CN104498508A - 小麦渐渗系应答非生物胁迫调控基因TaGBF及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小麦渐渗系应答非生物胁迫调控基因，是小麦体细胞杂种渐渗系山融3号碱性亮氨酸拉链蛋白基因TaGBF，该基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明还公开了含有所述基因的植物表达载体pSTART/TaGBF、pCambia3626-bar/TaGBF或pGA3426-RNAi-hph/TaGBF。本发明还公开了基因TaGBF及含有该基因的植物表达载体在培育耐盐或耐旱植物中的应用。实验证明，本发明中的RNAi干扰系转基因小麦的抗非生物胁迫能力明显提高。

Description

小麦渐渗系应答非生物胁迫调控基因TaGBF及其应用

技术领域

本发明涉及小麦盐、旱调控基因及其应用，尤其涉及小麦渐渗系应答非生物胁迫调控基因TaGBF及其应用，属于生物基因工程技术领域。

背景技术

小麦是一种重要的粮食作物，中国小麦每年播种面积也达4.3亿亩以上，它的生产状况直接关系到中国经济的发展和人民生活水平的提高，但是干旱、盐渍等非生物逆境严重影响其生长发育和产量，因此选育耐逆的小麦新品种，进而开发利用盐渍化土壤，扩大小麦类种植面积，提高单位产量，已成为当前一个十分迫切的任务。

除了传统育种方法外，利用基因工程和细胞工程等新技术可以快速稳定地获得具有优良抗逆能力的小麦新品种。利用转基因技术将新的抗逆相关功能基因转入到小麦中，以此高效开发抗逆转基因小麦新品种，用于在干旱或盐渍化地区种植是一项具有广阔应用前景的技术。其前提是，必须较系统地了解小麦抗逆机制，分离高效的与抗逆相关的基因。

多年来，有关植物抗逆机制方面的研究已取得了较大的进展，克隆了与植物胁迫相关基因，为进一步阐明植物抗旱的分子机制提供了理论线索和依据。一些实验表明，将植物本身以及其他生物中与抗逆相关的基因转入植物中，其异源转录和翻译产物可以使转基因植物的抗逆能力发生改变。用于转化的功能基因包括两类：一类为与植物抗逆相关的功能基因，通过过表达或者基因敲出的方法直接提高植物的抗逆能力；另一类是与植物抗逆信号通路相关的调控基因，将这类基因在植物中表达同样可以提高植物耐逆性，而且效果可能更加明显。

目前，已发现了一些能显著改变植物抗逆能力的基因，其中转录因子作为植物抗逆信号通路中的枢纽，被越来越多的人所关注。研究表明，将这些基因转化到植物中，可以明显改变植物的抗性。

bZIP家族蛋白是一类非常重要的转录因子，在植物的生长，发育以及代谢过程中均起到较为重要的作用，近年来已有试验表明，许多bZIP蛋白参与植物对多种非生物胁迫的响应过程，调控与胁迫相关基因的转录。但是有关bZIP家族G亚族的转录因子在盐、旱非生物胁迫响应中的作用尚未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种小麦渐渗系bZIP基因即小麦渐渗系应答非生物胁迫调控基因TaGBF及其应用。

本发明所述的小麦渐渗系应答非生物胁迫调控基因TaGBF，其特征在于：所述基因为小麦体细胞杂种渐渗系山融3号碱性亮氨酸拉链蛋白基因TaGBF，该基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了含有上述小麦渐渗系应答非生物胁迫调控基因TaGBF的植物表达载体，其特征在于：所述植物表达载体是pSTART/TaGBF、pCambia3626-bar/TaGBF或pGA3426-RNAi-hph/TaGBF。

本发明所述的小麦渐渗系应答非生物胁迫调控基因TaGBF在培育耐盐或耐旱植物中的应用。进一步的，本发明所述含有基因TaGBF的植物表达载体pSTART/TaGBF、pCambia3626-bar/TaGBF或pGA3426-RNAi-hph/TaGBF在培育耐盐或耐旱植物中的应用。其中，所述植物优选是普通小麦或拟南芥。

具体的，本发明从小麦体细胞杂种渐渗系山融3号中分离得到了一种小麦bZIP家族G亚族基因TaGBF(该基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示)，以常规方法构建双子叶植物表达载体pSTART/TaGBF转化模式植物拟南芥，鉴定基因的功能，并进一步构建单子叶植物表达载体pCambia3626-bar/TaGBF或pGA3426-RNAi-hph/TaGBF转化普通小麦(扬麦20)，鉴定此基因在小麦抗逆中的作用。

