JP3013711B2 - 変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼとその遺伝子及びアミノ酸の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、変異型ホスホエノール
ピルビン酸カルボキシラーゼ、それをコードする遺伝子
及びアミノ酸の製造方法に関し、詳しくは、アスパラギ
ン酸によるフィードバック阻害を解除する変異を有する
遺伝子とその利用に関する。

【０００２】

【従来の技術】ホスホエノールピルビン酸カルボキシラ
ーゼは、大部分の細菌や全ての植物に見いだされる酵素
である。本酵素の役割は、アスパラギン酸やグルタミン
酸の生合成および、クエン酸サイクルに回転維持のため
にＣ４ジカルボン酸を供給することにある。しかし、微
生物を用いたアミノ酸の発酵生産において本酵素が及ぼ
す影響を示した報告は少なく、その重要性は明らかでは
ない（Atushi, Yokota and Isamu, Shiio, Agric. Bio
l. Chem., 52, 455-463 (1988)、Josef, Cremer et a
l., Appl. Environ. Microbiol., 57, 1746-1752 (199
1)、Petra, G. Peters-Weintisch, FEMS Microbiol. Le
tters, 112, 269-274 (1993)）。

【０００３】ところで、アミノ酸はタンパクの成分とし
て細胞に普遍的に存在する化合物であるが、経済的なエ
ネルギー代謝及び物質代謝のために、その生産は厳密に
制御されている。この制御は、主としてフィードバック
制御、すなわち代謝経路の下流における産物が上流の反
応を触媒する酵素の活性を阻害することによる制御であ
り、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼも、活
性発現に様々な調節を受けている。

【０００４】例えば、エシェリヒア（Escherichia）
属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属細菌の
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼでは、アス
パラギン酸によって活性が阻害される。

【０００５】従来、アミノ酸醗酵においては効率的な生
産のために種々の技術が開発され、フィードバック制御
に非感受性になった変異株を使用したロイシン、イソロ
イシン、トリプトファン、フェニルアラニン等の醗酵生
産が行われている。しかしながら、アスパラギン酸によ
る阻害に非感受性になったホスホエノールピルビン酸カ
ルボキシラーゼ変異酵素や、これをアスパラギン酸属や
グルタミン酸族のアミノ酸の醗酵生産に利用するという
試みは知られていない。

【０００６】一方、大腸菌（Escherichia coli）のホ
スホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする
遺伝子である ppc 遺伝子はすでにクローニングされ、
塩基配列も決定されている（Fujita,N.,Miwa,T.,Ishiji
ma,S.,Izui,K. and KatsukiH. J.Biochem.95,909-916(1
984)）が、同酵素においてもアスパラギン酸による阻害
が解除された変異体の報告はない。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記観点か
らなされたものであり、アスパラギン酸によるフィード
バック阻害が実質的に解除されたホスホエノールピルビ
ン酸カルボキシラーゼ及びその遺伝子及びその利用法を
提供することを課題とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するために鋭意検討を重ねた結果、大腸菌のホスホ
エノールピルビン酸カルボキシラーゼのＮ末端から４３
８番目のアルギニンをシステインに変換することによっ
てアスパラギン酸による阻害が実質的に解除される事を
見いだし、そのような変異酵素をコードする遺伝子を取
得する事に成功した。また、大腸菌のホスホエノールピ
ルビン酸カルボキシラーゼのＮ末端から６２０番目のリ
ジンをセリンに変換することによってアスパラギン酸に
よる阻害が実質的に解除される事を見いだし、そのよう
な変異酵素をコードする遺伝子を取得する事に成功し
た。これらの結果、本発明を完成させるに至った。

【０００９】すなわち本願発明は、エシェリヒア属に属
する微生物由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシ
ラーゼにおいて、Ｎ−末端から４３８番目のアルギニン
がシステインに置換された、またはＮ末端から６２０番
目のリジンがセリンに置換されたことを特徴とする変異
型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、及びこ
の変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを
コードするＤＮＡ配列である。本発明はさらに、このＤ
ＮＡ断片を保持するエシェリヒア属又はコリネホルム細
菌に属する微生物、及びこれらの微生物を好適な培地で
培養し、この培地からＬ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ
−メチオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−グルタミン酸、
Ｌ−アルギニン及びＬ−プロリンから選ばれるアミノ酸
を分離することを特徴とするアミノ酸の製造方法を提供
する。

【００１０】尚、本明細書において、変異型ホスホエノ
ールピルビン酸カルボキシラーゼをコードするＤＮＡ配
列あるいはこれにプロモーターを含むＤＮＡ配列を、単
に「本発明のＤＮＡ配列」、あるいはホスホエノールピ
ルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子ということがある。以
下、本発明について詳細に説明する。

【００１１】＜１＞変異型ホスホエノールピルビン酸カ
ルボキシラーゼ 本発明の変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラ
ーゼ（以下、単に「変異型酵素」ともいう）は、エシェ
リヒア属に属する微生物のホスホエノールピルビン酸カ
ルボキシラーゼにおいて、ホスホエノールピルビン酸カ
ルボキシラーゼのアスパラギン酸によるフィードバック
阻害を解除する変異を有するものである。

【００１２】このような変異としては、ホスホエノール
ピルビン酸カルボキシラーゼの酵素活性を失わないま
ま、上記フィードバック阻害を実質的に解除するもので
あればどのようなものでもよいが、具体的には、ホスホ
エノールピルビン酸カルボキシラーゼのＮ−末端から４
３８番目のアルギニンをシステインに置換させる変異が
挙げられる。あるいは、ホスホエノールピルビン酸カル
ボキシラーゼのＮ−末端から６２０番目のリジンをセリ
ンに置換させる変異が挙げられる。

【００１３】一方、本発明者らは、大腸菌のアスパラギ
ン酸結合蛋白質におけるアルギニン残基の重要性（Krik
os,A.,Mouth,N.Boyd A and Simon M.I. Cell,33,615-6
22(1983),Mowbray,S.L and Koshland,D.E. J.Biol.Che
m.264,15638-15643(1990),Milburn,M.V.Prive,G.G.,Mil
ligan,D.L.,Scott,W.G.,Yeh,J.Jancarik,J.,Koshkand,
D.E. and Kim,S.H. Science,254,1342-1347(1991)）に
着目し、鋭意検討を重ねた結果、４３８番目のアルギニ
ンをシステインに変換することによってアスパラギン酸
による阻害が実質的に解除される事を見いだした。４３
８番目のアルギニンをシステインに変換するには、ホス
ホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺
伝子の４３８番目のアルギニンのコドンをシステインの
コドンに変換すればよい。例えば、配列番号１におい
て、ヌクレオチド番号１５４８〜１５５０のＣＧＴを、
ＴＧＴ又はＴＧＣに変換すればよい。

【００１４】また、本発明者らは、蛋白質中のリジン残
基を化学修飾する化合物である２，４，６−トリニトロ
ベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）によって、ホスホエノ
ールピルビン酸カルボキシラーゼのリジン残基の化学修
飾を行った。修飾反応を行う際、ホスホエノールピルビ
ン酸カルボキシラーゼの阻害剤となりうるリンゴ酸を共
存させた。つまり、ホスホエノールピルビン酸カルボキ
シラーゼと基質との結合部位近傍のリジン残基は、結合
したリンゴ酸によって保護を受けて化学修飾されないだ
ろうと仮定したのである。その結果、６２０番目のリジ
ン残基がホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼと
リンゴ酸との結合にとって重要であることが示唆され、
さらに、この６２０番目のリジン残基をセリン残基に変
換することによって、ホスホエノールピルビン酸カルボ
キシラーゼの酵素活性が維持されたまま、アスパラギン
酸によるフィードバック阻害が解除されることが見いだ
された。６２０番目のリジン残基をセリン残基に変換す
るには、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを
コードする遺伝子の６２０番目のリジンのコドンをセリ
ンのコドンに変換すればよい。例えば、配列番号１にお
いて、ヌクレオチド番号ＡＡＡを、ＴＣＴ、ＴＣＣ、Ｔ
ＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴ又はＡＧＣに置換すればよい。

【００１５】エシェリヒア属に属する微生物のホスホエ
ノールピルビン酸カルボキシラーゼとして、大腸菌のホ
スホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子から推
定されるアミノ酸配列（Fujita,N.,Miwa,T.,Ishijima,
S.,Izui,K. and Katsuki H. J.Biochem.95,909-916(198
4)）を、配列表配列番号１に示す。

