CN108018308B - 决明coki基因在提高植物耐盐及抗旱性中的应用 - Google Patents

决明coki基因在提高植物耐盐及抗旱性中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种决明COKI基因在提高植物耐盐及抗旱性中的应用，该基因核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明首次发现决明COKI基因具有促进植物在盐及干旱胁迫环境下快速生长的用途，本发明也通过实验证明转入COKI基因并通过表达的植物在盐及干旱胁迫环境下，侧根长度更长，密度更高，其萌发率也得到显著提高，叶片相对含水量更高，同时植株高度也高于野生型植物。

Description

决明COKI基因在提高植物耐盐及抗旱性中的应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种提高植物耐盐及抗旱性的基因、含有该基因的重组载体及其在改良植物对盐、干旱胁迫抗性上的应用。
背景技术
Kunitz蛋白酶抑制剂(Kunitz protease inhibitor，KI)是一种来源于植物的天然生物活性肽，能够抑制动物肠道内胰蛋白酶及类胰蛋白酶的活性。由于KI能够抑制鳞翅目昆虫中肠类胰蛋白酶等消化酶的活性，阻碍鳞翅目昆虫对食物中蛋白质类营养物质的消化吸收，影响鳞翅目昆虫的生长发育，在农业上可以发挥抗虫作用。另外，由于Kunitz蛋白酶抑制剂能够抑制哺乳动物肠道内胰蛋白酶的活性，因此在医学上可做为治疗急性胰腺炎的药物。
现有报道Kunitz蛋白酶抑制剂与植物抗御微生物、病虫害的能力息息相关，但并未见有将决明中的Kunitz蛋白酶抑制剂(Cassia obtusifolia Kunitz proteaseinhibitor，COKI)基因用于促进植物在盐及干旱等胁迫条件下快速生长的报道。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种提高植物耐盐及抗旱性的基因、含有该基因的重组载体以及该基因在改良植物对盐、干旱胁迫抗性上的应用。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
决明COKI基因在提高植物耐盐及抗旱性中的应用，具体过程包括：提取决明COKI基因，将该基因连接到植物表达载体上，并转化感受态细胞，制得包含该基因的重组质粒，将重组质粒浸染植物，使该基因在植物细胞中得以表达。
进一步地，所用植物表达载体为pBI 121，感受态细胞为根癌农杆菌GV3101。
进一步地，采用花序浸染法浸染植物，具体过程为：培养野生型植物至长出花序，将整个花序浸没到含有重组质粒的培养基中，每隔2-3s取出，浸染3次，用滤纸吸掉花序上多余液体后，再用保鲜膜包裹密封花序，黑暗培养24h后去掉保鲜膜，进行正常培养，每隔一周重复上述浸染步骤，共重复3次。本发明提供的决明COKI基因在提高植物耐盐及抗旱性中的应用，具有以下有益效果：
本发明首次发现决明COKI基因具有促进植物在盐及干旱胁迫环境下快速生长的用途，本发明也通过实验证明转入COKI基因并通过表达的植物在盐及干旱胁迫环境下，侧根长度更长，密度更高，其萌发率也得到显著提高，叶片相对含水量更高，同时植株高度也高于野生型植物。
该基因能够应用在农业与林业领域，提高植物对盐及干旱胁迫的耐受能力，并为抗盐及抗旱植物基因工程提供了候选基因。
附图说明
图1为本发明的技术流程图。
图2为重组载体COKI-pBI 121的图谱。
图3为显微镜下观察转COKI基因拟南芥与野生型拟南芥的侧根生长情况。
图4为COKI基因拟南芥与野生型拟南芥土培胁迫处理后植株生长表型。
图5为COKI基因拟南芥与野生型拟南芥胁迫处理后叶片相对含水量。
具体实施方式
本发明的技术流程图见图1，具体过程如下：
实施例1制备决明种子Kunitz蛋白酶抑制剂(COKI)基因、质粒
(1)提取总RNA：利用OMEGA公司提供的植物RNA提取试剂盒提取决明种子总RNA，对提取的决明种子总RNA进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测其提取质量和浓度。
