CN115807030B - 一种与落叶松开花时间相关的LaSCL6蛋白及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与落叶松开花时间相关的LaSCL6蛋白及其编码基因和应用，属于植物基因工程领域。所述的调控落叶松育种周期的关键基因LaSCL6，其核苷酸序列如序列1所示，其编码的氨基酸序列如序列2所示，属于GRAS转录因子家族。本发明通过构建LaSCL6的过表达载体，转化水稻获得了LaSCL6过表达水稻株系，如序列3所示，与野生型相比，LaSCL6过表达株系的开花时间均显著提前，说明LaSCL6具有缩短育种周期、提高育种效率的功能，在林木遗传育种中具有重要的应用价值。

Description

一种与落叶松开花时间相关的LaSCL6蛋白及其编码基因和 应用

技术领域

本发明公开了一种缩短落叶松开花时间的关键基因LaSCL6及其应用，属于植物基因工程领域。

背景技术

落叶松(Larix)，是重要的结构材和纸浆材树种，具有早期速生、容易成林、适应性强、轮伐期短、材质优良的特性。随着世界性林木资源的紧缺，落叶松的遗传改良也倍受重视。但落叶松幼年期长达10年左右，限制了其通过有性杂交进行遗传改良的效率。因此，研究落叶松开花时间的遗传调控机制，有利于通过分子手段人工调控落叶松的生殖发育进程，这对落叶松的遗传改良具有重大意义，并且也可为其它林木，如红松、云杉等的遗传改良提供有效参考。

SCARECROW-LIKE 6(SCL6)基因又名HAIRY MERISTEM(HAM)、LOST MERISTEMS(LOM)，是GRAS转录因子家族成员，参与植物生殖阶段转变过程。SCL6成员在拟南芥基因组中共有3个，在水稻基因组中共有4个，在番茄基因组中共有6个。但是在裸子植物尤其是落叶松中还没有关于SCL6基因在生殖发育过程中的功能研究。已有研究发现，在大麦及水稻中，当SCL6表达水平降低时，其开花及生殖阶段转变推迟，表明SCL6基因在植物开花时间调控中具有重要作用。

开花时间直接决定了育种和良种生产的速度。落叶松生产中，扦插、嫁接、修剪和密度控制等措施都可以改变开花时间和过程。但是，这些措施的效果是有限的，没有在遗传上改变落叶松的生长习性，迫切需要通过基因工程手段来改变开花时间和过程。包括落叶松在内的裸子植物中SCL6同源基因相关研究仍是空白。克隆和开发利用落叶松转录因子LaSCL6，不仅有助于揭示落叶松开花的分子机制，还可为落叶松遗传改良和良种选育提供优良的目标基因和分子标记，这都为创制出提早结实的落叶松优良种质打下基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够调控落叶松开花时间的蛋白及其编码基因。

本发明提供一种LaSCL6蛋白，所述LaSCL6蛋白，是如下A1)、A2)或A3)的蛋白质：

A1)氨基酸序列是序列表中序列2的蛋白质；

A2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且与植物耐热性和抗病性相关的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。

本发明涉及所述的LaSCL6蛋白相关的生物材料，为下述B1)至B9)中的任一种：

B1)编码所述蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；

B8)降低所述蛋白质表达的核酸分子；

B9)含有B8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。

其中，B1)所述核酸分子为如下b1)或b2)所示的所述蛋白质的编码基因：

b1)编码序列是序列表中序列1的第59位到1978位核苷酸的cDNA分子或DNA分子；

b2)核苷酸是序列表中序列1的cDNA分子或DNA分子

本发明提供一种调节植物开花时间的方法，包括通过调节植物中LaSCL6蛋白的表达量调节植物开花时间的步骤。

其中，所述调节植物开花时间为使植物的开花时间提前，调节植物中LaSCL6蛋白的表达量的方法为增加节植物中LaSCL6蛋白的表达量。

其中，所述增加节植物中LaSCL6蛋白的表达量。

本发明提供一种培育开花时间提前的植物的植物的方法，包括提高目的植物中所述LaSCL6蛋白的表达量，得到开花时间提前的植物的步骤；所述开花时间提前的植物的开花时间早于所述目的种子植物的开花时间。

上述的方法在植物育种中的应用，也应在本发明的保护范围之内。

所述植物育种为培育开花时间提前的植物。

所述植物为单子叶植物或者双子叶植物。

所述植物为水稻或者落叶松。

本申请公开了一种调控落叶松开花时间的关键基因LaSCL6，将LaSCL6基因转入水稻，植株的开花的时间显著提前，说明了LaSCL6基因为落叶松开花的正调控因子，可应用于调控植物生命周期运转的时间。

植物中生命周期的运转包括多个生物学事件，通过遗传手段促进这些过程的发生，可以有效的加速生命周期运转，缩短育种年限。因此，本发明提供的LaSCL6基因在林木遗传改良过程中具有重要应用价值。

