KR101050669B1 - 이분자 형광 상보 기법을 이용하여 단백질의 수모화를 분석하는 방법 및 그에 사용되는 벡터들 - Google Patents

Abstract

본 발명은 이분자 형광 상보(bimolecular fluorescence complementation) 기법을 이용하여 세포에서 일어나는 단백질의 수모화(sumoylation) 현상을 실시간으로 분석하는 방법과 그에 사용되는 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 자연 상태에서 일어나는 단백질의 수모화를 실시간으로 분석할 수 있을 뿐만 아니라 수모화가 일어나는 세포 내 위치까지 분석할 수 있다는 장점이 있다.

수모(small ubiquitin-related modifier; SUMO), 수모화(sumoylation)

Description

이분자 형광 상보 기법을 이용하여 단백질의 수모화를 분석하는 방법 및 그에 사용되는 벡터들{A method for analyzing sumoylation of protein and cloning vectors used in the method}

본 발명은 세포에서 단백질의 수모화(sumoylation)를 실시간으로 분석하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 이분자 형광 상보 (bimolecular fluorescence complementation) 기법을 이용하여 세포 내 수모화를 분석하는 방법에 관한 것이다.

생명체는 단백질이 유전자로부터 전사, 번역된 후 단백질 수식(post-translational modification) 과정을 통하여 단백질의 기능을 조절한다. 현재까지 인산화(phosphorylation), 유비퀴틴화(ubiquitylation), 아세틸화(acetylation), 메틸화(methylation) 등의 다양한 단백질 수식 과정이 알려져 있는데, 이러한 과정들은 적은 에너지 소모로도 단백질의 세포 내 양 또는 위치 등 단백질의 성질을 바꾸어 생명체의 성장과 발달에 중요한 역할을 한다고 보고되었다. 최근에는 다양한 연구들을 통해 단백질 수식 과정으로 유비퀴틴 유사 단백질(ubiquitin-like protein; Ubls)들이 밝혀지고 있고, 이러한 수식 과정을 통해 세포는 세포 주기 조절, 단백질 분해, 단백질의 세포 내 위치 조절, 세포 크기 조절 등의 다양한 단백 질의 기능을 조절한다고 알려지고 있다(Li et al., Nature 1999, 398:246-251; Goehring et al., Mol. Biol. Cell. 2003, 14:4329-4341; Laplaza et al., Biochem. J. 2004, 377:459-467). 특히, 최근에 여러 유비퀴틴 유사 단백질들 중 수모(small ubiquitin-related modifier; SUMO) 단백질이 여러 생명체에서 가장 많이 연구되고 있고 중요한 역할을 한다고 알려지고 있다(Johnson, Annu. Rev. Biochem. 2004, 73:355-382).

수모는 약 15 kDa 정도의 단백질로 100여 개의 아미노산으로 구성되어 있어 구조적으로도 유비퀴틴과 유사하다. 척추동물에서는 네 종류의 수모 단백질들(SUMO-1, 2, 3, 4)이 발견된 반면 효모에서는 한 종류의 수모 단백질(Smt3)이 발견되었는데 이는 척추 동물에서의 SUMO1과 유사하다고 밝혀져 있다. 수모 단백질은 유비퀴틴 단백질과 같이 기질 단백질의 라이신 잔기에 공유결합한다. 하지만 단백질의 유비퀴틴화는 단백질을 분해시키는 작용으로 잘 알려져 있지만, 단백질의 수모화는 주위 환경에 따라 단백질의 분해뿐만 아니라, 단백질의 기능을 변화시킬 것으로 예상되고 있다(Johnson, J. Biol. Chem. 1997, 272:26799-26802; Johnson, J. Cell Biol. 1999, 147:981-994). 따라서 세포 내 단백질의 기능을 유추하는 데 있어 단백질 수모화 분석이 필수적이라 할 수 있으며, 최근에 이에 대한 연구들이 활발히 진행되고 있다.

단백질의 수모화 현상에 대한 관심이 증가함에 따라 이를 분석하기 위한 여 러 연구가 진행되고 있으며, 현재 효모에서는 총 6000여 개의 단백질 중 300여 개의 단백질이 수모화 된다고 밝혀져 있다. 효모 단백질의 수모화 연구에 사용되고 있는 방법은 크게 면역침강법(immunoprecipitation)을 이용한 후 질량분석법으로 분석하는 방법과 연속 친화 정제 표지(tandem affinity purification tag)가 부착된 단백질을 이용하여 웨스턴 블롯(Western blot)으로 분석하는 방법으로 나눌 수 있다.