实验证实，将本发明所述基因TaGBF导入植物细胞，使其在植物中表达量降低就可以使转基因植物获得耐盐能力。进一步明确了所述基因TaGBF在培育耐盐植物中的应用。预示本发明成果可广泛用于培育抗逆农作物新品种，并为深入阐明植物抗逆机制提供理论依据。

本发明的有益效果是：利用现有的植物基因工程技术，本发明首次克隆得到了小麦渐渗系山融3号应答非生物胁迫新基因TaGBF，并通过小麦生长点转化法将该基因转入小麦，经过比较分析证明，RNAi干扰系的转基因植株的耐盐能力明显增强。有望为创造新型耐盐植物，提高植物耐盐能力，改良作物品种提供有力的帮助。

附图说明

图1TaGBF基因全长cDNA序列的扩增结果。

图2TaGBF在光、氯化钠、聚乙二醇、脱落酸处理下山融3号中的实时定量qRT-PCR分析。

其中：Light是在光处理下的结果图；NaCl是在氯化钠处理下的结果图；PEG是在聚乙二醇处理下的结果图；ABA是在脱落酸处理下的结果图。

图3TaGBF转基因拟南芥植株基因表达量的qRT-PCR鉴定。

其中：WT：野生型对照；OX-17，OX-18,OX-22：过表达转基因拟南芥(下同)。

图4TaGBF转基因拟南芥在含有NaCl、Mannitol(甘露醇)、ABA培养基上的萌发情况。

图5TaGBF转基因拟南芥幼苗1/2MS及在含有NaCl、Mannitol(甘露醇)、ABA培养基上的生长情况。

其中：A为在1/2MS培养基上的生长状况，B为在含有NaCl的培养基上的生长状况，C为在含有甘露醇的培养基上的生长状况，D为在含有ABA的培养基上的生长状况。

图6TaGBF转基因拟南芥中抗逆相关Marker基因分析

其中：ABA1,ABA2,NCED3均为ABA合成相关的Marker基因,ABI5为ABA信号转导相关的Marker基因。

图7TaGBF转基因小麦植株的qRT-PCR鉴定。

其中：YangMai：扬麦；OE：小麦过表达系；RNA：小麦RNAi干扰系(下同)。

A图是小麦过表达系的基因表达量检测结果，B图是小麦RNAi干扰系的基因表达量检测结果。

图8TaGBF转基因小麦植株在200mM NaCl培养基上的生长情况。

其中：YangMai：扬麦；OE：小麦过表达系；RNA：小麦RNAi干扰系。

具体实施方式

实施例1、小麦山融3号TaGBF的克隆

1.1植物材料的处理

1)将小麦种子(山融3号)在4℃春化20天

2)用70％酒精处理种子2-3分钟。

3)弃去酒精，用无菌水洗3-5次，每次充分振荡混匀。

4)用无菌水浸泡种子，避光，25℃，40-60rpm/min，摇床孵育过夜。

5)将种子正面向上，摆放在用无菌水充分润湿的滤纸上，避光萌发。

6)3天后将种子转移到培养篮中，1/2Hoagland，水培，置于23℃，长日照的培养间生长至两叶一心期。

1.2小麦RNA提取

1)将超低温冻结的30-50mg RNA提取样品称量后迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状(无明显的可见颗粒，如果没有研磨彻底会影响RNA的收率和质量)。

2)将粉末状RNA提取样品小心而快速的转移到液氮预冷的2ml离心管中，加入适量的1.5ml RNAiso Reagent，震荡混匀，此时裂解液呈透明状，室温静置5分钟。

3)12,000g 4℃离心5分钟。

4)小心吸取上清液，移入新的2ml离心管中(切勿吸取沉淀)。

5)加入氯仿(RNAiso Reagent的1/5体积量)，盖紧离心管盖，用力震荡(氯仿沸点低、易挥发，振荡时应防止离心管盖突然弹开)。待充分乳化溶液呈乳白状(无分相现象)后，再室温静置5分钟。

6)12,000g 4℃离心15分钟。

7)从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。吸取上清液转移至另一新的1.5ml离心管中(切忌吸出白色中间层)。

8)向上清液中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在15～30℃下静置10分钟。

9)12,000g 4℃离心10分钟。一般在离心后，试管底部会出现白色沉淀。

10)小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入75％的乙醇l ml(切勿触及沉淀)，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，12,000g 4℃离心5分钟后小心弃去乙醇(为了更好地控制RNA中的盐离子含量，应尽量除净乙醇)。

11)室温干燥沉淀2～5分钟(不可以离心或加热干燥，否则RNA将会很难溶解，有关RNA溶解可以参考Troubleshooting中的相关说明)，加入适量的RNase-free水溶解沉淀，必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后用于后续试验或于-80℃保存。