(2)cDNA的合成：以得到的决明种子RNA为模板，OligodT(18)为引物，按照M-MLV逆转录酶说明书逆转录得到cDNA。
(3)设计引物：设计两条引物，分别加入保护碱基和相应的限制酶切位点，引物序列为：
COKIF(BamHI)：CGCGGATCCATGAAACTTGTAAAAATGGCTCC(SEQ ID NO：2)；
COKIR(SnaBI)：CCCTACGTATTAACTAGCAACGACTTGCTTG(SEQ ID NO：3)。
(4)PCR反应：以反转录得到的cDNA为模板，COKIF(BamHI)和COKI(SnaBI)为引物进行PCR反应。
反应体系如下：Prime Star Mix 25μl，cDNA 2μl，COKIF 1μl，COKIR 1μl，ddH2O21μl。PCR反应参数为：94℃预变性5min，94℃变性1min，64℃退火1min，72℃延伸2min，共35个循环，最后72℃复性10min，于4℃保存。
(5)胶回收：将PCR产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收747bp左右的扩增带，获得目的基因，其序列如SEQ ID NO：1所示。
(6)连接、转化：在目的基因末端加PolyA尾，将加PolyA完成的片段连接到pMD19-T载体上，转化E.coli DH5α感受态细胞，将阳性克隆菌送公司测序以确定扩增序列的正确性。
(7)制备pMD19-T-COKI质粒：将转化液接种于含氨苄青霉素(100μg/ml)抗性的固体LB平板，37℃，200rpm培养过夜，挑单菌落到含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB液体培养基中进行培养，然后用质粒小提试剂盒E.Z.N.A.TMPlasmid Mini Kits提取pMD19-T-COKI质粒。
(8)将胶回收片段连接到植物表达载体pBI 121上，然后转化E.coli DH5α感受态细胞，将转化液接种于含Kan(50μg/ml)的LB培养基中进行活化，对检测为阳性的菌液提取质粒，具体为采用质粒小提试剂盒E.Z.N.A.TM Plasmid Mini Kits提取pBI 121-COKI质粒。
实施例2pBI 121-COKI植物表达载体的构建与转化根癌农杆菌GV3101
由于BamHI和SnaBI酶的酶切条件不同，而且由pBI121质粒图谱看出，SnaBI酶切位点在β-glucuronidase中，产生平末端，因此我们选择单酶切来完成真核表达载体的构建。
pMD19-T-COKI质粒和pBI 121-COKI质粒同时进行单酶切，酶切体系如下：
用BamHI酶切：
Figure BDA0001524471620000041
50μl反应体系，30℃反应4h，不需要电泳检测，反应液直接回收纯化，得到30μl的回收产物。
用SnaBI酶切，酶切体系如下：
Figure BDA0001524471620000042
共50μl反应体系，37℃反应4h后，用1.3％琼脂糖凝胶电泳(10×Loading Buffer终止反应)切胶回收，纯化COKI和pBI 121。
由于单酶切后的载体pBI 121极容易发生自连，这就降低了载体与目的片段连接的效率，因此我们对单酶切后纯化的载体pBI121用碱性磷酸酶CIAP去磷酸化，将pBI 121的5’端突出的磷酸集团消化掉，使质粒自身不能形成环状结构。去磷酸化反应体系如下：
Figure BDA0001524471620000051
总共50μl，37℃反应30min，用苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)抽提2次，再用氯仿/异戊醇(24:1)抽提一次，添加5μl的3M醋酸钠(NaOAC)，然后加入125μl(2.5倍)的冷乙醇，在-20℃保冷1h后，离心回收沉淀，再用70％冷乙醇洗干净后，室温晾干，用15μl TB Buffer溶解沉淀，即为去磷酸化的pBI 121。
综上所述，将扩增出来的COKI基因序列和pBI 121载体分别用BamHI和SnaBI双酶切消化，获得一端粘性末端、另一端为平端的片段，用T4DNA连接酶连接两个片段，获得连接好的重组质粒，其图谱见图2，反应体系与反应条件如下：
Figure BDA0001524471620000052