일단 면역침강법을 살펴보면, 생체 내에서 단백질은 다른 단백질과 결합을 통해 기능을 수행하기 때문에 특정 단백질을 정제하면 결합하는 다른 단백질들도 같이 정제가 된다. X와 결합하는 다른 단백질을 Y라 하면 X에 대한 항체를 넣어주었을 때 X/Y/X-항체의 복합침전물을 얻을 수 있는데 이 침전물을 전기영동 분석한 후 Y를 검출하면 X와 Y의 상호작용을 생화학적으로 분석할 수 있다. 이 방법은 많은 단백질 상호작용 연구에 널리 이용되고 있고, 단백질 수모화 연구에도 적용하여 수모화 되어 있는 미지의 단백질을 분리해낼 수 있다. 이와 더불어, 단백질을 구성하는 단백질 고유의 펩타이드들을 분석할 수 있는 질량분석 기법을 이용하여 면역침강법으로 복합 침전된 미지의 단백질들을 분석할 수 있다. 이를 이용하여 Johnson과 Blobel (Johnson and Blobel, J. Cell Biol. 1999, 147:981-994)은 단백질의 수모화가 세포 주기 진행에 큰 역할을 할 수 있음을 보고하였다. 세포 주기는 여러 단백질의 생성과 분해를 통해 순환하는데, 이때 진행과 멈춤이 정확하게 조절되어야만 세포가 정상적으로 살 수 있다. 특히 여러 단백질들 중에 셉틴 단백질들은 효모가 성장할 때 형성되는 버드넥(bud neck) 부분에 형성되는 단백질들을 말하 는데, 이들 단백질들이 수모화에 의해 정확하게 세포 주기를 조절하게 된다고 보고하였다. 즉, 수모화가 단백질의 기능을 조절하여 세포 성장에 중요한 역할을 하고 있다는 것을 보여준다. Hoege 등(Hoege et al., Nature 2002, 419:135-141)은 DNA 복제에 중요한 역할을 한다고 알려진 PCNA 단백질이 수모화된다는 것을 밝혔고, 이는 DNA 복구를 비롯한 DNA의 전반적인 안정성에 중요하다는 것을 보고하였다. Bachant 등(Bachant et al., Mol. Cell 2002, 9:1169-1182)은 세포 분열 시에 적도판에 배열되는 크로마틴의 구성 요소와 동원체의 코헤신 구조에 중요한 역할을 한다고 알려진 DNA topoisomerase II인 Top2 단백질이 수모화되는 것을 밝혔고, 수모화를 통해 Top2의 기능이 조절됨을 보고하였다.

단백질의 수모화가 세포 내에서 많은 단백질의 기능을 조절하여 세포의 성장과 발달에 중요한 역할을 할 것이라 생각되지만, 실제로 많은 수의 수모 타겟 단백질이 발견되지 않았었다. 왜냐하면, 타겟 단백질의 양이 적어서 질량 분석이 어렵거나 수모화가 다양한 환경에서 특정 조건에서만 일어남으로써 정상상태에서는 타겟 단백질의 검출에 한계가 있을 수 있기 때문이다. 하지만 질량 분석 기술의 급진전으로 극소량(100 fmol 이하 수준)의 단백질만으로도 단백질 확인이 가능해졌다. 따라서 수모 단백질을 면역침강하여 정제된 미지의 단백질을 고성능 질량 분석 기법으로 분석하면 수모화되는 미량의 단백질도 분석할 수 있다. 이를 이용하여 새로운 수모화 단백질들을 찾아낼 수 있었고, 최근에는 특정 개체의 유전체 수준에서 수모화되는 단백질들을 찾으려는 연구들이 진행되고 있다. 그 예로, Zhou 등(Zhou et al., J. Biol. Chem. 2004, 279:32262-8)은 효모에서 수모 단백질의 N 말단에 FLAG 표지를 붙여 면역침강함으로써 수모화된 단백질들을 얻은 후, 질량 분석기를 이용하여 수모화 단백질을 분석할 수 있음을 보고하였다. 또한 Zhou 등은 세포는 다양한 세포 성장 환경에서 단백질의 수모화를 통해서 단백질의 기능을 조절하여 환경에 적응한다는 점에 착안하여, 과산화수소(H2O2) 혹은 에탄올(ethanol) 처리시의 단백질의 수모화 패턴 변화를 분석하여 80여 개의 수모화 단백질을 밝혀 내었다. Wohlschlegel 등(Wohlschlegel et al., J. Biol. Chem. 2004, 279:45662-8), Denison 등(Denison et al., Mol. Cell. Proteomics 2005, 4:246-254), Panse 등(Panse et al., J. Biol. Chem. 2004, 279:41346-41351)도 효모에서의 수모 단백질인 Smt3의 N 말단에 HIS 등의 표지를 붙인 후 면역침강시킨 후, 정제된 미지의 단백질을 질량 분석 기법으로 분석하여 각각 약 280, 220, 100 여 개의 수모화 단백질을 밝혀내었다.

단백질 수모화 연구를 위해 연속 친화 정제 표지가 부착된 단백질을 이용하여 웨스턴 블롯으로 분석하는 방법도 있다. Ghaemmaghami 등(Ghaemmaghami et al., Nature 2003, 425: 737-741)은 연속 친화 정제 표지가 부착된 균주 라이브러리를 이용하여 효모 단백질의 전체적인 발현 프로파일을 포괄적으로 분석할 수 있음을 보고하였다. 이 연속 친화 정제 표지를 이용하면 특정 단백질의 발현 정도뿐만 아니라, 번역 후 단백질 수식(post-translational modification) 과정에 의한 단백질의 변화도 분석할 수 있다. 즉, 약 15 kDa 정도 크기의 유비퀴틴 혹은 수모 단백질이 타겟 단백질의 라이신 잔기에 공유결합을 이루게 되면 결합하는 단백질의 수에 따라 본래의 단백질 크기보다 더 큰 단백질이 검출될 것이다. 이를 이용하여 수모 에 의해 웨스턴 밴드의 이동 현상이 일어나는 수모화 단백질들을 구분해낼 수 있다. 그 예로, Wykoff 등(Wykoff et al., Mol. Cell. Proteomics 2005, 4:73-83)은 유전체 수준의 연속 친화 정제 표지 부착 라이브러리를 이용하여 약 80여 개의 수모화 단백질들을 밝혀내었다. 뿐만 아니라 상기의 면역침강법을 이용한 분석방법들에서도 면역침강법으로 밝혀낸 실험 결과를 확인하기 위하여, 웨스턴 블롯으로 단백질의 크기 변화를 분석하여 단백질의 수모화를 연구하였다.

