JP2000014388A - 組換えｃｒｐおよびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ヒト染色体のＣＲＰ（Ｃ反応性タンパク質）
遺伝子をＰＣＲ法で増幅し、ベクタープラスミドに連結
した組換え体プラスミドおよび該組換え体プラスミドで
形質転換された酵母を作製すると同時に、有用物質のＣ
ＲＰを、充分に活性を保持した状態で安定に大量に製造
する。 【効果】 ヒトＣＲＰを大量生産することが可能となっ
た。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、Ｃ反応性タンパク質
（以下、「ＣＲＰ」という）の組換えタンパク質、およ
びその製造方法に関する。本発明は、特に、ヒトＣＲＰ
遺伝子を有する新規なプラスミド、このプラスミドで形
質転換された新規な微生物、例えば酵母および該形質転
換体を培養することによるヒトＣＲＰの新規製造方法に
関するものである。

【０００２】本発明によってＣＲＰの工業的製法が確立
され、しかも特にヒトＣＲＰは純度が非常に高いので、
医薬はもとより診断、臨床検査の技術分野においても、
有利に利用することができる。

【０００３】

【従来の技術】ＣＲＰは、肺炎球菌の莢膜のＣ多糖体と
反応する血清中のβグロブリン分画に存在するタンパク
質であり、感染、炎症、組織損傷などによって血中濃度
が０．２μｇ／ｍｌから数百倍から千倍に激増する急性
期タンパク質の一種として知られている。ＣＲＰは分子
量が１３万で同一ペプチド５個からなり、そのアミノ酸
配列は血清アミロイドのＰタンパク質、補体Ｃ１の一部
と相同性がある。ＣＲＰとＣ多糖体との複合体は補体の
古典的経路を活性化することが知られている。（生化学
辞典 第２版 第６１５頁 １９９０年発行 株式会社
東京化学同人）。また、ヒトのマクロファージを用いた
ｉｎ ｖｉｔｒｏの実験でＣＲＰがＩＬ−１を介してマ
クロファージのＩＬ−６産生促進作用を持つことが知ら
れている。よって、ＣＲＰは生体内における免疫系にお
いて何らかの重要な機能を果たしていると推測されるも
のの、生体内における実際の機能は未だに不明な点が多
いタンパク質である。

【０００４】臨床検査分野において、血中ＣＲＰ濃度の
定量は、一元免疫拡散法、毛細管法などＣＲＰを含む被
検血清に抗ＣＲＰ血清を加える方法で測定されている。
しかし、現在用いられている腹水由来の抗原はＣＲＰと
アミノ酸配列上のホモロジーの高いＳＡＰ（Ｓｅｒｕｍ
Ａｍｙｌｏｉｄ Ｐ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）をはじめ
とする血清成分を、抗原として問題のない程度まで精製
除去したものであるが、そのためには多くの精製ステッ
プが必要となり生産コストがかかる。また精製が不十分
で血清成分が混合したようなＣＲＰを抗原として動物に
免疫して得られた抗血清あるいはＩｇＧを用いて血液中
のＣＲＰを測定すると、精製で完全に除去できなかった
ＳＡＰをはじめとする血清成分に対する抗体のバックグ
ランドがあって正確に定量することが難しかった。

【０００５】それゆえ、臨床検査分野における抗原ＣＲ
ＰとしてＳＡＰをはじめとする血清成分の残存の無い高
純度で安価なＣＲＰの出現が熱望されていた。

【０００６】一方、組換えＤＮＡに有用なプラスミドお
よびそれによって形質転換された微生物はよく知られて
いる。例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８，１０５６（１
９７８）には、プラスミドｐＢＲ３２２にラクトースプ
ロモーターをつないだプラスミドを導入した大腸菌内で
動物タンパク質が生産されることが記載されている。

【０００７】また、近年の遺伝子工学技術により、ヒト
ＣＲＰをコードする遺伝子も開示されている。例えば、
ＬｅｉらのＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０，１３３７
７（１９８５）および、ＷｏｏらのＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２６０，１３３８４（１９８５）により開示され
ている。本報告は、ヒトＣＲＰ遺伝子配列を染色体から
と、ｃＤＮＡ（メッセンジャーＲＮＡから逆転写酵素で
ＤＮＡに転写した遺伝子）から決定している。大腸菌な
どにおいて組換えタンパク質を発現させることも実際に
行われている（田中俊夫，松尾雄志：臨床化学，２３
（ｓｕｐｌ，２）：１０７ｂ，１９９４）。

【０００８】しかし、記載のプラスミドは大腸菌で形質
転換される全塩基配列を含むものであり、全ＣＲＰ遺伝
子をベクタープラスミドに結合し、大腸菌以外の微生物
を宿主細胞とした形質転換体を培養して該タンパクを作
ることを教示していない。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】臨床検査分野におい
て、血液中のＣＲＰ量を定量する場合、その抗体作製に
用いる抗原ＣＲＰに微量の血清成分（特にＳＡＰ）が残
存すると、得られた抗血清は残存血清成分に対する抗体
も含むことになり、測定値にバックグランドが生じる。
従ってヒト の原料から抗原ＣＲＰを調製する限り、血
液中のＣＲＰ量を正確に定量できるＣＲＰ抗体の調製が
困難であった。

【００１０】

【課題を解決するための手段】そこで、上記問題を解決
するために鋭意研究を行った結果、遺伝子工学的にＣＲ
Ｐを調製することによって、生物学的に活性な組換えＣ
ＲＰを大量に製造することを可能とした。具体的には、
本発明の製造方法は、ヒトＣＲＰ遺伝子を用いた遺伝子
工学技術により、ヒトＣＲＰを製造することを特徴とす
る。また、上記本発明の製造方法により製造された、組
換えヒトＣＲＰを提供する。

