CN112011557A

CN112011557A - 一种水稻基因OsRMT1及其在制备具有高温胁迫耐性转基因植物中的用途

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Publication number: CN112011557A
Application number: CN202010872789.5A
Authority: CN
Inventors: 余舜武; 张余; 李天菲; 杨访问; 吴金红; 黎佳佳; 罗利军
Original assignee: SHANGHAI AGROBIOLOGICAL GENE CENTER
Current assignee: SHANGHAI AGROBIOLOGICAL GENE CENTER
Priority date: 2020-08-26
Filing date: 2020-08-26
Publication date: 2020-12-01
Anticipated expiration: 2040-08-26
Also published as: CN112011557B

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种来源于水稻植物的基因及其在提高植物的高温抗性的应用。本发明公开了一种用于制备具有高温胁迫耐性转基因植物的水稻基因OsRMT1，其核酸序列如SEQ ID NO.1所示，并进一步公开将含有该编码核酸的多核苷酸的分离的DNA分子连接至植物中组成启动子，其编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，以及该水稻基因OsRMT1在制备具有高温胁迫耐性转基因植物中的用途。本发明OsRMT1基因在植物抗高温方面具有明显的作用，因此可将本发明所述基因与植物中过表达启动子结合后导入合适的表达载体并转化植物宿主，提高植物耐热的能力。

Description

一种水稻基因OsRMT1及其在制备具有高温胁迫耐性转基因植物中的用途

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种来源于水稻植物的基因及其在提高植物的高温抗性的应用。

背景技术

我国是一个农业大国，农作物的正常生长对保证我国粮食安全具有重要意义。随着社会经济的快速发展，温室气体大量排放，导致全球气温上升，气候变幻无常，极端气候频繁发生。我国是一个典型的自然灾害频发的国家，其中夏季的高温，常造成农作物大量减产。为了实现长期的粮食安全和可持续发展，深入了解植物耐高温的分子机制是农业科学技术研究的重要目标之一。水稻与高温研究报道显示当平均气温每升高1℃，水稻生育期将缩短14-15天，由于水稻生育期缩短，导致分蘖速度加快，使得有效分蘖数减少、干物质积累下降造成水稻减产(杜华明。气候变化对农业的影响研究进展。甘肃农业,2006,18-20)。此外花期对高温最为敏感，此阶段遭遇高温后结实率显著降低，严重甚至颗粒无收。挖掘和研究水稻耐高温基因，尝试将重要的抗逆基因对农作物进行基因工程改造，在当前是一种有效地改良农作物耐高温性能的育种手段。

高温作为重要的环境胁迫，异常高温易导致植物体内活性氧物质大量积累，如过氧化氢、羟自由基、超氧阴离子自由基以及单线态氧等的产生，这些活性氧会对生物膜、蛋白质等造成氧化伤害。为了应对伤害，植物能快速启动相应信号系统进行转录调节和蛋白修饰，如热激转录因子的激活启动热激蛋白的高表达。蛋白修饰主要包括磷酸化、乙酰化、糖基化和泛素化等过程，其中泛素化修饰是一种重要的清除胁迫条件下所不需要的蛋白的重要方式，在高温胁迫中扮演重要角色。例如拟南芥中发现了一种E3泛素连接酶AtPUB48，在高温胁迫条件下，通过促进耐热相关基因的表达增强拟南芥的萌发率和幼苗的耐热性(Peng L,Wan X,Huang K,Pei L,Xiong J,Li X,Wang J.AtPUB48 E3 ligase plays acrucial role in the thermotolerance of Arabidopsis.Biochemical andBiophysical Research Communications,2019,509:281-286)。油菜中也发现了一个膜定位的E3连接酶BnTR1，在植物热响应中起关键作用，通过调节钙离子通道的活性影响Ca²⁺的动态，最终改变植物热激因子和热激蛋白的表达，BnTR1的适度表达能够将非生物逆境对水稻或者油菜的危害降至最低同时赋予了植物对高温胁迫的耐受性(Liu Z,Wang J,Yang F,Yang L,Yue Y,Xiang J,Gao M,Xiong F,Lv D,Wu X.A novel membrane-bound E3ubiquitin ligase enhances the thermal resistance in plants.PlantBiotechnology Journal,2014,12:93-104)。水稻中也发现一个OsHTAS基因，编码一个Ringfinger类型的泛素连接酶，在水稻苗期耐热性中起着积极的作用。OsHTAS对多种胁迫均有应答，并且受外源ABA强烈诱导。酵母双杂交显示，OsHTAS与泛素/26S蛋白酶体系统的组成部分和水稻抗坏血酸过氧化物酶的一个亚型相互作用。OsHTAS调节水稻苗期过氧化氢的积累，促进了ABA的生物合成，使水稻叶片气孔状态发生变化(Liu J,Zhang C,Wei C,Wang M,Liu X,Yu F,Xie Q,Tu J.The RING Finger Ubiquitin E3 Ligase OsHTAS EnhancesHeat Tolerance by Promoting H2O2-Induced Stomatal Closure in Rice.PlantPhysiol,2015,170(1):429-443)。

