 활성을 가지는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 확인하는데 있어서 여러 수준의 서열 동일성을 사용할 수 있다. 예를 들면, 50%이상, 55%이상, 60%이상, 65% 이상, 70%이상, 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상, 또는 100% 등을 포함하는 서열 동일성일 수 있다.

상기 서열번호 1과 65% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드는 박테리아, 효모, 곰팡이에서 유래한 것일 수 있다. 일례로, 아스퍼질러스(Aspergillus), 칸디다(Candida), 코시디오이드(Coccidioides), 크립토코커스(Cryptococcus), 데바료미세스(Debaryomyces), 에로모데시움(Eromothecium), 푸자리움(Fusarium), 이삿첸키아(Issatchenkia), 클루이베로미세스(Kluyveromyces), 마그나포르데(Magnaporthe), 뉴로스포라(Neurospora), 네오사르토랴(Neosartorya), 파라코시디이오이드(Paracoccidioides), 뉴모시스티스(Pneumocystis), 사카로미세스(Saccharomyces), 스키조사카로미세스 (Schizosaccharomyces), 야로위아(Yarrowia), 토루라스포라(Torulaspora), 및 지고사카로미세스(Zygosaccharomyces)으로 이루어지는 군에서 선택되는 것일 수 있다. 구체예에서, 아스퍼질러스 니둘란스 (Aspergillus nidulans), 아스퍼질러스 오리자(Aspergillus oryzae), 아스퍼질러스 카와치이(Agipergillus kawachii), 아스퍼질러스 플라부스 (Aspergillus flavus), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 투블리니엔시스(Candida dubliniensis), 칸디다 클라브라타(Candida glabrata),칸디다 말토즈(Candida maltose), 콕시디오이데스 포사다시이(Coccidioides posadasii), Cryptococcus neoformans, Debaryomyces hansenii, Eromothecium gossypii, Fusarium oxysporum, Issatchenkia orientalis, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces thermotolerans, Magnaporthe grisea, Neurospora crassa, Neosartorya fumigate, Paracoccidioides brasiliensis, Pneumocystis carinii, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Schizosaccharomyces japonicus, Yarrowia lipolytica, Zygosaccharomyces bailii 등일 수 있다.

상기 폴리펩티드는 베타-1,3-글루카노실트란스퍼라제 (beta-1,3-glucanosyltransferase: GAS) 활성을 갖는 것일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 효소 코드 EC 2.4.1.-로 분류되는 효소일 수 있다.

다른 양상은 상기한 효모에 내산성을 부여하는 특성을 가진, 서열번호 1과 65% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2, 3, 4, 및 5 중 하나이상의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 서열번호 2는 서열번호 1의 폴리펩티드를 코딩하는 코딩 서열을 나타내고, 서열번호 3, 4, 및 5는 상기 코딩 서열에 Issatchenkia orientalis ATCC 20381의 5'-UTR 및 3'-UTR 서열의 일부를 포함하는 서열로서 3개 변이체의 서열을 나타낸다. 상기 폴리뉴클레오티드는 자연에 존재하는 것이 아닌, 인위적으로 가공된 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, 인트론이 제거된 폴리뉴클레오티드, 또는 cDNA일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 분리된 (isolated) 것일 수 있다.

다른 양상은 상기한 효모에 내산성을 부여하는 특성을 가진, 서열번호 1과 65% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한, 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 효모에 내산성을 부여하기 위한 것일 수 있다.

다른 양상은 서열번호 1과 65% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 베타-1,3-글루카노실트란스퍼라제의 양이 증가되어 있고 내산성을 갖는 효모 세포를 제공한다.

상기 베타-1,3-글루카노실트란스퍼라제 (beta-1,3-glucanosyltransferase: GAS)는 효모 유래의 것일 수 있다. 상기 효소는 효소 코드 EC 2.4.1.-로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 효모는 아스코미코타 필럼 (Ascomycota phylum)에 속하는 것일 수 있다. 아스코미코타 필럼은 사카로미코티나 (Saccharomycotina) 또는 타프리노미코티나 (Taphrinomycotina) 서브필럼을 포함할 수 있다. 상기 효모는 사카로미세테스 (Saccharomycetes) 또는 스키조사카로미세테스 (Schizosaccharomycetes) 클라스를 포함할 수 있다. 상기 효모는 사카로미세타세 (Saccharomycetaceae) 패밀리에 속하는 것일 수 있다. 사카로미세타세 (Saccharomycetaceae) 패밀리는 브레타노미세스 (Brettanomyces), 칸디다 (Candida), 씨테로미세스 (Citeromyces), 씨니클로미세스 (Cyniclomyces), 데바이로미세스 (Debaryomyces), 이삿첸키아 (Issatchenkia), 카작스타니아 (Kazachstania), 클루이베로미세스 (Kluyveromyces), 코마가타엘라 (Komagataella), 쿠라이시아 (Kuraishia), 라찬세아 (Lachancea), 로데로미세스 (Lodderomyces), 나카세오미세스 (Nakaseomyces), 파키솔렌 (Pachysolen), 피치아 (Pichia), 사카로미세스 (Saccharomyces), 스파타스포라 (Spathaspora), 테르라피시스포라 (Tetrapisispora), 반데르왈토지마 (Vanderwaltozyma), 토룰라스포라 (Torulaspora), 윌리옵시스 (Williopsis), 지고사카로미세스(Zygosaccharomyces), 또는 지고토룰라스포라 (Zygotorulaspora)를 포함할 수 있다. 상기 효모는 예를 들면, 칸디다 (Candida), 이삿첸키아 (Issatchenkia), 클루이베로미세스 (Kluyveromyces), 피치아 (Pichia), 사카로미세스 (Saccharomyces), 토룰라스포라 (Torulaspora), 지고사카로미세스(Zygosaccharomyces), 지고토룰라스포라 (Zygotorulaspora), 또는 스키조사카로미세스일 수 있다.

상기 사카로미세스 속은 예를 들면, 사카로미세스 세레비지애 (S. cerevisiae), 사카로미세스 바야누스 (S. bayanus), 사카로미세스 보울라디 (S. boulardii), 사카로미세스 불데리 (S. bulderi), 사카로미세스 카리오카누스 (S. cariocanus), 사카로미세스 카리오쿠스 (S. cariocus), 사카로미세스 체발리에리 (S. chevalieri), 사카로미세스 다이레넨시스 (S. dairenensis), 사카로미세스 엘립소이데우스 (S. ellipsoideus), 사카로미세스 유바야뉴스 (S. eubayanus), 사카로미세스 엑시거스 (S. exiguus), 사카로미세스 플로렌티누스 (S. florentinus), 사카로미세스 클루이베리 (S. kluyveri), 사카로미세스 마티니에 (S. martiniae), 사카로미세스 모나센시스 (S. monacensis), 사카로미세스 노르벤시스 (S. norbensis), 사카로미세스 파라독서스 (S. paradoxus), 사카로미세스 파스토리아누스 (S. pastorianus), 사카로미세스 스펜서로룸 (S. spencerorum), 사카로미세스 투리센시스 (S. turicensis), 사카로미세스 우니스포루스 (S. unisporus), 사카로미세스 우바룸 (S. uvarum), 또는 사카로미세스 조나투스 (S. zonatus)일 수 있다. 상기 베타-1,3-글루카노실트란스퍼라제는 사카로미세스 세레비지애로부터 유래된 것일 수 있다. 상기 베타-1,3-글루카노실트란스퍼라제 예를 들면, 사카로미세스 세레비지애로부터 유래된 GAS1,2,3,4,및 5일 수 있다.

상기 증가는 서열번호 1과 65% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현의 증가에 의한 것일 수 있다. 상기 양은 대조군 대비 약 0.1%이상, 약 1% 이상, 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 또는 약 100% 이상 증가된 것일 수 있다. 상기 대조군은 상기 폴리펩티드, 또는 베타-1,3-글루카노실트란스퍼라제의 양이 증가되도록 조작되지 않은 효모 세포일 수 있다. 상기 대조군은 상기 폴리펩티드를 포함하고 있지 않은 세포일 수 있다.

상기 발현의 증가는 서열번호 1과 65% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 도입에 의한 것일 수 있다. 상기 유전자가 도입되는 효모 세포는 자체적으로 상기 유전자를 포함하는 것, 또는 포함하고 있지 않은 것일 수 있다. 상기 유전자는 그의 발현을 가능하게 하는 조절 서열, 예를 들면, 프로모터, 인핸서, 폴리 아데닐화 부위, 또는 그 조합과 작동가능하게 연결된 것일 수 있다. 상기 유전자는 효모 세포의 게놈에 삽입되거나, 게놈 외에 위치하는 것일 수 있다. 상기 도입에 의하여 발현될 수 있는 기능적 상기 유전자의 카피 수가 증가될 수 있다. 상기 카피 수는 1 이상, 10 이상, 100 이상, 또는 1,000 이상 증가될 것일 수 있다. 예를 들면, 1 내지 1,000, 1 내지 100, 1 내지 50, 1 내지 10, 1 내지 5, 또는 1 내지 3일 수 있다.