【００１１】本発明者らは、ＣＲＰをヒトプラセンタ由
来の染色体ＤＮＡからＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を用いて増幅し、こ
れを発現できるプラスミドにクローン化しうること、お
よび該プラスミドで形質転換された酵母が大量のヒトＣ
ＲＰを生産すること、またこの組換えＣＲＰは天然型と
全く同一のアミノ酸配列を持ち、天然型と同様にカルシ
ウムイオン存在下にホスホリルコリンと結合すること、
ホスホリルコリン固定化カラムを用いたアフィニティ精
製法を用いることで抗原として最適な純度にまで精製さ
れることを見い出したのである。

【００１２】そして更に検討を行い、このようにして得
られた組換えＣＲＰを抗原として免疫し、血清成分と交
差しないＣＲＰ抗体が得られることを確認し、遂に本発
明の完成に至ったものである。

【００１３】本発明は、ヒト染色体のＣＲＰ遺伝子をＰ
ＣＲ法で増幅し、ベクタープラスミドに連結した組換え
体プラスミドおよび該組換え体プラスミドで形質転換さ
れた酵母（Saccaromyces cerevisiae）を作製すると同
時に、有用物質のＣＲＰを、充分に活性を保持した状態
で安定に大量に製造し、市場に供給することを要旨とす
る。

【００１４】本発明のプラスミドを得るには、例えばＢ
ｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，７２，６
１９−６２９（１９６３）の記載の方法に従い、ＣＲＰ
遺伝子とプロモーター及びベクターとしての役割を有す
るＤＮＡとをＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９６，１７１−１
８４（１９７４）に記載の方法で制限酵素で消化し、次
いでリガーゼを用いて連結することにより調製できる。
本発明は、その一態様において、発現ベクターが、配列
番号2に示す酵母発現ベクターＹＲｐ１Ｇである。

【００１５】ＣＲＰ遺伝子 ＣＲＰは天然に由来するものでも、遺伝子工学技術によ
って発現された組換えタンパク質に由来するものでもよ
いが、病原性の二次感染を考慮すると組換え型が有利で
ある。天然のＣＲＰは、例えばＩＮＣＳＴＡＲ社（米
国）から入手可能である。また、ＣＲＰについてはその
遺伝子の全塩基配列が解明されており（Ｗｏ Ｐ，Ｋｏ
ｒｅｎｂｅｒｇＪＲ，Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ＡＳ，Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２６０：１３３８４−１３３８
８、１９８５）、また、ヒト以外にも多くの哺乳類に存
在していると考えられ、そのような他の哺乳類に存在す
るタンパク質も本発明の方法に使用できる。ＣＲＰ遺伝
子は、前記先行技術文献等に基づいて慣用された技術、
例えば、ハイブリダイゼーション法、ＰＣＲ法等によっ
て得ることができる。

【００１６】さらに、本明細書においてＣＲＰ遺伝子は
限定されるわけではないが、例えば配列番号１に記載さ
れた２０６アミノ酸残基のアミノ酸配列をコードする塩
基配列を意味する。

【００１７】天然のアミノ酸配列と異なっていても、上
記ＣＲＰの生物活性を有する類似体は、本発明の組換え
に含まれる。類似体は、例えば、保存的に置換された配
列を含むことができ、天然のＣＲＰの１個またはそれ以
上のアミノ酸残基は、異なった残基で置き換えられる
が、その保存置換されたＣＲＰは、天然のタンパク質の
場合と本質的に同等の望まれる生物学的活性を保持して
いることが示される。保存置換の例としては、ＣＲＰの
二次および／または三次構造を変化させないアミノ酸の
置換がある。当業者は、上述したような公知の遺伝子工
学技術を用いて、例えば、ヒトＣＲＰ遺伝子を容易に１
またはそれ以上の塩基配列の欠失、置換または付加を行
い、ヒトＣＲＰの類似体を得ることができる。また、天
然に存在するヒトＣＲＰの類似体、例えばアリルも、本
発明のヒトＣＲＰに含まれる。さらにまた、グリコシル
基、脂質、リン酸塩、アセチル基等のような他の化学残
基との共有結合または凝集結合を形成することによっ
て、ヒトＣＲＰの誘導体を生成するように修飾すること
もできる。

【００１８】発現ベクターおよび宿主細胞 本発明は、組換えヒトＣＲＰ発現のための組換え発現ベ
クター、および該発現ベクターで形質転換された宿主細
胞を提供する。いずれかの適当な発現系を用いることも
できる。酵母の発現系が好ましい。発現ベクターは、酵
母等の微生物、哺乳動物、ウイルスまたは昆虫遺伝子に
するものなどの適当な転写または翻訳調節ヌクレオチド
配列に対して機能的に結合した、ヒトＣＲＰをコードす
る遺伝子を含む。調節配列の例としては、転写プロモー
ター、オペレーターまたはエンハンサー、ｍＲＮＡのリ
ボソーム結合部位、並びに転写および翻訳の開始および
終結を制御する適当な配列が含まれる。ヒトＣＲＰの大
量発現を可能にするために、強力な転写プロモーター配
列を発現ベクターに含ませることが好ましい。また、一
般に、所望の宿主細胞中で複製する能力を与える複製起
点、および形質転換細胞を識別する選択遺伝子を、発現
ベクター中に包含させる。

【００１９】本発明の発現ベクターを得るには、例えば
Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２，６
１９−６２９，１９６３に記載の方法に従い、ヒトＣＲ
Ｐ遺伝子とプロモーター及びベクターとしての役割を有
するＤＮＡとをＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９６，１７１
−１８４，１９７４に記載の方法で、例えばＥｃｏＲ
Ｉ，ＢａｍＨＩ等の制限酵素で消化し、次いで、例えば
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いて結合すること
により調製できる。

【００２０】ヒトＣＲＰの発現に適当な宿主細胞として
は、酵母、原核細胞または高等真核生物細胞がある。酵
母、細菌、真菌および哺乳動物細胞宿主と一緒に用いる
のに適当なクローニングおよび発現ベクターは、例え
ば、Ｐｏｕｗｅｌｓら、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒ
ｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，エルセ
ビア、ニューヨーク（１９８５）に記載されている。

