CN109402151A

CN109402151A - 大麦基因HvHVP10及其在提高植物耐盐性方面的应用

Info

Publication number: CN109402151A
Application number: CN201811324092.3A
Authority: CN
Inventors: 傅良波; 吴德志; 沈秋芳; 张国平
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2018-11-08
Filing date: 2018-11-08
Publication date: 2019-03-01

Abstract

本发明属于生物基因工程技术领域，特别涉及一种大麦基因HvHVP10及其在提高植物耐盐性方面的应用。一种大麦HvHVP10基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，其转录本cDNA全长核苷酸序列如SEQ ID No:2所示。本发明所涉及的大麦HvHVP10基因，来源于栽培大麦Golden Promise。本发明首次通过转基因手段，证实了盐胁迫下，在水稻中异源表达大麦HvHVP10基因后，转基因水稻的耐盐性得到了显著的改良，有效减缓了盐胁迫带来的不利影响，从而维持水稻的正常生长。

Description

大麦基因HvHVP10及其在提高植物耐盐性方面的应用

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，特别涉及一种大麦基因HvHVP10及其在提高植物耐盐性方面的应用。

背景技术

土壤盐害严重抑制作物的生长并导致减产甚至绝产，是全球农业生产上面临的最主要的一种非生物胁迫(Munns and Tester.Mechanisms of Salinity Tolerance.AnnuRev Plant Biol,2008,59:651-681)。目前，世界盐土面积大且分布广泛，超过9亿公顷的土地已被盐碱化，其中包括20％的耕地和近50％的灌溉地。相比于其他国家和地区，我国位于东亚太平洋沿岸，有1亿多公顷的盐碱土，高于世界平均比例(Zhang JF,Jiang JM,ShanQH,Chen GC,Wang Y,Shen LM,Pan CX,Wu H,Abarquez A.Soil salinization andecological remediation by planting trees in China.Inter Conf Mech AutoControl Engi,2010,1349–1352)。同时，工业污染物的过度排放、不合理的耕作制度、灌溉模式和生产方式等持续加剧了盐碱地的形成。土壤盐害对农业生产和粮食安全的威胁日趋严重。因此，培育耐盐新品种是当前作物科学研究的重要任务。

农作物物种之间的耐盐性存在显著的差异。大麦不仅具有谷类作物中最强的耐盐性，而且存在丰富的野生资源(如青藏高原野生大麦)。前期的研究已探明青藏高原野生大麦拥有丰富的遗传多态性和耐盐性遗传变异(Wu DZ,Qiu L,Xu LL,Ye LZ.GeneticVariation of HvCBF Genes and Their Association with Salinity Tolerance inTibetan Annual Wild Barley.Plos One,2011,6(7):e22938),这些野生和栽培大麦蕴含丰富的耐盐基因库，无疑为水稻耐盐性遗传改良提供了宝贵的基因资源。另一方面，利用大麦的基因改良水稻的耐盐性已有成功的先例。美国康奈尔大学吴瑞教授领导的课题组将从大麦糊粉层分离到的一个LEA(late embryogenesis abundant)蛋白家族成员基因HVA1导入粳稻品种日本晴中，发现大麦HVA1基因的导入增强了转基因水稻株系的耐盐性(Xu DP,Duan XL,Wang BY,Hong BM,Ho THD,Wu R.Expression of a late embryogenesisabundant protein gene,HVA1,from barley confers tolerance to water deficit andsalt stress in transgenic rice.Plant Physiol,1996,110(1):249-257)。这一研究结果充分证明，利用大麦特异的耐盐基因改良水稻的耐盐性是可行的。

在植物细胞中，质子泵是一类依赖于ATP水解释放的能量驱动逆浓度梯度转运氢离子通过膜的膜整合糖蛋白。该蛋白通过造成膜两侧的pH梯度和电位梯度，调控植物的生长发育。液泡膜上的H⁺-PPase是植物抵抗盐胁迫的一类十分重要的质子泵，通过将Na⁺转运到液泡内使离子区隔化，从而使植物细胞能够适应盐胁迫环境。HvHVP10基因编码大麦液泡氢离子焦磷酸酶。在盐胁迫条件下，该酶通过水解焦磷酸为主动运输Na⁺至液泡提供驱动力。通过把Na⁺区隔在大麦液泡中，不仅能够减少大麦根部Na⁺的毒害，并能有效减少根部Na⁺往地上部运输，从而显著降低地上部Na⁺浓度。