상기 유전자의 도입은 형질전환, 형질도입 (transfection), 전기천공 (electroporation)과 같은 알려진 방법에 의하여 수행될 수 있다. 상기 유전자는 운반체 (vehicle)를 통하여 도입되거나, 그 자체로서 도입될 수 있다. 본 명세서에 있어서, "운반체"란 연결되어 있는 다른 핵산을 전달할 수 있는 핵산 분자를 포함한다. 특정한 유전자의 도입을 매개하는 핵산 서열이라는 관점에서, 본 명세서에서 운반체는, 벡터, 핵산 구조체, 및 카세트와 상호 교환 가능하게 사용될 수 있는 것으로 해석된다. 벡터에는 예를 들면 플라스미드 또는 바이러스 유래 벡터 등이 포함된다. 플라스미드란 추가의 DNA가 연결될 수 있는 원형의 이중가닥 DNA 고리를 포함한다. 벡터에는 예를 들면, 플라스미드 발현벡터, 바이러스 발현벡터, 예를 들면, 복제결함 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노 연관 바이러스, 또는 그 조합이 포함될 수 있다. 효모 발현 벡터는 예를 들면, 사카로미세스 세레비지애에서의 발현을 위한 벡터일 수 있고, 그의 예로 pYepSec1, 2i, pAG-1, Yep6, Yep13, PEMBLYe23, pMFa, pJRY88, 또는 pYES2를 포함할 수 있다.

또는 상기 발현의 증가는 서열번호 1과 65% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 베타-1,3-글루카노실트란스퍼라제를 코딩하는 유전자의 발현이 증가되도록 그의 내재적 유전자가 증폭되거나, 그의 내재적 유전자 또는 그 조절 서열이 변이된 것일 수 있다. 상기 변이는 삽입, 치환, 전환 또는 부가일 수 있다.

상기 내산성을 갖는 효모는 아스코미코타 필럼 (Ascomycota phylum)에 속하는 것일 수 있다. 아스코미코타 필럼은 사카로미코티나 (Saccharomycotina) 또는 타프리노미코티나 (Taphrinomycotina) 서브필럼을 포함할 수 있다. 상기 효모는 사카로미세테스 (Saccharomycetes) 또는 스키조사카로미세테스 (Schizosaccharomycetes) 클라스를 포함할 수 있다. 상기 효모는 사카로미세타세 (Saccharomycetaceae) 패밀리에 속하는 것일 수 있다. 사카로미세타세 (Saccharomycetaceae) 패밀리는 브레타노미세스 (Brettanomyces), 칸디다 (Candida), 씨테로미세스 (Citeromyces), 씨니클로미세스 (Cyniclomyces), 데바이로미세스 (Debaryomyces), 이삿첸키아 (Issatchenkia), 카작스타니아 (Kazachstania), 클루이베로미세스 (Kluyveromyces), 코마가타엘라 (Komagataella), 쿠라이시아 (Kuraishia), 라찬세아 (Lachancea), 로데로미세스 (Lodderomyces), 나카세오미세스 (Nakaseomyces), 파키솔렌 (Pachysolen), 피치아 (Pichia), 사카로미세스 (Saccharomyces), 스파타스포라 (Spathaspora), 테르라피시스포라 (Tetrapisispora), 반데르왈토지마 (Vanderwaltozyma), 토룰라스포라 (Torulaspora), 윌리옵시스 (Williopsis), 지고사카로미세스(Zygosaccharomyces), 지고토룰라스포라 (Zygotorulaspora)를 포함할 수 있다. 상기 효모는 예를 들면, 칸디다 (Candida), 이삿첸키아 (Issatchenkia), 클루이베로미세스 (Kluyveromyces), 피치아 (Pichia), 사카로미세스 (Saccharomyces), 토룰라스포라 (Torulaspora), 지고사카로미세스(Zygosaccharomyces), 지고토룰라스포라 (Zygotorulaspora), 또는 스키조사카로미세스일 수 있다.

상기 사카로미세스 속은 예를 들면, 사카로미세스 세레비지애 (S. cerevisiae), 사카로미세스 바야누스 (S. bayanus), 사카로미세스 보울라디 (S. boulardii), 사카로미세스 불데리 (S. bulderi), 사카로미세스 카리오카누스 (S. cariocanus), 사카로미세스 카리오쿠스 (S. cariocus), 사카로미세스 체발리에리 (S. chevalieri), 사카로미세스 다이레넨시스 (S. dairenensis), 사카로미세스 엘립소이데우스 (S. ellipsoideus), 사카로미세스 유바야뉴스 (S. eubayanus), 사카로미세스 엑시거스 (S. exiguus), 사카로미세스 플로렌티누스 (S. florentinus), 사카로미세스 클루이베리 (S. kluyveri), 사카로미세스 마티니에 (S. martiniae), 사카로미세스 모나센시스 (S. monacensis), 사카로미세스 노르벤시스 (S. norbensis), 사카로미세스 파라독서스 (S. paradoxus), 사카로미세스 파스토리아누스 (S. pastorianus), 사카로미세스 스펜서로룸 (S. spencerorum), 사카로미세스 투리센시스 (S. turicensis), 사카로미세스 우니스포루스 (S. unisporus), 사카로미세스 우바룸 (S. uvarum), 또는 사카로미세스 조나투스 (S. zonatus)일 수 있다.

"내산성 (acid tolerant)"이란 조작되지 않은 세포에 비하여, 산성 조건에서 더 좋은 성장을 보이는 것일 수 있다. 상기 산성 조건은 유기산, 무기산 또는 그 조합을 포함하는 산성 조건일 수 있다. 상기 유기산은 C1 내지 C20을 갖는 유기산일 수 있다. 상기 유기산은 아세트산, 젖산, 프로피온산, 3-히드록시프로피온산, 부티르산, 4-히드록시부티르산, 숙신산, 푸마르산, 말산, 옥살산, 아디프산, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 효모 세포는 서열번호 1과 65% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 양이 증가되어 있지 않은 효모 세포에 비하여, pH 2.0 내지 7.0, 예를 들면, pH 2.0 내지 5.0, pH 2.0 내지 4.0, pH 2.0 내지 3.8, pH 2.5 내지 3.8, pH 3.0 내지 3.8, pH 2.0 내지 3.0, pH 2.0 내지 2.7, pH 2.0 내지 2.5, 또는 pH 2.5 내지 3.0의 범위에서 더 잘 생장할 수 있는 것일 수 있다.

또는 "내산성 (acid tolerant)"이란 조작되지 않은 세포에 비하여, 산성 조건에서 더 높은 생존을 보이는 것일 수 있다. 상기 산성 조건은 유기산, 무기산 또는 그 조합을 포함하는 산성 조건일 수 있다. 상기 유기산은 C1 내지 C20을 갖는 유기산일 수 있다. 상기 유기산은 아세트산, 젖산, 프로피온산, 3-히드록시프로피온산, 부티르산, 4-히드록시부티르산, 숙신산, 푸마르산, 말산, 옥살산, 아디프산, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 효모 세포는 서열번호 1과 65% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 양이 증가되어 있지 않은 효모 세포에 비하여, pH 2.0 내지 7.0, 예를 들면, pH 2.0 내지 5.0, pH 2.0 내지 4.0, pH 2.0 내지 3.8, pH 2.5 내지 3.8, pH 3.0 내지 3.8, pH 2.0 내지 3.0, pH 2.0 내지 2.7, pH 2.0 내지 2.5, 또는 pH 2.5 내지 3.0의 범위에서 더 잘 생존할 수 있는 것일 수 있다.

또는 "내산성 (acid tolerant)"이란 조작되지 않은 세포에 비하여, 산성 조건에서 더 좋은 대사 과정을 보이는 것일 수 있다. 상기 산성 조건은 유기산, 무기산 또는 그 조합을 포함하는 산성 조건일 수 있다. 상기 유기산은 C1 내지 C20을 갖는 유기산일 수 있다. 상기 유기산은 아세트산, 젖산, 프로피온산, 3-히드록시프로피온산, 부티르산, 4-히드록시부티르산, 숙신산, 푸마르산, 말산, 옥살산, 아디프산, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 효모 세포는 서열번호 1과 65% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 양이 증가되어 있지 않은 효모 세포에 비하여, pH 2.0 내지 7.0, 예를 들면, pH 2.0 내지 5.0, pH 2.0 내지 4.0, pH 2.0 내지 3.8, pH 2.5 내지 3.8, pH 3.0 내지 3.8, pH 2.0 내지 3.0, pH 2.0 내지 2.7, pH 2.0 내지 2.5, 또는 pH 2.5 내지 3.0의 범위에서 더 잘 대사할 수 있는 것일 수 있다. 이 때 "대사할 수 있는 (metabolizable)"의 정도는 세포당 영양분 흡수율, 예를 들면, 세포당 포도당 흡수율을 통해 측정될 수 있다. 또는 "대사할 수 있는 (metabolizable)"의 정도는 세포당 산물 배출율, 예를 들면 세포당 이산화탄소 배출율을 통해 측정될 수 있다.

상기 효모 세포는 천연 효모 세포뿐만 아니라, 산물, 예를 들면, 락테이트와 같은 유기산 생산용 변이 효모 세포도 포함할 수 있다. 상기 변이 효모 세포는 예를 들면, 상기 산물의 합성에 관련된 단백질의 활성이 증가된 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 산물의 합성에 관련된 단백질을 코딩하는 유전자가 도입되거나, 상기 유전자의 발현이 증가되도록 그의 내재적 유전자가 증폭되거나, 그의 내재적 유전자 또는 그 조절 서열이 변이된 것일 수 있다. 또한, 상기 변이 효모는 상기 산물의 분해에 관련된 단백질을 코딩하는 유전자가 불활성화되거나, 감쇄된 것일 수 있다.

