CN112342222A - 小麦耐盐基因TaAAP3及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程、分子生物学、遗传育种科学技术领域，具体涉及一种小麦耐盐基因AAP3及其应用。本发明公开了氨基酸通透酶基因TaAAP3基因组序列及该基因在盐胁迫下的表达模式，获得了含有所述基因TaAAP3的过表达载体和过表达该基因的小麦转基因植株。实验证明，本发明所述转基因小麦的耐盐能力显著高于对照（非转基因小麦），可用于小麦的耐盐育种，具有巨大的应用价值。

Description

小麦耐盐基因TaAAP3及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程、分子生物学、遗传育种科学技术领域，具体涉及一种小麦耐盐基因AAP3及其应用。

背景技术

土壤盐化已经成为全球农业一个持续加剧的问题。中国盐渍化和次生盐渍化土地占全国耕地面积的10％左右。其中，环渤海地区是我国主要的盐碱地分布区域，有1000多万亩盐碱荒地和4000多万亩受盐碱危害的中低产田。由于盐胁迫影响植物生长、光合、蛋白合成、能量代谢和脂类代谢等，因此，在人口不断增加、耕地面积日趋减少的形势下，加快耐盐碱作物新品种的培育改良和推广应用，对保障国家粮食安全及保护生态环境具有重要意义。利用转基因技术将耐盐基因导入作物进行遗传改良，是一项具有广阔应用前景的技术。然而，从含有数以万计基因的植物基因组中发掘可用于作物遗传改良的耐盐基因比较困难。

目前，已经报道的小麦耐盐基因包括TaAOC1、TaNAS1、TaCYP81、TaHKT1、TaSTK等。除此之外，不同研究团队对上述耐盐基因之外的基因的发掘工作仍在摸索中。由于盐胁迫下植物能积累一些小分子含氮有机物(如游离氨基酸、甜菜碱、NH⁴⁺、尿素等)来进行代谢或渗透调节，从而在一定程度上缓解盐胁迫给植物带来的不利影响，其中游离氨基酸浓度的响应尤为灵敏，其作用不容忽视。氨基酸透性酶家族(amino acid permeases，AAPs)是一类氨基酸转运蛋白，对植物中氨基酸的含量起着重要作用。然而，AAP基因是否与植物的耐盐性有关迄今未见相关报道。

发明内容

针对现有对AAP基因研究的不足，本发明提供一种新耐盐基因-小麦TaAAP3及其应用。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：

一种小麦耐盐基因TaAAP3，所述基因组的核苷酸序列如SEQID No.1所示。

一种含上述基因TaAAP3的表达载体PTCK303-TaAAP3。

上述基因TaAAP3在培育耐盐植物中的应用。

上述表达载体PTCK303-TaAAP3在培育耐盐植物中的应用。

上述基因TaAAP3或表达载体PTCK303-TaAAP3的应用，其特征在于，所述的植物为小麦。

1.从小麦中克隆获得TaAAP3基因。

以山羊草AAP3的mRNA序列(GeneBank：XM_020311037.1)为基础，在NCBI中进行比对搜索，获得小麦mRNA序列(GenBank：AK449433.1)，根据此序列设计引物，以小麦新品种济麦262的基因组DNA为模板进行PCR扩增，片段大小为1790bp，克隆测序获得长度为1780bp的DNA片段，如SEQID No.1所示。

2.提供TaAAP3基因在盐胁迫下的表达模式。

对两叶一心的济麦262小麦幼苗进行盐胁迫处理，对处理后0h、6h、12h和24h、48h，复水后24小时的根、茎、叶进行取样、RNA提取及反转录。利用实时定量PCR(QPCR)引物QAAP3F：5CGCCTACTCCTATTCGCTCATCC；QAAP3R：ACCCTGACTTGGGCCACCTCT进行QPCR检测TaAAP3基因在盐胁迫下的表达模式。

3.表达载体(PTCK303-TaAAP3)构建及小麦转基因。

将含有TaAAP3基因的PMD-18T质粒(总长度约4050bp)和PTCK303质粒(约14Kbp)用BamHI和SpeI进行双酶切，分别利用胶回收长度为1780bp的TaAAP3基因和14143bp的载体片段，然后，利用T4连接酶对上述两片段进行连接。将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中，利用菌落PCR挑选阳性菌落，再提取质粒用BamHI和SpeI内切酶对其进行二次酶切验证该质粒的连接正确性。最后，进行小麦转基因。

4.TaAAP3基因功能研究

将转基因植株种植，单株取幼叶提取DNA，用载体上的Hyg的特异引物对转基因植株进行PCR扩增，获得转基因阳性植株。选取T₃代阳性植株的种子及非转基因种子进行耐盐性实验。