【００２１】ヒトＣＲＰは、好ましくは、酵母宿主中
で、特に好ましくは、サッカロマイセス属（例えば、サ
ッカロマイセス・セレビシエ）中で発現させることがで
きる。ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）属またはクルイベロミ
セス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）などの酵母の他
の属を用いてもよい。酵母ベクターは、２μ酵母プラス
ミドからの複製起点配列、自己複製配列（ＡＲＳ）、プ
ロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終
結のための配列および選択可能マーカー遺伝子など用い
ることもできる。

【００２２】酵母ベクターに適当なプロモーター配列に
は、特に、メタロチオネイン、３−ホスホグリセリン酸
キナーゼ（ＰＧＫ）（Ｈｉｔｚｅｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：２０７３，１９８０）、または
エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロ
ゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラ
ーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン
酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピ
ルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホ
スホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼなど
の他の解糖酵素（Ｈｅｓｓら、Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍ
ｅ Ｒｅｇ．７：１４９，１９６８；およびＨｏｌｌａ
ｎｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７：４９００、１９７８）
のプロモーターが含まれる。酵母発現で用いるための他
の適当なベクターおよびプロモーターは、Ｈｉｔｚｅｍ
ａｎ，ＥＰＡ−７３，６５７号で更に記載されている。
また、グルコース抑制性のＡＤＨ１（Ｂｅｎｎｅｔｚｅ
ｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：３０１８、１
９８２）又はＡＤＨ２（Ｒｕｓｓｅｌｌら、Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：２６７４，１９８２；およびＢ
ｅｉｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ３００：７２４，１９８２）
を用いることもできる。あるいは、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１
０（Ｓｔ．Ｊｏｈｎら、Ｃｅｌｌ １６：４４３，１９
７９；およびＳｔ．Ｊｏｈｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．１５２：２８５，１９８１）等を用いることもでき
る。さらに、酵母および大腸菌の両方で複製可能なシャ
トルベクターを、大腸菌中での選択および複製のための
ｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）からのＤＮＡ配列
（Ａｍｐ耐性遺伝子および複製起点）を上記酵母ベクタ
ー中に挿入することによって構築することもできる。分
泌シグナルとしては、インベルターゼ、酸性フォスファ
ターゼ、性フェロモン（α因子、ａ因子）、キラー毒素
などが挙げられる。

【００２３】酵母宿主細胞での発現ベクターとしては、
例えば、配列番号2に示す、酵母のＹＥｐ１Ｇ（特開平
７−２８９２６７号公報）が好ましい。酵母宿主細胞の
代わりに、グラム陰性またはグラム陽性の微生物等の原
核生物、例えば、大腸菌またはバチルス属（Ｂａｃｉｌ
ｌｉ）を宿主細胞として用いることができる。形質転換
に適当な原核生物宿主細胞には、例えば、大腸菌、枯草
菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ネズミチ
フス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕ
ｍ）、並びにシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ）及びブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ
ｓ）内の様々な他の種が含まれる。

【００２４】原核生物宿主細胞中で用いるための発現ベ
クターは、概して、１種類またはそれ以上の表現型選択
可能マーカー遺伝子を含む。表現型選択可能マーカー遺
伝子は、例えば、抗生物質耐性を与えるかまたは独立栄
養要求を与えるタンパク質をコードしている遺伝子であ
る。原核生物宿主細胞に有用な発現ベクターの例として
は、クローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７
０１７）などの商業的に入手可能なプラスミドにするも
のがある。他の商業的に入手可能なベクターとしては、
例えば、ｐＫＫ２３３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉ
ｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ウプサラ、スウェーデン）
およびｐＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ、マ
ディソン、ＷＩ、米国）がある。

【００２５】組換え原核生物宿主細胞発現ベクターに一
般的に用いられるプロモーター配列としては、β−ラク
タマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースプロモーター
系（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ２７５：６１５、１９
７８；およびＧｏｅｄｄｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ２８１：
５４４、１９７９）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモ
ーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．８：４０５７，１９８０；およびＥＰＡ−３６
７７６号）、Ｔ７プロモーター系（Ｄａｖａｎｌｏｏ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８１：２０３５，１９８４）およびｔａｃプロモーター
（Ｍａｎｉａｔｉｓ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎ
ｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ、４１２頁、１９８２）がある。また、ファージλＰ
ＬプロモーターおよびｃＩ８５７ｔｓ熱不安定性リプレ
ッサー配列を用いることもできる。また、分泌シグナル
ペプチドとしては例えば大腸菌 のアルカリ性ホスファ
ターゼ、外膜タンパク質Ａ、外膜タンパク質Ｆ、β−ラ
クタマーゼなどのシグナルペプチドがあげられる。制限
酵素としては、例えばＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩがあげら
れ、リガーゼとしては、例えばＴ４ＤＮＡリガーゼがあ
げられる。

【００２６】あるいは、哺乳動物または昆虫宿主細胞培
養系もまた、組換えＣＲＰを発現させるのに用いること
ができる。哺乳動物宿主細胞中で用いるための発現ベク
ターは、例えば、オカヤマおよびバーグ（Ｍｏｌ．Ｃｅ
ｌｌ Ｂｉｏｌ．３：２８０，１９８３）によって開示
されたように構築することができる。

【００２７】上述したように、本発明においては広範な
範囲から選択された宿主細胞を用いることができる。当
業者は本明細書の記載に基づいて、適当な宿主細胞を選
択することが可能である。好ましい宿主細胞は、公知の
遺伝子工学技術、交配技術等によって得ることもでき
る。あるいは、天然に得られた突然変異体から、好まし
い宿主細胞を選択することもできる。