迄今，在水稻中，尚未报道HvHVP10基因的同源序列以及该基因在水稻中异源表达后能否提高水稻的耐盐性，大麦基因HvHVP10转入到其它植物(如小麦，玉米等)后异源表达能否提高耐盐性也没有相关的研究。因此，从大麦中发掘优异的耐盐相关基因，如HvHVP10，对改良和提高作物的耐盐性具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种异源表达的大麦基因HvHVP10，该基因能显著提高植物的耐盐能力。

本发明提供所述大麦基因HvHVP10在提高植物耐盐性方面的应用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种大麦HvHVP10基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，其转录本cDNA全长核苷酸序列如SEQ ID No:2所示。本发明所涉及的大麦HvHVP10基因，来源于栽培大麦Golden Promise。

一种由所述的大麦HvHVP10基因编码的大麦氢离子焦磷酸酶，该酶的氨基酸序列如SEQ ID No:3所示。

一种pCAMBIA1300载体，该载体的核苷酸序列如SEQ ID No:4所示。

一种含有大麦HvHVP10基因的重组载体，pCAMBIA1300:HvHVP10异源重组载体，该重组载体是由SEQ ID No:2所示的编码基因HvHVP10的cDNA全长序列中编码区域的2289bp基因片段连入pCAMBIA1300载体BamHI和KpnI位点间构建得到。

一种大麦HvHVP10基因在提高植物耐盐性方面的应用。本发明通过分离、克隆大麦HvHVP10基因编码序列，构建其异源重组载体，然后转化受体植物，作为优选，所述受体植物为水稻Nipponbare，并对转基因水稻进行耐盐性评价。耐盐性评价实验证实：盐胁迫下，相比于非转基因水稻，转HvHVP10基因水稻的耐盐性得到了显著改良。

一种大麦HvHVP10基因在制备提高植物耐盐性相关制剂方面的应用。

本发明的有益效果是：

1.本发明首次通过转基因手段，证实了盐胁迫下，在水稻中异源表达大麦HvHVP10基因后，转基因水稻的耐盐性得到了显著的改良，有效减缓了盐胁迫带来的不利影响，从而维持水稻的正常生长。

2.大麦和水稻同属于禾本科作物，HvHVP10来自于大麦基因组，且水稻基因组中无该基因的同源序列。在水稻中异源表达该基因，在改良水稻耐盐性的同时，环境友好，风险较低，区别于植物异源表达来自于细菌、昆虫或动物的基因。

3.本发明指出大麦HvHVP10基因在水稻中异源表达的作用，如能得到充分发掘和有效利用，亦可在其它作物中异源表达，从而提高其他作物的耐盐性。

附图说明

图1是HvHVP10基因结构图，黑色数字表示碱基位点，灰框表示外显子，内部白色数字代表外显子编号，黑线表示非编码区域；

图2是载体构建示意图，其中：35S启动子驱动抗性基因潮霉素(Hygromycin)，玉米Ubi启动子(ZmUbi)驱动HvHVP10基因，BamHI和KpnI是双酶切位点，NOS表示终止子，RB表示右边界，LB表示左边界；

图3是HvHVP10异源表达转基因株系和对照株系水培实验结果。(a)是盐处理条件下(75mM氯化钠处理10天)，对照和转基因材料的表型差异图；(b)是对照条件下(无氯化钠培养10天)，对照和转基因材料的表型图。WT：野生型Nipponbare，TS：转基因水稻植株；

图4是转基因株系和对照株系水培盐处理10天后地上部和根部钠元素浓度结果。(a)是地上部钠元素浓度，(b)是根部钠元素浓度。WT：野生型Nipponbare，HE：转基因水稻植株，单位：mg/g。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。

在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

全式金HiFi高保真酶，购自北京全式金生物技术(TransGen Biotech)有限公司；

T载体，购自北京全式金生物技术(TransGen Biotech)有限公司；

农杆菌EHA105，购自江苏百格基因科技有限公司。

实施例1大麦HvHVP10基因克隆

1、植物材料的处理

大麦Golden Promise种子用2％(v/v)H₂O₂消毒20min后，用蒸馏水冲洗5次后，种子腹面朝上在发芽盒中发芽。于培养室(14小时22℃/10小时18℃)暗培养3天，至地上部露白2cm后补光(14小时光照/10小时黑暗)。取7日苗龄的大麦幼苗，液氮速冻后保存于-70℃，用于DNA和总RNA提取。