12)RNA质量检测：a)通过测定OD260、OD280、OD230的吸收值计算RNA的含量及纯度；b)1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA是否降解；c)RNA直接进行PCR检测是否存在DNA污染。

1.3cDNA第一链的快速扩增

1)Microtube管中配制下列模板RNA/引物混合液，全量6μl。

模板RNA(total RNA)           5μg

Oligo(dT)18primer(50μM)     1μl

RNase free dd H₂O            Up to 13.5μl

2)70℃保温10分钟后迅速在冰上急冷2分钟以上。

3)离心数秒钟使模板RNA/引物的变性溶液聚集于Microtube管底部。

4)在上述Microtube管中配制下列反转录反应液。

5)42℃保温1小时。

6)70℃保温15分钟后冰上冷却，得到的cDNA溶液可直接用于2nd-Strand cDNA的合成或者PCR扩增等，PCR扩增时cDNA溶液的使用量建议使用1μl～5μl。

1.4TaGBF的克隆

1)根据基因芯片的检测结果，获得TaGBF的部分序列。

设计两对基因特异引物(序列如下)：

TaGBFS：5'ATGGCGCATGATGAAGC 3'

TaGBFA：5'TCAGTTTGCAGCCACGAC 3'

2)以山融3号全长cDNA文库为模版，利用上述引物克隆获得TaGBF基因全长序列。

1.5TaGBF的PCR扩增

1)引物序列：见1.3部分。

2)PCR反应体系(20μL)：

3)PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃复性30sec，72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸7min。

4)扩增片段的回收后与T载体连接、转化大肠杆菌、选取阳性克隆测序。

结果见图1。

实施例2、TaGBF的表达分析

2.1胁迫下RNA的提取

山融3号种子正常萌发，Hoagland培养液培养至两叶一心期时(约3周时间)开始进行干旱(18％PEG)、盐胁迫(200mM NaCl)、冷、ABA处理。处理不同时间后，Trizol法提取幼苗根、叶RNA同上1.2所述。

2.2逆转录获得cDNA

逆转录产生cDNA同上1.3所述。

2.3qRT-PCR反应

1)以cDNA为模板，进行PCR反应。引物如下：

qRTs：TGAGACAGAGGAATTGGCCACAC

qRTa：CAACTGCTGATTTGTCCAGAGGC

PCR体系：

2)qRT-PCR程序：

95℃5min；40cycles 95℃15s，60℃15s,72℃20s。

结果见图2。

实施例3、双子叶植物表达载体的构建

植物表达载体pSTART是含有35S启动子和NPTⅡ基因的双元载体，在其多克隆位点上含有限制性内切酶BamHI和SacI的识别位点。据此在目的基因起始密码上游和终止密码下游设计含BamHI和SacI识别序列的引物，用高保真Taq酶扩增目的基因，体系同1.4。

用限制性内切酶BamHI和SacI对载体pSTART和目的基因扩增产物片断分别进行酶切。完全酶切的载体在1％琼脂糖凝胶上电泳分离后，经胶回收，与酶切的目的基因扩增片段相连。

酶切体系，

1)质粒或基因扩增产物BamHI和SacI双酶切

于37℃恒温水浴锅酶切2小时以上。将酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。在紫外透射仪下用洁净刀片切下pSTART大片段和目的基因条带，回收。

2)经酶切的载体片段和目的基因片段以摩尔比1:4的比例进行16℃连接过夜。

3)连接产物热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化菌在含Kan 50μg/ml的LB固体平板上37℃培养16小时左右。

4)重组子的鉴定

A.载体特异引物的合成

为了鉴定目的基因的插入方向，根据35S启动子序列设计一个载体特异引物，序列如下：GTT GGG GTT TCT ACA GGA CGT

B.重组质粒的PCR验证

挑取在kan培养基上的抗性单菌落分别接种于5ml含Kan的LB液体培养基中37℃振荡培养过夜，碱变性法提取质粒，用载体特异引物和基因的下游引物进行PCR扩增，体系同1.5。PCR反应条件如下：预变性94℃5min，35个循环为：94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，最后，72℃延伸10min。PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