【００１６】本発明の変異型酵素は、下記の本発明のＤ
ＮＡ配列によってコードされ、このＤＮＡ配列を大腸菌
等で発現させることにより生産される。

【００１７】＜２＞本発明のＤＮＡ配列及びそれを保持
する微生物 一方、本発明のＤＮＡ配列は、上記変異型酵素をコード
するＤＮＡ配列であり、エシェリヒア属に属する微生物
のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコード
するＤＮＡ断片において、ホスホエノールピルビン酸カ
ルボキシラーゼのアスパラギン酸によるフィードバック
阻害を解除する変異をコーディング領域内に有する。こ
のようなＤＮＡ配列は、ホスホエノールピルビン酸カル
ボキシラーゼをコードするＤＮＡ配列に、上記アミノ酸
の変異に相当するコドンに変異を導入することにより得
られる。

【００１８】変異を導入する遺伝子は、エシェリヒア属
に属する微生物のホスホエノールピルビン酸カルボキシ
ラーゼをコードする遺伝子であれば、いかなるものでも
よく、塩基配列が決定されておりクローン化されている
ことが好ましい。このような遺伝子として、例えば、す
でにクローニングされ塩基配列も決定されている、大腸
菌の遺伝子（Fujita,N.,Miwa,T.,Ishijima,S.,Izui,K.
and Katsuki H. J.Biochem.95,909-916(1984)）が挙げ
られる。この遺伝子のコーディング領域の配列は、配列
番号１に示したとおりである（塩基番号２３７〜２８８
８）。

【００１９】ホスホエノールピルビン酸カルボキシラー
ゼ遺伝子にアミノ酸置換、挿入および欠失等の変異を実
施する方法としては、Overlapping Extension法（Ho.,
S.N.,Hunt,H.D.,Horton,R,M.,Pullen,J.K. and Pease,
L.R.,Gene,77,51-59(1989)）、部位特異的変異法（Kram
er,W. and Frits,H.J.,Meth. in Enzymol.,154,350 (19
87); Kunkel,T.A. et.al.,Meth. in Enzymol.,154,367
(1987)）などが挙げられる。これらは、未変異の遺伝子
ＤＮＡを鋳型とし、変異点にミスマッチを含む合成ＤＮ
Ａをプライマーとして前記遺伝子ＤＮＡの相補鎖を合成
することにより、変異を導入するという原理に則ってい
る。これらの方法を用いれば、目的部位に意図する変異
を起こすことができる。

【００２０】その他、両末端に制限酵素切断末端を持
ち、変異点の両側を含む配列を合成し、未変異遺伝子の
相当する部分と入れ換える事により、変異を導入するこ
とができる（カセット変異法）。

【００２１】上記のようにして変異が導入されたホスホ
エノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードするＤＮ
Ａ配列を、適当な宿主−ベクター系に導入し、このＤＮ
Ａ配列を発現させることによって、変異型酵素を生産さ
せることができる。また、本発明のＤＮＡ断片を、宿主
染色体ＤＮＡ内に組み込むことにより形質転換してもよ
い。

【００２２】宿主としては、エシェリヒア属に属する微
生物、例えば、大腸菌、コリネホルム細菌等が挙げられ
る。コリネホルム細菌は、コリネバクテリウム属細菌、
従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コリ
ネバクテリウム属細菌として統合されたブレビバクテリ
ウム属細菌、及びコリネバクテリウム属細菌と非常に近
縁なブレビバクテリウム属細菌であって、グルタミン酸
を生産するものである。尚、アミノ酸製造に好適な宿主
については、後述する。

【００２３】一方、ベクターＤＮＡとしては、プラスミ
ドベクターが好ましく、宿主の細胞内で自立複製可能な
ものが好ましい。宿主が大腸菌の場合には、例えば pUC
19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG399、RSF1010等が挙
げられる。他にもファージＤＮＡのベクターも利用でき
る。

【００２４】また、宿主がコリネホルム細菌の場合に使
用できるベクター及びそれを保持する宿主を以下に例示
する。尚、かっこ内に国際寄託機関の寄託番号を示し
た。

【００２５】 pAJ655 エシェリヒア・コリAJ11882(FERM BP-136)コリネハ゛クテリウム・ク゛ルタミクム SR8201(ATCC39135) pAJ1844 エシェリヒア・コリAJ11883(FERM BP-137)コリネハ゛クテリウム・ク゛ルタミクム SR8202(ATCC39136) pAJ611 エシェリヒア・コリAJ11884(FERM BP-138) pAJ3148 コリネハ゛クテリウム・ク゛ルタミクムSR8203(ATCC39137) pAJ440 ハ゛チルス・ス゛フ゛チリスAJ11901(FERM BP-140)

【００２６】これらのベクターは、寄託微生物から次の
ようにして得られる。対数増殖期に集められた細胞をリ
ゾチーム及びＳＤＳを用いて溶菌し、３００００×ｇで
遠心分離して溶解物から得た上澄液にポリエチレングリ
コールを添加し、セシウムクロライド−エチジウムブロ
マイド平衡密度勾配遠心分離により分別精製する。

【００２７】本発明のＤＮＡ配列を上記ベクターに挿入
して得られる組換えベクターで大腸菌を形質転換するに
は、例えば細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透
過性を高める方法（Mandel, M. and Higa, A., J. Mol.
Biol., 53, 159 (1977)）等、通常大腸菌の形質転換に
用いられる方法を用いることができる。

【００２８】また、コリネホルム細菌の形質転換法とし
ては、上記の細胞を塩化カルシウムで処理する方法、ま
たは細胞がＤＮＡを取込可能な特定の成長時期に取り込
む方法（Duncan, C. H. et al.によるバチルス・ズブチ
リスに関する報告）がある。さらに、プラチミドＤＮＡ
を容易に取り込むＤＮＡ受容体のプロトプラストまたは
スフェロプラストを成形することによって細菌細胞内に
取り込むことが可能である。これらは、バチルス・ズブ
チリス、アクチノマイセス及び酵母について知られてい
る（Chang, S. et al. Molec. Gen. Genet., 168, 111,
(1979)、Bibbet al., Nature, 274, 398, (1978)、Hin
nen, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 19
29 (1978)）。その他、特開平２−２０７７９１号公報
にコリネバクテリウム細菌の形質転換法が開示されてい
る。

【００２９】本発明のＤＮＡ配列を上記宿主内で発現さ
せるには、ｌａｃ、ｔｒｐ、ＰＬ等の微生物内で効率よ
く働くプロモーターを用いてもよく、本発明のＤＮＡ配
列がホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子
のプロモーターを含んでいる場合は、これをそのまま用
いてもよい。また、コリネホルム細菌を宿主とする場合
は、公知のブレビバクテリウム属細菌由来のｔｒｐプロ
モーター（特開昭６２−２４４３８２号公報）等を使用
することもできる。

【００３０】また、上記のように、本発明のＤＮＡ配列
を自立複製可能なベクターＤＮＡに挿入したものを宿主
に導入し、プラスミドとして宿主に保持させてもよい
が、本発明のＤＮＡ配列を、トランスポゾン（Berg,D.
E. and Berg,C.M.,Bio/Technol.,1,417(1983)）、Ｍｕ
ファージ（特開平２−１０９９８５）または相同性組換
え（Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring
Habor Lab.(1972)）を用いた方法でエシェリヒア属細
菌の染色体に組み込んでもよい。また、コリネホルム細
菌の染色体に本発明のＤＮＡを組み込むには、特開平５
−７４９１号公報に開示される温度感受性プラスミドが
利用できる。

【００３１】上記のようにして本発明のＤＮＡ配列で形
質転換された微生物を培養し、このＤＮＡ配列を発現さ
せると、変異型酵素が得られる。このようにして得られ
た変異型酵素が、アスパラギン酸によるフィードバック
阻害が解除されているかどうかは、酵素反応系にアスパ
ラギン酸を添加して活性を測定することにより、明かと
なる。酵素活性の測定には、分光学的方法（Yoshinaga,
T.,Izui,K and Katsuki,H. J.Biochem.,68,747-750(197
0)）等を用いる事ができる。

【００３２】また、本発明のＤＮＡ配列は、アスパラギ
ン酸によるフィードバック阻害が解除された変異酵素を
コードしているので、このＤＮＡ配列を有する微生物
を、以下に示すように、アスパラギン酸族やグルタミン
酸族のアミノ酸の効率的な醗酵生産に利用することがで
きる。