总共25μl体系，16℃连接8-12h。
随后，将连接液转化到根癌农杆菌GV3101感受态细胞中，涂布于含有卡那霉素(50μg/ml)抗性的LB固体培养基中，筛选阳性转化子，挑单菌落于含卡那霉素和利福平(50μg/ml)的LB液体培养基中，于28℃，200rpm培养28h后，进行菌液PCR鉴定，并提质粒做双酶切鉴定。最后将初步检测正确的部分转化子送出去测序，以确保COKI-pBI121成功转化到根癌农杆菌GV3101中，部分加20％甘油低温保菌。
实施例3浸染拟南芥及转COKI基因拟南芥的筛选
挑选重组型根癌农杆菌单菌落于LB液体培养基(含有50μg/ml的卡那霉素和50μg/ml的利福平)中，于28℃，220rpm培养27h左右后扩大20倍，在相同条件下培养到OD600为0.7左右时取出，于5000g离心15min，收集含pBI 121-COKI重组质粒的GV3101菌液，将培养基吸干净。
配制400ml含5％蔗糖的1/2MS培养基，pH调到5.8，定容后加0.025％的SilwetL-77(100μl)，混匀。用1/2MS培养基反复吹打上述离心获得的含重组质粒的GV3101，直到菌体与培养基完全混匀。
采用花序浸染法转化拟南芥：培养野生型拟南芥种子至长出4片真叶后移栽到灭过菌的营养土中，待长出许多花序后，将拟南芥整个花序浸没到上述含有重组质粒的GV3101的1/2MS培养基中，每隔2-3s取出，浸染3次，用干燥滤纸吸掉多余菌液后，用保鲜膜包裹密封。黑暗培养24h后去掉保鲜膜，插入小棍防止花序倒伏，于正常条件培养。每隔一周重复上述浸染步骤，共重复3次，以提高拟南芥的转化效率。大概1个月后，收获种子，即为T0代种子。将T0代种子置于含卡那霉素(50μg/ml)的1/2MS培养基中进行抗性筛选培养，筛选直至获得T2代及以后转COKI基因拟南芥。
转COKI基因拟南芥的分子鉴定：提取转基因拟南芥的总DNA，以COKI基因特异性引物(COKIF：ATGAAACTTGTAAAAATGGCTCC，COKIR：TTAACTAGCAACGACTTGCTTG)进行PCR鉴定，PCR产物经测序以确定阅读框的正确，确认COKI基因已整合到拟南芥基因组中。同时，提取转基因拟南芥的总RNA，反转录，以COKI基因特异性引物(COKIF：ATGAAACTTGTAAAAATGGCTCC，COKIR：TTAACTAGCAACGACTTGCTTG)进行PCR鉴定，PCR产物经测序以确定阅读框的正确，确认COKI基因已在转基因拟南芥中获得表达。
实施例4转COKI基因拟南芥在盐及干旱胁迫条件下侧根的生长情况
在含1/2MS培养基的琼脂板中分别萌发转COKI基因拟南芥种子与对照拟南芥种子，4℃暗藏48h，培养5天(培养条件25℃，光照16小时，黑暗8小时，湿度80％)。
种子萌发后，将幼苗平行转入到含有1％的聚乙二醇6000的1/2MS培养基模拟干旱胁迫，培养8天(培养条件同上)。取琼脂板表面上生长的根系，用直尺直接测量主根长，用根系扫描分析仪(WinRHIZO)测定根总长，侧根长度为根总长减去主根长度，计算结果为转COKI基因拟南芥侧根长度为野生型拟南芥侧根长度的1.246倍，表明在干旱胁迫条件下，COKI基因能够显著促进拟南芥侧根的生长。
种子萌发后，将幼苗平行转入到含有100mmol/L的NaCl的1/2MS培养基模拟盐胁迫，培养8天(培养条件同上)。取琼脂板表面上生长的根系，用直尺直接测量主根长，用根系扫描分析仪(WinRHIZO)测定根总长，侧根长度为根总长减去主根长度，计算结果为转COKI基因拟南芥侧根长度为野生型拟南芥侧根长度的1.577倍，表明在盐胁迫条件下，COKI基因能够显著促进拟南芥侧根的生长。
由于根系扫描仪只能分析目视条件下的根生长情况，因此采用显微镜下(放大倍数为100倍)对根系进行放大观察，结果发现相对于野生型拟南芥，转COKI基因拟南芥的侧根密度更高，数量更多，结果见图3，图中左侧为转COKI基因拟南芥的侧根生长情况，右侧为野生型拟南芥侧根生长情况，A为干旱胁迫条件下侧根生长情况，B为盐胁迫条件下侧根生长情况。
实施例5转COKI基因拟南芥对盐及干旱胁迫条件的耐受性
1、在盐及干旱胁迫条件下转COKI基因拟南芥与野生型拟南芥的萌发情况。