C.质粒酶切鉴定

提质粒进行BamHI和SacI酶切，酶切体系同上。1％琼脂糖凝胶电泳，检测是否含有预期分子量大小的片段，验证载体的正确构建。

实施例4、单子叶植物表达载体的构建

植物表达载体pCambia3626-bar/TaGBF和pGA3426-RNAi-hph/TaGBF是含有ubiquitin启动子表达载体。

pCambia3626-bar/TaGBF的构建：在pCambia3626-bar/TaGBF多克隆位点上含有限制性内切酶BamHI和SacI的识别位点。据此在目的基因起始密码上游和终止密码下游设计含BamHI和SacI识别序列的引物，用高保真Taq酶扩增目的基因，用限制性内切酶BamHI和SacI对载体pCambia3626-bar/TaGBF和目的基因扩增产物片断分别进行酶切。完全酶切的载体在1％琼脂糖凝胶上电泳分离后，经胶回收，与酶切的目的基因扩增片段相连。转化大肠杆菌感受态，用载体上的引物ccctgccttcatacgct和基因下游引物进行PCR鉴定，用BamHI和SacI进行酶切验证，相关方法同实施例3。

pGA3426-RNAi-hph/TaGBF的构建：用末端含有KpnI酶切位点GGGGTACC的引物扩增基因序列，将扩增获得的序列及pGA3426用KpnI进行酶切、回收后，连同氨苄抗性基因(由pGA3720用SmaI进行酶切、回收获得)在16℃连接过夜。转化大肠杆菌感受态，用引物ccctgccttcatacgct和ggcaactatggatgaacgaaat进行PCR及测序鉴定，相关方法同实施例3。

实施例5、农杆菌感受态的制备与转化

5.1农杆菌EHA105感受态的制备

1)从YEP平板(含50μg/ml利福平)上挑取根癌农杆菌单菌落，接种于含50μg/ml。

2)利福平的YEP液体培养基中，200rpm/min，28℃培养过夜。

3)取2ml过夜培养液接种于50ml含相同抗生素的YEP液体培养基中在相同条件下培养至OD₆₀₀达0.5。

4)菌液冰浴30min，4℃，5000rpm离心10min，收集菌体。

5)将菌体重悬于冰浴的10ml 0.15mol/L的NaCl中，离心收集菌体。

6)再悬浮于1ml 20mmol/L冰预冷的CaCl2溶液中，以200μl/管将菌液分装在1.5ml。

7)Eppendorf管中，置液氮中速冻1min，-70℃保存备用。

5.2冻融法转化根癌农杆菌EHA105

1)在室温下融化两管农杆菌感受态细胞，分别加入1μg表达载体质粒DNA和1μg空载体，混匀后冰浴30min。

2)置液氮速冻1min，迅速移至37℃温浴3min。

3)加入无抗生素的YEP 800μl，28℃震荡培养3hr。

4)7000rpm离心30s收集菌体，涂于含50μg/ml利福平、50μg/ml Kan的YEP平板上，28℃倒置暗培养2-3天。

5.3菌体PCR鉴定

菌体PCR方法及程序同上1.5所述。

实施例6、拟南芥转化及筛选

6.1拟南芥种植

取拟南芥(哥伦比亚野生型)种子，置于垫有滤纸的平皿内,用少量蒸馏水润湿滤纸，于4℃冰箱进行春化处理，3-5天后播种于育苗盘内，放置于人工气候箱内(16h光照，22℃/8h黑暗，18℃)，生长6－8周后，待抽苔开花时用于转化。

6.2拟南芥转化

1)转化前一天，取2ml活化的农杆菌加到含相应抗生素的200ml YEP培养基中，过夜培养至OD₆₀₀＝1.0-1.2。

2)离心收集菌体，并重悬于浸染液(5％蔗糖，0.04％Silwet L-77)中，使OD₆₀₀＝0.8。

3)将花序浸入浸染液30秒，其间前后摆动花序，使花序上形成一层膜。

4)用保鲜膜覆盖花序，暗培养一天后揭去保鲜膜，继续置人工气候箱使其生长。

5)隔5-7天再用相同的方法浸染一次。

6)大约一个月后收获种子。

7)空载体的转化同样采用6.2所述方法。

6.3拟南芥转化阳性株系筛选

1)收获的T0代种子消毒后(75％乙醇5min，清洁剂洗涤10-15min，无菌水冲洗3－5次)，铺于含50μg/mL Kan的MS筛选培养基上。

2)4℃春化48h，移到培养室(16h光照/8h黑暗，22℃恒温)生长7-10天。将抗性绿色小苗移到土中继续生长。

3)等植物绝大多数花苞已经结荚时，用小绳将植物单株绑起，以便单株收获T1代种子。

4)重复步骤1)－3)，将单株收获的T1代种子继续在含卡那的MS培养基上进行筛选，挑选抗性比为3:1的单插入独立株系移栽，并单株收获种子得到T2，继续重复步骤1)－3)，直至T2代单株种子在卡那抗性培养基上不再分离，至此得到纯合的T2代植株用于后续的进一步研究。空载体纯合体的筛选同样采用6.3所述方法。