하지만 상기의 수모화 단백질 분석 방법들은 모두 생체 외(in vitro) 조건에서 실험을 하기 때문에 실제 생체 내(in vivo) 상호작용과 상이한 경우가 많을 뿐만 아니라, 면역침강법과 웨스턴 방법 모두 단백질을 정제하는 과정에서 손실이 일어날 가능성이 많기 때문에 아주 강한 결합의 단백질 상호작용이 아니면 탐지하기 어렵다는 한계가 있다. 또한, 수모가 세포의 성장과 주위 환경 변화에 대한 인식과 반응에 중요함에도 불구하고, 상기의 분석 방법들은 생체 외 조건 실험방법이기 때문에, 주위 환경이나 세포 성장상태에 따른 단백질의 수모화 연구에 이용하기에는 한계가 있다. 따라서 생체 내 단백질 상호작용을 보다 정확하게 분석하기 위한 시스템의 개발이 필요하다.

Hu 등(Hu et al., Mol. Cell 2002, 9:789-798)은 동물 세포에서 이분자 형광 상보 기법을 이용하여 단백질 상호작용 분석이 가능함을 보고하였다. 이분자 형광 상보 기법은 기존에 보고되었던 단백질 절편의 상보 작용(protein fragment complementation)을 형광 단백질에 적용시켜, 형광단백질을 N 말단 및 C 말단 절편으로 나눈 후 상호 작용을 알아보고자 하는 두 단백질 뒤에 각각 발현되게 한다. 만약 두 단백질이 상호작용을 하기 위해 가까워졌을 경우 형광단백질의 두 절편 또한 정상적인 3차 구조를 형성하여 형광을 나타내게 된다. Hu 등은 상기 시스템을 이용하여 황색 형광단백질을 N 말단과 C 말단으로 나눈 후 각각을 전사 인자인 Fos와 Jun 단백질 뒤에 부착시킨 후 동물 세포에서 발현되게 하여 두 전사 인자 사이에 단백질 상호작용이 이루어지고 있으며, 그 결합에 ZIP 도메인이 중요한 역할을 한다는 것을 보고하였다. 상기 시스템을 이용하여 Hu와 Kerppola (Hu & Kerppola, Nat. Biotechnol. 2003, 21:539-545)는 동물 세포에서 다양한 색의 형광 단백질을 이용한 복합적인 단백질 상호작용 분석을 하였고, Walter 등(Walter et al., Plant J. 2004, 40:428-438)과 Bracha 등(Bracha et al., Plant J. 2004, 40:419-427)은 비슷한 시기에 식물 세포에서 이분자 형광 상보 기법이 적용될 수 있음을 보고하였으며, Hoff 등(Hoff et al., Curr. Genet. 2005, 47:132-138)은 사상균(filamentous fungus)의 일종인 Acremonium chrysogenum에서도 이분자 형광 상보 기법이 적용될 수 있음을 보고하였다. 또한 최근에는 모델 생물인 효모에서도 이분자 형광 상보 기법을 이용한 단백질 상호작용 분석이 가능함을 보고(Sung & Huh, Yeast, 2007, 24:767-775)한 바 있어, 여러 개체에서 살아있는 세포 내에서 단백질 상호 작용분석과 상호 작용의 세포 내 위치를 분석할 수 있는 장점이 인정받고 있는 상황이다. 뿐만 아니라 최근의 몇몇 연구들을 통해 이분자 형광 상보 기법이 조건 특이적으로 변화하는 단백질 상호작용 분석에 적용 가능함이 보고되었기 때문에, 세포 성장 상태나 조건 특이적으로 변화하는 단백질의 수모화를 분석하기에 이분자 형광 상보 기법은 매우 적합한 방법이라고 할 수 있다.

하지만 이분자 형광 상보 기법이 갖는 많은 장점에도 불구하고 이 기법을 이용하여 번역 후 단백질 수식 과정을 분석한 연구는 아직 별로 없다. 한 예로, Fang과 Kerppola (Fang & Kerppola, PNAS 2004, 101:14782-87)가 이분자 형광 상보 기법을 이용하여 단백질의 유비퀴틴화와 수모화를 살펴본 연구가 보고되었다. 이 연구에서는 전사인자인 Jun 단백질에 형광단백질 C 말단을 부착시키고, 유비퀴틴과 수모 단백질의 N 말단에 형광단백질 N 말단을 부착시킨 후 동물 세포에서 발현되게 하여 Jun 단백질의 유비퀴틴화가 리소좀에서 일어나고 Jun 단백질의 안정성에 중요한 역할을 한다는 것을 밝혀냈다. 그러나 상기 연구는 목표 단백질의 상호작용을 실제 염색체상의 유전자가 아닌 플라스미드에 단백질을 코딩하는 유전자 서열과 형광 단백질의 절편을 코딩하는 서열을 넣어주어서 인위적으로 과량 발현되게 하는 것이기 때문에 실제 세포 내의 상황과는 다소 차이가 날 수 있으며 게다가 특정 환경 조건에서 동적으로 변화하는 상호작용의 분석에는 한계가 있다.

본 발명의 목적은 실제 세포 내에서 일어나는 특정 단백질의 수모화를 관찰함으로써 생체 내 조건에서의 단백질 수모화를 분석할 수 있는 방법 및 그에 사용되는 신규한 벡터들을 제공하는 것에 있다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 염색체상 특정유전자에 형광단백질 일부를 포함하는 이배체 세포를 제작하여 세포내 특정단백질의 수모화(sumoylation)를 실시간으로 분석하는 방법을 제공한다. 본 발명의 이분자 형광 상보 기법을 이용하여 세포내 단백질의 수모화(sumoylation)를 실시간으로 분석하는 방법은 다음과 같은 단계를 포함한다. (가) 반수체 상태의 세포내 염색체의 특정 단백질 유전자 끝에 형광단백질 N 말단 일부를 형질전환시키고, 상기 반수체 상태의 세포와 교배하는 또 다른 반수체 상태의 세포내 염색체의 수모(Small ubiquitin-related modifier SUMO) 단백질 유전자 끝에 상기 N 말단 일부를 제외한 형광단백질 C 말단 일부를 형질전환시키는 단계; (나) 상기 형질전환된 두 세포를 각각 증식하는 단계; (다) 상기 증식된 세포들을 교배시켜 형성된 이배체만을 선택하는 단계; 및 (라) 상기 형성된 이배체를 형광현미경으로 관찰하는 단계.