采用NaCl溶液模拟盐胁迫：将无菌拟南芥种子播种于含100mM与150mM NaCl的1/2MS固体培养基中，每皿播种100粒饱满的转基因种子和野生型种子，于25℃、16h光/8h暗条件下培养。以芽长超过2mm计为发芽，定期统计发芽率。
以PEG6000模拟干旱胁迫：将无菌拟南芥种子播种于含终浓度为2％与3％的PEG6000的1/2MS固体培养基中，于25℃、16h光/8h暗条件下培养。以芽长超过2mm计为发芽，定期统计发芽率。
萌发率实验结果表明，转COKI基因拟南芥在干旱、盐胁迫条件下的萌发率均超过野生型拟南芥。其中100mM NaCl胁迫条件下，转COKI基因拟南芥的萌发率是野生型拟南芥的111％；150mM NaCl胁迫条件下，转COKI基因拟南芥的萌发率是野生型拟南芥的148％；2％PEG模拟干旱胁迫条件下，转COKI基因拟南芥的萌发率是野生型拟南芥的118％；3％PEG模拟干旱胁迫条件下，转COKI基因拟南芥的萌发率是野生型拟南芥的218％。
2、将转COKI基因拟南芥与野生型拟南芥分别栽培于土质培养基中，分别测定盐及干旱胁迫条件下植株高度。
在含有1/2MS培养基的琼脂板中分别加入转COKI基因拟南芥种子与对照拟南芥种子，4℃暗藏48h，培养5天(培养条件25℃，光照16小时，黑暗8小时，湿度80％)，萌发种子。种子萌发后，将幼苗平行转入到混合培养基质[m(沙石)：m(蛭石)：m(泥碳)＝1.5：1：1]中使其自然生长(培养条件25℃，光照12小时，黑暗12小时，湿度80％)，以Hoagland营养液培养。培养8d后对幼苗进行盐及干旱胁迫处理，盐胁迫条件为100mM与150mM的NaC1溶液；干旱胁迫条件为2％与3％的PEG，定期测量植物株高。
100mM NaCl模拟盐胁迫8天后，测定转COKI基因拟南芥与野生型拟南芥的植株高度，发现转COKI基因拟南芥的植株高度是野生型拟南芥的150％；150mM NaCl模拟盐胁迫4天后，转COKI基因拟南芥的植株高度是野生型拟南芥的128％；采用2％PEG模拟干旱迫8天后，转COKI基因拟南芥的植株高度是野生型拟南芥的111％；3％PEG模拟干旱胁迫4天后，转COKI基因拟南芥的植株高度是野生型拟南芥的114％，结果如图4所示，为干旱及盐胁迫条件下，野生型和转基因拟南芥的植株生长表型情况。
3、将转COKI基因拟南芥与野生型拟南芥分别栽培于土质培养基中，分别测定盐及干旱胁迫条件下叶片失水率。
在含有1/2MS培养基的琼脂板中分别加入转COKI基因拟南芥种子与对照拟南芥种子，4℃暗藏48h，培养5天(培养条件25℃，光照16h，黑暗8h，湿度80％)，萌发种子。种子萌发后，将幼苗平行转入到混合培养基质[m(沙石)：m(蛭石)：m(泥碳)＝1.5：1：1]中使其自然生长(培养条件25℃，光照12h，黑暗12h，湿度80％)，以Hoagland营养液培养。培养8天后对幼苗进行盐及干旱胁迫处理，盐胁迫条件为100mM与150mM的NaC1溶液；干旱胁迫条件为2％与3％的PEG，定期测定叶片相对含水量。
采叶片，称其叶片鲜重(FW)；再将叶片放于蒸馏水中至饱和，用吸水纸吸干表面水，称重，记录，再次将叶片放回蒸馏水中，重复操作，称重，直到叶重不再增加，称水饱和叶重(SPW)；最后将叶片于105℃，干燥30min，然后在80℃干燥至叶重恒定，记录干燥叶重(DW)。
根据公式计算相对含水量：RWC＝(FW-DW)/(SPW-DW)*100％
100mM NaCl模拟盐胁迫8天后，测定转COKI基因拟南芥与野生型拟南芥叶片的相对含水量，发现转COKI基因拟南芥的叶片相对含水量是野生型拟南芥的108％；150mM NaCl模拟盐胁迫4天后，转COKI基因拟南芥的叶片相对含水量是野生型拟南芥的104％；采用2％PEG模拟干旱迫8天后，转COKI基因拟南芥的叶片相对含水量是野生型拟南芥的109％；3％PEG模拟干旱胁迫4天后，转COKI基因拟南芥的叶片相对含水量是野生型拟南芥的105％，叶片相对含水量如图5所示。
序列表
<110> 西南交通大学
<120> 决明COKI基因在提高植物耐盐及抗旱性中的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 747
<212> DNA
<213> Cassia obtusifolia L
<400> 1
atgaaacttg taaaaatggc tccaagagca ctcttcttct tcttcttctt cttcttcctc 60