水稻是我国最重要的粮食作物，高温是近几年发生比较频繁且影响最为严重的逆境因子之一。高温胁迫对产量可造成50％的损失，发掘耐高温基因，解析作物耐高温机理，培育耐高温的水稻品种是解决粮食危机的重要途径，也是现阶段以及未来研究的重点方向。水稻中E3泛素连接酶家族成员是一个超大家族，其成员预测超过1300个(杨珍珍,王志龙,卢向阳,等.水稻泛素连接酶功能研究进展.中国农学通报,2013(18):7-11)，进一步发掘调控水稻耐高温的E3连接酶基因，了解植物耐高温机理，为水稻抗逆育种提供新的基因资源具有重要意义。

发明内容

本发明是基于一部分来源于水稻的OsRMT1基因正调控水稻耐高温抗性的发现。从某种方面来说，本发明提供了基因工程植物过量表达OsRMT1基因增强对高温抗性和构建基因工程植物方法，以拓展当前植物生物技术中的可应用于提高植物耐高温能力的基因，获得新型转基因抗逆植物品种。

为解决上述技术问题，本发明的第一方面，提供一种用于制备具有高温胁迫耐性转基因植物的水稻基因OsRMT1，其核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

另一方面，本发明提供一种用于制备具有高温胁迫耐性转基因植物的水稻基因OsRMT1编码的蛋白，其编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或编码氨基酸序列与SEQ IDNO.2中从148-364序列长度有至少70％、80％、90％或95％的同一性。

另一方面，本发明提供一种含有上述水稻基因OsRMT1的重组载体。

另一方面，本发明还提供一种生产具有高温胁迫耐性转基因植物的方法，具体包括以下步骤：

1)将水稻基因OsRMT1可操作地连接于植物表达调控序列，形成植物表达载体，所述水稻基因OsRMT1的核酸序列如SEQ ID NO.1所示；

2)将步骤1)所得的植物表达载体转入植物细胞；

3)经筛选获得的转化细胞，再生为植物及其后代。

所述植物包括植物细胞、植物组织或植物种子。优选的，所述植物选自水稻、玉米、小麦、大麦、黍、高粱等中任意一种。

另一方面，本发明提供上述水稻基因OsRMT1在制备具有高温胁迫耐性转基因植物方面的用途。

另一方面，本发明还提供一种含有编码核酸的多核苷酸的分离的DNA分子在制备具有高温胁迫耐性转基因植物品种中的用途，其特征在于：

(a)其编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；或

(b)其编码氨基酸序列与SEQ ID NO.2中从148-364序列长度有至少70％、80％、90％或95％的同一性；或

(c)其多核苷酸序列为编码OsRMT1蛋白的多核苷酸。

另一方面，本发明还提供一种提高植物耐热性的启动子，通过所述分离的DNA分子连接至植物中组成启动子，其中核酸能过量表达OsRMT1基因。

进一步的，所述提高植物耐热性的启动子的编码氨基酸序列与SEQ ID NO.2中从148-364序列长度有至少70％、80％、90％或95％的同一性。优选90％以上的同一性。

另一方面，本发明公开一种植物包含重组核酸含有启动子可操作地连接至编码OsRMT1的多核苷酸，其编码氨基酸序列与SEQ ID NO.2中从148-364序列长度有至少70％、80％、90％或95％的同一性。

另一方面，本发明公开了一种生产具有高温胁迫耐性转基因植物的方法，所述方法包含向植物导入核苷酸序列，该核苷酸序列含有启动子操作连接至编码OsRMT1的多核苷酸，其中所述编码氨基酸序列与SEQ ID NO.2中从148-364序列长度有至少70％、80％、90％或95％的同一性。

本发明筛选并鉴定了一种新的水稻基因OsRMT1，其具有明显的抗高温作用，因此可将本发明基因与植物中过表达启动子结合后导入合适的表达载体并转化植物宿主，提高植物耐热的能力。

附图说明

图1是水稻基因OsRMT1的蛋白结构图。采用NCBI中BLAST软件(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)对SEQ ID NO.2蛋白序列进行分析，预测位点317-360为C₃H₂C₃型锌指结构域(双下划线标示)。

图2为超表达载体pCB2004-OsRMT1示意图。

图3为OsRMT1基因编辑载体示意图。

图4为超表达转基因水稻叶片中OsRMT1基因相对表达量图。采用实时反转录实时定量PCR方法检测OsRMT1基因在转基因水稻叶片中表达量，其中，横轴的编号T1-T15表示不同转OsRMT1基因水稻株系；纵轴表示：转基因株系相对于野生型对照植株的OsRMT1表达量比值，内参基因为actin1。

图5为OsRMT1基因编辑单株T0代鉴定结果图。A.野生型和纯合缺失突变体的sgRNA位点附近基因组序列比对；B.野生型和纯合编辑突变体产生多肽的多序列比对。

图6为幼苗期转OsRMT1基因水稻耐高温胁迫处理试验比较图。当水稻生长到4叶期时，将幼苗移置到45℃光照培养箱进行高温胁迫处理2d，然后恢复5d。A、高温处理前后植株表型。上层图片为高温处理前；下层图片为高温处理后。WT表示非转基因野生型水稻；T9、T10和T14表示转OsRMT1基因过表达株系；KO1和KO3表示基因编辑突变株系。B、基因编辑突变体和对照植株高温处理后的成活率。**表示P<0.01。