本发明的有益效果：

本发明利用基因工程技术，首次得到了小麦耐盐相关基因TaAAP3，并且获小麦耐盐相关基因TaAAP3的过表达转基因植株，经过试验比较分析证明，转基因植株的奶盐能力明显提高，为该基因广泛用于培育耐盐农作物新品种提供了基础。

附图说明

图1：TaAAP3基因全长基因组PCR扩增图。

图2：TaAAP3基因结构图。黄色代表外显子，黑色代表内含子。

图3：盐胁迫下TaAAP3在小麦根茎叶中的表达模式图。

图4：载体PTCK303骨架图。插入基因位置为将该位置替换成TaAAP3基因。

图5：PTCK303-TaAAP3构建过程。A，B为PMD-18T-TaAAP3经BamHI和SpeI内切酶切后的电泳条带，上面是PMD-18T载体条带(2692)，下面是TaAAP3基因的条带；C，D为PTCK303经BamHI和SpeI内切酶酶切后的电泳条带。M为Marker

图6：阳性植株PCR检测图：1为阳性对照(表达载体PTCK303+TaAAP3)；2-12为转基因植株；其中有条带的为阳性植株，M为Marker。

图7：盐胁迫下转基因株系和对照株系的比较图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好的理解本发明，但并不限定本发明。下属实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复试验，结果取平均值。

实施例1从小麦中克隆获得TaAAP3基因

1.引物设计

以山羊草AAP3的mRNA序列(GeneBank：XM_020311037.1)在NCBI中搜索，获得小麦mRNA序列(GenBank：AK449433.1)根据此序列设计引物序列如下：

TAAPCF1:ATGGGGGAGAACGGCGTGGGCAAGAACTAC(SEQID No.2)，

TAAPCR1:

GGACTAGTCCTCAGTCAGTTGTGAAGAACGGCTTGTAG(SEQID No.1)；

利用以上引物(引物中底下有横线的碱基为引入的Spe1内切酶的酶切位点，利于后续表达载体的构建)对旱地小麦新品种济麦262的基因组DNA进行PCR扩增。

2.PCR反应体系及程序

50μl反应体系：

PCR反应程序为：PCR反应程序为：94℃4min；94℃30s，60℃30s，72℃4min，(35cycles)；72℃，10min。

3.1％琼脂糖凝胶电泳

PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测后发现片段大小为1790bp目的条带(图1)。

4.扩增片段的回收、与载体的链接

扩增片段回收后与PMD-18T载体连接，获得含小麦TaAAP3基因的PMD-18T-TaAAP3，其中连接体系为：

试剂	使用量
		PMD-18T载体	1μl
胶回收产物	2μl
		SolutionⅠ	5μl
ddH2O	2μl
		合计	10μl

5.测序

含小麦TaAAP3基因的PMD-18T-TaAAP3，送到上海生物工程有限公司进行测序，获得了TaAAP3的基因组序列(NCBI登录号为MN184741)如SEQID No.1所示。利用在先软件Augustus(http://bioinf.uni-greifswald.de/augustus/)对该片段进行分析，发现该DNA片段包含完整的TaAAP3基因组片段(该片段包括起始密码子ATG和终止密码子TGA)。TaAAP3基因组片段包含4个外显子和3个内含子(图2)，CDS长度为1476bp共编码491个氨基酸。序列比对发现，该DNA片段与山羊草AAP3基因相似性为97.3％，与大麦AAP3基因相似性为95.7％，因此，将该基因命名为TaAAP3。

实施例2 TaAAP3基因在盐胁迫下的表达模式

利用已克隆出的TaAAP3的cDNA序列设计引物

QAAP3F:CGCCTACTCCTATTCGCTCATCC(SEQID No.4)，

QAAP3R:ACCCTGACTTGGGCCACCTCT(SEQID No.5)；选取济麦262饱满种子，置于直径为9cm的培养皿中，于光照培养箱中25℃恒温培养3d后，选择生长状态一致的幼苗移栽到至塑料培养盒中，1/2Hogland培养液培养至两叶一心时，用于盐胁迫处理：将待处理材料置于含250mmol/L NaCl水溶液中生长；处理取材时间均为0h、6h、12h和24h、48h，复水后24小时，取材部位均为根、茎、叶。对所取材料进行RNA提取及反转录。其中RNA提取方法为：

(1)先用液氮充分预冷研钵，取约0.2g样品，放入研钵中，用研杵研磨，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状；

(2)向研钵中加入1ml的RNAiso Plus(宝生物工程有限公司，大连)，将研磨成粉末状的样品完全覆盖，继续研磨充分匀浆；

(3)将匀浆液转移至1.5ml离心管中，室温(15-30℃)静止5分钟，4℃，12,000rmp离心5分钟；

(4)吸取上清液，加入1/5体积量的氯仿(约200μl)，振荡至溶液充分乳化后，室温静置5分钟；

(5)12,000rmp 4℃离心15分钟；

(6)从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。吸取上清液转移至另一新的离心管中；

(7)加入与上清等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀，冰上静置10分钟；

(8)12,000rmp 4℃离心10分钟，一般在离心后，试管底部会出现RNA沉淀；

(9)小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入1ml经RNase-free水配制的预冷的75％乙醇，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，12,000rmp 4℃离心5分钟后小心弃去乙醇；

