CN117305315A - OsIAA3基因及其编码蛋白的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明筛选并鉴定了一种新的水稻基因OsIAA3，其具有明显的提高水稻愈伤组织诱导率和分化率，因此可将本发明基因与植物中过表达启动子结合后导入合适的表达载体并转化植物宿主，提高植物愈伤组织诱导率和分化率。

Description

OsIAA3基因及其编码蛋白的应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及一种与调控水稻愈伤诱导率和分化率相关的基因，具体涉及一种调控水稻愈伤诱导率和分化率的基因OsIAA3及其应用。
背景技术
水稻遗传转化和花药培养作为水稻基因功能研究和遗传改良的重要手段之一，在品质改良、产量提升、提高非生物逆境耐受性和抗病抗虫性等方面具有重要作用。随着生物信息学的发展和功能基因组研究的深入，利用基因编辑技术对农作物进行精准改良的应用越来越受到重视。许多模式植物和农作物，如烟草、拟南芥、水稻、玉米、高粱、小麦、马铃薯、番茄等都已成功应用基因编辑系统进行品种改良(郝丽芬等，2017)。国家“七大农作物育种”重点专项在“主要粮食作物分子设计育种”等项目中专门设立了基因编辑项目群，指出应加快农作物重要性状发掘和基因功能解析研究，大规模的发掘可以编辑的基因，以实现调控作物有利性状基因的精准编辑；同时要开发广适性的遗传转化体系，提高遗传转化效率，扩展遗传转化的植物种类，为实现不同植物基因组编辑奠定基础(http://www.most.gov.cn/kjbgz/201807/t20180702_140379.htm)。而高效的组织培养体系正是高效的遗传转化和花药培养的基础。
在水稻组织培养过程中，愈伤的诱导、胚性愈伤增殖和绿苗分化是决定组培力的关键因素。影响这几方面能力的原因很多，包括供体基因型、外植体的生理状态、培养基的激素配比、培养条件以及它们之间的互作等等，其中基因型是决定植物组织培养能力的主要因素(Bolibok et al.,2006)。长期研究表明，粳稻品种的组培力普遍高于籼稻品种，籼稻品种的愈伤诱导率和绿苗分化率明显低于粳稻品种，常被称为籼稻品种组织培养的基因型障碍。例如籼稻品种花药培养平均出愈率不超过5％(Sripichitt et al.,2000；黄翠红等，2014)，有些材料甚至不能诱导出愈伤组织(向发云等，2007)；粳稻花培的愈伤组织诱导率一般在10％以上，有的可达40％以上(汪庆等，2013)。因此，水稻转基因或花药培养研究大多是以粳稻品种作为受体。而大量在育种上有应用价值的籼稻品种却很难通过组培获得足够数量的再生植株，即通过花药培养途径难以获得较大规模的加倍单倍体(DH)群体，支撑遗传作图的分辨率和育种分离群体的优良基因重组、后代选择的有效性。由于水稻组培性状遗传机理研究的不足，顽坳型水稻品种的组培应用一直难以突破。
发明内容
基于此，本发明的目的在于提供一种OsIAA3基因，并寻求其在调控水稻愈伤组织诱导率和分化率中的应用。
为实现上述目的，本发明具体技术方案如下：
OsIAA3基因在调控水稻愈伤诱导率和分化率中的应用，所述OsIAA3基因的序列如SEQ ID NO:1所示。
OsIAA3基因编码的蛋白在调控作物抗逆性中的应用，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，或者所述蛋白为由如上所述的OsIAA3基因编码得到。
OsIAA3基因在制备具有高诱导率和分化率的水稻愈伤组织中的应用，所述OsIAA3基因的序列如SEQ ID NO:1所示。
OsIAA3基因编码的蛋白在制备具有高诱导率和分化率的水稻愈伤组织中的应用，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，或者所述蛋白为由如上所述的OsIAA3基因编码得到。
一种调控水稻愈伤诱导率和分化率的方法，包括如下步骤：
1)构建OsIAA3基因超表达载体；所述OsIAA3基因的序列如SEQ ID NO:1所示；
2)遗传转化：将构建好的OsIAA3基因超表达载体转化农杆菌EHA105，并进行水稻愈伤组织转化；
3)筛选得到OsIAA3基因超表达的愈伤组织，进行分化、生根培养。
在其中一些实施例中，所述构建OsIAA3基因超表达载体，包括如下步骤：
1)根据OsIAA3基因的全长序列，设计扩增出完整编码阅读框的引物；
2)以OsIAA3基因cDNA序列为模板，进行PRC扩增，并连接至克隆载体-
Blunt Cloning Vector；
3)设计加接头的引物SEQ ID NO:4-5，与包含启动子和终止子蛋白植物表达载体Ub08进行重组反应，即得。
在其中一些实施例中，所述遗传转化，包括如下步骤：