2、大麦基因组DNA的提取

采用CTAB法提取大麦基因组DNA。

3、大麦总RNA的提取

采用Trizol法提取大麦总RNA。并用DNase I酶(Takara，日本)去除基因组DNA。

4、cDNA的合成

使用Takara公司的RT reagent Kit Perfect Real Time(DRR037A)试剂盒将上述3中提取的总RNA反转录成单链cDNA。

5、HvHVP10基因的克隆

以上述步骤4中的cDNA为模板，根据目的基因的ORF框设计引物，选用全式金HiFi高保真酶分别进行PCR扩增：

PCR体系(25μL)：

PCR程序：

获得特异性的目的条带，切胶回收后将片段连入T载体(全式金)，转化大肠杆菌DH5α，PCR验证得到阳性克隆，然后送公司进行测序。引物合成和测序均由上海生工生物工程股份有限公司完成。

所涉及的引物和序列信息见图1，其中：

以cDNA为模板，cDNA-F/R为引物扩增全长cDNA序列(包含ATG到TAG)2581bp，为SEQID No:1所示，引物信息为：

cDNA-F:5’-AGGGTTTCGTCGGCCTG-3’(SEQ ID No:5)，

cDNA-R:5’-TTTGCCAGGCACATACCAAC-3’(SEQ ID No:6)；

通过BioXM 2.6将HvHVP10基因的CDS核苷酸序列翻译成氨基酸序列762aa，为SEQID No:2所示。

实施例2转基因方法验证大麦HvHVP10基因在水稻中的功能

1、异源表达载体pCAMBIA1300:HvHVP10的构建

采用双酶切的方法，首先以上述实施例1中的含cDNA的阳性T载体为模板，设计TS-HvHVP10-F/R引物扩增长度为覆盖HvHVP10编码区域的2289bp片段，引物信息为：

TS-HvHVP10-F:5’-caggtcgactctagaggatccATGGCGATCCTCGGGGAG-3’(SEQ ID No:7)，

TS-HvHVP10-R:5’-gagctccgcggcccgggtaccCTAGATGTACTTGAACAGCAGACCTCC-3’(SEQ ID No:8)。

经PCR扩增，使用BamHI和KpnI酶双酶切PCR产物和载体pCAMBIA1300，37℃反应90分钟，使PCR产物和载体产生黏性末端。

酶切体系(50μL)：

将酶切产物用T4DNA连接酶进行连接，22℃反应2小时，形成含目的基因的异源表达载体，经转化大肠杆菌DH5α，测序无误后提取质粒得到pCAMBIA1300:HvHVP10异源表达载体(见图2)。

2、转基因水稻植株的获得

采用热激法将上述步骤1中构建好的异源表达表达载体，导入农杆菌EHA105中。将含异源表达载体的农杆菌转化水稻Nipponbare愈伤组织，经羧苄青霉素筛选后，获得数十株转基因候选植株。再依次提取转基因候选植株和水稻Nipponbare野生型的DNA，通过PCR的验证方法获得转基因阳性植株，其中验证引物为pCAMBIA1300-F/TSHVP10-R，扩增片段长度678bp，引物信息为：

pCAMBIA1300-F：5’-CATGTTGATGTGGGTTTTACTGA-3’(SEQ ID No:9)，

TSHVP10-R：5’-GCAGTGTATAGGGCTGGCTT-3’(SEQ ID No:10)。

繁种后，收获足够用于实验的转基因水稻种子。

3、转基因水稻植株耐盐性的评价

选取转基因材料3份、水稻Nipponbare野生型1份为材料。以上述材料发芽30天后的幼苗为实验材料，每个基因型移入相同数量的幼苗至15升培养盒，分别设置含NaCl浓度为0和75mM的营养液培养盒各2盆，作为正常条件和盐处理条件，每隔3天换一次NaCl浓度相同的营养液。培养室条件为：光照强度为250μm m^-2s^-1，日夜温度为26/20℃，日夜时长14/10h。经10天盐处理以后，用去离子水清洗三遍，将实验材料表面的盐分去除，控干多余水分后，拍照记录表型。将地上部和根部用剪刀分离，置于洁净的样品袋中，80℃烘2天，然后利用ICP-OES技术测定地上部和根部钠元素浓度。

实验结果表明，在没有盐处理的条件下，所有植株均生长正常，3份转基因水稻和野生型均没有表现出明显差异(见图3a)。而在75mM盐处理10天以后，转基因植株和野生型植株出现明显的表型差异(见图3b)，3份转基因水稻的生长表型显著优于野生型植株，无论是地上部还是根部，转基因水稻均比野生型水稻更健壮，分蘖更多。通过进一步分析地上部和根部的钠元素浓度，发现转基因水稻的地上部钠元素浓度显著低于野生型水稻(见图4a)，而在根部，转基因水稻和野生型水稻没有显著性差异(见图4b)。综合表型和钠元素浓度的差异，转基因水稻的耐盐性显著优于野生型植株。