具体实施方式

在本文中，术语“分离的”、“纯化的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其蛋白质分开。

本发明还包括能编码具有OsRMT1相同功能的蛋白的SEQ ID NO.1中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5和/或3端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。例如SEQID NO.3或SEQ ID NO.4所示的核酸序列。

在本发明中，还包括具有与OsRMT1相同功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。

蛋白的同源性百分比由GAP(Needleman和Wunsh,1970)分析(GCG程序)确定，其中参数gap creation penalty＝5，gap extension penalty＝0.3。被分析的序列长度至少为15个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为15个氨基酸的区域进行测试。更优选地，被分析的序列长度至少为50个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为50个氨基酸的区域进行测试。更优选地，被分析的序列长度至少为100个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为100个氨基酸的区域进行测试。更优选地，被分析的序列长度至少为250个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为250个氨基酸的区域进行测试。甚至更优选地，被分析的序列长度至少为500个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为500个氨基酸的区域进行测试。

通过本领域已知的方法可以分离和纯化多核苷酸(DNA或RNA)、载体、转化体和生物体。

本发明所分离出的多核苷酸，包括但不限于：SEQ ID NO.1编码OsRMT1基因的核苷酸序列；或者该核苷酸序列能与SEQ ID NO.1中从核苷酸第1-1104位的核苷酸序列杂交；或者其功能相当于SEQ ID NO.1所示序列的亚片段。

可以采用已经克隆的OsRMT1基因作为探针，从cDNA和基因组文库中筛选得到本发明的基因或同源基因，也可以直接采用基因合成的方法合成。同样也可以采用PCR(polymerase chain reaction)技术，从基因组、cDNA中扩增得到本方面的OsRMT1基因以及任何一段DNA或其同源的一段DNA。

用于本发明的载体可以是如噬菌体、质粒、粘粒、微型染色体、病毒或逆转录病毒载体。可用于克隆和/或表达本发明的多核苷酸的载体是能在需复制和/或表达多核苷酸的宿主细胞中复制和/或表达多核苷酸的载体。一般说来，携带本发明的核酸序列的重组表达载体可以使用Ti质粒、植物病毒载体，直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach,1998,Method for Plant Molecular Biology VIII,AcademyPress,New York,pp.411-463；Geiserson and Corey,1998,Plant Molecular Biology(2nd Edition)。

已开发出多种方法用于经由互补的粘性末端使多核苷酸与载体可操作相连。例如，可在欲插入载体DNA内的DNA区段添加互补的同聚体序列片段。然后通过互补同聚体尾之间的氢键连接载体和DNA区段以形成重组DNA分子。

含有一或多种限制性位点的合成接头提供了另一种连接DNA区段与载体的方法。用噬菌体T4 DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶I处理通过内切核酸酶限制性消化产生的DNA区段，所述的两种聚合酶用其3'、5’-核酸外切活性除去突出的γ-单链末端，并用其聚合活性补平3’-凹端。因此，这些活性的联合产生了平端DNA区段，然后在能催化平端DNA分子连接的酶，如噬菌体T4 DNA连接酶的存在下将平端区段与摩尔过量的接头分子一起保温。因此，反应产物是末端携有聚合接头序列的DNA区段，然后用适当的限制性酶裂解这些DNA区段，并连接至已用酶裂解的表达载体中，所述酶能产生与所述DNA区段相容的末端。从多个商家可以买到含有多个限制性内切核酸酶位点的合成接头。

其它新发展的技术利用同源重组方法，将携带有特定序列接头或同源序列接头的多核苷酸与载体进行同源重组，将欲插入载体DNA内的DNA区段与同样携带有特定序列或同源序列的载体通过重组酶的作用形成重组DNA分子。

多核苷酸插入物应该可操作地连接于同表达多核苷酸的宿主细胞相容的适当启动子上，启动子可以是强启动子和/或诱导型启动子。列举的一些启动子的例子包括噬菌体PL启动子、大肠杆菌lac、trP、phoA、tac启动子、SV40早期和晚期启动子以及逆转录病毒LTR启动子；其它适当启动子是本领域技术人员已知的。表达重组载体进一步含有转录起始、终止位点，并在转录区含有用于翻译的核糖体结合位点。重组载体表达的转录物的编码部分可包括位于起点处的翻译起始密码子和适当地位于被翻译多肽的末端的终止密码子(UAA,UGA或UAG)。

如上所述，表达载体可包括至少一个选择标记。所述标记包括编码抗生素的抗性基因，例如：新霉素磷酸转移酶(Neomycin phosphotransferase)基因nptⅡ、潮霉素磷酸转移酶(Hygromycin phosphotransferase)基因hpt和二氢叶酸还原酶(Dihydrofolatereductase)基因dhfr；另一类是编码除草剂抗性基因，例如，草丁膦乙酰转移酶(Phosphinothricin acetyltransferase)基因Bar、5-烯醇丙酮酰草酸-3-磷酸合成酶(5-Enoylpyruvate shikimatr-3-phosphate)基因epsps。适当宿主的代表性例子包括但不限于：原生质体细胞和植物细胞。上述宿主细胞的适当培养基和培养条件是本领域已知的。

