CN101851282B - 植物耐逆性相关蛋白MtCBF4及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物耐逆性相关蛋白MtCBF4及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质，是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。MtCBF4基因参与截型苜蓿的盐胁迫和干旱胁迫应答反应。将MtCBF4基因导入出发植物，可以得到耐逆性显著高于出发植物的转基因植物，本发明对于培育耐盐、耐干旱的转基因豆科作物具有重要价值。

Description

植物耐逆性相关蛋白MtCBF4及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及一种植物耐逆性相关蛋白MtCBF4及其编码基因和应用。

背景技术

作为世界上影响粮食产量和质量的主要负面因素之一，盐胁迫对很多作物都会产生危害。在盐胁迫条件下，作物的生长、发育和生物量都会受到很大的影响，尤其是某些依赖于灌溉的作物减产更为明显。世界上大约有超过五分之一的耕地受到盐胁迫的威胁，而且在全球人口增长和环境污染日趋严重的大背景下，土地的盐碱化问题愈发突出，并开始成为社会经济正常发展的阻力。

植物对自然环境中盐胁迫的适应是一个复杂的过程，依赖于一系列分子网络的级联激活，即：盐胁迫的感应、感应信号的传导、特定的与胁迫有关的基因的表达及代谢产物的合成，进而达到细胞内离子平衡的重新建立以及相关蛋白和膜系统的结构及功能的保护和恢复，最后使植物获得对盐胁迫的耐受或抵抗。因此，可以利用这些基因，通过基因工程手段，提高植物对胁迫的耐受性。

植物的耐盐性是一个复杂的数量性状，涉及到许多基因的表达和协调。目前已知的耐盐基因可分为四大类。第一类是参与信号传导和转录控制的基因，第二类是直接参与蛋白和膜保护的基因，第三类是参与水和离子吸收和运输的蛋白，第四类与胁迫有关的基因通过参与基因转录后调控和翻译后调控而发挥作用。尽管获得了许多耐盐相关基因，但是，这些基因大多来自模式生物拟南芥，由于在不同物种之间，耐盐基因的表达模式有显著差异，拟南芥的耐盐基因转化其他植物，不一定能使这些植物具有耐盐表形，所以，需要深入研究多种植物的耐盐机制，挖掘耐盐基因。

就世界范围而言，豆科现在已成为仅次于禾本科的重要植物类群。豆科是世界上第三大开花植物，既是动物和人类获得蛋白质的重要来源，又是食用油和工业用油的重要来源。因此，研究豆类植物有重要的经济意义和实用价值。截形苜蓿是豆科的模式植物之一，与其他豆类植物相比，具有相对小的二倍体基因组(大约4.5×10⁸bp)、自花授粉、后代种子多、生长周期较短和易于组织培养等特点，截形苜蓿基因组的框架已经测完，正在填充框架之间的序列。将拟南芥，截形苜蓿和大豆进行基因组水平的比较。发现大豆与截形苜蓿之间，有两大区域表现为线性；并且与拟南芥也有一系列线性关系的区域存在。其中，高达75％的大豆基因表现为与截形苜蓿的共线性。而只有某些区域，拟南芥才与大豆有比较高的共线性。因此，研究豆科模式植物截型苜蓿的耐盐机制，挖掘苜蓿耐盐相关基因，对于培育耐盐的豆科植物有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供植物耐逆性相关蛋白MtCBF4及其编码基因和应用。

本发明提供的植物耐逆性相关蛋白(MtCBF4)，为一种转录因子，来源于截型苜蓿(Medicago truncatula)，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。序列表中的序列1由205个氨基酸残基组成。

为了使(a)中的MtCBF4便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-Hi s	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的MtCBF4可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的MtCBF4的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码上述植物耐逆性相关蛋白的基因(MtCBF4)也属于本发明的保护范围。

所述基因可为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：

1)序列表中序列2自5’端第11至628位核苷酸所示的DNA分子(cDNA)；

2)序列表中序列2所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码耐逆性相关蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码耐逆性相关蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