본 발명의 또 다른 양태는 상기 이배체 세포를 형성하는 반수체 세포를 제조하기 위한 벡터를 제공한다. 본 발명의 벡터는 특정 유전자에 형광단백질 절편을 부착할 때 유연성을 제공하는 연결 펩타이드 서열, 형광단백질 N말단 혹은 C말단 절편을 코딩하는 서열, 영양요구성 선별 유전자로서 특정 아미노산 합성에 관여하는 효소를 코딩하는 서열을 포함하는 벡터이다. 바람직하게는 도면 3에 기재된 유전자 지도를 갖는 형광단백질 N 말단 절편 부착용 플라스미드 벡터 또는 도면 4에 기재된 유전자 지도를 갖는 형광단백질 C 말단 절편 부착용 플라스미드 벡터이고, 보다 더 바람직하게는 서열번호 9의 pFA6a-HIS3MX6-pRPL7B-VN 벡터 또는 서열번호 10의 pFA6a-HIS3MX6-pRPL7B-VC 벡터이다.

상기 벡터들은 원하는 단백질의 N-말단에 VN 혹은 VC를 부착하기 위한 벡터이다. 형광단백질의 VN 혹은 VC를 원하는 단백질의 C-말단에 부착하느냐 아니면 N-말단에 부착하느냐는 실험의 목적이나 성격에 따라 결정되는데, C-말단에 부착하는 경우에는 단백질 자체의 프로모터(promoter)로 발현시킬 수 있는 장점이 있는 반면, N-말단에 부착하는 경우에는 사용하는 프로모터에 따라 단백질의 발현을 조절할 수 있다는 장점이 있다. 그런데 수모 단백질의 경우 C-말단 부분이 단백질의 기능에 중요한 역할을 하기 때문에 C-말단에 VN 혹은 VC를 부착하게 되면 정상적인 기능을 하지 못한다. 따라서 수모단백질은 반드시 N-말단에 형광단백질 일부를 부착하여야 한다. 본 발명의 pFA6a-HIS3MX6-pRPL7B-VC 벡터는 수모 단백질의 N-말단에 VC를 부착하는 동시에 발현양도 세포 내에 자연적으로 존재하는 수모 단백질의 양과 비슷하게 되게끔 RPL7B 프로모터를 사용하여 제작한 벡터이다.

본 발명은 이분자 형광 상보 기법을 이용하여 단백질의 수모화를 실시간으로 분석하기 위한 벡터와 그 분석방법을 제공한다. 본 발명의 수모화 분석방법은 자연 상태에서 일어나는 단백질의 수모화 및 세포내 위치를 실시간으로 분석할 수 있을 뿐만 아니라 형광현미경만으로도 용이하게 관찰할 수 있는 장점이 있기 때문에 세포내 단백질 상호작용 분석에 매우 유용하게 이용될 수 있다.

이하 본 발명을 보다 구체적으로 이해할 수 있도록 실시예를 들어 설명한다. 그러나 다음의 실시예로써 본 발명의 취지를 제한하는 것은 아니다.

실시예 1.　효모 BY4741 ( ATCC201388 ) 및 BY4742 ( ATCC201389 )의 형질 전환

(1) 균주

본 발명에 사용된 효모인 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae)는 BY4741(ATCC201388) (MAT a his3 leu2 met15 ura3)과 BY4742(ATCC201389) (MAT α his3 leu2 lys2 ura3)로 각각 히스티딘(histidine), 루이신(leucine), 메티오닌(methionine), 우라실(uracil)과 히스티딘, 루이신, 라이신(lysine), 우라실 영양요구 균주이며, 두 균주를 교배시켰을 경우에는 메치오닌, 라이신 영양요구 균주가 되어 메치오닌과 라이신이 결핍되어 있는 배지에서 이배수체(diploid) 균주를 선별해낼 수 있다.

(2) 형광단백질 절편 부착용 플라스미드의 제작

본 발명의 벡터는 이전 연구(등록특허10-0825290 참조)에서 얻은 형질전환 대장균을 이용하여 제작하였다. 형질전환 대장균 및 플라스미드의 제작방법은 다음 과 같다.

PCR 증폭시 이용된 반응액의 조성은 DNA 주형(pBiFC-VN173 또는 pBiFC-VC155, 미국 퍼듀대학교 Hu 교수 제공), 500 nM 프라이머, 2mM 각 dNTP, 10X Pfu PCR 완충액, Pfu DNA 중합효소이었고 전체 부피는 50 ㎕로 조정하였다. 또한 PCR 증폭 조건은 94℃에서 2분 30초(1사이클), 94℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 2분(36사이클), 그리고 72℃에서 10분(1사이클)이었다. 그 다음 PCR 생성물을 1.5% 아가로스 젤에서 100 V로 30분간 전기 영동하여 700 bp의 형광단백질 N 말단 절편 및 500 bp의 형광단백질 C 말단 절편이 증폭되었음을 확인하였다.

상기 PCR 증폭물 각각을 제한효소로 처리하기 위해 총 90 ㎕의 PCR 증폭물을 PCR purification kit(바이오니아, 대한민국)를 이용하여 정제한 후 H₂O 30 ㎕에 용리(elution)하였다. 순수한 형광단백질 N 말단 및 C 말단의 PCR 증폭물을 PacI/AscI으로 이중 절단하고, 뼈대(backbone)를 만들기 위해 녹색형광단백질 유전자 C 말단 부착용 벡터인 pFA6a-GFP-HIS3MX6 (GenBank accession no. AJ002683) 플라스미드도 형광단백질 절편 유전자와 같이 PacI/AscI으로 처리하였다. 이렇게 처리된 PCR 증폭물 및 벡터 뼈대를 T4 DNA 연결 효소를 사용하여 4℃에서 12시간 동안 연결하여 이분자 형광 상보 부착용 벡터인 pFA6a-VN173-HIS3MX6 및 pFA6a-VC155-HIS3MX6을 제조하였다.