【００２８】ヒトＣＲＰの発現 上記発現ベクターを用いて、選択された所期の宿主細胞
を公知技術を用いて形質転換することができる。例え
ば、酵母の形質転換プロトコールは、Ｈｉｎｎｅｎら、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７５：
１９２９、１９７８に記載されている。形質転換された
宿主細胞は、各宿主細胞に応じ、組換えヒトＣＲＰの発
現に適した条件下で培養される。

【００２９】本発明の方法によって製造されたＣＲＰタ
ンパク質は、公知の方法によって精製することができ
る。製造されたＣＲＰタンパク質は、宿主細胞を溶菌し
その他の微生物性タンパク質から適当に精製して、ある
いは、ある場合には、ＣＲＰタンパク質を分泌している
培養液から精製して回収することができる。例えば、組
換えＣＲＰタンパク質が培養液中に分泌される場合は、
先ず、商業的に入手可能なタンパク質濃縮フィルター、
例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅＰｅｌ
ｌｉｃｏｎ限外濾過装置を用いてその培地を濃縮するこ
とができる。濃縮工程後、その濃縮物をゲル濾過基剤な
どの精製マトリックスに対して適用することができる。
或いは、陰イオン交換樹脂、例えば、ジエチルアミノエ
チル（ＤＥＡＥ）側基を有するマトリックスまたは支持
体を用いることができる。マトリックスは、アクリルア
ミド、アガロース、デキストラン、セルロースまたはタ
ンパク質精製において一般的に用いられる他の種類であ
り得る。或いは、陽イオン交換工程を用いることができ
る。適当な陽イオン交換体としては、スルホプロピル基
またはカルボキシメチル基を含む種々の不溶性マトリッ
クスがある。最後にＣＲＰタンパク質を更に精製するた
めに、１回またはそれ以上の逆相高速液体クロマトグラ
フィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）工程を、疎水性ＲＰ−ＨＰＬ
Ｃ基剤（例えば、遊離のメチルまたは他の脂肪族側基を
有するシリカゲル）を用いて、使用することができる。
前述の精製工程のいくつかまたは全てを様々な組み合わ
せを用いて、精製ヒトＣＲＰタンパク質を提供すること
ができる。酵母宿主細胞からの分泌組換えタンパク質
は、例えば、Ｕｒｄａｌら（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．
２９６：１７１、１９８４）によって開示されたものと
同様の方法によって精製することができる。ＣＲＰタン
パク質が培養物、分離生菌体、分離菌体の処理物、粗蛋
白抽出液、粗製蛋白などのあらゆる段階で採取可能とな
る。その際の精製法としては、通常の蛋白精製法を用い
ることができる。

【００３１】ヒトＣＲＰタンパク質は、例えば、ＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）によって他のタンパク質に相当するタンパク質バン
ドが検出できないように精製される。タンパク質バンド
は、銀染色、クマシーブルー染色（タンパク質が放射標
識されている場合）オートラジオグラフィーによって目
視することができる。

【００３２】本発明に用いられるヒトＣＲＰ遺伝子とし
ては、ヒトプラセンタの染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣ
Ｒ法で増幅することができる。この時用いる増幅用のプ
ライマーとしては、ヒトＣＲＰ遺伝子の塩基配列に基づ
いて設計した塩基配列である。これを活性の強いプロモ
ーターに接続し、ＹＥｐ型などの多コピー型のベクター
を用いて、宿主細胞に導入し、形質転換した。

【００３３】当該微生物を培養するに際して用いられる
栄養培地の炭素源として、例えばグルコース、シューク
ロース、フルクトース、澱粉加水分解物、糖蜜、亜硫酸
パルプ廃液の糖類、酢酸、乳酸などの有機酸類、さらに
は使用する細菌が資化しうるアルコール類、脂肪酸及び
グリセリンなどが使用でき、窒素源として、例えば硫酸
アンモニウム、塩化アンモニウム、燐酸アンモニウム、
アミノ酸、ペプトン、肉エキス、酵母エキスなどの無機
または有機物が使用できる。さらに無機塩類として、例
えばカリウム、ナトリウム、燐酸、亜鉛、鉄、マグネシ
ウム、マンガン、銅、カルシウム、コバルトなどの各塩
類、必要に応じて微量金属塩、コーン・スティープ・リ
カー、ビタミン類、核酸などを使用してもよく、細菌の
一般的な培地が使用できる。

【００３４】これらの培地を用いて、本発明の酵母を２
０〜４５℃、好ましくは２５〜３５℃、最適には３０
℃、ｐＨを７．０〜７．４、最適には７．２で好気的に
培養すればよい。

【００３５】以下、本発明を実施例により具体的に説明
するが、これらは、本発明の技術的範囲を限定するため
のものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容
易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは
本発明の技術的範囲に含まれる。

【００３６】

【実施例】

【００３７】実施例１ 組換えＣＲＰ発現のための発現
ベクターの作製 ヒトプラセンタ の染色体ＤＮＡ〔クローンテック（Ｃ
ＬＯＮＴＥＣＨ）社製〕を鋳型として、次の一本鎖合成
オリゴヌクレオチドである２種のプライマーの組み合わ
せを用いて、「遺伝子工学製品ガイド」（宝酒造株式会
社、１９９５−１９９６）の記載に従って、ヒトＣＲＰ
遺伝子をＰＣＲ法により増幅した。

【００３８】５'−ＧＣＴＧＣＡＧＴＣＡＧＧＧＣＣＡ
ＣＡＧＣＴＧＧＧＴＴＴ−３' ５'−ＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣＡＧＡＣＡＧＡＣＡＴＧ
ＴＣＧＡＧＧＡＡＧＧＣＴＴＴＴＧＴＧＴＴＴＣＣＣＡ
ＡＡ−３'

【００３９】この反応液のフェノール抽出によって夾雑
蛋白質の除去を行った。さらにアガロース電気泳動で約
０．６４ｋｂのヒトＣＲＰ遺伝子の増幅が確認できた。

【００４０】当該ＣＲＰ遺伝子と終止コドンを含むを含
むＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ切断部位間を、市販の大腸菌ベ
クターｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩの切断部位に
挿入して、ｐＵＣ ＣＲＰを構築した。