【００３３】＜３＞アミノ酸の製造方法 本発明のＤＮＡ配列を保持する微生物を好適な培地で培
養し、生じたアミノ酸を分離することにより、アミノ酸
を製造することができる。このようなアミノ酸として、
Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−イ
ソロイシン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アルギニン、Ｌ−
プロリンが挙げられる。

【００３４】以下に、本発明のＤＮＡ配列を導入し各ア
ミノ酸の製造に使用するのに好適な宿主及び培養法を例
示する。

【００３５】（１）本発明のアミノ酸の製造方法に好適
な宿主 (i)Ｌ−リジン製造に好適な宿主 本発明によるＬ−リジン製造に用いる宿主として、エシ
ェリヒア属細菌、好ましくはＬ−リジン生産性の大腸菌
が挙げられる。具体的には、リジンアナログに耐性を有
する変異株が例示できる。このリジンアナログは、エシ
ェリヒア属の微生物の増殖を阻害するようなものである
が、その抑制はＬ−リジンが培地中に共存すれば、全体
的または部分的に解除されるようなものである。例え
ば、オキサリジン、リジンハイドロキサメート、Ｓ−
（２−アミノエチル）−システイン（以下、「ＡＥＣ」
と略記する）、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラ
クタム等がある。これらのリジンアナログに耐性を有す
る変異株は、通常の人工変異操作をエシェリヒア属の微
生物に施すことにより得られる。Ｌ−リジン製造に用い
る菌株として、具体的には、エシェリヒア・コリ ＡＪ
１１４４２（ＦＥＲＭ Ｐ−５０８４として寄託されて
いる。特開昭５６−１８５９６号公報第４７１頁左下欄
参照）が挙げられる。

【００３６】一方、コリネホルム細菌の種々の人工変異
株が、Ｌ−リジン生産菌として用いられており、これら
を本発明に使用することができる。このような人工変異
株としては次のようなものがある。ＡＥＣ耐性変異株、
その成長にＬ−ホモセリンのようなアミノ酸を必要とす
る変異株（特公昭４８−２８０７８号，特公昭５６−６
４９９号），ＡＥＣに耐性を示し、更にＬ−ロイシン、
Ｌ−ホモセリン，Ｌ−プロリン，Ｌ−セリン，Ｌ−アル
ギニン，Ｌ−アラニン，Ｌ−バリン等のアミノ酸を要求
する変異株（米国特許第３７０８３９５号及び第３８２
５４７２号），ＤＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタ
ム，α−アミノ−ラウリルラクタム，アスパラギン酸−
アナログ，スルファ剤，キノイド，Ｎ−ラウロイルロイ
シンに耐性を示すＬ−リジン生産変異株，オキザロ酢酸
脱炭酸酵素（デカルボキシラ−ゼ）または呼吸系酵素の
阻害剤に耐性を示すＬ−リジン生産変異株（特開昭５０
−５３５８８号，特開昭５０−３１０９３号，特開昭５
２−１０２４９８号，特開昭５３−９３９４号，特開昭
５３−８６０８９号特開昭５５−９７８３号，特開昭５
５−９７５９号，特開昭５６−３２９９５号，特開昭５
６−３９７７８号，特公昭５３−４３５９１号，特公昭
５３−１８３３号），イノシトールまたは酢酸を要求す
るＬ−リジン生産変異株（特開昭５５−９７８４号，特
開昭５６−８６９２号），フルオロピルビン酸または３
４℃以上の温度に対して感性を示すＬ−リジン生産変異
株（特開昭５５−９７８３号，特開昭５３−８６０９０
号）、エチレングリコールに耐性を示し、Ｌ−リジンを
生産するブレビバクテリウムまたはコリネバクテリウム
の変異株（米国特許出願第３３３４５５号参照）。

【００３７】また、以下に示すコリネホルム細菌の野生
株、あるいは同株にＬ−リジン生産性の性質を付与した
株も同様に本発明に使用することができる。

【００３８】 コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム ＡＴＣＣ １３８７０ コリネバクテリウム・アセトグルタミクム ＡＴＣＣ １５８０６ コリネバクテリウム・カルナエ ＡＴＣＣ １５９９１ コリネバクテリウム・グルタミクム ＡＴＣＣ １３０３２ ＡＴＣＣ １３０６０ （ブレビバクテリウム・ディバリカタム） ＡＴＣＣ １４０２０ （ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム） ＡＴＣＣ １３８６９ （コリネバクテリウム・リリウム） ＡＴＣＣ １５９９０ コリネバクテリウム・メラセコーラ ＡＴＣＣ １７９６５ ブレビバクテリウム・サッカロリティクム ＡＴＣＣ １４０６６ ブレビバクテリウム・インマリオフィルム ＡＴＣＣ １４０６８ ブレビバクテリウム・ロゼウム ＡＴＣＣ １３８２５ ブレビバクテリウム・フラバム ＡＴＣＣ １３８２６ ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ＡＴＣＣ １９２４０ ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ＡＴＣＣ １５３５４

【００３９】(ii)Ｌ−スレオニン製造に好適な宿主 エシェリヒア属細菌としては、以下の菌株が挙げられ
る。エシェリヒア・コリ AJ12349 (FERM P-9574) 特開平2-458号公報
第887頁左上欄参照エシェリヒア・コリ AJ12351 (FERM P-9576) 特開平2-458号公報
第887頁右下欄参照エシェリヒア・コリ AJ12352 (FERM P-9577) 特開平2-458号公報
第888頁左上欄参照エシェリヒア・コリ AJ11332 (FERM P-4898) 特開平2-458号公報
第889頁左上欄参照エシェリヒア・コリ AJ12350 (FERM P-9575) 特開平2-458号公報
第889頁左上欄参照エシェリヒア・コリ AJ12353 (FERM P-9578) 特開平2-458号公報
第889頁右上欄参照エシェリヒア・コリ AJ12358 (FERM P-9764) 特開平2-458号公報
第890頁左上欄参照エシェリヒア・コリ AJ12359 (FERM P-9765) 特開平2-458号公報
第890頁左上欄参照エシェリヒア・コリ AJ11334 (FERM P-4900) 特公平1-29559号公
報第201頁６欄参照エシェリヒア・コリ AJ11333 (FERM P-4899) 特公平1-29559号公
報第201頁６欄参照エシェリヒア・コリ AJ11335 (FERM P-4901) 特公平1-29559号公
報第202頁７欄参照

【００４０】コリネホルム細菌としては、以下の菌株が
挙げられる。フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・ラクトファーメンタム AJ11188 (FERM P-4190) 特開
昭60-87788号公報第473頁 右上欄参照コリネハ゛クテリウム・ク゛ルタミクム AJ11682 (FERM BP-118) 特公平2-3
1956号公報第230頁８欄参 照フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・フラハ゛ム AJ11683 (FERM BP-119) 特公平2-3
1956号公報第231頁10欄参 照

【００４１】(iii)Ｌ−メチオニン製造に好適な宿主 Ｌ−メチオニン製造には、以下の菌株が挙げられる。エシェリヒア・コリ AJ11457 (FERM P-5175) 特開昭56-35992号
公報第552頁右上欄参照エシェリヒア・コリ AJ11458 (FERM P-5176) 特開昭56-35992号
公報第552頁右上欄参照エシェリヒア・コリ AJ11459 (FERM P-5177) 特開昭56-35992号
公報第552頁右上欄参照エシェリヒア・コリ AJ11539 (FERM P-5479) 特開昭56-144092号
公報第435頁左下欄参照エシェリヒア・コリ AJ11540 (FERM P-5480) 特開昭56-144092号
公報第435頁左下欄参照エシェリヒア・コリ AJ11541 (FERM P-5481) 特開昭56-144092号
公報第435頁左下欄参照エシェリヒア・コリ AJ11542 (FERM P-5482) 特開昭56-144092号
公報第435頁左下欄参照

【００４２】(iV)Ｌ−アスパラギン酸製造に好適な宿主 Ｌ−アスパラギン酸製造には以下の菌株が挙げられる。フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・フラハ゛ム AJ3859 (FERM P-2799) 特開昭51-6
1689号公報第524頁左上欄 参照フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・ラクトファーメンタム AJ3860 (FERM P-2800) 特開
昭51-61689号公報第524頁左上欄参照コリネハ゛クテリウム・アセトアシト゛フィラム AJ3877 (FERM P-2803) 特開昭
51-61689号公報第524頁左 上欄参照コリネハ゛クテリウム・ク゛ルタミクム AJ3876 (FERM P-2802) 特開昭51-6
1689号公報第524頁左上欄 参照