含有以上任一所述基因的重组表达载体也属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。

所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述重组表达载体是将所述基因插入pCAMBIA1302的多克隆位点得到的重组质粒。所述重组表达载体具体可为在pCAMBIA1302的Nco I和Spe I酶切位点之间插入所述基因得到的重组质粒。

含有以上任一所述基因(MtCBF4)的表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。

扩增所述基因(MtCBF4)全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。

本发明所提供的培育耐旱转基因植物的方法，可将编码所述植物耐逆性相关蛋白的基因导入目的植物(如植物细胞或组织)中，得到耐逆性高于所述目的植物的转基因植物。具体来说，可以将所述重组表达载体导入目的植物中，得到耐逆性高于所述目的植物的转基因植物。所述耐逆性具体可为耐盐胁迫和/或耐干旱胁迫。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将编码所述蛋白的基因导入植物细胞，可获得耐旱能力增强的转基因细胞系及转基因植株。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：大豆、烟草、百脉根、拟南芥、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。

MtCBF4基因参与截型苜蓿的盐胁迫和干旱胁迫应答反应。将MtCBF4基因导入出发植物，可以得到耐逆性显著高于出发植物的转基因植物，本发明对于培育耐盐、耐干旱的转基因豆科作物具有重要价值。

附图说明

图1为重组表达载体p1302-MtCBF4的构建流程图。

图2为抗生素阳性植株的PCR检测产物电泳图；1：1kb DNA ladder，由下到上分别为250bp，500bp，750bp，1000bp，1500bp，2000bp；2：阴性对照；3：阳性对照；4-11：抗生素阳性植株。

图3为抗生素阳性植株的RT-PCR检测产物电泳图；MtActinll为参比。

图4为植物盐胁迫实验后的萌发率统计图。

图5为植物干旱胁迫实验后的照片；A：对照；B：干旱胁迫。

图6为植物干旱胁迫实验后的存活率统计图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

截型苜蓿：2007年2月申小叶购自法国INRA BRC-MTR：Biological ResourceCentre for the model species Medicago truncatula L.；原始来源不清。

拟南芥(columbia生态型)：购自salk公司。

农杆菌EHA105：中国农业大学；抗生素抑制农杆菌的效果及对条斑紫菜生长发育的影响，王萍等，水产科学，2009 28(7)。

实施例1、MtCBF4基因的发现

通过两次芯片实验建立截型苜蓿完善的苜蓿种子萌发期和苗期盐胁迫基因表达谱，并对受盐胁迫显著诱导的基因进行聚类分析和GO注释分析，对感兴趣的探针进行GeneBins水平的pathway分类分析，基本构建了苜蓿耐盐调控网络框架。在此基础上建立截形苜蓿盐胁迫表达数据库。发现了一个盐诱导后表达量显著上调的转录因子，该转录因子在200mM NaCL诱导5小时后表达量上调64倍。

将序列1所示氨基酸残基组成的蛋白命名为MtCBF4蛋白，将MtCBF4蛋白的编码基因命名为MtCBF4基因，其编码区如序列表的序列2自5’端第11至628位核苷酸所示。

实施例2、转基因植物的获得和耐逆性鉴定

一、MtCBF4基因的克隆

由Invitrogen公司合成特异性引物对。

MtCBF4_5’：5’-TAC CAT GGA CAT GTT TAC TAT GAA TCA ATT-3’；

MtCBF4_3’：5’-ATA CTA GTT TAA AAT GAG TAA CTC CAC A-3’。

以截型苜蓿的cDNA为模板，用特异性引物对进行PCR扩增。将PCR扩增产物插入pMD18-T simple载体(购自TaKaRa生物工程公司)，得到重组载体pMD18-Tsimple-MtCBF4。经过测序验证，PCR扩增产物具有序列表中序列2所示的核苷酸(MtCBF4基因)。