본 명세서에 있어서, 용어 "불활성화 (inactivation)"는 전혀 발현이 되지 않는 유전자 또는 발현이 되더라도 그 활성이 없는 유전자가 생성되는 것을 의미할 수 있다. 용어 "감쇄 (attenuation)"는 유전자의 발현이 조작되지 않은 효모 세포에 비하여 낮은 수준으로 발현되거나, 또는 발현이 되더라도 그 활성이 낮은 것을 의미할 수 있다. 상기 활성은 조작되지 않은 대조군 종에 비하여, 폴리펩티드의 활성이 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 100% 감소된 것일 수 있다.

상기 불활성화 또는 감쇄는 선택적 또는 비선택적 방법에 의하여 수행될 수 있다. 선택적 방법은 예를 들면, 상동 재조합 방법일 수 있다. 상동 재조합 방법은 상기 유전자의 일부 서열을 포함하는 벡터를 세포에 형질전환하고, 세포를 배양하여 상기 서열이 세포의 내인성 유전자와 상동 재조합이 일어나도록 한 후, 상동재조합이 일어난 세포를 선별 마커에 의해 선별함으로써 이루어질 수 있다. 상기 선별 마커는 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성, 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커일 수 있다.　

상기 산물은 유기산, 단백질, 지방, 또는 당일 수 있다. 상기 산물은 예를 들면, 일정한 산도 이하에서는 전하, 예를 들면 음전하를 띠고 있지 않아, 유리된 화합물 (free compound)의 형태를 갖는 것일 수 있다. 이 경우, 상기 산물을 분리하기 위하여 카운터 이온 (counter ion)을 사용하여 염의 형태로 제조할 필요가 없다. 상기 산물은 유기산일 수 있다. 상기 유기산은 C1 내지 C20를 갖는 유기산일 수 있다. 상기 유기산은 아세트산, 젖산, 프로피온산, 3-히드록시프로피온산, 부티르산, 4-히드록시부티르산, 숙신산, 푸마르산, 말산, 시트르산, 옥살산, 아디프산, 또는 그 조합일 수 있다.

상기 효모 세포는 일례로 젖산 합성에 관련된 단백질의 활성이 증가된 것일 수 있다. 상기 증가는 예를 들면, 상기 젖산 합성에 관련된 단백질을 코딩하는 유전자의 발현의 증가에 의한 것일 수 있다. 상기 증가는 예를 들면, 상기 젖산 합성에 관련된 단백질을 코딩하는 유전자가 도입되거나, 상기 유전자의 발현이 증가되도록 그의 내재적 유전자가 증폭되거나, 그의 내재적 유전자 또는 그 조절 서열이 변이된 것에 의할 수 있다. 상기 증가는 대조군 대비 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 또는 약 100% 이상 증가된 것일 수 있다.

상기 젖산 합성에 관련된 단백질은 피루베이트를 락테이트로 전환하는 활성 즉, 락테이트 데히드로게나제일 수 있다. 락테이트 데히드로게나제의 활성은 락테이트를 생산하는데 충분한 정도로 증가된 것일 수 있다.

상기 "락테이트 데히드로게나제 (lactate dehydrogenase: LDH)"는 피루베이트를 락테이트로 전환을 촉매하는 효소일 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제는 NAD(P)-의존성 효소일 수 있으며, 또한 L-락테이트 또는 D-락테이트에 각각 작용할 수 있다. 상기 NAD(P)-의존성 효소는 L-락테이트에 작용하는 것인 EC 1.1.1.27, 또는 D-락테이트에 작용하는 것인 EC 1.1.1.28 로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제는 서열번호 19의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자는 서열번호 20의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 서열번호 19의 락테이트 데히드로게나제 및 서열번호 20의 그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 Sordaria macrospora로부터 유래한 것이다. 상기 락테이트 데히드로게나제는 서열번호 27의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자는 서열번호 28의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 서열번호 27의 락테이트 데히드로게나제 및 서열번호 28의 그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 일본 자라 (Pelodiscus sinensis japonicus)로부터 유래한 것이다.

또한, 상기 효모는 젖산의 분해와 관련되거나 젖산 생산을 방해하는 단백질의 활성이 제거되거나 감소된 것일 수 있다. 상기 제거 또는 감소는 젖산의 분해에 관련된 단백질을 코딩하는 유전자가 불활성화되거나, 감쇄된 것일 수 있다. 상기 젖산의 분해에 관련된 단백질은 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 활성을 가진 폴리펩티드, 예를 들면 피루베이트 데카르복실라제 (pyruvate decarboxylase: PDC), 락테이트를 피루베이트로 전환하는 활성을 가진 폴리펩티드, 예를 들면 락테이트 시트크롬-c 옥시도리덕타제 (CYB2), 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드, 예를 들면, 시토졸성 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제 (cytosolic glycerol-3-phosphate dehydrogenase: GPD1), 또는 그 조합일 수 있다. 상기 활성의 감소는 대조군에 대하여 활성이 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 100% 감소된 것일 수 있다.

상기 불활성화 또는 감쇄는 상기 유전자의 일부 서열을 포함하는 벡터를 세포에 형질전환하고, 세포를 배양하여 상기 서열이 세포의 내인성 유전자와 상동 재조합이 일어나도록 한 후, 상동재조합이 일어난 세포를 선별 마커에 의해 선별함으로써 이루어질 수 있다. 상기 선별 마커는 물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성, 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커일 수 있다.　

피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 활성을 가진 폴리펩티드는 EC 4.1.1.1로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 피루베이트로부터 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드는 서열번호 21의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 피루베이트로부터 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 22의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 유전자는 피루베이트 데카르복실라제 (pyruvate decarboxylase: PDC)를 코딩하는 pdc1 또는 pdc2일 수 있다. 서열번호 21의 PDC 및 서열번호 22의 그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 사카로미세스 세레비지애로부터 유래한 것이다.

상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 활성을 가진 폴리펩티드는 시토크롬 c-의존성 효소일 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 활성을 가진 폴리펩티드는 락테이트 시트크롬-c 옥시도리덕타제 (CYB2)일 수 있다. 상기 락테이트 시트크롬 c-옥시도리덕타제는 D-락테이트에 작용하는 것인 EC 1.1.2.4, 또는 L-락테이트에 작용하는 것인 EC 1.1.2.3으로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드는 서열번호 23의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 24의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 서열번호 23의 CYB2 및 서열번호 24의 그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 사카로미세스 세레비지애로부터 유래한 것이다.

상기 디히드록시아세톤 포스페이트를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 활성을 가진 폴리펩티드는 NADH의 NAD+로의 산화를 이용하여 DHAP를 글리세롤-3-포스페이트로의 환원을 촉매하는 효소일 수 있다. 상기 효소는 EC 1.1.1.8로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 시토졸성 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제 (cytosolic glycerol-3-phosphate dehydrogenase: GDP1)일 수 있다. 상기 디히드록시아세톤 포스페이트를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드는 서열번호 25의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 디히드록시아세톤 포스페이트를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 26의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 유전자는 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제를 코딩하는 gdp1일 수 있다.

상기 효모 세포는, 수탁번호 KCTC 12415 BP인 효모 세포에 서열번호 1과 65% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 유전자가 포함되어 있는 것일 수 있다.

다른 양상은 서열번호 1과 65% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 베타-1,3-글루카노실트란스퍼라제의 양이 증가되어 있고 내산성을 갖는 효모 세포를 배지 중에서 배양하는 단계; 및 배양물로부터 산물을 분리하는 단계;를 포함하는 내산성 효모 세포로부터 산물을 생산하는 방법을 제공한다.

상기 방법은 서열번호 1과 65% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 베타-1,3-글루카노실트란스퍼라제의 양이 증가되어 있고 내산성을 갖는 효모 세포를 배지 중에서 배양하는 단계를 포함한다.

서열번호 1과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 베타-1,3-글루카노실트란스퍼라제의 양이 증가되어 있고 내산성을 갖는 효모 세포에 대하여는 상기한 바와 같다.

상기 배양은 탄소원, 예를 들면, 글루코스를 함유하는 배지에서 수행될 수 있다. 효모 세포 배양에 사용되는 배지는 적절한 보충물을 함유한 최소 또는 복합 배지와 같은, 숙주 세포의 성장에 적합한 임의의 통상적인 배지일 수 있다. 적합한 배지는 상업적인 판매자로부터 입수 가능하고 또는 공지된 제조법에 따라 제조될 수 있다.

상기 배양에 선택되는 산물에 따라 특정한 효모 세포의 요구조건을 만족시킬 수 있는 배지일 수 있다. 상기 배지는 탄소원, 질소원, 염, 미량 원소, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 배지일 수 있다.