水培实验证明，将大麦HvHVP10基因转入水稻中，能显著提高水稻的耐盐性。

综上，大麦基因HvHVP10能显著提高其它植物的耐盐能力。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 大麦基因HvHVP10及其在提高植物耐盐性方面的应用

<130> ZJDX-FLB001

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4369

<212> DNA

<213> 大麦HvHVP10(Hordeum vulgare)

<400> 1

atggcgatcc tcggggagct cgggacggag atcctcatcc ccgtctgcgg ggtcatcggc 60

atcgtcttcg ccgtcgcgca gtggttcatc gtctccaagg tcaaggtcac ccccggcgcc 120

gcctccgccg ccgccggcgc caagaacggc tacggcgact acctcatcga ggaggaggag 180

ggcctcaacg accacaacgt cgtcgtcaag tgcgccgaga tccagaccgc catctctgaa 240

ggtgagctca cccgtcccct ccgccgacaa cggtggtggt cccccctctc cctctcaccc 300

gctccctccc acagatctgg ggccgccgtt gctcggcgcg cgcagatccg gccgtttcgc 360

ggccgtttcg ccggaggaac cgcccgcggt tcgagcgcgg ataatgtttg aaactgccgg 420

ctagtatgtt atttagaaag tagattctgc ttccaggggc caatggccac ggattgtggc 480

cgtccgttgg ctcgttccgt cgatttccag cgctgatctg agcggggagc tttcgaattt 540

cagctccaag actctttttt tccgcgcttt atggaaggat aaaaccatga gaaagctgga 600

ccgtatagcg gtgccaaaag ctgttccttg cttcctttta cgcaaaagga ggccgaatcc 660

gggcgccgga gcttttgatt cgcccgtggg tgctgcagaa cagtgtcgtt ttctccgaac 720

catgctgcgt tcctacgata tgatatttgt cactcctggc ttagttccaa atctgcacgg 780

tttcaaagtg ggctcatctt gacgcttttc tttgctaggc cagatttttg tttatgcggc 840

tccatgtggg ggctaggcca gcaaatcacc atctccccct tttttaaatc tgaattgaaa 900

ttgtcatcag atgctcgtgt ttggtgccaa attaaggctt caataaacac ttcttttaat 960

gccccgagcg gtgcccgtgc tctgcgtcgg tgctgtagtg aagacgtggc tttcagtggg 1020

caactgcaca tctctaccgt cgctgtcttt tttaattatg atgatagctt ggtattggaa 1080

ggtgcgtgat ggatctgcca gacgcagcaa gctcgacacg ttgtgagttg ccttgacttg 1140

agctcactcc actgccctgg gtcggcagat ccagacctga aacgtcaggc tcatggataa 1200

ggatctcgcc catctgtcac tgacgtgtca gtttgtccct agcctcgtga gattgccatc 1260

tccatctgcc taaccctcag ctgatgcgta tcctgtttct tgtgatttgt tgattggtgt 1320

caccaatgtt gacctgaggc gtttcttctt tgattgggat gggtaaactg gaagatctac 1380

tcttggaatt gtttgctagg gtaggattgt ctacgtggct tgccgctctt cccgctcttc 1440

cctagatgta aaacggcagt tgtggtagat atttgtttgg caatgtgtca gtctctaggt 1500

agatgctatt tcatctccta ctaatttcag gaagatacaa ttgaactgag attatgtagt 1560

ctgaaaagcg gactatatat ttaatatatt accattgagt ttgatcatat gatttatgtg 1620

taacaatcaa cttttattgt gaacaggggc aacatcattc cttttcacca tgtaccagta 1680

cgttggtatg ttcatggttg tctttgctgc gattatcttc ctcttccttg gatcgatcga 1740

gggattcagc acaaagggcc agccctgcac ctacagcaag ggcacctgca agccagccct 1800

atacactgct ctctttagca ctgcatcttt cttgcttgga gccatcacat ctctggtgtc 1860

tggtttcctt ggaatgaaga tcgccacata tgccaatgcc aggacgaccc ttgaagcaag 1920

gaagggtgtt gggaaggcat ttatcaccgc tttccgctct ggtgcagtca tgggcttctt 1980

gttgtcatca agtggtcttg tggttcttta catcaccatc aacgtgttta aaatgtacta 2040

cggtgatgac tgggaaggtc ttttcgagtc catcactggt tatggtcttg gtgggtcttc 2100