附图说明

图1为转基因水稻的阳性PCR验证结果图。

图2为转基因水稻的LaSCL6表达验证结果图。

图3为转基因水稻开花时间提前的示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中，常用的分子生物学实验方法参照《分子克隆实验指南》第三版，相关试剂和试剂盒的使用具体参照说明书。

下述实施例中的水稻购自武汉天问生物科技有限公司。

实施例1调控落叶松开花的关键基因LaSCL6的克隆：

提取落叶松组织cDNA，基于落叶松转录组中LaSCL6的序列设计引物，通过克隆获得LaSCL6的全长cDNA序列，-20℃保存。

克隆引物序列如下：

5’引物-TCAAGCCAACGCCAAAGC

3’引物-AAGAAGCGAAGAAGCAGACG

采用Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity(Invitrogen)进行PCR扩增。PCR反应体系：10X High Fidelity PCR Buffer 5μL；50mM MgSO4 2μL；10mM dNTP Mix 1μL；Forward primer 2μL；Reverse primer 2μL；Template DNA/cDNA 2μL；Platinum TaqDNA Polymerase High Fidelity(5U/μL)0.2μL；ddH2O至50μL。按如下循环进行：94℃2min；40cycles：94℃15s，55℃30s，68℃1min；4℃。

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，分离目标条带，切胶，使用胶回收试剂盒(TIANGEN公司)回收、纯化目标产物，将纯化后的扩增产物连接T载体，测序。测序后结果表明，LaSCL6的全长cDNA序列为2200bp，如序列1所示，利用NCBI的ORF finder分析后发现，其包含一个1920bp的阅读框(其为序列1的第59位到1978位)，编码一个包含639个氨基酸的蛋白质(氨基酸序列如序列2所示)。

(2)调控落叶松开花的关键基因LaSCL6植物过表达载体的构建：

以纯化后的LaSCL6全长cDNA扩增产物为模板，PCR扩增出LaSCL6的CDS序列，-20℃保存。

引物序列如下：

5’引物-acgggggactcttgaccatggggATGGAAGATTTGGAGAGTATG(序列3)

3’引物-ctggtcaccaattcacacgtgTTAAGGCGGGGGCCCGCACCT(序列4)

PCR反应条件同上。

使用无缝克隆的方法将LaSCL6的CDS序列连接到pCAMBIA1305.1的多克隆位点Nco1和Pml1中间。

反应体系和方法如下：

LaSCL6 CDS的PCR产物1μL，pCAMBIA1305.1的线性化载体4μL，无缝克隆酶反应液5μL(2×seamless cloning mix,博迈德)，混匀后50℃孵育15min。

pCAMBIA1305.1的线性化载体的制备方法：Nuclease-free Water 37μL,酶反应液5μL，pCAMBIA1305.1载体质粒3μL，Nco1和Pml1内切酶各2.5μL，混合后37℃孵育4h，80℃加热15min终止反应。冷却后进行琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收pCAMBIA1305.1的线性化载体片段，-20℃保存。

将上述获得的pCAMBIA1305.1重组LaSCL6过表达载体质粒通过冻融法转化到大肠杆菌感受态细胞中，进行测序验证。具体操作为：取1.5μL重组质粒加入100μL大肠杆菌感受态细胞(TransT1，全式金)中，混匀后冰上放置30min，立即42℃水浴热激30s，立刻取出冰上放置2min，加入500μL的LB液体培养基，37℃，200rpm培养1h。取100μL菌液涂于含50mg/L卡那霉素抗性的LB固体培养基平板上，倒置37℃培养过夜。挑取5-10个单克隆加入1mL含50mg/L卡那霉素抗性的LB液体培养基中37℃，200rpm扩大培养12h后进行测序。将测序正确的质粒保存于-20℃。

(3)调控落叶松开花的关键基因LaSCL6植物过表达载体农杆菌菌株的制备：

取上述测序验证后的LaSCL6重组质粒1μL加入农杆菌感受态细胞EHA105，混匀后冰上放置30min，液氮中放置5min，取出后37℃水浴5min，冰上放置5min。之后加入500μL无抗性LB液体培养基，28℃200rpm培养3h。取100μL菌液涂于含50mg/L庆大霉素、利福平和卡那霉素3种抗性的LB固体培养基平板上，倒置28℃培养2d，挑取3-5个单克隆进行菌液PCR，PCR反应条件同上。菌液PCR验证后的农杆菌菌株加入100mL含50mg/L庆大霉素、利福平、卡那霉素抗性的LB液体培养基中28℃200rpm扩大培养。