【００４１】酵母内発現用の多コピー型ベクターとし
て、配列番号１に示す塩基配列を有するＹＲｐ１Ｇ（特
開平７−２８９２６７号）を利用した。ＹＲｐ１Ｇ、高
いプロモーター活性を有するＧＡＰ（グリセルアルデヒ
ド３リン酸デヒドロゲナーゼ）プロモーターを含む。ｐ
ＵＣ ＣＲＰのＣＲＰ構造遺伝子を含む切断部位間をパ
ン酵母発現ベクター、ＹＲｐ１Ｇへ挿入して、発現プラ
スミドＹＲｐ１Ｇ ＣＲＰを作成した。（図１）

【００４２】実施例２ 組換えＣＲＰの生産 前述の特開平７−２８９２６７号に記載された方法に従
い、組換えＣＲＰタンパクの産生を行った。まず、実施
例１で作成した発現ベクターＹＲｐ１Ｇ ＣＲＰを用い
てパン酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ）を形質転換した。該形質転換酵母宿主細胞
を、特開平７−２８９２６７号に記載された方法に従
い、１６Ｌ容量発酵槽において組換えＣＲＰの生産を行
った。その結果、５１０ｇの湿菌体が得られた。その菌
体を等量の５ｍＭ βメルカプトエタノールと１ｍＭ
ＥＤＴＡを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液に懸濁
し、菌体をダイノミルで破砕し、細胞片を遠心分離によ
って除去することにより無細胞溶解物の粗抽出液を調製
した。

【００４３】組換えＣＲＰの精製は、ホスホコリンをＢ
ＳＡを介してトヨパールに固定化したカラムを用いたア
フィニティクロマトグラフィで精製した、精製した組換
えＣＲＰをＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動で分析し
たところ、天然型ＣＲＰと同一分子量の位置に泳動され
た。さらに組換えＣＲＰを電気泳動したアクリルアミド
ゲルを電気的にＰＶＤＦ膜に転写し、天然型ＣＲＰをウ
サギに免疫して得られた抗体を用いたウエスタンブロッ
ティング法で染色したところ、天然型ＣＲＰと同一の位
置に染色された。

【００４４】ついで、組換えＣＲＰをプロテインシーケ
ンサーを用いてＮ末端から１０残基シーケンスしたとこ
ろ、天然型の配列と一致した。

【００４５】実施例３ 抗体性能測定 実施例２で調製した精製した組換えＣＲＰをフロイント
の完全アジユバントと共にウサギに免疫して得られた抗
血清をヒト腹水から精製したＣＲＰを、ウサギに免疫し
て得られた抗血清と比較すると、同等のベッカータイタ
ー値を示した。（下記する表１）

【００４６】

【表ｌ】 ウサギ抗組換えヒトＣＲＰ抗血清と抗天然型ヒトＣＲＰ抗血清のべッカータイ ター値の比較 ─────────────────────── ベッカータイター（mg/ml） 抗血清 天然型ＣＲＰ 組換えＣＲＰ ─────────────────────── Ｎ１ ４．５ ４．６ Ｎ２ ５．０ ４．９ Ｒ２ ６．８ ６．９ Ｒ４ ６．５ ６．６ Ｒ８ ４．７ ４．６ ───────────────────────

【００４７】これらの抗体をＣＲＰ標準血清ＣＡ−７
（ＡＴＡＢ社製）、正常ヒト血清ＣＡ−１（ＡＴＡＢ社
製）、ＣＲＰ（−）血清、ＳＡＰを用いてウエスタンブ
ロッティングで分析すると両者は全く同一の反応性を示
した。

【００４８】

【発明の効果】以上述べたように、本発明によればＣＲ
Ｐタンパク質をコードする遺伝子を発現ベクターに組込
んだものを使用して宿主細胞を形質転換し、当該宿主細
胞によって前述の遺伝子を発現させることにより、ＣＲ
Ｐタンパク質を大量に供給することが可能となった。

【００４９】また、得られた組換え型ＣＲＰは天然型と
まったく同じアミノ酸配列を持ち、これを精製後免疫し
てえられた抗血清は天然型を免疫してえられた抗血清と
まったく同じ反応性を示すため、臨床検査用の試薬とし
て血液中のＣＲＰ量を正確に定量するための抗体を調製
するための抗原、あるいはキャリブレーターとして非常
に有用である。