상기 배양의 조건은 선택되는 산물, 예를 들면, 락테이트의 생산에 적합하게 적절히 조절될 수 있다. 상기 배양은 세포 증식을 위하여 호기성 조건에서 이루어질 수 있다. 선택적으로, 그 후 산물, 예를 들면, 락테이트를 생산하기 위하여 상기 세포를 혐기 조건에서 배양할 수 있다. 상기 혐기 조건은 용존산소 (dissolved oxygen: DO) 농도가 0% 내지 10%, 예를 들면 0 내지 8%, 0 내지 6%, 0 내지 4%, 0 내지 2%, 0.1% 내지 10%, 1% 내지 10%, 2% 내지 10%, 3% 내지 10%, 4% 내지 10%, 5% 내지 10%, 6% 내지 10%, 7% 내지 10%, 8% 내지 10%, 9% 내지 10%, 1% 내지 8%, 2% 내지 8%, 3% 내지 8%, 4% 내지 8%, 5% 내지 8%, 6% 내지 8%, 7% 내지 8%, 1% 내지 6%, 2% 내지 6%, 3% 내지 6%, 4% 내지 6%, 5% 내지 6%, 1% 내지 5%, 2% 내지 5%, 2% 내지 4%, 또는 2% 내지 5%와 같은 미세 호기성(microaerobic) 조건을 포함할 수 있다.

용어, "배양 조건"은 효모 세포를 배양하기 위한 조건을 의미한다. 이러한 배양 조건은 예를 들어, 효모 세포가 이용하는 탄소원, 질소원 또는 산소 조건일 수 있다. 효모가 이용할 수 있는 탄소원은 단당류, 이당류 또는 다당류가 포함할 수 있다. 상기 탄소원은 글루코오즈, 프럭토오즈, 만노오즈, 또는 갈락토오즈를 포함할 수 있다. 상기 질소원은 유기 질소 화합물, 또는 무기 질소 화합물일 수 있다. 상기 질소원은 아미노산, 아미드, 아민, 질산염, 또는 암모늄염 일 수 있다. 효모 세포를 배양하는 산소 조건에는 정상 산소 분압의 호기성 조건, 대기중에 0.1% 내지 10%의 산소를 포함하는 저산소 조건, 또는 산소가 없는 혐기성 조건이 있다. 대사 경로는 효모 세포가 실제로 이용 가능한 탄소원 및 질소원에 맞추어 수정될 수 있다.

상기 배양은 배양 전부 또는 그 일부의 기간 동안 산성 조건에서 배양하는 것일 수 있다. 상기 산성 조건은 pH 2.0 내지 7.0, 예를 들면, pH 2.0 내지 5.0, pH 2.0 내지 4.0, pH 2.0 내지 3.8, pH 2.5 내지 3.8, pH 3.0 내지 3.8, pH 2.0 내지 3.0, pH 2.0 내지 2.7, pH 2.0 내지 2.5, 또는 pH 2.5 내지 3.0의 범위일 수 있다.

상기 산물은 유기산, 단백질, 지방, 또는 당일 수 있다. 상기 산물은 예를 들면, 일정한 산도 이하에서는 전하, 예를 들면 음전하를 띠고 있지 않아, 유리된 화합물 (free compound)의 형태로 갖는 것일 수 있다. 이 경우, 상기 산물을 분리하기 위하여 카운터 이온 (counter ion)을 사용하여 염의 형태로 제조할 필요가 없다. 상기 산물은 유기산일 수 있다. 상기 유기산은 C1 내지 C20를 갖는 유기산일 수 있다. 상기 유기산은 아세트산, 젖산, 프로피온산, 3-히드록시프로피온산, 부티르산, 4-히드록시부티르산, 숙신산, 푸마르산, 말산, 시트르산, 옥살산, 아디프산, 또는 그 조합일 수 있다..

상기 방법은 배양물로부터 산물을 분리하는 단계;를 포함한다. 상기 분리는 선택되는 산물에 따라 알려진 분리 방법이 적절하게 선택될 수 있다. 상기 분리하는 단계는 배양물로부터 산물을 염의 형태가 아닌 유리 화합물 (free compound), 예를 들면, 유리산 (free acid)의 형태로 분리하는 것일 수 있다.

상기 방법에 있어서, 상기 효모 세포는 수탁번호 KCTC 12415 BP인 효모 세포에 서열번호 1과 65% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 베타-1,3-글루카노실트란스퍼라제를 코딩하는 유전자가 포함되어 있는 것인 효모 세포이고, 상기 산물은 젖산인 것일 수 있다.

다른 양상은 서열번호 1과 65% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 베타-1,3-글루카노실트란스퍼라제를 코딩하는 유전자를 효모 세포에 도입하는 단계;를 포함하는, 내산성 효모 세포를 생산하는 방법을 제공한다.

다른 양상은 서열번호 1과 65% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 베타-1,3-글루카노실트란스퍼라제를 코딩하는 내재적 유전자의 발현이 증가되도록 유전적으로 조작하는 단계;를 포함하는, 내산성 효모 세포를 생산하는 방법을 제공한다.

상기 방법에 있어서, 상기 조작은 상기 유전자를 증폭하는 것, 상기 유전자의 조절 서열을 조작하는 것, 또는 상기 유전자 자체의 서열을 조작하는 것을 포함하는 것일 수 있다. 상기 조작은 뉴클레오티드의 삽입, 치환, 전환 또는 부가인 것일 수 있다.

일 양상에 따른 서열번호 1과 65% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 의하면, 효모에 내산성을 부여할 수 있다.

다른 양상에 따른 폴리뉴클레오티드에 의하면, 효모에 내산성을 부여할 수 있는 상기 폴리펩티드를 생산할 수 있다.

다른 양상에 따른 효모 세포에 의하면, 내산성을 갖는다.

다른 양상에 따른 내산성 효모 세포로부터 산물을 생산하는 방법에 의하면, 산물을 효율적으로 생산할 수 있다.

다른 양상에 따른 내산성 효모 세포를 생산하는 방법에 의하면, 내산성 효모 세포를 효율적으로 생산할 수 있다.

도 1과 도 2는 산성 조건에서 젖산 존재하에서 각 효모 세포를 배양한 세포 성장 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 pH 3.2로 조정된 양을 달리한 젖산 함유 YPD 배지에서 세포를 30℃에서 6시간 동안 배양한 후 측정한, 1 시간 포도당 섭취 속도 (glucose uptake rate: GUR) 값의 결과를 나타낸다.
도 4는 cDNA 라이브러리 제작에 사용된 벡터의 지도를 나타낸 도면이다.
도 5 내지 도 8은 내산성 유전자 IoGAS1를 포함하는 젖산 생성 효모 세포를 산성 조건에서 배양한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 염산 함유 산성 배지 중에서 여러 재조합 효모 세포를 배양한 결과를 세포 성장으로 나타낸 도면이다.
도 10은 젖산 함유 산성 배지 중에서 여러 재조합 효모 세포를 배양한 결과를 세포 성장으로 나타낸 도면이다.
도 11은 여러 산성 배지 중에서 여러 효모 세포를 20 시간 동안 배양한 결과를 세포 성장으로 나타낸 도면이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 내산성 균주 및 유전자의 탐색

(1) 내산성 균주의 탐색

본 발명자들은 여러 효모 균주를 산성 조건에서 배양하여, 내산성이 강한 효모 균주를 확인하였다.

구체적으로, 사카로미세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) CEN.PK2-1D (유전자형: MATα ura3-52; trp1-289; leu2-3,112; his3ㅿ1; MAL2-8^C; SUC2, EUROSCARF accession number: 30000B), 사카로미세스 세레비지애 수탁번호 KCTC 12415(CEN.PK2-1D (ㅿpdc1::ldhㅿcyb2::ldhΔgpd1::ldh)), Kluvyveromyces maxianus ATCC 36907, 및 Issatchenkia orientalis ATCC 20381을 특정 pH의 산성 조건에서, 젖산의 존재하에서 배양하여, 세포 성장 및 포도당 섭취 속도 (glucose uptake rate: GUR)를 확인하였다. KCTC 12415 균주는 내재적 피루베이트 데카복실라제 (PDC1), L-락테이트 시토크롬-c-옥시도리덕타제 (CYB2), 및 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제 (GPD1) 유전자가 일본 자라 (Pelodiscus sinensis japonicus) 유래 락테이트 데히드로게나제 (LDH) 유전자의 상동 재조합에 의한 삽입에 의하여 불활성화된 것이다.

도 1과 도 2는 산성 조건에서 젖산 존재하에서 각 효모 세포를 배양한 세포 성장 결과를 나타낸 도면이다.

도 1은 염산 또는 수산화칼륨을 이용하여 pH 3.2 또는 pH 6.5로 조정된 YPD 배지 (물 1리터당 10 g 효모 추출물, 20 g 펩톤, 20 g 포도당, 및 20g/l 젖산 함유)에서 세포를 30℃에서 22 시간 동안 배양한 후, 세포 성장에 해당하는 OD₆₀₀ 값을 측정한 결과를 나타낸다.

도 2는 pH 3.2로 조정된 양을 달리한 젖산 함유 YPD 배지에서 세포를 30℃에서 22시간 동안 배양한 후, 세포 성장에 해당하는 OD₆₀₀ 값을 측정한 결과를 나타낸다.

도 3은 pH 3.2로 조정된 양을 달리한 젖산 함유 YPD 배지에서 세포를 30℃에서 6시간 동안 배양한 후, 포도당 섭취 속도 (glucose uptake rate: GUR) 값의 결과를 나타낸다.

도 1 내지 3에 나타낸 바와 같이, Issatchenkia orientalis ATCC 20381이 내산성이 강하였으며, 80g/l 이상의 젖산 농도에서도 정상에 가까운 세포 활성을 가지고 있었다.