1)将成熟的水稻种子去壳，用75％酒精浸泡1-2min，无菌水冲洗2次；再用3％NaClO消毒30min，再用无菌水洗3-4次，用无菌滤纸吸干多余的水分，将种子接种到愈伤组织诱导培养基上，每皿约30粒，于28℃暗培养1±0.2个月；所述愈伤组织有道培养基为含3.0mg/L的2,4-D的NB培养基；
2)水稻长出黄色膨大的愈伤组织，去其盾片，将愈伤转至新鲜的愈伤组织诱导培养基上进行继代；所述愈伤组织有道培养基为含2.0mg/L的2,4-D的NB培养基；
3)每2周继代一次，一般继代2-4次；在继代培养2±0.2周后，挑选胚性颗粒用于遗传转化。
在其中一些实施例中，所述遗传转化，进一步包括如下步骤：
a)将所述胚性颗粒浸入农杆菌菌液20-30min，再用无菌吸水纸吸干水分，将侵染的愈伤组织置于共培养培养基上，28℃暗培养2-4天，得培养的愈伤组织；所述共培养培养基组分为含2.0mg/L的2,4-D以及100μM的AS的MS培养基；
b)将共培养的愈伤组织用无菌水冲洗3-5遍，再浸泡在含Cef 400mg/L的MS液体培养基中20-30min后，将愈伤组织转入无菌滤纸上吸干。
在其中一些实施例中，所述筛选包括：
将遗传转化后的愈伤组织接种于选择培养基上；3周后，挑选新长出的愈伤接种于选择培养基上，再选择2周；所述选择培养基为含2,4-D 2.0mg/L、Hyg 30mg/L和Cef 400mg/L的NB培养基。
在其中一些实施例中，所述水稻为籼稻品种；在其中一些实施例中，所述水稻为组培顽坳型粳稻品种。
基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：
本发明筛选并鉴定了一种新的水稻基因OsIAA3，其具有明显的提高水稻愈伤组织诱导率和分化率，因此可将本发明基因与植物中过表达启动子结合后导入合适的表达载体并转化植物宿主，提高植物愈伤组织诱导率和分化率。
该方法可应用于水稻基因功能研究中或花培育种中的低组培力水稻品种，提高其在遗传转化或花药培养中的愈伤组织诱导率和绿苗分化率，从而广泛拓展水稻基因功能研究中遗传转化受体品种的范围，或提高籼稻品种的花培效率，助力籼稻育种，改良水稻品质、提升产量、提高非生物逆境耐受性和抗虫抗病性。本发明还提供了基因工程植物过量表达OsIAA3基因提高水稻愈伤组织诱导率和分化率和构建基因工程植物方法，以拓展当前植物生物技术中的可应用于提高植物组培和花药培养效率的基因，获得具有高效遗传转化效率的新型转基因植物品种。
附图说明
图1为超表达载体Ub08-OsIAA3示意图。
图2为OsIAA3基因编辑载体示意图。
图3为超表达转基因水稻叶片中OsIAA3基因相对表达量图。采用实时反转录实时定量PCR方法检测OsIAA3基因在转基因水稻叶片中表达量，其中，横轴的编号为OsIAA3转基因水稻株系；纵轴表示：转基因株系相对于野生型对照植株的OsIAA3表达量比值，内参基因为actin1。
图4为OsIAA3基因编辑单株T0代鉴定结果图。A.野生型和纯合缺失突变体的sgRNA位点附近基因组序列比对；B.野生型和纯合编辑突变体产生多肽的多序列比对。
图5为转OsIAA3基因水稻愈伤诱导率和分化率比较分析。WT表示非转基因野生型水稻；OsIAA3OE表示转OsIAA3基因过表达株系；osiaa3-ko1和osiaa3-ko2表示基因编辑突变株系。*表示P<0.05，**表示P<0.01。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。
在本文中，术语“分离的”、“纯化的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其蛋白质分开。
本发明还包括能编码具有OsIAA3相同功能的蛋白的SEQ ID NO.1中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5和/或3端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。
在本发明中，还包括具有与OsIAA3相同功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。