目的基因或目的多核苷酸的转化方法：一类是载体介导的转化方法，即将目的基因插入到农杆菌的质粒或病毒的DNA等载体分子上，随着载体DNA的转移而将目的基因导入到植物基因组中；农杆菌介导和病毒介导法就属于这种方法。第二类为基因直接导入法，是指通过物理或化学的方法直接将外源目的基因导入植物的基因组中。物理方法包括基因枪转化法、电激转化法、超声波法、显微注射法和激光微束法等；化学方法有PEG介导转化方法和脂质体法等。第三类为种质系统法，这包括花粉管通道法、生殖细胞浸染法、胚囊和子房注射法等。

本发明中，使用的术语“转化体”(transformant)，即带有异源DNA分子的宿主细胞或生物体。

本发明还包括含有本发明的核苷酸序列的宿主细胞，所述核苷酸序列经本领域已知的技术与一或多种异源控制区(如启动子和/或增强子)可操作相连。可以选择能调节插入的基因序列的表达，或能按照所需的特殊方式修饰和加工基因产物的宿主菌株。在某些诱导物的存在下，某些启动子启动的表达会升高。

通过众所周知的技术可以鉴定出被成功转化的细胞，即含有本发明所述核苷酸序列的重组载体的细胞或生物体。

以下结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：分离克隆OsRMT1基因

取生长4个星期的水稻幼苗叶片，采用TRIzol试剂(GIBCO BRL,USA)抽提水稻总RNA。利用反转录酶MLV(Tiangen，China)将其反转录成第一链cDNA。用引物F(5’-ATG GATGAT CACATG GGAAGA CG-3’)和引物R(5’-CTA GTT GGTATT CAGAGC GAC GG-3’)，扩增出基因的全长编码cDNA。PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃30sec，60℃30sec，72℃60sec共35个循环；72℃延伸5min。将扩增获得的PCR产物连入pGEM-T载体(Promega,USA)，筛选阳性克隆并测序，获得OsRMT1基因的cDNA序列(SEQ ID NO.1)。OsRMT1推测的蛋白序列进行同源基因的比对分析，发现该基因编码蛋白为包含C₃H₂C₃型锌指结构域的E3连接酶家族蛋白，在第317-360氨基酸为保守的锌指结构域(见图1)。

实施例2：OsRMT1基因超表达和编辑载体的构建和遗传转化

1)含目的基因表达载体的构建：

根据OsRMT1基因的全长序列(SEQ ID NO.1)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游引物和下游引物上分别添加接头引物，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经高保真pfu酶(Tiangen，China)进行PCR扩增后，将OsRMT1基因cDNA克隆至中间载体(如pDONR207)，进一步转化大肠杆菌DH5α，在保证阅读框架正确的前提下鉴定中间载体，然后抽提质粒，使用LR Clonase重组酶与包含启动子和终止子蛋白植物表达载体pCB2004进行重组反应，构成了一个完整的表达单元(见图2)，转化农杆菌EHA105，最后进行水稻愈伤组织转化实验。

2)靶基因编辑表达载体的构建：

对于利用Crispr/Cas9系统进行基因编辑的OsRMT1基因载体的构建，利用CRISPR-P 2.0工具(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)设计靶点为sgRNA：5’-gcagcttcccgaataaggaagg-3’，然后参照已发表的Crispr/Cas9基因编辑系统提供的方法进行基因编辑载体的构建，最后将U6启动子和sgRNA表达盒装载入表达载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H中，结果如图3所示。具体操作步骤详见参考文献(Ma X,Zhang Q,Zhu Q,LiuW,ChenY,Qiu R,Wang B,Yang Z,Li H,LinY,Xie Y,Shen R,Chen S,Wang Z,Chen Y,Liu Y.ARobust CRISPR/Cas9 System for Convenient,High-Efficiency Multiplex GenomeEditing in Monocot and Dicot Plants.Molecular Plant,2015,8:1274-1284)。构建好的质粒转化农杆菌EHA105，进行水稻愈伤组织转化实验。

3)水稻遗传转化

3.1种子消毒

成熟的日本晴水稻种子去壳后放入无菌三角瓶中，用75％酒精浸泡1-2min，无菌水冲洗2次；再用30％NaClO消毒30min，其间需经常摇动，再用无菌水洗3-4次，用无菌滤纸吸干多余的水分，将种子接种到愈伤组织诱导培养基(MS+2,4-D 2.0mg/L)上，每皿约30粒，于28℃暗培养。

3.2继代培养

经过近1月的诱导，水稻长出黄色膨大的愈伤组织，去其盾片，将愈伤转至新鲜的愈伤组织诱导培养基(MS+2,4-D 2.0mg/L)上进行继代。每2周继代一次，一般继代2-4次即可获得适合转基因的嫩黄色、颗粒状的胚性愈伤组织。在继代培养2周后，挑选胚性颗粒用于遗传转化。

3.3农杆菌的培养

在转化平板上挑取单菌落在1ml农杆菌培养基中培养。在50ml农杆菌培养基(含相应抗生素)中加入1ml上述培养物，200rpm，28℃培养5-6hr至OD600为0.6-1.0，培养结束前2hr加入乙酰丁香酮(AS，终浓度100uM)。取上述菌液在室温下，4000rpm，10min，弃上清，加入MS液体培养基(含AS 100uM)重悬菌体，在与上相同的条件下培养2hr，使菌液的OD600＝0.5-1，此时可用来转化愈伤组织。AS＝acetosringone