【００５０】

【配列番号】

【００５１】 配列番号：１ （ｉ）配列の特性 （Ａ）長さ：５８４８塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ （ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ （ｖｉｉ）直接の起源： （Ａ）生物名：ヒト （ｘｉ）配列：配列番号：１ 配列： CAG ACA GAC ATG TCG AGG AAG GCT TTT GTG TTT CCC AAA GAG TCG 45 Gln Thr Asp Met Ser Arg Lys Ala Phe Val Phe Pro Lys Glu Ser 5 10 15 GAT ACT TCC TAT GTA TCC CTC AAA GCA CCG TTA ACG AAG CCT CTC 90 Asp Thr Ser Tyr Val Ser Leu Lys Ala Pro Leu Thr Lys Pro Leu 20 25 30 AAA GCC TTC ACT GTG TGC CTC CAC TTC TAC ACG GAA CTG TCC TCG 135 Lys Ala Phe Thr Val Cys Leu His Phe Tyr Thr Glu Leu Ser Ser 35 40 45 ACC CGT GGG TAC AGT ATT TTC TCG TAT GCC ACC AAG AGA CAA GAC 180 Thr Arg Gly Tyr Ser Ile Phe Ser Tyr Ala Thr Lys Arg Gln Asp 50 55 60 AAT GAG ATT CTC ATA TTT TGG TCT AAG GAT ATA GGA TAC AGT TTT 225 Asn Glu Ile Leu Ile Phe Trp Ser Lys Asp Ile Gly Tyr Ser Phe 65 70 75 ACA GTG GGT GGG TCT GAA ATA TTA TTC GAG GTT CCT GAA GTC ACA 270 Thr Val Gly Gly Ser Glu Ile Leu Phe Glu Val Pro Glu Val Thr 80 85 90 GTA GCT CCA GTA CAC ATT TGT ACA AGC TGG GAG TCC GCC TCA GGG 315 Val Ala Pro Val His Ile Cys Thr Ser Trp Glu Ser Ala Ser Gly 95 100 105 ATC GTG GAG TTC TGG GTA GAT GGG AAG CCC AGG GTG AGG AAG AGT 360 Ile Val Glu Phe Trp Val Asp Gly Lys Pro Arg Val Arg Lys Ser 110 115 120 CTG AAG AAG GGA TAC ACT GTG GGG GCA GAA GCA AGC ATC ATC TTG 405 Leu Lys Lys Gly Tyr Thr Val Gly Ala Glu Ala Ser Ile Ile Leu 125 130 135 GGG CAG GAG CAG GAT TCC TTC GGT GGG AAC TTT GAA GGA AGC CAG 450 Gly Gln Glu Gln Asp Ser Phe Gly Gly Asn Phe Glu Gly Ser Gln 140 145 150 TCC CTG GTG GGA GAC ATT GGA AAT GTG AAC ATG TGG GAC TTT GTG 495 Ser Leu Val Gly Asp Ile Gly Asn Val Asn Met Trp Asp Phe Val 155 160 165 CTG TCA CCA GAT GAG ATT AAC ACC ATC TAT CTT GGC GGG CCC TTC 540 Leu Ser Pro Asp Glu Ile Asn Thr Ile Tyr Leu Gly Gly Pro Phe 170 175 180 AGT CCT AAT GTC CTG AAC TGG CGG GCA CTG AAG TAT GAA GTG CAA 585 Ser Pro Asn Val Leu Asn Trp Arg Ala Leu Lys Tyr Glu Val Gln 185 190 195 GGC GAA GTG TTC ACC AAA CCC CAG CTG TGG CCC TGA 621 Gly Glu Val Phe Thr Lys Pro Gln Leu Trp Pro *** 200 205 206