(2) Issatchenkia orientalis ATCC 20381의 cDNA 라이브러리의 제작 및 내산 성 유전자의 탐색

(2.1) 라이브러리 제작용 벡터

효모에서 유전자 과발현을 위해 널리 사용되는 벡터인 pRS426GPD 벡터 (ATCC 87631)를 각각 서열번호 6과 8의 프라이머쌍과 서열번호 7과 9의 프라이머 쌍을 프라이머로 한 PCR을 통하여 증폭한 후 In-fusion 클로닝 (Clontech, catalog #639690)하여 벡터 뼈대에 존재하고 있는 XbaI 및 PstI 제한효소 서열을 제거하여, XbaI 및 PstI 제한효소 서열이 제거된 벡터를 얻었다.

또한, 상기 XbaI 및 PstI 제한효소 서열이 제거된 벡터에서 서열번호 10과 11의 프라이머쌍을 프라이머로 한 PCR을 통하여 증폭하고, pEGFP-C1 벡터 (Clontech, catalog #6084-1)에서 서열번호 12와 13의 프라이머 쌍을 프라이머로 한 PCR을 통하여 증폭한 후 In-fusion 클로닝 (Clontech, catalog #639690)하여 벡터의 선발표지 유전자를 암피실린 내성 유전자인 bla에서 카나마이신 내성 유전자인 neo 유전자로 치환하였다. 이렇게 제작된 벡터를 pRS426GPD-KanPX 라고 명명하였다.

도 4는 cDNA 라이브러리 제작에 사용된 벡터의 지도를 나타낸 도면이다. 도 4에서, A 및 B는 각각 pRS426GPD와 pRS426GPD-KanPX를 나타낸다.

(2.2) cDNA 라이브러리 제작

(1)의 결과로부터, I.orientalis 균주의 유전형이 균주 내성에 중요한 역할을 수행할 것으로 예상하고 I.orientalis 균주가 산성 조건에서 배양될 때 과발현되는 유전자의 cDNA 라이브러리를 제작하였다. 산성 조건은 젖산을 배지 중에 포함시켜 산성 조건으로 하였다.

구체적으로, 먼저 I.orientalis 균주를 생장 속도가 가장 우수한 상태 (exponential phase)까지 YPD 배지 (물 1리터당 10 g 효모 추출물, 20 g 펩톤, 및 20 g 포도당)에서 30℃에서 6시간 동안 배양한 후, 생장 배지를 젖산이 80g/L 포함되고 수산화칼륨을 이용하여 pH3.2로 통제된 YPD 배지로 OD₆₀₀이 1.0이 되도록 교체하고 2시간을 더 배양하였다.

배양 후 세포를 모두 회수하여 세포 내에서 RNA를 분리 정제하였다. 분리 정제된 RNA는 cDNA로 합성한 후 효모 유전자 과발현 벡터인 pRS426GPD-KanPX 벡터의 XbaI과 XhoI의 제한 효소 부위에 클로닝하여 대장균 균주에 유전자 라이브러리로 제작되었다. 제작된 라이브러리는 카나마이신이 포함된 LB agar 배지(물 1리터 당 10g 트립톤, 5g 효모 추출물, 10g 염화나트륨, 15g 한천, 25mg 카나마이신, 및 pH 7.0)에서 선별되었다. 라이브러리의 규모는 2.5x10⁴ 클론 수준이었다. 제작된 유전자 라이브러리는 자연형 균주인 사카로미세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) CEN.PK2-1D 균주에 라이브러리 형태로 도입되어 효모 균주 라이브러리를 제작하였다. 제작된 라이브러리의 규모는 4.0x10⁶ 클론 수준이었다.

(2.3) cDNA 라이브러리로부터 내산성 유전자의 선별

제작된 효모 균주 라이브러리를 젖산이 20 g/L 포함된 SD-URA (물 1리터당 6.7g 효모 질소 조성물 (yeast nitrogen base), 1.92g 우라실이 제거된 표준 최소 화합물 (standard drop-out supplement without uracil), 20g 포도당, 20g 한천, pH 5.4-5.7) agar plate에 도말하여 30℃에서 스크리닝하였다. 5일 후 800 여개의 효모 콜로니들이 형성된 것을 확인하였다. 형성된 효모 콜로니들 중 생장 상태가 양호한 144개의 콜로니를 대상으로, pRS426GPD-KanPX 벡터의 삽입체 (insert)를 증폭할 수 있는 프라이머인 서열번호 14의 GPDpro-F 프라이머와 서열번호 15의 CYC1-R3 프라이머를 이용하여 콜로니 PCR 기법을 수행하여 각 균주 클론들이 가진 다양성을 확인하였다.

그 결과 모든 클론에서 삽입체 길이 2kb 수준의 같은 크기의 삽입체가 존재하는 것을 확인하였다. 선별된 콜로니들 중 16개 콜로니를 선별하여 효모에서 벡터 플라스미드를 분리 정제하여 대장균에 형질도입하고, 다시 플라스미드를 고농도로 회수하여 서열분석을 수행하였다. 그 결과, 모든 클론에 공통적으로 존재하는 유전자가 3가지의 변형된 형태 (variants)로 존재하는 것을 확인하였다. 이들 5'-UTR 및 3'-UTR을 포함한 전체 삽입체 서열은 서열번호 3, 4, 및 5에 기재하였다. 상기 3개의 삽입체는 5'-UTR 서열에 있어서 변이를 갖고 있으나 동일한 아미노산 서열을 코딩하였으며, 그 서열은 서열번호 1이고, 코딩 서열에 해당하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 2에 기재하였다.

NCBI BLAST 검색을 통하여, 서열번호 1의 아미노산 서열과 상동성이 있는 서열을 검색한 결과, 이 단백질이 여러 효모들에서 발현되는 beta-1,3-glucanosyltransferase (GAS) 단백질들과 상동성을 가짐을 확인하였다. 상동성의 정도는 60% 이하의 동일성을 보였다. 따라서, 이 유전자의 이름을 IoGAS1이라 명명하였다.

(3) 탐색된 내산성 유전자 IoGAS1 의 기능의 검정

젖산 생산 균주인 사카로미세스 세레비지애 수탁번호 KCTC 12415 균주에 클론 1과 클론 2로부터 분리된, IoGAS1 유전자 즉, 서열번호 3과 4의 폴리뉴클레오티드를 각각 포함한 pRS426GPD-KanPX 벡터를 각각 도입하고, 얻어진 균주를 배양하여 젖산 발효 성능을 비교 평가하였다. 대조군은 동일한 균주에 pRS426GPD-KanPX 벡터가 도입된 균주를 사용하였다.

내산성이 발효 성능에 미치는 영향을 평가하기 위해, pH 3.0의 포도당 60 g/L을 함유한 SD-URA 배지 (물 1리터당 6.7g 효모 질소 조성물 (yeast nitrogen base), 1.92g 우라실이 제거된 표준 최소 화합물 (standard drop-out supplement without uracil), 60g 포도당, 염산을 이용하여 pH 3.0으로 조정)에 상기 균주를 접종하고, 대기 중 산소 농도 2.5%로 유지한 미호기조건 (microaerobic)에서 30℃에서 200rpm으로 교반하면서 총 40시간 동안 배양하였다. 배양 도중 배양물을 채취하여 세포 농도를 OD600nm에서 측정하고, 세포를 원심분리하여 제거한 상층액으로부터 포도당의 잔량과 생산된 젖산의 양을 측정하였다.

도 5 내지 도 8은 내산성 유전자 IoGAS1를 포함하는 젖산 생성 효모 세포를 산성 조건에서 배양한 결과를 나타낸 도면이다. 도 5는 배양 시간에 따른 세포 성장을 나타낸 것이고, 도 6은 배양 시간에 따른 포도당 농도를 나타낸 것이고, 도 7은 배양 시간에 따른 생성된 젖산 농도를 나타낸 것이고, 도 8은 40 시간 배양 후 생성된 젖산의 양 및 수율을 나타낸 것이다. 도 5 내지 도 8에 나타낸 바와 같이, 클론1 및 클론2는 모두 대조군에 비해 우수한 젖산 생산성을 보였다. 특히 두 클론 모두 대조군에 비해 비슷한 양의 포도당을 흡수하면서 더 높은 젖산 생산성을 보였다. 이는 세포 내성의 강화로, 세포 내 pH 조절을 위해 소모되는 에너지가 상대적으로 낮아졌기 때문으로 보이나, 특정한 기작에 권리범위가 한정되는 것은 아니다. 도 5 내지 8에서, 클론 1 및 클론 2는 서열번호 3과 4의 폴리뉴클레오티드를 각각 포함한 pRS426GPD-KanPX 벡터가 사카로미세스 세레비지애 수탁번호 KCTC 12415 균주에 도입된 균주에 대한 결과를 각각 나타낸다.