3.4共培养

将水稻胚性愈伤组织浸入农杆菌菌液20-30min，再用无菌吸水纸吸干水分，将侵染的愈伤组织置于共培养培养基(MS+2,4-D 2.0mg/L+AS 100uM)上，28℃暗培养三天。

3.5洗菌

共培养的愈伤组织先用无菌水冲洗3遍，再浸泡在含Cef/CN 400mg/L的MS液体培养基中20-30min后，将愈伤组织转入无菌滤纸上吸干。

3.6选择培养

将吸干水分的愈伤组织接种于选择培养基(MS+2,4-D 2.0mg/L+Hyg 30mg/L+Cef400 mg/L)上。3周后，挑选新长出的愈伤接种于选择培养基(MS+2,4-D 2.0mg/L+Hyg50mg/L+Cef250 mg/L)上，再选择2周。

3.7分化培养

将经2次选择得到的抗性愈伤组织转入到预分化培养基(N6+KT 2.0mg/L+NAA0.2mg/L+6-BA 2.0mg/L+Hyg 30mg/L+Cef200 mg/L+琼脂9g/L+蔗糖45g/L)上暗培养10天左右，再转到分化培养基(N6+KT 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L+6-BA2.0 mg/L+Hyg 30mg/L+琼脂4.5g/L+蔗糖30g/L)上光照培养。

3.8生根培养

约1-2个月，将2cm左右高的幼苗转到生根培养基(1/2MS+Hyg 15mg/L+琼脂4.5g/L+蔗糖20g/L)上诱导不定根的发生。

3.9转基因苗的移栽

当幼苗长至10cm高时，将幼苗取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入泥土中，刚开始用玻璃罩罩几天，待植株健壮后再取下玻璃罩，温室中培养。

实施例3：OsRMT1基因在转基因植株中的表达分析

1)材料准备

转基因T1代水稻种子发芽后，移植于液体培养基(自来水配制成1/5MS大量元素)。幼苗生长15d后，剪取叶片快速投入液氮保存，用于RNA的抽提。

2)无DNA的总RNA制备

按上海全式金生物技术有限公司提供的植物叶RNA小量抽提试剂盒使用说明书抽提。使用Beckman Coulter^TM

640紫外分光光度计测定RNA浓度。为除去残留在RNA中的DNA，每个总RNA样品取5μg，加入1μL DNAase I(美国Invitrogen公司)和1μL10×反应缓冲液，补足体积至10μL，常温反应30min，然后每管加入1μL 2mmol L-1EDTA终止反应，最后在70℃加热10min使DNAase I失活。

3)第一链cDNA的合成

将上述RNA样品各取2μL，按美国Promega公司反转录试剂盒提供的试剂依次添加4μL 25mmol L-1MgCl₂，2μL10×RT缓冲液，2μL dNTP混和液和1μL oligo(dT)15，加水补足体积到18.5μL，在70℃加热变性10min，快速在冰上冷却。然后加0.5μL RNase inhibitor和1μL AMVRTase，在42℃水浴60min，70℃下加热10min终止反应。

4)定量PCR

根据基因OsRMT1的序列设计特异性引物BF:5’-GGT GAG GAG GTG GGC AAG AT-3’，BR:5’-AGT TGG TAT TCA GAG CGA CGG ATT-3’用于荧光定量PCR，根据水稻Actin基因(GenBank accession No.AY212324)的cDNA序列设计特异性引物AF:5’-CTT CCT CAT GCCATC CTG C-3’，AR:5’-GCA AGC TTC TCC TTGATG TCC-3’用于参照基因的荧光定量PCR。PCR使用美国ABI

7000定量PCR仪，每一个PCR设置一次重复。反应体系包含SYBRPremix Ex Taq^TM(2×)10μL，正反向引物各0.5μL，各种处理的cDNA模板1μL，加水补足体积至25μL。反应程序为：95℃30s，然后在95℃10s，61℃34s下循环40次，设定在每个循环中60℃34s时读取荧光值，同时进行ROX值校正，最后添加荧光PCR产物融解曲线分析，其他操作详见仪器使用说明书。为了检测RNA样品中是否存在DNA的污染，随机选取3个样品，各取1μLRNA作为模板进行PCR，方法同上。

5)分析方法

Ct是通过7000 system SDS Version1.2.3软件在PCR的荧光域值通过手工确定为0.2后产生的，将数据输入到EXCEL进行计算分析。数据分析采用方法为2-ΔΔCT，然后利用EXCEL表作表达差异柱状图。

6)分析结果

以空白非转基因日本晴品种为参照，分别检测了15个独立的转基因株系T1-T15。由于野生型植株该基因表达量本底比较高，表达量超过2倍的转基因株系未超过一半(见图4)，选取转基因株系T9、T10和T14，应用于进一步的转基因水稻研究。