【００５２】 配列番号：２ （ｉ）配列の特性 （Ａ）長さ：５８４８塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：両形態 （ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ （ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ （ｖｉｉ）直接の起源： （Ｃ）クローン名：ＹＲｐ１Ｇ （ｘｉ）配列：配列番号：２ 配列： 1 AGATCTGGGC CTCGTGATAC GCCTATTTTT ATAGGTTAAT GTCATGATAA TAATGGTTTC 61 TTAGACGTCA GGTGGCACTT TTCGGGGAAA TGTGCGCGGA ACCCCTATTT GTTTATTTTT 121 CTAAATACAT TCAAATATGT ATCCGCTCAT GAGACAATAA CCCTGATAAA TGCTTCAATA 181 ATATTGAAAA AGGAAGAGTA TGAGTATTCA ACATTTCCGT GTCGCCCTTA TTCCCTTTTT 241 ATATTGAAAA AGGAAGAGTA TGAGTATTCA ACATTTCCGT GTCGCCCTTA TTCCCTTTTT 301 TGAAGATCAG TTGGGTGCAC GAGTGGGTTA CATCGAACTG GATCTCAACA GCGGTAAGAT 361 CCTTGAGAGT TTTCGCCCCG AAGAACGTTT TCCAATGATG AGCACTTTTA AAGTTCTGCT 421 ATGTGGCGCG GTATTATCCC GTATTGACGC CGGGCAAGAG CAACTCGGTC GCCGCATACA 481 CTATTCTCAG AATGACTTGG TTGAGTACTC ACCAGTCACA GAAAAGCATC TTACGGATGG 541 CATGACAGTA AGAGAATTAT GCAGTGCTGC CATAACCATG AGTGATAACA CTGCGGCCAA 601 CTTACTTCTG ACAACGATCG GAGGACCGAA GGAGCTAACC GCTTTTTTGC ACAACATGGG 661 GGATCATGTA ACTCGCCTTG ATCGTTGGGA ACCGGAGCTG AATGAAGCCA TACCAAACGA 721 CGAGCGTGAC ACCACGATGC CTGTAGCAAT GGCAACAACG TTGCGCAAAC TATTAACTGG 781 CGAACTACTT ACTCTAGCTT CCCGGCAACA ATTAATAGAC TGGATGGAGG CGGATAAAGT 841 TGCAGGACCA CTTCTGCGCT CGGCCCTTCC GGCTGGCTGG TTTATTGCTG ATAAATCTGG 901 AGCCGGTGAG CGTGGGTCTC GCGGTATCAT TGCAGCACTG GGGCCAGATG GTAAGCCCTC 961 CCGTATCGTA GTTATCTACA CGACGGGGAG TCAGGCAACT ATGGATGAAC GAAATAGACA 1021 GATCGCTGAG ATAGGTGCCT CACTGATTAA GCATTGGTAA CTGTCAGACC AAGTTTACTC 1081 ATATATACTT TAGATTGATT TAAAACTTCA TTTTTAATTT AAAAGGATCT AGGTGAAGAT 1141 CCTTTTTGAT AATCTCATGA CCAAAATCCC TTAACGTGAG TTTTCGTTCC ACTGAGCGTC 1201 AGACCCCGTA GAAAAGATCA AAGGATCTTC TTGAGATCCT TTTTTTCTGC GCGTAATCTG 1261 CTGCTTGCAA ACAAAAAAAC CACCGCTACC AGCGGTGGTT TGTTTGCCGG ATCAAGAGCT 1321 ACCAACTCTT TTTCCGAAGG TAACTGGCTT CAGCAGAGCG CAGATACCAA ATACTGTCCT 1381 TCTAGTGTAG CCGTAGTTAG GCCACCACTT CAAGAACTCT GTAGCACCGC CTACATACCT 1440 CGCTCTGCTA ATCCTGTTAC CAGTGGCTGC TGCCAGTGGC GATAAGTCGT GTCTTACCGG 1501 GTTGGACTCA AGACGATAGT TACCGGATAA GGCGCAGCGG TCGGGCTGAA CGGGGGGTTC 1561 GTGCACACAG CCCAGCTTGG AGCGAACGAC CTACACCGAA CTGAGATACC TACAGCGTGA 1621 GCTATGAGAA AGCGCCACGC TTCCCGAAGG GAGAAAGGCG GACAGGTATC CGGTAAGCGG 1681 CAGGGTCGGA ACAGGAGAGC GCACGAGGGA GCTTCCAGGG GGAAACGCCT GGTATCTTTA 1741 TAGTCCTGTC GGGTTTCGCC ACCTCTGACT TGAGCGTCGA TTTTTGTGAT GCTCGTCAGG 1801 GGGGCGGAGC CTATGGAAAA ACGCCAGCAA CGCGGCCTTT TTACGGTTCC TGGCCTTTTG 1861 CTGGCCTTTT GCTCACATGT TCTTTCCTGC GTTATCCCCT GATTCTGTGG ATAACCGTAT 1921 TACCGCCTTT GAGTGAGCTG ATACCGCTCG CCGCAGCCGA ACGACCGAGC GCAGCGAGTC 1981 AGTGAGCGAG GAAGCGGAAG AGCGCCCAAT ACGCAAACCG CCTCTCCCCG CGCGTTGGCC 2041 GATTCATTAA TGCAGCTGGC ACGACAGGTT TCCCGACTGG AAAGCGGGCA GTGAGCGCAA 2101 CGCAATTAAT GTGAGTTAGC TCACTCATTA GGCACCCCAG GCTTTACACT TTATGCTTCC 2161 GGCTCGTATG TTGTGTGGAA TTGTGAGCGG ATAACAATTT CACACAGGAA ACAGCTATGA 2221 CCATGATTAC GCCAAGCTTA CATTTTATGT TAGCTGGTGG ACTGACGCCA GAAAATGTTG 2281 GTGATGCGCT TAGATTAAAT GGCGTTATTG GTGTTGATGT AAGCGGAGGT GTGGAGACAA 2341 ATGGTGTAAA AGACTCTAAC AAAATAGCAA ATTTCGTCAA AAATGCTAAG AAATAGGTTA 2401 TTACTGAGTA GTATTTATTT AAGTATTGTT TGTGCACTTG CCTGCAGGCC TTTTGAAAAG 2461 CAAGCATAAA AGATCTAAAC ATAAAATCTG TAAAATAACA AGATGTAAAG ATAATGCTAA 2521 ATCATTTGGC TTTTTGATTG ATTGTACAGG AAAATATACA TCGCAGGGGG TTGACTTTTA 2581 CCATTTCACC GCAATGGAAT CAAACTTGTT GAAGAGAATG TTCACAGGCG CATACGCTAC 2641 AATGACCCGA TTCTTGCTAG CCTTTTCTCG GTCTTGCAAA CAACCGCCGG CAGCTTAGTA 2701 TATAAATACA CATGTACATA CCTCTCTCCG TATCCTCGTA ATCATTTTCT TGTATTTATC 2761 GTCTTTTCGC TGTAAAAACT TTATCACACT TATCTCAAAT ACACTTATTA ACCGCTTTTA 2820 CTATTATCTT CTACGCTGAC AGTAATATCA AACAGTGACA CATATTAAAC ACAGTGGTTT 2881 CTTTGCATAA ACACCATCAG CCTCAAGTCG TCAAGTAAAG ATTTCGTGTT CATGCAGATA 2941 GATAACAATC TATATGTTGA TAATTAGCGT TGCCTCATCA ATGCGAGATC CGTTTAACCG 3001 GACCCTAGTG CACTTACCCC ACGTTCGGTC CACTGTGTGC CGAACATGCT CCTTCACTAT 3061 TTTAACATGT GGACTAGTCT CGGGATGCAT TTTTGTAGAA CAAAAAAGAA