CN115896046A

CN115896046A - 一种大麦的耐盐基因HvSIAH1及其表达载体以及应用

Info

Publication number: CN115896046A
Application number: CN202211412827.4A
Authority: CN
Inventors: 李颖波; 徐红卫; 张述伟; 宗营杰; 刘成洪; 陆瑞菊
Original assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2022-11-11
Filing date: 2022-11-11
Publication date: 2023-04-04

Abstract

本发明涉及一种大麦的耐盐基因HvSIAH1及其表达载体以及应用。所述耐盐基因HvSIAH1来自大麦品种花30，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述耐盐基因HvSIAH1编码具有耐盐能力的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。本发明首次从大麦中克隆得到一个E3泛素连接酶基因HvSIAH1，将其插入表达载体，然后将该基因的过量表达载体导入大麦品种中，结果证实该基因可以提高大麦品种对盐的耐受性；本发明还将该耐盐基因HvSIAH1用于基因工程育种，开发出具有较高耐盐性的大麦种质，因此本发明对于深入理解植物耐盐机制、作物种质创新有着重要意义。

Description

一种大麦的耐盐基因HvSIAH1及其表达载体以及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及一种大麦的耐盐基因HvSIAH1及其表达载体以及应用。

背景技术

随着气候变迁、灌溉和化肥的大量使用，土壤盐渍化问题越来越突出。我国盐渍土面积有3.6×10⁷ha，约占全国总耕地面积的4.88％。盐胁迫可抑制作物生长速度，降低分蘖、分枝数量，甚至致死，最终影响作物产量，已经成为制约我国农作物生长与产量的重要因素之一，威胁我国粮食安全。提高作物的耐盐性是利用盐渍土地最有效的办法，是提高粮食产量的基础。

挖掘并利用耐盐基因是提高作物耐盐性最为直接的方法。已有的研究也表明，将耐盐相关基因导入作物中能快速获得耐盐新品系。Munns等(2012)用回交的方式将一粒小麦Na⁺转运蛋白基因TmHKT1；5-A导入硬粒小麦中，含TmHKT1；5-A的硬粒小麦在盐碱地中产量显著增加。Ashraf和Foolad(2013)将控制离子吸收有关的一个QTL位点Saltol导入到了2个水稻栽培品种‘BR11’和‘BR28’中，获得的水稻材料在盐碱土上产量比对照增加。但是植物的耐盐性是一个典型的数量性状，有众多的基因参与耐盐调控途径。挖掘更多的耐盐相关基因，特别是重要的节点调控类基因，对于解析耐盐相关基因的调控网络，深入理解植物耐盐机制、作物种质创新有着重要意义。我国也将挖掘作物耐盐碱关键基因及调控网络作为十四五种质资源创新的重要内容之一。

大麦具有较强的耐盐性，是盐碱土改良的先锋作物之一(Gupta和Huang，2014)。同时大麦也是遗传学研究广泛应用的模式作物之一，具有饲用、食用、啤用和药用等用途，在国民经济生产发展中具有十分重要的地位。研究大麦耐盐机制，深入挖掘大麦中的耐盐基因，对我国大麦耐逆育种的进一步发展具有重要的理论意义和应用价值，还对于提升其它禾本科作物的耐盐性具有重要的应用价值。近年来，大麦基因组序列发布，也为大麦耐盐相关基因的克隆奠定了基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种大麦的耐盐基因HvSIAH1及其表达载体以及应用，从而解决现有技术中挖掘作物耐盐碱关键基因及解析耐盐相关基因的调控网络的迫切需求。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

根据本发明的第一方面，提供一种大麦的耐盐基因HvSIAH1，所述耐盐基因HvSIAH1来自大麦品种花30，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

根据本发明的第二方面，提供所述耐盐基因HvSIAH1编码具有耐盐能力的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

根据本发明的第三方面，提供一种含有如上面所述的耐盐基因HvSIAH1的表达载体。

优选的，所采用的载体质粒为pWMB110。

根据本发明的第四方面，提供一种过量表达如上面所述的耐盐基因HvSIAH1的大麦植株。

根据本发明的第五方面，提供一种如上述所述的大麦的耐盐基因HvSIAH1或含有该耐盐基因的表达载体在培育高耐盐性的大麦品种中的应用。

根据本发明的一个优选方案，所述应用包括：利用农杆菌转化大麦小孢子愈伤技术将含有耐盐基因HvSIAH1的表达载体转入大麦材料中。

根据本发明的一个优选方案，所述应用包括将所述耐盐基因HvSIAH1用于大麦材料Golden promise对盐胁迫的耐受性改进。

本实验室对大麦品种花30做小孢子培养，进行盐胁迫处理并做转录组测序，结果发现，盐胁迫小孢子愈伤后一个属于SINA(seven in absentia)家族的RING-finger类E3连接酶基因HvSIAH1显著上调表达。进一步的，发明人将HvSIAH1在大麦材料中进行遗传转化获得过量植株，结果表明，基因HvSIAH1能显著提高大麦的耐盐性，由此证明该基因HvSIAH1是一种耐盐基因。