catggctcta ttcggaagag ttggtggagg tatctacact aaggctgctg acgtgggtgc 2160

tgaccttgtt ggcaaagttg agaggaacat tcctgaagat gacccaagga acccagctgt 2220

aagttttctt ctcacttctc agcttttggc taatagtttt aggcaaatta gcagacattg 2280

cttacaattt atattttgac tattatgctt catggcatat cctttgctga acttggaact 2340

cttgtttgca ggtgattgct gacaacgtcg gtgacaacgt tggtgatatt gctggaatgg 2400

gatcagatct ctttggttca tacgcagaat cttcctgcgc tgctcttgtt gttgcttcca 2460

tctcatcttt tggaatcaac catgatttca ctgcgatgtg ctacccactg ctcgtgagct 2520

ctgtaggcat cattgtttgc ttgctcacca cactctttgc aactgatttc tttgagatta 2580

aggctgcaaa cgaaattgaa cctgctctga agaagcagct catcatctcc actgctctaa 2640

tgactgttgg tgttgcggtc atcagctggt tggctcttcc agctaagttc accatcttca 2700

acttcggtgc tcagaaggaa gtgtccaact ggtaaatttt tgggtcaata tttgttcaac 2760

tctgcaattt tggtacttcc ttctgattat gctttcttga tttttcacag gggcctgttc 2820

ttctgcgtgg cagttggtct gtgggctggt ctgattattg gatttgtgac tgaatactac 2880

actagcaacg cctacaggta actaaaacat tagtttctag ttatattgtt gttcatattt 2940

tatgttattg tgccttatcc cccagctgtt tccttgtggc agccctgtgc aagatgttgc 3000

cgattcctgc agaactggtg ctgccaccaa cgtcatcttc ggtcttgctc tggggtacaa 3060

gtctgttatc atcccaattt tcgctattgc tgtcagcatc tacgtcagct tctccattgc 3120

tgcaatgtac ggcattgcaa tggctgctct tggcatgcta agcacaatgg caactggtct 3180

tgccatcgat gcttatggtc ccattagtga caatgctggt ggaattgctg agatggctgg 3240

catgagccac agaatccgtg agaggactga tgctcttgat gctgctggca acacaaccgc 3300

tgctattggg aaggtaaatt ttcctgctgt acatttgttg ggcaactcct ttacttgacc 3360

actgttgatt tttgccacat ccagaagtta aaaatatttg ataagtacgt gagctatttg 3420

gttagtaggg aattaggcag tgggtgatgg gtttgtagtg aaagccactt tattggttat 3480

gtaactccct ccttgcatat aatgttgtag ggtttcgcca ttggatcagc tgctctcgtg 3540

tccctggcac ttttcggtgc ctttgtcagc agagctggtg tgaaggtcgt tgatgtccta 3600

tctcccaagg tgttcattgg tctgattgtc ggagccatgc ttccgtactg gttctctgcc 3660

atgaccatga agagtgttgg aagtgctgcc ctcaagatgg ttgaggaggt ccgcaggcag 3720

ttcaacacca ttcctggact gatggaggga actgccaagc ctgactatgc cacctgtgtc 3780

aagatctcca ctgatgcttc catcaaggag atgatccctc cgggtgcttt ggtcatgctc 3840

acccccctca ttgttggaac cctctttggc gtggaaaccc tgtctggtgt tctggctggt 3900

gccctcgttt ctggagtgca ggtatcgtac ttctttcttc ctttgagttg ctctgaatct 3960

gttaattcca ggaatttacc aaattccttt cttacagatc gccatctctg cttccaacac 4020

cggtggtgca tgggacaacg caaagaagta catcgaggta aatgcgctca gaagtctgga 4080

ttgtgttttt atgactgttt gtttatttat tattgatcat atctcttaac tttgtcattg 4140

aattctttgc tgcttgtttc aggccggcaa cagcgagcat gcgaggtccc ttggtcccaa 4200

gggttcagac tgccacaagg ccgccgtgat cggtgacacc atcggagacc ccctcaagga 4260

cacctcaggc ccgtcgctca acatcctcat caagctcatg gccgttgagt ccctcgtgtt 4320

cgcgcccttc ttcgccacgt acggaggtct gctgttcaag tacatctag 4369

<210> 2

<211> 2289

<212> DNA

<213> 大麦HvHVP10 转录本cDNA(Hordeum vulgare)