GTATAGATTC 3121 TTTGTTGGTA AAATAGCGCT CTCGCGTTGC ATTTCTGTTC TGTAAAAATG CAGCTCAGAT 3181 TCTTTGTTTG AAAAATTAGC GCTCTCGCGT TGCATTTTTG TTTTACAAAA ATGAAGCACA 3241 GATTCTTCGT TGGTAAAATA GCGCTTTCGC GTTGCATTTC TGTTCTGTAA AAATGCAGCT 3301 CAGATTCTTT GTTTGAAAAA TTAGCGCTCT CGCGTTGCAT TTTTGTTCTA CAAAATGAAG 3361 CACAGATGCT TCGTTAACAA AGATATGCTA TTGAAGTGCA AGATGGAAAC GCAGAAAATG 3421 AACCGGGGAT GCGACGTGCA AGATTACCTA TGCAATAGAT GCAATAGTTT CTCCAGGAAC 3481 CGAAATACAT ACATTGTCTT CCGTAAAGCG CTAGACTATA TATTATTATA CAGGTTCAAA 3541 TATACTATCT GTTTCAGGGA AAACTCCCAG GTTCGGATGT TCAAAATTCA ATGATGGGTA 3601 ACAAGTACGA TCGTAAATCT GTAAAACAGT TTGTCGGATA TTAGGCTGTA TCTCCTCAAA 3661 GCGTATTCGA ATATCATTGA GAAGCTGCAG ACTAGTTTTT CAATTCAATT CATCATTTTT 3721 TTTTTATTCT TTTTTTTGAT TTCGGTTTCT TTGAAATTTT TTTGATTCGG TAATCTCCGA 3781 ACAGAAGGAA GAACGAAGGA AGGAGCACAG ACTTAGATTG GTATATATAC GCATATGTAG 3841 TGTTGAAGAA ACATGAAATT GCCCAGTATT CTTAACCCAA CTGCACAGAA CAAAAACCTG 3901 CAGGAAACGA AGATAAATCA TGTCGAAAGC TACATATAAG GAACGTGCTG CTACTCATCC 3961 TAGTCCTGTT GCTGCCAAGC TATTTAATAT CATGCACGAA AAGCAAACAA ACTTGTGTGC 4021 TTCATTGGAT GTTCGTACCA CCAAGGAATT ACTGGAGTTA GTTGAAGCAT TAGGTCCCAA 4081 AATTTGTTTA CTAAAAACAC ATGTGGATAT CTTGACTGAT TTTTCCATGG AGGGCACAGT 4141 TAAGCCGCTA AAGGCATTAT CCGCCAAGTA CAATTTTTTA CTCTTCGAAG ACAGAAAATT 4201 TGCTGACATT GGTAATACAG TCAAATTGCA GTACTCTGCG GGTGTATACA GAATAGCAGA 4261 ATGGGCAGAC ATTACGAATG CACACGGTGT GGTGGGCCCA GGTATTGTTA GCGGTTTGAA 4321 GCAGGCGGCA GAAGAAGTAA CAAAGGAACC TAGAGGCCTT TTGATGTTAG CAGAATTGTC 4381 ATGCAAGGGC TCCCTATCTA CTGGAGAATA TACTAAGGGT ACTGTTGACA TTGCGAAGAG 4441 CGACAAAGAT TTTGTTATCG GCTTTATTGC TCAAAGAGAC ATGGGTGGAA GAGATGAAGG 4501 TTACGATTGG TTGATTATGA CACCCGGTGT GGGTTTAGAT GACAAGGGAG ACGCATTGGG 4561 TCAACAGTAT AGAACCGTGG ATGATGTGGT CTCTACAGGA TCTGACATTA TTATTGTTGG 4621 AAGAGGACTA TTTGCAAAGG GAAGGGATGC TAAGGTAGAG GGTGAACGTT ACAGAAAAGC 4681 AGGCTGGGAA GCATATTTGA GAAGATGCGG CCAGCAAAAC TAAAAAACTG TATTATAAGT 4741 AAATGCATGT ATACTAAACT CACAAATTAG AGCTTCAATT TAATTATATC AGTTATTACC 4801 CGGGAATCTC GGTCGTAATG ATTTTTATAA TGACGAAAAA AAAAAAATTG GAAAGAAAAA 4861 GCATGCGTCG AGTTTATCAT TATCAATACT CGCCATTTCA AAGAATACGT AAATAATTAA 4921 TAGTAGTGAT TTTCCTAACT TTATTTAGTC AAAAAATTAG CCTTTTAATT CTGCTGTAAC 4981 CCGTACATGC CAAAATAGGG GGCGGGTTAC ACAGAATATA TAACACTGAT GGTGCTTGGG 5041 TGAACAGGTT TATTCCTGGC ATCCACTAAA TATAATGGAG CCCGCTTTTT AAGCTGGCAT 5101 CCAGAAAAAA AAAGAATCCC AGCACCAAAA TATTGTTTTC TTCACCAACC ATCAGTTCAT 5161 AGGTCCATTC TCTTAGCGCA ACTACAGAGA ACAGGGCACA AACAGGCAAA AAACGGGCAC 5221 AACCTCAATG GAGTGATGCA ACCTGCCTGG AGTAAATGAT GACACAAGGC AATTGACCCA 5281 CGCATGTATC TATCTCATTT TCTTACACCT TCTATTACCT TCTGCTCTCT CTGATTTGGA 5341 AAAAGCTGAA AAAAAAGGTT TAAACCAGTT CCCTGAAATT ATTCCCCTAC TTGACTAATA 5401 AGTATATAAA GACGGTAGGT ATTGATTGTA ATTCTGTAAA TCTATTTCTT AAACTTCTTA 5461 AATTCTACTT TTATAGTTAG TCTTTTTTTT AGTTTTAAAA CACCAAGAAC TTAGTTTCGA 5521 ATAAACACAC ATAAATAAAC AAAGAATTCG TCGACGGATC CCTCGAGATT GAATTGAATT 5581 GAAATCGATA GATCAATTTT TTTCTTTTCT CTTTCCCCAT CCTTTACGCT AAAATAATAG 5641 TTTATTTTAT TTTTTGAATA TTTTTTATTT ATATACGTAT ATATAGACTA TTATTTACTT 5701 TTAATAGATT ATTAAGATTT TTATTAAAAA AAAATTCGTC CCTCTTTTTA ATGCCTTTTA 5761 TGCAGTTTTT TTTTCCCATT CGATATTTCT ATGTTCGGGT TTCAGCGTAT TTTAAGTTTA 5821 ATAACTCGAA AATTCTGCGT TTCGAAAA

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒトＣＲＰの酵母発現プラスミドＹＲｐ１Ｇ
ＣＲＰの概略図を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA53 BA61 BA80 CA03 CA04 DA12 EA04 GA11 HA15 4B064 AG01 AG26 AG27 CA06 CA19 CC24 CE12 DA01 DA13 4H045 AA20 BA10 CA40 CA46 EA20 EA50 FA72 FA73 FA74 HA07

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】生物学的に活性な組換えＣ反応性タンパク
   質の製造方法であって、 ａ）Ｃ反応性タンパク質をコードする遺伝子を発現ベク
   ターに組み込み； ｂ）前記発現ベクターで宿主細胞を形質転換し；そして ｃ）形質転換した宿主細胞を培養することを特徴とする
   前記製造方法。
2. 【請求項２】発現ベクターが、酵母発現ベクターＹＲｐ
   １Ｇである請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】宿主細胞が、酵母である請求項１ないし２
   のいずれか１項に記載の方法。
4. 【請求項４】請求項１ないし３のいずれか１項に記載の
   方法により製造された、組換えＣ反応性タンパク質。