(10)室温干燥沉淀2-5分钟，加入适量的RNase-free水溶解沉淀。

反转录方法为：

1.去除基因组DNA反应体系为：

试剂	使用量
		5×gDNA Eraser Buffer	2μl
gDNA Eraser	1μl
		Total RNA	2μl
RNA Free dH2O	5μl
		合计	10μl

42℃2min。

2.反转录反应

37℃15min，85℃5s，放入4℃保存。再利用以上引物进行实时定量PCR。

实时定量反应体系：

试剂	使用量
		TB Green Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2×)	10μl
RT反应液(cDNA的稀释液)	2μl
		QAAP3F引物(10μM)	1μl
QAAP3R引物(10μM)	1μl
		灭菌水	6μl
合计	20μl

反应步骤为：95℃30s；95℃5s 60℃31s 40个循环。结果发现在盐胁迫下，AAP3在根茎叶中的表达模式均发生了变化，说明该基因响应盐胁迫(图3)。

实施例3表达载体(PTCK303-TaAAP3)的构建及小麦转基因

将含有目的基因TaAAP3基因的PMD-18T质粒用BamHI和SpeI内切酶切进行双酶切，对酶切后的小片段进行胶回收，同时利用BamHI和SpeI内切酶对PTCK303(图4)进行双酶切(图5)，胶回收大片段，将胶回收后的两个片段利用T4连接酶进行连接。将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中，菌落PCR验证阳性菌落。然后对阳性菌落扩大培养，提取质粒，利用BamHI和SpeI内切酶对质粒进行双酶切，验证酶切后片段大小是否与目的基因大小相同。将质粒转入农杆菌中进行小麦转基因。

其中酶切反应体系为：

质粒(PMD-18T质粒或PTCK303)	2μg
		限制性内切酶SpeI	2μL
限制性内切酶BamHI	2μL
		10×buffer	5μL
ddH<sub>2</sub>O	至50μL

37℃ 2h

实施例4转基因植株的耐盐性实验

将转基因植株种植于山东省农业科学院转基因小麦基地，单株取幼叶提取DNA，用载体上的Hyg的特异引物对转基因植株进行PCR扩增，获得转基因阳性植株(图6)。选取T3代阳性植株的种子及非转基因种子进行耐盐性实验，利用相对盐害指数，相对根长和相对苗长来考察植株的耐盐性。实验步骤如下：

1.试验设1个对照和1个处理，重复3次。每个重复均挑选50粒饱满无损伤的种子用0.1％HgCl2消毒10min，灭菌水冲洗2次后置于铺有2层滤纸的培养皿中，处理组每个培养皿中加入10mL灭菌去离子水配置的2.0％NaCl溶液，对照组每个培养皿加入10mL灭菌去离子水，将其置于温度25℃的恒温箱中，在光、暗处理各12h的条件下培养7d。相对盐害指数为对照与盐处理种子平均发芽率的差值占对照种子平均发芽率的百分比，相对盐害指数越小，表示其耐盐能力越强。

2.为了保证苗期种子的生长一致，先将种子在蒸馏水中吸涨催芽两天，挑选发芽情况一致的15粒种子置于20目的筛网上，为了使筛网能悬浮在液体表面，筛网四周粘有塑料泡沫。将筛网放入与其配套的塑料盆中。在塑料盆中加入含有1％NaCl的霍格兰营养液处理7天，对照组中加入不含有NaCl的霍格兰营养液培养7天。培养条件为25℃的光照培养箱中，光、暗处理各12h。每个处理和对照均选取生长情况较均匀的10株测量苗长、根长，3次重复。相对根长和苗长也作为判断小麦耐盐性强弱一个指标，其数值越大说明耐盐性越强。公式为如下：相对苗长(根长)＝处理苗长(根长)/对照苗长(根长)。

结果显示，转基因阳性植株的发芽率(35.5％)显著高于对照(24.0％)，相对根长(0.41)和相对苗长(0.74)显著高于对照(0.36和0.66)(图7)。

Claims (5)

1.一种小麦耐盐基因TaAAP3，其特征在于：所述基因组的核苷酸序列如SEQID No.1 所示。

2.一种含有权利要求1所述基因TaAAP3的表达载体PTCK303-TaAAP3。

3.权利要求1所述基因TaAAP3在培育耐盐植物中的应用。

4.权利要求2所述表达载体PTCK303-TaAAP3在培育耐盐植物中的应用。

5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的植物为小麦。

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