【００４３】(v)Ｌ−イソロイシン製造に好適な宿主 エシェリヒア属細菌としては、エシェリヒア・コリ KX141 (VKPM-
B4781)（特開平4-330275号公報４５段落参照）が、コリ
ネホルム細菌としては、フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・ラクトファーメンタム AJ12
404 (FERM P-10141)（特開平2-42988号公報第603頁左下
欄参照）、フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・フラハ゛ム AJ12405 (FERM P-1014
2)（特開平2-42988号公報第524頁左下欄参照）が挙げら
れる。

【００４４】(vi)Ｌ−グルタミン酸製造に好適な宿主 エシェリヒア属細菌としては、以下の菌株が挙げられ
る。エシェリヒア・コリ AJ12628 (FERM P-12380) '93年フランス特許
公開No. 2 680 178号参照エシェリヒア・コリ AJ12624 (FERM P-12379) '93年フランス特許
公開No. 2 680 178号参照 コリネホルム細菌としては、以下の菌株が挙げられる。フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・ラクトファーメンタム AJ12745 (FERM BP-2922) 特
開平3-49690号公報第561頁 右下欄参照フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・ラクトファーメンタム AJ12746 (FERM BP-2923) 特
開平3-49690号公報第562頁 左上欄参照フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・ラクトファーメンタム AJ12747 (FERM BP-2924) 特
開平3-49690号公報第562頁 左上欄参照フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・ラクトファーメンタム AJ12748 (FERM BP-2925) 特
開平3-49690号公報第562頁 左上欄参照フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・フラハ゛ム ATCC 14067 特開平5-3793号公報第
３頁表１参照コリネハ゛クテリウム・ク゛ルタミクム ATCC 21492 特開平5-3793号公報第
３頁表１参照

【００４５】(vii)Ｌ−アルギニン製造に好適な宿主 エシェリヒア属細菌としては、以下の菌株が挙げられ
る。エシェリヒア・コリ AJ11593 (FERM P-5616) 特開昭57-5693号公
報第468頁左上欄参照エシェリヒア・コリ AJ11594 (FERM P-5617) 特開昭57-5693号公
報第468頁右上欄参照 コリネホルム細菌としては、以下の菌株が挙げられる。フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・フラハ゛ム AJ12144 (FERM P-7642) 特公平5-2
7388号公報第174頁４欄参 照コリネハ゛クテリウム・ク゛ルタミクム AJ12145 (FERM P-7643) 特公平5-2
7388号公報第174頁４欄参 照フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・フラハ゛ム ATCC 21493 特開平5-3793号公報第
３頁表１参照コリネハ゛クテリウム・ク゛ルタミクム ATCC 21659 特開平5-3793号公報第
３頁表１参照

【００４６】(viii)Ｌ−プロリン製造に好適な宿主 エシェリヒア属細菌としては、以下の菌株が挙げられ
る。エシェリヒア・コリ AJ11543 (FERM P-5483) 特開昭56-144093号
公報第435頁左下欄参照エシェリヒア・コリ AJ11544 (FERM P-5484) 特開昭56-144093号
公報第435頁左下欄参照

【００４７】コリネホルム細菌としては、以下の菌株が
挙げられる。フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・ラクトファーメンタム AJ11225 (FERM P-4370) 特開
昭60-87788号公報第473頁 左上欄参照フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・フラハ゛ム AJ11512 (FERM P-5332) 特公昭62-
36679号公報第185頁２欄参照フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・フラハ゛ム AJ11513 (FERM P-5333) 特公昭62-
36679号公報第185頁２欄参照フ゛レヒ゛ハ゛クテリウム・フラハ゛ム AJ11514 (FERM P-5334) 特公昭62-
36679号公報第185頁２欄参照コリネハ゛クテリウム・ク゛ルタミクム AJ11522 (FERM P-5342) 特公昭62-
36679号公報第185頁２欄参照コリネハ゛クテリウム・ク゛ルタミクム AJ11523 (FERM P-5343) 特公昭62-
36679号公報第185頁２欄参照

【００４８】（２）培養法 上記宿主を培養する方法は、従来のアミノ酸生産菌の培
養方法と特に変わらない。すなわち、培地としては炭素
源、窒素源、無機イオン、さらに必要に応じてアミノ
酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常のもの
である。

【００４９】炭素源としては、グルコース、シュクロー
ス、ラクトース等及びこれらを含有する澱粉加水分解
液、ホエイ、糖蜜等が用いられる。窒素源としては、ア
ンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩その他が
使用できる。尚、アミノ酸等の栄養要求性変異株を宿主
に使用する場合は、その株が要求するアミノ酸等の栄養
素を培地に適宜加える必要がある。以下に、アミノ酸製
造に用いる培地として、リジン製造用の培地の一例を表
１に示す。尚、炭酸カルシウムは別個に殺菌後、他成分
に添加する。

【００５０】

【表１】

【００５１】培養は、好気的条件下で培地のｐＨ及び温
度を適宜調節しつつ、実質的にアミノ酸の生成蓄積が停
止するまで行われる。こうして培養液中に蓄積されたア
ミノ酸を採取するには、通常の方法が適用できる。

【００５２】

【実施例】以下に、実施例を挙げて本発明を更に具体的
に説明する。 ＜１＞変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラー
ゼ遺伝子の作成 変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコ
ードするＤＮＡを作製するにあたって、材料としてプラ
スミドにクローニングされたホスホエノールピルビン酸
カルボキシラーゼ遺伝子を用いた。

【００５３】このプラスミドｐＴ２を保持させる宿主
は、プラスミド由来のホスホエノールピルビン酸カルボ
キシラーゼのみの活性を検出するために、ホスホエノー
ルピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子が欠損しているこ
とが好ましい。このような欠損株として大腸菌Ｆ１５
（Hfr,recA1,met,Δ(ppc-argECBH),Tn10）を用い、これ
にｐＴ２を保持させた大腸菌Ｆ１５株（ＡＪ１２８７
３）は、平成５年７月１５日に工業技術院生命工学工業
技術研究所（郵便番号３０５ 日本国茨城県つくば市東
一丁目１番３号）に、ＦＥＲＭ Ｐ−１３７５２として
寄託されており、平成６年７月１１日に、この原寄託か
らブダペスト条約に基づく国際寄託へ移管され、受託番
号 FERM BP-4732として寄託されている。またｐＴ２の
全塩基配列を、配列番号１に示す。

【００５４】ｐＴ２を用い、ホスホエノールピルビン酸
カルボキシラーゼ遺伝子の４３８番目のアルギニンのコ
ドンをシステインのコドンに置換するには、ＰＣＲ（Po
lymerase Chain Reaction）法を利用した Overlapping
Extension法（Ho,S,N.,Hunt,H.D.,Horton,R,M.,Pullen,
J.K. and Pease,L.R.,Gene,77,51-59(1989)）を用い
た。尚、ＰＣＲ法は、二本鎖ＤＮＡの一本鎖ＤＮＡへの
熱変性、増幅を目的とする部位の両端の配列に相当する
オリゴヌクレオチドプライマーと前記熱変性ＤＮＡとの
アニーリング、前記オリゴヌクレオチドをプライマーと
したポリメラーゼ反応からなる増幅サイクルを繰り返す
ことにより、前記ＤＮＡ配列を指数関数的に増幅する方
法である。

【００５５】ＰＣＲ法による部位特異的変異を行った領
域を図１に示す。本発明において用いたプライマーは、
４３８番目のアルギニンのコドンの前後の配列を有する
プライマーｃ（配列番号４：配列番号１中塩基番号１５
３５〜１５５４に相当）、このプライマーｃと相補的な
配列を有するプライマーｂ（配列番号３）、これらより
も上流側の配列を有するプライマーａ（配列番号２：配
列番号１中塩基番号１１８５〜１２００に相当）、下流
側の配列に相補的な配列を有するプライマーｄ（配列番
号５：配列番号１中塩基番号２３２７〜２３４２に相
当）の４種である。