실시예 2: IoGAS1 유전자를 포함한 효모 균주의 내산성

클론1의 벡터 즉 서열번호 2의 IoGAS1 코딩 서열을 포함하는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 포함한 pRS426GPD-KanPX 벡터 (이하 pRS426GPD-KanPX (서열번호 3) 벡터라 함), 및 클론1의 벡터에서 단백질을 코딩하는 DNA 서열 즉, 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열만을 취하여 pRS426GPD-KanPX 벡터에 삽입하여 얻어진 발현 벡터 (이하 pRS426GPD-KanPX (서열번호 2) 벡터라 함);를 내산성 효모인 S.cerevisiae CEN.PK2-1D에 각각 도입하여 효모 내산성 추이를 확인하였다.

pRS426GPD-KanPX (서열번호 2) 벡터를 제조하기 위하여, 클론1의 벡터를 주형으로 하고 서열번호 16과 17의 프라이머를 이용하여 PCR 방법을 통해 서열번호 2의 IoGAS1 유전자의 코딩 서열을 증폭하였다.

증폭된 DNA 조각들을 XhoI과 XbaI 제한효소로 절단한 pRS426GPD-KanPX 벡터와 섞어 In-fusion Kit (Clontech, catalog #639690)를 이용하여 각각 클로닝하였다. 이때 사용한 조건은 키트 제작자의 지침에 따랐다. 이렇게 클로닝된 벡터 즉 pRS426GPD-KanPX (서열번호 2) 벡터의 서열은 서열번호 18에 나타낸 바와 같다.

클로닝된 벡터는 각각 S.cerevisiae CEN.PK2-1D 자연형 균주에 도입하였다. 형성된 콜로니 중 5개를 취하여 각각 SD-URA 최소 배지 (물 1리터당 6.7g 효모 질소 조성물 (yeast nitrogen base), 1.92g 우라실이 제거된 표준 최소 화합물 (standard drop-out supplement without uracil), 20g 포도당) 1mL에 접종하여 하룻밤 동안 30℃에서 230rpm으로 교반하여 배양하였다. 배양액 중 700uL를 취하여 SD-URA 최소 배지 15mL에 접종하여 8시간 동안 30℃에서 230rpm으로 교반하여 배양하였다. 배양된 균주들 중 세포 농도가 가장 높은 각 1개의 배양액을 선택하여 3,700rpm 에서 5분간 원심분리를 통해 세포를 회수한 후 멸균수에 세포 농도가 OD₆₀₀=4.5가 되도록 현탁하였다.

이 현탁액 10uL를 24-well 마이크로플레이트에 담겨 있는 450uL 용량의 내산성 비교용 배지에 접종한 후 30℃에서 교반하여 20시간 동안 배양하였다. 내산성 비교용 배지는 SD-URA 최소 배지를 염산 또는 L-젖산으로 pH가 표시된 수준이 되도록 통제한 배지이다. 내염산성 비교용 배지는 pH 5.5 (통제하지 아니함), pH 3.00, pH 2.85, pH 2.70, pH 2.55, pH 2.40, pH 2.25, 및 pH 2.10이 되도록 제조한 후 필터로 멸균하였다. 내젖산성 비교용 배지는 pH 5.5 (통제하지 아니함), pH 3.00, pH 2.90, pH 2.80, pH 2.70, pH 2.60, pH 2.50, 및 pH 2.40이 되도록 제조한 후 필터로 멸균하였다. 이때 교반 속도는 배지 교반을 고려하여 자동으로 조절하였으며, 배양기 내 습도는 95% 이상을 유지하였고 공기 중 산소 농도는 대기와 같게 유지하여 호기 생장하도록 하였다. 배양 후 세포 배양액 100uL를 취하여 10mM Tris-HCl (pH 8.0) 버퍼 900uL와 섞은 후 600nm에서 흡광도를 측정하여 세포 농도를 측정하였다.

도 9는 염산 함유 산성 배지 중에서 여러 재조합 효모 세포를 배양한 결과를 세포 성장으로 나타낸 도면이다.

도 10은 젖산 함유 산성 배지 중에서 여러 재조합 효모 세포를 배양한 결과를 세포 성장으로 나타낸 도면이다.

도 11은 여러 산성 배지 중에서 여러 효모 세포를 20 시간 동안 배양한 결과를 세포 성장으로 나타낸 도면이다. 산성 배지는 통제되지 않은 pH 5.5, 염산으로 조정된 pH2.55, 및 젖산으로 조정된 pH 2.6의 배지를 사용하였다.

도 9 내지 도 11에서, IoGAS1 (서열번호3)과 IoGAS1 (서열번호2)는 각각 pRS426GPD-KanPX (서열번호 3) 벡터 또는 pRS426GPD-KanPX (서열번호 2) 벡터가 도입된 S.cerevisiae CEN.PK2-1D 균주에 대한 결과이다.

도 9에 나타낸 바와 같이, pRS426GPD-KanPX (서열번호 3) 벡터 또는 pRS426GPD-KanPX (서열번호 2) 벡터가 도입된 S.cerevisiae CEN.PK2-1D 균주의 경우, 염산을 포함하는 산성 배지에서, 낮은 pH, 특히 pH 약 2.7 이하에서 대조군 보다 많이 성장하였다.

또한, 도 10에 나타낸 바와 같이, pRS426GPD-KanPX (서열번호 3) 벡터 또는 pRS426GPD-KanPX (서열번호 2) 벡터가 도입된 S.cerevisiae CEN.PK2-1D 균주의 경우, 젖산을 함유하는 산성 배지에서, 낮은 pH 특히 pH 약 2.70이하에서 대조군보다 많이 성장하였다.

따라서, IoGAS1 유전자를 포함하는 효모 균주는 산성이 강하게 되면 될수록 대조군에 비하여 더 많이 성장하는 특성, 즉 산성에 대한 내성을 예기치 않게 가지고 있는 것이다. 또한, 내산성의 효과는 효모가 생산하는 유기산과 무관하게 산성에 대한 내성이 있음을 알 수 있다.

도 9 내지 11에 나타낸 바와 같이, IoGAS1 유전자가 발현될 경우 산성 조건의 pH로 통제한 배지에서의 배양에서 S.cerevisiae CEN.PK2-1D 효모의 내산성이 강화된 것을 확인할 수 있었다. IoGAS1 유전자가 도입된 효모 균주는 염산 및 L-젖산에 대하여 각각 내성을 가지는 것으로 확인되었다.

이상의 실시예로부터, pRS426GPD-KanPX (서열번호 3) 벡터 또는 pRS426GPD-KanPX (서열번호 2) 벡터를 포함하는 효모 균주는 산성이 강하게 되면 될수록 대조군에 비하여 더 많이 성장하는 특성, 즉 산성에 대한 내성을 예기치 않게 가지고 있는 것이다. 정상적인 효모 세포의 생장이 급격하게 억제되는 pH 2.1 내지 7.5, 예를 들면, pH 2.1 내지 2.70, pH 2.1 내지 2.6, pH 2.1 내지 2.5, pH 2.1 내지 2.4, pH 2.1 내지 2.3, pH 2.1 내지 2.2, pH 2.2 내지 2.75, pH 2.2 내지 2.70, pH 2.2 내지 2.6, pH 2.2 내지 2.5, pH 2.2 내지 2.4, pH 2.2 내지 2.3, pH 2.3 내지 2.75, pH 2.3 내지 2.70, pH 2.3 내지 2.6, pH 2.3 내지 2.5, pH 2.3 내지 2.4,pH 2.4 내지 2.75, pH 2.4 내지 2.70, pH 2.4 내지 2.6, pH 2.4 내지 2.5, pH 2.5 내지 2.75, pH 2.5 내지 2.70, 또는 pH 2.5 내지 2.6의 범위에서도 IoGAS1 유전자를 포함하는 효모 세포는 성장할 수 있다.