本发明的创造性主要在于，首次通过转基因手段发现了大麦中的一个新的耐盐相关基因HvSIAH1，并且证实该基因HvSIAH1能显著提升转化植株的耐盐性，其次，本发明还成功将该基因应用于大麦耐盐基因工程育种中，以开发更多的具有较高耐盐性的大麦种质。

综上所述，本发明首次从大麦(Hordeum vulgare L.)中克隆得到了一个E3泛素连接酶基因HvSIAH1，将其插入表达载体，然后将得到的该基因的过量表达载体导入大麦品种中，即可以提高该大麦品种对盐的耐受性。本发明还将该耐盐基因HvSIAH1用于基因工程育种，将其导入耐盐性较差的大麦品种中，从而获得具备较高耐盐性的大麦种质。因此本发明对于深入理解植物耐盐机制、作物种质创新有着重要意义。

附图说明

图1示出了HvSIAH1随时间变化在受盐胁迫的大麦小孢子愈伤中表达模式，*表示p<0.05；

图2示出了pWMB110:HvSIAH1载体构建过程；

图3示出了PCR鉴定农杆菌阳性克隆结果，M表示Marker；

图4示出了转基因阳性植株中HvSIAH1相对Actin的表达情况，WT为野生型Goldenpromise，S1-S10为转基因T0代阳性植株；

图5示出了盐胁迫后HvSIAH1过量表达植株和野生型Golden promise根长的比较分析，误差线上不同字母表示p<0.05，其中，SIAHOE1-3为挑选的三株盐胁迫后HvSIAH1过量表达植株。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。

实施例1大麦品种“花30”中E3泛素连接酶基因HvSIAH1的克隆

选取“花30”植株幼穗中部小花小孢子发育处于单核早-中期的“花30”穗子，剪去叶片，保留上部两片叶子基部约1.5cm，放入4℃冰箱中进行2～4周低温预处理；经过低温预处理的“花30”取花苞游离小孢子，每个试管接4个穗子的花苞，加入12ml提取液，用高速分散器超速旋切；把旋切好的悬浮液，用300目筛网过滤，滤液以700rpm，5min低速离心，重复3次，收集小孢子；收集到的小孢子用提取液于25℃、黑暗中预处理2d后再纯化培养小孢子；培养前小孢子用诱导培养基洗涤1次，密度调节至1.0×10⁵个/m1，混匀后取1.5ml小孢子悬浮液接种于培养皿(3×1.5cm)中，Parafilm封口，25℃，暗培养。培养第19天时，在营养液中加入终浓度为350mg/L的氯化钠溶液，分别在加入氯化钠溶液后的0、1、2、4、6、12、24、48小时取大麦小孢子愈伤并提取RNA。使用引物HvSIAH1Q-F：CAAGATGTGGGTCAACCTGA(SEQ IDNO.3)和HvSIAH1Q-R：AAGGCAGAGCCTTGTCGAT(SEQ ID NO.4)对不同盐胁迫后不同时间点愈伤做Q-PCR表达分析，发明人发现E3连接酶基因片段在受盐胁迫的大麦品种‘花30’小孢子愈伤中上调表达(图1)。在此基础上，发明人利用基因登录号搜索大麦基因组数据库，获得该基因的cDNA全长序列。根据获得的E3连接酶基因开放阅读框设计引物HvSIAH1-F：TTCACGCCAATTTGAAAACA(SEQ ID NO.5)和HvSIAH1-R：CGATATTGCAGGCCCATAGT(SEQ IDNO.6)。

以“花30”受盐胁迫的小孢子愈伤所提取的RNA反转录的cDNA为模板进行PCR扩增，获得了一个1131bp的基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该基因编码的氨基酸包含一个SIANT的结构域，属于Ring finger家族的E3连接酶，发明人将该基因命名为HvSIAH1。

实施例2HvSIAH1遗传转化载体的构建

以HvSIAH1基因cDNA为模板，使用引物对HvSIAH1-110-F(CGGGATCCATGGGGCGGAGGAGGCA，SEQ ID NO.7)和HvSIAH1-110-R(GGGGTACCTCAACGGCCTTCGTCCA，SEQ ID NO.8)进行PCR扩增，回收扩增片段。用同源重组的方法，将酶切产物插入到BamHI和SpeI双酶切后的载体pWMB110，将HvSIAH1置于Ubiquitin启动子后面的多克隆位点处。由此将目标基因HvSIAH1克隆到强启动子Ubiquitin的下游，获得表达载体pWMB110:HvSIAH1(构建过程如图2所示)。经测序验证，表明载体构建成功。

实施例3HvSIAH1稳定过量表达植株的获得

利用本实验室已有的农杆菌转化大麦小孢子愈伤技术(参见专利CN108085334B)，将pWMB110:HvSIAH1转入大麦材料Golden promise中。其步骤如下：