상기 재조합 벡터를 대장균(TG1)에 형질전환시킨 후 암피실린 선택배지에서 배양한 다음, 성장한 콜로니들로부터 플라스미드 DNA를 얻었다(Plasmid kit, Bioneer).

(3) 효모 세포의 형질전환

우선 형광단백질 N 말단 절편 및 형광단백질 C 말단 절편을 증폭하기 위하여상기 형광단백질 절편 부착용 플라스미드를 이용하여 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응액의 조성은 DNA 주형 5㎕, 5 mM의 양 프라이머 5㎕, 2 mM dNTP (dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP 각각) 5㎕, 10X Pfu PCR 완충액 5㎕, Pfu DNA 중합효소 0.5㎕ 이었고, 전체 부피는 50㎕로 조정하였다. 또한 PCR 증폭의 사이클 조건은 94℃에서 2분 30초(1사이클), 94℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 2분(36사이클), 그리고 72℃에서 10분(1사이클)이었다. 그런 다음, PCR 생성물을 1.5% 아가로스 젤에서 100 V로 20분간 전기 영동하여 HIS3 유전자를 포함하는 약 2000 bp의 형광단백질 N 말단 절편 및 형광단백질 C 말단 절편이 증폭되었음을 확인하였다.

이어, BY4741 사카로마이세스 세레비제를 YPD (효모 추출가루 1%, 펩톤 2%, 포도당 2%) 30 ml에서 30℃ 배양기를 이용하여 15시간 동안 OD₆₀₀=1.0이 되도록 배양하였다. 성장한 세포를 3000 rpm에서 5분간 원심분리를 하여 회수한 다음, 0.1 M LiAc 3 ml을 첨가하고 세척한 후, 다시 3000 rpm에서 5분간 원심분리를 하여 세포를 회수한 다음 0.1 M LiAc 3 ml를 첨가하여 세척하고 다시 3000 rpm에서 5분간 원심분리를 하여 세포를 회수한 다음 0.1 M LiAc 300 ㎕에 세포를 잘 풀어준다. 이어, 100 ㎕ 50% (w/v) PEG 3350, 15 ㎕ 1 M LiAc, 20 ㎕ 4 mg/ml carrier DNA (Sigma) 및 상기 제조한 형광단백질 절편 PCR 증폭물 15 ㎕를 첨가하고 잘 혼합하였다. 그 다음 상기 혼합물을 PCR 기계를 이용하여 30℃에서 30분, 42℃에서 15분간 배양시킨다. 그 후 배양된 세포를 6000 rpm에서 30초간 원심분리를 하여 세포를 회수한 다음 H₂O 100 ㎕를 첨가하여 세포를 잘 풀어준 다음 선택 배지인 히스티딘 결핍 포도당배지(SC-H) 플레이트에 분주하여 30℃에서 3일 정도 배양한다. 선택 배지에서 자라난 콜로니는 형광단백질의 N 말단 혹은 C 말단 절편과 HIS3 선별 유전자를 포함하는 형질 전환된 세포인 것이다.

이를 한 번 더 확인하기 위해 히스티딘 결핍 포도당 배지에서 자라난 콜로니를 이쑤시개를 이용하여 따낸 다음 다시 히스티딘 결핍 포도당 배지에 긁은 후 30℃에서 15시간 배양한다. 그 다음 목표 유전자의 끝에서 500 bp 상위 서열과 형광단백질 부착용 벡터의 시작부위 서열을 프라이머로 사용하여 효모 콜로니 PCR 방법으로 목표 유전자에 제대로 형광 단백질 절편이 부착되었는지 확인한다. 효모 콜로니 PCR 방법은 다음과 같다. 일단 H₂O 20 ㎕ 에 히스티딘 결핍 포도당 배지에서 자란 세포를 팁으로 일정량을 긁어서 잘 풀어준 후 PCR 기계를 이용하여 100℃에서 15분간 끓여준 다음, PCR 반응액의 조성을 상기 끓여준 세포 5 ㎕, 상기 제작한 5 μM의 두 프라이머 2.5 ㎕, 2 mM each dNTP 1.5 ㎕, 10X Taq PCR 완충액 2.5 ㎕, Taq DNA 중합효소 0.5 ㎕이었고, 전체 부피는 25 ㎕로 조정하였다. 또한 PCR 증폭의 사이클 조건은 94℃에서 3분(1사이클), 94℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 1분(36사이클), 그리고 72℃에서 10분(1사이클)이다. 그런 다음, PCR 생성물 을 1.5% 아가로스 젤에서 100 V로 25분 전기영동하여 500 bp정도의 DNA가 증폭되었음을 확인하였다.