【００５６】プライマーｂ及びプライマーｃは、４３８
番目のアルギニンのコドン（ＣＧＴ）をシステインのコ
ドン（ＴＧＴ）に換えてある。この置換は、他のシステ
インのコドンであるＴＧＣでもよい。また、４３５番目
のアスパラギンのコドン（ＡＡＣ）の３文字目のＣをＴ
に置換してあり、アミノ酸を置換せずに内部にEcoRI部
位が導入されるので、これを指標に変異プラスミドの選
択ができるが、この変異は本発明に必須なものではな
い。

【００５７】ｐＴ２ＤＮＡを鋳型とし、プライマーａ及
びプライマーｂをプライマーに用いてＰＣＲ反応を行う
と、変異部位の上流から変異部位までの断片（図１中Ａ
Ｂ断片）が増幅される。また、プライマーｃ及びプライ
マーｄを用いてＰＣＲ反応を行うと、変異部位から下流
の断片（図１中ＣＤ断片）が増幅される。各々の増幅産
物（ＡＢ、ＣＤ）を熱変成後、再びアニールさせ、ポリ
メラーゼ反応を行うと、これらが連結した断片（図１中
ＡＤ断片）が得られる。尚、ＰＣＲ反応は、９４℃で１
分間加熱した後、変成（９４℃、１．５分）、アニーリ
ング（５０℃、２分）、ポリメラーゼによる伸長反応
（７２℃、３．５分）からなるサイクルを３０回行うこ
とにより行った。また、反応組成を表２に示す。

【００５８】

【表２】 ＊：ＰＣＲ断片ＡＢ、ＣＤは、ＰＣＲ反応後、その内の
１０μｌをポリアクリルアミドゲルより回収し、５μｌ
のＴＥ（10mM Tris-HCl pH8.0），１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐ
Ｈ８．０）に溶解したもの

【００５９】上記のようにして得られたＡＤ断片は、上
流側にBssHII部位（配列番号１中１２３１〜１２３６）
が、下流側にSplI（配列番号１中２２４９〜２２５４）
部位が存在しているので、これらの酵素で完全消化し、
プラスミドｐＴ２の対応する領域と置換した（図１）。

【００６０】＜２＞阻害解除型ホスホエノールピルビン
酸カルボキシラーゼの選択 上記で得られたプラスミドで大腸菌を形質転換し、形質
転換株を培養してプラスミドを回収し、EcoRIで切断さ
れるものを選択した。選択されたＤＮＡについて、上記
ＰＣＲ法で増幅した領域の塩基配列をジデオキシ法で決
定し、目的どおりの塩基置換が導入されている事を確認
した。このプラスミドをｐＴ２Ｒ４３８Ｃと命名した。
このプラスミドを前述の大腸菌Ｆ１５株に導入した株
（ＡＪ１２８７４）は、平成５年７月１５日に工業技術
院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５ 日本国茨
城県つくば市東一丁目１番３号）に、ＦＥＲＭ Ｐ−１
３７５３として寄託されており、平成６年７月１１日
に、この原寄託からブダペスト条約に基づく国際寄託へ
移管され、受託番号 FERM BP-4733として寄託されてい
る。

【００６１】ｐＴ２Ｒ４３８Ｃの塩基配列は、配列番号
１において、１５４１番目及び１５５０番目のヌクレオ
チドが、各々ＣからＴに置換された配列である。

【００６２】＜３＞変異型ホスホエノールピルビン酸カ
ルボキシラーゼのアスパラギン酸による阻害解除の確認 前述のｐＴ２Ｒ４３８Ｃを持つ大腸菌Ｆ１５株（ＡＪ１
２８７４）の産生するホスホエノールピルビン酸カルボ
キシラーゼについて、アスパラギン酸に対する感受性を
調べた。尚、前述したように、大腸菌Ｆ１５株はホスホ
エノールピルビン酸カルボキシラーゼを欠損しているの
で、ＡＪ１２８７４の産生するホスホエノールピルビン
酸カルボキシラーゼは、プラスミド由来のものである。

【００６３】アスパラギン酸に対する感受性は、既知の
方法（Yoshinaga,T.,Izui,K and Katsuki,H. J.Bioche
m.,68,747-750(1970)）に従って調べた。すなわち、活
性測定系中に、活性に影響する事が知られているアセチ
ルコエンザイムＡを１ｍＭ、２ｍＭの濃度で存在させ
て、酵素活性を測定したところ、アスパラギン酸に対す
る感受性は、図２のように測定された。

【００６４】アスパラギン酸が高濃度になると、野生型
の酵素は活性を実質的に失うのに対し、本発明の変異型
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼは、活性を
保持し続けている事が明らかである。

【００６５】＜４＞変異型ホスホエノールピルビン酸カ
ルボキシラーゼ遺伝子の作成（その２） プラスミドｐＴ２上に搭載されているホスホエノールピ
ルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の６２０番目のリジン
のコドンをセリンのコドンに置換するには、ＰＣＲ（Po
lymerase Chain Reaction）法を利用した Overlapping
Extension法（Ho,S,N.,Hunt,H.D.,Horton,R,M.,Pullen,
J.K. and Pease,L.R.,Gene,77,51-59(1989)）を用い
た。具体的な手法は、＜１＞で述べた方法に準じる。目
的の置換がなされた変異型遺伝子を搭載するプラスミド
をｐＴ２Ｋ６２０Ｓと命名した。また、得られた変異型
酵素をＫ６２０Ｓ変異型酵素と命名した。

【００６６】＜５＞変異型ホスホエノールピルビン酸カ
ルボキシラーゼのアスパラギン酸による阻害解除の確認 プラスミドｐＴ２Ｋ６２０Ｓが前述の大腸菌Ｆ１５株に
導入されて得られる形質転換株の産生するホスホエノー
ルピルビン酸カルボキシラーゼについて、アスパラギン
酸に対する感受性を調べた。尚、前述したように、大腸
菌Ｆ１５株はホスホエノールピルビン酸カルボキシラー
ゼを欠損しているので、該形質転換株の産生するホスホ
エノールピルビン酸カルボキシラーゼは、プラスミド由
来のものである。

【００６７】アスパラギン酸に対する感受性は、既知の
方法（Yoshinaga,T.,Izui,K and Katsuki,H. J.Bioche
m.,68,747-750(1970)）に従って調べた。すなわち、活
性測定系中に、活性に影響する事が知られているアセチ
ルコエンザイムＡを１ｍＭの濃度で存在させて、酵素活
性を測定したところ、アスパラギン酸に対する感受性
は、図３のように測定された。図３中、ａ）はｂ）の横
軸（Ｌ−アスパラギン酸濃度）を拡大したものである。

【００６８】アスパラギン酸が高濃度になると、野生型
の酵素は活性を実質的に失うのに対し、本発明の変異型
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼは、活性を
保持し続けている事が明らかである。

【００６９】図３には、６５０番目のリジンがセリンに
置換された変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシ
ラーゼ（Ｋ６５０Ａ変異型酵素）と、４９１番目のリジ
ンがセリンに置換された変異型ホスホエノールピルビン
酸カルボキシラーゼ（Ｋ４９１Ａ変異型酵素）のアスパ
ラギン酸に対する感受性も記されている。これらの変異
型酵素は、アスパラギン酸による阻害が解除されなかっ
た。

【００７０】

【発明の効果】本発明のＤＮＡ配列は、変異型ホスホエ
ノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードし、このＤ
ＮＡ配列を保持する微生物は、前記酵素を産生する。

【００７１】本発明の変異型ホスホエノールピルビン酸
カルボキシラーゼは、アスパラギン酸による活性阻害を
実質的に受けないので、アスパラギン酸により生合成の
調節を受けるアミノ酸の醗酵生産等に利用することがで
きる。