蛋白的同源性百分比由GAP(Needleman和Wunsh,1970)分析(GCG程序)确定，其中参数gap creation penalty＝5，gap extension penalty＝0.3。被分析的序列长度至少为15个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为15个氨基酸的区域进行测试。更优选地，被分析的序列长度至少为50个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为50个氨基酸的区域进行测试。更优选地，被分析的序列长度至少为100个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为100个氨基酸的区域进行测试。更优选地，被分析的序列长度至少为250个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为250个氨基酸的区域进行测试。甚至更优选地，被分析的序列长度至少为500个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为500个氨基酸的区域进行测试。
通过本领域已知的方法可以分离和纯化多核苷酸(DNA或RNA)、载体、转化体和生物体。
本发明所分离出的多核苷酸，包括但不限于：SEQ ID NO.1编码OsIAA3基因的核苷酸序列；或者该核苷酸序列能与SEQ ID NO.1中从核苷酸第1-792位的核苷酸序列杂交；或者其功能相当于SEQ ID NO.1所示序列的亚片段。
可以采用已经克隆的OsIAA3基因作为探针，从cDNA和基因组文库中筛选得到本发明的基因或同源基因，也可以直接采用基因合成的方法合成。同样也可以采用PCR(polymerase chain reaction)技术，从基因组、cDNA中扩增得到本方面的OsIAA3基因以及任何一段DNA或其同源的一段DNA。
用于本发明的载体可以是如噬菌体、质粒、粘粒、微型染色体、病毒或逆转录病毒载体。可用于克隆和/或表达本发明的多核苷酸的载体是能在需复制和/或表达多核苷酸的宿主细胞中复制和/或表达多核苷酸的载体。一般说来，携带本发明的核酸序列的重组表达载体可以使用Ti质粒、植物病毒载体，直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach,1998,Method for Plant Molecular Biology VIII,AcademyPress,New York,pp.411-463；Geiserson and Corey,1998,Plant Molecular Biology(2nd Edition)。
已开发出多种方法用于经由互补的粘性末端使多核苷酸与载体可操作相连。例如，可在欲插入载体DNA内的DNA区段添加互补的同聚体序列片段。然后通过互补同聚体尾之间的氢键连接载体和DNA区段以形成重组DNA分子。
含有一或多种限制性位点的合成接头提供了另一种连接DNA区段与载体的方法。用噬菌体T4 DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶I处理通过内切核酸酶限制性消化产生的DNA区段，所述的两种聚合酶用其3'、5’-核酸外切活性除去突出的γ-单链末端，并用其聚合活性补平3’-凹端。因此，这些活性的联合产生了平端DNA区段，然后在能催化平端DNA分子连接的酶，如噬菌体T4 DNA连接酶的存在下将平端区段与摩尔过量的接头分子一起保温。因此，反应产物是末端携有聚合接头序列的DNA区段，然后用适当的限制性酶裂解这些DNA区段，并连接至已用酶裂解的表达载体中，所述酶能产生与所述DNA区段相容的末端。从多个商家可以买到含有多个限制性内切核酸酶位点的合成接头。
其它新发展的技术利用同源重组方法，将携带有特定序列接头或同源序列接头的多核苷酸与载体进行同源重组，将欲插入载体DNA内的DNA区段与同样携带有特定序列或同源序列的载体通过重组酶的作用形成重组DNA分子。
多核苷酸插入物应该可操作地连接于同表达多核苷酸的宿主细胞相容的适当启动子上，启动子可以是强启动子和/或诱导型启动子。列举的一些启动子的例子包括噬菌体PL启动子、大肠杆菌lac、trP、phoA、tac启动子、SV40早期和晚期启动子以及逆转录病毒LTR启动子；其它适当启动子是本领域技术人员已知的。表达重组载体进一步含有转录起始、终止位点，并在转录区含有用于翻译的核糖体结合位点。重组载体表达的转录物的编码部分可包括位于起点处的翻译起始密码子和适当地位于被翻译多肽的末端的终止密码子(UAA,UGA或UAG)。
如上所述，表达载体可包括至少一个选择标记。所述标记包括编码抗生素的抗性基因，例如：新霉素磷酸转移酶(Neomycin phosphotransferase)基因nptⅡ、潮霉素磷酸转移酶(Hygromycin phosphotransferase)基因hpt和二氢叶酸还原酶(Dihydrofolatereductase)基因dhfr；另一类是编码除草剂抗性基因，例如，草丁膦乙酰转移酶(Phosphinothricin acetyltransferase)基因Bar、5-烯醇丙酮酰草酸-3-磷酸合成酶(5-Enoylpyruvate shikimatr-3-phosphate)基因epsps。适当宿主的代表性例子包括但不限于：原生质体细胞和植物细胞。上述宿主细胞的适当培养基和培养条件是本领域已知的。