ttgcttgcct tattcgccac aaaacttcca atattagcct cctcagacca aaacgtagtt 120
gacgcttttg gccaaccaat cttcgcaagt aagcaatact acatcatttc agccatcttc 180
gacgcaggag ctggcggcgg ggttaaacct ggaaattcaa cgaacgaatc atcagaacct 240
tctggaacca tctgcccgct ctccgtcatc caagacaact ccgatgtcga aaacggcgag 300
cccgtaactt tcaccatcat tccgaaacta cccctggcag gcccggccca gggaagaatc 360
tccacgggga cagaactggg aatcgccttc gcggagaagc ccgagtgcgc ggaatcctcc 420
gagtgggccg tgttcgcggg tctttcgaac aggtcgtggg tgggtatcgg gggcccaaaa 480
gcccacccgg aggaggagct ggtgggtggg tttttcaaga tagagaaatc gggcctctca 540
ttgtcctaca aacttgtgtt ttgtcccacc gaaacgacgt cggttaatac tgaaggcttc 600
tgttctgatg ttggaattga taataagaat ggagtgagac gtttggtatt ggatggtgat 660
agtgtcttcc atgtcatttt cttgaatgtt cttgaggcta attatgcaag atcctttaat 720
tacatcaagc aagtcgttgc tagttaa 747
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgaaacttg taaaaatggc tcc 23
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttaactagca acgacttgct tg 22

Claims (5)

1.决明COKI基因在提高植物耐盐及抗旱性中的应用；所述决明COKI基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.根据权利要求1所述的决明COKI基因在提高植物耐盐及抗旱性中的应用，其特征在于，具体过程包括：提取决明COKI基因，将该基因连接到植物表达载体上，并转化感受态细胞，制得包含该基因的重组质粒，将重组质粒浸染植物，使该基因在植物细胞中得以表达。
3.根据权利要求2所述的决明COKI基因在提高植物耐盐及抗旱性中的应用，其特征在于，所用植物表达载体为pBI 121，感受态细胞为根癌农杆菌GV3101。
4.根据权利要求2所述的决明COKI基因在提高植物耐盐及抗旱性中的应用，其特征在于，采用花序浸染法浸染植物。
5.根据权利要求4所述的决明COKI基因在提高植物耐盐及抗旱性中的应用，其特征在于，培养野生型植物至长出花序，将整个花序浸没到含有重组质粒的培养基中，每隔2-3s取出，浸染3次，用滤纸吸掉花序上多余液体后，再用保鲜膜包裹密封花序，黑暗培养24h后去掉保鲜膜，进行正常培养，每隔一周重复上述浸染步骤，共重复3次。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Isolation，structure modeling and function characterization of a trypsin inhibitor from Cassia obtusifolia;Zubi Liu et al.;《Biotechnol Lett》;20141206;第37卷;摘要和第868页 *
决明胰蛋白酶抑制剂 2 基因的克隆与不同胁迫条件下的表达模式;丁超琼 等;《西南农业学报》;20170228;第30卷(第2期);摘要和253页最后一段和图6 *

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