5)提取空载体对照及不同转基因株系的总RNA并逆转录合成cDNA。

6)PCR扩增：以上述不同材料的第一链cDNA为模板，进行qRT-PCR验证表明，TaGBF在转化植株中正常表达。结果见图3。

实施例7、转TaGBF拟南芥的抗性分析

7.1萌发抗性分析

将空载体对照、转TaGBF的过表达拟南芥种子经消毒(方法同上6.3.1所述)后，铺入1/2MS及含150mM NaCl,200mM Mannitol及0.5μM ABA的MS培养培养基中萌发，观察不同株系的萌发差异，结果见图4；

7.2拟南芥幼苗抗性分析

1)将空载体对照、转TaGBF的过表达拟南芥种子经消毒(方法同上6.3.1所述)后，铺入1/2MS培养基上萌发；

2)将萌发7天的幼苗转移至含150mM NaCl，200mM Mannitol及3μM ABA的1/2MS培养基中垂直培养，观察幼苗生长差异。以不含任何胁迫成分的MS培养基为对照结果见图5。

7.3转TaGBF拟南芥幼苗中抗逆相关Marker基因分析

1)拟南芥种子消毒、萌发、培养(方法同上6.3.1所述)；

2)将萌发后3天的对照及转基因株系样品，提取总RNA，逆转录形成cDNA，进行qRT-PCR分析。方法同实施例2，结果见图6。

实施例8、小麦转化及转基因植株筛选

8.1小麦种子的萌发

1)取饱满完好的小麦种子进行灭菌，用70％乙醇浸泡30sec，再用0.1％HgCl₂浸泡15min。浸泡期间不断晃动种子，以保证表面灭菌彻底，然后用无菌水冲洗4-5次。

2)灭菌后种子放在无菌的培养皿中，加适量无菌水15-35℃黑暗条件下萌发。

8.2小麦的转化

1)转化前一天，取2ml活化的农杆菌加到含相应抗生素的200ml YEP培养基中，过夜培养至OD₆₀₀＝1.0-1.2。

2)离心收集菌体，并重悬于浸染液(含0.2％AS)中，使OD₆₀₀＝0.8。

3)用刀片剥离备用黄化苗的胚芽鞘及幼叶使之暴露茎尖生长点，并用解剖针尖轻微挫伤其生长点细胞。

4)将配制好的菌体浸染液用1ml注射器缓慢滴加在无菌苗露出的生长点顶端，浸泡并缓慢渗入。

5)黑暗条件下，温度控制在17-28℃共培养2-4d，至植株顶端重新长出新叶。

6)将植株用清水洗掉菌体，移栽到装有灭菌蛭石的花盆中，保持适宜温度(18-23℃)和湿度，最后将存活植株温室盆栽。

8.3小麦转化阳性株系筛选

1)CTAB法提取小麦的基因组DNA，载体引物和基因下游引物进行PCR扩增检测

2)阳性植株收获的T1代种子种植后长出幼苗，继续进行基因组PCR检测，至T2代。

3)提取野生植株和转基因植株的RNA进行real-time PCR检测，结果见图7.

实施例9、转TaGBF小麦耐盐性分析

将对照、两个株系的转TaGBF小麦种子经消毒(方法同上6.3.1所述)后，萌发，之后转移至在Hoagland培养液中培养10天，方法见1.1；

在第11、12、13、14天，分别将培养液更换为含有50mM、100mM、150mM、200mMNaCl的1/2Hoagland培养液，此后继续使用含200mM NaCl的1/2Hoagland培养液培养小麦4天，观察小麦表型。对照组小麦始终使用1/2Hoagland培养液培养。

结果见图8。.

Claims (5)

1.一种小麦渐渗系应答非生物胁迫调控基因TaGBF，其特征在于：所述基因为小麦体细胞杂种渐渗系山融3号碱性亮氨酸拉链蛋白基因TaGBF，该基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.含有权利要求1所述基因的植物表达载体，其特征在于：所述植物表达载体是pSTART/TaGBF、pCambia3626-bar/TaGBF或pGA3426-RNAi-hph/TaGBF。

3.权利要求1所述小麦渐渗系应答非生物胁迫调控基因TaGBF在培育耐盐或耐旱植物中的应用。

4.权利要求2所述植物表达载体pSTART/TaGBF、pCambia3626-bar/TaGBF或pGA3426-RNAi-hph/TaGBF在培育耐盐或耐旱植物中的应用。

5.如权利要求3或4所述的应用，其特征在于：所述植物是普通小麦或拟南芥。