目的基因或目的多核苷酸的转化方法：一类是载体介导的转化方法，即将目的基因插入到农杆菌的质粒或病毒的DNA等载体分子上，随着载体DNA的转移而将目的基因导入到植物基因组中；农杆菌介导和病毒介导法就属于这种方法。第二类为基因直接导入法，是指通过物理或化学的方法直接将外源目的基因导入植物的基因组中。物理方法包括基因枪转化法、电激转化法、超声波法、显微注射法和激光微束法等；化学方法有PEG介导转化方法和脂质体法等。第三类为种质系统法，这包括花粉管通道法、生殖细胞浸染法、胚囊和子房注射法等。
本发明中，使用的术语“转化体”(transformant)，即带有异源DNA分子的宿主细胞或生物体。
本发明还包括含有本发明的核苷酸序列的宿主细胞，所述核苷酸序列经本领域已知的技术与一或多种异源控制区(如启动子和/或增强子)可操作相连。可以选择能调节插入的基因序列的表达，或能按照所需的特殊方式修饰和加工基因产物的宿主菌株。在某些诱导物的存在下，某些启动子启动的表达会升高。
通过众所周知的技术可以鉴定出被成功转化的细胞，即含有本发明所述核苷酸序列的重组载体的细胞或生物体。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
下面通过实施例对本发明进行详细介绍：
实施例1分离克隆OsIAA3基因
取生长4个星期的水稻幼苗叶片，采用TRIzol试剂(GIBCO BRL,USA)抽提水稻总RNA。利用反转录酶MLV(Tiangen，China)将其反转录成第一链cDNA。
用引物F(5’-ATGTCGCCGCCCCTCGAGCT-3’，SEQ ID NO.2)和引物R(5’-CTAGTTCCTGTTCTTGGACTTTTC-3’，SEQ ID NO.3)，扩增出基因的全长编码cDNA。PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃30sec，60℃30sec，72℃60sec共35个循环；72℃延伸5min。将扩增获得的PCR产物连入pGEM-T载体(Promega,USA)，筛选阳性克隆并测序，获得OsIAA3基因的cDNA序列(SEQ ID NO.1)。
SEQ ID NO.1具体序列为：
ATGTCGCCGCCCCTCGAGCTCGACTACATAGGCCTCTCGCCTCCGCCGCCGCCGCC
CTCCTCCTCCTCCGCCGCCGCCGCCCGCGCGGACGACGTCGACCTGAAGGGCACCGA
GCTCCGCCTCGGCCTCCCTGGCTCCGAGTCGCCGGACCGCCGCCCTGCGGCTATTGCC
GCTGCCGCTGCCACTGCCACCACCCTTGAGCTGCTGCCCGCCAAGGGTGCCAAGCGC
GTGTTCCCCGACGAGGCCGCGCTGACGCCGCCCACTGCCGCCGCCGGGAAGGGCAA
GGCGGCGAGGGAGGGGGAGGAGGTGGGGGCTGAGGAGGAGGACAAGAAGGTCGCC
GCGCCGCCGCAGCCGGCTGCGAAGGCTCAGGTGGTGGGATGGCCACCAATCCGCAG
CTACCGCAAGAACACGATGGCAACCAACCAGATAAAGAGCAACAAGGAGGATGTTG
ATGCTAAGCAGGGTCAGGGTTTCCTGTACGTCAAGGTTAGCATGGATGGTGCACCAT
ATCTGAGGAAGGTGGACCTCAAAACTTACAAGAACTACAAGGACATGTCTTTGGGTC
TCGAGAAAATGTTCATTGGCTTCAGCACCGGTAAGGAAGGTGCTGAGAACCAGAAA
GATGGTGAATATGTGTTAACCTACGAAGACAAGGATGGTGACTGGATGCTGGTTGGT
GATGTTCCATGGGAGATGTTCACCGACTCTTGCCGGAGGCTCAGAATCATGAAAGGC
TCAGATGCAATTGGACTTGCCCCAAGAGCAGGGGAAAAGTCCAAGAACAGGAACTAG
实施例2 OsIAA3基因超表达和编辑载体的构建和遗传转化
1)含目的基因表达载体的构建：