실시예 2 : 형광 단백질 N 말단 및 C 말단을 형질전환시킨 효모의 교배

상기 형질전환 균주들을 효모 콜로니 PCR 방법으로 확인한 후, 이분자 형광 상보 기법 분석을 위해 형광단백질의 N 말단과 C 말단이 모두 형질전환된 균주를 제작하였다. 상기 숙주 세포로 사용한 BY47418은 교배형(mating type)이 a이고 HIS3, LEU2 , MET15 및 URA3 유전자가 없는 변이체이며, 형광단백질 N 말단이 His3 마커(marker)와 함께 형질전환된 상태이고, BY4742는 교배형이 α이고 HIS3 , LEU2 , LYS2 및 URA3 유전자가 없는 변이체이며, 형광단백질 C 말단이 His3 마커와 함께 형질전환 된 상태이다. 상기 형광단백질의 N 말단과 C 말단이 부착된 두 숙주세포의 교배형이 다르기 때문에 교배가 가능하며, 특히 상기의 경우 메치오닌, 라이신 결핍 포도당 배지(SC-M-K)에서 형광단백질 N 말단과 C 말단이 모두 발현되는 이배체의 효모 균주를 제작할 수 있다. 교배 과정은 다음과 같다. 상기 방법으로 형광단백질의 절편이 형질전환된 BY4741, BY4742 균주를 YPD 액체 배지 5 ml에서 30℃ 배양기를 이용하여 15시간동안 OD₆₀₀=1.0이 되도록 하였다. 그 후 1.5 ml 튜브에 각 균주를 500 ㎕씩 넣은 후 상온에서 2시간 이상 배양시키면 교배가 이루어지고, 교배된 이배수체 균주를 선별해내기 위해 메치오닌과 라이신 결핍 포도당배지 플레이 트에 분주하여 3일 정도 배양하면 콜로니들이 형성되는 것을 확인하였다.

실시예 3. 현미경 관찰을 위한 세포 준비 방법

상기 이배수체 균주가 선별이 되면 단백질 상호작용 분석을 위해 형광현미경 관찰을 해야 한다. 형광 현미경 관찰을 위한 균주의 준비는 두 가지 방법이 있는데, 우선 메치오닌, 라이신 결핍 포도당 배지(SC-M-K) 플레이트에서 30℃에서 15시간 정도 배양된 콜로니를 팁으로 긁어내어 멸균된 H₂O 200 ㎕에 골고루 풀어준 후 일정량을 형광 현미경으로 관찰하는 방법과, SC (synthetic complete) 액체 배지 5 ml에서 30℃에서 15시간 정도 배양되어 OD₆₀₀=0.7이 되는 세포를 일정량 따서 형광 현미경을 관찰하는 방법이 있다.

실시예 4. 본 발명의 형질전환 효모를 이용한 단백질 상호작용 분석

상기의 균주 준비가 완료되면 흑백 CCD카메라가 장착된 칼 자이스(Carl Zeiss) Axiovert 200M 형광 도립 현미경으로 관찰한다. 단백질 상호작용에 의해 황색 형광단백질 N 말단 및 C 말단 절편이 상보적으로 결합하여 발하는 형광을 감지하기 위해 일반적인 녹색 형광단백질 감지에 사용되는 칼 자이스 B10 시프트프리 Blue 광역대 BP 필터를 사용하여 450~490 nm 파장의 빛을 노출시켜준 후 515~565 nm 파장의 빛을 감지하였고, 노출 시간은 2000 ms으로 관찰하였다.

실시예 5. 본 발명의 형질전환 효모를 이용한 수모화 단백질 분석

(1) 형광단백질 C 말단의 부착

수모 단백질이 수모로서의 기능을 하기 위해서는 수모 유전자에서 수모 전구체 단백질이 합성된 후 수모 특이적 프로티에이즈(Ulp1)에 의해 수모 단백질의 C 말단의 특정부위(-GGATY)가 잘려 -GG부분이 노출이 되어야만 한다. 따라서 이분자 형광 상보 기법을 위한 C 말단 부착은 세포 내에서 제대로 작용을 못하기 때문에, 수모화 단백질 연구를 위해서는 단백질의 N말단에 형광단백질의 단편을 부착해야만 한다. 이를 위해 본 연구에서는 이전 연구(실시예 1의 (2) 참조)를 통해 제작된 형광단백질 C 말단 절편 부착용 벡터를 DNA 주형으로 실시예 1번의 방법으로 SMT3-F4(서열번호 1)와 SMT3-R5-VC(서열번호 2)를 프라이머로 사용하여 BY4742 세포의 SMT3 유전자의 N 말단 부분에 형광단백질 C 말단을 부착시킨 균주를 만들었다.

(2) Rps3의 수모화 분석

Rps3는 40S 리보솜의 구성 단백질로서 최근 연구를 통해 수모화 된다고 알려져 있다(Zhou et al., J. Biol. Chem. 2004, 279:32262-32268; Panse et al., J. Biol. Chem. 2004, 279:41346-41351; Denison et al., Mol. Cell. Proteomics 2005, 4:246-254). Rps3 단백질의 수모화와 세포내 작용 위치를 분석하기 위해 이분자 형광 상보 기법을 사용하였다. 이전 연구(실시예 1의 (2) 참조)를 통해 제작 된 형광단백질 N 말단 절편 부착용 벡터를 DNA 주형으로 실시예 1번의 방법으로 RPS3-F2(서열번호 3)와 RPS3-R1(서열번호 4)를 프라이머로 사용하여 BY4741 세포의 RPS3 유전자의 끝부분에 형광단백질 N 말단을 부착시킨 균주를 만든 후, 상기 과정으로 제작한 수모 단백질 N 말단에 형광단백질 C 말단이 부착된 균주를 교배한 이배수체 효모 균주를 제작하여 형광 현미경을 관찰하였다.

도 2의 (가)는 이분자 형광 상보 기법용 균주(Rps3-VN X VC-Smt3)를 실시예 3번과 같은 방법으로 칼 자이스 B10 시프트프리 Blue 광역대 BP 필터를 사용하여 450~490 nm 파장의 빛을 노출시켜준 후 515~565 nm 파장의 빛을 감지하였고, 노출 시간은 2000 ms으로 관찰한 결과이다. Rps3 단백질의 수모화되는 세포 내 위치는 세포 전반에 걸쳐 고루 존재하는 것을 확인할 수 있다.