<110> Samsung Electronics. Co. Ltd. <120> A polypeptide conffering acid tolerant property to a yeast cell, polynucleotide encoding the same, a yeast cell having increased amount of the polypeptide, a method of producing a product using the yeast cell and a method of producing acid tolerant yeast cell <130> PN102304 <160> 28 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 542 <212> PRT <213> Issatchenkia orientalis ATCC 20381 <400> 1 Met Lys Phe Ser Lys Ser Leu Ala Leu Leu Ser Thr Ala Leu Phe Ser 1 5 10 15 Gly Val Ala Thr Ala Asn Asp Asp Phe Pro Thr Ile Asn Val Val Gly 20 25 30 Asn Lys Phe Phe Tyr Ser Asn Asn Ala Ser Gln Phe Tyr Ile Lys Gly 35 40 45 Val Ala Tyr Gln Gln Asn Thr Ala Gly Leu Asp Thr Asp Ala Lys Tyr 50 55 60 Val Asp Pro Leu Ala Asp Glu Glu Ser Cys Lys Arg Asp Ile Pro Tyr 65 70 75 80 Leu Thr Glu Leu His Thr Asn Thr Ile Arg Val Tyr Ala Leu Asn Ala 85 90 95 Ser Ala Asn His Asp Ala Cys Met Asn Ala Leu Gln Asp Ala Gly Ile 100 105 110 Tyr Val Ile Ala Asp Leu Ser Ser Pro Gly Glu Ser Ile Ile Thr Ser 115 120 125 Asp Pro Glu Trp Asp Leu Glu Leu Tyr Asp Arg Tyr Thr Ser Val Ile 130 135 140 Asp Met Met Gln Lys Tyr Asn Asn Val Leu Gly Phe Phe Ala Gly Asn 145 150 155 160 Glu Val Ile Thr Asn Ser Thr Asn Thr Asp Thr Ala Pro Phe Val Lys 165 170 175 Ala Ala Ile Arg Asp Met Lys Lys Tyr Ile Ser Asp Lys Gly Tyr Arg 180 185 190 Asp Ile Pro Val Gly Tyr Ser Ala Asn Asp Asp Ser Asn Thr Arg Val 195 200 205 Gln Ser Ala Asp Tyr Phe Ala Cys Gly Asp Asp Asp Ile Lys Ala Asp 210 215 220 Phe Tyr Gly Ile Asn Met Tyr Glu Trp Cys Gly Asn Ser Asn Phe Lys 225 230 235 240 Glu Ser Gly Tyr Glu Ala Arg Thr Lys Glu Phe Ser Asn Leu Thr Val 245 250 255 Pro Ile Phe Phe Ser Glu Tyr Gly Cys Asn Glu Val Gln Pro Arg Lys 260 265 270 Phe Thr Glu Val Gly Thr Ile Tyr Ser Asp Glu Met Thr Asp Val Trp 275 280 285 Ser Gly Gly Ile Val Tyr Met Tyr Phe Glu Glu Glu Asn Asn Tyr Gly 290 295 300 Leu Val Ser Val Glu Asp Asn Lys Val Ser Thr Met Ala Asp Phe Asn 305 310 315 320 Tyr Leu Lys Ser Glu Leu Gly Ser Ile Ser Pro Thr Tyr Ala Lys Ala 325 330 335 Ser Ala Ala Ser Ala Ser Ala Lys Thr Leu Gln Cys Pro Ser Thr Asp 340 345 350 Lys Asn Trp Ser Ala Ala Thr Asn Leu Pro Pro Thr Pro Asp Gln Ser 355 360 365 Leu Cys Asp Cys Val Glu Ser Ser Val Glu Cys Thr Val Ser Asp Asp 370 375 380 Val Asp Glu Ser Asp Tyr Ser Asp Leu Phe Gly Val Val Cys Asn Tyr 385 390 395 400 Ile Ser Cys Asp Glu Ile Asn Ala Asn Gly Lys Lys Gly Thr Tyr Gly 405 410 415 Ser Tyr Ser Phe Cys Asn Pro Lys Glu Lys Leu Ala Tyr Val Leu Asn 420 425 430 Lys Tyr Tyr Gln Asp Gln Asp Lys Asn Lys Ser Ala Cys Asp Phe Ser 435 440 445 Gly Ser Ala Thr Ile Val Lys Ser Ser Ala Ala Ser Thr Cys Ser Ser 450 455 460 Ile Leu Lys Asn Ala Ser Ala Ser Gln Thr Phe Thr Asn Ser Gly Ser 465 470 475 480 Thr Ala Lys Asp Ser Ser Glu Thr Lys Thr Ser Gly Ser Ala Lys Ser 485 490 495 Val Ser Ser Ile Ser Ser Thr Ser Lys Gly Ala Ala Ala Ser Leu Lys 500 505 510 Ala Pro Met His Ala Ser Ser Leu Ser Ser Met Tyr Leu Cys Thr Leu 515 520 525 Ile Gly Gly Val Val Val Gly Ser Ile Ser Met Ile Leu Ile 530 535 540 <210> 2 <211> 1629 <212> DNA <213> Issatchenkia orientalis ATCC 20381 <400> 2 atgaagttct caaagtctct cgctttacta tctactgctc tctttagcgg agtggccact 60 gctaatgacg atttccctac catcaatgtg gttggaaaca agtttttcta ctccaacaat 120 gcctctcagt tctacatcaa gggtgttgca taccaacaaa acactgcagg cttggacaca 180 gacgcaaagt atgttgatcc attggccgac gaggaaagtt gtaaaagaga cattccatat 240 ttgaccgagc tgcacacaaa taccatcaga gtgtatgccc ttaatgccag tgccaaccac 300 gatgcatgca tgaacgccct gcaagatgct ggtatttacg tcattgcaga cttgtcatct 360 ccaggtgaat ccatcattac cagtgatcca gaatgggatc ttgaattgta tgacagatac 420 acctcggtca ttgatatgat gcagaagtac aacaatgtct tggggttctt tgccggtaac 480 gaagtcatta ctaattccac aaacaccgac actgctcctt ttgtcaaggc ggcaatcaga 540 gatatgaaga agtacatctc cgataagggt tatagggata ttccagttgg ttattctgcg 600 aacgatgact ctaatacgag ggtccaatct gcagattatt ttgcgtgcgg tgatgatgac 660 atcaaagccg acttttatgg tatcaacatg tacgaatggt gtggtaactc caacttcaag 720 gagtccggtt acgaagctag aactaaggaa ttttccaact taactgttcc gattttcttt 780 tctgaatatg gttgtaacga agtccaacca 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tccagaatgg gatcttgaat 540 tgtatgacag atacacctcg gtcattgata tgatgcagaa gtacaacaat gtcttggggt 600 tctttgccgg taacgaagtc attactaatt ccacaaacac cgacactgct ccttttgtca 660 aggcggcaat cagagatatg aagaagtaca tctccgataa gggttatagg gatattccag 720 ttggttattc tgcgaacgat gactctaata cgagggtcca atctgcagat tattttgcgt 780 gcggtgatga tgacatcaaa gccgactttt atggtatcaa catgtacgaa tggtgtggta 840 actccaactt caaggagtcc ggttacgaag ctagaactaa ggaattttcc aacttaactg 900 ttccgatttt cttttctgaa tatggttgta acgaagtcca accaagaaag ttcaccgaag 960 ttggtacaat ttatagtgac gaaatgactg acgtttggtc tggtggtatc gtctacatgt 1020 atttcgagga agaaaacaac tacggtttag tttctgttga ggataacaag gtgtcaacca 1080 tggcagattt caattacttg aagtctgaat taggcagcat cagcccaacc tatgcaaagg 1140 cttccgcagc ttctgcatct gctaaaactt tacaatgtcc atctactgat aagaactggt 1200 ccgcagctac caacttacct ccaactccag atcaatccct ttgtgattgt gtcgaaagtt 1260 ctgttgaatg taccgtttct gatgatgtcg atgaaagtga ttacagtgac ctgtttggtg 1320 tggtttgtaa ctacatctcc tgtgatgaaa ttaacgctaa tggtaagaaa 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Ile Thr Glu Glu Leu Gly Ile Gln Cys 165 170 175 Gly Ala Leu Ser Gly Ala Asn Ile Ala Thr Glu Val Ala Gln Glu His 180 185 190 Trp Ser Glu Thr Thr Val Ala Tyr His Ile Pro Lys Asp Phe Arg Gly 195 200 205 Glu Gly Lys Asp Val Asp His Lys Val Leu Lys Ala Leu Phe His Arg 210 215 220 Pro Tyr Phe His Val Ser Val Ile Glu Asp Val Ala Gly Ile Ser Ile 225 230 235 240 Cys Gly Ala Leu Lys Asn Val Val Ala Leu Gly Cys Gly Phe Val Glu 245 250 255 Gly Leu Gly Trp Gly Asn Asn Ala Ser Ala Ala Ile Gln Arg Val Gly 260 265 270 Leu Gly Glu Ile Ile Arg Phe Gly Gln Met Phe Phe Pro Glu Ser Arg 275 280 285 Glu Glu Thr Tyr Tyr Gln Glu Ser Ala Gly Val Ala Asp Leu Ile Thr 290 295 300 Thr Cys Ala Gly Gly Arg Asn Val Lys Val Ala Arg Leu Met Ala Thr 305 310 315 320 Ser Gly Lys Asp Ala Trp Glu Cys Glu Lys Glu Leu Leu Asn Gly Gln 325 330 335 Ser Ala Gln Gly Leu Ile Thr Cys Lys Glu Val His Glu Trp Leu Glu 340 345 350 Thr Cys Gly Ser Val Glu Asp Phe Pro Leu Phe Glu Ala Val Tyr Gln 355 360 365 Ile Val Tyr Asn Asn Tyr Pro Met Lys Asn Leu Pro Asp Met Ile Glu 370 375 380 Glu Leu Asp Leu His Glu Asp 385 390 <210> 26 <211> 1176 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 26 atgtctgctg ctgctgatag attaaactta acttccggcc acttgaatgc tggtagaaag 60 agaagttcct cttctgtttc tttgaaggct gccgaaaagc ctttcaaggt tactgtgatt 120 ggatctggta actggggtac tactattgcc aaggtggttg ccgaaaattg taagggatac 180 ccagaagttt tcgctccaat agtacaaatg tgggtgttcg aagaagagat caatggtgaa 240 aaattgactg aaatcataaa tactagacat caaaacgtga aatacttgcc tggcatcact 300 ctacccgaca atttggttgc taatccagac ttgattgatt cagtcaagga tgtcgacatc 360 atcgttttca acattccaca tcaatttttg ccccgtatct gtagccaatt gaaaggtcat 420 gttgattcac acgtcagagc tatctcctgt ctaaagggtt ttgaagttgg tgctaaaggt 480 gtccaattgc tatcctctta catcactgag gaactaggta ttcaatgtgg tgctctatct 540 ggtgctaaca ttgccaccga agtcgctcaa gaacactggt ctgaaacaac agttgcttac 600 cacattccaa aggatttcag aggcgagggc aaggacgtcg accataaggt tctaaaggcc 660 ttgttccaca gaccttactt ccacgttagt gtcatcgaag atgttgctgg tatctccatc 720 tgtggtgctt 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His Ser Lys Leu Val Ile Ile Thr Ala 85 90 95 Gly Ala Arg Gln Gln Glu Gly Glu Ser Arg Leu Asn Leu Val Gln Arg 100 105 110 Asn Val Asn Ile Phe Lys Phe Ile Ile Pro Asn Val Val Lys Tyr Ser 115 120 125 Pro Asp Cys Met Leu Leu Val Val Ser Asn Pro Val Asp Ile Leu Thr 130 135 140 Tyr Val Ala Trp Lys Ile Ser Gly Phe Pro Lys His Arg Val Ile Gly 145 150 155 160 Ser Gly Cys Asn Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg Tyr Leu Met Gly Glu 165 170 175 Lys Leu Gly Ile His Ser Leu Ser Cys His Gly Trp Ile Ile Gly Glu 180 185 190 His Gly Asp Ser Ser Val Pro Val Trp Ser Gly Val Asn Val Ala Gly 195 200 205 Val Ser Leu Lys Ala Leu Tyr Pro Asp Leu Gly Thr Asp Ala Asp Lys 210 215 220 Glu His Trp Lys Glu Val His Lys Gln Val Val Asp Ser Ala Tyr Glu 225 230 235 240 Val Ile Lys Leu Lys Gly Tyr Thr Ser Trp Ala Ile Gly Leu Ser Val 245 250 255 Ala Asp Leu Ala Glu Thr Val Met Lys Asn Leu Arg Arg Val His Pro 260 265 270 Ile Ser Thr Met Val Lys Gly Met Tyr Gly Val Ser Ser Asp Val Phe 275 280 285 Leu Ser Val Pro Cys Val Leu Gly Tyr Ala Gly Ile Thr Asp Val Val 290 295 300 Lys Met Thr Leu Lys Ser Glu Glu Glu Glu Lys Leu Arg Lys Ser Ala 305 310 315 320 Asp Thr Leu Trp Gly Ile Gln Lys Glu Leu Gln Phe 325 330 <210> 28 <211> 999 <212> DNA <213> Pelodiscus sinensis japonicus <400> 28 atgtccgtaa aggaactact tatacaaaac gtccataagg aggagcattc tcacgctcac 60 aataagataa cagttgtagg agtaggtgca gtaggtatgg catgtgctat ttcgatatta 120 atgaaagact tggctgatga actagccttg gttgatgtga ttgaggataa gttacgtgga 180 gaaatgttag atttgcaaca tggttcattg ttcttgagaa cccccaaaat tgtctcgggt 240 aaggattatt cagtcactgc tcattctaaa ctggttatca ttacagcagg tgcaagacag 300 caagaagggg agagcagact aaatctggtt caacgtaatg tcaacatctt caagtttatc 360 atcccgaacg tagtaaaata cagtccagac tgcatgttgc ttgttgtgag taatccagtt 420 gacatcttaa cctatgttgc gtggaaaatc agtgggtttc caaaacatag ggtgattggc 480 tcaggatgca accttgatag cgccaggttt aggtatctaa tgggagaaaa attaggtatt 540 cactccttat cttgtcatgg ctggataata ggcgaacatg gtgattcttc ggtacctgtt 600 tggtccgggg ttaatgtggc tggtgttagt ttaaaagcat tatatcctga cctgggtact 660 gatgccgata aagaacattg gaaagaagtg cacaaacaag tggttgattc tgcttacgaa 720 gttattaaac ttaagggcta cacttcttgg gctataggtc tatcagtagc tgatttggca 780 gaaaccgtta tgaaaaattt aagaagagtc cacccaattt ccacgatggt caagggtatg 840 tacggtgtta gctctgacgt cttcttatct gttccttgtg ttttgggata tgcgggaatt 900 acagacgtcg tgaagatgac attgaaatca gaggaagagg aaaaactaag aaagtcagcc 960 gatactctgt ggggcattca aaaggaattg cagttttaa 999