实施例4：OsRMT1基因编辑突变体的筛选

对于CRISPR/Cas9编辑的OsRMT1基因T₀代单株利用一代测序进行鉴定。利用快速提取DNA方法对T₀代单株基因组DNA进行抽提，针对sgRNA编辑位点两侧设计引物，扩增片段覆盖编辑位点区域，对PCR产物进行测序。以日本晴靶位点序列为参考序列与所有的扩增编辑位点区域进行多序列比对，确定发生基因组编辑的纯合单株。根据测序结果，如图5A所示多序列比对结果，突变类型分别为sgRNA作用的靶位点处缺失1个碱基A、缺失3个碱基ATA和缺失4个碱基GGAA。其推导的氨基酸水平上，图中所表示的单株分别由于缺少1个和4个碱基，导致发生移码突变，引起转录本的提前终止，分别形成174个氨基酸多肽和175个氨基酸多肽；KO2所表示的单株由于所缺少的3个碱基正好位于499-451形成一个氨基酸，推导产生366个氨基酸多肽，因此导致形成的新的多肽比野生型仅少了一个异亮氨酸(图5B)。推测基因编辑后OsRMT1基因可能由于移码突变提前终止而使该基因丧失功能，故后面试验中使用KO1和KO3突变体植株为候选植株进行下一步研究工作。

实施例5：OsRMT1基因转基因植株在高温胁迫条件下的生长状况

选取了实施例4中OsRMT1基因过量表达转基因T3代株系T9、T10和T14以及实施例5中OsRMT1基因编辑突变体株系KO1和KO3进行了苗期高温胁迫实验。具体步骤如下：将相应转基因材料种子和对照野生型材料种子利用次氯酸钠消毒后，浸种1d、37℃催芽至露白后，播种于去掉底部的96孔PCR板上，放置在光照培养箱中利用营养液进行培养，生长至4周大时进行45℃高温胁迫，处理2d然后恢复5d，结果如图6所示，胁迫前各转基因材料和日本晴没有显著差异，经过高温胁迫、恢复生长后OsRMT1过表达株系OE-L9、OE-L10、OE-L14的叶片枯死程度显著低于日本晴。与之相对应的是，OsRMT1基因编辑后产生的功能缺失突变体叶片枯死严重，其成活率明显下降。以上结果表明，OsRMT1基因的增强表达能够增强水稻苗期的耐热性，而功能丧失削弱水稻的耐热能力。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为参考。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海市农业生物基因中心

<120> 一种水稻基因OsRMT1及其在制备具有高温胁迫耐性转基因植物中的用途

<130> 1

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1104

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1101)