(3) Hmo1의 수모화 분석

Hmo1은 게놈 유지에 관여하는 high mobility group (HMG) family member로 RNA 중합효소 I 의 전사 구성요소로 라이보솜 DNA에 붙어 있다고 알려져 있으며, 최근 연구를 통해 수모화된다고 알려져 있다(Zhou et al., J. Biol. Chem. 2004, 279:32262-32268; Denison et al., Mol. Cell. Proteomics 2005, 4:246-254). Hmo1 단백질의 수모화와 세포 내 작용 위치를 분석하기 위해 이분자 형광 상보 기법을 사용하였다. 이전 연구(실시예 1의 (2) 참조)를 통해 제작된 형광단백질 N 말단 절편 부착용 벡터를 DNA 주형으로 실시예 1번의 방법으로 HMO1-F2(서열번호 5)와 HMO1-R1(서열번호 6)을 프라이머로 사용하여 BY4741 세포의 HMO1 유전자의 끝부분에 형광단백질 N 말단을 부착시킨 균주를 만든 후, 상기 과정으로 제작한 수모 단 백질 N 말단에 형광단백질 C 말단이 부착된 균주를 교배한 이배수체 효모 균주를 제작하여 형광 현미경을 관찰하였다.

도 2의 (나)는 이분자 형광 상보 기법용 균주(Hmo1-VN X VC-Smt3)를 실시예 3번과 같은 방법으로 칼 자이스 B10 시프트프리 Blue 광역대 BP 필터를 사용하여 450~490 nm 파장의 빛을 노출시켜준 후 515~565 nm 파장의 빛을 감지하였고, 노출 시간은 2000 ms으로 관찰한 결과이다. Hmo1 단백질의 수모화되는 세포 내 위치는 핵 내의 인에 고루 존재하는 것을 확인 할 수 있다.

(4) Cet1의 수모화 분석

Cet1은 필수 RNA 5'-triphosphatase로 최근 연구를 통해 수모화된다고 알려져 있다(Wohlschlegel et al., J. Biol. Chem. 2004, 279:45662-45668; Panse et al., J. Biol. Chem. 2004, 279:41346-41351). Cet1 단백질의 수모화와 세포내 작용 위치를 분석하기 위해 이분자 형광 상보 기법을 사용하였다. 이전 연구(실시예 1의 (2) 참조)를 통해 제작된 형광단백질 N 말단 절편 부착용 벡터를 DNA 주형으로 실시예 1번의 방법으로 CET1-F4(서열번호 7)와 CET1-R5-VC(서열번호 8)를 프라이머로 사용하여 BY4741 세포의 CET1 유전자의 N 말단에 형광단백질 N 말단을 부착시킨 균주를 만든 후, 상기 과정으로 제작한 수모 단백질 N 말단에 형광단백질 C 말단이 부착된 균주를 교배한 이배수체 효모 균주를 제작하여 형광 현미경을 관찰하였다.

도 2의 (다)는 이분자 형광 상보 기법용 균주(VN-Cet1 X VC-Smt3)를 실시예 3번과 같은 방법으로 칼 자이스 B10 시프트프리 Blue 광역대 BP 필터를 사용하여 450~490 nm 파장의 빛을 노출시켜준 후 515~565 nm 파장의 빛을 감지하였고, 노출 시간은 2000 ms으로 관찰한 결과이다. Cet1 단백질의 수모화되는 세포 내 위치는 핵에 고루 존재하는 것을 확인할 수 있다.

상기 결과들은 본 발명의 이분자 형광 상보 기법을 이용한 단백질의 수모화 분석이 실제로 적용가능함을 보여준다. 기존에 수모화 된다고 보고된 Rps3, Hmo1, Cet1 단백질들에 형광단백질 N 말단을 붙인 균주와 Smt3에 형광단백질 C 말단이 부착된 균주를 교배한 이배수체 효모 균주를 제작하여 형광 현미경을 관찰해보았을 때, 형광이 발하는 것을 확인할 수 있었고 또한 수모화가 일어나는 세포 내 위치도 볼 수 있었다. 음성 대조군의 경우 형광을 거의 발하지 않는 것으로 보아 이분자 형광 상보 기법을 이용한 단백질 수모화 분석이 우연히 형광단백질 단편이 세포 내에서 결합하여 생기는 현상이 아닌 실제 단백질의 수모화임을 정확히 볼 수 있다.

도 1은 이분자 형광 상보 기법의 모식도이다.

도 2는 이분자 형광 상보 기법을 이용하여 단백질의 수모화와 그 위치를 실시간으로 분석한 결과이다.

도 3은 본 발명의 pFA6a-HIS3MX6-pRPL7B-VN 벡터의 유전자 지도를 나타낸다.

도 4는 본 발명의 pFA6a-HIS3MX6-pRPL7B-VC 벡터의 유전자 지도를 나타낸다.

도 5는 형질전환 세포를 만들기 위해 플라스미드 벡터에서 PCR로 증폭될 부분의 모식도이다.