<400> 2

atggcgatcc tcggggagct cgggacggag atcctcatcc ccgtctgcgg ggtcatcggc 60

atcgtcttcg ccgtcgcgca gtggttcatc gtctccaagg tcaaggtcac cccaggcgcc 120

gcctccgccg ccgccggcgc caagaacggc tacggcgact acctcatcga ggaggaggag 180

ggcctcaacg accacaacgt cgtcgtcaag tgcgccgaga tccagaccgc catctctgaa 240

ggggcaacat catttctttt caccatgtac cagtacgttg gtatgttcat ggttgtcttt 300

gctgcgatta tcttcctctt ccttggatcg atcgagggat tcagcacaaa gggccagccc 360

tgcacctaca gcaagggcac ctgcaagcca gccctataca ctgctctctt tagcactgca 420

tctttcttgc ttggagccat cacatctctg gtgtctggtt tccttggaat gaagatcgcc 480

acatatgcca atgccaggac gacccttgaa gcaaggaagg gtgttgggaa ggcatttatc 540

accgctttcc gctctggtgc agtcatgggc ttcttgttgt catcaagtgg tcttgtggtt 600

ctttacatca ccatcaacgt gtttaagatg tactacggtg atgactggga aggtcttttt 660

gagtccatca ctggttatgg tctcggtggg tcttccatgg ctctattcgg aagagttggt 720

ggaggtatct acactaaggc tgctgacgtg ggtgctgacc ttgttggcaa agttgagagg 780

aacattcctg aagatgaccc aaggaaccca gctgtgattg ctgacaacgt cggtgacaac 840

gttggtgata ttgctggaat gggatcagat ctctttggtt catacgcaga atcttcctgc 900

gctgctcttg ttgttgcttc catctcatct tttggaatca accatgattt cactgcgatg 960

tgctacccac tgctcgtgag ctctgtaggc atcattgttt gcttgctcac cacactcttt 1020

gcaactgatt tctttgagat taaggctgca aacgaaattg aacctgctct gaagaagcag 1080

ctcatcatct ccactgctct aatgactgtt ggtgttgcgg tcatcagctg gttggctctt 1140

ccagctaagt tcaccatctt caacttcggt gctcagaagg aagtgtccaa ctggggcctg 1200

ttcttctgcg tggcagttgg tctgtgggct ggtctgatta ttggatttgt gactgaatac 1260

tacactagca acgcctacag ccctgtgcaa gatgttgccg attcctgcag aactggtgct 1320

gccaccaacg tcatcttcgg tcttgctctg gggtacaagt ctgttatcat cccaattttc 1380

gctattgctg tcagcatcta cgtcagcttc tccattgctg caatgtacgg cattgcaatg 1440

gctgctcttg gcatgctaag cacaatggca actggtcttg ccatcgatgc ttatggtccc 1500

attagtgaca atgctggtgg aattgctgag atggctggca tgagccacag aatccgtgag 1560

aggactgatg ctcttgatgc tgctggcaac acaaccgctg ctattgggaa gggtttcgcc 1620

attggatcag ctgctctcgt gtccctggca cttttcggtg cctttgtcag cagagctggt 1680

gtgaaggtcg ttgatgtcct atctcccaag gtgttcattg gtctgattgt cggagccatg 1740

cttccgtact ggttctctgc catgaccatg aagagtgttg gaagtgctgc cctcaagatg 1800

gttgaggagg tccgcaggca gttcaacacc attcctggac tgatggaggg aactgccaag 1860

cctgactatg ccacctgtgt caagatctcc actgatgctt ccatcaagga gatgatccct 1920

ccgggtgctt tggtcatgct cacccccctc attgttggaa ccctctttgg cgtggaaacc 1980

ctgtctggtg ttctggctgg tgccctcgtt tctggagtgc agatcgccat ctctgcttcc 2040

aacaccggtg gtgcatggga caacgcaaag aagtacatcg aggccggcaa cagcgagcat 2100

gcgaggtccc ttggtcccaa gggttcagac tgccacaagg ccgccgtgat cggtgacacc 2160

atcggagacc ccctcaagga cacctcaggc ccgtcgctca acatcctcat caagctcatg 2220

gccgttgagt ccctcgtgtt cgcgcccttc ttcgccacgt acggaggtct gctgttcaag 2280

tacatctag 2289

<210> 3

<211> 762

<212> PRT

<213> 大麦HvHVP10(Hordeum vulgare)