<400> 1

atg gat gat cac atg gga aga cgg aca gtt ggt ggc ctt ctc ttc acc 48

Met Asp Asp His Met Gly Arg Arg Thr Val Gly Gly Leu Leu Phe Thr

1 5 10 15

aag ggg ggc tca att ctt ctc ttc aga gaa gac agt gcg cgt cac aag 96

Lys Gly Gly Ser Ile Leu Leu Phe Arg Glu Asp Ser Ala Arg His Lys

20 25 30

gcc acc aat tgc tgc acg cga cac ggt tgc agc agc aag cat ttg gcc 144

Ala Thr Asn Cys Cys Thr Arg His Gly Cys Ser Ser Lys His Leu Ala

35 40 45

ggc aaa gac aag caa aca cac agg gca gca aca gca gcc aag gaa gca 192

Gly Lys Asp Lys Gln Thr His Arg Ala Ala Thr Ala Ala Lys Glu Ala

50 55 60

tca gaa acc cct cgg aga tca cag att ttc agg aaa ccc agc acg agg 240

Ser Glu Thr Pro Arg Arg Ser Gln Ile Phe Arg Lys Pro Ser Thr Arg

65 70 75 80

act cct cag gga agt act gct act gat aac atc agc agg aat gca gca 288

Thr Pro Gln Gly Ser Thr Ala Thr Asp Asn Ile Ser Arg Asn Ala Ala

85 90 95

agc tcc tat agc gaa aac gac aat agg cca aga gaa act cca ggg cgt 336

Ser Ser Tyr Ser Glu Asn Asp Asn Arg Pro Arg Glu Thr Pro Gly Arg

100 105 110

gat tta atc gct cgt ctc aaa gag agg gtc aat gca tca aga aaa cga 384

Asp Leu Ile Ala Arg Leu Lys Glu Arg Val Asn Ala Ser Arg Lys Arg

115 120 125

tca ttg aac aga gaa aac agt cca tca tca cca aat gga tta agt gct 432

Ser Leu Asn Arg Glu Asn Ser Pro Ser Ser Pro Asn Gly Leu Ser Ala

130 135 140

act tcc tca agt agt agc cgc aca gtc tca aga ccg tcg cat cgg gca 480

Thr Ser Ser Ser Ser Ser Arg Thr Val Ser Arg Pro Ser His Arg Ala

145 150 155 160

gct tcc cga ata agg aag gca gat gaa ggt gca aat gca gga gct gta 528

Ala Ser Arg Ile Arg Lys Ala Asp Glu Gly Ala Asn Ala Gly Ala Val

165 170 175

aat gta cgc aga gac agc agt gga gat acc agg agg aat tca gat agg 576

Asn Val Arg Arg Asp Ser Ser Gly Asp Thr Arg Arg Asn Ser Asp Arg

180 185 190

gat gtc gat gat ttc ttg cta gtt gag cag gca gca aga gat agc act 624

Asp Val Asp Asp Phe Leu Leu Val Glu Gln Ala Ala Arg Asp Ser Thr

195 200 205

gaa gga ttc ata tct gga ttc ttg gca aga tac aga agt aat cat cag 672

Glu Gly Phe Ile Ser Gly Phe Leu Ala Arg Tyr Arg Ser Asn His Gln

210 215 220

gga cta ctt tca tct ttg gac gac agc ata gag gat gca aat ggg tac 720

Gly Leu Leu Ser Ser Leu Asp Asp Ser Ile Glu Asp Ala Asn Gly Tyr

225 230 235 240

tgg cgc ttc aat atg gaa gga agt gaa gag ctt gag aac tac ttc ata 768

Trp Arg Phe Asn Met Glu Gly Ser Glu Glu Leu Glu Asn Tyr Phe Ile

245 250 255

ttc aat gat cgg tac aga ggg atg aga atg gac att gac ggc atg tct 816

Phe Asn Asp Arg Tyr Arg Gly Met Arg Met Asp Ile Asp Gly Met Ser

260 265 270

tat gag gaa ttg cta gca ttg gga gat aga att ggc acc gta agc act 864

Tyr Glu Glu Leu Leu Ala Leu Gly Asp Arg Ile Gly Thr Val Ser Thr

275 280 285

ggc ctt tca gaa gac gcg ctg tcc aag tgt cta gac aga agc atg tac 912

Gly Leu Ser Glu Asp Ala Leu Ser Lys Cys Leu Asp Arg Ser Met Tyr

290 295 300

atg gcc act act tca gga act cat gaa gat tgt gag aga aaa tgc agc 960

Met Ala Thr Thr Ser Gly Thr His Glu Asp Cys Glu Arg Lys Cys Ser

305 310 315 320

ata tgc cag gag gaa tat tca gat ggt gag gag gtg ggc aag atg gtc 1008

Ile Cys Gln Glu Glu Tyr Ser Asp Gly Glu Glu Val Gly Lys Met Val

325 330 335

tgc aaa cat tac tac cac ttc tcc tgc ata aag aac tgg ctc cgg cag 1056

Cys Lys His Tyr Tyr His Phe Ser Cys Ile Lys Asn Trp Leu Arg Gln

340 345 350

aag aac tgg tgt ccc att tgt aaa tcc gtc gct ctg aat acc aac tag 1104

Lys Asn Trp Cys Pro Ile Cys Lys Ser Val Ala Leu Asn Thr Asn

355 360 365

<210> 2

<211> 367

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 2

Met Asp Asp His Met Gly Arg Arg Thr Val Gly Gly Leu Leu Phe Thr

1 5 10 15

Lys Gly Gly Ser Ile Leu Leu Phe Arg Glu Asp Ser Ala Arg His Lys

20 25 30

Ala Thr Asn Cys Cys Thr Arg His Gly Cys Ser Ser Lys His Leu Ala

35 40 45

Gly Lys Asp Lys Gln Thr His Arg Ala Ala Thr Ala Ala Lys Glu Ala

50 55 60

Ser Glu Thr Pro Arg Arg Ser Gln Ile Phe Arg Lys Pro Ser Thr Arg

65 70 75 80

Thr Pro Gln Gly Ser Thr Ala Thr Asp Asn Ile Ser Arg Asn Ala Ala

85 90 95

Ser Ser Tyr Ser Glu Asn Asp Asn Arg Pro Arg Glu Thr Pro Gly Arg

100 105 110

Asp Leu Ile Ala Arg Leu Lys Glu Arg Val Asn Ala Ser Arg Lys Arg

115 120 125

Ser Leu Asn Arg Glu Asn Ser Pro Ser Ser Pro Asn Gly Leu Ser Ala

130 135 140

Thr Ser Ser Ser Ser Ser Arg Thr Val Ser Arg Pro Ser His Arg Ala

145 150 155 160

Ala Ser Arg Ile Arg Lys Ala Asp Glu Gly Ala Asn Ala Gly Ala Val

165 170 175

Asn Val Arg Arg Asp Ser Ser Gly Asp Thr Arg Arg Asn Ser Asp Arg

180 185 190

Asp Val Asp Asp Phe Leu Leu Val Glu Gln Ala Ala Arg Asp Ser Thr

195 200 205

Glu Gly Phe Ile Ser Gly Phe Leu Ala Arg Tyr Arg Ser Asn His Gln

210 215 220

Gly Leu Leu Ser Ser Leu Asp Asp Ser Ile Glu Asp Ala Asn Gly Tyr

225 230 235 240

Trp Arg Phe Asn Met Glu Gly Ser Glu Glu Leu Glu Asn Tyr Phe Ile

245 250 255

Phe Asn Asp Arg Tyr Arg Gly Met Arg Met Asp Ile Asp Gly Met Ser

260 265 270

Tyr Glu Glu Leu Leu Ala Leu Gly Asp Arg Ile Gly Thr Val Ser Thr

275 280 285

Gly Leu Ser Glu Asp Ala Leu Ser Lys Cys Leu Asp Arg Ser Met Tyr

290 295 300

Met Ala Thr Thr Ser Gly Thr His Glu Asp Cys Glu Arg Lys Cys Ser

305 310 315 320

Ile Cys Gln Glu Glu Tyr Ser Asp Gly Glu Glu Val Gly Lys Met Val

325 330 335

Cys Lys His Tyr Tyr His Phe Ser Cys Ile Lys Asn Trp Leu Arg Gln

340 345 350

Lys Asn Trp Cys Pro Ile Cys Lys Ser Val Ala Leu Asn Thr Asn

355 360 365

<210> 3

<211> 1103

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<220>

<221> mutation

<222> (1)..(1103)