<110> Seoul National University Industry Foundation <120> A method for analyzing sumoylation of protein and cloning vectors used in the method <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gtagcatata ggacagaagg acccagttca gttctagttt gaattcgagc tcgtttaaac 60 60 <210> 2 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 cctctggctt agcttcttga ttgacttctg agtccgacat accaccagaa cccttgtaca 60 gctcgtccat g 71 <210> 3 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 agctgaagaa actgaagctc aagctgaacc agttgaagct ggtcgacgga tccccgggtt 60 60 <210> 4 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tattgtactt atagtttatt tatgtattta ataattaaat tcgatgaatt cgagctcgtt 60 60 <210> 5 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gaagaaggat aagaagaagg acaaatccaa ctcttctatt ggtcgacgga tccccgggtt 60 60 <210> 6 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc 1140 ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc gcggtatcat 1200 tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag 1260 tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct cactgattaa 1320 gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt taaaacttca 1380 tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc 1440 ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc 1500 ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc 1560 agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt 1620 cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt 1680 caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc 1740 tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa 1800 ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac 1860 ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gcattgagaa agcgccacgc ttcccgaagg 1920 gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga 1980 gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact 2040 tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa 2100 cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc 2160 gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg ataccgctcg 2220 ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag agcgcccaat 2280 acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcaggttaa cctggcttat 2340 cgaaattaat acgactcact atagggagac cggcagatcc gcggccgcat aggccactag 2400 tggatctgat atcatcgatg aattcgagct cgtttaaact ggatggcggc gttagtatcg 2460 aatcgacagc agtatagcga ccagcattca catacgattg acgcatgata ttactttctg 2520 cgcacttaac ttcgcatctg ggcagatgat gtcgaggcga aaaaaaatat aaatcacgct 2580 aacatttgat taaaatagaa caactacaat ataaaaaaac tatacaaatg acaagttctt 2640 gaaaacaaga atctttttat tgtcagtact ctttacaaca ctcccttcgt gcttgggact 2700 tcagaacttc cagtaagact agtagccgcg cgcatggcaa cagccagaga tttaaaagcg 2760 ctttcagcac gatgatggtc attactacca tataagcagg taacatgcaa agtaattcca 2820 gctgctaccg aaaaggaata tagtaagtga gggatcattt cacaggacaa ttccccaacc 2880 ttttcacgct ttaatcccaa atcgataaca gcatagggcc gtcccgacaa gtcaactacg 2940 cttctagaaa gagcttcgtc aagtggacaa taagcatgtc caaatctttt aacgccggca 3000 aagttaccca tagcctgctt gaatgcaata ccaagtgcaa tagcagtatc ttctgcagtg 3060 tgatgatcat cgatgattaa atcacctctt gagtaaagtc gtaagctcca gcctgcatgt 3120 ttagccagtg catgatacat gtgatccaag aatccaattc ccgtgtctac ttggattact 3180 tgttctccct tttggtttgc atgcttggaa gttataagtt catcaataaa attcgactct 3240 tcaggtaagg gagctttgtc caaagcgatg gcaacgctga ttttcgtttc gttcgtattt 3300 ctttctacaa aagccctcct acccatggtt gtttatgttc ggatgtgatg tgagaactgt 3360 atcctagcaa gattttaaaa ggaagtatat gaaagaagaa cctcagtggc aaatcctaac 3420 cttttatatt tctctacagg ggcgcggcgt ggggacaatt caacgcgtct gtgaggggag 3480 cgtttccctg ctcgcaggtc tgcagcgagg agccgtaatt tttgcttcgc gccgtgcggc 3540 catcaaaatg tatggatgca aatgattata catggggatg tatgggctaa atgtacgggc 3600 gacagtcaca tcatgcccct gagctgcgca cgtcaagact gtcaaggagg gtattctggg 3660 cctccatgtc gctggccggg tgacccggcg gggacgaggc aagctaaaca gatctgttgt 3720 gccttacttt tctcgcttag ttcatgagct agcttcttgt caccttgttg ataagcggtt 3780 tgcgattcat ggctgagttg gtctcttttc ttatacgctt catctgctaa tcttctcaat 3840 ctttgatact cttcatcagt gctatgattg tagtccctta caggattctg agttccgact 3900 actactccac ctgttccttt catagtttta agtgcggcgc tttagcttca aactgactca 3960 tggttgcgta aaaacatggt tgctttttgt cgttttcctc gaaaggcttt accttttcat 4020 taagccgctc cattttaaaa tgttttaata aatccacttt tttccggcgc ataatggatc 4080 cagaaaggaa ctggcaacta aatccgtaca tttctgaaat tatttcagtt cgcagattat 4140 tttctcagtt ttaccgtata ttcttatgta ttacagttga ggtacccaca cgcgcacttg 4200 aaaagtatat aaaagtgaaa tatttcagag ctcttcctat tgctttttca atagaggctt 4260 aaatcttcct cgtttgtaga gtaagtagac ccatattaca aatctccatc aacgtcataa 4320 tgtccttaat taaccgtccg gcgtgcaaaa tcccgaacga cctgaaacag aaagtcatga 4380 accacgacaa gcagaagaac ggcatcaagc tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg 4440 acggcggcgt gcagctcgcc gaccactacc 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Claims (3)

1. 서열번호 9를 갖는 pFA6a-HIS3MX6-pRPL7B-VN 벡터.
2. 서열번호 10을 갖는 pFA6a-HIS3MX6-pRPL7B-VC 벡터.
3. 다음과 같은 단계를 포함하는 이분자 형광 상보 기법을 이용하여 세포내 단백질의 수모화(sumoylation)를 실시간으로 분석하는 방법:

   (가) 반수체 상태의 세포내 염색체의 특정 단백질 유전자 끝에 형광단백질 N 말단 일부를 형질전환시키고, 상기 반수체 상태의 세포와 교배하는 또 다른 반수체 상태의 세포내 염색체의 수모(Small ubiquitin-related modifier SUMO) 단백질 유전자 끝에 상기 N 말단 일부를 제외한 형광단백질 C 말단 일부를 형질전환시키는 단계;

   (나) 상기 형질전환된 두 세포를 각각 증식하는 단계;

   (다) 상기 증식된 세포들을 교배시켜 형성된 이배체만을 선택하는 단계; 및

   (라) 상기 형성된 이배체를 형광현미경으로 관찰하는 단계를 포함하며,

   상기 반수체는 서열번호 9의 pFA6a-HIS3MX6-pRPL7B-VN 벡터 또는 서열번호 10의 pFA6a-HIS3MX6-pRPL7B-VC 벡터를 이용하여 제조하는 것을 특징으로 하는 방법.

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