【００７２】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：5186 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：環状 配列の種類：他の核酸 Genomic DNA及びベクター 起源 生物名：エシェリヒア・コリ(Escherichia coli) 株名： 配列の特徴：CDS 存在位置：237..2888 配列 TCGACCGGCG ATTTTTTAAC ATTTCCATAA GTTACGCTTA TTTAAAGCGT CGTGAATTTA 60 ATGACGTAAA TTCCTGCTAT TTATTCGTTT GCTGAAGCGA TTTCGCAGCA TTTGACGTCA 120 CCGCTTTTAC GTGGCTTTAT AAAAGACGAC GAAAAGCAAA GCCCGAGCAT ATTCGCGCCA 180 ATGCGACGTG AAGGATACAG GGCTATCAAA CGATAAGATG GGGTGTCTGG GGTAAT 236 ATG AAC GAA CAA TAT TCC GCA TTG CGT AGT AAT GTC AGT ATG CTC GGC 284 Met Asn Glu Gln Tyr Ser Ala Leu Arg Ser Asn Val Ser Met Leu Gly 1 5 10 15 AAA GTG CTG GGA GAA ACC ATC AAG GAT GCG TTG GGA GAA CAC ATT CTT 332 Lys Val Leu Gly Glu Thr Ile Lys Asp Ala Leu Gly Glu His Ile Leu 20 25 30 GAA CGC GTA GAA ACT ATC CGT AAG TTG TCG AAA TCT TCA CGC GCT GGC 380 Glu Arg Val Glu Thr Ile Arg Lys Leu Ser Lys Ser Ser Arg Ala Gly 35 40 45 AAT GAT GCT AAC CGC CAG GAG TTG CTC ACC ACC TTA CAA AAT TTG TCG 428 Asn Asp Ala Asn Arg Gln Glu Leu Leu Thr Thr Leu Gln Asn Leu Ser 50 55 60 AAC GAC GAG CTG CTG CCC GTT GCG CGT GCG TTT AGT CAG TTC CTG AAC 476 Asn Asp Glu Leu Leu Pro Val Ala Arg Ala Phe Ser Gln Phe Leu Asn 65 70 75 80 CTG GCC AAC ACC GCC GAG CAA TAC CAC AGC ATT TCG CCG AAA GGC GAA 524 Leu Ala Asn Thr Ala Glu Gln Tyr His Ser Ile Ser Pro Lys Gly Glu 85 90 95 GCT GCC AGC AAC CCG GAA GTG ATC GCC CGC ACC CTG CGT AAA CTG AAA 572 Ala Ala Ser Asn Pro Glu Val Ile Ala Arg Thr Leu Arg Lys Leu Lys 100 105 110 AAC CAG CCG GAA CTG AGC GAA GAC ACC ATC AAA AAA GCA GTG GAA TCG 620 Asn Gln Pro Glu Leu Ser Glu Asp Thr Ile Lys Lys Ala Val Glu Ser 115 120 125 CTG TCG CTG GAA CTG GTC CTC ACG GCT CAC CCA ACC GAA ATT ACC CGT 668 Leu Ser Leu Glu Leu Val Leu Thr Ala His Pro Thr Glu Ile Thr Arg 130 135 140 CGT ACA CTG ATC CAC AAA ATG GTG GAA GTG AAC GCC TGT TTA AAA CAG 716 Arg Thr Leu Ile His Lys Met Val Glu Val Asn Ala Cys Leu Lys Gln 145 150 155 160 CTC GAT AAC AAA GAT ATC GCT GAC TAC GAA CAC AAC CAG CTG ATG CGT 764 Leu Asp Asn Lys Asp Ile Ala Asp Tyr Glu His Asn Gln Leu Met Arg 165 170 175 CGC CTG CGC CAG TTG ATC GCC CAG TCA TGG CAT ACC GAT GAA ATC CGT 812 Arg Leu Arg Gln Leu Ile Ala Gln Ser Trp His Thr Asp Glu Ile Arg 180 185 190 AAG CTG CGT CCA AGC CCG GTA GAT GAA GCC AAA TGG GGC TTT GCC GTA 860 Lys Leu Arg Pro Ser Pro Val Asp Glu Ala Lys Trp Gly Phe Ala Val 195 200 205 GTG GAA AAC AGC CTG TGG CAA GGC GTA CCA AAT TAC CTG CGC GAA CTG 908 Val Glu Asn Ser Leu Trp Gln Gly Val Pro Asn Tyr Leu Arg Glu Leu 210 215 220 AAC GAA CAA CTG GAA GAG AAC CTC GGC TAC AAA CTG CCC GTC GAA TTT 956 Asn Glu Gln Leu Glu Glu Asn Leu Gly Tyr Lys Leu Pro Val Glu Phe 225 230 235 240 GTT CCG GTC CGT TTT ACT TCG TGG ATG GGC GGC GAC CGC GAC GGC AAC 1004 Val Pro Val Arg Phe Thr Ser Trp Met Gly Gly Asp Arg Asp Gly Asn 245 250 255 CCG AAC GTC ACT GCC GAT ATC ACC CGC CAC GTC CTG CTA CTC AGC CGC 1052 Pro Asn Val Thr Ala Asp Ile Thr Arg His Val Leu Leu Leu Ser Arg 260 265 270 TGG AAA GCC ACC GAT TTG TTC CTG AAA GAT ATT CAG GTG CTG GTT TCT 1100 Trp Lys Ala Thr Asp Leu Phe Leu Lys Asp Ile Gln Val Leu Val Ser 275 280 285 GAA CTG TCG ATG GTT GAA GCG ACC CCT GAA CTG CTG GCG CTG GTT GGC 1148 Glu Leu Ser Met Val Glu Ala Thr Pro Glu Leu Leu Ala Leu Val Gly 290 295 300 GAA GAA GGT GCC GCA GAA CCG TAT CGC TAT CTG ATG AAA AAC CTG CGT 1196 Glu Glu Gly Ala Ala Glu Pro Tyr Arg Tyr Leu Met Lys Asn Leu Arg 305 310 315 320 TCT CGC CTG ATG GCG ACA CAG GCA TGG CTG GAA GCG CGC CTG AAA GGC 1244 Ser Arg Leu Met Ala Thr Gln Ala Trp Leu Glu Ala Arg Leu Lys Gly 325 330 335 GAA GAA CTG CCA AAA CCA GAA GGC CTG CTG ACA CAA AAC GAA GAA CTG 1292 Glu Glu Leu Pro Lys Pro Glu Gly Leu Leu Thr Gln Asn Glu Glu Leu 340 345 350 TGG GAA CCG CTC TAC GCT TGC TAC CAG TCA CTT CAG GCG TGT GGC ATG 1340 Trp Glu Pro Leu Tyr Ala Cys Tyr Gln Ser Leu Gln Ala Cys Gly Met 355 360 365 GGT ATT ATC GCC AAC GGC GAT CTG CTC GAC ACC CTG CGC CGC GTG AAA 1388 Gly Ile Ile Ala Asn Gly Asp Leu Leu Asp Thr Leu Arg Arg Val Lys 370 375 380 TGT TTC GGC GTA CCG CTG GTC CGT ATT GAT ATC CGT CAG GAG AGC ACG 1436 Cys Phe Gly Val Pro Leu Val Arg Ile Asp Ile Arg Gln Glu Ser Thr 385 390 395 400 CGT CAT ACC GAA GCG CTG GGC GAG CTG ACC CGC TAC CTC GGT ATC GGC 1484 Arg His Thr Glu Ala Leu Gly Glu Leu Thr Arg Tyr Leu Gly Ile Gly 405 410 415 GAC TAC GAA AGC TGG TCA GAG GCC GAC AAA CAG GCG TTC CTG ATC CGC 1532 Asp Tyr Glu Ser Trp Ser Glu Ala Asp Lys Gln Ala Phe Leu Ile Arg 420 425 430 GAA CTG AAC TCC AAA CGT CCG CTT CTG CCG CGC AAC TGG CAA CCA AGC 1580 Glu Leu Asn Ser Lys Arg Pro Leu Leu Pro Arg Asn Trp Gln Pro Ser 435 440 445 GCC GAA ACG CGC GAA GTG CTC GAT ACC TGC CAG GTG ATT GCC GAA GCA 1628 Ala Glu Thr Arg Glu Val Leu Asp Thr Cys Gln Val Ile Ala Glu Ala 450 455 460 CCG CAA GGC TCC ATT GCC GCC TAC GTG ATC TCG ATG GCG AAA ACG CCG 1676 Pro Gln Gly Ser Ile Ala Ala Tyr Val Ile Ser Met Ala Lys Thr Pro 465 470 475 480 TCC GAC GTA CTG GCT GTC CAC CTG CTG CTG AAA GAA GCG GGT ATC GGG 1724 Ser Asp Val Leu Ala Val His Leu Leu Leu Lys Glu Ala Gly Ile Gly 485 490 495 TTT GCG ATG CCG GTT GCT CCG CTG TTT GAA ACC CTC GAT GAT CTG AAC 1772 Phe Ala Met Pro Val Ala Pro Leu Phe Glu Thr Leu Asp Asp Leu Asn 500 505 510 AAC GCC AAC GAT GTC ATG ACC CAG CTG CTC AAT ATT GAC TGG TAT CGT 1820 Asn Ala Asn Asp Val Met Thr Gln Leu Leu Asn Ile Asp Trp Tyr Arg 515 520 525 GGC CTG ATT CAG GGC AAA CAG ATG GTG ATG ATT GGC TAT TCC GAC TCA 1868 Gly Leu Ile Gln Gly Lys Gln Met Val Met Ile Gly Tyr Ser Asp Ser 530 535 540 GCA AAA GAT GCG GGA GTG ATG GCA GCT TCC TGG GCG CAA TAT CAG GCA 1916 Ala Lys Asp Ala Gly Val Met Ala Ala Ser Trp Ala Gln Tyr Gln Ala 545 550 555 560 CAG GAT GCA TTA ATC AAA ACC TGC GAA AAA GCG GGT ATT