1)将农杆菌感受态(LBA4404菌株)和pWMB110：HvSIAH1质粒轻轻混匀，使用冻融法将质粒导入LBA4404菌株。使用引物HvSIAH1Q-F：CAAGATGTGGGTCAACCTGA(SEQ ID NO.3)和HvSIAH1Q-R：AAGGCAGAGCCTTGTCGAT(SEQ ID NO.4)鉴定阳性克隆，结果如图3所示。将含pWMB110:HvSIAH1载体的农杆菌扩繁至OD₆₀₀＝0.6～0.8，4000rpm离心15min，使用10mMMgSO₄重悬，4000rpm离心15min，加入小孢子诱导培养基(以改良的N6培养基为基本培养基，添加麦芽糖90g/L，2,4-D 2.0mg/L、KT 0.5mg/L、100μM乙酰丁香酮、800mg/L半胱氨酸，2mg/L AgNO₃，pH调节至5.8，过滤灭菌)将菌液浓度调至OD₆₀₀＝0.6～0.8。

2)约100个小孢子愈伤加入步骤1)获得的20ml农杆菌菌液，超声波处理(100W)5min，使用50kPa负压处理3次，每次60s，之后摇床继续侵染30min，移至共培养基培养(以改良的N6培养基为基本培养基，添加麦芽糖90g/L，2,4-D 2.0mg/L、KT 0.5mg/L、100μM乙酰丁香酮、800mg/L半胱氨酸，2mg/L AgNO₃，pH调节至5.8，过滤灭菌)4天；

3)将愈伤转移至诱导筛选培养基上(以改良的N6培养基为基本培养基，添加麦芽糖90g/L，2,4-D 2.0mg/L、KT 0.5mg/L、5mg/L Bialophos、3.5g/L植物凝胶，pH调节至5.8；采用121℃、0.11MPa高温、高压灭菌15min)，筛选2～4周。

4)农杆菌侵染小孢子培养诱导绿苗分化：用药勺将胚性愈伤组织转移至分化培养基(以2/3MS为基本培养基,添加麦芽糖30g/L、6-BA 0.5mg/L、KT0.5mg/L、NAA 0.05mg/L、Bialophos 5mg/L,用3.5g/L植物凝胶固化培养基,pH 5.8；采用121℃、0.11MPa高温、高压灭菌15min)上，26℃光照培养10～20d，获得分化绿苗。

5)壮苗生根：分化形成的绿苗长至3～4cm高时，转接至壮苗培养基(以1/2MS为基本培养基，添加蔗糖30g/L、IAA 0.4mg/L、矮壮素2.5mg/L、Bialophos 10mg/L，用6g/L琼脂粉固化培养基,pH 5.8；采用121℃、0.11MPa高温、高压灭菌15min)中，壮苗生根。培养3～4周后，转入营养液水培，中间可进行阳性鉴定操作，待苗长20～30cm时可移栽盆钵或大田。

6)阳性植株检测：取小孢子再生试管苗幼苗叶片，加入TE缓冲液过滤，磨碎，加入PAT/bar速测试纸(上海佑隆生物科技有限公司)，有两条带即为阳性植株。提取10棵阳性植株叶片的RNA，使用HvSIAH1Q-F：CAAGATGTGGGTCAACCTGA(SEQ ID NO.3)、HvSIAH1Q-R：AAGGCAGAGCCTTGTCGAT(SEQ ID NO.4)和HvActinQ-F：GACTCTGGTGATGGTGTCAGC(SEQ IDNO.9)、HvActinQ-R：GGCTGGAAGAGGACCTCAGG(SEQ ID NO.10)做Q-PCR，转基因植株中HvSIAH1的表达量相对看家基因Actin基因的表达情况如图4所示。优先选取表达量较高的S1、S9、S10植株为进一步的研究对象，繁殖到T2代。

实施例4HvSIAH1耐盐功能的分析

在大麦材料Golden promise中过量表达HvSIAH1，T2代植株水培(Hoogland营养液)生长至二叶一心期时加入终浓度为350mM的NaCl进行盐胁迫实验。盐胁迫7天后，统计植株的地上部干重，结果表明，HvSIAH1过量表达植株的根长显著长于野生型Golden promise(图5)。说明过量表达HvSIAH1能显著增强大麦植株对盐胁迫的耐受性。

以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。

Claims

1.一种大麦的耐盐基因HvSIAH1，其特征在于，所述耐盐基因HvSIAH1来自大麦品种花30，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的耐盐基因HvSIAH1，其特征在于，所述耐盐基因HvSIAH1编码具有耐盐能力的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种含有如权利要求1所述的大麦的耐盐基因HvSIAH1的表达载体。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所采用的载体质粒为pWMB110。

5.一种过量表达如权利要求1所述大麦的耐盐基因HvSIAH1的大麦植株。

6.一种如权利要求1所述的大麦的耐盐基因HvSIAH1或权利要求3所述的表达载体在培育高耐盐性大麦品种中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用包括：利用农杆菌转化大麦小孢子愈伤技术将含有耐盐基因HvSIAH1的表达载体转入耐盐性较差的大麦材料中，获得具有较高耐盐性的大麦品种。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用还包括：将所述耐盐基因HvSIAH1用于大麦材料Golden promise对盐胁迫的耐受性改进。