<400> 3

Met Ala Ile Leu Gly Glu Leu Gly Thr Glu Ile Leu Ile Pro Val Cys

1 5 10 15

Gly Val Ile Gly Ile Val Phe Ala Val Ala Gln Trp Phe Ile Val Ser

20 25 30

Lys Val Lys Val Thr Pro Gly Ala Ala Ser Ala Ala Ala Gly Ala Lys

35 40 45

Asn Gly Tyr Gly Asp Tyr Leu Ile Glu Glu Glu Glu Gly Leu Asn Asp

50 55 60

His Asn Val Val Val Lys Cys Ala Glu Ile Gln Thr Ala Ile Ser Glu

65 70 75 80

Gly Ala Thr Ser Phe Leu Phe Thr Met Tyr Gln Tyr Val Gly Met Phe

85 90 95

Met Val Val Phe Ala Ala Ile Ile Phe Leu Phe Leu Gly Ser Ile Glu

100 105 110

Gly Phe Ser Thr Lys Gly Gln Pro Cys Thr Tyr Ser Lys Gly Thr Cys

115 120 125

Lys Pro Ala Leu Tyr Thr Ala Leu Phe Ser Thr Ala Ser Phe Leu Leu

130 135 140

Gly Ala Ile Thr Ser Leu Val Ser Gly Phe Leu Gly Met Lys Ile Ala

145 150 155 160

Thr Tyr Ala Asn Ala Arg Thr Thr Leu Glu Ala Arg Lys Gly Val Gly

165 170 175

Lys Ala Phe Ile Thr Ala Phe Arg Ser Gly Ala Val Met Gly Phe Leu

180 185 190

Leu Ser Ser Ser Gly Leu Val Val Leu Tyr Ile Thr Ile Asn Val Phe

195 200 205

Lys Met Tyr Tyr Gly Asp Asp Trp Glu Gly Leu Phe Glu Ser Ile Thr

210 215 220

Gly Tyr Gly Leu Gly Gly Ser Ser Met Ala Leu Phe Gly Arg Val Gly

225 230 235 240

Gly Gly Ile Tyr Thr Lys Ala Ala Asp Val Gly Ala Asp Leu Val Gly

245 250 255

Lys Val Glu Arg Asn Ile Pro Glu Asp Asp Pro Arg Asn Pro Ala Val

260 265 270

Ile Ala Asp Asn Val Gly Asp Asn Val Gly Asp Ile Ala Gly Met Gly

275 280 285

Ser Asp Leu Phe Gly Ser Tyr Ala Glu Ser Ser Cys Ala Ala Leu Val

290 295 300

Val Ala Ser Ile Ser Ser Phe Gly Ile Asn His Asp Phe Thr Ala Met

305 310 315 320

Cys Tyr Pro Leu Leu Val Ser Ser Val Gly Ile Ile Val Cys Leu Leu

325 330 335

Thr Thr Leu Phe Ala Thr Asp Phe Phe Glu Ile Lys Ala Ala Asn Glu

340 345 350

Ile Glu Pro Ala Leu Lys Lys Gln Leu Ile Ile Ser Thr Ala Leu Met

355 360 365

Thr Val Gly Val Ala Val Ile Ser Trp Leu Ala Leu Pro Ala Lys Phe

370 375 380

Thr Ile Phe Asn Phe Gly Ala Gln Lys Glu Val Ser Asn Trp Gly Leu

385 390 395 400

Phe Phe Cys Val Ala Val Gly Leu Trp Ala Gly Leu Ile Ile Gly Phe

405 410 415

Val Thr Glu Tyr Tyr Thr Ser Asn Ala Tyr Ser Pro Val Gln Asp Val

420 425 430

Ala Asp Ser Cys Arg Thr Gly Ala Ala Thr Asn Val Ile Phe Gly Leu

435 440 445

Ala Leu Gly Tyr Lys Ser Val Ile Ile Pro Ile Phe Ala Ile Ala Val

450 455 460

Ser Ile Tyr Val Ser Phe Ser Ile Ala Ala Met Tyr Gly Ile Ala Met

465 470 475 480

Ala Ala Leu Gly Met Leu Ser Thr Met Ala Thr Gly Leu Ala Ile Asp

485 490 495

Ala Tyr Gly Pro Ile Ser Asp Asn Ala Gly Gly Ile Ala Glu Met Ala

500 505 510

Gly Met Ser His Arg Ile Arg Glu Arg Thr Asp Ala Leu Asp Ala Ala

515 520 525

Gly Asn Thr Thr Ala Ala Ile Gly Lys Gly Phe Ala Ile Gly Ser Ala

530 535 540

Ala Leu Val Ser Leu Ala Leu Phe Gly Ala Phe Val Ser Arg Ala Gly

545 550 555 560

Val Lys Val Val Asp Val Leu Ser Pro Lys Val Phe Ile Gly Leu Ile

565 570 575

Val Gly Ala Met Leu Pro Tyr Trp Phe Ser Ala Met Thr Met Lys Ser

580 585 590

Val Gly Ser Ala Ala Leu Lys Met Val Glu Glu Val Arg Arg Gln Phe

595 600 605

Asn Thr Ile Pro Gly Leu Met Glu Gly Thr Ala Lys Pro Asp Tyr Ala

610 615 620

Thr Cys Val Lys Ile Ser Thr Asp Ala Ser Ile Lys Glu Met Ile Pro

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Pro Gly Ala Leu Val Met Leu Thr Pro Leu Ile Val Gly Thr Leu Phe