根据OsIAA3基因的全长序列(SEQ ID NO.1)，设计扩增出完整编码阅读框的引物(SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，并在上游引物和下游引物上分别添加接头引物，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经高保真pfu酶(Tiangen，China)进行PCR扩增后，将OsIAA3基因cDNA克隆至克隆载体-Blunt Simple Cloning Vector，进一步转化大肠杆菌DH5α，在保证阅读框架正确的前提下鉴定中间载体，然后抽提质粒，设计加接头的引物F(5’-gatgaactatacaaaactagtATGTCGCCGCCCCTCGAGCT-3’,SEQ ID NO.4)和引物R(5’-gggaaattcgagctggtcaccCTAGTTCCTGTTCTTGGACTTTTC-3’,SEQ ID NO.5)使用北京全式金生物技术有限公司(TransGen Biotech)的/>-Basic Seamless Cloning andAssembly Kit重组酶与包含启动子和终止子蛋白植物表达载体Ub08进行重组反应，构成了一个完整的表达单元(见图1)，转化农杆菌EHA105，最后进行水稻愈伤组织转化实验。
2)靶基因编辑表达载体的构建：
对于利用Crispr/Cas9系统进行基因编辑的OsIAA3基因载体的构建，利用CRISPR-P 2.0工具(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)设计sgRNA靶点为：5’-GCGTCAGCGCGGCCTCGTCGGGG-3’(SEQ ID NO.6)，然后参照已发表的Crispr/Cas9基因编辑系统提供的方法进行基因编辑载体的构建，最后将U6启动子和sgRNA表达盒装载入表达载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H中，结果如图2所示。具体操作步骤详见参考文献(Ma X,Zhang Q,Zhu Q,Liu W,Chen Y,Qiu R,Wang B,Yang Z,Li H,Lin Y,Xie Y,Shen R,Chen S,Wang Z,Chen Y,Liu Y.A Robust CRISPR/Cas9 System for Convenient,High-EfficiencyMultiplex Genome Editing in Monocot and Dicot Plants.Molecular Plant,2015,8:1274-1284)。构建好的质粒转化农杆菌EHA105，进行水稻愈伤组织转化实验。
3)水稻遗传转化
3.1种子消毒
成熟的日本晴水稻种子去壳后放入无菌三角瓶中，用75％酒精浸泡1-2min，无菌水冲洗2次；再用3％ NaClO消毒30min，其间需经常摇动，再用无菌水洗3-4次，用无菌滤纸吸干多余的水分，将种子接种到愈伤组织诱导培养基(NB+2,4-D 3.0mg/L)上，每皿约30粒，于28℃暗培养。
3.2继代培养
经过近1月的诱导，水稻长出黄色膨大的愈伤组织，去其盾片，将愈伤转至新鲜的愈伤组织诱导培养基(NB+2,4-D 2.0mg/L)上进行继代。每2周继代一次，一般继代2-4次即可获得适合转基因的嫩黄色、颗粒状的胚性愈伤组织。在继代培养2周后，挑选胚性颗粒用于遗传转化。
3.3农杆菌的培养
在转化平板上挑取单菌落在1ml农杆菌培养基中培养。在50ml农杆菌培养基(含相应抗生素)中加入1ml上述培养物，200rpm，28℃培养5-6hr至OD600为0.6-1.0，培养结束前2hr加入乙酰丁香酮(AS，acetosringone，终浓度100uM)。取上述菌液在室温下，4000rpm，10min，弃上清，加入MS液体培养基(含AS 100uM)重悬菌体，在与上相同的条件下培养2hr，使菌液的OD600＝0.5-1，此时可用来转化愈伤组织。
3.4共培养
将水稻胚性愈伤组织浸入农杆菌菌液20-30min，再用无菌吸水纸吸干水分，将侵染的愈伤组织置于共培养培养基(MS+2,4-D 2.0mg/L+AS 100uM)上，28℃暗培养三天。
3.5洗菌
共培养的愈伤组织先用无菌水冲洗3-5遍，再浸泡在含Cef 400mg/L的MS液体培养基中20-30min后，将愈伤组织转入无菌滤纸上吸干。
3.6筛选培养
将吸干水分的愈伤组织接种于选择培养基(NB+2,4-D 2.0mg/L+Hyg 30mg/L+Cef400mg/L)上。3周后，挑选新长出的愈伤接种于选择培养基(NB+2,4-D 2.0mg/L+Hyg 50mg/L+Cef 250mg/L)上，再选择2周。
3.7分化培养
将经2次筛选得到的抗性愈伤组织转入到预分化培养基(N6+KT 2.0mg/L+NAA0.2mg/L+6-BA 2.0mg/L+Hyg 30mg/L+Cef 200mg/L+琼脂9g/L+蔗糖45g/L)上暗培养10天左右，再转到分化培养基(N6+KT 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L+6-BA 2.0mg/L+Hyg 30mg/L+琼脂4.5g/L+蔗糖30g/L)上光照培养。