<400> 3

atggatgatc acatgggaag acggacagtt ggtggccttc tcttcaccaa ggggggctca 60

attcttctct tcagagaaga cagtgcgcgt cacaaggcca ccaattgctg cacgcgacac 120

ggttgcagca gcaagcattt ggccggcaaa gacaagcaaa cacacagggc agcaacagca 180

gccaaggaag catcagaaac ccctcggaga tcacagattt tcaggaaacc cagcacgagg 240

actcctcagg gaagtactgc tactgataac atcagcagga atgcagcaag ctcctatagc 300

gaaaacgaca ataggccaag agaaactcca gggcgtgatt taatcgctcg tctcaaagag 360

agggtcaatg catcaagaaa acgatcattg aacagagaaa acagtccatc atcaccaaat 420

ggattaagtg ctacttcctc aagtagtagc cgcacagtct caagaccgtc gcatcgggca 480

gcttcccgaa taggaaggca gatgaaggtg caaatgcagg agctgtaaat gtacgcagag 540

acagcagtgg agataccagg aggaattcag atagggatgt cgatgatttc ttgctagttg 600

agcaggcagc aagagatagc actgaaggat tcatatctgg attcttggca agatacagaa 660

gtaatcatca gggactactt tcatctttgg acgacagcat agaggatgca aatgggtact 720

ggcgcttcaa tatggaagga agtgaagagc ttgagaacta cttcatattc aatgatcggt 780

acagagggat gagaatggac attgacggca tgtcttatga ggaattgcta gcattgggag 840

atagaattgg caccgtaagc actggccttt cagaagacgc gctgtccaag tgtctagaca 900

gaagcatgta catggccact acttcaggaa ctcatgaaga ttgtgagaga aaatgcagca 960

tatgccagga ggaatattca gatggtgagg aggtgggcaa gatggtctgc aaacattact 1020

accacttctc ctgcataaag aactggctcc ggcagaagaa ctggtgtccc atttgtaaat 1080

ccgtcgctct gaataccaac tag 1103

<210> 4

<211> 1100

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<220>

<221> mutation

<222> (1)..(1100)

<400> 4

atggatgatc acatgggaag acggacagtt ggtggccttc tcttcaccaa ggggggctca 60

attcttctct tcagagaaga cagtgcgcgt cacaaggcca ccaattgctg cacgcgacac 120

ggttgcagca gcaagcattt ggccggcaaa gacaagcaaa cacacagggc agcaacagca 180

gccaaggaag catcagaaac ccctcggaga tcacagattt tcaggaaacc cagcacgagg 240

actcctcagg gaagtactgc tactgataac atcagcagga atgcagcaag ctcctatagc 300

gaaaacgaca ataggccaag agaaactcca gggcgtgatt taatcgctcg tctcaaagag 360

agggtcaatg catcaagaaa acgatcattg aacagagaaa acagtccatc atcaccaaat 420

ggattaagtg ctacttcctc aagtagtagc cgcacagtct caagaccgtc gcatcgggca 480

gcttcccgaa taaggcagat gaaggtgcaa atgcaggagc tgtaaatgta cgcagagaca 540

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gcttcaatat ggaaggaagt gaagagcttg agaactactt catattcaat gatcggtaca 780

gagggatgag aatggacatt gacggcatgt cttatgagga attgctagca ttgggagata 840

gaattggcac cgtaagcact ggcctttcag aagacgcgct gtccaagtgt ctagacagaa 900

gcatgtacat ggccactact tcaggaactc atgaagattg tgagagaaaa tgcagcatat 960

gccaggagga atattcagat ggtgaggagg tgggcaagat ggtctgcaaa cattactacc 1020

acttctcctg cataaagaac tggctccggc agaagaactg gtgtcccatt tgtaaatccg 1080

tcgctctgaa taccaactag 1100

Claims

1.一种用于制备具有高温胁迫耐性转基因植物的水稻基因OsRMT1，其特征在于，所述水稻基因OsRMT1的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的用于制备具有高温胁迫耐性转基因植物的水稻基因OsRMT1编码的蛋白，其特征在于，其编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或编码氨基酸序列与SEQ IDNO.2中从148-364序列长度有至少70％、80％、90％或95％的同一性。

3.一种含有权利要求1所述水稻基因OsRMT1的重组载体。

4.一种生产具有高温胁迫耐性转基因植物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2)将步骤1)所得的植物表达载体转入植物细胞；

3)经筛选获得的转化细胞，再生为植物及其后代。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述植物包括植物细胞、植物组织或植物种子。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述植物选自水稻、玉米、小麦、大麦、黍、高粱中的任意一种。

7.权利要求1所述水稻基因OsRMT1在制备具有高温胁迫耐性转基因植物方面的用途。

8.一种含有编码核酸的多核苷酸的分离的DNA分子在制备具有高温胁迫耐性转基因植物品种中的用途，其特征在于：

(a)其编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；或

(c)其多核苷酸序列为编码OsRMT1蛋白的多核苷酸。

9.一种提高植物耐热性的启动子，通过权利要求8所述分离的DNA分子连接至植物中组成所述启动子，其中核酸能过量表达OsRMT1基因。