GAG CTG ACG 1964 Gln Asp Ala Leu Ile Lys Thr Cys Glu Lys Ala Gly Ile Glu Leu Thr 565 570 575 TTG TTC CAC GGT CGC GGC GGT TCC ATT GGT CGC GGC GGC GCA CCT GCT 2012 Leu Phe His Gly Arg Gly Gly Ser Ile Gly Arg Gly Gly Ala Pro Ala 580 585 590 CAT GCG GCG CTG CTG TCA CAA CCG CCA GGA AGC CTG AAA GGC GGC CTG 2060 His Ala Ala Leu Leu Ser Gln Pro Pro Gly Ser Leu Lys Gly Gly Leu 595 600 605 CGC GTA ACC GAA CAG GGC GAG ATG ATC CGC TTT AAA TAT GGT CTG CCA 2108 Arg Val Thr Glu Gln Gly Glu Met Ile Arg Phe Lys Tyr Gly Leu Pro 610 615 620 GAA ATC ACC GTC AGC AGC CTG TCG CTT TAT ACC GGG GCG ATT CTG GAA 2156 Glu Ile Thr Val Ser Ser Leu Ser Leu Tyr Thr Gly Ala Ile Leu Glu 625 630 635 640 GCC AAC CTG CTG CCA CCG CCG GAG CCG AAA GAG AGC TGG CGT CGC ATT 2204 Ala Asn Leu Leu Pro Pro Pro Glu Pro Lys Glu Ser Trp Arg Arg Ile 645 650 655 ATG GAT GAA CTG TCA GTC ATC TCC TGC GAT GTC TAC CGC GGC TAC GTA 2252 Met Asp Glu Leu Ser Val Ile Ser Cys Asp Val Tyr Arg Gly Tyr Val 660 665 670 CGT GAA AAC AAA GAT TTT GTG CCT TAC TTC CGC TCC GCT ACG CCG GAA 2300 Arg Glu Asn Lys Asp Phe Val Pro Tyr Phe Arg Ser Ala Thr Pro Glu 675 680 685 CAA GAA CTG GGC AAA CTG CCG TTG GGT TCA CGT CCG GCG AAA CGT CGC 2348 Gln Glu Leu Gly Lys Leu Pro Leu Gly Ser Arg Pro Ala Lys Arg Arg 690 695 700 CCA ACC GGC GGC GTC GAG TCA CTA CGC GCC ATT CCG TGG ATC TTC GCC 2396 Pro Thr Gly Gly Val Glu Ser Leu Arg Ala Ile Pro Trp Ile Phe Ala 705 710 715 720 TGG ACG CAA AAC CGT CTG ATG CTC CCC GCC TGG CTG GGT GCA GGT ACG 2444 Trp Thr Gln Asn Arg Leu Met Leu Pro Ala Trp Leu Gly Ala Gly Thr 725 730 735 GCG CTG CAA AAA GTG GTC GAA GAC GGC AAA CAG AGC GAG CTG GAG GCT 2492 Ala Leu Gln Lys Val Val Glu Asp Gly Lys Gln Ser Glu Leu Glu Ala 740 745 750 ATG TGC CGC GAT TGG CCA TTC TTC TCG ACG CGT CTC GGC ATG CTG GAG 2540 Met Cys Arg Asp Trp Pro Phe Phe Ser Thr Arg Leu Gly Met Leu Glu 755 760 765 ATG GTC TTC GCC AAA GCA GAC CTG TGG CTG GCG GAA TAC TAT GAC CAA 2588 Met Val Phe Ala Lys Ala Asp Leu Trp Leu Ala Glu Tyr Tyr Asp Gln 770 775 780 CGC CTG GTA GAC AAA GCA CTG TGG CCG TTA GGT AAA GAG TTA CGC AAC 2636 Arg Leu Val Asp Lys Ala Leu Trp Pro Leu Gly Lys Glu Leu Arg Asn 785 790 795 800 CTG CAA GAA GAA GAC ATC AAA GTG GTG CTG GCG ATT GCC AAC GAT TCC 2684 Leu Gln Glu Glu Asp Ile Lys Val Val Leu Ala Ile Ala Asn Asp Ser 805 810 815 CAT CTG ATG GCC GAT CTG CCG TGG ATT GCA GAG TCT ATT CAG CTA CGG 2732 His Leu Met Ala Asp Leu Pro Trp Ile Ala Glu Ser Ile Gln Leu Arg 820 825 830 AAT ATT TAC ACC GAC CCG CTG AAC GTA TTG CAG GCC GAG TTG CTG CAC 2780 Asn Ile Tyr Thr Asp Pro Leu Asn Val Leu Gln Ala Glu Leu Leu His 835 840 845 CGC TCC CGC CAG GCA GAA AAA GAA GGC CAG GAA CCG GAT CCT CGC GTC 2828 Arg Ser Arg Gln Ala Glu Lys Glu Gly Gln Glu Pro Asp Pro Arg Val 850 855 860 GAA CAA GCG TTA ATG GTC ACT ATT GCC GGG ATT GCG GCA GGT ATG CGT 2876 Glu Gln Ala Leu Met Val Thr Ile Ala Gly Ile Ala Ala Gly Met Arg 865 870 875 880 AAT ACC GGC TAATCTTCCT CTTCTGCAAA CCCTCGTGCT TTTGCGCGAG 2925 Asn Thr Gly GGTTTTCTGA AATACTTCTG TTCTAACACC CTCGTTTTCA ATATATTTCT GTCTGCATTT 2985 TATTCAAATT CTGAATATAC CTTCAGATAT CCTTAAGGGC CTCGTGATAC GCCTATTTTT 3045 ATAGGTTAAT GTCATGATAA TAATGGTTTC TTAGACGTCA GGTGGCACTT TTCGGGGAAA 3105 TGTGCGCGGA ACCCCTATTT GTTTATTTTT CTAAATACAT TCAAATATGT ATCCGCTCAT 3165 GAGACAATAA CCCTGATAAA TGCTTCAATA ATATTGAAAA AGGAAGAGTA TGAGTATTCA 3225 ACATTTCCGT GTCGCCCTTA TTCCCTTTTT TGCGGCATTT TGCCTTCCTG TTTTTGCTCA 3285 CCCAGAAACG CTGGTGAAAG TAAAAGATGC TGAAGATCAG TTGGGTGCAC GAGTGGGTTA 3345 CATCGAACTG GATCTCAACA GCGGTAAGAT CCTTGAGAGT TTTCGCCCCG AAGAACGTTT 3405 TCCAATGATG AGCACTTTTA AAGTTCTGCT ATGTGGCGCG GTATTATCCC GTATTGACGC 3465 CGGGCAAGAG CAACTCGGTC GCCGCATACA CTATTCTCAG AATGACTTGG TTGAGTACTC 3525 ACCAGTCACA GAAAAGCATC TTACGGATGG CATGACAGTA AGAGAATTAT GCAGTGCTGC 3585 CATAACCATG AGTGATAACA CTGCGGCCAA CTTACTTCTG ACAACGATCG GAGGACCGAA 3645 GGAGCTAACC GCTTTTTTGC ACAACATGGG GGATCATGTA ACTCGCCTTG ATCGTTGGGA 3705 ACCGGAGCTG AATGAAGCCA TACCAAACGA CGAGCGTGAC ACCACGATGC CTGTAGCAAT 3765 GGCAACAACG TTGCGCAAAC TATTAACTGG CGAACTACTT ACTCTAGCTT CCCGGCAACA 3825 ATTAATAGAC TGGATGGAGG CGGATAAAGT TGCAGGACCA CTTCTGCGCT CGGCCCTTCC 3885 GGCTGGCTGG TTTATTGCTG ATAAATCTGG AGCCGGTGAG CGTGGGTCTC GCGGTATCAT 3945 TGCAGCACTG GGGCCAGATG GTAAGCCCTC CCGTATCGTA GTTATCTACA CGACGGGGAG 4005 TCAGGCAACT ATGGATGAAC GAAATAGACA GATCGCTGAG ATAGGTGCCT CACTGATTAA 4065 GCATTGGTAA CTGTCAGACC AAGTTTACTC ATATATACTT TAGATTGATT TAAAACTTCA 4125 TTTTTAATTT AAAAGGATCT AGGTGAAGAT CCTTTTTGAT AATCTCATGA CCAAAATCCC 4185 TTAACGTGAG TTTTCGTTCC ACTGAGCGTC AGACCCCGTA GAAAAGATCA AAGGATCTTC 4245 TTGAGATCCT TTTTTTCTGC GCGTAATCTG CTGCTTGCAA ACAAAAAAAC CACCGCTACC 4305 AGCGGTGGTT TGTTTGCCGG ATCAAGAGCT ACCAACTCTT TTTCCGAAGG TAACTGGCTT 4365 CAGCAGAGCG CAGATACCAA ATACTGTCCT TCTAGTGTAG CCGTAGTTAG GCCACCACTT 4425 CAAGAACTCT GTAGCACCGC CTACATACCT CGCTCTGCTA ATCCTGTTAC CAGTGGCTGC 4485 TGCCAGTGGC GATAAGTCGT GTCTTACCGG GTTGGACTCA AGACGATAGT TACCGGATAA 4545 GGCGCAGCGG TCGGGCTGAA CGGGGGGTTC GTGCACACAG CCCAGCTTGG AGCGAACGAC 4605 CTACACCGAA CTGAGATACC TACAGCGTGA GCATTGAGAA AGCGCCACGC TTCCCGAAGG 4665 GAGAAAGGCG GACAGGTATC CGGTAAGCGG CAGGGTCGGA ACAGGAGAGC GCACGAGGGA 4725 GCTTCCAGGG GGAAACGCCT GGTATCTTTA TAGTCCTGTC GGGTTTCGCC ACCTCTGACT 4785 TGAGCGTCGA TTTTTGTGAT GCTCGTCAGG GGGGCGGAGC CTATGGAAAA ACGCCAGCAA 4845 CGCGGCCTTT TTACGGTTCC TGGCCTTTTG CTGGCCTTTT GCTCACATGT TCTTTCCTGC 4905 GTTATCCCCT GATTCTGTGG ATAACCGTAT TACCGCCTTT GAGTGAGCTG ATACCGCTCG 4965 CCGCAGCCGA ACGACCGAGC GCAGCGAGTC AGTGAGCGAG GAAGCGGAAG AGCGCCCAAT 5025 ACGCAAACCG CCTCTCCCCG CGCGTTGGCC GATTCATTAA TGCAGAAGGG TTGGTTTGCG 5085 CATTCACAGT TCTCCGCAAG AATTGATTGG CTCCAATTCT TGGAGTGGTG AATCCGTTAG 5145 CGAGGTGCCG CCGGCTTCCA TTCAGGTCGA GGTGGCCCGG G 5186