3.8生根培养
约1-2个月，将2cm左右高的幼苗转到生根培养基(1/2MS+Hyg 15mg/L+琼脂4.5g/L+蔗糖20g/L)上诱导不定根的发生。
3.9转基因苗的移栽
当幼苗长至10cm高时，将幼苗取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入泥土中，刚开始用玻璃罩罩几天，待植株健壮后再取下玻璃罩，温室中培养。
实施例3 OsIAA3基因在转基因植株中的表达分析
1)材料准备
转基因T2代水稻种子发芽后，移植于液体培养基(自来水配制成1/5MS大量元素)。幼苗生长15d后，剪取叶片快速投入液氮保存，用于RNA的抽提。
2)无DNA的总RNA制备
按上海全式金生物技术有限公司提供的植物叶RNA小量抽提试剂盒使用说明书抽提。使用Beckman CoulterTM 640紫外分光光度计测定RNA浓度。为除去残留在RNA中的DNA，每个总RNA样品取5μg，加入1μL DNAase I(美国Invitrogen公司)和1μL10×反应缓冲液，补足体积至10μL，常温反应30min，然后每管加入1μL 2mmol L-1EDTA终止反应，最后在70℃加热10min使DNAase I失活。
3)第一链cDNA的合成
将上述RNA样品各取2μL，按美国Promega公司反转录试剂盒提供的试剂依次添加4μL25mmol L-1MgCl2，2μL10×RT缓冲液，2μL dNTP混和液和1μL oligo(dT)15，加水补足体积到18.5μL，在70℃加热变性10min，快速在冰上冷却。然后加0.5μL RNase inhibitor和1μL AMVRTase，在42℃水浴60min，70℃下加热10min终止反应。
4)定量PCR
根据基因OsIAA3的序列设计特异性引物:
qIAA3F(SEQ ID NO.7):5’-ATGGTGACTGGATGCTGGTT-3’，
qIAA3R(SEQ ID NO.8):5’-CCAATTGCATCTGAGCCTTT-3’
用于荧光定量PCR，根据水稻Actin基因(GenBank accession No.AY212324)的cDNA序列设计特异性引物:
Actin-F(SEQ ID NO.9):5’-CTT CCT CAT GCC ATC CTG C-3’，
Actin-R(SEQ ID NO.10):5’-GCA AGC TTC TCC TTG ATG TCC-3’
用于参照基因的荧光定量PCR。
PCR使用美国ABI7000定量PCR仪，每一个PCR设置三次重复。反应体系包含Top Green qPCR SuperMix(+Dye I)(2×)10μL，正反向引物各0.5μL，各种处理的cDNA模板1μL，加水补足体积至20μL。反应程序为：95℃30s，然后在95℃10s，61℃34s下循环40次，设定在每个循环中60℃34s时读取荧光值，同时进行ROX值校正，最后添加荧光PCR产物融解曲线分析，其他操作详见仪器使用说明书。为了检测RNA样品中是否存在DNA的污染，随机选取3个样品，各取1μL RNA作为模板进行PCR，方法同上。
5)分析方法
Ct是通过7000system SDS Version1.2.3软件在PCR的荧光域值通过手工确定为0.2后产生的，将数据输入到EXCEL进行计算分析。数据分析采用方法为2-ΔΔCT，然后利用EXCEL表作表达差异柱状图。
6)分析结果
以空白非转基因日本晴品种为参照，鉴定了过表达材料OsIAA3-OE的表达量，该株系具有较高的表达量(图3)，说成功获得了过表达转基因植株。。
实施例4OsIAA3基因编辑突变体的筛选
对于CRISPR/Cas9编辑的OsIAA3基因T0代单株利用一代测序进行鉴定。利用快速提取DNA方法对T0代单株基因组DNA进行抽提，针对sgRNA编辑位点两侧设计引物，扩增片段覆盖编辑位点区域，对PCR产物进行测序。以日本晴靶位点序列为参考序列与所有的扩增编辑位点区域进行多序列比对，确定发生基因组编辑的纯合单株。根据测序结果，如图4中A图所示多序列比对结果，突变类型分别为sgRNA作用的靶位点处插入1个碱基C(osiaa3ko1，SEQ ID NO.11)，导致移码突变，引起转录本提前终止，形成105个氨基酸的多肽(SEQ IDNO.12)；插入1个碱基A(osiaa3ko2，SEQ ID NO.13)，导致移码突变，引起转录本提前终止，形成105个氨基酸的多肽(SEQ ID NO.14)，但是二者形成的氨基酸序列并不一致(图4)。其更与OsIAA3基因正常表达得到的蛋白序列(SEQ ID NO.15)不一致。
SEQ ID NO.11:
ATGTCGCCGCCCCTCGAGCTCGACTACATAGGCCTCTCGCCTCCGCCGCCGCCGCCCTCCTCCTCCTCCGCCGCCGCCGCCCGCGCGGACGACGTCGACCTGAAGGGCACCGAGCTCCGCCTCGGCCTCCCTGGCTCCGAGTCGCCGGACCGCCGCCCTGCGGCTATTGCCGCTGCCGCTGCCACTGCCACCACCCTTGAGCTGCTGCCCGCCAAGGGTGCCAAGCGCGTGTTCCCCGGACGAGGCCGCGCTGACGCCGCCCACTGCCGCCGCCGGGAAGGGCAAGGCGGCGAGGGAGGGGGAGGAGGTGGGGGCTGAGGAGGAGGACAAGAAGGTCGCCGCGCCGCCGCAGCCGGCTGCGAAGGCTCAGGTGGTGGGATGGCCACCAATCCGCAGCTACCGCAAGAACACGATGGCAACCAACCAGATAAAGAGCAACAAGGAGGATGTTGATGCTAAGCAGGGTCAGGGTTTCCTGTACGTCAAGGTTAGCATGGATGGTGCACCATATCTGAGGAAGGTGGACCTCAAAACTTACAAGAACTACAAGGACATGTCTTTGGGTCTCGAGAAAATGTTCATTGGCTTCAGCACCGGTAAGGAAGGTGCTGAGAACCAGAAAGATGGTGAATATGTGTTAACCTACGAAGACAAGGATGGTGACTGGATGCTGGTTGGTGATGTTCCATGGGAGATGTTCACCGACTCTTGCCGGAGGCTCAGAATCATGAAAGGCTCAGATGCAATTGGACTTGCCCCAAGAGCAGGGGAAAAGTCCAAGAACAGGAACTAG
SEQ ID NO.12
MSPPLELDYIGLSPPPPPPSSSSAAAARADDVDLKGTELRLGLPGSESPDRRPAAIAAAA ATATTLELLPAKGAKRVFPGRGRADAAHCRRREGQGGEGGGGGGG
SEQ ID NO.13
ATGTCGCCGCCCCTCGAGCTCGACTACATAGGCCTCTCGCCTCCGCCGCCGCCGCCCTCCTCCTCCTCCGCCGCCGCCGCCCGCGCGGACGACGTCGACCTGAAGGGCACCGAGCTCCGCCTCGGCCTCCCTGGCTCCGAGTCGCCGGACCGCCGCCCTGCGGCTATTGCCGCTGCCGCTGCCACTGCCACCACCCTTGAGCTGCTGCCCGCCAAGGGTGCCAAGCGCGTGTTCCCCGATCGAGGCCGCGCTGACGCCGCCCACTGCCGCCGCCGGGAAGGGCAAGGCGGCGAGGGAGGGGGAGGAGGTGGGGGCTGAGGAGGAGGACAAGAAGGTCGCCGCGCCGCCGCAGCCGGCTGCGAAGGCTCAGGTGGTGGGATGGCCACCAATCCGCAGCTACCGCAAGAACACGATGGCAACCAACCAGATAAAGAGCAACAAGGAGGATGTTGATGCTAAGCAGGGTCAGGGTTTCCTGTACGTCAAGGTTAGCATGGATGGTGCACCATATCTGAGGAAGGTGGACCTCAAAACTTACAAGAACTACAAGGACATGTCTTTGGGTCTCGAGAAAATGTTCATTGGCTTCAGCACCGGTAAGGAAGGTGCTGAGAACCAGAAAGATGGTGAATATGTGTTAACCTACGAAGACAAGGATGGTGACTGGATGCTGGTTGGTGATGTTCCATGGGAGATGTTCACCGACTCTTGCCGGAGGCTCAGAATCATGAAAGGCTCAGATGCAATTGGACTTGCCCCAAGAGCAGGGGAAAAGTCCAAGAACAGGAACTAG
SEQ ID NO.14
MSPPLELDYIGLSPPPPPPSSSSAAAARADDVDLKGTELRLGLPGSESPDRRPAAIAAAA ATATTLELLPAKGAKRVFPDRGRADAAHCRRREGQGGEGGGGGGG
SEQ ID NO.15
MSPPLELDYIGLSPPPPPPSSSSAAAARADDVDLKGTELRLGLPGSESPDRRPAAIAAAAATATTLELLPAKGAKRVFPDEAALTPPTAAAGKGKAAREGEEVGAEEEDKKVAAPPQPAAKAQVVGWPPIRSYRKNTMATNQIKSNKEDVDAKQGQGFLYVKVSMDGAPYLRKVDLKTYKNYKDMSLGLEKMFIGFSTGKEGAENQKDGEYVLTYEDKDGDWMLVGDVPWEMFTDSCRRLRIMKGSDAIGLAPRAGEKSKNRN