Claims (29)

1. 효모에 내산성을 부여하는 특성을 가진, 서열번호 1과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.
2. 청구항 1의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
3. 청구항 2에 있어서, 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 폴리뉴클레오티드.
4. 서열번호 1과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 베타-1,3-글루카노실트란스퍼라제의 양이 증가되어 있는 내산성을 갖는 효모 세포.
5. 청구항 4에 있어서, 서열번호 1과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 베타-1,3-글루카노실트란스퍼라제의 양은 서열번호 1과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현의 증가에 의하여 증가된 것인 효모 세포.
6. 청구항 4에 있어서, 서열번호 1과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 도입된 것인 효모 세포.
7. 청구항 4에 있어서, 서열번호 1과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현이 증가되도록 그의 내재적 유전자가 증폭되거나, 그의 내재적 유전자 또는 그 조절 서열이 변이된 것인 효모 세포.
8. 청구항 4에 있어서, 상기 효모 세포는 Issatchenkia 속, Kluyveromyces 속, Pichia 속, Saccharomyces 속, Zygosaccharomyces 속, 또는 Schizosaccharomyces 속에 속하는 것인 효모 세포.
9. 청구항 4에 있어서, 유기산, 무기산, 또는 그 조합에 대하여 내성을 갖는 것인 효모 세포.
10. 청구항 4에 있어서, 아세트산, 젖산, 프로피온산, 3-히드록시프로피온산, 부티르산, 4-히드록시부티르산, 숙신산, 푸마르산, 말산, 옥살산, 아디프산, 염산, 황산, 또는 그 조합에 대하여 내성을 갖는 것인 효모 세포.
11. 청구항 4에 있어서, 서열번호 1과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 베타-1,3-글루카노실트란스퍼라제의 양이 증가되어 있지 않은 효모 세포에 비하여, pH 2.0 내지 3.0의 범위에서 더 잘 생장할 수 있는 것인 효모 세포.
12. 청구항 4에 있어서, 피루베이트를 락테이트로 전환하는 활성을 가진 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자를 포함하는 것인 효모 세포.
13. 청구항 4에 있어서, 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 활성, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 활성, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트 (G3P)로 전환하는 활성, 또는 그 조합이 제거되거나 감소된 것인 효모 세포.
14. 청구항 4에 있어서, 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트 (G3P)로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 또는 그 조합이 불활성화되거나 감소된 것인 효모 세포.
15. 청구항 4에 있어서, 수탁번호 KCTC 12415 BP인 효모 세포에 서열번호 1과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 유전자가 포함되어 있는 것인 효모 세포.
16. 서열번호 1과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 베타-1,3-글루카노실트란스퍼라제의 양이 증가되어 있고 내산성을 갖는 효모 세포를 배지 중에서 배양하는 단계; 및
    배양물로부터 산물을 분리하는 단계;를 포함하는 내산성 효모 세포로부터 산물을 생산하는 방법.
17. 청구항 16에 있어서, 상기 배양은 배양 전부 또는 그 일부의 기간 동안 산성 조건에서 배양하는 것인 방법.
18. 청구항 16에 있어서, 상기 산성 조건은 pH 2.0 내지 pH 4.0인 것인 방법.
19. 청구항 16에 있어서, 상기 산물은 유기산인 것인 방법.
20. 청구항 16에 있어서, 상기 유기산은 아세트산, 젖산, 프로피온산, 3-히드록시프로피온산, 부티르산, 4-히드록시부티르산, 숙신산, 푸마르산, 말산, 옥살산, 아디프산, 또는 그 조합인 것인 방법.
21. 청구항 16에 있어서, 상기 분리하는 단계는 배양물로부터 유리산 (free acid)을 분리하는 것인 방법.
22. 청구항 16에 있어서, 상기 효모 세포는 서열번호 1과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 베타-1,3-글루카노실트란스퍼라제의 양이 서열번호 1과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현의 증가에 의하여 증가된 것인 방법.
23. 청구항 16에 있어서, 상기 효모 세포는 서열번호 1과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 도입된 것인 방법.
24. 청구항 16에 있어서, 상기 효모 세포는 서열번호 1과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현이 증가되도록 그의 내재적 유전자가 증폭되거나, 그의 내재적 유전자 또는 그 조절 서열이 변이된 것인 방법.
25. 청구항 16에 있어서, 상기 효모 세포는 수탁번호 KCTC 12415 BP인 효모 세포에 서열번호 1과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 유전자가 포함되어 있는 것인 효모 세포이고,
    상기 산물은 젖산인 것인 방법.
26. 서열번호 1과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 또는 베타-1,3-글루카노실트란스퍼라제를 코딩하는 유전자를 효모 세포에 도입하는 단계;를 포함하는, 내산성 효모 세포를 생산하는 방법.
27. 서열번호 1과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 또는 베타-1,3-글루카노실트란스퍼라제를 코딩하는 내재적 유전자의 발현이 증가되도록 유전적으로 조작하는 단계;를 포함하는, 내산성 효모 세포를 생산하는 방법.
28. 청구항 27에 있어서, 상기 조작은 상기 유전자를 증폭하는 것, 상기 유전자의 조절 서열을 조작하는 것, 또는 상기 유전자 자체의 서열을 조작하는 것을 포함하는 것인 방법.
29. 청구항 27에 있어서, 상기 조작은 뉴클레오티드의 삽입, 치환, 전환 또는 부가인 것인 방법.
    
    
    

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