二、重组表达载体(p1302-MtCBF4)的构建

构建过程参见图1。

1、用限制性内切酶Nco I和Spe I双酶切载体pMD18-T simple-MtCBF4，回收小片段(MtCBF4基因)；

2、用限制性内切酶Nco I和Spe I双酶载体pCAMBIA1302(Center for theApplication of Molecular Biology to International Agriclture，www.cambia.org)，回收大片段(骨架载体)；

3、将步骤1回收的小片段和步骤2回收的大片段连接，得到连接产物；将连接产物进行测序，测序结果表明，得到了重组表达载体p1302-MtCBF4(骨架载体为pCAMBIA1302，在Nco I和Spe I位点间插入了序列2所示的MtCBF4基因)。

三、重组农杆菌的制备

1、农杆菌感受态细胞的制备

挑取农杆菌EHA105单菌落接种于100ml YEB液体培养基中，220rpm、28℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.5；转入无菌离心管，5000rpm离心5min，去上清，加入10ml预冷的0.15M的CaCl₂溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min；4℃、5000rpm离心5min，去上清，加入4ml预冷的含10％甘油的0.15M的CaCl₂溶液，轻轻悬浮；农杆菌悬浮液分装于无菌eppendorf管中，每管200μl于液氮中速冻1min，冻存于-70℃。

2、重组农杆菌的制备

取1μg p1302-MtCBF4加入到200μl EHA105感受态细胞中，混匀，静止5min；液氮中速冻1min，37℃水浴5min，加入1ml YEB液体培养基，28℃、150rpm振荡培养4h；5000rpm离心3min，弃上清，加入0.1ml YEB液体培养基，重新悬浮细胞；涂布于YEB固体平板(含50μg/ml卡那霉素和50μg/ml利福平)上，28℃培养约48h。

PCR鉴定阳性克隆(引物：5’引物：5’-ATG GAA GCA CAA AGC GCT CAC-3’；3’引物：5’-TTA GCG TTC TAT CTG AAT AGT TAC AT-3’)。结果显示，p1302-MtCBF4已经成功转入农杆菌中，得到重组农杆菌。

四、转基因植物的获得

1、将重组农杆菌接种于10ml YEB液体培养基(含50μg/ml卡那霉素和50μg/ml利福平)中，28℃、200rpm振荡培养过夜；

2、转化前一天以1∶50体积比(v∶v)接种于200ml含相同抗生素的YEB培养基中扩大培养至OD₆₀₀为1.2-1.6，5000rpm、15min离心集菌，重悬，使OD₆₀₀为0.8；

3、采用Foral dip法将农杆菌转化花蕾期的拟南芥

在拟南芥抽苔4-5cm时剪去顶端花序，使腋生花序生长，剪时伤口应位于最高的茎生叶上方，约4-5天后进行转化，转化前要使土壤充分湿透且将大的花蕾去掉，只保留未开放的小花蕾；转化时将拟南芥整株与花盆一起倒扣在盛有200ml重组农杆菌菌液的容器中浸泡2-3min，浸泡完毕后，取出花盆，侧放于托盘中，盖上黑色塑料布，24hr后揭开塑料布，直立放置花盆，进行正常的光照培养，收获T₁代种子。

4、抗生素(潮霉素；Hyg+)筛选

收获T₁种子后，播种于MS固体平板(含80mg/L潮霉素)上，4℃春化72hr，置22℃光照培养箱中培养7-10天，转化体表现为真叶呈深绿色，根深长至培养基中，将转化体移至不含抗生素的MS培养基中，6-8天后将绿色的幼苗转到土壤中繁种，收获的种子。

筛选2代，得到T₃代种子。

5、分子检测

(1)PCR检测

以T₃代拟南芥的基因组DNA为模板(p1302-MtCBF4为阳性对照，野生型拟南芥的基因组DNA为阴性对照)，进行PCR扩增(5’引物：5’-ATG GAA GCA CAA AGCGCT CAC-3’；3’引物：5’-TTA GCG TTC TAT CTG AAT AGT TAC AT-3’扩增。