实施例5对OsIAA3基因转基因植株组培力的评价
选取了实施例3中OsIAA3基因过量表达转基因T2代株系A10以及实施例4中OsIAA3基因编辑突变体T2代株系osiaa3ko1，osiaa3ko2进行愈伤组织诱导率及愈伤组织分化率的鉴定实验。具体步骤如下：将转基因材料种子和同期播种收获的空载体对照材料种子去壳，用75％酒精和3％次氯酸钠依次消毒，无菌水清洗5次，灭菌滤纸吸干种子表面水分，接种到NB诱导培养基上，30℃暗培养3周，统计转基因株系与野生型材料的初生愈伤诱导率。剥取初生愈伤，接种到分化培养基上，25℃光培养40天左右，统计愈伤分化率。结果表明OsIAA3基因的过量表达能够显著提高水稻初生愈伤诱导率及分化率(图5)，而通过基因编辑产生的功能缺失突变体相比对照材料，其初生愈伤诱导率及分化率极显著下降(图5)，说明OsIAA3基因对水稻组培特性具有重要作用。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.OsIAA3基因在调控水稻愈伤诱导率和分化率中的应用，其特征在于，所述OsIAA3基因的序列如SEQ ID NO:1所示。
2.OsIAA3基因编码的蛋白在调控作物抗逆性中的应用，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，或者所述蛋白为由权利要求1所述的OsIAA3基因编码得到。
3.OsIAA3基因在制备具有高诱导率和分化率的水稻愈伤组织中的应用，其特征在于，所述OsIAA3基因的序列如SEQ ID NO:1所示。
4.OsIAA3基因编码的蛋白在制备具有高诱导率和分化率的水稻愈伤组织中的应用，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，或者所述蛋白为由权利要求1所述的OsIAA3基因编码得到。
5.一种调控水稻愈伤诱导率和分化率的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)构建OsIAA3基因超表达载体；所述OsIAA3基因的序列如SEQ ID NO:1所示；
2)遗传转化：将构建好的OsIAA3基因超表达载体转化农杆菌EHA105，并进行水稻愈伤组织转化；
3)筛选得到OsIAA3基因超表达的愈伤组织，进行分化、生根培养。
6.根据权利要求5所述的调控水稻愈伤诱导率和分化率的方法，其特征在于，所述构建OsIAA3基因超表达载体，包括如下步骤：
1)根据OsIAA3基因的全长序列，设计扩增出完整编码阅读框的引物；
2)以OsIAA3基因cDNA序列为模板，进行PRC扩增，并连接至克隆载体-BluntCloning Vector；
3)设计加接头的引物SEQ ID NO:4-5，与包含启动子和终止子蛋白植物表达载体Ub08进行重组反应，即得。
7.根据权利要求5所述的调控水稻愈伤诱导率和分化率的方法，其特征在于，所述遗传转化，包括如下步骤：
1)将成熟的水稻种子去壳，用75％酒精浸泡1-2min，无菌水冲洗2次；再用3％NaClO消毒30min，再用无菌水洗3-4次，用无菌滤纸吸干多余的水分，将种子接种到愈伤组织诱导培养基上，每皿约30粒，于28℃暗培养1±0.2个月；所述愈伤组织有道培养基为含3.0mg/L的2,4-D的NB培养基；
2)水稻长出黄色膨大的愈伤组织，去其盾片，将愈伤转至新鲜的愈伤组织诱导培养基上进行继代；所述愈伤组织有道培养基为含2.0mg/L的2,4-D的NB培养基；
3)每2周继代一次，一般继代2-4次；在继代培养2±0.2周后，挑选胚性颗粒用于遗传转化。
8.根据权利要求7所述的调控水稻愈伤诱导率和分化率的方法，其特征在于，所述遗传转化，进一步包括如下步骤：
a)将所述胚性颗粒浸入农杆菌菌液20-30min，再用无菌吸水纸吸干水分，将侵染的愈伤组织置于共培养培养基上，28℃暗培养2-4天，得培养的愈伤组织；所述共培养培养基组分为含2.0mg/L的2,4-D以及100μM的AS的MS培养基；
b)将共培养的愈伤组织用无菌水冲洗3-5遍，再浸泡在含Cef 400mg/L的MS液体培养基中20-30min后，将愈伤组织转入无菌滤纸上吸干。
9.根据权利要求5所述的调控水稻愈伤诱导率和分化率的方法，其特征在于，所述筛选包括：
将遗传转化后的愈伤组织接种于选择培养基上；3周后，挑选新长出的愈伤接种于选择培养基上，再选择2周；所述选择培养基为含2,4-D 2.0mg/L、Hyg 30mg/L和Cef 400mg/L的NB培养基。
10.根据权利要求5-9任一项所述的调控水稻愈伤诱导率和分化率的方法，其特征在于，所述水稻为低组培力的水稻品种(包括大部分籼稻品种与部分组培顽坳型粳稻品种)。
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