【００７３】配列番号：２ 配列の長さ：16 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ AAAAACCTGC GTTCTC 16

【００７４】配列番号：３ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ TGACTTAAG GTTTACAGGCC 20

【００７５】配列番号：４ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ ACTGAATTCC AAATGTCCGC 20

【００７６】配列番号：５ 配列の長さ：16 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ AAGTGCAGG CCGTTT 16

【００７７】

【図面の簡単な説明】

【図１】 ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
遺伝子に変異を導入する方法を示す図。

【図２】 野生型及び変異型ホスホエノールピルビン酸
カルボキシラーゼ（Ｎ−末端から４３８番目のアルギニ
ンをシステインに置換したもの）の活性にアスパラギン
酸が与える影響を示す図。

【図３】 野生型及び変異型ホスホエノールピルビン酸
カルボキシラーゼ（Ｎ−末端から６２０番目のリジンを
セリンに置換したもの）の活性にアスパラギン酸が与え
る影響を示す図。ａ）は、ｂ）の横軸（Ｌ−アスパラギ
ン酸濃度）を拡大したものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 13/10 Ｃ１２Ｐ 13/10 Ｂ 13/12 13/12 Ａ 13/14 13/14 Ａ 13/24 13/24 Ａ // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:185） (Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:185） (Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｃ１２Ｒ 1:185） (Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｒ 1:185） (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 13/10 Ｃ１２Ｒ 1:185） (Ｃ１２Ｐ 13/10 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 13/12 Ｃ１２Ｒ 1:185） (Ｃ１２Ｐ 13/14 Ｃ１２Ｒ 1:185） (Ｃ１２Ｐ 13/14 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 13/24 Ｃ１２Ｒ 1:185） (Ｃ１２Ｐ 13/24 Ｃ１２Ｒ 1:01） (56)参考文献 特開 昭60−87788（ＪＰ，Ａ) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ Ｖｏｌ．96 ｐｐ．823− 828（1999) Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏ ｌ．247 ｐ．74−81（1997) Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．95 ｐ．909−916（1984) Ｇｅｎｅ Ｖｏｌ．31 ｐ．279−283 （1984) Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．109 ｐ．49−54（1991) Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏ ｌ．202 ｐ．797−803（1991) Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ. 261 Ｎｏ．34 ｐ．16078−16081 （1986) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 9/00 C12N 1/21 C12P 13/06 - 13/24 C12N 15/52 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ／Ｌ（ＱＵＥＳＴＥＬ)

Claims (10)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 エシェリヒア属に属する微生物由来のホ
   スホエノールピルビン酸カルボキシラーゼにおいて、Ｎ
   −末端から４３８番目のアルギニンがシステインに置換
   されたことを特徴とする変異型ホスホエノールピルビン
   酸カルボキシラーゼ。
2. 【請求項２】 エシェリヒア属に属する微生物のホスホ
   エノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードするＤＮ
   Ａ断片において、ホスホエノールピルビン酸カルボキシ
   ラーゼのＮ−末端から４３８番目のアルギニンをシステ
   インに置換させる変異を有することを特徴とするＤＮＡ
   断片。
3. 【請求項３】 配列表配列番号１において塩基番号２３
   ７〜２８８８で表される塩基配列のうち、塩基番号１５
   ４８〜１５５０のＣＧＴが、ＴＧＴ又はＴＧＣに置換さ
   れた配列であることを特徴とする請求項２記載のＤＮＡ
   断片。
4. 【請求項４】 エシェリヒア属に属する微生物由来のホ
   スホエノールピルビン酸カルボキシラーゼにおいて、Ｎ
   −末端から６２０番目のリジンがセリンに置換されたこ
   とを特徴とする変異型ホスホエノールピルビン酸カルボ
   キシラーゼ。
5. 【請求項５】 エシェリヒア属に属する微生物のホスホ
   エノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードするＤＮ
   Ａ断片において、ホスホエノールピルビン酸カルボキシ
   ラーゼのＮ−末端から６２０番目のリジンをセリンに置
   換させる変異を有することを特徴とするＤＮＡ断片。
6. 【請求項６】 配列表配列番号１において塩基番号２３
   ７〜２８８８で表される塩基配列のうち、塩基番号２０
   ９４〜２０９６のＡＡＡが、ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、
   ＴＣＧ、ＡＧＴ又はＡＧＣに置換された配列であること
   を特徴とする請求項５記載のＤＮＡ断片。
7. 【請求項７】 請求項２、３、５又は６に記載のＤＮＡ
   断片が染色体ＤＮＡ内に組み込まれて形質転換されたエ
   シェリヒア属又はコリネホルム細菌に属する微生物。
8. 【請求項８】 請求項２、３、５又は６に記載のＤＮＡ
   断片とエシェリヒア属細菌またはコリネホルム細菌の細
   胞内で自律複製可能なベクターＤＮＡとを連結してなる
   組換えＤＮＡ。
9. 【請求項９】 請求項８記載の組換えＤＮＡで形質転換
   されたエシェリヒア属又はコリネホルム細菌に属する微
   生物。
10. 【請求項１０】請求項７又は９に記載の微生物を好適な
    培地で培養し、この培地からＬ−リジン、Ｌ−スレオニ
    ン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−グルタミ
    ン酸、Ｌ−アルギニン及びＬ−プロリンから選ばれるア
    ミノ酸を分離することを特徴とするアミノ酸の製造方
    法。