PCR扩增反应体系(50μl)：ddH₂O 37μl，10×PCR Buffer 5μl，dNTP(25mM)4μl，5’引物1μl，3’引物1μl，rTaq酶(5U/μl)1μl，模板(1μg/μl)1μl。

PCR反应程序：94℃变性5min；94℃变性50sec，56℃复性50sec，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。

反应结束后，1.0％琼脂糖凝胶电泳检测结果。

电泳图见图2。8株T₃代拟南芥获得了预期618bp的片段，选泳道7和11对应的两个植株(L17和L24)进行RT-PCR检测。

(2)RT-PCR检测

①Trizol法提取PCR阳性植株(L17和L24)以及野生型拟南芥的总RNA。

②以完整性好、无污染的RNA为模板，用M-MLV酶(购自Promage公司)反转录为cDNA。反转录体系：RNA(1.0μg/μl)8.0μl，Oligd T 2.0μl，RNfree H₂O5.0μl；混匀后，短暂离心将之收集于管底，72℃温育5min，再立即置于冰上5min；再加入5×M-MLV Buffer 2.0μl、dNTP 2.0μl、RTase M-MLV(200U/μl)0.75μl、HPR(40U/μl)0.25μl，混匀，短暂离心将之收集于管底，在42℃温育60min，70℃反应15min，取出置于冰上，离心后储存于-20℃。

③以0.5μl反转录产物为模板进行PCR扩增，PCR反应体系及反应条件同步骤(1)。

如图3所示，L17和L24RT-PCR结果获得了预期618bp的片段，表明MtCBF4在拟南芥中表达。

五、转空载体对照植物的获得

用pCAMBIA1302代替p1302-MtCBF4，步骤同步骤三和步骤四，得到转空载体对照拟南芥。

六、转基因植物的耐逆性鉴定

分别将野生型拟南芥(WT)、转空载体对照拟南芥、L17拟南芥和L24拟南芥的种子(每个植株20粒种子)进行盐胁迫实验和干旱胁迫实验。

1、盐胁迫实验

将拟南芥种子种于含有220mM NaCl的MS培养基上，4℃春化72hr，光照培养7天，进行萌发率计算(以根长1mm为萌发标准)。

统计结果如图4所示(结果为三次实验的平均值)。野生型拟南芥的萌发率是46.83％，L17种子的萌发率为79.66％，L24种子的萌发率分别为62.86％。野生型拟南芥和转空载体对照的萌发率相近，L17拟南芥和L24拟南芥种子的萌发率显著高于野生型拟南芥，表明转基因拟南芥较野生型拟南芥有更高的抗盐能力。

2、干旱胁迫实验

将拟南芥种子种于种于MS培养基上，4℃春化72hr，光照培养7天，转移到培养土(营养土∶蛭石＝1∶1)，浇水3周后，干旱处理(不浇水)2周，复水4天后拍照，并计算存活率。正常浇水的拟南芥种子采用完全相同的条件培养，作为对照。

照片见图5，存活率统计结果见图6(结果为三次实验的平均值)。野生型拟南芥的存活率是17.71％，L17的存活率是55.68％，L24的存活率是30.73％。野生型拟南芥和转空载体对照的存活率相近，L17拟南芥和L24拟南芥种子的存活率显著高于野生型拟南芥，表明转基因拟南芥较野生型拟南芥有更高的抗干旱能力。

Claims (3)

1.一种培育转基因植物的方法，是将序列表中序列1所示的氨基酸序列的编码基因导入目的植物中，得到耐逆性高于所述目的植物的转基因植物，所述耐逆性为耐盐和/或耐干旱。

2.如权利要求2所述的方法，其特征在于：序列表中序列1所示的氨基酸序列的编码基因通过将该基因插入pCAMBIA1302的多克隆位点得到的重组表达载体导入所述目的植物中。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述目的植物为拟南芥。 

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