645 650 655

Gly Val Glu Thr Leu Ser Gly Val Leu Ala Gly Ala Leu Val Ser Gly

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Val Gln Ile Ala Ile Ser Ala Ser Asn Thr Gly Gly Ala Trp Asp Asn

675 680 685

Ala Lys Lys Tyr Ile Glu Ala Gly Asn Ser Glu His Ala Arg Ser Leu

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Gly Pro Lys Gly Ser Asp Cys His Lys Ala Ala Val Ile Gly Asp Thr

705 710 715 720

Ile Gly Asp Pro Leu Lys Asp Thr Ser Gly Pro Ser Leu Asn Ile Leu

725 730 735

Ile Lys Leu Met Ala Val Glu Ser Leu Val Phe Ala Pro Phe Phe Ala

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Thr Tyr Gly Gly Leu Leu Phe Lys Tyr Ile

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<211> 11217

<212> DNA

<213> 人工序列(pCAMBIA1300载体)

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aaagtacttt gatcccgagg ggaaccctgt ggttggcatg cacatacaaa tggacgaacg 60

gataaacctt ttcacgccct tttaaatatc cgttattcta ataaacgctc ttttctctta 120

ggtttacccg ccaatatatc ctgtcaaaca ctgatagttt aaactgaagg cgggaaacga 180

caatctgatc caagctcaag ctgctctagc attcgccatt caggctgcgc aactgttggg 240

aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg 300

caaggcgatt aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg 360

ccagtgccaa gcttgcatgc ctgcagtgca gcgtgacccg gtcgtgcccc tctctagaga 420

taatgagcat tgcatgtcta agttataaaa aattaccaca tatttttttt gtcacacttg 480

tttgaagtgc agtttatcta tctttataca tatatttaaa ctttactcta cgaataatat 540

aatctatagt actacaataa tatcagtgtt ttagagaatc atataaatga acagttagac 600

atggtctaaa ggacaattga gtattttgac aacaggactc tacagtttta tctttttagt 660

gtgcatgtgt tctccttttt ttttgcaaat agcttcacct atataatact tcatccattt 720

tattagtaca tccatttagg gtttagggtt aatggttttt atagactaat ttttttagta 780

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atcccccgaa ttaattcggc gttaattcag tacattaaaa acgtccgcaa tgtgttatta 5040

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acctttttcc cctgctaggg caatttgccc tagcatctgc tccgtacatt aggaaccggc 7920

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aatcgcgggc actgccctgg ggatcggaat cgactaacag aacatcggcc ccggcgagtt 9960

gcagggcgcg ggctagatgg gttgcgatgg tcgtcttgcc tgacccgcct ttctggttaa 10020

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gtgcagccgg ccgcgtgcag ttcggcccgt tggttggtca agtcctggtc gtcggtgctg 10980

acgcgggcat agcccagcag gccagcggcg gcgctcttgt tcatggcgta atgtctccgg 11040

ttctagtcgc aagtattcta ctttatgcga ctaaaacacg cgacaagaaa acgccaggaa 11100

aagggcaggg cggcagcctg tcgcgtaact taggacttgt gcgacatgtc gttttcagaa 11160

gacggctgca ctgaacgtca gaagccgact gcactatagc agcggagggg ttggatc 11217

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(cDNA-F)

<400> 5

agggtttcgt cggcctg 17

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(cDNA-R)

<400> 6

tttgccaggc acataccaac 20

<210> 7

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(TS-HvHVP10-F)

<400> 7

caggtcgact ctagaggatc catggcgatc ctcggggag 39

<210> 8

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(TS-HvHVP10-R)

<400> 8

gagctccgcg gcccgggtac cctagatgta cttgaacagc agacctcc 48

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(pCAMBIA1300-F)

<400> 9

catgttgatg tgggttttac tga 23

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(TSHVP10-R)

<400> 10

gcagtgtata gggctggctt 20

Claims

1.一种大麦HvHVP10基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。

2.一种权利要求1所述的大麦HvHVP10基因的转录本cDNA，该转录本cDNA全长核苷酸序列为SEQ ID No:2所示。

3.一种由权利要求1所述的大麦HvHVP10基因编码的大麦氢离子焦磷酸酶，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:3所示。

4.一种含有大麦HvHVP10基因的重组载体，其特征在于：所述重组载体由pCAMBIA1300载体和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的大麦HvHVP10基因的转录本cDNA经过BamHI和KpnI酶双酶切后重组而成。

5.一种大麦HvHVP10基因在提高植物耐盐性方面的应用。

6.一种大麦HvHVP10基因在制备提高植物耐盐性相关制剂方面的应用。