(4)农杆菌介导的水稻遗传转化：

1)愈伤组织诱导及预培养：取野生型日本晴种子，用75％乙醇消毒30-60s，再用2-3％次氯酸钠溶液灭菌20min左右，无菌水冲洗3-5次，吸干表面水分，将种子放置在诱导培养基上，于28℃下暗培养；当淡黄色愈伤组织长到合适体积后，用刀片切下并放置于增殖培养基上，10～14天左右即可用于侵染。

2)侵染液制备：挑取含有重组质粒的EHA105农杆菌单菌落接种于100mL加有相应抗生素(50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平)的液体LB培养基中，28℃，180rpm振荡培养至菌液的OD600＝0.5-0.6，收集菌液，4℃，4000rpm离心10min，弃上清，用侵染液(AS 20mg/L)等体积重悬菌体至OD600为0.4-0.5备用。

3)侵染：用侵染液侵染适量数目的愈伤组织，轻柔震荡20min左右。

4)共培养：侵染后取出愈伤组织，吸干表明水分铺在共培养培养基上，于28°C暗光培养3天；

5)恢复培养：将共培养后的愈伤组织取出，先用含有400mg/L头孢霉素无菌水冲洗2-3次，再用含有400mg/L头孢霉素的液体培养基中洗3-5min，用无菌滤纸吸干多余的水分，放入恢复培养基中培养7天；

6)筛选培养：将恢复过后的愈伤组织放置在筛选培养基(潮霉素40mg/L和400mg/L头孢霉素)中，黑暗培养，两周继代一次，直到长出抗性愈伤组织。

7)分化及生根培养：将筛选后的愈伤组织放置在分化培养基(潮霉素40mg/L和400mg/L头孢霉素)中，光照下培养，直至新的小苗长出；当苗长到一定大小就将其转移至生根培养基中，进行生根培养；最终对生长健壮的植株进行炼苗移栽，得到转基因株系T1、T2、T3和T4。

(5)转基因植株的检测：

取转基因和野生型水稻于液氮中速冻，每个株系3个重复，将样品研磨后用于提取基因组DNA和总RNA。以基因组DNA为模板，使用LaSCL6基因序列及载体序列为引物检测LaSCL6是否整合到水稻的染色体中。使用总RNA进行反转录，以反转录产物为模板，利用定量引物进行荧光定量PCR，检测LaSCL6是否在水稻中表达，结果见如图1所示。

基因组检测引物如下：

5’引物-CAATCCCACTATCCTTCGCAAGACC(序列5)

3’引物-TTGGGAACGAATGGCGTAGGG(序列6)

定量引物如下：

5’引物-GCTTCCCGAATCCTCAACG(序列7)

3’引物-GCCTCCGAGAAACTCTTGTATG(序列8)

(6)表型观测：

将水稻转基因苗和野生型苗一起种到大田后，观察记录开花时间，随后进行统计分析(表达量结果如图2所示，植物表型情况如图3所示)，比较转基因株系与野生型之间的差异，评价LaSCL6过表达对水稻开花时间的改变。从图2中可以看出，与野生型相比，转基因株系T1-T4,均为过表达LaSCL6的水稻株系。结合图3显示的过表达LaSCL6的水稻开花时，野生型上还没有开花的迹象；以及对开花时间的记载(野生型需要105-106天，平均105.6天，而转基因株系需要79-85天，平均81.9天)。上述结果表明，与野生型相比，过表达LaSCL6的水稻开花时间比野生型早约20天，说明LaSCL6基因过量表达加速了水稻开花。在应用层面，LaSCL6及其过量表达技术可以作为高效的分子工具加快植物开花。

以上说明对本发明而言只是说明性的，而非限制性的，本领域普通技术人员理解，在不脱离所附权利要求所限定的精神和范围的情况下，可做出许多修改、变化或等效，但都将落入本发明的保护范围。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (4)

1.一种调节植物开花时间的方法，其特征在于，包括通过调节植物中LaSCL6蛋白的表达量调节植物开花时间的步骤；

所述LaSCL6蛋白，是如下A1）或A2）的蛋白质：

A1）氨基酸序列是序列表中序列2的蛋白质；

A2）在A1）的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质；

所述调节植物开花时间为使植物的开花时间提前，调节植物中LaSCL6蛋白的表达量的方法为增加节植物中LaSCL6蛋白的表达量；

所述植物为水稻或者落叶松。

2.权利要求1所述的方法在植物育种中的应用，所述植物育种为培育开花时间提前的植物，所述植物为水稻或者落叶松。

3.一种培育开花时间提前的植物的方法，其特征在于，包括提高目的植物中权利要求1中所述LaSCL6蛋白的表达量，得到开花时间提前的植物的步骤；所述开花时间提前的植物的开花时间早于所述目的植物的开花时间，所述植物为水稻或者落叶松。

4.权利要求3所述的方法在植物育种中的应用，所述植物育种为培育开花时间提前的植物，所述植物为水稻或者落叶松。

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